CN101501484A - 通过毛细管电泳法分析试样的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供通过毛细管电泳法进行分析的方法,该方法可使装置小型化、分析精度高、可容易实施。一种通过毛细管电泳法分析试样的方法,其特征在于,其包括:准备用于前述毛细管电泳法的毛细管的工序;和,在前述毛细管中,使试样与含阴极性基化合物结合而成的复合物进行电泳的工序。其中,前述毛细管为如下的毛细管:在其内壁层叠有下述A层,在前述A层之上层叠有下述B层。A层:夹层,其由选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、无极性聚合物和含阳极性基化合物所组成的组中的至少一种形成、前述聚二烯丙基二甲基氯化铵通过物理吸附被固定于前述内壁,前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个通过共价键被固定于前述内壁;B层:阴极性层,由含阴极性基化合物形成。
Description
技术领域
本发明涉及通过毛细管电泳法分析试样的方法、用于该方法的毛细管和毛细管电泳装置。
背景技术
毛细管电泳法中,聚集在毛细管内壁的离子因施加电压而移动,从而产生电渗流,由此试样移动而进行电泳。作为毛细管,使用熔融二氧化硅制的毛细管,这有时因试样的吸附而得不到良好的电渗流。为此,提出了覆盖毛细管内壁的技术(专利文献1、2、3、4)。另一方面,血液中的血红蛋白(Hb)与血液中的葡萄糖反应成为糖化Hb。血液中的糖化Hb由于反映了生物体内血糖值的过去的经历,因而被作为糖尿病的诊断和治疗等中的指标,其中,β链N末端的缬氨酸发生糖化的物质被称为血红蛋白A1c(HbA1c),作为特别重要的指标,在临床检查等中实施其测定。血液中的血红蛋白的测定方法例如有琼脂糖电泳法、毛细管电泳法、HPLC法、免疫法、酶法等。这些当中,可检测出血红蛋白的遗传变异等微小的变异的是毛细管电泳法和HPLC法。另一方面,对于血红蛋白的分析装置,需要其小型化。关于这方面,HPLC法难以使装置整体小型化。相对于此,毛细管电泳法中,通过微芯片(microchip)化,可使装置整体小型化。
但是,前述的现有的毛细管电泳法中,存在无法高精度分析血红蛋白的问题。为了解决该问题,有如下技术:将毛细管内壁用蛋白质覆盖,进而用多糖类覆盖其上(专利文献5)。但是,该技术中,每当分析时,必需进行用蛋白质覆盖毛细管内壁的操作,存在分析变复杂的问题。另一方面,有不覆盖毛细管内壁而在双性离子性类型的运行缓冲液中含有脂肪族二胺等流动阻碍剂来进行毛细管电泳的方法(专利文献6)。但是,该方法中,存在虽然能分离变异血红蛋白但无法分离血红蛋白A1c的问题。这些问题是不仅在血红蛋白、在其他试样的毛细管电泳法中也普遍存在的问题。
专利文献1:日本特开2005-291926号公报
专利文献2:日本特开平4-320957号公报
专利文献3:日本特表平5-503989号公报
专利文献4:日本特表平8-504037号公报
专利文献5:日本特开平9-105739号公报
专利文献6:日本特开2006-145537号公报
发明内容
于是,本发明的目的在于提供可使装置小型化、分析精度高、可容易实施的通过毛细管电泳法分析试样的方法、用于该方法的毛细管和毛细管电泳装置。
为了实现前述目的,本发明的分析方法,其特征在于,其为通过毛细管电泳法分析试样的方法,其包括:
准备用于前述毛细管电泳法的毛细管的工序;和,
在前述毛细管中,使试样与含阴极性基化合物结合而成的复合物进行电泳的工序,
前述毛细管为如下的毛细管:在前述毛细管内壁层叠有下述A层,在前述A层之上层叠有下述B层。
A层:夹层,由选自聚二烯丙基二甲基氯化铵(Polydiallyldimethylammoniumchloride)、无极性聚合物和含阳极性基化合物所组成的组中的至少一种形成、
包含前述聚二烯丙基二甲基氯化铵时,前述聚二烯丙基二甲基氯化铵通过物理吸附被固定于前述毛细管内壁、
包含前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个时,前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个通过共价键被固定于前述毛细管内壁;
B层:由含阴极性基化合物形成的阴极性层。
本发明的毛细管,其特征在于,其为用于前述本发明的分析方法的毛细管电泳用的毛细管,其中,
在前述毛细管内壁层叠有下述A层,在前述A层之上层叠有下述B层。
A层:夹层,由选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、无极性聚合物和含阳极性基化合物所组成的组中的至少一种形成、
包含前述聚二烯丙基二甲基氯化铵时,前述聚二烯丙基二甲基氯化铵通过物理吸附被固定于前述毛细管内壁、
包含前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个时,前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个通过共价键被固定于前述毛细管内壁;
B层:由含阴极性基化合物形成的阴极性层。
本发明的毛细管电泳装置,其特征在于,该毛细管电泳装置用于前述本发明的分析方法,其包含前述本发明的毛细管。此外,本发明的毛细管电泳装置如后述那样,可以为被小型化(微芯片化)的微芯片电泳装置。
本发明的分析方法中,由于使用夹着固定于毛细管内壁的A层形成有B层的毛细管,因而可防止例如血红蛋白等血液试样中的蛋白质等吸附于毛细管内壁,由此可产生良好的电渗流。此外,本发明的分析方法中,试样与含阴极性基化合物结合而生成复合物并使其进行电泳,因此,与试样单独进行电泳相比,分离效率变高。由以上可知,根据本发明的分析方法,可以以短时间且高精度实施血红蛋白等试样的分析。此外,前述A层由于被牢固固定于毛细管内壁,因而一旦形成,则即便洗涤也不容易剥离,可反复使用。为此,本发明的分析方法中,一旦形成A层,则没有必要每次分析都形成A层,因此,可容易实施分析。此外,本发明中,由于采用毛细管电泳法,因而可使分析装置小型化。
附图说明
图1是显示本发明的一实施例的血红蛋白的分析结果的图表。
图2是显示本发明的其他实施例的血红蛋白的分析结果的图表。
图3是显示本发明的另一其他实施例的血红蛋白的分析结果的图表。
图4是显示本发明的另一其他实施例的血红蛋白的分析结果的图表。
图5是显示本发明的另一其他实施例的血红蛋白的分析结果的图表。
图6是显示本发明的毛细管电泳装置的一例的结构的图。图6(A)是该例的毛细管电泳装置的俯视图,图6(B)是图6(A)的I-I剖面图,图6(C)是图6(A)的II-II剖面图。
图7是显示本发明的毛细管电泳装置的其他例的结构的图。
图8是显示本发明的毛细管电泳装置的另一其他例的结构的图。
图9是显示本发明的毛细管电泳装置的另一其他例的结构的图。
具体实施方式
本发明中,前述运行缓冲液,是指实际的分离工序中使用的缓冲液(缓冲液,buffer)。本发明的分析方法中,优选通过使前述A层与包含前述含阴极性基化合物的液体接触,从而形成前述B层。该情况下,优选前述包含含阴极性基化合物的液体为包含含阴极性基化合物的运行缓冲液。
本发明的分析方法中,优选通过使前述毛细管内壁与包含聚二烯丙基二甲基氯化铵的液体接触,从而在前述毛细管内壁形成聚二烯丙基二甲基氯化铵制的A层。
本发明的分析方法中,优选在前述毛细管中,在包含含阴极性基化合物的运行缓冲液中添加试样,接着,对毛细管的两端施加电压,使试样与含阴极性基化合物的复合物进行电泳。
本发明的分析方法和毛细管中,形成前述B层的前述含阴极性基化合物、和与前述试样形成复合物的前述含阴极性基化合物,可以相同也可以不同。前述含阴极性基化合物优选含阴极性基的多糖类。作为前述含阴极性基的多糖类,有例如硫酸化多糖类、羧酸化多糖类、磺酸化多糖类、磷酸化多糖类,其中,优选硫酸化多糖类和羧酸化多糖类。作为前述硫酸化多糖类,优选硫酸软骨素、肝素等,更优选硫酸软骨素。作为前述羧酸化多糖类,优选藻酸或其盐(例如,藻酸钠)。硫酸软骨素有A、B、C、D、E、H、K这七种,可使用任一种。
本发明的分析方法和毛细管中,前述无极性聚合物优选硅酮聚合物,前述阳极性基优选氨基、铵基。
本发明中,前述试样优选包含血红蛋白的试样。
本发明的毛细管电泳装置中,包括基板、多个液槽和毛细管,在前述基板上形成有前述多个液槽,前述多个液槽通过前述毛细管连通,前述毛细管可以为前述本发明的毛细管。此时,前述基板的最大长度为例如10~100mm的范围,优选30~70mm的范围,前述基板的最大宽度为例如10~60mm的范围,前述基板的最大厚度为例如0.3~5mm的范围。另外,前述基板的最大长度,是指前述基板的长度方向的最长部的长度,前述基板的最大宽度,是指与前述基板的前述长度方向垂直的方向(宽度方向)的最长部的长度,前述基板的最大厚度,是指与前述基板的前述长度方向和前述宽度方向的两方向垂直的方向(厚度方向)的最长部的长度。这样,本发明的毛细管电泳装置可以为被小型化(微芯片化)的微芯片电泳装置。
接着,详细说明本发明。
如前所述,本发明的毛细管在其内壁夹着前述A层形成有前述B层。
前述毛细管的材质没有特别限制,可列举例如玻璃、熔融二氧化硅、塑料等。玻璃制、熔融二氧化硅制的毛细管的内壁通常为具有阴性的电荷的状态。塑料制的毛细管内壁是根据塑料中的极性基的有无或种类而成为具有阳性或者阴性的电荷的状态,或者为无电荷(无极性)的状态。此外,即使是不带有极性基的塑料,通过导入极性基,可使其成为具有电荷的状态。作为前述塑料制的毛细管,可使用市售品,可列举由例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚醚醚酮(PEEK)等形成的毛细管。前述毛细管的内径为例如10~200μm的范围、优选25~100μm的范围。前述毛细管的长度为例如10~1000mm的范围。
前述A层可使用聚二烯丙基二甲基氯化铵、无极性聚合物和含阳极性基化合物的任一种来形成,也可以将这些组合使用两种以上来形成。
使用聚二烯丙基二甲基氯化铵在前述毛细管内壁形成前述A层时,例如将聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液通入前述毛细管内即可。当前述毛细管由玻璃或熔融二氧化硅形成时,聚二烯丙基二甲基氯化铵牢固吸附于前述毛细管内壁,由此形成A层。该A层不会容易因洗涤而剥离。前述聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液的浓度为例如1~20重量%的范围、优选5~10重量%的范围。优选在通入聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液之前,向前述毛细管中通入碱性水溶液,接着通入提纯水来洗涤。作为前述碱性水溶液,有例如氢氧化钠水溶液。此外,在通入聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液之后,为了除去未参与前述A层的形成中的残留聚二烯丙基二甲基氯化铵,优选在前述毛细管中通入提纯水。
在前述毛细管内壁形成前述A层的无极性聚合物优选硅酮聚合物,这如前所述。使用硅酮聚合物形成前述A层时,例如将含硅酮聚合物的液体通入前述毛细管内即可。当前述毛细管由玻璃或熔融二氧化硅形成时,硅酮聚合物以共价键被牢固固定于前述毛细管内壁,由此形成A层。该A层不容易因洗涤而剥离。
作为前述硅酮聚合物,可列举例如聚硅氧烷和聚硅氮烷。作为前述聚硅氧烷和前述聚硅氮烷,包括例如聚二有机硅氧烷、聚二有机硅氮烷、聚有机氢硅氧烷。作为前述聚硅氧烷和前述聚硅氮烷的具体例,可列举聚二烷基硅氧烷、聚二烷基硅氮烷、聚芳基硅氧烷、聚芳基硅氮烷、聚烷基芳基硅氧烷、聚二芳基硅氧烷、环状硅氧烷以及环状硅氮烷。
包含前述硅酮聚合物的液体,为例如在溶剂中分散或溶解硅酮聚合物而得到的分散液或者溶解液。通入前述硅酮聚合物的分散液或者溶解液之后,通过干燥等蒸发除去溶剂时,在前述毛细管内壁形成前述硅酮聚合物的皮膜层。对其加热时,前述硅酮聚合物通过共价键与玻璃制或者熔融二氧化硅制的毛细管内壁结合。前述加热处理优选例如如下那样实施。首先,在形成有前述硅酮聚合物的皮膜层的毛细管内部通入惰性气体以除去氧气。在该状态下,通过加热等将前述毛细管的两端密封以成为密闭状态。将该毛细管在例如200~450℃下加热处理10分钟~12小时时,前述硅酮聚合物通过共价键与前述毛细管内壁结合。接着,冷却前述毛细管,通过切断等而开放两端,用溶剂将内部洗涤以除去未反应的硅酮聚合物。如此操作,可在毛细管内壁形成硅酮聚合物制的前述A层。前述硅酮聚合物制的A层的厚度为例如50~400nm的范围、优选100~400nm的范围。通过硅酮聚合物形成有A层的毛细管可以使用市售品。
通过前述含阳极性基化合物在前述毛细管内壁形成A层时,例如使用包含前述阳极性基和反应基的化合物即可。当前述毛细管为玻璃制或者熔融二氧化硅制时,可使用具有阳极性基和硅的化合物(甲硅烷基化剂)。作为前述阳极性基,优选氨基、铵基。作为前述含阳极性基化合物优选的是具有氨基和铵基的至少一个阳极性基的甲硅烷基化剂。氨基可以为伯氨、仲氨、叔氨。
前述甲硅烷基化剂可列举例如N-(2-二氨基乙基)-3-丙基三甲氧基硅烷、氨基苯氧基二甲基乙烯基硅烷、3-氨基丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-氨基丙基甲基双(三甲基甲硅烷氧基)硅烷、3-氨基丙基五甲基二硅氧烷、3-氨基丙基硅烷三醇、双(P-氨基苯氧基)二甲基硅烷、1,3-双(3-氨基丙基)四甲基二硅氧烷、双(二甲基氨基)二甲基硅烷、双(二甲基氨基)乙烯基甲基硅烷、双(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氰基丙基(二异丙基)二甲基氨基硅烷、(氨基乙基氨基甲基)苯乙基三甲氧基硅烷、N-甲基氨基丙基三乙氧基硅烷、四(二乙基氨基)硅烷、三(二甲基氨基)氯硅烷、三(二甲基氨基)硅烷等。
前述甲硅烷基化剂中,可使用将硅原子置换成钛或者锆的物质。前述甲硅烷基化剂可使用单独一种,也可组合使用二种以上。
使用前述甲硅烷基化剂的A层的形成,通过例如如下实施。首先,将甲硅烷基化剂溶解或分散到有机溶剂来调制处理液。作为前述处理液的调制中所使用的前述有机溶剂,可使用例如二氯甲烷、甲苯等。前述处理液的甲硅烷基化剂的浓度没有特别限制。将该处理液通入到玻璃制或者熔融二氧化硅制的毛细管中、加热。通过该加热,前述甲硅烷基化剂通过共价键结合于前述毛细管内壁,其结果,阳极性基被配置于前述毛细管内壁。其后,用有机溶剂(二氯甲烷、甲醇、丙酮等)、酸性溶液(磷酸等)、碱性溶液和表面活性剂溶液的至少一种洗涤(后处理)。另外,该洗涤是任意的,但优选实施。形成有使用前述甲硅烷基化剂的A层的毛细管可使用市售品。
接着,在前述A层之上通过含阴极性基化合物形成B层。通过将前述包含含阴极性基化合物的液体与前述A层接触,可形成前述B层。该情况下,可另行调制用于形成B层的液体,从操作效率方面考虑,优选调制包含含阴极性基化合物的运行缓冲液,并将其通入具有前述A层的毛细管中。
前述运行缓冲液没有特别限制,优选为使用酸的缓冲液。前述酸有例如马来酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、邻苯二甲酸、丙二酸、苹果酸。此外,前述运行缓冲液优选包含弱碱。作为前述弱碱,有例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、三羟甲基氨基甲烷等。前述运行缓冲液的pH为例如pH4.5~6的范围。前述运行缓冲液的缓冲液的种类有MES、ADA、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES等。前述运行缓冲液中,前述含阴极性基化合物的浓度为例如0.01~5重量%的范围。
接着,本发明的分析方法例如可对包含血红蛋白的试样按如下操作实施。
首先,对使用通过聚二烯丙基二甲基氯化铵形成前述A层的毛细管进行的分析方法进行说明。首先,准备玻璃制或者熔融二氧化硅制的毛细管。使用泵等施加压力向其中通入氢氧化钠水溶液等碱性溶液,接着,通入提纯水洗涤。前述碱性溶液和前述提纯水的各通液时间为例如1~10分钟,前述通液时的各压力为例如0.05~0.1MPa。接着,通过泵等施加压力向前述毛细管中通入聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液。该通液的时间为例如5~30分钟,前述通液时的压力为例如0.05~0.1MPa。接着,通过泵等施加压力向前述毛细管中通入提纯水,除去残留的聚二烯丙基二甲基氯化铵。该通液时的时间和压力与前述洗涤的情况相同。如此操作,通过聚二烯丙基二甲基氯化铵在毛细管内壁形成A层。另外,通液时间和通液压力由毛细管的内径和长度来适当决定,前述各通液时间和各通液压力在例如内径50μm、长320mm的毛细管中是优选的例子。以下也同样。
接着,通过泵等施加压力,将包含硫酸软骨素等含阴极性基化合物的运行缓冲液通入前述毛细管。该通液的时间为例如10~60分钟,通液的压力为例如0.05~0.1MPa。通过该通液,在前述A层之上层叠由硫酸软骨素等形成的B层。在该状态下,将含血红蛋白的试样导入前述毛细管,对前述毛细管的两端施加电压、进行电泳。前述含血红蛋白的试样没有特别限制,可列举例如对全血进行溶血处理的试样,此外,还可用提纯水、运行缓冲液稀释该试样。前述含血红蛋白的试样的导入从前述毛细管的阳极侧进行。被导入的血红蛋白与前述运行缓冲液中的含阴极性基化合物结合而形成复合物。通过施加电压,前述毛细管内的运行缓冲液中产生电渗流,前述复合物向毛细管的阴极侧移动。前述施加电压的程度为例如5~30kV。该移动通过光学方法检测出。借助光学方法的检测没有特别限制,优选在415nm的波长下进行。
接着,使用通过无极性聚合物和含阳极性基化合物的至少一个形成A层的毛细管进行的分析方法,除了如前所述准备形成有A层的毛细管来使用以外,可与前述同样地实施。
本发明中,作为分析对象的血红蛋白没有特别限制,有例如正常血红蛋白、糖化血红蛋白(例如,HbA1c、不稳定型HbA1c、GHbLys等)、遗传变异型血红蛋白等。本发明中,可将HbA1c与其以外的血红蛋白分离来分析。
接着,举例对本发明的毛细管电泳装置进行说明。这里,本发明的毛细管电泳装置并不限于下述的例子。
图6是表示本发明的毛细管电泳装置的一例。图6(A)是该例的毛细管电泳装置的俯视图,图6(B)是图6(A)的I-I剖视图,图6(C)是图6(A)的II-II剖视图。此外,该图中,为了容易理解,各结构要素的大小和比率等与实际不同。该例的毛细管电泳装置为被小型化(微芯片化)的微芯片电泳装置。如图所示,该微芯片电泳装置包括:基板1、多个(该例中为4个)液槽2a~d、4根毛细管3x1、3x2、3y1和3y2。前述4根毛细管全部为前述本发明的毛细管。前述4个液槽2a~d包括:第1导入槽2a、第1回收槽2b、第2导入槽2c和第2回收槽2d。前述4根毛细管其各自一端在中心部c聚集,十字状连结。其结果,前述4根毛细管其内部被连通。前述基板1设置有用于嵌入前述4根毛细管的孔洞(未图示)。前述毛细管3x1按照其另一端位于前述第1导入槽2a的底面的方式嵌入到前述基板1中。前述毛细管3x2按照其一端位于前述第1回收槽2b的底面的方式嵌入到前述基板1中。前述毛细管3x1和3x2构成试样分析用的毛细管流路3x。前述毛细管3y1按照其另一端位于前述第2导入槽2c的底面的方式嵌入到前述基板1中。前述毛细管3y2按照其另一端位于前述第2回收槽2d的底面的方式嵌入到前述基板1中。前述毛细管3y1和3y2构成试样导入用的毛细管流路3y。前述多个液槽2a~d各自在前述基板1上以凹部形式形成。前述基板1在前述试样导入用的毛细管流路3y的第1回收槽2b侧具有长方体状的开口部(窗)9。另外,该例的微芯片电泳装置为长方体状。但本发明并不限于此。本发明的微芯片电泳装置只要对电泳分析不带来妨碍,则可以为任何形状。此外,该例的微芯片电泳装置的平面形状为长方形。但本发明并不限于此。本发明的微芯片电泳装置的平面形状可以为例如正方形或其他形状。并且,该例的微芯片电泳装置中,前述试样分析用的毛细管流路3x与前述试样导入用的毛细管流路3y的最大长度不同。但本发明并不限于此。本发明的微芯片电泳装置中,前述试样分析用的毛细管流路3x与前述试样导入用的毛细管流路3y的最大长度可以相同。这些以外的结构中,本发明的微芯片电泳装置的结构也不限于该例子。
接着,对该例子的微芯片电泳装置的制造方法进行说明。其中,前述微芯片电泳芯片也可通过下述的制造方法以外的方法制造。
该例的微芯片电泳装置中,作为前述基板1,可使用由例如玻璃、聚合物材料等形成的基板。作为前述玻璃材料,可列举例如合成石英玻璃、硼硅酸玻璃等。作为前述聚合物材料,可列举例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃聚合物(COP)、聚碳酸酯(PC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚乳酸等。
该例的微芯片电泳装置中,前述基板1的最大长度、最大宽度和最大厚度如前所述。
前述4根毛细管的内径各自如前述本发明的毛细管的内径。前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y的最大长度为例如0.5~15cm的范围。前述4根毛细管的长度各自根据前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y的最大长度来决定。
前述多个液槽2a~d的容积没有特别限制,例如分别为1~1000mm3的范围,优选50~100mm3的范围。图6中,前述多个液槽2a~d的形状为圆柱状。但本发明并不限于此。本发明的微芯片电泳装置中,前述多个液槽的形状只要对后述试样的导入和回收没有妨碍则没有特别限制,可以制成例如四棱柱状、四棱锥状、圆锥状、将这些组合的形状等任意的形状。此外,前述多个液槽的容积和形状可全部相同、也可各自不同。
该例的微芯片电泳装置的制造工序的一例如下所示。其中,前述微芯片电泳装置也可以用下述的制造工序以外的工序制造。
首先,制作前述基板1。对前述基板1的前述4个液槽2a~d和前述开口部(窗)9的形成方法没有特别限制。例如,前述基板1的材质为前述玻璃时,作为前述形成方法,可列举例如超声波加工等。例如,前述基板1的材质为前述聚合物材料时,作为前述形成方法,可列举例如使用模具的注射成型、注入成型、挤压成型等成型法、切削加工法等。前述4个液槽2a~d和前述开口部(窗)9可各自单独形成,也可将全部同时形成。单独形成前述4个液槽2a~d和前述开口部(窗)9时,可以以任何顺序形成。通过前述使用模具的方法等,同时形成前述4个液槽2a~d和前述开口部(窗)9全部时,工序少,此为优选。
接着,将前述4根毛细管嵌入前述基板1。这样操作,可得到该例的微芯片电泳装置。
前述微芯片电泳装置还可具有多个电极。图7显示具有前述多个电极的该例的微芯片电泳装置。该图中,在与图6同一部分标有同一符号。如图所示,该微芯片电泳装置具有4根电极6a~d。前述4根电极6a~d各自按照其一端位于前述多个液槽2a~d内的方式嵌入前述基板1。前述4根电极6a~d可以在例如制造前述基板1时通过预先在形成于前述基板1侧面形成前述4根电极6a~d的导入孔而容易地配置。另外,前述微芯片电泳装置中,前述多个电极为任意的结构部件。前述多个电极还可以在例如使用前述微芯片电泳装置时插入到前述多个液槽内。
前述多个电极6a~d只要可用于电泳法则可以是任何电极。前述多个电极6a~d为例如各自为不锈钢(SUS)制电极、铂(Pt)电极、金(Au)电极等。
前述微芯片电泳装置可以进一步包含用于将含血红蛋白等的试样溶血、且稀释的前处理槽。前述含血红蛋白的试样的溶血处理没有特别限制,可以为例如用溶血剂将前述含血红蛋白的试样溶血的处理。前述溶血剂破坏例如前述含血红蛋白的试样中的血球成分的血球膜。作为前述溶血剂,可列举例如前述运行缓冲液、皂甙、NACALAI TESQUE,INC.制的商品名“TritonX-100”等,特别优选前述运行缓冲液。前述前处理槽优选例如与前述导入槽连通。前述前处理槽形成于其被连通的液槽、例如前述第2导入槽2c的附近等适当的位置即可。有前述前处理槽的情形中,前述含血红蛋白的试样被导入到前述前处理槽。由此,被前处理的前述含血红蛋白的试样通过连结前述前处理槽和与其连通的液槽例如前述第2导入槽2c的流路而被导入到前述第2导入槽2c。前述前处理槽可以为用于将前述含血红蛋白的试样溶血的槽与用于稀释前述含血红蛋白的试样的槽这2个槽连通的结构。
前述微芯片电泳装置可以进一步具有分析部。图8是显示具有前述分析部的该例的微芯片电泳装置。该图中,在与图6和图7相同的部分标记有同一符号。如图所示,该微芯片电泳装置具有分析部7。该例的微芯片电泳装置中,前述分析部7为检测器(线检测器)。前述线检测器直接配置于前述毛细管3x2之上,其配置方式为:位于前述试样分析用的毛细管流路3x与前述试样导入用的毛细管流路3y的交差部分的前述第1的回收槽2b侧。该微芯片电泳装置中,基板1除了设有用于嵌入前述4根毛细管的孔洞以外,还设有用于嵌入前述分析部(线检测器)7的孔洞(未图示)。前述线检测器内设光源和检测部。前述线检测器从前述光源向试样发光并通过前述检测部检测来自试样的反射光,从而测定吸光度。前述分析部7并不限于前述线检测器,只要可进行例如包含血红蛋白的试样的分析,则可以为任何的检测器。例如,前述分析部7可以由配置于前述微芯片电泳装置的下方的光源、和配置于对应于前述线检测器的配置处的位置的检测部构成。该情况下,通过从前述光源向试样发光并通过前述检测部检测来自试样的透过光,从而测定吸光度。
图9是显示本发明的微芯片电泳装置的另一其他例。该图中,在与图8相同的部分标记有同一符号。如图所示,该例的微芯片电泳装置除了分析部7不同以外,具有与图8所示的微芯片电泳装置同样的结构。如该例那样,前述分析部7可以在1点测定吸光度。
使用图8和9所示的微芯片电泳装置的本发明的分析方法,例如对包含血红蛋白的试样可通过如下操作实施。
首先,对前述4根毛细管使用由聚二烯丙基二甲基氯化铵形成前述A层的毛细管时的分析方法进行说明。首先,通过泵等施加压力,将氢氧化钠水溶液等碱性水溶液通入前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y,接着,通入提纯水洗涤。前述碱性水溶液和前述提纯水的各通液时间和前述通液时的压力为例如如前所述。接着,通过泵等施加压力,将聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液通入前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y。该通液的时间和通液的压力为例如如前所述。接着,通过泵等施加压力,将提纯水通入前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y,除去残留的聚二烯丙基二甲基氯化铵。该通液的时间和通液的压力为例如如前所述。这样操作,由聚二烯丙基二甲基氯化铵在前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y的内壁形成A层。
接着,通过泵等施加压力,将包含硫酸软骨素等含阴极性基的多糖类的运行缓冲液通入前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y。该通液的时间和通液的压力为例如如前所述。通过该通液,在前述A层之上层叠由硫酸软骨素等形成的B层。接着,通过压力或毛细管作用,将前述运行缓冲液填充到前述试样分析用的毛细管流路3x和前述试样导入用的毛细管流路3y。
另外,在微芯片电泳装置非使用时(非分析时),如果预先完成至前述运行缓冲液的填充工序,则可省略前述各工序并直接进入以下的工序,故优选。
接着,在前述第2导入槽2c中导入含血红蛋白的试样。作为前述含血红蛋白的试样,如前所述。微芯片电泳装置具有前述前处理槽(未图示)时,将前述含血红蛋白的试样导入前述前处理槽,在其中进行前处理。接着,对前述电极6c和前述电极6d施加电压,使前述试样导入用的毛细管流路3y的两端产生电位差。由此,将前述含血红蛋白的试样导入前述试样导入用的毛细管流路3y。被导入的血红蛋白与前述运行缓冲液中的含阴极性基的多糖类结合形成复合物。通过施加电压,前述试样导入用的毛细管流路3y内的运行缓冲液中产生电渗流,前述复合物移动至前述试样分析用的毛细管流路3x与前述试样导入用的毛细管流路3y的交差部分。
前述电极6c与前述电极6d之间的电位差为例如0.5~5kV的范围。
接着,对前述电极6a和前述电极6b施加电压,使前述试样分析用的毛细管流路3x的两端产生电位差。这样,将在两端具有电位差的毛细管流路瞬间从前述试样导入用的毛细管流路3y切换到前述试样分析用的毛细管流路3x,从而如图8和9的箭头所示那样,使前述试样8从前述试样分析用的毛细管流路3x与前述试样导入用的毛细管流路3y的交差部分移动至前述第1的回收槽2b侧。
前述电极6a与前述电极6b之间的电位差为例如0.5~5kV的范围。
接着,通过前述检测器7,检测出根据移动速度的差而分离的前述含血红蛋白的试样中的各成分。由此,可分离前述含血红蛋白的试样中的各成分来分析。
接着,在前述4根毛细管中使用由无极性聚合物和含阳极性基化合物的至少一个形成A层的毛细管时的分析方法如前所述,除了使用形成有A层的毛细管以外,可以与前述同样操作来实施。
实施例
接着,对本发明的实施例进行说明。
(实施例1)
准备熔融二氧化硅制的毛细管(全长32cm、有效长8.5cm、内径50μm)。在该毛细管中以压力0.1MPa(1000mbar)通入氢氧化钠水溶液(1mol/L)10分钟,接着,在与前述相同的压力下通入提纯水20分钟、洗涤。接着,在与前述相同的压力下通入聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液(10重量%)30分钟,接着,在与前述相同的压力下通入提纯水20分钟,从而在前述毛细管的内壁形成聚二烯丙基二甲基氯化铵制的A层。接着,准备在100mM苹果酸和精氨酸水溶液中添加0.5重量%的比例的硫酸软骨素而得到的运行缓冲液(pH5.5)。在与前述相同的压力下将该运行缓冲液通入形成有前述A层的毛细管,在前述A层之上形成前述B层。在前述毛细管内填充有运行缓冲液的状态下,将由血红蛋白溶解于提纯水而成的试样注入前述毛细管内,对前述毛细管的两端施加10kV电压,进行电泳。前述含血红蛋白的试样的注入是从前述毛细管的阳极侧进行。在415nm的吸光度下检测出移动的血红蛋白。将该结果示于图1的图表中。如图所示,本实施例中,可将正常血红蛋白(HbA0)与糖化血红蛋白(HbA1c)分离来检测。此外,本实施例中使用的毛细管在洗涤之后仅如前所述那样通入运行缓冲液就形成前述B层,可马上进行分析。
(实施例2)
准备在内壁具有由具有氨基的甲硅烷基化剂以共价键固定形成的A层的熔融二氧化硅制的毛细管(全长32cm、有效长8.5cm、内径50μm)。在该毛细管中以压力0.1MPa(1000mbar)通入提纯水20分钟、洗涤。接着,准备在100mM苹果酸和精氨酸水溶液中以0.5重量%的比例添加硫酸软骨素而得到的运行缓冲液(pH5.5)。在与前述相同的压力下将该运行缓冲液通入前述毛细管,在前述A层之上形成前述B层。在前述毛细管内填充有运行缓冲液的状态下,将由血红蛋白溶解于提纯水而成的试样注入前述毛细管内,对前述毛细管的两端施加10kV电压,进行电泳。前述含血红蛋白的试样的注入是从前述毛细管的阳极侧进行。在415nm的吸光度下检测出移动的血红蛋白。该结果如图2的图表所示。如图所示,本实施例中,可将正常血红蛋白(HbA0)与糖化血红蛋白(HbA1c)分离来检测。此外,本实施例中使用的毛细管在洗涤之后仅如前所述那样通入运行缓冲液就形成前述B层,可马上进行分析。于是,用与前述同样的试样实施10次相同的分析,评价再现性。该结果示于下述表1。下述表1中,相对面积(%)为相对于总峰面积的正常血红蛋白(HbA0)和糖化血红蛋白(HbA1c)的各峰面积的比率(%)。如下述表1所示,在正常血红蛋白(HbA0)和糖化血红蛋白(HbA1c)的各个中,变差系数(CV)的值小,由此,本发明的分析方法可以说再现性优异。
表1
(实施例3)
准备在内壁具有由具有氨基的甲硅烷基化剂以共价键固定形成的A层的熔融二氧化硅制的毛细管(全长32cm、有效长8.5cm、内径50μm)。在该毛细管中以压力0.1MPa(1000mbar)通入提纯水20分钟、洗涤。接着,准备在100mM苹果酸和精氨酸水溶液中以0.8重量%的比例添加藻酸钠而得到的运行缓冲液(pH5.5)。在与前述相同的压力下将该运行缓冲液通入前述毛细管,在前述A层之上形成前述B层。在前述毛细管内填充有运行缓冲液的状态下,将由血红蛋白溶解于提纯水而成的试样注入前述毛细管内,对前述毛细管的两端施加10kV电压,进行电泳。前述含血红蛋白的试样的注入是从前述毛细管的阳极侧进行。在415nm的吸光度下检测出移动的血红蛋白。该结果示于图3的图表。如图所示,本实施例中,可将正常血红蛋白(HbA0)与糖化血红蛋白(HbA1c)分离来检测。此外,本实施例中使用的毛细管在洗涤之后仅如前所述那样通入运行缓冲液就形成前述B层,可马上进行分析。
(实施例4)
准备在内壁具有由具有氨基的甲硅烷基化剂以共价键固定形成的A层的熔融二氧化硅制的毛细管(全长32cm、有效长8.5cm、内径50μm)。在该毛细管中以压力0.1MPa(1000mbar)通入提纯水20分钟、洗涤。接着,准备在100mM苹果酸和精氨酸水溶液中添加0.5重量%的比例的肝磷酯钠的运行缓冲液(pH5.5)。在与前述相同的压力下将该运行缓冲液通入前述毛细管,在前述A层之上形成前述B层。在前述毛细管内填充有运行缓冲液的状态下,将由血红蛋白溶解于提纯水而成的试样注入前述毛细管内,对前述毛细管的两端施加10kV电压,进行电泳。前述含血红蛋白的试样的注入是从前述毛细管的阳极侧进行。在415nm的吸光度下检测出移动的血红蛋白。该结果示于图4的图表。如图所示,本实施例中,可将正常血红蛋白(HbA0)与糖化血红蛋白(HbA1c)分离来检测。此外,本实施例中使用的毛细管在洗涤之后仅如前所述那样通入运行缓冲液就形成前述B层,可马上进行分析。
(实施例5)
准备在内壁具有由聚(二甲基硅氧烷)以共价键固定形成的A层的熔融二氧化硅制的毛细管(全长32cm、有效长8.5cm、内径50μm)。在该毛细管中以压力0.1MPa(1000mbar)通入提纯水20分钟、洗涤。接着,准备在100mM苹果酸和精氨酸水溶液中添加1.0重量%的比例的硫酸软骨素得到的运行缓冲液(pH5.5)。在与前述相同的压力下将该运行缓冲液通入前述毛细管,在前述A层之上形成前述B层。在前述毛细管内填充有运行缓冲液的状态下,将由血红蛋白溶解于提纯水而成的试样注入前述毛细管内,对前述毛细管的两端施加10kV电压,进行电泳。前述含血红蛋白的试样的注入是从前述毛细管的阳极侧进行。在415nm的吸光度下检测出移动的血红蛋白。该结果示于图5的图表。如图所示,本实施例中,可将正常血红蛋白(HbA0)与糖化血红蛋白(HbA1c)分离来检测。此外,本实施例中使用的毛细管在洗涤之后仅如前所述那样通入运行缓冲液就形成前述B层,可马上进行分析。于是,用与前述同样的试样实施10次相同的分析,评价再现性。该结果示于下述表2。下述表2中,与前述表1同样,相对面积(%)为相对于总峰面积的正常血红蛋白(HbA0)和糖化血红蛋白(HbA1c)的各峰面积的比率(%)。如下述表2所示,在正常血红蛋白(HbA0)和糖化血红蛋白(HbA1c)的各个中,变差系数(CV)的值小,由此,本发明的分析方法可以说再现性优异。
表2
工业上的可利用性
如以上所示,根据本发明,可通过毛细管电泳法容易且高精度实施血红蛋白等试样的分析。而且,本发明由于采用毛细管电泳法,因而还可使分析装置小型化。本发明可适用于临床检查、生化检查、医学研究等对血红蛋白等试样分析的所有领域,其用途没有限定,可适用于广泛的领域。
Claims (18)
1.一种通过毛细管电泳法分析试样的方法,其特征在于,该分析方法包括:
准备用于前述毛细管电泳法的毛细管的工序;和,
在前述毛细管中,使试样与含阴极性基化合物结合而成的复合物进行电泳的工序,
前述毛细管为如下的毛细管:在前述毛细管内壁层叠有下述A层,在前述A层之上层叠有下述B层,
A层:夹层,由选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、无极性聚合物和含阳极性基化合物所组成的组中的至少一种形成、
包含前述聚二烯丙基二甲基氯化铵时,前述聚二烯丙基二甲基氯化铵通过物理吸附被固定于前述毛细管内壁、
包含前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个时,前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个通过共价键被固定于前述毛细管内壁;
B层:阴极性层,由含阴极性基化合物形成。
2.根据权利要求1所述的分析方法,通过使前述A层与包含前述含阴极性基化合物的液体接触,从而形成前述B层。
3.根据权利要求2所述的分析方法,前述包含含阴极性基化合物的液体为包含含阴极性基化合物的运行缓冲液。
4.根据权利要求1所述的分析方法,通过使前述毛细管内壁与包含聚二烯丙基二甲基氯化铵的液体接触,从而在前述毛细管内壁形成聚二烯丙基二甲基氯化铵制的A层。
5.根据权利要求1所述的分析方法,在前述毛细管中,在包含含阴极性基化合物的运行缓冲液中添加试样,接着,在前述毛细管的两端施加电压,使前述试样与含阴极性基化合物的复合物进行电泳。
6.根据权利要求1所述的分析方法,前述含阴极性基化合物为含阴极性基的多糖类。
7.根据权利要求6所述的分析方法,前述含阴极性基的多糖类为选自硫酸化多糖类、羧酸化多糖类、磺酸化多糖类和磷酸化多糖类所组成的组中的至少一种多糖类。
8.根据权利要求7所述的分析方法,前述硫酸化多糖类为硫酸软骨素。
9.根据权利要求1所述的分析方法,前述无极性聚合物为硅酮聚合物,前述含阳极性基化合物为具有氨基和铵基中至少一个阳极性基的甲硅烷基化剂。
10.根据权利要求1所述的分析方法,前述试样为包含血红蛋白的试样。
11.一种毛细管,其特征在于,其为用于权利要求1所述的分析方法的毛细管电泳用的毛细管,其中,在前述毛细管内壁层叠有下述A层,在前述A层之上层叠有下述B层,
A层:夹层,由选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、无极性聚合物和含阳极性基化合物所组成的组中的至少一种形成、
包含前述聚二烯丙基二甲基氯化铵时,前述聚二烯丙基二甲基氯化铵通过物理吸附被固定于前述毛细管内壁、
包含前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个时,前述无极性聚合物和前述含阳极性基化合物的至少一个通过共价键被固定于前述毛细管内壁;
B层:阴极性层,由含阴极性基化合物形成。
12.根据权利要求11所述的毛细管,前述含阴极性基化合物为含阴极性基的多糖类。
13.根据权利要求12所述的毛细管,前述含阴极性基的多糖类为选自硫酸化多糖类、羧酸化多糖类、磺酸化多糖类和磷酸化多糖类所组成的组中的至少一种多糖类。
14.根据权利要求13所述的毛细管,前述硫酸化多糖类为硫酸软骨素。
15.根据权利要求11所述的毛细管,前述无极性聚合物为硅酮聚合物,前述含阳极性基化合物为具有氨基和铵基中至少一个阳极性基的甲硅烷基化剂。
16.一种毛细管电泳装置,其特征在于,该毛细管电泳装置用于权利要求1所述的分析方法,其中,包括权利要求11所述的毛细管。
17.根据权利要求16所述的毛细管电泳装置,其包括基板、多个液槽和毛细管,在前述基板上形成有前述多个液槽,前述多个液槽通过前述毛细管连通,前述毛细管为权利要求11所述的毛细管。
18.根据权利要求17所述的毛细管电泳装置,前述基板的最大长度为10~100mm的范围,前述基板的最大宽度为10~60mm的范围,前述基板的最大厚度为0.3~5mm的范围。
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