KR20230141948A - 샘플 매트릭스에서 단백질 변이체를 분석하기 위한 이미지 모세관 등전 집속 - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
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- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
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Abstract
본 개시의 실시예는 혈관 내피 성장 인자 VEGF-트랩과 같은 단백질의 전하 변이체를 분석하기 위한 방법에 상응하는 방법, 시스템, 장치 및 키트에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2017.08.18. 출원된 미국 가출원 번호 제62/547,602호에 대하여 우선권을 주장하며, 이는 여기에 그 전체가 참조로 수록된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹(EFS-Web)을 통하여 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 함유하고 여기에 그 전체가 참조로 수록된다. 상기 ASCII 카피는, 2018.08.15. 생성되었으며, 명칭이 REGE-005_001WO_ST25.txt이며 크기가 4,214 바이트(byte)이다.
본 개시의 분야
본 개시의 분야는 샘플 매트릭스에서 VEGF 트랩과 같은 단백질의 전하 변이체를 분석하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
배경
전하 변이체의 분석은 종종 바이오의약품으로 사용되는 다양한 단백질에 바람직한데, 왜냐하면 이러한 변화는 약물 활성, 안정성, 및 일부 경우 환자 안전에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 전하 변이체를 식별하고 특성화하기 위해 업계에서 사용되는 종래의 방법은 이온-교환 크로마토 그래피, 등전 집속 겔 전기영동, 및 모세관 등전 집속을 포함한다. 이미지 모세관 등전 집속(Image capillary isoelectric focusing)은 높은 해상도, 샘플량 감소, 및 빠른 실행 시간으로 인해 유용한 것으로 밝혀졌다. 따라서, VEGF 트랩과 같은 단백질에 대한 전하 변이체를 결정하기 위해 이미지 모세관 등전 집속을 사용하는 방법 및 시스템이 유리할 것이다.
발명의 개요
다양한 단백질의 전하 변이체 분석을 위한 방법 및 시스템이 여기에 기재된다. 예를 들어, 본 방법 및 시스템은 VEGF 트랩의 전하 변이체를 분석하는데 사용될 수 있다. VEGF 트랩을 분석하기 위해 현재 승인된 방법으로서 등전 집속 겔에서 밴드 3-9를 그룹화하여 전하 변이체 분포를 보고하는 대신, 여기에 기재된 방법 및 시스템은 일반적으로 전하 변이체 이성질체의 백분율과 관련하여 전하 이질성을 보고하기 위해 이미지 모세관 등전 집속을 사용하고, 이를 전기영동도(electropherogram)의 서로 다른 3개 영역으로 그룹화한다. 이러한 보고 방식은 VEGF 트랩 샘플의 이성질체에서 발생하는 변화에 더욱 민감할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 개시의 구체예는 단백질의 전하 변이체를 결정하기 위한 방법, 시스템 및 장치에 관한 것이며, 특히 이하에서 "VEGF-트랩"으로 불리는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 차단제와 같은 단백질의 전하 분산을 평가하기 위한 이미지 모세관 등전 집속(iCIEF) 분석에 관한 것이다. iCIEF는 VEGF-트랩 전하 변이체 분석을 위해 현재 승인된 등전 집속(Isoelectric Focusing, IEF) 방법의 대안이다.
iCIEF의 구체예는 등전점(isoelectric point, pI)에 기초하여 단백질 전하 변이체를 분리하는 기술에 해당한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 단백질 샘플은 캐리어 양쪽성전해질(carrier ampholyte)(예컨대, Pharmalyte™), 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제(즉, 요소)의 혼합물을 포함하는 분리 모세관에 로딩된다. 소정의 시간 동안 전압이 인가되어 캐리어 양쪽성전해질이 모세관 내에서 pH 구배를 형성하게 된다. 일부 구체예에서, 전압은 "집속(focusing)" 시간에 대응하여 더 긴 시간인 1초 동안 인가된다. 이는 변이체의 전체 전하가 중성(즉, 이들의 pI)인 점에 도달할 때까지 모세관 내에서 단백질 전하 변이체 이동을 야기한다.
이러한 구체예에서, (플루오로카본(FC)으로 코팅된) 모세관은 단백질 전하 변이체의 직접적인 검출 및 정량화를 가능하게 하는 디지털(예컨대, CCD) 카메라에 결합된다. 구체적으로, 집속 시간(focusing time) 후에, CCD 카메라는 모세관 내의 단백질을 검출하기 위해 모세관 튜브를 (바람직하게는 실시간으로) 이미징하도록 구성된다. 일부 구체예에서, 검출은 대략 280 nm의 파장에서 발생한다. 이러한 기술의 파라미터는 다음을 포함한다:
-
양쪽성전해질의 브랜드 및 농도,
-
사용된 첨가제의 유형 및 농도, 그리고
-
집속 시간 및 샘플 농도.
모세관 내의 단백질의 응집 및 침전은 전기영동도의 재현성에 해롭다. 이를 위해, 요소와 같은 첨가제를 사용하여 단백질이 집속될 때 단백질을 안정화시키고 용해시키는 것을 도울 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 혈관 내피 성장 인자 VEGF-트랩의 전하 변이체를 분석하는 방법이 제공되며 이는 적어도 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물을 갖는 분리 모세관에 단백질 샘플을 로딩하는 단계, 소정의 제1 시간 기간 동안 제1 전압을 인가하여 상기 양쪽성전해질이 상기 모세관 내에서 pH 구배를 형성하는 단계, 소정의 제2 시간 기간 동안 제2 전압을 인가하여 상기 단백질의 전하 변이체의 이동을 이들 각각의 pI에 집속(focus)시키는 단계, 및 상기 단백질의 전하 변이체를 검출하고 정량화하는 단계를 포함한다.
이러한 구체예에서, 전하 변이체를 검출하고 정량화하는 단계는 복수의 전하 변이체 이성질체에 대한 흡광도를 측정하는 단계, 상기 복수의 전하 변이체 이성질체를 적어도 제1 산/산성 영역(R1), 제2 중성 영역(R2), 및 제3 염기/염기성 영역(R3)을 포함하는 분리된 영역으로 분리시키는 단계, 및 각각의 영역 R1, R2 및 R3에 해당하는 전하 변이체 이성질체의 백분율을 결정하는 단계를 포함한다.
이러한 구체예에서, 검출 및 정량화를 위한 이미지 분석은 종래의 방법과 시스템(예컨대, 이미지 분석 소프트웨어)을 따를 수 있다.
위에서 요약된 구체예들에서, 다음의 추가적인 특징/기능 중 하나 및/또는 다른 것이 포함될 수 있지만 (추가적인 본 발명의 구체예를 야기함), 이들 특징 중 임의의 하나 또는 그 이상이 상이할 수 있으나 본 발명의 범위 내에 있으며 - 다음에 제시된 목록은 단지 하나의 구체예임이 지적되어야 한다:
-
전하 변이체의 검출 및 정량화가 수행됨;
-
대략 280 nm의 파장에서 전하 변이체의 검출이 발생함;
-
모세관 튜브에 로딩된 단백질의 농도는 대략 2.0 mg/ml임;
-
안정화 첨가제는 요소를 포함함;
-
혼합물 내의 요소의 양은 대략 2M을 포함함;
-
혼합물은 대략 0.35% 메틸셀룰로오스를 포함함;
-
제1 전압은 1500 V를 포함함;
-
소정의 제1 시간은 대략 1 분임;
-
제2 전압은 3000 V를 포함함;
-
소정의 제2 시간은 대략 7 분임;
-
모세관 튜브에 로딩된 단백질의 농도는 대략 1.0 내지 8.0 mg/ml임;
-
혼합물 내의 요소의 양은 0M 초과이며 대략 8M 미만임;
-
혼합물은 대략 0.01% 내지 대략 0.35% 메틸셀룰로오스, 또는 임의의 그 사이 범위를 포함함;
-
제1 전압은 대략 1V 내지 약 3000 V, 또는 임의의 그 사이 범위임;
-
소정의 제1 시간은 대략 1 초 내지 대략 5 분, 또는 임의의 그 사이 범위임;
-
제2 전압은 약 1V 내지 대략 3000 V, 또는 임의의 그 사이 범위임; 및/또는
-
소정의 제2 시간은 대략 1 분 내지 대략 14 분, 또는 임의의 그 사이 범위임.
일부 구체예에서, VEGF-트랩의 전하 변이체 분석에 사용하도록 구성된 iCIEF 모세관 튜브가 제공되며, 단백질을 수용하도록 구성되고 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물로 구성된 모세관 튜브를 포함한다. 모세관 튜브는 또한 플루오로카본 코팅을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, VEGF-트랩의 전하 변이체 분석에 사용하도록 구성된 iCIEF 모세관 키트가 제공되며, 단백질을 수용하도록 구성되고 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물로 구성된 하나 이상의 모세관 튜브를 포함하고, 여기서 상기 모세관 튜브는 플루오로카본 코팅을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1A-1F는 상이한 양쪽성전해질을 사용하는 VEGF 트랩의 전기영동도를 나타낸다. 도 1A에서, 양쪽성전해질은 3-10의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™이며; 도 1B에서, 양쪽성전해질은 5-8의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™와 8-10.5의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™의 조합이며; 도 1C에서, 양쪽성전해질은 2-9의 pI 범위를 갖는 Servalyt™이며; 도 1D에서, 양쪽성전해질은 4-9의 pI 범위를 갖는 Servalyt™이며; 도 1E에서, 양쪽성전해질은 3-10의 pI 범위를 갖는 Biolyte™이며; 그리고 도 1F에서, 양쪽성전해질은 3-10의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™와 6.7 내지 7의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™의 조합이다.
도 2A-2E는 여러 요소 농도에서의 VEGF 트랩의 전기영동도를 비교한다.
도 3은 등전 집속 및 이미지 모세관 등전 집속 방법을 사용하여 획득된 VEGF 트랩의 전기영동도를 비교한다.
도 4A-4G는 등전 집속 및 이미지 모세관 등전 집속 방법을 사용하는 VEGF 트랩 OFFGEL 분획물 분석(분획물 #5-#10)을 나타낸다.
도 5A-5F는 도 4A-4G에서 분석된 VEGF 트랩 OFFGEL 분획물(분획물 #5-#10)이 스파이킹된 VEGF 트랩 RS의 전기영동도를 나타낸다.
도 6은 독립 마커가 스파이킹된 블랭크 및 VEGF 트랩의 전기영동도를 비교한다.
도 7A는 할당된 영역 1, 2, 및 3이 있는 VEGF 트랩 RS 샘플의 이미지 모세관 등전 집속 전기영동도를 나타낸다.
도 7B는 등전 집속 방법과 이미지 모세관 등전 집속 방법의 전기영동도 보고서의 차이를 나타낸다.
도 8은 VEGF 트랩 안정성과 관련하여 이미지 모세관 등전 집속을 사용하여 획득한 데이터를 제공한다.
도 9는 강제로 저하된 VEGF 트랩 샘플에서 수행된 이미지 모세관 등전 집속을 사용하여 획득된 안정성 데이터를 제공한다.
도 10A-10C는 도 9에서 제공된 이미지 모세관 등전 집속 데이터의 통계 분석을 나타낸다.
도 11은 이미지 모세관 등전 집속 방법의 선형성과 관련된 데이터를 제공한다.
도 12는 양쪽성전해질의 세 가지 샘플에 대한 이미지 모세관 등전 전기영동도를 비교한다.
도 13A-13D는 과거 VEGF 트랩 샘플에서 획득된 이미지 모세관 등전 집속 데이터의 통계 분석을 나타낸다.
도 1A-1F는 상이한 양쪽성전해질을 사용하는 VEGF 트랩의 전기영동도를 나타낸다. 도 1A에서, 양쪽성전해질은 3-10의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™이며; 도 1B에서, 양쪽성전해질은 5-8의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™와 8-10.5의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™의 조합이며; 도 1C에서, 양쪽성전해질은 2-9의 pI 범위를 갖는 Servalyt™이며; 도 1D에서, 양쪽성전해질은 4-9의 pI 범위를 갖는 Servalyt™이며; 도 1E에서, 양쪽성전해질은 3-10의 pI 범위를 갖는 Biolyte™이며; 그리고 도 1F에서, 양쪽성전해질은 3-10의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™와 6.7 내지 7의 pI 범위를 갖는 Pharmalyte™의 조합이다.
도 2A-2E는 여러 요소 농도에서의 VEGF 트랩의 전기영동도를 비교한다.
도 3은 등전 집속 및 이미지 모세관 등전 집속 방법을 사용하여 획득된 VEGF 트랩의 전기영동도를 비교한다.
도 4A-4G는 등전 집속 및 이미지 모세관 등전 집속 방법을 사용하는 VEGF 트랩 OFFGEL 분획물 분석(분획물 #5-#10)을 나타낸다.
도 5A-5F는 도 4A-4G에서 분석된 VEGF 트랩 OFFGEL 분획물(분획물 #5-#10)이 스파이킹된 VEGF 트랩 RS의 전기영동도를 나타낸다.
도 6은 독립 마커가 스파이킹된 블랭크 및 VEGF 트랩의 전기영동도를 비교한다.
도 7A는 할당된 영역 1, 2, 및 3이 있는 VEGF 트랩 RS 샘플의 이미지 모세관 등전 집속 전기영동도를 나타낸다.
도 7B는 등전 집속 방법과 이미지 모세관 등전 집속 방법의 전기영동도 보고서의 차이를 나타낸다.
도 8은 VEGF 트랩 안정성과 관련하여 이미지 모세관 등전 집속을 사용하여 획득한 데이터를 제공한다.
도 9는 강제로 저하된 VEGF 트랩 샘플에서 수행된 이미지 모세관 등전 집속을 사용하여 획득된 안정성 데이터를 제공한다.
도 10A-10C는 도 9에서 제공된 이미지 모세관 등전 집속 데이터의 통계 분석을 나타낸다.
도 11은 이미지 모세관 등전 집속 방법의 선형성과 관련된 데이터를 제공한다.
도 12는 양쪽성전해질의 세 가지 샘플에 대한 이미지 모세관 등전 전기영동도를 비교한다.
도 13A-13D는 과거 VEGF 트랩 샘플에서 획득된 이미지 모세관 등전 집속 데이터의 통계 분석을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
VEGF 트랩과 같은 다양한 단백질의 전하 변이체 분석을 위한 방법 및 시스템이 여기에 기재된다. VEGF 트랩은 표 1에 제시된 서열을 포함하는 융합 단백질이다. VEGF 트랩을 분석하기 위해 현재 승인된 방법으로서 등전 집속 겔에서 밴드 3-9를 그룹화하여 전하 변이체 분포를 보고하는 대신, 여기에 기재된 방법 및 시스템은 일반적으로 전하 변이체 이성질체의 백분율과 관련하여 전하 이질성을 보고하기 위해 이미지 모세관 등전 집속을 사용하고, 이를 전기영동도(electropherogram)의 서로 다른 3개 영역으로 그룹화한다. 전술한 바와 같이, 이러한 보고 방식은 VEGF 트랩 샘플의 이성질체에서 발생하는 변화에 더욱 민감할 수 있다.
표 1 - VEGF 트랩 서열
| 단백질 | 서열 | 서열 식별 번호 |
| VEGF 트랩 | SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFpIDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 1 |
아래 약어가 본 개시의 전반에 걸쳐서 사용된다:
-
iCIEF - 이미징 모세관 등전 집속
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IEF - 등전 집속
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pI - 등전점
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RS - 참조 표준
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DS - 원료의약품(Drug substance)
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DSI - 원료의약품 중간체(Drug substance Intermediate)
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FDS - 제형화된 원료의약품.
VEGF 트랩의 전하 변이체를 분석하는 방법은 일반적으로 적어도 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물을 포함하는 분리 모세관에 단백질 샘플을 로딩하는 단계, 소정의 제1 시간 기간 동안 제1 전압을 인가하여 상기 양쪽성전해질이 상기 모세관 내에서 pH 구배를 형성하는 단계, 소정의 제2 시간 기간 동안 제2 전압을 인가하여 상기 모세관 내에서 상기 단백질의 전하 변이체의 이동을 집속시켜 상기 변이체의 전체 전하가 중성이 되도록 하는 단계, 및 상기 단백질의 전하 변이체를 검출하고 정량화하는 단계를 포함한다.
분리 모세관에는 VEGF 트랩이 약 0.5 mg/mL 내지 약 2 mg/mL 범위의 농도로 로딩될 수도 있다. 예를 들어, 분리 모세관에는 VEGF 트랩이 약 0.5 mg/mL, 약 1.0 mg/mL, 약 1.5 mg/mL, 또는 약 2 mg/mL의 농도로 로딩될 수 있다. 일부 구체예에서, 분리 모세관은 VEGF 트랩이 약 1.0 mg/mL의 농도로 로딩된다.
혼합물에서의 메틸셀룰로오스의 양은 약 0.01% 내지 약 0.35%의 범위일 수 있다. 예를 들어, 혼합물에서의 메틸셀룰로오스의 양은 약 0.01%, 약 0.05%, 약 0.10%, 약 0.15%, 약 0.20%, 약 0.25%, 약 0.30%, 또는 약 0.35%일 수 있다. 일부 구체예에서, 혼합물에서의 메틸셀룰로오스의 양은 약 0.35%이다.
제1 전압과 관련하여, 이는 대략 1 V 내지 대략 3000 V 범위일 수 있다. 예를 들어, 제1 전압은 약 1 V, 약 100 V, 약 500 V, 약 1000 V, 약 1500 V, 약 2000 V, 약 2500 V, 또는 약 3000 V일 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 전압은 약 1500 V이다.
제2 전압은 또한 대략 1 V 내지 약 3000 V 범위일 수 있다. 예를 들어, 제2 전압은 약 1 V, 약 100 V, 약 500 V, 약 1000 V, 약 1500 V, 약 2000 V, 약 2500 V, 또는 약 3000 V일 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 전압은 약 3000 V이다.
소정의 제1 시간은 약 1 초 내지 약 5 분 범위일 수 있다. 예를 들어, 소정의 제1 시간은 약 1 초, 약 10 초, 약 20 초, 약 30 초, 약 40 초, 약 50 초, 약 1 분 (60 초), 약 1.5 분 (90 초), 약 2 분 (120 초), 약 2.5 분 (150 초), 약 3 분 (180 초), 약 3.5 분 (210 초), 약 4 분 (240 초), 약 4.5 분 (270 초), 또는 약 5 분(300 초)일 수 있다. 일부 구체예에서, 소정의 제1 시간은 약 1 분(60 초)이다.
소정의 제2 시간은 약 1 분 내지 약 14 분 범위일 수 있다. 예를 들어, 소정의 제2 시간은 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 4 분, 약 5 분, 약 6 분, 약 7 분, 약 8 분, 약 9 분, 약 10 분, 약 11 분, 약 12 분, 약 13 분, 또는 약 14 분일 수 있다. 일부 구체예에서, 소정의 제2 시간은 약 7 분이다.
임의 적절한 첨가제가 혼합물에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 첨가제로서 요소를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 2M의 요소(urea)가 혼합물에 포함되는 것이 유리할 수 있다. 다양한 시약(양쪽성전해질)이 혼합물에 포함될 수 있으며, 이하에서 더욱 상세하게 설명된다. 하나의 구체예에서, VEGF 트랩이 1.0 mg/mL의 농도로 모세관에 로딩되고, 0.35% 메틸셀룰로오스, 2M 요소, 및 3% 3-10의 pI을 갖는 양쪽성전해질의 혼합물을 사용하는 이미지 모세관 등전 집속을 사용하여 분석된다.
시약 및 장비. 아래 표 2는 본 개시의 일부 구체예에 따라 사용된 시약(양쪽성전해질) 및 장비를 열거한다. 수행된 실시예는 iCE3(ProteinSimple®) 전하 변이체 분석기를 사용한다. 달리 명시하지 않는 한, 방법 개발 및 특성화 동안 VEGF-트랩 참조 표준(RSVITV-5)이 시험 조항으로 사용되었다.
표 2 - 사용된 실시예 시약 및 기타 성분
| 샘플 시약 |
| Pharmalyte™ 3-10 |
| Servalyt™ 4-9 |
| Servalyt™ 2-9 |
| Pharmalyte™ 5-8 |
| Pharmalyte™ 8-10.5 |
| Pharmalyte™ 6.7-7.7 |
| Biolyte™ 3-10, 40% |
| 요소(Urea) |
| 메틸셀룰로오스 |
| pI 마커 (5.12, 7.05, 7.65) |
| ProteinSimpIe® iCE3 |
구체예의 적어도 일부에 대한 실시예:
양쪽성전해질 스크리닝을 pI 범위 및 양쪽성전해질 공급원을 기준으로 초기에 수행하였다. 각각의 고유한 pI 범위를 차지하는 4개의 양쪽성전해질을 3가지 상이한 공급원으로부터 조달하였다. 양쪽성전해질을 아래 출발단계를 사용하여 분석하였다:
-
2.0 mg/mL 단백질 농도,
-
2 M 요소,
-
0.35% 메틸셀룰로오스,
-
1500 V에서 1분의 사전-집속, 그리고
-
3000 V에서 7분의 집속.
도 1A-F는 iCE3 전하 분석기로 6가지 범위의 양쪽성전해질을 사용하여 획득한 전기영동도를 나타낸다. 아래 양쪽성전해질 범위가 사용되었다:
도 A - 3-10 Pharmalyte
도 B - 5-8/8-10.5 콤보 Pharmalyte
도 C - 2-9 Servalyt
도 D - 4-9 Servalyt
도 E - Bio-Lyte 3-10, 40%
도 F - 3-10 및 6.7-7.7 Pharmalyte의 3가지-혼합
선택된 단백질. pI 3-10 범위의 양쪽성전해질을 iCIEF 전기영동도의 전체 프로파일로 선택했는데 왜냐하면 이들이 VEGF-트랩에 대하여 현재 승인된 전하 변이체 분석 과정으로부터의 전기영동도를 가장 근접하게 닮았기 때문이다(예컨대, 도 3에 제시된 IEF 이미지 참조).
요소 최적화. 일부 구체예에 따르는 방법 최적화는 또한 다양한 요소 농도(요소가 없는 상태부터 8M까지)를 포함한다. 도 2A-2E는 VEGF-트랩 RSVITV-5 샘플 전기영동도에 대한 이러한 다양한 요소 농도의 효과를 나타낸다. 요소 농도의 감소는 일반적으로 해상도를 향상시키는 반면, 요소의 증가(8M)는 해상도의 감소를 초래한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 고유 조건(요소 없음) 하에서 해리된 VEGF-트랩은 해상도 감소 및 재현성 부족의 유사한 문제를 가졌다. 따라서, 1-3M 요소 농도를 사용할 때 전체 피크 패턴 및 해상도를 VEGF-트랩에 대하여 서로 비교가능하였다.
2 M 요소를 사용하여 추가 실험을 수행하여 양쪽성전해질 3-10 농도 및 단백질 농도를 최적화하였다. 도 3은 1.0 mg/mL 단백질 농도에서 2 M 요소, 0.35 % 메틸 셀룰로오스 및 3% 3-10 양쪽성전해질을 사용하여 획득한 전기영동도를 나타낸다. iCIEF 전기영동도를 또 다른 전기영동도와 비교하고 잠정적인 피크 할당을 수행했다(도 3).
방법 특성화. iCIEF 분석법을 사용하여 획득한 전체 전하 프로파일 및 피크의 패턴을 IEF 밴드 프로파일과 비교할 수 있었다(도 2A-2E에 제시됨). 그러나, IEF 분석법의 밴딩 패턴을 더욱 이해하고 이를 iCIEF 분석을 사용하여 얻은 피크 패턴에 연결시키기 위해, VEGF-트랩 샘플의 OFFGEL 분획화를 수행하였다. OFFGEL 전기영동으로부터 얻은 개별 전하 변이체 분획물을 IEF 및 iCIEF 분석법을 사용하여 분석하였다. 아질런트 3100 OFFGEL 분획기(Agilent 3100 OFFGEL Fractionator)를 사용하여 그 등전점에 따라 VEGF-트랩 참조 표준을 분획화하고, 액체 분획물로 회수된 분리된 이성질체를 IEF와 iCIEF의 두 가지 방법을 사용하여 분석했다. VEGF-트랩 RS를 VEGF-트랩에 대해 관찰된 전하 변이체의 pI 범위를 커버하는 pH 6-9의 고정화 pH 구배 스트립(IPG 스트립, Immobilized pH Gradient strip)을 사용하여 분획화하였다. 실험 및 분리의 상세한 설정은 아래와 같다:
1) 저장 용액을 2.3 mL 50 % 글리세롤, 230.4 μl의 IPG 완충액(pH 6-11), 및 16.64 ml의 물을 합하여 총 부피 19.2 ml를 생성함으로써 제조하였다.
2) VEGF 트랩 용액을 73 μg VEGF(4.2 mg)를 12 mL 저장 용액 및 3 mL 물에 첨가하여 제조하였다.
3) IPG 스트립 재수화 용액을 1.15 mL의 물과 4.6 mL의 저장 용액을 조합하여 과량으로 제조하였다.
4) pH 범위 6-9(24 cm)의 IPG 겔 스트립을 2개의 기구 트레이의 2개 레인마다 한번씩(every other lane) 배열하고, 24 웰 프레임을 그 위에 고정시켰다. 표준 OFFGEL 키트 프로토콜(OFFGEL 사용자 메뉴얼: Agilent 3100 OFF GEL Fractionator Kit quick Start Guide, 5th Edition Sep 2010 참조)을 스트립 재수화, 항체 로딩, 및 기구에 대한 트레이 로딩에 대하여 사용하였다.
5) 20℃의 플랫폼 온도가 사용되었다. 24 웰 설정을 위한 표준 기구 단백질 집속 방법을 최대 전압 설정이 8000 V이고 최대 전력 설정이 200 mW인 50 μA의 정전류를 사용하여 실행하였다.
6) 34 시간의 분획화 후, 실행을 중단하고 웰 3 내지 12에 대하여 각각의 레인으로부터 유사한 웰 번호를 모은 후, 물로 교환하고, 분석 전에 대략 5배 농축시켰다.
7) 나노드롭(Nanodrop) 상에서 소산 계수(extinction coefficient) 1.15로 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 각 분획물에서의 항체 양을 결정하였다. 하나의 기구에서 분획물의 농도를 결정하고 그 후 분획물의 부피에 농도를 곱하였다.
간단히 설명하면, 4.2 mg의 VEGF-트랩 RS를 12 개의 IPG 스트립을 사용하여 32 시간 동안 분획화하였고; 동일한 pI 범위에 상응하는 각각의 스트립으로부터의 개별 분획물을 모으고 투석 후와 정량화하였다. 분획화로부터, 충분한 회수를 갖는 총 7 개의 분획물(분획물 4-10)을 IEF 및 iCIEF를 사용하여 분석하였다. 분획물을 두 가지 방법으로 분석하였다: IEF 및 iCIEF 분석법을 사용하는 OFFGEL 분획물(4-10)의 개별 분석(도 4 참조) 및 OFFGEL 분획물(5-10)을 VEGF-트랩 RS 내에 스파이킹 한 후 IEF 및 iCIEF를 사용하여 스파이킹된 샘플을 분석(도 5). 표 3은 OFFGEL 분획화 연구에서 회수한 분획물과 해당 양을 나타낸다.
표 3
| OFFGEL 분획물 번호 |
단백질 농도 (mg/mL) |
회수된 부피 (μL) |
| 3* | 1.229 | 15 |
| 4 | 1.628 | 98 |
| 5 | 1.884 | 104 |
| 6 | 2.909 | 113 |
| 7 | 3.498 | 124 |
| 8 | 3.56 | 124 |
| 9 | 3.326 | 124 |
| 10 | 2.098 | 110 |
| 11* | 1.235 | 94 |
| 12* | 2.574 | 15 |
IEF 및 iCIEF를 사용하여 독립적으로 OFFGEL 분획물을 분석하는 것 외에도, 회수율이 높은 분획물(5-10)을 1:0.1(VEGF-트랩 RS : 분획물)의 비율로 스파이킹하고 두 가지 전하 변이체 분석 방법으로 분석하였다. 도 5는 iCIEF(상부 패널) 및 IEF(하부 패널) 분석법을 사용하여 분석된 VEGF-트랩 OFFGEL 분획물(5-10)로 스파이킹된 VEGF-트랩 RS의 전기영동도 패널을 도시한다. RS 내로 스파이킹된 각각의 OFFGEL 분획물에 대해, 상응하는 대조군 RS(스파이킹 안됨)가 IEF 및 iCIEF 분석법에 대해 오버레이된다. 스파이킹된 및 스파이킹 안된 (RS + OFFGEL 및 RS) 샘플의 오버레이는 IEF와 iCIEF 분석법 사이의 피크 패턴의 상관관계를 시각화하고 이해하는데 도움이 된다. 각 패널에서, 스파이킹된 분획물에 상응하는 전하 종의 강화는 산성 분획물(도 5A)에서 염기성 분획물(도 5F)까지의 화살표를 사용하여 강조된다.
겔 기반 IEF 밴드 패턴과 모세관 기반 iCIEF 피크 패턴 사이의 상관관계는 OFFGEL 분획물의 분석으로부터 명백하였다. 도 4 및 5(스파이킹된 분획물과 함께 개별 분획물 분석)로부터, 현재 승인된 IEF 겔 방법에 의해 달성된 전하 이성질체 분리는 VEGF-트랩에 대한 모세관 기반 iCIEF 방법을 사용하여 얻어진 피크의 패턴과 비교가능하고 유사하다는 것을 추론할 수 있다.
iCIEF 방법을 사용하는 전하 변이체 분포 보고. VEGF-트랩 전하 변이체 분포에 대한 현재 승인된 IEF 방법은 IEF 겔에서 밴드 3-9를 그룹화시켜 백분율 전하 분산을 보고한다. 밴드 3-9의 면적 백분율은 예를 들어, 미오글로빈(독립 단백질 마커)을 미오글로빈의 pI에 기초한 밴드 번호를 식별하기위한 가이드로서 사용하여 합산되고 보고된다. IEF 방법에 대한 현재 사양 수용 기준(SPEC)은 82%(밴드 3-9)이다.
유사한 접근법이 iCIEF 분석법에 대하여 채택되었는데 여기서 프로틴심플(ProteinSimple), pI 7.05 마카 캣#(Marker Cat#) 102226으로부터의 독립 마커가 iCIEF 마스터 믹스(2 M 요소, 0.35% 메틸 셀룰로오스, 3% 3-10 양쪽성전해질) 내에 스파이킹된다. 마스터 믹스 내에 스파이킹된 마커 7.05의 iCIEF 전기영동도가 도 6(상단 패널)에 표시되며, 마스터 믹스의 브라케팅 pI 5.12 및 pI 9.50 마커가 보정 용도로 사용된다. 도 5의 하부 패널은 VEGF-트랩 iCIEF 샘플 프로파일에서 피크 5를 식별하는데 사용될 스파이킹된 7.05 마커를 함유하는 블랭크와 중첩된 VEGF-트랩 RS의 iCIEF 전기영동도를 보여준다. 마커 피크 7.05는 피크 4와 5 사이의 pI에서 이동하고, 이는 VEGF-트랩에 대한 주요 이성질체의 클러스터에서 주요 피크 6을 식별하는 역할을 한다(피크 5, 6 및 7).
IEF 방법과 같이 피크 3-9를 보고하기 보다는, (일부 구체 예에 따르는) iCIEF 방법은 영역 1(산성), 영역 2(중성) 및 영역 3(염기성)으로 그룹화된 전하 변이체 이성질체의 백분율로 VEGF-트랩 샘플의 전하 이질성을 보고한다. VEGF-트랩 iCIEF 전기영동도에서 중성 pI 범위를 중심으로 이동하고 가장 우세한 이성질체인 3 개의 주요 피크(피크 번호 5, 6 및 7)의 클러스터는 영역 2(중립)로 그룹화된다. 3 개 피크의 클러스터 중에서, 특정 pI로 이동하는 주요 피크 5에 해당하는 특정 이성질체가 도 7에 도시된 바와 같이 블랭크 주입에서 스파이킹된 독립적인 pI 7.05 마커를 사용하여 확인된다. VEGF-트랩 iCIEF 샘플의 영역 1(산성)은 VEGF-트랩 전기영동도에서 3 개의 주요 피크(피크 5, 6 및 7)의 클러스터와 비교하여 비교적 산성인 피크 그룹으로 보고된다. VEGF-트랩 iCIEF 샘플의 영역 3(염기성)은 VEGF-트랩 전기영동도에서 3 개의 주요 피크(피크 5, 6 및 7)의 클러스터와 비교하여 비교적 염기성인 피크 그룹으로 보고된다.
영역 1, 2, 및 3을 사용하는 보고 방식은 밴드 3-9의 종래 IEF 겔 기반 방법의 그룹화와는 대조적으로 3 개 영역(영역 1, 2 및 3)을 모니터링함으로써 전하 변이체 이성질체를 더욱 세밀하게 제어할 수 있는 이점을 제공한다. 도 7B는 IEF 보고와 본 개시의 iCIEF 방법의 구체예에 따른 보고와의 차이를 도시한다. 또한, 영역 1, 2 및 3에 관한 보고는 종래 방식보다 훨씬 일찍 전하 변이체 이성질체의 변화에 대한 민감도의 독특한 이점을 iCIEF 분석법에 제공한다. 이는 종래 IEF 분석 절차보다 iCIEF 분석이 판독에서 훨씬 더 민감하도록 하고 더 우수한 안정성 표시 분석을 나타내도록 한다. 아래 표 4는 IEF 분석의 전통적인 3-9 보고와 대조적으로 iCIEF 분석법에 채택된 새로운 그룹화 접근법의 안정성 표시 능력의 예를 제공한다. 가속화된 VEGF-트랩 안정성 샘플은 IEF 분석법과 유사한 두 가지 보고 접근법-영역 그룹화 및 피크 3-9에 의한 새로운 iCIEF 분석법을 사용하여 분석되었고 IEF 분석법으로부터 얻은 종래 결과와 비교되었다.
표 4(아래)에서, 영역 1, 2 및 3 그룹화 접근법은 VEGF-트랩 샘플의 전하 변이체 분포의 변화에 대해 훨씬 더 민감하고 이를 더 잘 나타낸다는 것을 알 수 있다. IEF 방법은 밴드 3-9에 대해 2 %의 감소로 전체 전하 분포의 변화를 보였으며 이러한 변화는 3-9 피크 접근법을 사용하여 그룹화될 때 iCIEF 분석법의 결과와 비교할 수 있었다. 그러나, VEGF-트랩의 25℃ 가속된 스트레스 샘플의 경우, 영역 1(또는 산성 변이체)에서의 5 % 증가 및 영역 3(염기성 변이체)에서의 이에 따른 약 5 %의 감소가 iCIEF 분석을 사용하여 관찰되었다는 것이 표 4로부터 명백하다. iCIEF 분석에서 VEGF-트랩 전하 분포에서 관찰된 이러한 경향은 그 다양한 시알릴화(sialylation)에 기인한 전하 패턴의 구조 및 복잡성에 기초하여 VEGF-트랩 샘플에서 발생하는 변화의 성질을 정확하게 반영한 것이다. 가속된 열 응력 하에서 iCIEF 분석법을 사용한 VEGF-트랩 샘플의 산성 변이체(영역 1-고도로 시알릴화된 종)의 증가는 응집과 결합된 가능성있는 탈아미드화를 반영한다. 다른 한편, IEF 방법에 의한 종래 3-9 밴드를 사용하는 그룹화는 VEGF-트랩 전하 이성질체에서 발생하는 미세한 변화를 차단하고 상이한 전하 종을 제어할 여지가 없어서 VEGF-트랩 샘플의 전하 이질성의 미세한 변화를 감지하는 방법만큼 민감하지 않다.
VEGF-트랩은 10 개의 글리코실화 부위를 갖는다. 이러한 부위에 부착된 글리칸 사슬은 분지형이고 각각의 분지는 음으로 하전된 당(sugar) 단량체, 시알산으로 종결되거나 종결되지 않을 수 있다. 글리칸 사슬의 말단에서 시알산기의 존재 하에서의 자연적 변화는 순 전하 범위를 갖는 VEGF-트랩 전하 변이체의 조화를 초래한다. 이들 밴드의 비율은 존재하는 하전된 종의 존재비에 따라 달라진다. 따라서 영역 1(고도로 시알릴화됨), 2(적절히 시알릴화됨) 및 3(적게 시알릴화됨)을 기반으로 다양한 전하 종을 그룹화하는 새로운 보고 방식은 iCIEF 분석이 VEGF-트랩 샘플의 시알릴형태(sialylform)에서 발생하는 변화에 더 잘 반응하도록 한다.
표 4
| 스트레스 조건 | iCIEF | IEF | iCIEF | ||
| % R1 | % R2 | % R3 | % 3-9 밴드 | % 3-9 피크 | |
| VEGF 25℃ 1 개월 | 31.90 | 43.09 | 25.01 | 82.94 | 87.48 |
| VEGF 25℃ 3 개월 | 33.85 | 43.28 | 22.87 | 82.11 | 87.86 |
| VEGF 25℃ 6 개월 | 37.25 | 42.47 | 20.28 | 80.42 | 85.15 |
| 차이 (%) | 5.35 | -0.62 | -4.73 | -2.52 | -2.33 |
iCIEF 분석법의 안정성 표시 능력. VEGF-트랩 DP 샘플(2-8℃에서 유지)의 실시간 안정성 샘플을 24 개월의 기간에 걸쳐 7 개의 독립적인 시점을 사용하여 분석 하였고; 표 5(아래)는 이 연구에 해당하는 데이터를 나타낸다. 이러한 VEGF-트랩 샘플의 과거 IEF 데이터가 참조용으로 제공되고 영역 그룹화 및 3-9 피크 보고로부터의 VEGF-트랩 iCIEF 데이터와 비교된다. 2-8℃의 실시간 저장 조건에서 과거 IEF 데이터에 기반한 VEGF-트랩 샘플에 대해 거의 또는 전혀 유의한 변화가 관찰되지 않았으며, iCIEF 3-9 피크 접근법을 사용하여 보고될 때 유사한 경향이 관찰되었다.
표 5 - iCIEF를 사용하여 분서고딘 실시간 VEGF-트랩 샘플
| 조건 | 시간 | %R1 | %R2 | %R3 |
IEF
(%3-9) |
iCIEF
(%3-9) |
| 5℃ | 3 개월 | 33.67 | 46.49 | 19.84 | 89.21 | 85.45 |
| 5℃ | 6 개월 | 32.90 | 47.14 | 19.96 | 87.09 | 85.26 |
| 5℃ | 9 개월 | 33.20 | 46.99 | 19.81 | 88.78 | 85.23 |
| 5℃ | 12 개월 | 33.71 | 47.05 | 19.24 | 91.37 | 85.12 |
| 5℃ | 15 개월 | 33.71 | 46.80 | 19.49 | 89.92 | 85.05 |
| 5℃ | 18 개월 | 33.89 | 47.00 | 19.11 | 88.27 | 85.25 |
| 5℃ | 24 개월 | 34.14 | 46.87 | 18.99 | 89.79 | 85.03 |
도 8은 iCIEF를 사용하여 24 개월 동안 VEGF-트랩의 % 영역 1, 2 및 3의 선형 적합성을 나타낸다. 영역 1의 작지만 꾸준한 증가 및 영역 3의 감소가 플롯에서 분명하다.
강제로 분해된 VEGF-트랩 DS 샘플을 사용한 추가 분석을 새로운 iCIEF 분석법을 사용하여 수행하였다. 이 연구를 위해, 희석되고 15 일 동안 45℃에서 스트레스를 받는 열분해된 VEGF DS 샘플을 iCIEF 방법(영역 및 3-9)을 사용하여 0, 3, 9 및 15 일 시점에서 분석하였다. 또한, 표 6(아래)에서 명백하듯이, 산성 전하 변이체(영역 1)에서의 미세한 증가가 영역 접근법을 사용하여 그룹화할 때 iCIEF 분석법에 대하여 관찰되며 이는 강제로 분해된 VEGF-트랩 샘플에 대하여 훨씬 이른 시점에서 보고하는 3-9 피크와 비교된다. % 3-9 보고가 3-9 피크에 걸친 전체 전하 분포의 2% 변화를 보고하는 한편, 동일한 조건에서 영역 1은 7% 증가를 나타냈고 영역 3은 이에 따른 시간에서 8%의 감소를 나타냈다. 도 9는 iCIEF 분석법을 사용한 강제 분해된 VEGF-트랩 샘플의 전기영동도를 나타내며; 산성 종의 증가가 프로파일로부터 명백하다.
표 6 - iCIEF(열 스트레스)를 사용하여 분석한 강제 분해된 VEGF-트랩 샘플의 백분율 분포
| 스트레스 조건 | iCIEF | iCIEF | ||
| % R1 | % R2 | % R3 | % 3-9 피크 | |
| VEGF DS 45℃ 0일차 | 28.66 | 44.30 | 27.04 | 84.54 |
| VEGF DS 45℃ 3일차 | 29.47 | 44.60 | 25.93 | 83.90 |
| VEGF DS 45℃ 9일차 | 31.83 | 45.88 | 22.29 | 83.56 |
| VEGF DS 45℃ 15일차 | 35.65 | 45.35 | 19.00 | 82.44 |
| 차이 (%) | 6.99 | 1.05 | -8.04 | -2.10 |
VEGF 스트레스 없는-샘플에 대한 각 피크 백분율과 비교함으로써 VEGF-트랩 스트레스 샘플에 대한 3개 영역의 % 분포의 통계 분석을 실시하였다. 도 10A-10C는 iCIEF 데이터에 대한 열 스트레스된 VEGF-트랩 샘플의 통계 분석을 나타낸다. 통계학적 유의미한 변화가 영역 1 및 3에 대하여 각각 관찰되었다.
iCIEF 분석법 특성화 및 최적화 데이터에 기반하여, 분석 파라미터를 도출하고 표 7(아래)에 표로 나타냈다. 이들 방법 조건은 선형성, 정확성, 정밀도 및 중간 정밀도에 대해 평가되었다.
표 7 - 개발 및 최적화 실험에서 도출된 중요한 방법 파라미터
| 요소 | 2M |
| 메틸셀룰로오스 | 0.35% |
| 양쪽성전해질 3-10 | 3% |
| VEGF-트랩 | 1.0 mg/mL |
| 집속-전 | 1 분 @ 1500 V |
| 집속 | 7 분 @ 3000 V |
iCIEF 분석법 자격. iCIEF 분석법의 선형성. 방법 선형성은 단일 분석가에 의해 평가되었다. 샘플 용액을 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 1.5 mg/mL 및 2.0 mg/mL의 다양한 단백질 농도에서 VEGF-트랩 참조 표준을 사용하여 제조하였다. 이 실험에서, 샘플 매트릭스의 단백질 농도는 0.5 내지 2mg/mL로 변한 반면 다른 매트릭스 성분들은 3% 양쪽성전해질 3-10 및 0.35% 메틸셀룰로오스에서 일정하게 유지시켰다. 집속 시간을 또한 1+7 분에서 일정하게 유지시켰다. 표 8은 0.5 내지 2.0 mg/mL의 선형 범위에 걸쳐 VEGF-트랩 샘플에 대한 영역 1, 2 및 3의 백분율 분포를 요약한 것이다. VEGF-트랩 샘플에 대한 면적 계수의 함수로서 농도의 선형성 플롯을 도 11에서 제공한다.
표 8 - iCIEF 분석법의 선형성
| VEGF-트랩 RS (mg/mL) | % R1 | % R2 | % R3 |
| 0.5 | 29.51 | 46.44 | 24.05 |
| 0.5 | 29.79 | 46.38 | 23.84 |
| 1 | 29.66 | 45.88 | 24.46 |
| 1 | 30.03 | 45.94 | 24.02 |
| 1.5 | 30.27 | 45.83 | 23.91 |
| 1.5 | 29.68 | 45.95 | 24.37 |
| 2 | 29.54 | 46.31 | 24.15 |
| 2 | 29.57 | 46.26 | 24.17 |
분석은 회귀 분석에 기초하여 R2 > 0.99로 0.5 mg/mL 내지 2.0 mg/mL의 단백질 농도 범위에 걸쳐 허용 가능한 선형성을 입증하였다. 또한, 이성질체 분포가 이러한 동일한 농도 범위에 걸쳐 일정하게 유지되었다. 이는 분석이 0.5 내지 2.0 mg/mL의 단백질 농도 범위에 걸쳐 피크 면적 및 이성질체 분포 모두에서 일관된 결과를 제공할 수 있음을 나타낸다.
iCIEF 분석법의 정확성. 방법 정확성을 1.0 mg/mL의 공칭 농도와 비교하여 선형성 데이터를 사용하여 희석 비례에 기초하여 평가하였다. 선형성 데이터에 근거한 희석 회수율을 아래 표 9에 제시한다. 퍼센트 회수율을 = (측정된 면적 백분율/공칭 면적 백분율) x 100%를 사용하여 계산하였다.
표 9 - 희석 비례에 기반한 VEGF-트랩 iCIEF 분석의 정확성
| % 평균 | % 회수율 | |||||
| VEGF-트랩 RS (mg/mL) |
% R1 | % R2 | % R3 | % R1 | % R2 | % R3 |
| 0.5 | 29.65 | 46.41 | 23.95 | 99.35 | 101.09 | 98.78 |
| 1 | 29.85 | 45.91 | 24.24 | 공칭(Nominal) | ||
| 1.5 | 29.98 | 45.89 | 24.14 | 100.44 | 99.96 | 99.59 |
| 2 | 29.56 | 46.29 | 24.16 | 99.03 | 100.82 | 99.67 |
VEGF-트랩 샘플에 대하여 0.5 내지 2.0 mg/mL 단백질 농도 범위에서 희석 비례에 기반한 회수율은 3개 영역에 대하여 98%-101% 이내였다.
iCIEF 방법의 중간 정확성 분석. VEGF-트랩 RS 샘플에 대해 4 일에 걸쳐 각각의 시약 제제 및 2 개의 iCE3 전하 변이체 분석기 기기를 사용하여 2 명의 개별 분석가(A, B)에 의해 중간 정확성을 평가하였다. 분석 결과를 아래 표 10에 나타낸다.
표 10 - 중간 정확성 분석 결과
| 분석가 | %영역 1 | %영역 2 | %영역 3 |
| A | 29.44 | 45.87 | 24.69 |
| 30.53 | 45.08 | 24.39 | |
| 29.71 | 45.83 | 24.46 | |
| A | 29.91 | 45.98 | 24.11 |
| 29.50 | 46.18 | 24.31 | |
| 29.76 | 46.14 | 24.10 | |
| B | 28.78 | 46.65 | 24.57 |
| 29.40 | 46.22 | 24.38 | |
| 29.61 | 45.85 | 24.54 | |
| B | 29.56 | 46.10 | 24.34 |
| 30.01 | 45.85 | 24.15 | |
| 29.50 | 45.89 | 24.61 | |
| 전체 평균 | 29.64 | 45.97 | 24.39 |
| 표준 편차 | 0.42 | 0.37 | 0.20 |
| % RSD | 1.40 | 0.80 | 0.81 |
제안된 VEGF-트랩 iCIEF 테스트 방법은 상이한 시약 제제를 사용하는 상이한 분석가가 실행할 때 허용 가능한 정확성을 입증하였다. 전체 % RSD가 계산되었고 3개 영역 모두에 대해 2%의 RSD 내에 있었다.
iCIEF 분석법의 견고성. 분석법 견고성의 여러 요소를 다양한 실험으로 평가하였다. 이러한 실험을 표 11에 열거한다.
표 11 - 방법 견고성 실험 요약
| 견고성 실험 | 평가된 성능 |
| 제조된 용액 안정성 | 시간 T=O와 비교하여 24 시간에 걸친 이성질체 분포의 일관성 |
| 양쪽성전해질 3-10의 또 다른 샘플 평가 | 3개 영역에 걸친 전체 프로파일 및 % 분포의 일관성 |
| 안정성 표시의 증거 | 이성질체 분포에 대한 스트레스 노출의 영향 |
기계에서의 제조된 용액 안정성. 용액 안정성은 샘플 매트릭스에서 참조 표준의 샘플을 제조하고 iCIEF를 사용하여 샘플을 분석함으로써 평가되었다. 샘플을 3% 양쪽성전해질 3-10, 0.35% 메틸셀룰로오스 및 2 M 요소로 구성된 매트릭스 내에서 10℃에서 분석한 후에 iCE3 기기에 저장하였다. 대략 24 시간 후에 샘플을 다시 분석 하였다. 각각의 분석에 대한 이성질체 분포를 아래 표 12에 제시한다.
표 12 - 기계에서의 제조된 iCIEF 샘플 안정성의 결과
| 샘플 명칭 | %영역 1 | %영역 2 | %영역 3 |
| 시간 0 주입 1에서의 VEGF RS | 29.49 | 45.72 | 24.80 |
| 시간 0 주입 2에서의 VEGF RS | 29.88 | 45.62 | 24.50 |
| 시간 24 시간 주입 1에서의 VEGF RS | 29.52 | 45.92 | 24.56 |
| 시간 24 시간 주입 2에서의 VEGF RS | 29.95 | 45.74 | 24.31 |
| % 차이 | 0.46 | 0.30 | 0.49 |
T = O에서 그리고 다시 T = 24 시간에서 분석된 샘플 사이의 절대 차이는 각 시점에서 관찰된 범위 (최대 및 최소)에 기초하여 계산되었다. 절대 차이는 3개 영역에 대해 0.5% 이하였다. 이는 iCE3 전하 변이체 분석기에서 10℃에서 저장될 때 시료가 최대 24 시간 동안 매트릭스에서 안정적임을 나타낸다.
양쪽성전해질(3-10)의 샘플 평가. 하나의 공급원에서 얻은 3-10 양쪽성전해질의 여러 샘플을 분석하였다. 상이한 샘플을 사용하여 분석된 VEGF-트랩 샘플의 전체 전하 변이체 프로파일은 유사하였다. 피크 패턴 측면에서 전기영동도 프로파일의 약간의 차이가 영역 1에서 일부 양쪽성전해질 샘플에 대해 관찰되었지만, 백분율 분포는 유사하고 분석 변동성 내에 있었다. 양쪽성전해질의 3개 샘플로부터의 대표적인 전기영동도를 도 12에 제시한다.
실시예 - 새로운 iCIEF 분석법을 사용한 과거 VEGF-트랩 방출 샘플(DS, FDS 및 DSI)의 분석
iCIEF 분석법의 견고성을 더욱 확립하기 위해, 계보와 관련이 없는 총 37 개의 고유한 과거 VEGF-트랩 샘플을 양쪽성전해질의 두 가지 샘플을 사용하는 iCIEF를 사용하여 분석하였다. 분석은 15 VEGF-트랩 DSI (원료의약품 중간체, 수성 완충 용액, pH 6.2, 5 mM 소듐 포스페이트, 5 mM 소듐 시트레이트 및 100 mM 소듐 클로라이드 포함), 10 VEGF-트랩 DS 샘플 (원료의약품 SPEC C701, 수성 완충 용액, pH 6.2, 10 mM 소듐 포스페이트 함유) 및 12 VEGF-트랩 FDS 샘플(제형화된 원료의약품, SPEC C713 수성 완충 용액, pH 6.2, 10 mM, 소듐 포스페이트, 40 mM 소듐 클로라이드, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20 및 5% (w/v) 수크로오스 포함)을 포함하였다. 이들 VEGF-트랩 샘플을 iCIEF 분석법을 사용하여 분석하였다.
양쪽성전해질은 전기장의 영향 하에서 pH 구배를 설정하는데 도움을 주는 3 내지 10의 등전점 스펙트럼을 갖는 양쪽성 화합물의 상이한 동족체의 혼합물이다. iCIEF 분석법에서 사용된 양쪽성전해질 3-10은 일반적으로 배취식(batch)으로 제조되는 하나의 공급원으로부터 구입하였다. 또 다른 단백질에 대한 iCIEF 분석에 관한 우리의 실무 지식과 함께 공급 업체의 권장사항을 기반으로, 상이한 샘플 간의 약간의 변화가 관찰되었으며 이는 불가피한 것이다. 따라서, 상이한 양쪽성전해질 샘플에 걸쳐 새로운 iCIEF 분석의 견고성을 확립하기 위하여, 양쪽성전해질의 두 가지 샘플을 분석하였다. DS, DSI 및 FDS 제품 단계로부터의 VEGF 샘플을 제안된 영역 그룹화 접근법(R1, R2 및 R3)을 사용하고 또한 IEF 분석법과 유사한 3-9 피크 그룹화를 기반으로 분석하였다. 도 13A-13C는 % 영역 1, 2 및 3 그리고 VEGF-트랩 DS, DSI 및 FDS 샘플에 대한 피크 3-9의 함수로서 양쪽성전해질 샘플의 통계 분석을 나타낸다. 37개 VEGF-트랩 샘플에 상응하는 데이터를 양쪽성전해질 샘플 중 하나에 대하여 표 13에서 제공한다. 표 14-16은 37개 샘플에 대한 완전한 데이터 세트를 제공한다.
표 13 - iCIEF 분석 절차를 사용하여 분석한 과거 VEGF-트랩 DSI, DS 및 FDS 샘플
| VEGF-트랩 DSI 샘플 | %R1 | %R2 | %R3 | % 3 내지 9 피크 |
| 1 | 29.7 | 43.6 | 26.7 | 82.7 |
| 2 | 28.5 | 43.6 | 28.0 | 83.5 |
| 3 | 28.0 | 44.3 | 27.7 | 84.2 |
| 4 | 28.1 | 44.2 | 27.8 | 83.9 |
| 5 | 28.7 | 44.9 | 26.4 | 84.6 |
| 6 | 27.6 | 44.2 | 28.2 | 84.0 |
| 7 | 23.7 | 41.8 | 34.6 | 81.7 |
| 8 | 26.8 | 43.1 | 30.1 | 82.9 |
| 9 | 28.5 | 45.2 | 26.4 | 85.0 |
| 10 | 27.2 | 44.1 | 28.7 | 84.0 |
| 11 | 28.5 | 45.2 | 26.4 | 85.0 |
| 12 | 27.9 | 44.3 | 27.8 | 84.4 |
| 13 | 28.0 | 43.7 | 28.3 | 83.7 |
| 14 | 27.8 | 42.9 | 29.3 | 83.3 |
| 15 | 29.2 | 44.7 | 26.1 | 84.3 |
| 16 | 29.0 | 44.0 | 27.0 | 84.2 |
| 17 | 28.9 | 43.7 | 27.4 | 83.8 |
| 18 | 30.6 | 44.3 | 25.1 | 84.1 |
| 19 | 29.7 | 43.9 | 26.4 | 83.8 |
| 20 | 29.9 | 43.7 | 26.4 | 83.3 |
| 21 | 29.1 | 43.9 | 27.1 | 84.1 |
| 22 | 27.1 | 44.8 | 28.1 | 85.3 |
| 23 | 30.4 | 44.7 | 24.9 | 84.8 |
| 24 | 28.3 | 43.7 | 28.1 | 83.2 |
| 25 | 27.3 | 43.3 | 29.5 | 83.2 |
| 26 | 28.0 | 42.3 | 29.6 | 81.8 |
| 27 | 27.2 | 45.2 | 27.6 | 85.8 |
| 28 | 30.1 | 43.4 | 26.5 | 84.1 |
| 29 | 29.2 | 44.1 | 26.7 | 84.0 |
| 30 | 29.8 | 43.4 | 26.8 | 83.3 |
| 31 | 29.7 | 44.7 | 25.7 | 84.6 |
| 32 | 32.3 | 45.3 | 22.4 | 84.5 |
| 33 | 33.4 | 44.4 | 22.2 | 83.8 |
| 34 | 33.6 | 45.2 | 21.1 | 84.5 |
| 35 | 31.0 | 45.2 | 23.8 | 85.3 |
| 36 | 33.8 | 42.1 | 24.1 | 81.3 |
| 37 | 29.2 | 42.2 | 28.6 | 82.2 |
| 38 | 28.2 | 41.9 | 29.9 | 81.8 |
| 39 | 28.7 | 42.9 | 28.4 | 82.8 |
표 14 - Pharmalyte 샘플에 의해 분석된 DSI 로트
| VEGF 트랩 DSI 샘플 | %R1 | %R2 | %R3 | % 3 내지 9 피크 |
| 1 | 30.2 | 43.1 | 26.7 | 87.9 |
| 2 | 27.8 | 44.4 | 27.8 | 88.8 |
| 3 | 28.0 | 44.5 | 27.6 | 88.9 |
| 4 | 27.9 | 44.4 | 27.8 | 88.7 |
| 5 | 28.8 | 44.8 | 26.4 | 85.3 |
| 6 | 27.5 | 44.3 | 28.2 | 87.1 |
| 7 | 23.7 | 41.4 | 34.9 | 89.7 |
| 8 | 26.9 | 42.9 | 30.2 | 88.4 |
| 9 | 28.5 | 45.1 | 26.4 | 89.3 |
| 10 | 27.6 | 43.9 | 28.4 | 88.7 |
| 11 | 28.3 | 44.9 | 26.8 | 88.3 |
| 12 | 28.1 | 44.6 | 27.3 | 87.8 |
| 13 | 28.2 | 43.7 | 28.1 | 87.8 |
| 14 | 27.6 | 43.5 | 28.9 | 87.9 |
| 15 | 29.3 | 44.7 | 26.0 | 89.2 |
표 15 - Pharmalyte 샘플에 의해 분석된 DS 로트
| VEGF 트랩 DS 샘플 | %R1 | %R2 | %R3 | % 3 내지 9 피크 |
| 1 | 28.8 | 44.7 | 26.4 | 89.3 |
| 2 | 29.4 | 44.3 | 26.3 | 89.2 |
| 3 | 29.2 | 44.5 | 26.2 | 88.9 |
| 4 | 27.3 | 43.4 | 29.2 | 88.2 |
| 5 | 29.6 | 44.0 | 26.4 | 88.9 |
| 6 | 28.3 | 43.8 | 27.9 | 88.8 |
| 7 | 26.7 | 45.3 | 28.1 | 89.8 |
| 8 | 30.2 | 45.1 | 24.7 | 90.1 |
| 9 | 30.5 | 44.5 | 25.0 | 89.3 |
| 10 | 29.1 | 43.9 | 27.0 | 89.3 |
| 11 | 27.9 | 42.5 | 29.5 | 87.5 |
표 16 - Pharmalyte 샘플에 의해 분석된 FDS 로트
| VEGF 트랩 FDS 샘플 | %R1 | %R2 | %R3 |
% 3 내지 9
피크 |
| 1 | 27.5 | 45.0 | 27.5 | 90.0 |
| 2 | 30.0 | 43.5 | 26.5 | 88.7 |
| 3 | 29.1 | 43.7 | 27.2 | 89.1 |
| 4 | 30.2 | 43.0 | 26.7 | 88.4 |
| 5 | 29.8 | 44.6 | 25.6 | 89.8 |
| 6 | 32.5 | 45.4 | 22.1 | 90.3 |
| 7 | 33.3 | 44.7 | 22.0 | 89.6 |
| 8 | 33.6 | 45.4 | 21.0 | 90.9 |
| 9 | 30.7 | 45.5 | 23.8 | 90.1 |
| 10 | 34.2 | 41.7 | 24.2 | 87.2 |
| 11 | 29.0 | 42.4 | 28.6 | 87.2 |
| 12 | 28.4 | 41.3 | 30.3 | 86.5 |
| 13 | 28.5 | 42.5 | 29.1 | 87.6 |
영역 1, 2 및 3 그리고 3-9 그룹화 접근법에 대해 양쪽성전해질의 샘플에 대해 수집된 데이터를 기반으로 일치 쌍 분석(Matched Pair analysis)(도 13D)을 수행하였다. 일치 쌍 분석으로부터의 데이터를 사용하여 2개의 양쪽성전해질 사이의 평균을 비교하고 양쪽성전해질 샘플에서의 고유한 차이로 인해 관찰될 수 있는 분석 보고의 차이를 평가하였다. 데이터에 기초하여, 3개의 영역 R1, R2 및 R3에 대한 샘플 간의 최대 관찰된 평균 차이는 영역 관련하여 보고될 때 0.1% 미만인 것으로 추론될 수 있다. 또한, p-값에 기초하여, 영역 접근법을 사용하여 영역 1, 2 및 3에 걸친 % 분포가 양쪽성전해질 샘플 사이에서 통계적으로 유의미하지 않다고 결론내릴 수 있다.
그러나, DS, DSI 및 FDS 샘플에 대한 VEGF-트랩 데이터 세트가 IEF 분석법과 유사한 3-9 피크 그룹화 접근법을 사용하여 분석될 때, 통계적으로 유의미한 차이가 약간의 일부 양쪽성전해질 샘플 사이에서 주목된다. 예를 들어, 일부 샘플 사이에서, iCIEF 분석법에 대한 피크 3-9로 보고될 때 평균 차이는 4.8% 만큼 높다. 도 13A-13D는 상이한 양쪽성전해질을 사용하여 얻은 iCIEF 프로파일을 보여주고 있으며 양쪽성전해질 샘플 사이에서 관찰된 가변성이 산성 영역에 제한되고 영역 1, 2 및 3을 그룹화함으로써 가변성이 차단됨을 이미지로부터 알 수 있다. 이는 iCIEF 분석에 대한 보고의 영역 접근법을 강력하고 재현가능한 접근법으로 만든다.
%영역 1, 2 및 3 그룹화를 기반으로 하여 양쪽성전해질 샘플을 사용하는 DSI, DS 및 FDS 샘플 분석으로부터의 데이터는 iCIEF 분석을 더욱 견고한 분석법으로 만든다.
따라서, 본 개시에 제시된 iCIEF 시스템, 방법 및 장치는 VEGF-트랩 원료의약품, 원료의약품 중간체, 제형화된 원료의약품, 및 의약품의 전하 변이체 프로파일을 정량화한다. 이러한 구체예는 VEGF-트랩의 전하 이종성 분석을 위한 현재 승인된 겔 기반 IEF 방법을 대체하는 역할을 할 수 있다.
OFFGEL 3100 분획기를 사용하여 분획된 VEGF-트랩 전하 변이체는 모세관 기반 iCIEF 분석법에서 얻은 피크와 겔 기반 기반 IEF 분석 절차에서 분석된 밴드 사이의 상관관계의 입증을 가능하게 하였다. OFFEGEL 전기영동된 VEGF-트랩 분획물을 개별적으로 분석하고 연구에서 스파이크를 통해 개별 iCIEF 피크를 VEGF-트랩 전하 변이체의 IEF 밴드와 직접 비교하였다. 연구 결과, 새로운 iCIEF 분석 절차는 동등하고 더욱 정확한 방식으로 겔 기반 IEF 방법을 사용하여 이전에 분해된 모든 전하 변이체 이성질체를 분해할 수 있음을 확인했다.
따라서, 여기에 개시된 영역 1, 2 및 3의 백분율 분포에 기초한 이러한 보고 접근법의 일부 구체예는 모든 VEGF-트랩 이성질체에 대한 제어를 가능하게 하고 분석법을 더욱 민감하게 하여 견고한 안정성 표시 분석이 되도록 한다.
iCEF 방법과 함께 사용하기 위한 모세관 튜브가 또한 여기에 개시된다. 일반적으로, iCIEF 모세관 튜브는 VEGF-트랩의 전하 변이체 분석에 사용되도록 구성되며, 단백질을 수용하도록 구성되고 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물로 구성된 모세관 튜브를 포함한다. 모세관 튜브는 또한 플루오로카본 코팅을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, VEGF-트랩의 전하 변이체 분석에 사용하도록 구성된 iCIEF 모세관 키트가 제공되며, 단백질을 수용하도록 구성되고 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물로 구성된 하나 이상의 모세관 튜브를 포함하고, 여기서 상기 모세관 튜브는 플루오로카본 코팅을 포함한다.
본 발명의 다양한 실시예가 설명되고 도시되었지만, 해당 분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하거나 및/또는 여기에 기재된 결과 및/또는 하나 이상의 장점을 얻기 위한 다양한 또 다른 수단 및/또는 구조를 구상할 것이며, 이러한 변형 및/또는 수정 각각은 여기에 개시된 본 발명의 실시예 범위 이내에 있은 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 해당 분야의 통상의 기술자는 여기에 개시된 모든 파라미터, 양, 백분율, 농도, 치수, 재료, 및 구성이 하나의 실시예이며 실제 파라미터, 양, 백분율, 농도, 치수, 재료, 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 응용 또는 응용들에 의존할 것임을 쉽게 이해할 것이다. 해당 분야의 통상의 기술자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 여기에 개시된 특정한 본 발명의 실시예에 대한 많은 균등범위를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러므로, 전술한 실시예는 단지 예시로서 제시된 것으로 이해되어야 한다. 여기에 개시된 본 발명의 실시예는 구체적으로 개시되고 청구된 것과 다른 방식으로 실시될 수도 있다. 본 개시의 발명의 실시예는 또한 여기에 개시된 개별 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및 방법을 포함한다. 또한, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및 방법의 임의의 조합이 또한 본 발명이다(이러한 것이 상호 모순되지 않는 경우). 일부 실시예는 하나 이상의 특징/요소/기능을 구체적으로 결여한다는 점에서 종래 기술과 구별될 수 있다(즉, 이러한 실시예에 관한 청구항은 부정적 한정을 포함할 수도 있다).
또한 언급된 바와 같이, 다양한 본 발명의 사상은 하나 이상의 방법으로서 구체화될 수도 있다. 방법의 한 부분으로 수행된 실시는 임의 적절한 방식으로 순서화될 수도 있다. 따라서, 실시가 제시된 순서와 다른 순서로 수행되는 실시예가 구현될 수 있으며, 이는 제안된 실시예에서 순차적인 실시로 제시됨에도 불구하고 일부 실시가 동시에 실현될 수 있음을 포함할 수 있다.
본 출원의 임의의 곳에 제시된 간행물 또는 다른 문서에 대한 임의의 및 모든 참조는 본원에 그 전체가 참고로 수록된다. 더욱이, 여기에 정의되고 사용된 모든 정의는 사적적 정의, 참조에 의해 포함된 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 통제하는 것으로 이해되어야 한다.
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<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Rambhadran, Anu
Cui, Peng
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<223> VEGF Trap
<400> 1
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430
Claims (23)
- 다음을 포함하는 혈관 내피 성장 인자 VEGF-트랩의 전하 변이체 분석 방법:
적어도 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물을 포함하는 분리 모세관에 단백질 샘플을 로딩하는 단계;
소정의 제1 시간 기간 동안 제1 전압을 인가하여 상기 양쪽성전해질이 상기 모세관 내에서 pH 구배를 형성하는 단계;
소정의 제2 시간 기간 동안 제2 전압을 인가하여 상기 모세관 내에서 상기 단백질의 전하 변이체의 이동을 집속시켜 상기 변이체의 전체 전하가 중성이 되도록 하는 단계; 및
상기 단백질의 전하 변이체를 검출하고 정량화하는 단계. - 청구항 1에 있어서,
전하 변이체를 검출하고 정량화하는 단계는
복수의 전하 변이체 이성질체에 대한 흡광도를 측정하는 단계;
상기 복수의 전하 변이체 이성질체를 적어도 제1 산/산성 영역(R1), 제2 중성 영역(R2), 및 제3 염기/염기성 영역(R3)을 포함하는 분리된 영역으로 분리시키는 단계; 및
각각의 영역 R1, R2 및 R3에 해당하는 전하 변이체 이성질체의 백분율을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 1에 있어서, 전하 변이체의 검출 및 정량화 둘 모두가 수행되는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 대략 280 nm의 파장에서 전하 변이체의 검출이 발생하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 모세관 튜브에 로딩된 단백질의 농도가 대략 2.0 mg/ml인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 안정화 첨가제는 요소를 포함하는, 방법.
- 청구항 5에 있어서, 혼합물에서의 요소의 양이 대략 2 M을 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 혼합물은 대략 0.35% 메틸셀룰로오스를 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 제1 전압은 1500 V를 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 소정의 제1 시간은 대략 1 분인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 제2 전압은 3000 V를 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 소정의 제2 시간은 대략 7 분인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 모세관 튜브에 로딩된 단백질의 농도가 대략 1.0 내지 8.0 mg/ml, 또는 임의의 그 사이 범위인, 방법.
- 청구항 6에 있어서, 혼합물 내의 요소의 양은 0M 초과 대략 8M 미만, 또는 임의의 그 사이 범위인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 혼합물은 대략 0.01% 내지 대략 0.35% 메틸셀룰로오스, 또는 임의의 그 사이 범위를 포함하는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 제1 전압은 대략 1V 내지 약 3000 V, 또는 임의의 그 사이 범위인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 소정의 제1 시간은 대략 1 초 내지 대략 5 분, 또는 임의의 그 사이 범위인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 제2 전압은 약 1V 내지 대략 6000 V, 또는 임의의 그 사이 범위인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 소정의 제2 시간은 대략 1 분 내지 대략 14 분, 또는 임의의 그 사이 범위인, 방법.
- 다음을 포함하며, VEGF-트랩의 전하 변이체 분석에서 사용하도록 구성된 iCIEF 모세관 튜브:
단백질을 수용하도록 구성되고, 캐리어 양쪽성전해질, 메틸셀룰로오스, 및 안정화 첨가제의 혼합물로 구성된 모세관 튜브,
여기서 상기 모세관 튜브는 플루오로카본 코팅을 포함함. - 청구항 20에 있어서, 이들의 구성요소는 청구항 2-19 중 어느 하나 및/또는 또 다른 하나를 따르는, 모세관 튜브.
- 청구항 19-20 중 어느 하나에 따르는 하나 이상의 모세관 튜브를 포함하고 VEGF-트랩의 전하 변이체 분석에서 사용되도록 구성된 iCIEF 키트.
- 청구항 1-19 중 어느 하나 또는 또 다른 하나에 따르는 방법을 수행하기 위한 시스템.
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