CN111132695A - 分析样品基质中蛋白变异体的成像毛细管等电聚焦 - Google Patents

Abstract

本公开的实施方案涉及与一种用于分析诸如血管内皮生长因子VEGF‑Trap的蛋白的电荷变异体的方法对应的方法、系统、装置和试剂盒。

Description

分析样品基质中蛋白变异体的成像毛细管等电聚焦

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月18日提交的美国临时申请序列号62/547,602的优先权，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交并且据此以全文引用的方式并入。2018年8月15日创建的所述ASCII拷贝名为REGE-005_001WO_ST25.txt并且大小为4,214字节。

技术领域

本公开的领域涉及用于分析样品基质中诸如VEGF Trap的蛋白的电荷变异体的方法和系统。

背景技术

电荷变异体的分析常常是用作生物医药的各种蛋白所需的，因为此类变化可影响药物活性、稳定性，并且在一些情况下影响患者安全性。工业上用于鉴别和表征电荷变异体所采用的常规方法包括离子交换色谱、等电聚焦凝胶电泳和毛细管等电聚焦。成像毛细管等电聚焦由于其分辨率高、样品体积小以及运行时间快而被发现是可用的。因此，使用成像毛细管等电聚焦来确定诸如VEGF Trap的蛋白的电荷变异体的方法和系统将是有益的。

发明内容

本文描述用于各种蛋白的电荷变异体分析的方法和系统。例如，所述方法和系统可用于分析VEGF Trap的电荷变异体。不是通过当前认可的用于分析VEGF Trap的方法，即对等电聚焦凝胶中的带3-9进行分组来报告电荷异质性分布，这里描述的方法和系统一般使用成像毛细管等电聚焦来根据电荷变异体同种型的百分比报告电荷异质性，并将其分组成电泳图的三个不同区域。此报告方法可对VEGF Trap样品的同种型中发生的变化更灵敏。

如上面所提到的，本公开的实施方案涉及用于确定蛋白的电荷变异体的方法、系统和装置，并且具体地，涉及评估诸如血管内皮生长因子(VEGF)阻断剂的蛋白的电荷变异的成像毛细管等电聚焦(iCIEF)测定，在下文中称为“VEGF-Trap”。iCIEF是当前认可的用于VEGF-Trap电荷变异体分析的等电聚焦(IEF)方法的替代方法。

iCIEF的实施方案对应于基于等电点(pI)分离蛋白电荷变异体的技术。例如，在一些实施方案中，将蛋白样品加载到包含载体两性电解质(例如，PharmalyteTM)、甲基纤维素和稳定添加剂(即尿素)的混合物的分离毛细管上。施加电压持续预先确定的时间段，导致载体两性电解质在毛细管内形成pH梯度。在一些实施方案中，施加电压持续对应于“聚焦”时间的较长的第二时间段。这导致蛋白电荷变异体在毛细管内迁移，直至到达变异体的总电荷为中性的点(即，其pI)。

在此类实施方案中，毛细管(其涂覆有氟碳化合物(FC))联接到数码(例如，CCD)相机，从而使得能够直接检测和定量蛋白电荷变异体。具体地，在聚焦时间之后，CCD相机被配置为对毛细管进行成像(优选地实时成像)来检测毛细管内的蛋白。在一些实施方案中，检测发生在约280nm的波长处。此技术中的参数包括：

-两性电解质的品牌和浓度；

-使用的添加剂的类型和浓度；以及

-聚焦时间和样品浓度。

毛细管内蛋白的聚集和沉淀不利于电泳图的再现。为此，可使用诸如尿素的添加剂来在聚焦时帮助稳定和溶解蛋白。

因此，在一些实施方案中，提供一种用于分析血管内皮生长因子VEGF-Trap的电荷变异体的方法，并且所述方法包括：将蛋白样品加载到具有至少载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物的分离毛细管上；施加第一电压持续第一预先确定的时间段，使得载体两性电解质在毛细管内形成pH梯度；施加第二电压持续第二预先确定的时间段以聚焦蛋白的电荷变异体向其各自pI的迁移；以及检测和定量蛋白的电荷变异体。

在此类实施方案中，检测和定量电荷变异体包括：测量多个电荷变异体同种型的吸光度；将所述多个电荷变异体同种型分离成至少包括第一酸/酸性区(R1)、第二中性区(R2)和第三碱/碱性区(R3)的隔离区；以及确定落在区域R1、R2和R3中的每个区域内的电荷变异体同种型的百分比。

对于此类实施方案，用于检测和定量的图像分析可根据常规方法和系统(例如，图像分析软件)。

在上面总结的实施方案中，可包括以下附加特征/功能性中的一个和/或另一个(得到另外的发明实施方案)，然而，应当指出的是，这些特征中的任一个或多个可以不同但仍在本发明的范围内，下面提供的列表只是一个实施方案：

-进行电荷变异体的检测和定量；

-电荷变异体的检测发生在约280nm的波长处；

-加载到毛细管上的蛋白浓度为约2.0mg/ml；

-稳定添加剂包含尿素；

-混合物中尿素的量包括约2M；

-混合物包括约0.35％的甲基纤维素；

-第一电压包括1500V；

-第一预先确定的时间为约1分钟；

-第二电压包括3000V；

-第二预先确定的时间为约7分钟；

-加载到毛细管上的蛋白的浓度在约1.0mg/ml与8.0mg/ml之间；

-混合物中尿素的量大于0M且小于约8M；

-混合物包括在约0.01％与约0.35％之间或任何中间范围的甲基纤维素；

-第一电压在约1V与约3000V之间或任何中间范围；

-第一预先确定的时间在约1秒与约5分钟之间或任何中间范围；

-第二电压在约1V与约3000V之间或任何中间范围；和/或

-第二预先确定的时间在约1分钟与约14分钟之间或任何中间范围。

在一些实施方案中，提供一种被配置用于在VEGF-Trap的电荷变异体分析中使用的iCIEF毛细管，并且所述iCIEF毛细管包括被配置为接收蛋白并且被配置成具有载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物的毛细管。毛细管还可包括碳氟化合物涂层。

在一些实施方案中，提供一种被配置用于在VEGF-Trap的电荷变异体分析中使用的iCIEF试剂盒，并且所述iCIEF试剂盒包括被配置为接收蛋白并且被配置成具有载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物的一个或多个毛细管，其中所述毛细管包括碳氟化合物涂层。

附图说明

图1A至图1F示出使用不同两性电解质的VEGF Trap的电泳图。在图1A中，两性电解质是pI在3-10范围内的的Pharmalyte^TM；在图1B中，两性电解质是pI在5-8范围内的的Pharmalyte^TM和pI在8-10.5范围内的Pharmalyte^TM的组合；在图1C中，两性电解质是pI在2-9范围内的Servalyt^TM；在图1D中，两性电解质是pI在4-9范围内的Servalyt^TM；在图1E中，两性电解质是pI在3-10范围内的Biolyte^TM；并且在图1F中，两性电解质是pI在3-10范围内的Pharmalyte^TM和pI在6.7-7范围内的Pharmalyte^TM的组合。

图2A至图2E比较在不同尿素浓度下的VEGF Trap的电泳图。

图3比较使用等电聚焦与成像毛细管等电聚焦方法获得的VEGF Trap的电泳图。

图4A至图4G示出使用等电聚焦和成像毛细管等电聚焦方法的VEGF Trap OFFGEL级分分析(级分5号-10号)。

图5A至图5F示出掺加图4A至图4G中分析的VEGF Trap OFFGEL级分(级分5号-10号)的VEGF Trap RS的电泳图。

图6比较掺加独立标志物的空白与VEGF Trap的电泳图。

图7A示出分配了区域1、2和3的VEGF Trap RS样品的成像毛细管等电聚焦电泳图。

图7B示出等电聚焦方法与成像毛细管等电聚焦方法之间的在电泳图报告中的差别。

图8提供使用与VEGF Trap稳定性相关的成像毛细管等电聚焦所获得的数据。

图9提供使用对强制降解的VEGF Trap样品进行的成像毛细管等电聚焦所获得的稳定性数据。

图10A至图10C示出图9中提供的成像毛细管等电聚焦数据的统计分析。

图11提供与成像毛细管等电聚焦方法的线性度相关的数据。

图12比较两性电解质的三个样品的成像毛细管等电电泳图。

图13A至图13D示出从历史VEGF Trap样品获得的成像毛细管等电聚焦数据的统计分析。

具体实施方式

本文描述用于诸如VEGF Trap的各种蛋白的电荷变异体分析的方法和系统。VEGFTrap是包含表1所示的序列的融合蛋白。不是通过当前认可的用于分析VEGF Trap的方法，即对等电聚焦凝胶中的带3-9进行分组来报告电荷异质性分布，这里描述的方法和系统一般使用成像毛细管等电聚焦来根据电荷变异体同种型的百分比报告电荷异质性，并将其分组成电泳图的三个不同区域。如前所述，此报告方法可对VEGF Trap样品的同种型中发生的变化更灵敏。

表1-VEGF Trap序列

本公开全篇使用下列缩写：

-iCIEF-成像毛细管等电聚焦

-IEF-等电聚焦

-pI-等电点

-RS-参考标准

-DS-原料药

-DSI-原料药中间体

-FDS-配制原料药。

用于分析VEGF Trap的电荷变异体的方法一般包括：将蛋白样品加载到包含至少载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物的分离毛细管上；施加第一电压持续第一预先确定的时间段，使得载体两性电解质在毛细管内形成pH梯度；施加第二电压持续第二预先确定的时间段以在毛细管内聚焦蛋白的电荷变异体的迁移，使得变异体的总负荷为中性；以及检测和定量蛋白的电荷变异体。

分离毛细管可加载有在约0.5mg/mL至约2mg/mL范围内的浓度的VEGF Trap。例如，分离毛细管可加载有约0.5mg/mL、约1.0mg/mL、约1.5mg/mL或约2mg/mL的浓度的VEGFTrap。在一些实施方案中，分离毛细管加载有约1.0mg/mL的浓度的VEGF Trap。

混合物中甲基纤维素的量可在约0.01％至约0.35％的范围内。例如，混合物中甲基纤维素的量可为约0.01％、约0.05％、约0.10％、约0.15％、约0.20％、约0.25％、约0.30％或约0.35％。在一些实施方案中，混合物中甲基纤维素的量为约0.35％。

对于第一电压，其可以在约1V至约3000V的范围内。例如，第一电压可为约1V、约100V、约500V、约1000V、约1500V、约2000V、约2500V或约3000V。在一些实施方案中，第一电压为约1500V。

第二电压也可以在约1V至约3000V的范围内。例如，第二电压可为约1V、约100V、约500V、约1000V、约1500V、约2000V、约2500V或约3000V。在一些实施方案中，第二电压为约3000V。

第一预先确定的时间可在约1秒至约5分钟的范围内。例如，第一预先确定的时间可为约1秒、约10秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约1分钟(60秒)、约1.5分钟(90秒)、约2分钟(120秒)、约2.5分钟(150秒)、约3分钟(180秒)、约3.5分钟(210秒)、约4分钟(240秒)、约4.5分钟(270秒)或约5分钟(300秒)。在一些实施方案中，第一预先确定的时间为约1分钟(60秒)。

第二预先确定的时间可在约1分钟至约14分钟的范围内。例如，第二预先确定的时间可为约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟或约14分钟。在一些实施方案中，第二预先确定的时间为约7分钟。

在混合物中可采用任何合适的添加剂。在一些实施方案中，使用尿素作为添加剂可以是有益的。例如，将2M尿素包括在混合物中可以是有益的。各种试剂(两性电解质)也可以包括在混合物中，详情如下。在一个实施方案中，将VEGF Trap以1.0mg/mL的浓度加载到毛细管中，并且使用成像毛细管等电聚焦方法进行分析，所述方法采用0.35％的甲基纤维素、2M尿素和具有3-10的pI的3％的两性电解质的混合物。

试剂和设备。下面的表2列出根据本公开的一些实施方案所使用的试剂(两性电解质)和设备。进行的实例利用iCE3

电荷变异体分析仪。除非另有说明，在方法开发和表征期间，将VEGF-Trap参考标准(RSVITV-5)用作测试制品。

表2-使用的示例试剂和其他组分

至少一些实施方案的实例：

基于pI范围和两性电解质来源初始进行两性电解质筛分。从三个不同来源获得四种两性电解质，每种覆盖独特的pI范围。使用以下起始来分析两性电解质：

-2.0mg/mL蛋白浓缩物；

-2M尿素；

-0.35％甲基纤维素；

-在1500V下预聚焦1分钟；以及

-在3000V下聚焦7分钟。

图1A至图1F示出使用六种两性电解质范围与iCE3电荷分析仪所获得的电泳图。使用以下两性电解质范围：

图A-3-10Pharmalyte 图B-5-8/8-10.5组合Pharmalyte

图C-2-9Servalyt 图D-4-9Servalyt

图E-Bio-Lyte 3-10，40％图F-3-10Pharmalyte与6.7-7.7Pharmalyte的3-共混物

所选蛋白。pI在3-10范围内的两性电解质被选为iCIEF电泳图的总体概图(profile)，因为其与来自目前认可的VEGF-Trap电荷变异体分析程序的电泳图最为相似(参见例如图3所示的IEF图像)。

尿素优化。根据一些实施方案，方法优化还包括改变尿素浓度(从无尿素至8M)。图2A至图2E示出此类变化的尿素浓度对VEGF-Trap RSVITV-5样品电泳图的影响。虽然尿素浓度的降低通常改善分辨率，但是发现增加的尿素(8M)导致分辨率降低。然而，在天然条件(无尿素)下解析的VEGF-Trap具有分辨率降低和再现性不足的类似问题。因此，当使用1M-3M尿素浓度分离时，VEGF-Trap的总体峰型和分辨率彼此相当。

使用2M尿素进行进一步的实验以优化两性电解质3-10的浓度和蛋白的浓度。图3示出在1.0mg/mL蛋白浓度下使用2M尿素、0.35％的甲基纤维素和3％的3-10两性电解质获得的电泳图。将iCIEF电泳图与另一个电泳图进行比较，并且进行暂定的峰分配(图3)。

方法表征。使用iCIEF测定方法获得的总电荷概图和峰型与IEF带概图相当(如图2A至图2E所示)。然而，为了进一步理解IEF测定方法并将其带型(banding pattern)与使用iCIEF分析获得的峰型联系起来，对VEGF-Trap样品进行OFFGEL分级。使用IEF和iCIEF测定方法对从OFFGEL电泳获得的各个电荷变异体级分进行分析。使用Agilent 3100OFFGEL分级器来根据VEGF-Trap参考标准的等电点对其进行分级，并且使用两种方法IEF和iCIEF来对作为液体级分回收的分离的同种型进行分析。使用固定pH梯度胶条(Immobilized pHGradient strip；IPG胶条)对VEGF-Trap RS进行分级，其中pH为6-9，覆盖针对VEGF-Trap观察到的电荷变异体的pI范围。实验和分离的详细设置如下：

1)通过将2.3mL 50％甘油、230.4μl IPG缓冲液(pH 6-11)和16.64ml水合并以得到总体积19.2ml来制备储备溶液。

2)通过将73μg VEGF(4.2mg)添加到12mL储备溶液和3mL水中来制备VEGF Trap溶液。

3)通过将1.15mL水和4.6mL储备溶液合并来过量地制备IPG胶条再水化溶液。

4)在两个仪器托盘的每隔一个泳道中布置pH在6-9范围内的IPG凝胶条(24cm)，并且在它们上方的适当位置固定24孔框架。将标准OFFGEL试剂盒方案(参见OFFGEL usermanual:Agilent 3100OFF GEL Fractionator Kit quick Start Guide,2010年9月第5版)用于胶条再水化、抗体加载以及将托盘装载到仪器上。

5)使用20℃的平台温度。使用50μA的恒定电流运行针对24孔装置的标准仪器蛋白聚焦方法，其中最大电压设定为8000V且最大功率设定为200mW。

6)分级34h后，停止运行并将来自孔3至12的每个泳道的类似孔数汇集，然后交换到水中，并且浓缩约5倍之后进行分析。

7)通过在Nanodrop(一种确定级分浓度的仪器)上测量在280nm处的吸光度(消光系数为1.15)，然后将级分体积乘以浓度来确定每个级分中的抗体量。

简而言之，使用12个IPG胶条对4.2mg VEGF-Trap RS分级32小时；在渗析后将来自对应于相同pI范围的每个胶条的各个级分汇集并定量。分级后，使用IEF和iCIEF对具有足够回收率的总共七个级分(级分4-级分10)进行分析。使用两种方式对级分进行分析：使用IEF和iCIEF测定方法对OFFGEL级分(4-10)进行单独分析(参见图4)，以及将OFFGEL级分(5-10)掺加到VEGF-Trap RS中，之后使用IEF和iCIEF来分析添加的样品(参见图5)。表3列出从OFFGEL分级研究中回收的级分以及对应的量。

表3

除使用IEF和iCIEF独立地分析OFFGEL级分之外，以1:0.1(VEGF-Trap RS:级分)的比率掺加回收率较高的级分(5-10)并通过两种电荷变异体分析方法进行分析。图5示出掺加使用iCIEF(上图)和IEF(下图)测定方法分析的VEGF-Trap OFFGEL级分(5-10)的VEGF-Trap RS的一组电泳图。对于掺加到RS中的每个OFFGEL级分，重叠了IEF和iCIEF测定方法的对应对照RS(未掺加)。掺加和未掺加(RS+OFFGEL和RS)样品的重叠有助于可视化和理解IEF与iCIEF测定方法之间峰型的相关性。在每个图中，使用从酸性级分(图5A)开始到碱性级分(图5F)的箭头来强调与掺加的级分对应的电荷物质的增强。

根据OFFGEL级分的分析，基于凝胶的IEF带型与基于毛细管的iCIEF峰型之间的相关性显而易见。从图4和图5(连同掺加级分的各个级分分析)可以推断，对于VEGF-Trap，通过当前认可的IEF凝胶方法实现的电荷同种型分离与使用基于毛细管的iCIEF方法获得的峰型相当且相似。

使用iCIEF方法报告电荷变异体分布。当前认可的用于VEGF-Trap电荷变异体分布的IEF方法通过将IEF凝胶的带3-9进行分组来报告电荷变异百分比。使用例如肌红蛋白(独立的蛋白标志物)作为指导物以基于肌红蛋白的pI鉴别带数，计算带3-9的面积百分比的总和并报告。IEF方法的当前规范接受标准(SPEC)为82％(带3-9)。

新的iCIEF测定方法采用类似方法，其中将来自ProteinSimple的独立标志物，pI7.05标志物登录号102226掺加到iCIEF主混合物(2M尿素、0.35％甲基纤维素、3％3-10两性电解质)中。图6(上图)示出掺加到主混合物中的标志物7.05的iCIEF电泳图，主混合物中的包围(bracketing)pI 5.12和pI 9.50标志物用于校准目的。图5的下图示出VEGF-Trap RS的iCIEF电泳图，其重叠了含有掺加的7.05标志物的空白，所述标志物将用于鉴别VEGF-Trap iCIEF样品概图中的峰5。标志物峰7.05在峰4与峰5之间的pI处迁移，并且其将用于鉴别VEGF-Trap的主同种型的群集(峰5、峰6和峰7)中的主峰6。

不是像IEF方法那样报告峰3-9，iCIEF方法(根据一些实施方案)根据分组为区域1(酸性)、区域2(中性)和区域3(碱性)的电荷变异体同种型的百分比来报告VEGF-Trap样品的电荷异质性。将VEGF-Trap iCIEF电泳图中在中性pI范围周围迁移并且为最突出的同种型的三个主峰(峰编号5、6和7)的群集分组为区域2(中性)。在三个峰的群集中，如图7所示使用掺加在空白注射中的独立的pI 7.05标志物鉴别与迁移到特定pI的主峰5对应的不同的同种型。将VEGF-Trap iCIEF样品中的区域1(酸性)报告为与VEGF-Trap电泳图中的三个主峰(峰5、6和7)的群集相比相对酸性的峰组。将VEGF-Trap iCIEF样品中的区域3(碱性)报告为与VEGF-Trap电泳图中的三个主峰(峰5、6和7)的群集相比相对碱性的峰组。

与传统的基于IEF凝胶的方法的带3-9的分组相对比，使用区域1、2和3的报告方法提供允许通过监测3个区域(区域1、2和3)来更严格地控制电荷变异体同种型的优势。图7B示出IEF报告与根据本公开的iCIEF方法的实施方案的报告之间的差别。此外，根据区域1、2和3的报告为iCIEF测定方法提供独特的优势，即与传统的方法相比，其对电荷变异体同种型变化的灵敏度早得多。这使得与先前的IEF测定过程相比，iCIEF测定的读出灵敏得多且为更好的稳定性指示测定。下面的表4给出与IEF测定的传统的3-9报告相对比，iCIEF测定方法采用的新分组方法的稳定性指示能力的实例。通过两种报告方法，即区域分组和类似于IEF测定方法的峰3-9，使用新的iCIEF测定来对加速的VEGF-Trap稳定性样品进行分析并将其与IEF测定方法的历史结果进行比较。

在表4(在下面)中可以看出，区域1、2和3分组方法对VEGF-Trap样品的电荷变异体分布的变化更灵敏且更有指示性。IEF方法示出带3-9的总电荷分布下降2％的变化，并且此变化与使用3-9峰方法分组时的iCIEF测定方法的结果相当。然而，从表4显而易见，对于25℃加速应力的VEGF-Trap样品，使用iCIEF测定观察到区域1(或酸性变异体)增加5％并且区域3(碱性变异体)伴随地减少约5％。在iCIEF测定中的VEGF-Trap电荷分布中观察到的这种趋势准确反映了VEGF-Trap样品中发生的的变化的实质是基于其由其不同程度的唾液酸化所致的结构和电荷模式的复杂性。在加速的热应力作用下使用iCIEF测定方法，VEGF-Trap样品的酸性变异体(区域1-高度的唾液酸物质)增加反映可能的脱酰胺和聚集作用。另一方面，通过IEF方法的使用传统3-9个带的分组掩蔽了在VEGF-Trap电荷同种型中发生的细微变化并且不能控制不同的电荷物质，使其灵敏度不如检测到VEGF-Trap样品的电荷异质性的细微变化的方法。

VEGF-Trap具有10个糖基化位点。连接至这些位点的聚糖链是分支的，并且每个分支的末端可能为或不为带负电的糖单体唾液酸。在聚糖链末端存在唾液酸基团的情况下，自然变异导致具有一定范围的净电荷的VEGF-Trap电荷变异体的集合。这些带的比例根据存在的带电物质的丰度而变化。因此，基于区域1(严重唾液酸化)、区域2(中度唾液酸化)和区域3(最少唾液酸化)对各种电荷物质进行分组的新报告方法使iCIEF测定对VEGF-Trap样品的唾液酸转化(sialylform)中发生的变化有更好的响应。

表4

iCIEF测定方法的稳定性指示能力。使用跨越24个月的时间段的7个独立的时间点对VEGF-Trap DP样品(保持在2-8℃)的实时稳定性样品进行分析；表5(在下面)示出与此研究对应的数据。这些VEGF-Trap样品的历史IEF数据被提供用于参考，并且与区域分组和3-9峰报告的VEGF-Trap iCIEF数据进行比较。在2-8℃的实时存储条件下，基于历史IEF数据几乎未观察到VEGF-Trap样品的显著变化，当使用iCIEF 3-9峰方法报告时，观察到类似的趋势。

表5-使用iCIEF分析的实时VEGF-Trap样品

图8示出使用iCIEF在24个月时间段内VEGF-Trap的区域1、2和3的百分比的线性拟合。从曲线图明显看出区域1的小而稳定的增加和区域3的降低。

使用新的iCIEF测定方法，使用强制降解的VEGF-Trap DS样品进行附加分析。对于此研究，使用iCIEF方法(区域和3-9)在0、3、9和15天的时间点分析稀释并在45℃下在15天的时间段内施加应力的热降解VEGF DS样品。从表6(在下面)明显看出，当与强制降解VEGF-Trap样品的在较早时间点的3-9峰值报告相比，当使用区域方法分组时对于iCIEF测定方法观察到酸性电荷变异体(区域1)的细微增加。尽管3-9％报告示出在3-9峰中总电荷分布的2％变化，但是在相同条件下区域1示出7％的增加，而区域3示出伴随时间变化的8％的降低。图9示出使用iCIEF测定方法的强制降解VEGF-Trap样品的电泳图；从概图明显看出酸性物质增加。

表6-使用iCIEF(热应力)分析的强制降解VEGF-Trap样品的百分比分布

通过与VEGF非应力样品的相应峰百分比相比较，对VEGF-Trap应力样品的三个区域的百分比分布进行统计分析。图10A至图10C示出iCIEF数据的热应力VEGF-Trap样品的统计分析。分别观察到区域1和3的统计学显著变化。

基于iCIEF测定方法的表征和优化数据，得到测定参数，并且制成表7(在下面)。评估这些方法条件的线性度、准确度、精确度和中间精确度。

表7-从开发和优化实验得到的关键方法参数

尿素	2M
		甲基纤维素	0.35％
两性电解质3-10	3％
		VEGF-Trap	1.0mg/mL
预聚焦	在1500V下1min
		聚焦	在3000V下7min

iCIEF测定方法定量。iCIEF测定方法的线性度。由单个分析员评估方法线性度。使用VEGF-Trap参考标准，在0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL和2.0mg/mL的不同蛋白浓度下制备样品溶液。在此实验中，样品基质中的蛋白浓度在0.5mg/mL至2mg/mL变化，同时保持其他基质组分恒定在3％两性电解质3-10和0.35％甲基纤维素。聚焦时间也保持恒定在1+7分钟。表8总结了在0.5mg/mL至2.0mg/mL线性范围内VEGF Trap样品的区域1、2和3的百分比分布。图11中提供VEGF-Trap样品的浓度作为面积计数的函数的线性度曲线图。

表8-iCIEF测定方法的线性度

基于回归分析，分析展示在0.5mg/mL至2.0mg/mL的蛋白浓度范围内的可接受的线性度，其中R2＞0.99。此外，在此相同的浓度范围内，同种型分布保持一致。这指示，所述分析能够提供在0.5mg/mL至2.0mg/mL的蛋白浓度范围内峰面积和同种型分布的一致结果。

iCIEF测定方法的准确度。通过与1.0mg/mL的标称浓度相比，使用线性数据基于稀释比例评估方法准确度。以下表9中示出基于线性度数据的稀释回收率。使用＝(测量面积百分比/标称面积百分比)×100％计算回收率百分比。

表9-基于稀释比例的VEGF-Trap iCIEF测定的准确度

对于VEGF-Trap样品，在0.5mg/mL至2.0mg/mL的蛋白浓度范围内，三个区域的基于稀释比例的回收率在98％-101％内。

iCIEF方法的中间精确度分析。中间精确度由两个单独的分析员(A，B)使用其各自的试剂制剂例并且使用两个iCE3电荷变异体分析仪仪器在4天内对VEGF Trap RS样品进行评估。以下表10中列出分析的结果。

表10-中间精确度分析的结果

当由不同的分析员使用不同的试剂制剂执行时，提出的VEGF-Trap iCIEF测试方法展示可接受的精确度。对所有三个区域的总体RSD％进行计算，并且其在2％的RSD内。

iCIEF测定方法的稳健性。通过各种实验评估分析方法稳健性的若干要素。这些实验列于表11中。

表11-方法稳健性实验的总结

机器中制备的溶液稳定性。通过制备在样品基质中的参考标准的样品并使用iCIEF分析样品来评估溶液稳定性。在10℃下、在由3％两性电解质3-10、0.35％甲基纤维素和2M尿素组成的基质中分析后，将样品存储在iCE3仪器中。约24小时后再次分析样品。每次分析的同种型分布呈现在下面的表12中。

表12-机器中制备的iCIEF样品稳定性的结果

样品名称	区域1％	区域2％	区域3％
				VEGFRS在时间为0时注射1	29.49	45.72	24.80
VEGFRS在时间为0时注射2	29.88	45.62	24.50
				VEGFRS在时间为24小时时注射1	29.52	45.92	24.56
VEGFRS在时间为24小时时注射2	29.95	45.74	24.31
				差值％	0.46	0.30	0.49

基于在每个时间点观察到的范围(最大值和最小值)，计算在T＝O时分析的样品与在T＝24小时再次分析的样品之间的绝对差值。所述三个区域的绝对差值等于或小于0.5％。这指示，当在10℃下储存在iCE3电荷变异体分析仪中时，样品在基质中稳定多至24小时。

两性电解质(3-10)样品的评估。对同一来源的3-10两性电解质的若干样品进行分析。使用不同样品分析的VEGF-Trap样品的总电荷变异体概图相当。对于一些两性电解质样品，在区域1中观察到电泳图概图的峰型的微小差异，然而，百分比分布是相似的并且在测定波动范围内。图12示出三种两性电解质样品的代表性电泳图。

实施例-使用新的iCIEF测定方法分析历史VEGF-Trap释放样品(DS、FDS和DSI)

为了进一步确立iCIEF测定方法的稳健性，使用了使用两种两性电解质样品的iCIEF分析总计37个与谱系无关的独特的历史VEGF-Trap样品。分析包括15个VEGF-TrapDSI(原料药中间体，水性缓冲溶液，pH 6.2，包含5mM磷酸钠、5mM柠檬酸钠和100mM氯化钠)、10个VEGF-Trap DS样品(原料药SPEC C701，水性缓冲溶液，pH 6.2，包含10mM磷酸钠)和12个VEGF-Trap FDS样品(配制原料药，SPEC C713水性缓冲溶液，pH 6.2，包含10mM磷酸钠、40mM氯化钠、0.03％(w/v)聚山梨酯20和5％(w/v)蔗糖)。使用iCIEF测定方法分析这些VEGF-Trap样品。

两性电解质是等电点的范围在3与10之间的两性化合物的不同同系物的混合物，其有助于建立在电场影响下的pH梯度。iCIEF测定方法中使用的两性电解质3-10购自一个来源，它们通常是批量生产的。基于供应商的建议以及我们对其他蛋白的iCIEF测定的工作知识，观察到不同样品之间的轻微不同并且这种轻微不同是不可避免的。因此，为了确立新的iCIEF测定在不同两性电解质样品中的稳健性，分析了两种两性电解质样品。使用提出的区域分组方法(R1、R2和R3)并且还基于与IEF测定方法相似的3-9峰分组分析了DS、DSI和FDS产品阶段的VEGF样品。图13A至图13C示出VEGF-Trap DS、DSI和FDS样品的两性电解质样品随区域1、2和3以及峰3-9变化的统计分析。表13提供一种两性电解质样品的与37个VEGF-Trap样品对应的的数据。表14至表16提供37个样品的完整数据集。

表13-使用iCIEF测定过程分析的历史VEGF-Trap DSI、DS和FDS样品

表14-通过Pharmalyte样品分析的DSI批

VEGFTrapDSI样品	R1％	R2％	R3％	3至9个峰％
					1	30.2	43.1	26.7	87.9
2	27.8	44.4	27.8	88.8
					3	28.0	44.5	27.6	88.9
4	27.9	44.4	27.8	88.7
					5	28.8	44.8	26.4	85.3
6	27.5	44.3	28.2	87.1
					7	23.7	41.4	34.9	89.7
8	26.9	42.9	30.2	88.4
					9	28.5	45.1	26.4	89.3
10	27.6	43.9	28.4	88.7
					11	28.3	44.9	26.8	88.3
12	28.1	44.6	27.3	87.8
					13	28.2	43.7	28.1	87.8
14	27.6	43.5	28.9	87.9
					15	29.3	44.7	26.0	89.2

表15-通过Pharmalyte样品分析的DS批

表16-通过Pharmalyte样品分析的FDS批

基于区域1、2和3以及3-9分组方法收集的两性电解质样品的数据进行配对分析(图13D)。配对分析的数据用于比较两种两性电解质之间的平均值，并且用于评估由于两性电解质样品的固有差异而可能观察到的测定报告的任何差异。基于数据可以推断，当根据区域进行报告时，三个区域R1、R2和R3的样品之间的最大观察平均差值小于0.1％。此外，基于p值可以断定，使用区域方法，两个两性电解质样品之间的在区域1、2和3中的百分比分布统计学不显著。

然而，当使用与IEF测定方法相似的3-9个峰分组方法分析DS、DSI和FDS样品的VEGF-Trap数据集时，注意到一些两性电解质样品之间的统计学显著的差异。例如，在一些样品之间，当根据iCIEF测定方法的峰3-9报告时，平均差值高达4.8％。图13A至图13D示出使用不同两性电解质样品获得的iCIEF概图，并且从图像中明显看出，在两性电解质样品之间观察到的波动被限制在酸性区域，并且通过分组区域1、2和3掩蔽波动。这使得iCIEF测定的区域报告方法成为稳健且可再现的方法。

基于百分比区域1、2和3分组，使用两性电解质样品的DSI、DS和FDS样品分析的数据使得iCIEF测定成为更稳健的测定方法。

因此，本公开呈现的iCIEF系统、方法和装置定量了VEGF-Trap原料药、原料药中间体、配制原料药和药物产品的电荷变异体概图。此类实施方案可用于替换当前认可的基于凝胶的IEF方法以用于VEGF-Trap的电荷异质性分析。

使用OFFGEL 3100分级器分级的VEGF-Trap电荷变异体证明了基于毛细管的iCIEF测定方法获得的峰与基于凝胶的IEF测定过程获得的带之间的相关性。通过单独分析OFFEGEL电泳的VEGF-Trap级分，并且通过研究中的尖峰波形，实现了对VEGF-Trap电荷变异体的单个iCIEF峰与IEF带的直接比较。研究证实，新的iCIEF测定过程能够以同等且更精确的方式解析先前使用基于凝胶的IEF方法解析的所有电荷变异体同种型。

因此，基于本文公开的区域1、2和3的百分比分布的此报告方法的一些实施方案允许控制所有VEGF-Trap同种型，并且使测定更灵敏，使其成为稳健的稳定性指示测定。

本文还描述与iCEF方法一起使用的毛细管。一般来讲，iCIEF毛细管被配置用于在VEGF-Trap的电荷变异体分析中使用，并且包括被配置为接收蛋白并且被配置成具有载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物的毛细管。毛细管还可包括碳氟化合物涂层。

在一些实施方案中，提供一种被配置用于在VEGF-Trap的电荷变异体分析中使用的iCIEF试剂盒，并且所述iCIEF试剂盒包括被配置为接收蛋白并且被配置成具有载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物的一个或多个毛细管，其中所述毛细管包括碳氟化合物涂层。

虽然各种本发明实施方案已在本文中进行描述和说明，但是本领域的普通技术人员应易于预想各种其他手段和/或结构以用于执行功能和/或获得本文所述的结果和/或优点中的一种或多种，并且此类变化和/或修改各自被视为在本文所述的本发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文所描述的所有参数、量、百分比、浓度、尺寸、材料和配置都是实例，并且实际参数、量、百分比、浓度、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教义的具体应用。本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所描述的具体的本发明实施方案的许多等效物。因此，应当理解，前述实施方案是仅借助于实例而呈现。本文公开的本发明的实施方案可以与具体描述和要求保护不同的其他方式实施。本公开的本发明实施方案还包括本文所描述的单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和方法。此外，两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和方法的任何组合也是发明性的(如果它们不相互矛盾)。一些实施方案可因具体地缺乏一个或多个特征/要素/功能(即，涉及此类实施方案的权利要求可包括否定限制)而区别于现有技术。

此外，如提到的，各种发明构思可作为一种或多种方法来实施。作为所述方法的一部分执行的动作可以任何合适的方式排序。因此，可以构建其中以不同于所展示的顺序执行动作的实施方案，其可以包括同时执行一些动作，即使这些动作在说明性实施方案中被示出为顺序动作。

本申请中任何地方呈现的对出版物或其他文件的任何和所有引用，均以全文引用方式并入本文。此外，所有的定义，如本文所定义和使用，应理解为控制所定义的术语的字典定义、在以引用的方式并入的文件中的定义和/或普通含义。

Claims (23)

1.一种用于分析血管内皮生长因子VEGF-Trap的电荷变异体的方法，所述方法包括：

将蛋白样品加载到包含至少载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物的分离毛细管上；

施加第一电压持续第一预先确定的时间段使得所述载体两性电解质在所述毛细管内形成pH梯度；

施加第二电压持续第二预先确定的时间段以在所述毛细管内聚焦所述蛋白的电荷变异体的迁移使得所述变异体的总电荷为中性；以及

检测和定量所述蛋白的电荷变异体。

2.如权利要求1所述的方法，其中：

检测和定量电荷变异体包括：

测量多个电荷变异体同种型的吸光度；

将所述多个电荷变异体同种型分离成至少包括第一酸/酸性区(R1)、第二中性区(R2)和第三碱/碱性区(R3)的隔离区；以及

确定落在区域R1、R2和R3中的每个区域内的电荷变异体同种型的百分比。

3.如权利要求1所述的方法，其中进行电荷变异体的检测和定量。

4.如权利要求1所述的方法，其中电荷变异体的检测发生在约280nm的波长处。

5.如权利要求1所述的方法，其中加载到所述毛细管上的蛋白的浓度为约2.0mg/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其中稳定添加剂包含尿素。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述混合物中尿素的量包括约2M。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含约0.35％的甲基纤维素。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一电压包括1500V。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述第一预先确定的时间为约1分钟。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述第二电压包括3000V。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述第二预先确定的时间为约7分钟。

13.如权利要求1所述的方法，其中加载到所述毛细管上的蛋白的浓度在约1.0mg/ml与8.0mg/ml之间或任何中间范围。

14.如权利要求6所述的方法，其中所述混合物中尿素的量大于0M且小于约8M或任何中间范围。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述混合物包括在约0.01％与约0.35％之间或任何中间范围的甲基纤维素。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述第一电压在约1V与约3000V之间或任何中间范围。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述第一预先确定的时间在约1秒与约5分钟之间或任何中间范围。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述第二电压在约1V与约3000V之间或任何中间范围。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述第二预先确定的时间在约1分钟与约14分钟之间或任何中间范围。

20.一种被配置用于在VEGF-Trap的电荷变异体分析中使用的iCIEF毛细管，其包括：

毛细管，其被配置为接收蛋白并且被配置成具有载体两性电解质、甲基纤维素和稳定添加剂的混合物，

其中所述毛细管包括碳氟化合物涂层。

21.如权利要求20所述的毛细管，其中其所述部件符合权利要求2-19中任一项和/或另一项。

22.一种被配置用于在VEGF-Trap的电荷变异体分析中使用的iCIEF试剂盒，其包括如权利要求19-20中任一项所述的一个或多个毛细管。

23.一种用于执行如权利要求1-19中任一项或另一项所述的方法的系统。

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