JP2023145494A - 試料マトリックスにおいてタンパク質変異体を分析するための画像キャピラリー等電点電気泳動法 - Google Patents
試料マトリックスにおいてタンパク質変異体を分析するための画像キャピラリー等電点電気泳動法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】血管内皮成長因子VEGF-Trapなどのタンパク質の電荷変異体を分析する新規な方法の提供。【解決手段】本開示の実施形態は、血管内皮成長因子VEGF-Trapなどのタンパク質の電荷変異体を分析する方法に対応する方法、システム、機器、及び、キットに関する。【選択図】図1-1
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2017年8月18日に出願した、米国仮出願第62/547,602号の優先権を主張するものであって、同出願の全内容を参照により本明細書に援用する。
本出願は、2017年8月18日に出願した、米国仮出願第62/547,602号の優先権を主張するものであって、同出願の全内容を参照により本明細書に援用する。
配列表
本願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出し、かつその全内容を参照により本明細書に援用する配列表を含む。2018年8月15日に作成した同ASCIIコピーは、その識別名が、REGE-005_001WO_ST25.txtであり、そして、大きさは、4,214バイトである。
本願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出し、かつその全内容を参照により本明細書に援用する配列表を含む。2018年8月15日に作成した同ASCIIコピーは、その識別名が、REGE-005_001WO_ST25.txtであり、そして、大きさは、4,214バイトである。
開示の分野
本開示の分野は、試料マトリックスでのVEGF Trapなどのタンパク質の電荷変異体を分析するための方法とシステムに関する。
本開示の分野は、試料マトリックスでのVEGF Trapなどのタンパク質の電荷変異体を分析するための方法とシステムに関する。
電荷変異体は、大抵の場合、かような変化が、薬物の活性、安定性、そして、場合によっては、患者の安全性にも影響を与える場合があるので、電荷変異体の分析は、バイオ医薬品として使用する様々なタンパク質について必要とされている。当該業界で使用している電荷変異体を特定及び特徴決定するための従来の方法として、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動ゲル電気泳動、及び、キャピラリー等電点電気泳動がある。画像キャピラリー等電点電気泳動法は、その解像度の高さ、試料が少量で済むこと、それに、高速での実行時間が故に有用である、ことが認められている。したがって、画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して、VEGF Trapなどのタンパク質の電荷変異体を決定する方法及びシステムは有益である。
本明細書では、様々なタンパク質の電荷変異体分析のための方法及びシステムを記載している。例えば、これらの方法とシステムを使用して、VEGF Trapの電荷変異体を分析することができる。VEGF Trapを分析するための承認済の方法、すなわち、等電点電気泳動ゲルをバンド3~9にグループ分けして電荷変異体分布を報告する方法に代えて、本明細書で説明する方法及びシステムは、一般的に、画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して、電荷変異体のアイソフォームのパーセンテージに関する電荷不均一性を報告し、そして、それらを電気泳動図の3つの異なる領域にグループ分けする。ここで報告する手順では、VEGF Trap試料のアイソフォームで認められる変化に対して、さらに敏感になり得る。
上記したように、本開示の実施形態は、タンパク質の電荷変異体を決定するための方法、システム、及び、機器、特に、以下で「VEGF-Trap」と称する血管内皮成長因子(VEGF)ブロッカーなどのタンパク質の電荷分散を評価するための画像キャピラリー等電点電気泳動(iCIEF)アッセイに関する。iCIEFとは、VEGF-Trap電荷変異体分析のための承認済の等電点電気泳動(IEF)法の代替法である。
iCIEFの実施形態は、等電点(pI)に基づいて、タンパク質電荷変異体を分離する技術に対応している。例えば、一部の実施形態では、タンパク質試料を、両性電解質担体(例えば、Pharmalyte(商標))、メチルセルロース、及び、安定化添加剤(すなわち、尿素)の混合物を含む分離毛細管に取り込ませる。所定の時間、電圧を印加すると、両性電解質担体が、毛細管内でpH勾配を形成する。一部の実施形態では、当該電圧を、「電気泳動」時間に対応する第2のより長い時間かけて印加する。これにより、当該タンパク質電荷変異体は、当該変異体の全体的な電荷が中性になる時点(すなわち、それらのpI)に達するまで、当該毛細管内を移動する。
そのような実施形態において、当該毛細管チューブ(フルオロカーボン(FC)でコーティングしたもの)を、タンパク質電荷変異体を直接に検出、及び、定量することを可能にするデジタル(例えば、CCD)カメラに接続する。特に、焦点調節した後に、当該毛細管チューブを(好ましくは、リアルタイムで)画像化するようにCCDカメラを構成して、毛細管内のタンパク質を検出する。一部の実施形態では、約280nmの波長で検出する。この技術でのパラメーターとして、
- 両性電解質のブランドと濃度、
- 使用する添加物の種類と濃度、及び
- 焦点調節時間と試料濃度、がある。
- 両性電解質のブランドと濃度、
- 使用する添加物の種類と濃度、及び
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当該毛細管内でのタンパク質の凝集と沈殿は、電気泳動図の再現性に悪影響を及ぼす。この点に関して、尿素などの添加剤の使用は、タンパク質に対する焦点を調節する際に、当該タンパク質の安定化及び可溶化に役立ち得る。
したがって、一部の実施形態では、血管内皮成長因子VEGF-Trapの電荷変異体を分析する方法を提供しており、この方法は、少なくとも両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を含む分離用毛細管にタンパク質試料を取り込ませることと、第1の所定の期間、第1の電圧を印加することであって、当該両性電解質担体に、当該毛細管内でpH勾配を形成させる、当該第1の電圧を印加することと、第2の所定の期間、第2の電圧を印加することであって、それぞれのpIまでの当該タンパク質の電荷変異体の移動に対する焦点を合わせる、当該第2の電圧を印加することと、当該タンパク質の電荷変異体を検出及び定量することと、を含む。
そのような実施形態において、電荷変異体の検出及び定量は、複数の電荷変異体アイソフォームの吸光度を測定することと、当該複数の電荷変異体アイソフォームを、少なくとも第1の酸/酸性領域(R1)、第2の中性領域(R2)、及び、第3の塩基/塩基性領域(R3)を含む単離した領域に分離することと、領域R1、R2、及び、R3のそれぞれに含まれる電荷変異体アイソフォームのパーセンテージを決定することと、を含む。
そのような実施形態の場合、検出及び定量のための画像分析は、従来の方法及びシステム(例えば、画像分析ソフトウェアに従うことができる。
上記においてまとめた実施形態では、以下のさらなる特徴/機能の1つ以上を含み得る(その結果、なおもさらなる発明の実施形態を提供する)が、これらの特徴のいずれか1つ以上は相違し得るものであり、かつ、それらは依然として本発明の範囲内にあり得ることを申し添える。以下に提供したリストは一実施形態に過ぎない:
- 電荷変異体を、検出及び定量する;
- 電荷変異体を、約280nmの波長で検出する;
- 当該毛細管チューブに取り込ませるタンパク質の濃度は、約2.0mg/mlである;
- 当該安定化添加剤は、尿素を含む;
- 当該混合物中の尿素の量は、約2Mである;
- 当該混合物は、約0.35%のメチルセルロースを含む;
- 当該第1の電圧は、1500Vを含む;
- 当該第1の所定の時間は、約1分である;
- 当該第2の電圧は、3000Vを含む;
- 当該第2の所定の時間は、約7分である;
- 当該毛細管チューブに取り込ませるタンパク質の濃度は、約1.0~8.0mg/mlの間である;
- 当該混合物での尿素の量は、0Mより大きく、かつ、約8M未満である;
- 当該混合物は、約0.01%~約0.35%、または、その間のあらゆる範囲のメチルセルロースを含む;
- 当該第1の電圧は、約1V~約3000Vの間、または、その間のあらゆる範囲である;
- 当該第1の所定の時間は、約1秒~約5分の間、または、その間のあらゆる範囲である;
- 当該第2の電圧は、約1V~約3000Vの間、または、その間のあらゆる範囲である;及び/または
- 当該第2の所定の時間は、約1分~約14分の間、または、その間のあらゆる範囲である。
- 電荷変異体を、検出及び定量する;
- 電荷変異体を、約280nmの波長で検出する;
- 当該毛細管チューブに取り込ませるタンパク質の濃度は、約2.0mg/mlである;
- 当該安定化添加剤は、尿素を含む;
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- 当該混合物は、約0.35%のメチルセルロースを含む;
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- 当該混合物での尿素の量は、0Mより大きく、かつ、約8M未満である;
- 当該混合物は、約0.01%~約0.35%、または、その間のあらゆる範囲のメチルセルロースを含む;
- 当該第1の電圧は、約1V~約3000Vの間、または、その間のあらゆる範囲である;
- 当該第1の所定の時間は、約1秒~約5分の間、または、その間のあらゆる範囲である;
- 当該第2の電圧は、約1V~約3000Vの間、または、その間のあらゆる範囲である;及び/または
- 当該第2の所定の時間は、約1分~約14分の間、または、その間のあらゆる範囲である。
一部の実施形態では、VEGF-Trapの電荷変異体分析での使用のために構成したiCIEF毛細管チューブを提供しており、これは、タンパク質を取り込めるように構成しており、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の毛細管チューブを含む。当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングも含み得る。
一部の実施形態では、VEGF-Trapの電荷変異体分析での使用のために構成したiCIEFキットを提供しており、当該iCIEFキットは、タンパク質を取り込めるように構成しており、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の1つ以上の毛細管チューブを含み、当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングを含む。
本明細書では、VEGF Trapなどの様々なタンパク質の電荷変異体分析のための方法及びシステムを説明する。VEGF Trapは、表1に示す配列を含む融合タンパク質である。VEGF Trapを分析するための承認済の方法、すなわち、等電点電気泳動ゲルをバンド3~9にグループ分けして電荷変異体分布を報告する方法に代えて、本明細書で説明する方法及びシステムは、一般的に、画像キャピラリー等電点電気泳動を使用して、電荷変異体のアイソフォームのパーセンテージに関する電荷不均一性を報告し、そして、それらを電気泳動図の3つの異なる領域にグループ分けする。以前に述べたように、ここで報告する手順では、VEGF Trap試料のアイソフォームで認められる変化に対して、さらに敏感になり得る。
本開示を通して、以下の略語を使用する:
- iCIEF - 画像キャピラリー等電点電気泳動
- IEF - 等電点電気泳動
- pI - 等電点
- RS - 参照標準
- DS - 原薬
- DSI - 原薬中間体
- FDS - 製剤原薬。
- iCIEF - 画像キャピラリー等電点電気泳動
- IEF - 等電点電気泳動
- pI - 等電点
- RS - 参照標準
- DS - 原薬
- DSI - 原薬中間体
- FDS - 製剤原薬。
VEGF Trapの電荷変異体を分析する方法は、一般的には、少なくとも両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を含む分離用毛細管にタンパク質試料を取り込ませることと、第1の所定の時間、第1の電圧を印加することであって、当該両性電解質担体に、当該毛細管内でpH勾配を形成させる、当該第1の電圧を印加することと、第2の所定の時間、第2の電圧を印加することであって、当該毛細管内での当該タンパク質の電荷変異体の移動に焦点を合わせて、当該変異体の全体的な電荷を中性にする、当該第2の電圧を印加することと、当該タンパク質の電荷変異体を検出及び定量することと、を含む。
当該分離毛細管には、約0.5mg/mL~約2mg/mLの範囲の濃度のVEGF Trapを取り込ませることができる。例えば、当該分離毛細管には、約0.5mg/mL、約1.0mg/mL、約1.5mg/mL、または、約2mg/mLの濃度のVEGF Trapを取り込ませ得る。一部の実施形態では、当該分離毛細管に、約1.0mg/mLの濃度のVEGF Trapを取り込む。
当該混合物でのメチルセルロースの量は、約0.01%~約0.35%の範囲とし得る。例えば、当該混合物でのメチルセルロースの量は、約0.01%、約0.05%、約0.10%、約0.15%、約0.20%、約0.25%、約0.30%、または、約0.35%とし得る。一部の実施形態では、当該混合物でのメチルセルロースの量は、約0.35%である。
当該第1の電圧に関して、それは、約1V~約3000Vの範囲とし得る。例えば、当該第1の電圧を、約1V、約100V、約500V、約1000V、約1500V、約2000V、約2500V、または、約3000Vとし得る。一部の実施形態では、当該第1の電圧は、約1500Vである。
当該第2の電圧を、約1V~約3000Vの範囲とし得る。例えば、当該第2の電圧を、約1V、約100V、約500V、約1000V、約1500V、約2000V、約2500V、または、約3000Vとし得る。一部の実施形態では、当該第2の電圧は、約3000Vである。
当該第1の所定の時間を、約1秒~約5分の範囲とし得る。例えば、当該第1の所定の時間を、約1秒、約10秒、約20秒、約30秒、約40秒、約50秒、約1分(60秒)、約1.5分(90秒)、約2分(120秒)、約2.5分(150秒)、約3分(180秒)、約3.5分(210秒)、約4分(240秒)、約4.5分(270秒)、または、約5分(300秒)とし得る。一部の実施形態では、当該第1の所定の時間は、約1分(60秒)である。
当該第2の所定の時間を、約1分~約14分の範囲とし得る。例えば、当該第2の所定の時間を、約1分、約2分、約3分、約4分、約5分、約6分、約7分、約8分、約9分、約10分、約11分、約12分、約13分、または、約14分とし得る。一部の実施形態では、当該第2の所定の時間は、約7分である。
あらゆる適切な添加剤を、当該混合物に使用し得る。一部の実施形態では、添加剤として尿素を使用すると、有益となり得る。例えば、2M尿素を混合物に含めると、有益となり得る。後に詳述するように、様々な試薬(両性電解質)をも当該混合物に含め得る。ある実施形態において、VEGF Trapを、1.0mg/mLの濃度で毛細管に取り込ませ、そして、0.35%メチルセルロース、2M尿素、及び、3~10のpIを有する3%両性電解質の混合物を使用する画像キャピラリー等電点電気泳動法を使用して分析する。
試薬及び機器。以下の表2は、本開示の一部の実施形態に従って使用する試薬(両性電解質)と機器とを列挙している。手がけた実施例では、iCE3(ProteinSimple(登録商標))電荷変異体分析器を使用する。特に断りのない限り、VEGF-Trap参照標準(RSVITV-5)を、方法の開発と特徴決定の期間での被験物質として使用した。
少なくとも一部の実施形態の例:
まず、両性電解質のスクリーニングを、pIの範囲、及び、両性電解質の供給源に基づいて行った。それぞれが固有のpI範囲をカバーする4つの両性電解質を、3つの異なる供給源から得た。これらの両性電解質を、以下の出発物を用いて分析した:
- 2.0mg/mLのタンパク質濃度、
- 2M尿素、
- 0.35%メチルセルロース、
- 1500Vで、1分間の事前焦点調節、及び
- 3000Vで、7分間の焦点調節。
まず、両性電解質のスクリーニングを、pIの範囲、及び、両性電解質の供給源に基づいて行った。それぞれが固有のpI範囲をカバーする4つの両性電解質を、3つの異なる供給源から得た。これらの両性電解質を、以下の出発物を用いて分析した:
- 2.0mg/mLのタンパク質濃度、
- 2M尿素、
- 0.35%メチルセルロース、
- 1500Vで、1分間の事前焦点調節、及び
- 3000Vで、7分間の焦点調節。
図1A~Fは、両性電解質の6つの範囲を使用して、iCE3電荷分析器で得た電気泳動図を例示している。以下の両性電解質範囲を使用した。
図A- 3~10 Pharmalyte
図B- 5~8/8~10.5 Pharmalyteの組み合わせ
図C- 2~9 Servalyt
図D- 4~9 Servalyt
図E- Bio-Lyte 3~10、40%
図F- 3~10及び6.7~7.7の3成分混合Pharmalyte
図A- 3~10 Pharmalyte
図B- 5~8/8~10.5 Pharmalyteの組み合わせ
図C- 2~9 Servalyt
図D- 4~9 Servalyt
図E- Bio-Lyte 3~10、40%
図F- 3~10及び6.7~7.7の3成分混合Pharmalyte
選択したタンパク質。VEGF-Trapに関して、承認済の電荷変異体解析手順で得た電気泳動図に最もよく似ているため、pI3~10の範囲の両性電解質を、iCIEF電気泳動図の全体的なプロファイルとして選択した(例えば、図3に示したIEF画像を参照されたい)。
尿素の最適化。一部の実施形態では、方法の最適化は、尿素濃度の変更(尿素不含から最大で8Mまで)も含んでいた。図2A~2Eは、VEGF-Trap RSVITV-5試料の電気泳動図について、このような尿素濃度の変化の効果を示している。一般的に、尿素濃度を下げると解像度が向上するが、尿素を増やすと(8M)、解像度の低下を招くことが認められた。しかしながら、ネイティブ条件(尿素不含)で解像したVEGF-Trapでは、解像度の低下と再現性の欠如という同様の問題が存在していた。したがって、1~3Mの尿素濃度を使用して分離した場合、VEGF-Trapの全体的なピークパターンと分解能とは、互いに同等であった。
両性電解質3~10濃度とタンパク質濃度とを最適化するために、2M尿素を使用して、さらに実験を行った。図3は、タンパク質濃度1.0mg/mLで、2M尿素、0.35%メチルセルロース、及び3%3~10両性電解質を使用して得た電気泳動図を示している。当該iCIEF電気泳動図を、別の電気泳動図と比較し、そして、暫定的なピークを割り当てた(図3)。
方法の特徴決定。当該iCIEFを使用して、全体的な電荷プロファイルと、ピークのパターンとを得て、アッセイ法は、(図2A~2Eに示すように)当該IEFバンドプロファイルに匹敵していた。しかしながら、当該IEFアッセイ法のバンドパターンをさらに理解し、そして、iCIEF分析を使用して得たピークパターンに橋渡しするために、VEGF-Trap試料のOFFGEL分別を行った。当該OFFGEL電気泳動から得た個々の電荷変異体分画を、IEF及びiCIEFアッセイ法を使用して分析した。Agilent 3100 OFFGEL Fractionatorを使用して、VEGF-Trap参照標準をその等電点に従って分画し、そして、液体分画として回収した分離アイソフォームを、2つの方法、IEF及びiCIEFを使用して分析した。VEGF-Trapで認められたpI範囲の電荷変異体をカバーするpH6~9の固定化pH勾配ストリップ(IPGストリップ)を使用して、VEGF-Trap RSを分画した。実験と分離の詳細な設定は、以下の通りである:
1)2.3mLの50%グリセロール、230.4μlのIPG緩衝剤(pH6~11)、及び、16.64mlの水を組み合わせて、総体積を19.2mlにして、原液を調製した。
2)73μgのVEGF(4.2mg)を、12mLの原液、及び、3mLの水に対して添加して、VEGF Trap溶液を調製した。
3)1.15mLの水と、4.6mLの原液とを組み合わせて、IPGストリップの再水和溶液を過剰に調製した。
4)pH範囲が6~9(24cm)であるIPGゲルストリップを、2つの機器トレイの1つおきのレーンに配置し、そして、24ウェルフレームを、その上の所定の位置に留めた。標準のOFFGELキットプロトコル(OFFGEL使用説明書:Agilent 3100 OFF GEL Fractionator Kit quick Start Guide,5th Edition Sep 2010を参照されたい)を、ストリップの再水和、抗体の取り込み、及び、機器にトレイを取り付けるために使用した。
5)20℃のプラットフォーム温度を使用した。24ウェル設定の標準機器タンパク質焦点調節方法を、50μAの定電流、8000Vの最大電圧設定、200mWの最大電力設定を使用して実行した。
6)34時間の分別後に、分析を停止し、そして、ウェル3~12の各レーンの同様のウェル番号をプールし、次いで、水に交換し、そして、分析前の約5倍にまで濃縮した。
7)各分画の抗体量を、Nanodropの吸光係数1.15で、280nmの吸光度を測定して決定した。1つの機器で当該分画の濃度を決定し、次いで、分画の体積に対して当該濃度を乗じた。
簡単に説明すると、12個のIPGストリップを使用して、4.2mgのVEGF-Trap RSを、32時間、分画した;同じpI範囲に対応する各ストリップに由来する個々の分画をプールし、そして、透析の後に定量した。分別で十分な回収率を示した合計で7つの分画(分画4~10)を、IEF及びiCIEFを使用して分析した。これらの分画を、2つの方法で分析した:IEF及びiCIEFアッセイ法を用いた、OFFGEL分画(4~10)の個別分析(図4を参照されたい)、及びOFFGEL分画(5~10)のVEGF-Trap RSへのスパイクと、それに続く、IEF及びiCIEFを用いたスパイクした試料の分析(図5)である。表3に、OFFGEL分別試験で回収した分画と、それに対応する量を示す。
IEF及びiCIEFを使用してOFFGEL分画を個別に分析することに加えて、より高い回収率を示す分画(5~10)を、1:0.1の比率(VEGF-Trap RS:分画)でスパイクし、そして、2つの電荷変異体分析法で分析した。図5は、iCIEF(上部パネル)及びIEF(下部パネル)アッセイ法を使用して分析した、VEGF-Trap OFFGEL分画(5~10)でスパイクしたVEGF-Trap RSの電気泳動図のパネルを例示している。RSにスパイクしたOFFGEL分画の各々について、対応するコントロールRS(スパイクなし)は、IEF及びiCIEFアッセイ法と重なる。スパイク及び非スパイク(RS+OFFGEL、及び、RS)試料の重ね合わせは、IEFアッセイ法とiCIEFアッセイ法と間のピークのパターンの相関関係を視覚化させ、そして、理解させる上で役立つ。各パネルでは、酸性分画(図5A)から塩基性分画(図5F)に向かう矢印を使用して、スパイクした分画に対応する電荷種の増強を強調表示している。
ゲルをベースとしたIEFバンドパターンと、毛細管をベースとしたiCIEFピークパターンとの間の相関関係は、OFFGEL分画の分析から明らかであった。図4及び5(スパイクした分画を含む個々の分画分析)から、承認済のIEFゲル法で達成した電荷アイソフォーム分離が、VEGF-Trapに関する毛細管をベースとしたiCIEF方法を使用して得たピークのパターンに匹敵し、また、類似していると推測することができる。
iCIEF法を使用した電荷変異体の分布の報告。VEGF-Trap電荷変異体の分布に関して、承認済のIEF方法は、IEFゲルのバンド3~9をグループ分けすることで、電荷分散率を報告する。ミオグロビンのpIに基づいてバンド番号を識別するガイドとして、例えば、ミオグロビン(独立したタンパク質マーカー)を使用して、バンド3~9の面積パーセンテージを合計して報告する。IEF方法での現在の仕様許容基準(SPEC)は、82%(バンド3~9)である。
同様の手順を、ProteinSimple、pI 7.05 Marker Cat# 102226の独立したマーカーを、iCIEFマスターミックス(2M尿素、0.35%メチルセルロース、3%3~10両性電解質)にスパイクしている新規のiCIEFアッセイ法に適合させた。マスターミックスにスパイクしたマーカー7.05のiCIEF電気泳動図を図6(トップパネル)に示しており、pI 5.12とpI 9.50とを兼ね備えたマーカーを含むマスターミックスを、較正のために使用する。図5の下部パネルは、スパイクした7.05マーカーを含むブランクで重ね合わせたVEGF-Trap RSのiCIEF電気泳動図であり、これは、VEGF-Trap iCIEF試料プロファイルでのピーク5を識別するために使用する。マーカーピーク7.05は、ピーク4と5の間のpIで移動し、これは、VEGF-Trapの主要なアイソフォームのクラスター(ピーク5、6、7)での主要なピーク6を識別する上で役立つ。
IEF方法のようにピーク3~9を報告するのではなく、(一部の実施形態での)当該iCIEF方法では、領域1(酸性)、領域2(中性)、及び、領域3(塩基性)としてグループ分けした電荷変異体アイソフォームのパーセンテージに関して、VEGF-Trap試料の電荷不均一性を報告する。当該VEGF-Trap iCIEF電気泳動図での3つの主要なピーク(ピーク番号5、6、7)のクラスターは、中性pI範囲の周辺を移動し、かつ最も顕著なアイソフォームであり、領域2(中性)としてグループ分けされる。3つのピークのクラスターの内で、特定のpIに向けて移動する主要ピーク5に対応する明確なアイソフォームを、図7に示したような、ブランク注入においてスパイクした独立したpI 7.05マーカーを使用して識別する。当該VEGF-Trap iCIEF試料での領域1(酸性)を、当該VEGF-Trap電気泳動図での3つの主要なピーク(ピーク5、6、及び、7)のクラスターと比較して比較的酸性であるピークのグループとして報告する。当該VEGF-Trap iCIEF試料での領域3(塩基性)を、当該VEGF-Trap電気泳動図での3つの主要なピーク(ピーク5、6、及び、7)のクラスターと比較して比較的塩基性であるピークのグループとして報告する。
領域1、2、及び、3を使用する報告手法では、従来のIEFゲルをベースとした方法でバンド3~9をグループ分けすることとは対照的に、3つの領域(領域1、2、及び、3)をモニターすることで、当該電荷変異体アイソフォームを、さらに厳密に制御できるという利点がある。図7Bは、IEF報告と、本開示のiCIEF法の実施形態での報告との間の差異を例示する。さらに、領域1、2、及び、3に関する報告は、iCIEFアッセイ法に対して、従来の手法よりも遙かに迅速に電荷変異体アイソフォームの変化に対する感度に関して独特の利点を与える。これにより、当該iCIEFアッセイを、その読み出しにおける感度が高く、かつ、従前のIEFアッセイ手順よりも良好な安定性を示すアッセイにする。以下の表4は、IEFアッセイの従来の3~9報告とは対照的に、iCIEFアッセイ法に適合した新規のグループ分け手法の能力を示す安定性の例である。加速VEGF-Trap安定試料を、報告のあった2つの手法-当該IEFアッセイ法と同様の領域グループ分けとピーク3~9による新規のiCIEFアッセイとを使用して分析を行い、そして、当該IEFアッセイ法の履歴結果と比較した。
表4(下記)では、領域1、2、3のグループ分け手法の感度が非常に高く、かつ、VEGF-Trap試料の電荷変異体分布の変化を示すことが認められる。当該IEF方法は、バンド3~9で2%の減少を示す全体的な電荷分布の変化を示しており、そして、この変化は、3~9ピーク手法を使用してグループ分けした場合の当該iCIEFアッセイ方法の結果と同等であった。しかしながら、表4から明らかなように、VEGF-Trapの25℃加速ストレス試料では、当該iCIEFアッセイを使用して、領域1(または、酸性変異体)の5%の増加と、領域3(塩基性変異体)の約5%の減少が同時に認められた。当該iCIEFアッセイにおけるVEGF-Trap電荷分布で認められたこの傾向は、そのシアル化の程度に起因する電荷パターンの構造と複雑さに基づいて、当該VEGF-Trap試料に生じる変化の性質を正確に反映している。加速熱ストレス下での当該iCIEFアッセイ法を使用したVEGF-Trap試料の酸性変異体(領域1-高度のシアル化種)の増加は、凝集を伴う脱アミド化の可能性を反映している。一方で、当該IEF方法による従来の3~9バンドを使用したグループ分けは、当該VEGF-Trap電荷アイソフォームで発生する微妙な変化を覆い隠してしまい、そして、異なる電荷種を制御する余地をほとんど残さないので、VEGF-Trap試料の電荷不均一性の微妙な変化を検出する方法ほどの感度を示さない。
VEGF-Trapには、10個のグリコシル化部位がある。これらの部位に付着したグリカン鎖は分岐しており、そして、各分岐は、負に帯電した糖モノマーであるシアル酸を終端とし得る、または、し得ない。当該グリカン鎖の末端にあるシアル酸基の存在の自然変異は、正味電荷の範囲を有するVEGF-Trap電荷変異体の集合体をもたらす。これらのバンドの割合は、存在する荷電種の量によって異なる。したがって、領域1(顕著なシアル化)、2(中程度のシアル化)、3(ほとんどシアル化されていない)に基づいて様々な電荷種をグループ分けする新規の報告手法は、VEGF-Trap試料のシアル型で発生する変化に対するiCIEFアッセイの応答性を向上させる。
iCIEFアッセイ法の安定性を示す能力。VEGF-Trap DP試料のリアルタイム安定性試料(2~8℃で保持)を、24か月の期間に及ぶ7つの独立した時点を使用して分析した;表5(下記)は、この研究に対応するデータを示す。これらのVEGF-Trap試料の履歴IEFデータを参照用に提供し、そして、領域グループ分け、及び、3~9ピーク報告でのVEGF-Trap iCIEFデータと比較した。履歴IEFデータに基づいて、当該VEGF-Trap試料では、2~8℃のリアルタイム保存条件では、有意な変化は、ほとんど、または、全く認められなかったが、iCIEF3~9ピーク手法を使用して報告すると、同様の傾向が認められた。
図8は、iCIEFを使用して、24か月間にわたるVEGF-Trapの%領域1、2、及び、3の線型フィットを示す。領域3が減少するに伴い、領域1がわずかながらも着実に増加していることが、プロットから明らかである。
強制的に分解したVEGF-Trap DS試料を使用したさらなる分析を、新たなiCIEFアッセイ法を使用して行った。この研究では、45℃で、15日間にわたって希釈を行い、かつ、ストレスを負荷した熱分解VEGF DS試料を、0、3、9、及び、15日の時点で、iCIEF法(領域的、及び、3~9)を使用して分析した。表6(下記)から明らかなように、強制的に分解したVEGF-Trap試料に関して、なおも早い時点で報告をした3~9ピークと比較して、領域手法を使用してグループ分けをすると、iCIEFアッセイ法では、酸性電荷変異体(領域1)のわずかな増加が認められる。%3~9報告は、当該3~9ピーク全体の電荷分布全体で2%の変化を示したが、同じ条件下での領域1は、7%の増加を示し、そして、領域3では、同時に時間とともに8%の減少を示した。図9は、iCIEFアッセイ法を使用して強制的に分解したVEGF-Trap試料の電気泳動図を示し;酸性種の増加は、プロファイルから明らかである。
VEGF-Trapストレス試料の3つの領域の%分布の統計分析を、当該VEGF非ストレス試料の各々のピークパーセンテージと比較して行った。図10A~10Cは、iCIEFデータに関して、熱ストレスを受けたVEGF-Trap試料の統計分析を示す。統計的に有意な変化が、領域1及び3のそれぞれで認められた。
iCIEFアッセイ法での特徴決定と最適化データに基づいて、アッセイパラメーターを導き出し、そして、表7(下記)にまとめてある。これらの方法条件を、直線性、正確性、精度、及び、中間精度について評価した。
iCIEFアッセイ法の適格性。iCIEFアッセイ法の直線性。方法の直線性を、1名の分析官が評価した。0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、及び、2.0mg/mLの様々なタンパク質濃度で、VEGF-Trap参照標準を使用して、試料溶液を調製した。この実験では、当該試料マトリックスでのタンパク質濃度を、0.5~2mg/mLに変化させ、そして、その他のマトリックス成分を、3%両性電解質3~10、及び、0.35%メチルセルロースで一定に保った。焦点調節時間も、1+7分で一定に保った。表8に、0.5~2.0mg/mLの線型範囲にわたって、VEGF-Trap試料の領域1、2、及び、3のパーセンテージ分布をまとめてある。当該VEGF-Trap試料の面積計測値の関数として、濃度の直線性プロットを、図11に示す。
当該アッセイは、回帰分析に基づいて、R2>0.99で、0.5mg/mL~2.0mg/mLのタンパク質濃度範囲で、許容可能な直線性を実証した。加えて、アイソフォーム分布は、この同じ濃度範囲で一貫していた。このことは、当該アッセイが、0.5~2.0mg/mLのタンパク質濃度範囲にあっては、ピーク面積とアイソフォーム分布の両方で一貫した結果を提供できることを示す。
iCIEFアッセイ法の正確性。方法の正確性を、当該直線性データを使用して、1.0mg/mLの公称濃度と比較することで、希釈比例に基づいて評価した。直線性データに基づいた希釈回収率を、以下の表9に示す。回収率を、=(測定面積率/公称面積率)×100%を使用して、計算した。
当該VEGF-Trap試料について、タンパク質濃度0.5~2.0mg/mLの範囲の希釈比例に基づいた回収率は、3つの領域で、98%~101%以内であった。
iCIEF方法の中間精度分析。中間精度は、2名の分析官(A、B)が、それぞれの試薬製剤を使用して、またVEGF-Trap RS試料について、4日間にわたって、2つのiCE3電荷変異体分析機器を使用して評価した。分析の結果を、以下の表10に示す。
提案されたVEGF-Trap iCIEF試験方法は、異なる試薬製剤を使用して、異なる分析官が実施した場合に、許容可能な精度を実証した。全体の%RSDを計算したところ、3つのすべての領域で、2%のRSD以内であった。
機械で調製した溶液の安定性。試料マトリックスにおいて参照標準の試料を調製し、そして、iCIEFを使用して試料を分析して、溶液の安定性を評価した。当該試料を、3%の両性電解質3~10、0.35%メチルセルロース、及び、2M尿素からなるマトリックスにおいて、10℃で分析した後に、iCE3機器に保存した。当該試料を、約24時間後に、再び分析した。各分析でのアイソフォーム分布を、以下の表12に示す。
T=0で分析した試料と、T=24時間で再度分析した試料との間の絶対差を、各時点で認められた範囲(最大、及び、最小)に基づいて計算した。3つの領域に関する絶対差は、0.5%以下であった。このことは、iCE3電荷変異体分析器で、10℃で保存すると、当該試料が、当該マトリックス内で最長で24時間は安定であることを示している。
両性電解質(3~10)の試料の評価。ある供給源に由来する3~10両性電解質の幾つかの試料を分析した。異なる試料を使用して分析した当該VEGF-Trap試料の全体的な電荷変異体プロファイルは同等であった。一部の両性電解質試料の領域1では、ピークパターンに関する電気泳動図プロファイルにわずかな差異が認められたが、パーセンテージの分布は類似しており、かつ、アッセイのばらつきの範囲内であった。両性電解質の3つの試料の代表的な電気泳動図を図12に示す。
新規のiCIEFアッセイ法を使用した、従来のVEGF-Trap放出試料(DS、FDS、及び、DSI)の分析
iCIEFアッセイ法のロバスト性をさらに確立するために、2つの両性電解質の試料を使用するiCIEFを使用して、系統が関連しない合計で37個のユニークな従来のVEGF-Trap試料を分析した。この分析では、15個のVEGF-Trap DSI(原薬中間体、水性緩衝液、pH6.2、5mMリン酸ナトリウム、5mMクエン酸ナトリウム、及び、100mM塩化ナトリウムを含む)、10個のVEGF-Trap DS試料(原薬SPEC C701、水性緩衝液、pH6.2、10mMリン酸ナトリウムを含む)、及び、12個のVEGF-Trap FDS試料(製剤原薬、SPEC C713、水性緩衝液、pH6.2、10mMリン酸ナトリウム、40mM塩化ナトリウム、0.03%(w/v)ポリソルベート20、及び、5%(w/v)スクロース)を用いた。これらのVEGF-Trap試料を、当該iCIEFアッセイ法を使用して分析した。
両性電解質とは、電界の影響下でのpH勾配の確立に役立つ3~10の間に等電点のスペクトルを有する両性化合物の異なる同族体の混合物である。当該iCIEFアッセイ法で使用する両性電解質3~10は、とある供給源から購入しており、これは、一般的には、数回に分けて製造されている。供給業者の推奨事項と、iCIEFアッセイでのその他のタンパク質に関する実用的な知識に基づいて、異なる試料の間でのわずかな変化が認められており、これは回避できない。したがって、異なる両性電解質試料の全体について、新規のiCIEFアッセイのロバスト性を確立するために、両性電解質の2つの試料を分析した。DS、DSI、及び、FDS産物段階でのVEGF試料を、提案された領域(R1、R2、及び、R3)をグループ分けする手法を使用して、また当該IEFアッセイ法と同様に、3~9ピークのグループ分けに基づいて分析した。図13A~13Cは、VEGF-Trap DS、DSI、及び、FDS試料の%領域1、2、及び、3、ならびに、ピーク3~9の関数として、両性電解質試料の統計分析を示す。37個のVEGF-Trap試料に対応するデータを、両性電解質試料の1つに関して、表13に示す。表14~16に、37個の試料の完全なデータセットを示す。
領域1、2、及び、3、ならびに、3~9のグループ化手法に関する両性電解質の試料について収集したデータに基づいて、マッチドペア分析(図13D)を行った。マッチドペア分析のデータを使用して、2つの両性電解質の平均を比較し、そして、両性電解質試料の本質的な差異に起因して認められ得るアッセイの報告での差異を評価した。このデータに基づいて、3つの領域R1、R2、及び、R3の試料の間で認められた最大平均差は、領域の観点から報告した場合では、0.1%未満であると推測することができる。加えて、p-値に基づいて、当該領域手法を使用すると2つの両性電解質試料の間で領域1、2、及び、3での%分布は、統計的に有意でないと結論付けできる。
しかしながら、DS、DSI、及び、FDS試料のVEGF-Trapデータセットを、IEFアッセイ法と同様の3~9ピークグループ分け手法を使用して分析すると、一部の両性電解質試料の間で統計的な有意差が認められる。例えば、一部の試料間では、iCIEFアッセイ法のピーク3~9に関して報告した平均差は4.8%である。図13A~13Dは、異なる両性電解質試料を使用して得たiCIEFプロファイルを示しており、そして、画像から、両性電解質試料の間で認められる変化は酸性領域に限定されており、また、領域1、2、3をグループ化することで、変化が覆い隠されていることは明らかである。これにより、当該iCIEFアッセイについて報告する領域的手法を、ロバストかつ再現可能な手法にする。
%領域1、2、及び、3のグループ分けに基づいて、両性電解質試料を使用して、DSI、DS、及び、FDS試料分析から得たデータは、当該iCIEFアッセイを、よりロバストなアッセイ方法にする。
したがって、本開示で提示する当該iCIEFシステム、方法、及び、機器は、VEGF-Trap原薬、原薬中間体、製剤原薬、及び、製剤の電荷変異体プロファイルを定量する。そのような実施形態は、VEGF-Trapの電荷不均一性分析のための承認済のゲルをベースとしたIEF法と置換する上で役立ち得る。
OFFGEL 3100分留装置を使用して分画した当該VEGF-Trap電荷変異体は、毛細管をベースとしたiCIEFアッセイ法で得たピークと、ゲルをベースとしたIEFアッセイ手順で分離したバンドとの相関の実証を可能にした。OFFEGELで電気泳動したVEGF-Trap分画を個別に分析し、そして、研究におけるスパイクを通じて、個々のiCIEFピークと、VEGF-Trap電荷変異体のIEFバンドとを直接に比較できるようにした。この研究は、新規のiCIEFアッセイ手順が、ゲルをベースとしたIEF方法を使用して、以前に解像したすべての電荷変異体アイソフォームを、同等かつより正確な方法で解像できることを確認した。
したがって、本明細書で開示した領域1、2、及び、3のパーセンテージ分布に基づいた、この報告手法の一部の実施形態は、すべてのVEGF-Trapアイソフォームの制御を可能にし、また、アッセイをさらに高感度なものとし、ロバストな安定性を示すアッセイとする。
本明細書では、当該iCEF方法で使用する毛細管チューブについても説明する。一般的に、当該iCIEF毛細管チューブは、VEGF-Trapの電荷変異体分析での使用のために構成しており、そして、タンパク質を取り込むように構成され、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の毛細管チューブを具備している。当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングをも含み得る。
一部の実施形態では、VEGF-Trapの電荷変異体分析での使用のために構成したiCIEFキットを提供しており、そして、当該iCIEFキットは、タンパク質を取り込むように構成され、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の1つ以上の毛細管チューブを具備しており、当該毛細管チューブは、フルオロカーボンコーティングを含む。
様々な発明の実施形態を本明細書で説明及び例示してきたが、当業者であれば、本明細書に記載した機能を実行すること、及び/または、結果、及び/または、1つ以上の利点を獲得するための様々なその他の手段、及び/または構造を容易に想到するものであり、そして、そのような変更、及び/または、改変の各々は、本明細書に記載した本発明の実施形態の範囲内とみなす。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載したすべてのパラメーター、量、パーセンテージ、濃度、寸法、材料、及び、構成が、例示的なものであり、そして、実際のパラメーター、量、パーセンテージ、濃度、寸法、材料、及び/または、構成が、本発明の教示が使用される特定の用途(複数可)によって決定されることを容易に理解する。当業者であれば、日常的な実験だけを行って、本明細書に記載した特定の発明の実施形態の数多くの均等物を認識し、または、確認することができる。したがって、上記した実施形態は、例示のみを目的として提示したものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の実施形態は、具体的に説明及び特許請求した以外の方法で実施し得る。本明細書に開示した発明の実施形態は、本明細書に記載した個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び、方法も含む。加えて、2つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び、方法のあらゆる組み合わせも(それらが、相互に矛盾しないのであれば)発明となる。一部の実施形態は、1つ以上の特徴/要素/機能性を明確に欠いている点で従来技術と区別し得る(すなわち、そのような実施形態に関する請求項は、負の制限を含み得る)。
加えて、上記したように、様々な発明概念を、1つ以上の方法として具体化し得る。当該方法の一部として実行する行為は、あらゆる適切な方法で順序を定め得る。したがって、例示的な実施形態では連続的な行為として示しているが、実施形態は、幾つかの行為を、同時に実行することを含め、例示したものとは異なる順序で実行する構成とし得る。
本出願のあらゆる箇所で示した刊行物またはその他の文書に対する、あらゆる、及び、すべての言及は、それらの全内容を参照により本明細書に援用する。さらに、本明細書で定義、及び、使用したすべての定義は、辞書の定義、参照により援用される文書での定義、及び/または、定義された用語の通常の意味よりも優先されることを理解すべきである。
Claims (23)
- 血管内皮成長因子VEGF-Trapの電荷変異体を分析する方法であって:
少なくとも両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を含む分離用毛細管にタンパク質試料を取り込ませることと;
第1の所定の時間、第1の電圧を印加することであって、前記両性電解質担体に、前記毛細管内でpH勾配を形成させる、前記第1の電圧を印加することと;
第2の所定の時間、第2の電圧を印加することであって、前記毛細管内での前記タンパク質の電荷変異体の移動に焦点を合わせて、前記変異体の全体的な電荷を中性にする、前記第2の電圧を印加することと;
前記タンパク質の電荷変異体を検出及び定量することと、を含む、前記方法。 - 電荷変異体の検出及び定量が:
複数の電荷変異体アイソフォームの吸光度を測定することと;
前記複数の電荷変異体アイソフォームを、少なくとも第1の酸/酸性領域(R1)、第2の中性領域(R2)、及び、第3の塩基/塩基性領域(R3)を含む、単離した領域に分離することと;
領域R1、R2、及び、R3のそれぞれに含まれる電荷変異体アイソフォームのパーセンテージを決定することと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 電荷変異体の検出及び定量の双方を行う、請求項1に記載の方法。
- 電荷変異体を、約280nmの波長で検出する、請求項1に記載の方法。
- 前記毛細管チューブに取り込ませたタンパク質の濃度が、約2.0mg/mlである、請求項1に記載の方法。
- 安定化添加剤が、尿素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記混合物での尿素の量は、約2Mを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記混合物が、約0.35%のメチルセルロースを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の電圧が、1500Vを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の所定の時間が、約1分である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の電圧が、3000Vを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の所定の時間が、約7分である、請求項1に記載の方法。
- 前記毛細管チューブに取り込ませたタンパク質の濃度が、約1.0~8.0mg/ml、または、その間のあらゆる範囲である、請求項1記載の方法。
- 前記混合物での尿素の量が、0Mより大きく、かつ、約8Mより小さく、または、その間のあらゆる範囲である、請求項6に記載の方法。
- 前記混合物が、約0.01%~約0.35%、または、その間のあらゆる範囲のメチルセルロースを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の電圧は、約1V~約3000Vの間、または、その間のあらゆる範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の所定の時間は、約1秒~約5分の間、または、その間のあらゆる範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の電圧は、約1V~約6000Vの間、または、その間のあらゆる範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の所定の時間は、約1分~約14分、または、その間のあらゆる範囲である、請求項1に記載の方法。
- VEGF-Trapの電荷変異体分析での使用のために構成したiCIEF毛細管チューブであって:
タンパク質を取り込めるように構成しており、かつ、両性電解質担体、メチルセルロース、及び、安定化添加剤の混合物を有する構成の毛細管チューブを含み、
前記毛細管チューブが、フルオロカーボンコーティングを含む、前記iCIEF毛細管。 - 前記毛細管の構成要素が、請求項2~19のいずれか1つ以上と適合する、請求項20に記載の毛細管チューブ。
- 請求項19~20のいずれかに記載の1つ以上の毛細管チューブを含む、VEGF-Trapの電荷変異体分析での使用のために構成したiCIEFキット。
- 請求項1~19のいずれかに記載の方法を行うためのシステム。
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