CN102498392B - 通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白分析及测定、用于毛细管电泳的缓冲液组合物及试剂盒 - Google Patents

通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白分析及测定、用于毛细管电泳的缓冲液组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种通过糖化血红蛋白的毛细管电泳进行分析的方法，所述糖化血红蛋白包含于生物试样中且包含至少一条珠蛋白链，该珠蛋白链包含结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基，其中所述方法包括使用包含至少一种化合物的缓冲液组合物，该化合物能够专一性复合一种或多种糖化血红蛋白的葡萄糖残基并且在碱性pH下能够向所述血红蛋白传递多个负电荷。举例而言，所述化合物可为3，4-或3，5-二羧基苯基硼酸、优选为3，5-二羧基苯基硼酸。所述方法尤其可用于分离及测定生物试样中存在的HbA1c血红蛋白，该生物试样任选包含其它血红蛋白、具体而言其它次要部分。本发明还涉及用于该分析中的缓冲液组合物、以及用于通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白的分析及测定的试剂盒。

Description

通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白分析及测定、用于毛细管电泳的缓冲液组合物及试剂盒
技术领域
本申请涉及通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白(具体而言血红蛋白A1c)的分析及测定领域。
本发明涉及一种通过生物试样的毛细管电泳来进行分析的方法，该生物试样包含一种或若干种血红蛋白且具体而言一种或若干种糖化血红蛋白，以及涉及用于该分析的适当缓冲液组合物、及用于通过毛细管电泳进行的糖化血红蛋白的分析及测定的试剂盒。
背景技术
血红蛋白(Hb)是通常包含四个亚单元的球形分子，各亚单元由结合至血红蛋白部分的多肽链构成。多肽链笼统地由名称血红蛋白分子的“珠蛋白部分”命名。
所有人类血红蛋白由四条多肽链构成，两条相同链为一组分成两组。在成年人类中，通常存在三种类型的血红蛋白：血红蛋白A(HbA)，其占绝大多数(其通常代表成年人中的约97％血红蛋白)，其由2条α链及两条β链构成(血红蛋白α2β2)；血红蛋白A2(HbA2，其通常代表成年人中的约1-3％血红蛋白)，其由两条α链及两条δ链构成(血红蛋白α2δ2)；及胎儿血红蛋白(HbF)，其由两条α链及两条γ链构成(血红蛋白α2γ2)，其仅存在痕量(在成年人中通常小于1％血红蛋白)且限于限制细胞群体(“F细胞”)。
血红蛋白含有称为次要物质的物质；其是糖化血红蛋白。
糖化血红蛋白(亦称为糖基化血红蛋白或糖基血红蛋白)对应于通过在珠蛋白的胺官能团(NH2)上结合糖(主要为葡萄糖)而修饰的血红蛋白分子组；血红蛋白的NH2基团与源自还原糖的醛基团发生缩合。随后通过阿马道里重排稳定此非酶促反应。潜在糖化位点是血红蛋白的四条珠蛋白链(视血红蛋白的类型为α链及β、δ、或γ链)的N-端氨基酸及血红蛋白的珠蛋白链中的游离氨基-ε基团(具体而言，赖氨酸残基的那些)。
存在许多形式的糖化血红蛋白；其视结合糖的数量、珠蛋白链及所述链上所结合糖的性质及所述糖于珠蛋白链上的位置而定。
当考虑任一NH2残基上的糖化血红蛋白分子时，使用术语“总糖化血红蛋白”。
术语“血红蛋白A1(HbA1)”是指有一个糖分子结合至蛋白质一或两条β链的N-端氨基酸的血红蛋白A分子。非均相的A1部分具体而言包含次要部分A1a、A1b及尤其A1c。血红蛋白A1a(HbA1a)包括血红蛋白A1a1(HbA1a1)(其中结合至N-端氨基酸的糖是果糖1，6-二磷酸)及血红蛋白A1a2(HbA1a2)(其中结合至N-端氨基酸的糖是葡萄糖-6-磷酸)。在血红蛋白A1b(HbA1b)的情形下，结合至N-端氨基酸的糖是丙酮酸。最终，结合至血红蛋白A1c(HbA1c)的β链的N-端氨基酸的糖是葡萄糖；HbA1c通过使一个葡萄糖分子与β链的N-端缬氨酸的NH2基团缩合获得，源自先前形成的不稳定醛亚胺(称为不稳定HbA1c或preA1c)的重排(阿马道里重排)形成稳定酮-胺。
最终，术语血红蛋白A0(HbA0)通常涵盖不包含结合至β链的N-端位置处的氨基酸的糖的非糖化A血红蛋白及糖化A血红蛋白。
蛋白质糖化(包括糖化血红蛋白且具体而言血红蛋白A1c，以及其他)是由血液中过高浓度的糖造成(如同糖尿病的情形一般)。蛋白质的糖化会改变其功能，从而造成细胞损伤、组织损伤及血管老化，并参与若干疾病(例如，动脉硬化、肾机能不全、糖尿病性视网膜病及白内障)的发展。血红蛋白一旦糖化则不能充分运输氧。
在所包括的所有血红蛋白群及亚群中，HbA1c尤其令人感兴趣，此乃因其用作患者的糖尿病状态的长效标记。HbA1c的形成取决于血糖(血液中的葡萄糖浓度)。其参与红血细胞的寿命的整个过程，通常为120天。因而，HbA1c的血液浓度指示测定前2-3个月期间的平均血糖。HbA1c的血液浓度的评价可指示该阶段期间的长期高血糖症。HbA1c的血液浓度并不受血液葡萄糖含量的短期波动的影响。因而，通过测量两个日期之间的HbA1c含量，可监测糖尿病的演化。
在糖尿病患者中，目的是获得与特征为良好血糖平衡的图表尽可能接近的HbA1c含量。在血液中，与A血红蛋白(糖化血红蛋白及非糖化血红蛋白)的总浓度相比，具有正常血糖的非糖尿病人类的参照值是4％至6％HbA1c(即，20-42mmol/mol；Panteghini等人，2007)。
因而，对糖化血红蛋白的检测、具体而言HbA1c含量升高的检测备受关注，用于诊断糖尿病(1型或2型)或监测糖尿病患者、具体而言用于评价抵抗糖尿病(1型或2型)的治疗功效。
然而，阐释结果偶尔可较为困难，此乃因许多因素(具体而言异常血红蛋白的存在)可窜改所述结果。
实际上，在某些患者中出现称为“异常”或变体、具体而言由字母S、C、D、E、H及J表示的血红蛋白。血红蛋白A部分或完全由一种或若干种异常血红蛋白替代。具体而言，其源自某些珠蛋白链的合成减少和/或由于另一氨基酸取代一氨基酸而对α、β、γ或δ链的结构的修饰。因而，β链的修饰可产生例如S或C血红蛋白(其中β链中6位置的谷氨酸分别经缬氨酸或赖氨酸取代的α2β2血红蛋白)。
这些异常血红蛋白亦容易发生糖化。因而，存在与HbA1c一样包含一个结合至β链上的N-端缬氨酸的葡萄糖分子的血红蛋白S1c(HbS1c)及C1c(HbC1c)(Abraham等人，1984)。
糖化血红蛋白且具体而言血红蛋白HbA1c的分析及测定方法可分为2大类。
第一类(主要类)包括诸如免疫测定或亲和层析等方法。其是基于结合至血红蛋白的糖分子的结构特征。作为一实例，Wilson等人于1993的公开案及专利US 6,162,645阐述一种通过亲和层析测定人类血样中发现的糖化血红蛋白的方法。该方法是基于使用经由聚阴离子化合物(例如，聚丙烯酸)偶联至硼酸(boronic acid)、苯基硼酸、正硼酸(boric acid)或类似硼酸盐化合物的固体带正电相。当用该固相温育欲分析血样时，使该试样中存在的糖化血红蛋白分子的葡萄糖残基与硼酸盐化合物复合。由此将糖化血红蛋白分子接枝于固相上。随后可相对于未固定血红蛋白的比例对固定于固相上的糖化血红蛋白的比例进行定量。通过测量荧光的消光(Wilson等人，1993)或通过使用针对人类血红蛋白的标记抗体(US 6,162,645)实施此测定。
用于糖化血红蛋白分析及测定的第二类方法包括离子交换层析或电泳。其利用分子的理化特性且基于糖化蛋白质与非糖化蛋白质之间存在的电荷差。
在阐述于文献中的可测定糖化血红蛋白的各种分析方法中，电泳方法分成若干类：凝胶分析包括聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析(Beccaria，1978；Simon，1982；Stickland，1982；Bosisio，1994)及琼脂凝胶分析(US 5,246,558；US 4,222,836；Menard，1980)。毛细管电泳分析包括等电聚焦分析(Molteni，1994；Hempe，1994)、使用抗-A1c抗体的自由溶液分析(US 5,431,793)、使用裸毛细管的自由溶液分析(US 5,599,433)及使用动态涂布的自由溶液分析(EP 0 733 900 A2；US 5,611,903)。
通过生物试样的电泳来进行的分析可分离试样中存在的各种蛋白质、具体而言各种血红蛋白，且使得能够测定生物试样中之一种或若干种目标蛋白质的量和/或比例。在毛细管电泳中，在填充有电解质的毛细管中，生物试样的蛋白质随其质量及其电荷的变化在电场效应下自阳极迁移至阴极。其由此产生包含一系列峰(亦称为部分)的电泳迁移曲线，所述峰的每一种对应于一种或若干种蛋白质。异常血红蛋白(例如HbS、HbC及HbE)具有不同于HbA的电泳迁移率。此外，由于结合至β链的N-端氨基酸的糖残基，HbA1具有减少的等电点且因此具有稍微不同于其它HbA0型血红蛋白的电荷。因而，在电泳场(electrophoretic field)中或在离子交换树脂中，HbA1的迁移速率不同于HbA0的迁移速率，这使得可分离具有不同电荷的HbA1与HbA0。
毛细管电泳的优势亦在于以下事实：仅需要极少量欲分析的生物试样。此外，通过此技术的分离可极为快速，此乃因为在分离期间可使用高电压而不会造成试样加热过度。
在经涂布毛细管中实施通过等电聚焦的分析(Molteni，1994；Hempe，1994)。使用甲基纤维素进行涂布。所用阴极电解质是氢氧化钠(NaOH)且阳极电解质是磷酸(H3PO4)。通过使用两性电解质，此分析使得能够分离血红蛋白的各种变体，包括HbA1c，其峰极其接近HbA的峰(ΔpI＜0.10)。尽管此方法运行良好，但按常规并不易于实施且需极大精确度，具体而言在两性电解质的pH范围方面(HbA1c的等电点(pI)极为接近HbA0的等电点)。
在碱性pH(pH 8-10)的正硼酸盐(borate)缓冲液中，使用已与抗HbA1c单克隆抗体反应的试样，实施利用抗-HbA1c抗体的自由溶液分析(US 5,431,793)。更确切而言，使用未预先与抗-HbA1c抗体反应的工作试样产生第一电泳图。获得单峰，面积为x，其含有所有血红蛋白(包括HbA1c)。通过分析已与抗-HbA1c抗体接触的工作试样获得第二电泳图。由此分离未结合的抗-HbA1c抗体、抗-HbA1c抗体/HbA1c复合物及未被抗体的复合的血红蛋白。随后通过第一电泳图的峰下面积与第二电泳图中未复合抗-HbA1c抗体的血红蛋白之峰下面积(面积为y)之间的差值(即x-y值)来测定HbA1c的量。由此证明此方法实施起来耗时且复杂。
使用裸毛细管的自由溶液分析方法(US 5,599,433)于碱性pH(pH9-12)下包括结合至血红蛋白的糖复合剂(正硼酸盐)及两性缓冲液(CAPS)。在所述条件下获得的曲线(示于本申请的图1中)显示HbA1的峰(在专利US-5,599,433中阐述为HbA1c的峰)与HbA0的峰(参见实施例1)的分离相当小。此外，已纯化次要部分的分析显示HbA1a、A1b部分与HbA1c共迁移，此会干扰最终测定结果(参见本申请的实施例2及图2)。事实上，该技术分离HbA0与HbA1部分，但不分离HbA1部分本身。
利用动态双涂布的毛细管分析的技术(EP 0 733 900 A2；US5,611,903)仅用于基于市售毛细管电泳(Analis CEofixTM HbA1c试剂盒)的测试。其由用含有聚阳离子的“起始剂”(存于溶液中，pH 4.6)首次洗涤毛细管组成，从而用该聚阳离子涂布毛细管壁。随后利用含有聚阴离子的分析缓冲液(pH 4.6)实施第二次洗涤，其具有通过与聚阳离子相互作用提供第二涂布层的效应。则毛细管内壁上存在的负电荷的量甚至比裸毛细管上的高，从而产生更高电渗回流(electroosmotic flux)。所分析的各种形式的血红蛋白(包括糖化A1血红蛋白)之间获得的拆分是令人满意的，且分析时间较短。自实践角度来讲，必须在每一分析之间使用由试剂盒制造商提供的精确程序重新施加此双重涂布，但该程序仅针对单毛细管设备((P/ACE，Beckman)，不适于常规分析)阐述。
因而，需要可有效分离糖化血红蛋白(具体而言HbA1c)与含有其它血红蛋白的生物试样中存在的其它血红蛋白、变体、干扰形式(不稳定形式、乙酰化形式、氨甲酰化形式)及其它次要部分(尤其HbA1a及HbA1b)的试剂及简单实践方法。理想地，此一方法可直接自所得电泳曲线实施糖化血红蛋白(具体而言HbA1c)的半定量或定量测定。
发明内容
本发明提出一种替代性毛细管电泳方法，其使得可对一种或若干种糖化血红蛋白实施半定量或定量分析，该糖化血红蛋白包含于包含(具体而言)其它血红蛋白(糖化和/或非糖化)的生物试样中且包含至少一条珠蛋白链，该珠蛋白链包含结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。本发明的所述方法利用结合至所述糖化血红蛋白的葡萄糖分子的结构特性及试样的各种血红蛋白之间存在的电荷差。
本发明者已显示，通过使用特定缓冲液组合物可获得糖化血红蛋白的大大改良的分离、且更具体而言HbA1c的大大改良的分离，所述糖化血红蛋白包含结合至至少一条珠蛋白链上、且具体而言链β上的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。
本发明方法的优势之一的：由于使用该缓冲液组合物，故对应于存于生物试样中的一种或若干种类型的目标糖化血红蛋白(一种或若干种类型的血红蛋白，其包含结合至至少一条珠蛋白链上的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基，例如HbA1c)的电泳峰相对于不使用缓冲液组合物时可获得的峰位置发生位移。此位移并不干扰试样中其它蛋白质、具体而言其它血红蛋白(糖化和/或非糖化)的分离。具体而言，此使得可分离HbA1c与其它次要HbA1(具体而言HbA1a及HbA1b)。因此，意味着分析结果可可靠地读取且可使得准确测定一种或若干种目标糖化血红蛋白，所述糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基，其中一个葡萄糖结合至至少一条珠蛋白链的N-端位置处的氨基酸(例如，血红蛋白A1c)。
因而，本发明方法是用于建立糖尿病患者的诊断或监测、具体而言用于评价抗糖尿病治疗效力的所选方法。
因而，本申请提供一种通过糖化血红蛋白(一种或若干种糖化血红蛋白)的毛细管电泳来进行分析的方法，所述糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基且包含于包含一种或若干种血红蛋白的生物试样中，该方法包括使用包含至少一种化合物的缓冲液组合物，该化合物能够专一性复合生物试样的糖化血红蛋白(一种或若干种糖化血红蛋白)的葡萄糖残基(一个或若干个残基)并且于碱性pH(即大于7的pH)下提供所述糖化血红蛋白若干负电荷。
本申请上下文中所用术语“若干”意指至少两个、即两个或多于两个，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个。
本申请上下文中所用术语“至少一个”意指一个或若干。
本申请上下文中所用术语“血红蛋白”意指血红蛋白的任一形式或部分(包括次要部分)(不管其正常或异常)、以及所述血红蛋白的许多变体(已阐述至少1000种血红蛋白变体)。
本申请上下文中所用术语“糖化血红蛋白”意指任何通过将一个或若干个糖(具体而言，一个或若干个葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖1，6-二磷酸或丙酮酸)结合至一条或若干条珠蛋白链(任何珠蛋白链)来修饰的血红蛋白。可将所述糖结合至珠蛋白链上的N-端位置处的氨基酸和/或结合至具有游离氨基酸基团的氨基酸(例如，赖氨酸)。
本申请中所用术语“珠蛋白链”意指本领域技术人员已知的任一珠蛋白链、具体而言选自alpha(α)、beta(β)、delta(δ)及gamma(γ)链的链(不管其正常或异常)、或所述链中之一的变体。根据一特定实施方式，所述“珠蛋白链”是β链，例如A1血红蛋白(具体而言A1c、S或C)的β链。
当在本发明实施方式中提及“糖化血红蛋白”时，应了解，所述实施方式对本申请中引用的每一特定类型的糖化血红蛋白具有特定应用。
除非另有说明，否则本申请中所示的每一实施方式皆可独立地和/或与任何一个或若干个其它所述实施方式组合使用。
本发明的毛细管电泳分析方法适用于包含至少一种糖化血红蛋白的生物试样，该糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基且必须包含结合至一条或若干条珠蛋白链上且具体而言在β链上N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。在本申请中，所述血红蛋白称为“在N-端位置糖化的血红蛋白”。
所述方法使得可分离一种或若干种在N-端位置糖化的血红蛋白与其它糖化血红蛋白(即，其中珠蛋白链无结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的糖化血红蛋白)或非糖化血红蛋白(其可存在于所分析的生物试样中)。
根据一特定实施方式，β链上N-端位置处的氨基酸是缬氨酸。
在一优选实施方式中，本发明的分析方法欲用于分析包含血红蛋白A1c的生物试样。具体而言，其适于分离血红蛋白A1c与所分析生物试样中可能存在的其它血红蛋白或其它血红蛋白(以不同方式糖化或非糖化)以及具体而言其它次要部分(例如与HbA1a及HbA1b分离)。
根据一特定实施方式，本发明的分析方法可分离血红蛋白S1c和/或血红蛋白C1c与所分析生物试样中可存在的其它血红蛋白(以不同方式糖化或非糖化)。
术语“缓冲液组合物”意指尽管添加少量酸或碱或尽管稀释仍保留大约相同pH的组合物、具体而言溶液。
在本申请中使用术语“复合”(“to complex”或“complexing”)表示在两个实体之间、具体而言在两个分子(例如，小分子及大分子)之间经由官能团发生缔合(化学或仅仅物理缔合)。
在一优选实施方式中，该两个实体中之一(能够复合葡萄糖残基的化合物)与来自另一实体(糖化血红蛋白)的葡萄糖残基的顺式-二醇基团、具体而言两个邻位羟基组合(例如，与其反应)。
如可在“实施例”部分中所见，“专一性复合一种或若干种糖化血红蛋白的葡萄糖残基并且在碱性pH下为所述糖化血红蛋白提供负电荷”在本申请中意指本发明上下文中所用化合物使得对应于在N-端位置由葡萄糖糖化的血红蛋白的电泳迁移峰可位移出对应于在N-端位置由另一糖(例如，葡萄糖-6-磷酸、果糖1，6-二磷酸或丙酮酸)糖化的血红蛋白的电泳迁移区以外，且优选可位移出对应于试样中其它血红蛋白的电泳迁移峰的区域以外。因而，不包含与β链的N-端氨基酸结合的任一葡萄糖残基的次要部分(具体而言A1a及A1b部分)并不干扰根据本发明方法进行的HbA1c分析。
作为一实例，在本发明上下文中，可使用以下测试证实化合物专一性复合一种或若干种糖化血红蛋白的葡萄糖残基并在碱性pH下提供负电荷的能力：将含有糖化血红蛋白的各种纯化部分且具体而言A0及A1c部分或A0、A1b及A1a部分的参考试样(例如，“HbA1a、HbA1b混合物”、“A1c”及“A0”，来自Exocell，USA)引入含有以下缓冲液组合物的毛细管电泳毛细管中：200mM CHES、20mM腐胺、10mM与120mM之间(例如，30mM或50mM)的测试化合物、(若需要)2.5g/l氯化钠、水、及(若需要)将pH值调节至大于9(例如9.4)的碱。随后使用例如(Sebia)设备于415nm的波长下实施裸毛细管自由溶液毛细管电泳。其后，研究所得电泳曲线；若对应于HbA1c的峰与对应于HbA0的峰之间(或者视所用试样的类型，对应于HbA1c的峰与对应于HbA0、HbA1b及HbA1a的峰之间)的分离完全，则在本发明意义上，测试化合物被视为能够专一性复合葡萄糖残基并能够在碱性pH下提供负电荷。相反，若对应于HbA1c的峰及对应于HbA1b的峰(或者视所用试样的类型，对应于HbA1c的峰及对应于HbA0、HbA1b及HbA1a的峰)迭置或重迭，则该测试化合物不被视为适用于实施本发明。
上文所示测试中的测试化合物的浓度仅以指示方式给出；若在上文所示测试上下文中，浓度为10mM至120mM的测试化合物不能在对应于HbA1c的峰与对应于试样的其它血红蛋白的峰的间产生足够分离，则为获得对应于HbA1c的峰的最佳分离可超出此浓度范围。
在本发明上下文中可使用任一化合物(即，通常为有机分子)、任一抗体、多肽、肽、或在本发明意义上能够专一性复合葡萄糖残基并在碱性pH下提供负电荷的任意其它化合物。可使用本领域技术人员已知的任一方法产生适当抗体且其可为例如多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体或抗体片段(例如，Fab片段)。
如可在“实施例”部分中所见，正硼酸(boric acid)并非在本发明意义上能够专一性复合葡萄糖残基并在碱性pH下提供负电荷的化合物，此乃因其并不使得可实施可靠分析且具体而言糖化血红蛋白且(具体而言)HbA1c的可靠测定。下文更详细定义适当化合物的实例。
与能够专一性复合葡萄糖残基的化合物复合的每一葡萄糖残基与不同化合物分子相互作用。
根据一特定实施方式，当所述化合物以足量存于本发明缓冲液组合物中时，其尤其能够专一性复合糖化血红蛋白的N-端葡萄糖残基，即对于包含结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的每一珠蛋白链(具体而言β链)而言，能够专一性复合该葡萄糖残基。因而，该化合物能够专一性复合在A1c血红蛋白或S1c或C1c血红蛋白的β链上的N-端位置处结合的每一葡萄糖残基。
根据一特定实施方式，当在本发明缓冲液组合物中存在足量该化合物时，其能够专一性复合在N-端位置处由葡萄糖糖化的血红蛋白的所有葡萄糖残基。
根据一特定实施方式，当在本发明缓冲液组合物中存在足量该化合物时，不管其在珠蛋白链上的位置如何，该化合物均能够专一性复合血红蛋白的所有葡萄糖残基。因而，当该化合物在本发明缓冲液组合物中存在足量时，包含数量为x的葡萄糖残基的血红蛋白分子可结合数量为x的该化合物分子。
通过与生物试样中糖化血红蛋白的一个或若干个葡萄糖残基专一性复合，该化合物在碱性pH下提供所述糖化血红蛋白或多种血红蛋白若干负电荷，即，使得这些糖化血红蛋白于碱性pH下能够带有额外负电荷。
所述化合物可使与其复合的相同血红蛋白的每一葡萄糖残基皆于碱性pH下带有若干负电荷。由于在碱性pH下这种负电荷供应，故由于包含至少一个葡萄糖残基的血红蛋白与所述化合物复合，其电泳迁移率得以改良。这在电泳曲线上通过对应于糖化血红蛋白的电泳峰的位移来表现，所述糖化血红蛋白包含一个或若干个葡萄糖残基且存在于所分析的生物试样中。
包含至少一个葡萄糖残基且存于生物试样中的所有血红蛋白与复合葡萄糖并于碱性pH下提供负电荷的化合物形成复合物(当然，前提条件为该化合物存在足量以与这些血红蛋白中每一种复合)。然而，不同血红蛋白且具体而言包含至少一个葡萄糖残基的不同血红蛋白均具有不同等电点(由于其珠蛋白链的性质、这些珠蛋白链上的葡萄糖残基的数量及位置、及可结合至该血红蛋白的其它糖的数量、性质及位置)。由于通过每一葡萄糖残基与该化合物复合而在碱性pH下提供负电荷，这些不同血红蛋白之间的电荷差异在其呈与该化合物复合的形式时甚至更显著。
包括结合至糖化血红蛋白的珠蛋白链的至少一个上(具体而言在β链上)的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的糖化血红蛋白因此比其它血红蛋白(不同糖化或非糖化)多至少一个葡萄糖。具体而言，血红蛋白A1c在β链上比血红蛋白A1的其它次要部分多至少一个葡萄糖。因此，这些在N-端位置处糖化的血红蛋白当根据本发明与该化合物复合时在碱性pH下载有比其它血红蛋白(不包含结合至珠蛋白链的N-端氨基酸的葡萄糖残基的糖化血红蛋白或非糖化血红蛋白)更多的负电荷。
因而，通过增大包含葡萄糖的不同血红蛋白之间和/或包含葡萄糖的一种或若干种血红蛋白与所分析生物试样中存在的其它血红蛋白之间存在的电泳迁移率之差，可在N-端位置处糖化的一种或若干种血红蛋白与该试样中可能存在的其它血红蛋白之间、具体而言在血红蛋白A1c与该试样中可能存在的血红蛋白A1血红蛋白的其它次要部分之间达成更好分离。
因而，本发明方法可有效分离在N-端位置糖化的血红蛋白(具体而言HbA1c)与含有其它血红蛋白的生物试样中存在的其它血红蛋白、某些变体及其它次要部分。此外，常规干扰分子(例如，不稳定、乙酰化或氨甲酰化形式)并不干扰使用本发明方法的HbA1c的测定。具体而言，本发明方法使得能够在电泳分离步骤期间避免干扰，所述干扰可能是在碱性pH下不存在通过复合提供的负电荷时由血红蛋白A1c及生物试样中存在的血红蛋白A1的其它次要部分(包括HbA1a及HbA1b)的共迁移所致。
随后可在所分析生物试样中可存在的另一或其它血红蛋白存在下测定N-端位置处糖化的经分离血红蛋白。因而，作为一实例，可在血红蛋白A1的其它次要部分存在下且具体而言在HbA1a和/或HbA1b存在下测定HbA1c，且所分析生物试样中存在的这些其它次要部分不干扰该测定。
本申请中的术语“测定”(“to assay”或“assay”)意指可能在所分析生物试样的一种或若干种其它血红蛋白存在下测定目标血红蛋白或多种目标血红蛋白的量和/或测定所述目标血红蛋白相对于该试样中存在的血红蛋白总量或某些血红蛋白之量的比例。
在本发明上下文中实施的测定可为半定量测定，因而，测量给定血红蛋白相对于该试样中存在的另一血红蛋白或其它血红蛋白之量的百分比。因而，在HbA1c情形下，通常测量HbA1c相对于一种或若干种其它A血红蛋白之量的百分比；通常用对应于HbA1c的电泳峰面积除以对应于HbA0的峰面积或除以(对应于HbA1c的峰面积+对应于HbA0的峰面积)之和、或除以所有HbA峰面积之和或除以(对应于HbA1c的峰面积+对应于HbA0的峰面积+对应于HbA2的峰面积)之和、或甚至除以电泳曲线的总表面积。
测定亦可为定量测定；随后以该生物试样中存在的给定血红蛋白的毫摩尔数(mmol)/摩尔另一血红蛋白或其它血红蛋白、例如以HbA1c的毫摩尔数/摩尔HbA来表示所述结果。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有负电荷的化合物包含若干官能团、具体而言两个或两个以上官能团。
所述官能团中的至少一个通过与(例如)葡萄糖残基的顺式-二醇基团、具体而言两个邻位羟基相互作用而专一性复合葡萄糖残基(具体而言，结合至珠蛋白链上N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基)。作为一实例，该(这些)基团可为硼酸根基团、具体而言如本申请中所定义的硼酸根基团。
所述葡萄糖复合基团可使糖化血红蛋白中每个复合葡萄糖残基皆在碱性pH下具有一个负电荷，即，使每个复合血红蛋白分子皆在碱性pH下具有一个或若干个负电荷(若血红蛋白分子仅包含一个葡萄糖残基则有一个负电荷，且若血红蛋白分子包含n个葡萄糖残基则有n个负电荷)。
该化合物的另一官能团、其它官能团之一、或其它官能团(即，不与葡萄糖复合的官能团)可使糖化血红蛋白中的该血红蛋白分子的每个经复合葡萄糖残基皆在碱性pH下具有一个或若干个负电荷。
因而，在本发明的此特定实施方式中，每个根据本发明专一性复合葡萄糖残基的化合物分子皆包含至少一个能够复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基(且具体而言在N-端位置糖化的血红蛋白的N-端葡萄糖残基)的官能团及至少一个并不复合葡萄糖但使得该糖化血红蛋白能够在碱性pH下带有多个额外负电荷的官能团，这是因为该官能团使该糖化血红蛋白在碱性pH下具有一个或若干个补加负电荷。能够复合葡萄糖的官能团亦可在碱性pH下提供负电荷。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合葡萄糖残基并于碱性pH下提供负电荷的化合物(更确切而言该化合物的每一分子)可使糖化血红蛋白分子(且具体而言在N-端位置处糖化的血红蛋白)中该糖化血红蛋白分子的每一经复合葡萄糖残基皆在碱性pH下具有若干负电荷。优选地，其使一个糖化血红蛋白分子中的每一复合葡萄糖残基皆在碱性pH下具有至少两个(具体而言2个、3个、4个、5个或6个)负电荷。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合葡萄糖残基的一官能团或官能团中的至少一个在碱性pH下带有负电荷。
根据本发明的一特定实施方式，能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有负电荷的化合物包含一个或若干个可在碱性pH下离子化(具体而言可阴离子化)的基团。该化合物可为各种类型。举例而言，该化合物可包含一个或若干个羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基。具体而言，该化合物可为多羧酸、具体而言二羧酸或三羧酸。该化合物亦可为聚磺酸，具体而言二磺酸或三磺酸。
根据本发明的一特定实施方式，可使糖化血红蛋白分子中该糖化血红蛋白分子的每一复合葡萄糖残基在碱性pH下具有一个或若干个负电荷的基团、多个基团之一或多个基团包含一个或若干个可在如本申请中所定义碱性pH下离子化的基团且具体而言一个或若干个(具体而言2个或3个)羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基或由其组成。
根据本发明的一特定实施方式，专一性复合葡萄糖残基的一基团、所述基团之一或所述基团包含一个或若干个硼酸根基团或由其组成。
在本申请中，术语“硼酸根基团(boronate group)”意指具有下式的基团：
其中D1及D2彼此独立地选自羟基及易于在水溶液中、具体而言在碱性pH下水解以产生羟基的基团。
在本发明的一特定实施方式中，该硼酸根基团是基团-B(OH)2(亦称作硼酸基(boronyl))或离子化形式(具体而言-B(OH)- 3)。
在本发明的一特定实施方式中，能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有负电荷的化合物是：
(i)硼酸根基化合物(boronate compound)，其具有通式RB(OH)2(亦称作硼酸(boronic acid)的化合物)或具有通式RB(OH)- 3，其中基团R包含至少一个芳基和/或烷基(直链、支链或环状)和/或芳烷基和/或其组合，且该基团R可使糖化血红蛋白中与硼酸根基团复合的每一葡萄糖残基在碱性pH下具有一个或若干个负电荷；或
(ii)该硼酸根基化合物的盐。
因而，在碱性pH下，除在碱性pH下由硼酸根基化合物或其盐的硼酸基或硼酸根提供的负电荷外，基团R亦可使糖化血红蛋白中的与硼酸基或硼酸根基团复合的每一葡萄糖残基具有一个或若干个补加负电荷。
在本申请上下文中，术语“具有通式RB(OH)2的化合物”亦意指与其平衡的任一离子形式(具体而言RB(OH)- 3)、或视介质的条件能够与其平衡的任一形式。
在本申请上下文中，术语“盐”表示任一盐且具体而言钠盐、锂盐或钾盐。
除芳基、烷基、芳烷基官能团或其组合之一外，本发明的硼酸根基化合物的基团R亦可包括其它官能团和/或杂原子。
根据一特定实施方式，对于与本发明硼酸根基化合物或其盐的硼酸基或硼酸根基团复合的每一葡萄糖残基而言，在碱性pH下基团R提供两个或更多个(优选两个)负电荷。
根据一特定实施方式，基团R由一个或若干个芳基、烷基(直链、支链或环状)和/或芳烷基和/或其组合组成。
根据一特定实施方式，本发明硼酸根基化合物的基团R中存在的芳基、烷基、芳烷基或其它官能团和/或杂原子或其组合可被取代。
本申请中所用术语“被取代”可表示经单取代或(相反)经多取代，具体而言，经二-、三-、四-、五-或六-取代。
具体而言，取代基可为如本申请中所定义的在碱性pH下可离子化(具体而言，可阴离子化)的基团。基团R可包括一个或若干个杂原子、或其它官能团。
根据本发明的一特定实施方式，硼酸根基化合物的基团R使糖化血红蛋白分子中的每一复合葡萄糖残基在碱性pH下具有一个或若干个负电荷。优选地，其使糖化血红蛋白中的每一复合葡萄糖残基在碱性pH下具有一个、两个、三个或四个负电荷。
如上文所定义硼酸根基化合物具体而言包含硼酸、且具体而言苯基硼酸(phenylboronic acid)。
根据本发明的一特定实施方式，能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有负电荷的化合物是多取代的苯基硼酸酯(phenylboronate)、具体而言二取代的苯基硼酸酯(例如经羧基和/或磺酰基二取代)。
根据本发明的一特定实施方式，硼酸根基化合物或其盐的基团R是二酸，具体而言二羧酸。根据本发明的一特定实施方式，硼酸根基化合物是二羧基苯基硼酸、优选选自3，5-二羧基苯基硼酸及3，4-二羧基苯基硼酸。
因而，举例而言，所用的硼酸根基化合物可为3，5-二羧基苯基硼酸(3，5-dCPBA)。此化合物可自(具体而言)供货商Combi-blocks公司(SanDiego，USA)以商品名3，5-二羧基苯基硼酸及自Apollo Scientific有限公司(Cheshire，United Kingdom)以商品名3，5-二羧基苯硼酸购得。
在本发明的缓冲液组合物中，能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有负电荷的化合物的浓度通常相对于蛋白质的总量、具体而言相对于生物试样中存在的所有血红蛋白的总量或相对于生物试样中存在的所有包含葡萄糖的血红蛋白的总量在化学计量上过量。因而，当试样或一等份该试样稀释于缓冲液组合物中时，此化合物在缓冲液组合物中的量大于试样中存在的血红蛋白的所有葡萄糖残基被该化合物复合所需的量。因而，对于分析生物试样中存在的包含葡萄糖的每一糖化血红蛋白分子而言，缓冲液组合物中的该化合物的分子数量至少与此糖化血红蛋白分子中存在的葡萄糖残基的数量一样多。此使得可完全分离目标糖化血红蛋白或多个目标糖化血红蛋白与分析生物试样中亦存在的其它血红蛋白。
根据本发明的一特定实施方式，在本发明缓冲液组合物中，能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有负电荷的化合物的浓度在0.10mM至100mM范围内、优选在10mM至60mM范围内、且更优选在20mM至50mM范围内，例如30mM或50mM。
本申请中所用的表达“在x至y范围内”意指界限x及y包括于所指示的范围x-y内。
根据一特定实施方式，本发明的缓冲液组合物另外包含：
-缓冲化合物，pKa在8.0至11.0范围内；和/或
-阻流剂；和/或
-碱；和/或
-盐；和/或
-适当的稀释溶液，例如水。
因而，本发明的缓冲液组合物包含以下或由以下组成：(i)能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有负电荷的化合物，及(ii)选自下述的一种或若干种且具体而言所有的化合物：pKa在8.0至11.0范围内的缓冲化合物、阻流剂、碱、盐、适当的稀释溶液(例如水)及其混合物。
缓冲化合物优选是两性离子化合物。具体而言，其可选自AMP、AMPD、AMPSO、N-二甘氨酸、CABS、CAPS、CAPSO、CHES、HEPBS、甲胺、TABS、TAPS、氨基乙磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)及Tris；具体而言，选择CAPS、CAPSO或CHES，优选为CHES。这些化合物于目标pH(pH 8-11)下具有高缓冲能力且特别适用于获得血红蛋白的良好聚焦。
缓冲化合物在本发明缓冲液组合物中的浓度通常在20mM至500mM范围内、优选在50mM至400mM范围内、且更优选在100mM至350mM范围内或在150mM至300mM范围内，例如约200mM或约300mM。
阻流剂意欲增强电荷差的效应以获得各种血红蛋白之间分离的良好拆分。此类型化合物通过降低电渗透流量起作用，其会阻碍不同部分的迁移且可增大其分离。所用阻流剂可为脂族二胺、具体而言选自1，3-二胺基丙烷、1，4-二氨基丁烷(腐胺)、1，5-二氨基戊烷(尸胺)、1，6-二氨基己烷、精胺及DETA的脂族二胺、或该脂族二胺的衍生物或其混合物。
本文所用术语“衍生物”意指脂族聚胺、环状聚胺、盐(例如钠盐)或其混合物之一。
根据本发明的一特定实施方式，阻流剂选自腐胺、其衍生物及其混合物。
根据本发明的一特定实施方式，阻流剂是腐胺。具体而言，腐胺呈纯净形式，任选添加盐。
根据本发明的另一特定实施方式，阻流剂是腐胺盐酸盐(或腐胺-2HCl)。
在本发明的缓冲液组合物中，阻流剂的浓度有利地在0.10mM至40mM范围内、优选在10mM至30mM范围内且更优选在15mM至25mM范围内，例如20mM。
任选向缓冲液组合物中添加的碱可调节该组合物的pH。具体而言，可使用属于氢氧化物家族的碱，具体而言选自以下的碱：氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化钫、单-、二-、三-或四-烷基氢氧化铵、及其混合物。
根据本发明的一特定实施方式，任选向缓冲液组合物中添加的碱是氢氧化钠。
有利地，向缓冲液组合物中添加足够碱以使其pH是9.0或更大、优选在9.0至11.0范围内且更优选在9.0至10.0范围内、例如在9.3至9.5范围内、且仍更优选pH为9.4或9.5。9以上的碱性pH可产生带负电荷的血红蛋白部分(血红蛋白的等电点在6.05至7.63范围内)。
根据本发明的一特定实施方式，本发明缓冲液组合物中任选存在的盐是钠盐、优选氯化钠。缓冲液组合物可包含例如2.5g/l氯化钠。
根据本发明的一特定实施方式，当缓冲液组合物包含腐胺、具体而言纯腐胺时，其另外包含盐(具体而言钠盐)、优选氯化钠、例如2.5g/l氯化钠。
根据本发明的另一特定实施方式，缓冲液组合物包含腐胺盐酸盐，不包含氯化钠且优选不包含任一盐。
根据本发明的一特定实施方式，缓冲液组合物包含以下或由以下组成：
-200mM CAPSO；
-10mM腐胺(例如，腐胺-2HCl或纯腐胺及氯化钠)；
-50mM 3，5-二羧基苯基硼酸；
-水；及
-若需要，碱(例如氢氧化钠)，以将pH调节至例如大于9或10的值、且优选调节至10.2的值；
或者，更优选地，由以下组成：
-200mM CAPSO；
-15mM腐胺(例如，腐胺-2HCl或纯腐胺及氯化钠)；
-100mM 3，5-二羧基苯基硼酸；
-水；及
-若需要，碱(例如氢氧化钠)，以将pH调节至例如大于9或10的值、且优选调节至10.2的值；
或者，仍更优选地，由以下组成：
-200mM CHES；
-20mM腐胺(例如，腐胺-2HCl或纯腐胺及氯化钠)；
-30mM 3，5-二羧基苯基硼酸；
-水；及
-若需要，碱(例如氢氧化钠)，以将pH调节至例如大于9的值、且优选调节至9.4的值。
根据本发明的另一特定实施方式，缓冲液组合物包含上文所指示浓度的上文所指示组分、及一种或若干种盐(具体而言钠盐、尤其氯化钠、例如2.5g/l氯化钠)或由其组成。
如实施例部分中所阐释，所述缓冲液组合物使得能以自由溶液毛细管电泳领域中独特的方式完美分离所分析生物试样中存在的血红蛋白HbA1c与其它血红蛋白、以及相互分离各种次要部分(包括HbA1a、HbA1b及HbA1c)。
本申请中所用术语“生物试样”意指包含红细胞的任意生物流体。该生物流体可源自健康或患病人类患者(例如，糖尿病患者)或为(具体而言)源自非人类哺乳动物(健康或患病)的动物起源。该生物液体(人类或非人类哺乳动物)可为(例如)血液、具体而言正常或不正常血液、经洗涤、经倾析、经离心、经溶血血液或全血。生物试样亦可为合成或纯化起源。
本发明在血样的分析中具有特定应用、具体而言用于源自糖尿病患者或源自糖尿病非人类哺乳动物的血样的分析。
根据一特定实施方式，该生物试样包含以下或由以下组成：若干血红蛋白、具体而言包含结合至至少一条珠蛋白链上(例如在β链上)的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的若干糖化血红蛋白、且更具体而言血红蛋白A1c。
可在通过毛细管电泳分析之前用适宜稀释溶液(例如，溶血溶液和/或分析缓冲溶液(具体而言本发明的缓冲液组合物))稀释所用的生物试样。优选地，使用溶血血液试样实施分析。
根据另一特定实施方式，最初在溶血溶液中、随后在本发明缓冲液组合物中稀释生物试样。
本申请中所用术语“溶血溶液”表示能够造成红细胞溶血、即破坏红细胞且由此释放血红蛋白的溶液。视其组成，其可任选通过利用小的额外机械动作(涡旋、搅拌等)实施红细胞的总裂解。溶血溶液可包括细胞裂解的常用添加剂，例如，Triton X100，其通常以1g/L的浓度使用。溶血溶液亦可任选包括能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并在如本申请中所定义的碱性pH下提供所述糖化血红蛋白负电荷的化合物。
举例而言，溶血溶液可选自以下：来自Sebia的溶血溶液血红蛋白(e)、来自Sebia的溶血溶液血红蛋白(e)、来自Sebia的溶血溶液HbA1c、纯水、补充有表面活性剂的水、具体而言补充有Triton X100的水(例如，1g/L Triton X100)及其混合物。
根据一特定实施方式，通过本发明毛细管电泳的分析方法包含以下步骤：
a)将本发明的缓冲液组合物及生物试样引入电泳毛细管中；及
b)通过毛细管电泳分离该生物试样的各成分。
该两个步骤通常在于(例如)溶血溶液中稀释生物试样的步骤之后。具体而言，此稀释步骤可在试样载体、例如在(Sebia)稀释段或(Sebia)试样杯中实施。
在步骤a)中，本发明的缓冲液组合物及生物试样可单独(同时或不同时)引入同一电泳毛细管中，随后在毛细管中产生混合物。作为一实例，可首先引入本发明的缓冲液组合物，随后将试样引入电泳毛细管中。
或者，可在步骤a)中将呈与本发明缓冲液组合物的混合物形式的生物试样引入电泳毛细管中。
视所用毛细管电泳设备的类型及欲实施的分析数量的变化，使用单一毛细管或并列的若干毛细管。当使用单一毛细管时，此毛细管通常连续使用若干次以实施若干分析。当然，当使用若干毛细管时，若需要可在并列使用若干毛细管期间连续实施若干电泳迁移。
通过毛细管电泳分离生物试样的各成分的步骤具体而言由以下组成：向毛细管施加具有足够电压的电场以分离一种或若干种目标糖化血红蛋白与生物试样中可存在的其它蛋白质且(具体而言)其它血红蛋白。
实施液体毛细管电泳的条件是本领域技术人员针对将试样及缓冲液组合物引入毛细管并通过电泳迁移分离试样的各成分的步骤而常用的条件。所施加电场可为例如约400V/cm。其通常包含用洗涤溶液洗涤毛细管、用分析所用缓冲液组合物洗涤、任选将试样稀释一或多次、将试样引入毛细管中、迁移及检测。可通过自动化机器实施这些步骤。
实施毛细管电泳的条件是例如适于使用来自Sebia的自动化机器或来自Sebia的的条件。
通常在分离生物试样中各成分的步骤之后实施检测一种或若干种蛋白质、具体而言生物试样中存在的一种或若干种血红蛋白、且更具体而言生物试样中存在的一种或若干种目标糖化血红蛋白(例如血红蛋白A1c)的步骤。
具体而言，可通过在(例如)约415nm的波长下(其对血红蛋白具有专一性)测量吸光率来实施此检测步骤；可在约200nm的波长下分析血红蛋白，但为了避免干扰血浆蛋白，具体而言，优选在415nm的波长下对其进行分析。
在本发明上下文中，可如实施例中所阐释以与所检测血红蛋白的量成比例的检测信号产生的电泳曲线的形式呈现电泳分离的结果。因而，本发明方法通常另外包括自检测信号产生电泳图的步骤。
如上文所示，当所分析生物试样中存在目标血红蛋白时，可对其进行定量。为此，测定对应于该血红蛋白之峰的表面积。
因而，该方法通常亦包含以下步骤：具体而言自电泳图测定生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白的量和/或生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白相对于生物试样中存在的蛋白质总量、血红蛋白总量和/或某些血红蛋白之量(例如，相对于HbA或HbA0的量)的比例。具体而言，可测定生物试样中存在的糖化血红蛋白A1c、S1c和/或C1c相对于生物试样中存在的所有血红蛋白总量或相对于某些血红蛋白之量(例如，分别相对于A、S和/或C血红蛋白之总量)的比例。
在本发明的一个特定实施方式中，可直接自电泳曲线获得此测定。
根据本发明的一特定实施方式，该分析方法亦包括相对于一种或若干种标准化校正剂(例如，一种或若干种参考生物试样)对所分析生物试样中存在的一种或若干种血红蛋白进行定量的步骤；此使得可使结果标准化。
因而，为在测定期间获得高水平精确度，通常在每次运转电泳设备时使用参考生物试样(例如，含有已知浓度的不同天然和/或合成糖化血红蛋白部分的标准试样，若需要经纯化)校正每一毛细管。作为一实例，为测定HbA1c，通常使用至少两种校正剂，例如，包含已知高浓度HbA1c的第一校正剂及包含已知低浓度HbA1c的第二校正剂。随后，利用电泳设备的每一毛细管测量每一毛细管中存在的HbA1c之量。此使得能够为每一毛细管建立回归曲线(在至少两个点上)，且因而可标准化使用各种毛细管实施的测量。此亦使得可通过使用由毛细管的此方法测定的HbA1c值来标准化相对于参考方法所得的结果。
根据本发明的一特定实施方式，所实施的毛细管电泳是自由溶液毛细管电泳，具体而言是裸毛细管自由溶液毛细管电泳。
自毛细管所用材料角度来讲，利用那些对毛细管电泳正常的材料。专家能够改变毛细管的性质及分析所需的其尺寸。
作为一实例，在一特定实施方式中，电泳毛细管是熔凝硅石。
本发明亦涉及根据本发明的毛细管电泳分析方法的用途，其用于分离一种或若干种包含葡萄糖之糖化血红蛋白、更确切而言一种或若干种各自在一条或若干条珠蛋白链上(例如，β链上)包含与N-端位置处的氨基酸结合的一个或若干个葡萄糖残基的糖化血红蛋白与生物试样中存在的其它蛋白质、具体而言至少一种另一血红蛋白、优选其它血红蛋白，及(若适当)测定所述糖化血红蛋白。
本发明亦涉及适于生物试样的毛细管电泳分析的缓冲液组合物，该生物试样包含血红蛋白且具体而言一种或若干种糖化血红蛋白、更具体而言一种或若干种包含一条或若干条珠蛋白链上(例如，在β链上)的一个或若干个葡萄糖的糖化血红蛋白。该缓冲液组合物包含至少一种能够专一性复合物糖化血红蛋白的葡萄糖残基以及还能使所述血红蛋白在碱性pH下具有若干负电荷的化合物。
具体而言，该缓冲液组合物用于实施本申请中所提供的生物试样的毛细管电泳的方法。
具体而言，根据本发明的一特定实施方式，缓冲液组合物包含多羧酸硼酸、具体而言二羧酸或三羧酸(例如3，5-二羧基苯基硼酸)作为可专一性复合葡萄糖残基并在碱性pH下提供负电荷的化合物。
根据本发明的另一特定实施方式，除能够专一性复合葡萄糖残基并在碱性pH下提供负电荷的化合物外，缓冲液组合物亦包含以下：
-阻流剂；和/或
-缓冲化合物，pKa在8.0至11.0范围内；和/或
-碱；和/或
-盐(具体而言钠盐，例如氯化钠)；和/或
-适当稀释溶液，例如水。
这些各种成分可如本申请中所定义。
根据本发明的一特定实施方式，缓冲液组合物的pH为9.0或更大、优选地pH在9.0至11.0范围内且更优选地pH在9.0至10.0范围内，例如pH在9.3至9.5范围内且仍更优选地pH为9.4。具体而言，该pH可通过提供足量的如上文所定义的碱而获得。
本发明的缓冲液组合物是以分析缓冲液组合物的常用方式、即通过将呈液体形式或呈欲稀释的固体形式的成分提供至可接受的载体来制备。通常，载体是蒸馏或去矿物质水。
本发明亦涉及一种试剂盒，其包含本发明的缓冲液组合物及(若适当)使用说明以实施电泳分析。换言之，本发明的试剂盒可包含本发明的缓冲液组合物及包装材料及(若适当)使用说明或由其组成。
因而，本发明的试剂盒具体而言包含能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并在如本申请中所定义的碱性pH下提供负电荷的化合物。当该试剂盒除该化合物外亦包含其它化合物、具体而言选自下述的一种或若干种化合物时，该试剂盒的各种化合物可进行包装用以临时混合，或相反可包装在一起(具体而言在相同组合物中，呈混合物形式)：pKa在8.0至11.0范围内的缓冲化合物、阻流剂、碱、盐(具体而言钠盐，例如氯化钠)、适当的稀释溶液(例如水)及其混合物。或者，该试剂盒的某些化合物可单独包装，而其它化合物可包装在一起(具体而言呈混合物形式)。
根据本发明的一特定实施方式，提供一份或若干份本发明缓冲液组合物，在分析之前由使用者对其进行重构。因此，可克服例如当该组合物的所有组分或一些组分以混合物形式包装时可能产生的关于稳定性的问题。
本发明的试剂盒亦可包含一种或若干种洗涤毛细管用溶液和/或一种或若干种稀释段(dilution segment)和/或一种或若干种适于稀释欲分析生物试样的溶液(例如，溶血溶液、具体而言如本申请中所定义的溶血溶液)和/或一种或若干种使得能够校正各毛细管的参考生物试样(例如，天然和/或合成糖化部分，若需要可纯化)。
本发明亦涉及如本申请中所定义的缓冲液组合物的用途和/或本发明的试剂盒，其用于通过毛细管电泳分析包含一个或若干个葡萄糖残基的(一种或若干种)糖化血红蛋白，具体而言包含一种或若干种血红蛋白的生物试样中所含的A1c、S1c及C1c血红蛋白。
本发明亦是关于如本申请中所定义的缓冲液组合物和/或本发明试剂盒和/或能够专一性复合糖化血红蛋白(一种或若干种糖化血红蛋白)的葡萄糖残基(一个或若干个)并能使该或这些糖化血红蛋白在碱性pH下具有若干负电荷的化合物的用途，其用于通过毛细管电泳分离包含结合至至少一条珠蛋白链上(例如，在β链上)的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基的一种或若干种糖化血红蛋白，且更具体而言通过毛细管电泳分离血红蛋白A1c与生物试样中存在的其它蛋白质、具体而言至少一种另一血红蛋白及优选其它血红蛋白及(若适当)测定由此所分离的所述血红蛋白。
具体而言，本发明的缓冲液组合物、本发明的试剂盒和/或能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并在如本申请中所定义的碱性pH下提供负电荷的化合物在例如本发明方法的上下文中适用于诊断人类或非人类哺乳动物的糖尿病和/或适用于监测人类或非人类哺乳动物(具体而言糖尿病对象)的血糖平衡，具体而言以评价抵抗糖尿病的治疗功效和/或调整糖尿病对象中的糖尿病治疗。随后所分析的所述生物试样源自该人类或非人类哺乳动物。
本申请中所用术语“糖尿病”表示1型和/或2型糖尿病。
本发明亦涉及本发明的缓冲液组合物、本发明的试剂盒和/或能够专一性复合糖化血红蛋白的葡萄糖残基并在如本申请中所定义的碱性pH下提供负电荷的化合物在制造诊断试剂盒方面的用途。具体而言，该诊断试剂盒可用于诊断人类或非人类哺乳动物的糖尿病和/或监测人类或非人类哺乳动物(具体而言糖尿病对象)的血糖平衡。该试剂盒由此可评价在患有糖尿病的人类或非人类哺乳动物中抵抗糖尿病的治疗功效和/或可调整在糖尿病对象中抵抗糖尿病的治疗。
人类非糖尿病中的HbA1c含量通常在4％至6％范围内(即，在血液中20-42毫摩尔HbA1c/摩尔血红蛋白)，且在糖尿病患者(未治疗)中为7％以上。
倘若HbA1c含量在6％至7％范围内(即，在血液中的浓度为42-53毫摩尔HbA1c/摩尔血红蛋白)，建议开始抗糖尿病治疗。
倘若超过8％的阈值(其等效于血液中64毫摩尔HbA1c/摩尔血红蛋白的浓度)(Panteghini及John，2007)，则患者发生糖尿病并发症(微血管病、大血管病变等)中之一者的风险增大。则建议应当修改患者的抗糖尿病治疗。根据阐释本发明的以下实施例及附图，本发明的其它特征及优势变得显而易见。
附图简述
图1：在CE Agilent上使用专利US 5,599,433中所述分析缓冲液自正常人类血样获得的电泳图，该分析缓冲液含有100mM CAPS及300mM正硼酸(pH：11.00；温度：24℃；电压：6.1kV，即190V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图2：在CE Agilent上使用专利US 5,599,433中所述分析缓冲液自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线，该分析缓冲液含有100mM CAPS及300mM正硼酸(pH：11；温度：24℃；电压：6.1kV，即190V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图3：在CE Agilent上使用缓冲液组合物自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线，该缓冲液组合物含有200mM CAPSO及10mM腐胺，但不含正硼酸盐化合物或硼酸根基化合物(pH：10.20；温度：24℃；电压：6.1kV，即190V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图4：在CE Agilent上使用含有200mM CAPSO、10mM腐胺及50mM正硼酸盐的缓冲液组合物自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线(pH：10.20；温度：24℃；电压：6.1kV，即190V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图5：在CE Agilent上使用含有200mM CAPSO、10mM腐胺及50mM 3-羧基苯基硼酸的缓冲液组合物自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线(pH：10.20；温度：24℃；电压：6.1kV，即190V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图6：在CE Agilent上使用含有200mM CAPSO、10mM腐胺及50mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线(pH：10.20；温度：24℃；电压：6.1kV，即190V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图7：在CE Agilent上使用含有200mM CAPSO、15mM腐胺及100mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线(pH：10.20；温度：30℃；电压：10kV，即310V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图8：在CE Agilent上使用含有200mM CHES、20mM腐胺及30mM3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物于pH 9.40下自含有HbA0和/或糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A0、A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线。熔凝硅石毛细管，未经涂布(温度：34℃；电压：17.3kV，即520V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图9：在CE Agilent上使用含有200mM CHES、20mM腐胺及30mM3，4-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物于pH 9.40下自含有HbA0和/或糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A0、A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线。熔凝硅石毛细管，未经涂布(温度：34℃；电压：17.3kV，即520V/cm；注射：50毫巴，20s)。
图10：在(Sebia)上使用含有200mM CHES、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物于pH 9.40下自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分的参考试样获得的A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线。熔凝硅石毛细管，未经涂布(温度：34℃；电压：9.4kV，即520V/cm；注射：20毫巴，6s)
图11：在(Sebia)上使用缓冲液组合物自在溶血溶液(水+1g/L Triton X100)中稀释至1/6的正常人类血样获得的电泳图，该缓冲液组合物含有(A)200mM CAPSO缓冲液、10mM腐胺及50mM 3，5-二羧基苯基硼酸(pH 10.2)，或(B)200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸(于pH 9.40下)。熔凝硅石毛细管，未经涂布(温度：34℃；电压：9.4kV，即520V/cm；注射：8毫巴，6s)。
图12：缓冲液组合物中3，5-二羧基苯基硼酸的浓度对A1c与Ao血红蛋白之间的分离的影响的研究(温度：30℃；电压：10kV，即310V/cm)。
图13：在(Sebia)上自包含变体HbE且在溶血溶液(水+1g/L Triton X100)中稀释至1/6的正常人类血样获得的电泳图，使用含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)及未经涂布的熔凝硅石毛细管(温度：34℃；电压：9.4kV，即520V/cm；注射：8毫巴，6s)。
图14：在(Sebia)上自在溶血溶液(水+1g/L Triton X100)中稀释至1/6的对照AFSC使用含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)及未经涂布的熔凝硅石毛细管(温度：34℃；电压：9.4kV，即520V/cm；注射：8毫巴，6s)获得的电泳图。
图15：在(Sebia)上自包含F及Bart变体且在溶血溶液(水+1g/L Triton X100)中稀释至1/6的正常血样混合(pool)使用含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)及未经涂布的熔凝硅石毛细管(温度：34℃；电压：9.4kV，即520V/cm；注射：8毫巴，6s)获得的电泳图。
图16：在(Sebia)上自包含HbD变体且在溶血溶液(水+1g/L Triton X100)中稀释至1/6的正常人类血样使用含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)及未经涂布的熔凝硅石毛细管(温度：34℃；电压：9.4kV，即520V/cm；注射：8毫巴，6s)获得的电泳图。
图17：对本发明者使用(Sebia)分析仪藉由毛细管电泳获得的结果与使用Variant II(Bio-Rad)分析仪藉由HPLC获得的结果进行的比较。
图18A：在(Sebia)自动化机器上实施的HbA1c的琼脂糖凝胶。泳道1及2：稀(5.0％)A1c校正剂及浓(10.8％)A1c校正剂。泳道3至9：在37℃下将正常全血与具有以下浓度的葡萄糖一起温育3h：0g/L(参照；泳道3)、1g/L(泳道4)、5g/L(泳道5)、10g/L(泳道6)、20g/L(泳道7)、30g/L(泳道8)及50g/L(泳道9)。
图18B：用(Sebia)分析仪以图18A的试样获得的毛细管电泳曲线。然而，并不对含有1g/L葡萄糖的试样实施分析，此乃因其在凝胶中无可见差别(图18A)。将试样在溶血溶液(水+1g/L TritonX100)中稀释至1/6，且使用含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)及未经涂布的熔凝硅石毛细管(温度：34℃；电压：9.4kV，即520V/cm；注射：8毫巴，6s)。
图18C：汇总在琼脂糖凝胶上利用用于图18A及18B中所展示的血液分析的(Sebia)分析仪获得的HbA1c值的表格。
实施例
A.设备及方法
毛细管电泳
分离原则是于碱性pH(pH＞9)下的自由溶液毛细管电泳以获得带负电荷的血红蛋白部分(血红蛋白的等电点在6.05至7.63范围内)。
在设有8个熔凝硅石毛细管(内径为25微米、有用长度为16cm且总长度为18cm)的毛细管电泳设备((Sebia)毛细管电泳系统)上、或在设有一个熔凝硅石毛细管(内径为25微米、有用长度为24cm且总长度为32cm)的毛细管电泳设备上(来自Agilent Technologies的3DCE毛细管电泳系统)实施生物试样的毛细管电泳。
在425nm的波长下实施检测。在溶血溶液(于水中的1g/L TritonX100)中稀释血样并通过流体动力注射进行注射。在每次分析之前用0.25M氢氧化钠、随后用缓冲液组合物洗涤毛细管。
缓冲液组合物
实施毛细管电泳的缓冲液组合物包含水、pKa在8至11范围内的缓冲化合物(视情形为CAPS、CAPSO或CHES)、可将pH调节至期望值的碱、任选的阻流剂(腐胺)、及任选的正硼酸盐(borate)化合物(正硼酸(boric acid))或硼酸盐(boronate)。
自Combi-blocks公司(San Diego，USA)及Apollo Scientific有限公司(Cheshire，United Kingdom)获得3，5-二羧基苯基硼酸(3，5-dCPBA)。
通过稳定的BoroChem SAS(Caen，France)合成3，4-二羧基苯基硼酸(3，4-dCPBA)。
B.结果
实施例1
自在溶血溶液(溶解于去矿物质水中的1g/L Triton X100)中稀释至1/6的正常人类血液(包含血红蛋白HbA0、HbA1及HbA2)使用专利US5,599,433中所述分析缓冲液来实施毛细管电泳，该分析缓冲液含有100mM CAPS及300mM正硼酸，pH为11。所得电泳图展示于图1中。血红蛋白的各峰之间的分离较不明显。
实施例2
自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样(Exocell，USA)使用专利US 5,599,433中所述分析缓冲液实施毛细管电泳，该分析缓冲液含有100mM CAPS及300mM正硼酸，pH为10.20。所得A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图2中。HbA1c与HbA1a、A1b血红蛋白之间的分离明显不足；HbA1c电泳峰覆盖HbA1a/HbA1b峰。
实施例3
自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样(Exocell，USA)使用缓冲液组合物实施毛细管电泳，该缓冲液组合物含有200mM CAPSO及10mM腐胺(pH 10.20)，但不含正硼酸盐化合物亦不含硼酸根基化合物。所得A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图3中。对应于HbA1c的峰与HbAo的峰共迁移。
实施例4
自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样(Exocell，USA)使用含有200mM CAPSO、10mM腐胺及50mM正硼酸盐的缓冲液组合物(pH 10.20)实施毛细管电泳。所得A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图4中。对应于HbA1c的峰位于对应于HbAo及HbA1a/HbA1b的峰之间且太靠近对应于其它HbA1的峰以致于不能可靠测定HbA1c。
实施例5
自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样(Exocell，USA)使用含有200mM CAPSO、10mM腐胺及50mM 3-羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(pH 10.20)实施毛细管电泳。所得A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图5中。对应于HbA1c的峰位于对应于HbA1b及HbA1a的峰之间。
实施例6
自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样(Exocell，USA)使用含有200mM CAPSO、10mMDAB及50mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(pH 10.20)实施毛细管电泳。所得A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图6中。对应于HbA1c的峰位于对应于HbA1b及HbA1a的峰之后。
实施例7
自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样(Exocell，USA)使用含有200mM CAPSO、15mM阻流剂(腐胺)及100mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(pH 10.20)实施毛细管电泳。所得A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图7中。对应于HbA1c的峰位于对应于HbA1b及HbA1a的峰之后且不同于这些峰；血红蛋白HbA1c与血红蛋白HbA1a及HbA1b之间的分离极佳。
实施例8
自含有HbA0和/或糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样使用含有200mM CHES、20mM阻流剂(腐胺)及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)实施毛细管电泳。所得A0、A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图8中。对应于HbA1c的峰位于对应于HbA0、HbA1b及HbA1a的峰之后且明显不同于这些峰；血红蛋白HbA1c与HbA1a及HbA1b血红蛋白之间的分离极佳。
实施例9
自含有HbA0和/或糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样使用含有200mM CHES、20mM阻流剂(腐胺)及30mM 3，4-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)实施毛细管电泳。所得A0、A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图9中。可看出，对应于HbA1c的峰位于对应于HbA0、HbA1b及HbA1a的峰之后且明显不同于这些峰；血红蛋白HbA1c与HbA1a及HbA1b血红蛋白之间的分离极佳。
通过比较实施例8及9的电泳曲线，可看出，与其它部分相比，3，5-二羧基苯基硼酸可在分离HbA1c方面产生稍微较好的结果，而就聚焦而言3，4-二羧基苯基硼酸可获得稍微较好的结果。
实施例10
自含有糖化血红蛋白的不同纯化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的参考试样(Exocell，USA)使用含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)在(Sebia)上实施毛细管电泳。所得A1a、A1b及A1c的标准电泳曲线展示于图10中。可看出，对应于HbA1c的峰位于对应于HbA1b及HbA1a的峰之后且明显不同于这些峰；血红蛋白HbA1c与HbA1a及HbA1b血红蛋白之间的分离极佳。
实施例11
使用含有200mM CAPSO缓冲液、10mM腐胺及50mM 3，5-二羧基苯基硼酸(于pH 10.20下)、或200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸(于pH 9.40下)的缓冲液组合物对在溶血溶液(水+1g/L Triton X100)中稀释至1/6的正常人类血液实施通过毛细管电泳的分析。在(Sebia)上使用未经涂布的熔凝硅石毛细管获得的电泳图分别展示于图11A及11B中。在两种情形下，观察到血红蛋白HbA1c与其它血红蛋白形式完全分离。
实施例12
研究缓冲液组合物中的3，5-二羧基苯基硼酸的浓度对A1c与Ao血红蛋白之间的分离的影响。所用缓冲液组合物含有200mM CAPSO、15mM腐胺及0-120mM 3，5-二羧基苯基硼酸。结果展示于图12中。A1c/Ao分离随着3，5-二羧基苯基硼酸浓度而增大。
实施例13
在(Sebia)上使用在溶血溶液(水+1g/L Triton X100)中稀释至1/6的四种不同试样实施毛细管电泳：包含HbE变体的正常人类血液(图13)、AFSC对照(图14)、包含F及Bart变体的正常血液混合(图15)及包含HbD变体的正常人类血液(图16)。在含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)中使用未经涂布的熔凝硅石毛细管实施毛细管电泳。
图13至16显示血红蛋白的主要变体(E、F、S、C、D及Bart)不干扰HbA1c部分。然而，应注意，在Bart血红蛋白的情形下，Hb Bart与HbA1c部分之间的拆分并不完全。因此，为了能够在Hb Bart存在下测定HbA1c，该两个部分应能够使用适宜整合方法进行定量。若不可能进行此定量，则需要就此警告使用者，以防其观察到此类在预期峰上具有峰肩的曲线。
实施例14
将通过本发明方法使用(Sebia)分析仪通过毛细管电泳获得的结果与利用参考技术中之一即利用Variant II(Bio-Rad)分析仪的HPLC获得的结果进行比较。
在含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物中于pH 9.40下自在溶血溶液(水+1g/L TritonX100)稀释至1/6的全血实施毛细管电泳。
图17显示通过毛细管电泳进行分析的此新颖技术与通过利用来自Bio-Rad的Variant II的HPLC进行的HbA1c分析的极好关联。在使用2种校正剂(稀A1c及浓A1c)校正EC数据之后，通过本发明方法获得的值极为接近那些通过参考方法获得的值。
实施例15：证实使用本发明方法HbA1c的不稳定部分不干扰HbA1c测定的研究。
假定本发明分析方法中所用的复合葡萄糖及在碱性pH下提供负电荷的化合物能够与血液葡萄糖相互作用(此相互作用是假定的且未经证实)，则如下实施游离葡萄糖对HbA1c的血液结果的任意干扰的研究：于37℃下将正常血液用不同浓度的葡萄糖(0-50g/L)温育3小时以产生HbA1c的不稳定形式(在分子重排(Amadori重排)之前获得的形式)。在实施温育后，对血样进行离心并在生理水中重新构成所得颗粒，且随后使用来自Sebia的自动化机器(HbA1c凝胶)及使用(Sebia)技术使用含有200mM CHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸的缓冲液组合物(于pH 9.40下)并列分析溶血溶液(15μL颗粒+25μL生理水+160μL溶血溶液(水+1g/L TritonX100))。
通过在自动化机器上分析获得的HbA1c凝胶(参见图18A)证实形成不稳定HbA1c部分，其迁移至与HbA1c相同的水平且在与血液一起温育期间浓度随着葡萄糖浓度增大而增大。应注意，在凝胶中，在由Sebia界定的正常使用条件下，不稳定部分由于(具体而言)溶血溶液的酸性pH而并不出现。
相反，在(Sebia)上利用本发明缓冲液组合物(200mMCHES缓冲液、20mM腐胺及30mM 3，5-二羧基苯基硼酸，于pH 9.40下)对相同血样实施的分析显示，不管研究范围内的温育葡萄糖的浓度如何(0-50g/L)，测定均不受游离葡萄糖的存在的干扰：HbA1c的曲线及值不变(参见图18B及18C)。
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Claims (51)

1.一种通过毛细管电泳分析一种或若干种糖化血红蛋白的方法，所述糖化血红蛋白包含于含有血红蛋白的生物试样中且包含至少一条β珠蛋白链，该β珠蛋白链包含结合至该β珠蛋白链的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基，所述方法包括使用包含至少一种化合物的缓冲液组合物，该化合物包含一个或若干个在碱性pH下可阴离子化的基团且包含一个或多个硼酸基和/或硼酸根基团，该化合物能够专一性复合结合至该生物试样的糖化血红蛋白中的所述N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基并能使所述糖化血红蛋白在碱性pH下具有若干负电荷，所述方法用于通过毛细管电泳分析包含于含有血红蛋白的生物试样中的血红蛋白A1c。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或若干个在碱性pH下可阴离子化的基团包括一个或若干个羧酸根、羧基、磺酸根和/或磺酰基。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述包含一个或若干个在碱性pH下可阴离子化的基团且包含一个或多个硼酸基和/或硼酸根基团的化合物是：
(i)硼酸根基化合物，其具有通式RB(OH)2或RB(OH)3 -，其中基团R包含至少一个芳基和/或直链、支链或环状烷基和/或芳烷基和/或其它官能团或杂原子、和/或其组合，且所述基团R使糖化血红蛋白中与该硼酸根基团复合的每一葡萄糖残基在碱性pH下具有一个或若干个负电荷；或
(ii)所述硼酸根基化合物的盐。
4.如权利要求3所述的方法，其中该硼酸根基化合物是多取代的苯基硼酸酯。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述多取代的苯基硼酸酯经羧基和/或磺酰基基团二取代。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述硼酸根基化合物是基团R为二酸的化合物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述基团R为二羧酸。
8.如权利要求3所述的方法，其中该硼酸根基化合物是选自3,4-二羧基苯基硼酸及3,5-二羧基苯基硼酸的二羧基苯基硼酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述硼酸根基化合物是3,5-二羧基苯基硼酸。
10.如权利要求1所述的方法，其中在该缓冲液组合物中所述能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性pH下提供负电荷的化合物的浓度相对于蛋白质的总量、相对于该生物试样中存在的所有血红蛋白的总量或相对于该生物试样中存在的所有包含葡萄糖的血红蛋白的总量在化学计量上过量。
11.如权利要求1所述的方法，其中在该缓冲液组合物中所述能够专一性复合该生物试样中的糖化血红蛋白的葡萄糖残基并能在碱性pH下提供负电荷的化合物的浓度在0.10mM至100mM范围内。
12.如权利要求11所述的方法，其中在该缓冲液组合物中所述化合物的浓度在10mM至60mM范围内。
13.如权利要求11所述的方法，其中在该缓冲液组合物中所述化合物的浓度在20mM至50mM范围内。
14.如权利要求11所述的方法，其中在该缓冲液组合物中所述化合物的浓度是30mM。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液组合物还包含选自以下的阻流剂：脂族二胺；选自脂族聚胺、环状聚胺或脂族二胺盐的所述脂族二胺的衍生物；或其混合物之一。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述阻流剂是脂族二胺。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述脂族二胺选自1,3-二氨基丙烷、1,4-二氨基丁烷(腐胺)、1,5-二氨基戊烷(尸胺)、1,6-二氨基己烷、精胺及DETA。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述阻流剂是腐胺或衍生物。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的阻流剂的浓度在0.10mM至40mM范围内。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的阻流剂的浓度在10mM至30mM范围内。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的阻流剂的浓度在15mM至25mM范围内。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的阻流剂的浓度是20mM。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液组合物还包含：
-缓冲化合物，其pKa在8.0至11.0范围内；和/或
-碱；和/或
-盐；和/或
-适当的稀释溶液。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述盐是钠盐。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述钠盐是氯化钠。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述适当的稀释溶液是水。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述缓冲化合物是选自AMP、AMPD、AMPSO、N-二甘氨酸、CABS、CAPS、CAPSO、CHES、HEPBS、甲胺、TABS、TAPS、氨基乙磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸及Tris的两性离子化合物。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述缓冲化合物是CHES、CAPS或CAPSO。
29.如权利要求23所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的所述缓冲化合物的浓度在20mM至500mM范围内。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的所述缓冲化合物的浓度在50mM至400mM范围内。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的所述缓冲化合物的浓度在150mM至300mM范围内。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述缓冲液组合物中的所述缓冲化合物的浓度是200mM。
33.如权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液组合物的pH为9或更大。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述缓冲液组合物的pH在9.0至11.0范围内。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述缓冲液组合物的pH在9.0至10.0范围内。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述缓冲液组合物的pH为9.4。
37.如权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：
a)将所述缓冲液组合物及生物试样引入电泳毛细管中；及
b)通过毛细管电泳分离所述生物试样的各成分。
38.如权利要求37所述的方法，其中在分离所述生物试样中各成分的步骤后实施检测该生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白的步骤。
39.如权利要求37或38所述的方法，其还包括自与所检测血红蛋白之量成比例的检测信号产生电泳图的步骤。
40.如权利要求1所述的方法，其还包括如下步骤：测定所述生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白的量和/或该生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白相对于该生物试样中存在的蛋白质总量、血红蛋白的总量或某些血红蛋白的量的比例。
41.如权利要求1所述的方法，其还包括如下步骤：自检测信号产生的电泳图测定所述生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白的量和/或该生物试样中所存在的一种或若干种血红蛋白相对于该生物试样中存在的蛋白质总量、血红蛋白的总量或某些血红蛋白的量的比例，所述检测信号与所检测的血红蛋白的量成比例。
42.如权利要求1所述的方法，其还包括相对于一种或若干种标准化校正剂对所述生物试样中存在的一种或若干种血红蛋白进行定量的步骤。
43.如权利要求1所述的方法，其中所述生物试样是血样。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述生物试样是正常或不正常血样、经洗涤、经倾析、经离心血样或全血血样，所述试样适宜时经溶血。
45.如权利要求1所述的方法，其中将所述生物试样稀释于选自下述的溶血溶液中：
-溶血溶液血红蛋白(e)；
-溶血溶液HbA1c；
-溶血溶液血红蛋白(e)；
-纯水；
-补充有表面活性剂的水；及
-其混合物。
46.一种缓冲液组合物，其适于通过毛细管电泳分析一种或若干种糖化血红蛋白，所述糖化血红蛋白包含结合至至少一条β珠蛋白链上的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基且包含于含有一种或若干种血红蛋白的生物试样中，所述组合物如权利要求1至35中任一项中所定义。
47.一种试剂盒，其包含如权利要求46所述的缓冲液组合物且若适当则包含使用说明。
48.如权利要求1至9中任一项中所定义的专一性复合结合至生物试样的糖化血红蛋白的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基并在碱性pH下提供负电荷的化合物、和/或如权利要求1至36或46中任一项所定义的缓冲液组合物和/或如权利要求47所述的试剂盒，在制备用于体外诊断人类或非人类哺乳动物的糖尿病和/或监测人类或非人类哺乳动物的血糖平衡的诊断产品中的用途。
49.一种如权利要求1至9中任一项中所定义的能够专一性复合结合至生物试样的糖化血红蛋白的N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基并能在碱性pH下提供负电荷的化合物、和/或如权利要求1至36或46中任一项所定义的缓冲液组合物和/或如权利要求47所述的试剂盒用于下述的用途：通过毛细管电泳分离一种或若干种糖化血红蛋白与其它蛋白质，所述糖化血红蛋白包含至少一条β珠蛋白链，该β珠蛋白链含有结合至N-端位置处的氨基酸的葡萄糖残基。
50.如权利要求49所述的用途，其中所述其他蛋白质是生物试样中存在的至少另一种血红蛋白。
51.如权利要求49所述的用途，其中所述其他蛋白质是生物试样中存在的其他血红蛋白。
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