KR100958165B1 - 비젤방식의 2차원 단백질분리용 다중채널장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비젤방식의 2차원 단백질분리용 다중채널장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질 시료를 pI 별로 1차 분리하는 등전집중부 및 1차로 분리된 단백질을 2차로 분자량별로 분리하는 흐름장흐름분획부를 함유하는 평판형 채널이 하나 이상 병렬구로 연결되어, 다중채널에서 단백질의 동시 분리가 가능하고, 단백질 분리속도가 향상되며, 채널부피 증가로 인한 시료 주입의 한계를 극복할 수 있는 비젤방식의 2차원 단백질분리용 다중채널장치에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 단백질을 pI와 분자량의 크기 순서에 따라 분리할 수 있으며, 단백질 분리공정에 따른 단백질의 변성이 일어나지 않으며, 등전점 분리에 사용되는 양쪽성 전해질의 자동제거가 가능하며, 분리된 단백질을 별도로 검출하여 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법을 적용함으로써 단백질 식별이 가능하다.

단백질 분리, 등전집중, 흐름장-흐름분획, 다중채널 분리

Description

비젤방식의 2차원 단백질분리용 다중채널장치{Non-gel based 2-dimensional protein separation multichannel devices}

본 발명은 비젤방식의 2차원 단백질분리용 다중채널장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질 시료를 pI 별로 1차 분리하는 등전집중부 및 1차로 분리된 단백질을 2차로 분자량별로 분리하는 흐름장흐름분획부를 함유하는 평판형 채널이 하나 이상 병렬구조로 연결되어, 다중채널에서 단백질의 동시 분리가 가능하고, 단백질 분리속도가 향상되며, 채널부피 증가로 인한 시료 주입의 한계를 극복할 수 있는 비젤방식의 2차원 단백질분리용 다중채널장치에 관한 것이다.

생명과학 및 의약 분야에서 질병치료 및 예방과 관련하여 질병관련 단백질에 대한 체계적인 분석이 요구되고 있다. 특히, 분자 생물학 및 게노믹스(게놈 과학)를 포함하여 약물 발견을 위한 기초연구의 발전으로 인하여, 최근 약물 발견의 영역이 급속하게 변화하고 있고, 지노믹(genomic) 약물 발견으로 대표되는 약물 발견을 위한 신규 방법이 개발되고 있다.

이에, 생명과학 및 신규 의약품 개발 등의 의약 분야에서는 특정 질환 또는 특정 환경에서 생리학적 활성을 갖는 물질을 확인하여야 하는바, 이러한 생물학적 활성을 갖는 물질들은 대부분 단백질로 이루어져 있고, 이러한 단백질의 구조 및 기능의 해명은 상기 생명과학 및 의약 분야에서 본질적인 문제에 해당된다. 특히, 인간 유전자의 종류는 대략 35,000 정도로 확인되었으나, 게놈(genome)들이 생산하는 단백질의 숫자는 수십만 내지 수백만에 이르는 것으로 추정되고 있고, 세포기관 내에서 필요한 모든 반응을 수행하는 것이 단백질의 역할이기 때문에 유전자의 기능을 단백질 수준에서 체계적으로 연구하는 것이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 단백질은 분자량, 등전점(isoelectric point, pI), 친수성 또는 소수성 기질 등 다양한 특성으로 인하여 매우 복잡하므로 단백질을 분석하기 위해서는 일차적으로 단백질을 분리한 뒤 이를 질량분석법과 생물정보학 등과 연계시켜 단백질을 식별하는 과정이 필요하고, 이러한 과정에서 질병과 관련된 단백질의 경우 다른 일반적인 단백질에 비하여 상대적 존재비가 낮은 단백질들이므로 고성능의 단백질 분리기술을 통해 이를 분석하는 것이 필요하게 된다. 특히, 단백질은 생명 현상에 매우 중요하고, 단백질 분자, DNA 분자, 합성 화합물 또는 광자 등이 포함되는 다른 분자와의 상호작용에서 이의 기능을 나타내므로, 특정 단백질을 이해하기 위해서는 이러한 분자의 물리적 및/또는 화학적 성질을 단지 상술하는 것에 그치지 않고, 서로 영향을 미치는 분자를 동정하고 상호작용(생리학적 작용) 현상의 양식을 해명함으로써 어떠한 상호작용이 어떠한 분자와 함께 발생하는가를 확인하는 것을 포함한다.

단백질을 분리 및 분석하는 대표적인 방법으로서 소듐도데실설페이트-폴리아크릴아미드-젤-전기영동(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)법이 있는바, 이는 폴리아크릴아미드-젤 판에 전기장을 걸어주어 선택성의 차이로 단백질을 분리하는 방법이다. 이러한 방법은 단백질을 분자량 순서로 분리하여 확인하는 분야와 단순한 단백질의 분리 및 확인 과정에 널리 사용되는 일차원 분리방법으로서, 단백질이 SDS 용액상태에서 3차 구조가 변성되거나 단백질이 젤 내부에 갇히게 되는 문제점이 있다.

한편, 게놈에 의하여 생성되는 단백질을 총칭하여 단백질 집합체(단백체, proteome)로 정의되고 세포내에서의 위치, 또는 세포나 조직의 생리적인 상태에 따라 단백질의 생성 및 상대적 존재비 등이 결정되는 프로테옴(proteome)과 같은 많은 숫자의 단백질 혼합물을 분리하고 그 특성을 동정하는 경우에는 상기에서 설명한 일차원 분리기술만으로는 식별자체가 불가능하다. 따라서 상기 단백질 집합체를 분리하기 위해서는 단백질의 특성에 따라 1차로 분리된 단백질을 분자량의 차이에 따라 2차로 분리하는 2차원 분리방법인 2차원-폴리아크릴아미드-젤 전기영동법(2D-PAGE)이 사용된다[Zhou, F. et al . Anal . Chem. 2004, 76, 2734-2740; Klose, J. et al. Electrophoresis , 1995, 16, 1034-1059; Righetti, P. G.l et al. Prefractionation Techniques in Proteome Analysis, Anal . Chem. 2001, 73, 320-326]. 이와 같은 2D-PAGE는 양쪽성 전해질(ampholyte) 담체로 pH구배가 고정 형성되어 있는 좁은 젤-스트립(gel strip)에서 단백질을 등전전하(pI)에 따라 등전집중(isolectric focusing, IEF)시키며, 이 단계는 대략 12시간 이상 소요된다. 다음 으로, 상기 단백질들이 pI 순서에 따라 분리된 다음 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 젤 판 상단 가로방향으로 젤-스트립을 고정시킨 후 세로 방향으로 전기영동을 수행하게 되면 단백질들은 분자량 크기 순서에 따라 세로방향으로 분리되는데, 이때 단백질 분자량이 작은 것이 젤 판 하단으로 많이 이동하게 된다. 2D-PAGE 분리에 소요되는 총 시간은 대략 36시간 정도이다. 다음으로, 2차원 분리가 끝나면 젤 판 위에 나타난 단백질 스팟(spot)들을 염색하여 단백질들의 수를 확인하고, 필요에 따라 각 스팟의 단백질을 회수하여 효소분해처리한 뒤 질량분석법을 이용하여 단백질을 식별한다.

이러한 2D-PAGE 방법은 단백질들의 대략적인 패턴(pattern)을 확인하는데 높은 해상도를 지니고 있어 매우 유용하며 준-회수(semi-preparative) 규모로의 분리가 가능하여 매우 복잡한 단백질 혼합물형태를 지닌 인간 혈장 단백질은 물론이고 소변, 각종 생체조직 등에서 추출한 단백질들의 분석, 임상적으로 질병의 검출 및 진단을 위해 사용될 수 있다[(Giddings, J. C., Unified Separation Science, John Wiley & Sons, New York 1991, pp. 126-128.].

그러나, 상기 2D-PAGE는 노동 집약적 방법이고 자동화하기 어려울 뿐만 아니라, 검출 감도 및 역동적인 범위에 있어서의 제한으로 인한 문제점 등이 있으며, 단백질 분리 시 SDS 용액을 사용하므로 분리를 위한 단백질을 변성되지 않는 상태로 분리하기 곤란하여 단백질이 변성된 상태에서 분리가 이루어지며, 분리된 단백질들 또한 젤 매트릭스 내에 갇혀 있게 되어 시료의 회수가 용이하지 않아 대개 젤 내에서 단백질을 효소분해처리한 뒤 펩타이드 형태로 회수한 후 분석하여야 하는 등의 문제점 등이 있다.

한편, 모세관내에서 등전집중을 수행하는 모세관등전집중(capillary isoelectric focusing, CIEF) 방법은 실리카 모세관내에 양쪽성 전해질 담체를 단백질과 함께 채운 뒤 전기장을 걸어 단백질의 pI에 따라 분리하는 방법이다[Conti, M. et al . Electrophoresis 1996, 17, 1485-1491]. 여기서, 상기 등전집중의 원리는 2D-PAGE의 등전집중(IEF)과 동일하지만 젤-스트립에서 이루어지는 것이 아니라, 실리카 모세관내에서 이루어지는 점에서 차이를 보이고 있으며, 상기 모세관등전집중은 모세관내에서 분리가 이루어지기 때문에 적은 양의 단백질 시료를 처리할 수 있고, 높은 감도를 갖는 경우에는 pI 값이 0.003의 작은 차이를 갖는 단백질의 분리도 가능하다[Quigley, W.C. et al . J. Anal . Chem. 2000, 76, 4645-4658]. 또한, 상기 모세관등전집중은 모세관내에서 분리가 이루어지기 때문에 적은 양의 단백질 시료를 처리할 수 있고, 높은 감도를 갖는 반면 프로테옴과 같은 복잡한 단백질 혼합물을 처리하기에는 분리능력에 한계가 있어 분리 효율을 증대시키기 위하여 단일 분석기술로 이용되기보다는 크로마토그래피와 같은 2차 분리방법과 온라인 연결하여 사용하려는 노력이 최근 시도되고 있다.

상기 모세관등전집중과 온라인으로 연결하여 2차원 분리를 수행하는 기술로서 대표적인 일례는 모세관등전집중을 모세관 역상액체 크로마토그래피(reversed phase liquid chromatography, RPLC)와 온라인 연결한 모세관등전집중-역상액체 크로마토그래피(CIEF-RPLC) 법으로서, 이는 모세관등전집중에서 pI 영역별로 분리된 단백질 또는 펩타이드 밴드를 크로마토그래피 칼럼에서 펩타이드의 소수성 차이에 따라 2차로 분리하는 방법이다[Chen, J. et al . Electrophoresis 2002, 23, 3143-3148]. 이러한 방법을 이용할 경우, 초파리 단백체를 가수분해한 뒤 얻어진 펩타이드 혼합물에 대하여 실험한 결과 8시간 정도의 분리 작업을 통하여 피크 용량 1800개 이상의 효율을 얻을 수 있다.

또한, 모세관등전집중과 모세관젤전기영동법(capillary gel electrophoresis, CGE)을 온라인으로 연결하는 모세관등전집중-모세관젤전기영동(CIEF-CGE)법은 전술한 폴리아크릴아미드 젤 판 대신 폴리아크릴아미드젤이 채워진 모세관 내에서 단백질 분자량 순서에 의한 분리를 수행할 수 있으며 헤모글로빈 등 간단한 단백질의 분리에 시도되었다[Yang, C.l et al . Anal . Chem. 2003, 75, 215-218]. 상기 모세관등전집중-역상액체크로마토그래피법은 단백질 차원에서의 분리보다는 단백질 효소로 가수분해한 뒤 얻은 펩타이드의 혼합물을 분리할 경우에 유용하다. 그러나, 단백질이 크로마토그래피 칼럼을 통과할 때 유발되는 단백질 사슬의 파괴, 칼럼내에서의 단백질 손실 등으로 인하여 단백질에 대한 적용이 곤란하다. 모세관등전집중-역상액체크로마토그래피를 질량분석기에 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI) 방법으로 온라인 연결하는 것은 가능하나[Tnag, Q. et al . Anal . Chem. 1996, 68, 2482-2487; Yang, L. et al . Anal . Chem. 1998, 70, 3235-3241; Martinovi, S. et al . Anal . Chem. 2000, 72, 5356-5360], 모세관등전집중 분리에 사용되는 양쪽성 전해질이 제거되지 않아 분리가 종료된 후 양쪽성 전해질을 제거하기 위해 별도의 정제과정을 거쳐야 한다. 그러므로 상기 방법은 양쪽성 전해질의 제거가 선행되지 않으면 용액 속의 이온들의 방해로 인해 시료분 석이 곤란하게 되는바, 이를 해결하기 위해 마이크로 투석 가능한 음극셀 등의 멤브레인을 이용하여 양쪽성 전해질을 상당량 제거하여야 한다[Zhou, F. et al . Anal . Chem. 2004, 76, 2734-2740]. 그러나 전술한 방법을 이용하여 단백질을 분리한다 하여도 역상액체크로마토그래피 분리 시 유기용매가 사용되므로 단백질의 변성을 피할 수 없고, 분자량이 큰 단백질을 분리하는데 적용할 수 없는 문제점이 있다.

한편, 단백질을 분자량 순서에 따라 분리하는 방법으로는 흐름장-흐름분획(flow field flow fractionation, FlFFF)법이 있는데, 이는 장-흐름분획(field flow fractionation, FFF)법의 하나로서 단백질, 세포, 수용성 고분자 및 나노입자들의 크기별 분리와 확산계수, 입자크기, 분자량 등의 특성분석에 이용되는 분리분석법이다[J. C. Giddings, et al . Science 1976, 193, 1244; M. H. Moon, et al . Anal. Chem. 1999, 71(14), 2657]. 상기 장-흐름분획법에 따른 분리에 있어서, 사용하는 채널은 단면이 직육면체이며 속이 비어있는 채널로서 정지상이 채워져 있지 않고 시료의 분리는 채널축을 따라 시료들을 이동시키는 유체의 흐름방향에 수직방향으로 걸어주는 외부장의 세기에 따라 분리가 이루어지므로, 상기 흐름장-흐름분획 분리법은 외부장으로서 유체의 교차흐름을 이용하며, 상기 교차흐름의 속도를 조절하여 단백질 등의 거대분자들의 체류를 제어한다.

상기 흐름장-흐름분획 채널내에서 시료의 체류는 채널바닥을 빠져나가는 교차흐름의 속도와 시료가 갖는 브라운 확산운동의 균형에 의하여 이루어지며 시료들이 채널내에서 이동하는 평균높이는 단백질의 경우 분자량 또는 스톡스(Stoke's) 직경에 따라 달라지는 브라운확산 정도에 의해 결정된다. 그러므로 분자량이 작을수록 큰 확산운동을 하게 되어 채널 바닥으로부터 높은 위치에서 교차흐름의 세기와 평형을 이루게 되며 이때 채널의 축을 따라 흐르는 분리흐름은 포물선형으로서 단백질 또는 거대분자시료들은 그 크기에 따른 분리순서를 갖게 된다. 따라서, 분자량이 작은 시료가 먼저 채널로부터 배출됨으로써 단백질 분자량 크기 순서에 따른 분리가 이루어진다.

도 1은 단백질들의 분리에 적용되는 흐름장-흐름분획(AFlFFF)법의 장치구성을 나타낸 것으로서, 사용되는 채널은 비대칭흐름장-흐름분획 채널이라 명명되며 이것은 재래식 채널구조가 대칭적인 구조를 가지며 채널 위, 아래 블럭에 프릿을 가지는 것과 달리 비대칭채널에서는 채널의 아래블럭에만 프릿을 갖는 구조로 비대칭채널이라 명명된다. 유체의 전달은 HPLC 펌프로부터 전달되고 채널로부터 분리되어 용리되는 단백질 시료들은 자외선/가시광선검출기(UV/VIS detector)를 이용하여 검출한다. 도 1에 나타난 비대칭흐름장-흐름분획 채널에서의 단백질 분리는 다음과 같다. 인젝터(Injector)를 통하여 채널내로 주입된 단백질 시료는 분리가 시작되기 전 시료이완-집중(relaxation-focusing) 과정을 수행해주어야 하는데 이것은 시료가 외부에서 걸어주는 외부장의 세기와 시료가 갖는 확산과의 평형상태를 갖게 해주는 방법으로서 흐름장-흐름분획법의 필수적인 과정이라 할 수 있다. 시료이완-집중은 채널입구와 출구 또는 도 1에서와 같이 집중흐름(focusing flow) 입구를 통하여 유체를 주입하되 채널에 주입된 시료가 채널 입구의 삼각형 밑변 부분의 위치에서 집중될 수 있도록 두 흐름의 유속비를 조절하여 얻게 되며 이는 보통 시료가 이 완-집중될 위치가 전체 채널의 길이로부터 비율로 산정하여 유속 비를 계산한 뒤 실험적으로 적용한다. 이에 대한 것은 유기 염료나 수용성 잉크 등을 주입하여 잉크가 집중되는 위치를 확인함으로써 유속의 비를 최종 결정할 수 있다. 시료이완-집중 시간은 채널부피만큼의 완충용액이 채널 바닥을 통하여 충분히 빠져나가는 시간만큼 걸어주게 된다. 시료이완-집중과정이 끝나면 집중흐름 유입을 차단하고 채널 입구로만 유체를 전달하되 채널바닥으로 빠져나가는 교차흐름과 검출기로 전달되는 출구흐름의 비를 조절하여 단백질을 분리하게 된다. 시료 이완과정-집중시 집중흐름의 일부가 검출기로 유입되되, 단백질 분리 시 사용하는 출구흐름의 유속만큼 전달될 수 있도록 조정할 경우 이완-집중과정에서 분리과정으로 전환될 때 검출기에서의 유체흐름 정지현상을 피할 수 있게 된다.

비대칭채널을 이용하는 흐름장-흐름분획법에서 단백질을 분리할 경우, 단백질의 분자량이 작은 순서로부터 분자량이 큰 순서로 분리할 수 있으며 분리 용액으로 완충용액을 사용하므로 단백질이 변성되지 않은 상태로 분리함과 함께 채널내에 충진물이 채워져 있지 않아 단백질 시료의 파괴나 막힘과 같은 우려를 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 채널의 부피를 구성하는 간격띄우개(스페이서, spacer)의 두께와 폭을 조절하면 유체의 속도 변화 및 분리 효율 등을 가변시킬 수 있고, 마이크로 흐름속도로 단백질 분리를 구현할 수 있어 미량의 단백질 분리에 적합하다[D. Kang, M.H. Moon, Anal. Chem. 2004, 76, 3851-3855; S. Oh et al. J. Separation Sci., 2007, 30, 1082-1087].

그러나, 상기 흐름장-흐름분획법을 이용한 분리법은 젤-전기영동법에 비하여 단백질의 분자량이 작은 순서로부터 분자량이 큰 순서로 분리할 수 있고, 단백질 시료의 파괴나 분리 채널 막힘 등을 최소화할 수 있는 반면 분리능은 높은 편은 아니며, 단백질의 다양한 특성에 따른 분리를 수행하기 곤란한 문제점 등이 있다.

이에 대한 문제점을 극복하는 방안으로 젤을 사용하지 않으면서 등전집중과 분자량분리를 수행할 수 있는 2차원 분리법으로서 모세관등전집중-중공사흐름장흐름분획법이 개발되었는데 이 방법은 모세관내에서 등전집중을 수행하는 방식으로(capillary isoelectric focusing, CIEF) 실리카 모세관내에 양쪽성 전해질 담체를 단백질과 함께 채운 뒤 전기장을 걸어 단백질의 pI에 따라 분리하는 방법을 [Conti, M.; Gelfi, C.; Righetti, P.G. Electrophoresis 1996, 17, 1485-1491]. 중공사흐름장흐름분획법과 직렬로 연결하여 구성한 장치이다. 중공사흐름장흐름분획법은 단백질을 분리 및 분석하는 또 다른 일례로서, 중공사막을 분리채널로 이용하는 분리법[W.J. Lee, B.-R.Min, M.H.Moon, Anal . Chem. 1999, 71(16), 3446; M.H.Moon, K.H. Lee, B.-R.Min, J. Microcolumn Sep., 1999, 11(9), 676; P. Reschiglian, et al. Anal . Chem.　2005, 77, 47]으로써 외부장의 역할은 중공사막 외벽으로 배출되는 교차흐름 또는 방사흐름의 속도에 의해 결정되며 채널 내의 시료는 외부장과 평형을 유지하게 될 경우, 도 2에 나타난 바와 같이, 원형의 시료띠를 이루면서 진행하게 되며, 이때 채널 종축으로 진행하는 분리흐름과의 비율을 조절하여 분리속도를 조절하게 된다.

상기 모세관등전집중-중공사흐름장흐름분획법[D. Kang, M. Moon, Anal . Chem., 2006, 78, 5789-5798]은 젤을 사용하지 않으면서 단백질을 2차원으로 분리 할 수 있는 장점을 지녔으나 모세관을 이용한 단백질의 1차 등전집중 시 모세관의 용량의 한계로 인하여 분리가능한 단백질의 양이 한정될 수밖에 없으며 1차 분리가 이루어진 뒤 pI 로 분리된 단백질 분획을 중공사 분리모듈로 이송하여 분자량 분리를 수행하는 동안 나머지 단백질들은 모세관에서 대기한 뒤 순서적으로 중공사 모듈에서 분리과정을 수행해야 하므로 전체 분리시간은 원하는 pI fraction 만큼 길어지게 된다. 또한 1차로 pI 별 분리된 단백질 시료의 일부가 중공사 모듈에서 2차로 분자량별 분리가 수행되는 동안 나머지 pI 분획들은 모세관에서 전기장 하에 대기하고 있어야 하는데 이 과정에서 모세관 내벽에 구동되는 전기삼투흐름(electroosmotic flow)의 영향으로 인하여 단백질들이 조금씩 이동하게 된다. 이것은 결국 분리된 분획들이 다시 섞이게 될 수 있는 문제점을 야기하게 되며 분획들의 오염 원인이 되기도 한다. 그리고 모세관등전집중-중공사흐름장흐름분획법의 경우 1회 주입가능한 최대 단백질 양이 약 40㎍ 정도여서 다량의 단백체 시료들을 처리하기에는 다소 용량의 한계를 지니는 문제도 있다.

본 발명은 상기의 종래기술의 단점을 해소하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 단백질의 분리시간을 단축하고, 단백질 분리시료의 처리율을 증가시킬 수 있는 비젤방식의 단백질 분리 및 분석장치 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 비젤방식의 단백질 분리장치를 이용한 단백질의 분리 및 분석방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

소정 길이를 갖는 적어도 하나의 유체 채널을 포함하되,

각 채널은 단백질 시료를 pI별로 1차 분리하는 등전집중부 및 1차 분리된 단백질을 2차로 분자량 별로 분리하는 흐름장-흐름분획부로 구분되며, 각 유체 채널의 등전집중부는 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치를 제공한다.

본 발명은 또한

본 발명의 단백질 분리장치; 및

상기 분리장치에서 분리된 단백질을 분석하는 단백질 검출기를 포함하는 단백질 분석장치를 제공한다.

본 발명은 또한

단백질 시료 및 양쪽성 전해질 용액의 혼합물을 펌프에 채운 다음 등전집중부에 공급하고, 전기장을 걸어 등전집중시켜 pI별로 단백질을 분리하는 단계; 및

등전집중된 단백질 시료를 흐름장-흐름분획부로 유입하여 분자량에 따라 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 제1항의 단백질 분리장치를 이용한 단백질의 분리방법을 제공한다.

본 발명은 또한

본 발명의 단백질의 분리방법에 따라 단백질을 분리하는 단계; 및

상기에서 분리된 단백질을 단백질 검출기에서 분석하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 단백질을 pI와 분자량의 크기 순서에 따라 분리 및 회수할 수 있으며, 단백질 분리시 단백질들이 변성되지 않을 뿐만 아니라, pI 별로 분리하는 등전점 분리시 사용되는 양쪽성 전해질(ampholyte) 의 자동제거가 가능하며, 단백질을 분리 회수한 뒤 회수된 단백질을 효소 가수분해 처리할 경우 펩타이드의 분석에 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법을 적용하여 단백질 식별을 직접 이용할 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은

소정 길이를 갖는 적어도 하나의 유체 채널을 포함하되,

각 채널은 단백질 시료를 pI별로 1차 분리하는 등전집중부 및 1차 분리된 단백질을 2차로 분자량별로 분리하는 흐름장-흐름분획부로 구분되며, 각 유체 채널의 등전집중부는 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 분리장치는 상기 등전집중부에서 단백질의 pI별로 1차로 분리된 단백질을 분자량의 크기 순서에 따라 분리할 수 있는 흐름장-흐름분획부를 여러 채널에서 동시에 구동할 수 있는 다중채널을 통해 2차로 분리 분석할 수 있는 특징을 갖는다.

따라서, 본 발명의 단백질 분리장치는 일명 등전집중-다중채널흐름장흐름분획장치로서, 분리장치의 특성을 집약적으로 표현하는 목적으로 표시할 경우, 비젤방식의 2차원(pI 및 분자량) 단백질 분리용 다중채널로 명명할 수 있다.

또한, 본 발명은 단백질의 등전집중이 흐름장-흐름분획을 수행하는 다중채널 내에서 수행되므로 흐름장-흐름분획을 수행하는 과정 중 다중채널 바닥에 설치된 반투과 고분자막을 통하여 양쪽성 전해질을 자연히 제거할 수 있는 특징을 갖는다. 따라서, 종래의 모세관등전집중방법을 통해 분리된 단백질 시료의 경우 단백질의 질량분석단계에서 함께 수득된 양쪽성 전해질에 의한 분석방해요인을 제거하기 위 한 별도의 재분석과정이 필요 없어 단백질 분리공정시간이 단축되는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 단백질 분리장치는 다중채널내에서 등전집중과 분자량분리가 순차적으로 수행되므로 등전집중 후 시료의 이송을 위한 별도의 연결튜브가 필요하지 않으며, 분리를 위하여 유기용매를 전혀 사용하지 않으며, 이에 따라 단백질 시료 분리시 단백질이 변성되지 않고, 분석하고자 하는 단백질 시료를 pI 및 분자량 영역별로 분리하되, 젤상이 아닌 액상에서 pI-분자량의 방법으로 단백질 시료를 분리할 수 있으며, 원하는 pI-분자량 영역의 단백질 분취액(fraction)을 분취할 수 있고, 분석에 필요한 단백질 시료의 양 또한 필요 시 처리율을 높여 다량의 단백질 분리가 가능하다. 또한 pI 별로 분리된 단백질에 대한 분자량 분리 수행 단계에서 하나의 pI 영역에 대한 분자량 분리시 다른 영역의 단백질들이 대기하지 않고 여러 개의 pI영역의 단백질 밴드들에 대한 분자량 분리를 독립적이고도 동시에 수행할 수 있는 특징이 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 첨부된 도면은 본 발명의 예시적인 형태를 도시한 것으로, 이는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위해 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적인 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 분리장치를 나타내는 구성도이고, 도 4는 본 발명에 따른 단백질 분리장치의 연결양태를 나타내는 사진도로서,

본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 분리장치는 소정 길이를 갖는 적어도 하나의 유체 채널을 포함하며, 상기 각 채널은

단백질 시료를 pI별로 1차 분리하는 등전집중부; 및

1차 분리된 단백질을 2차로 분자량 별로 분리하는 흐름장-흐름분획부로 구분되며,

각 유체 채널의 등전집중부는 서로 연결되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 단백질 분리장치는

하부 블록(500);

하부 블록 상에 배치된 멤브레인(300);

멤브레인 상에 배치되며, 소정 길이를 갖는 적어도 하나의 절개부가 형성되어 있는 스페이서(200); 및

스페이서 상에 배치되며, 하부 블록과 체결되는 상부 블록(100)을 포함하여,

스페이서에 형성된 각 절개부는 상부 블록 및 하부 블록에 의하여 유체 채널을 형성하되, 유체 채널은 이웃하는 유채 채널과 연결된 등전집중부 및 이웃하는 유체 채널과 분리된 흐름장-흐름분획부로 구분되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 단백질 분리장치는

등전집중부의 유체 채널에 단백질 시료를 공급하는 시료 공급부(21);

등전집중부와 흐름장-흐름분획부의 경계부에 음전해질과 양전해질을 각각 공 급하는 제 1 및 제 2 전해질 공급부(11, 12); 및

등전집중부의 유체 채널 및 흐름장-흐름분획부의 유체 채널에 완충 용액을 각각 공급하는 펌프(31, 32)를 더 포함한다.

상기 시료 공급부(21)는 시린지 펌프 형태인 것이 바람직하며, 테프론 튜브를 통해 등전집중부의 좌측에 위치한 유입포트(114)로 단백질 시료 및 양쪽성 전해질의 혼합물을 공급한다. 또한, 등전집중부의 우측에 위치한 배출포트(115)를 통해 시료 공급부(21)로 들어온 시료 용액이 등전집중되는 부분에 직선상으로 배열되도록 채널 내의 용매가 배출구로 배출되도록 한다.

또한, 상기 전해질 저장부(11, 12)에는 양전해질 또는 음전해질이 각각 채워져 있는, 바람직하게는 플라스틱 재질로 되어 있고, 양극 또는 음극이 각각 포함되어 있다.

상기 전해질 저장부(11, 12)는 등전집중부의 양끝에 위치한 전해질 유입포트(111, 112)와 테프론 튜브를 통해 연결되어 단백질 시료를 등전집중한다.

상기 양극 및 음극은 당업계에서 통상적으로 사용되는 전극이라면 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 백금 전극이 좋다.

본 발명의 단백질 분리장치의 흐름장-흐름분획부에서 단백질의 분자량분리를 위해 완충용액을 공급하기 위한 제1공급펌프(31) 및 제2공급펌프(32)는 유체저장부와 연결되어 있다.

제1공급펌프(31)는 단백질의 분자량별 분리를 위한 유체, 바람직하게는 완충용액을 채널의 흐름장-흐름분획부의 유입구 쪽으로 공급하기 위한 것으로, 흐름장-흐름분획부의 유체유입포트(131∼136)와 테프론 튜브에 의해 연결되어 있다.

제2공급펌프(32)는 단백질의 분자량별 분리를 위한 유체, 바람직하게는 완충용액을 채널의 흐름장-흐름분획부의 집중흐름부 쪽으로 공급하기 위한 것으로, 흐름장-흐름분획부의 집중흐름유입포트(121∼126)와 테프론 튜브에 의해 연결되어 있다.

상기 제1공급펌프(31) 또는 제2공급펌프(32)는 HPLC 펌프를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.

또한, 상기 완충용액은 단백질 분리에 사용되는 통상의 완충용액이라면 특별히 제한하지는 않는다.

또한, 상기 상부 블록은 유체 채널에 대응하는 위치에 장착된 다수의 유입 포트(131∼136, 121∼126) 및 배출 포트(151∼156)를 포함하되, 유입 포트(131∼136)는 시료 공급부(21), 제 1 및 제 2 전해질 공급부(11, 12), 펌프(31, 32)와 유체 채널을 연결하며, 배출 포트(151∼156)는 흐름장-흐름분획부의 유체 채널에 대응한다.

상기 등전집중부는 일 종단과 흐름장-흐름분획부의 유입구까지의 거리가 0.2 내지 2cm이며, 단백질의 등전집중 분리가 일어나도록 각 채널의 등전집중부는 서로 연결된 구조로 제작되어 있다.

상기 흐름장-흐름분획부는 하부 블록(500)에 프릿(400)을 고정하고, 블록의 내부 프릿(400)과 맞닿는 부분은 간격을 띄워 유체가 통과할 때 잠시 저장되면서 전체적으로 압력을 유지할 수 있는 공간을 사이에 두고 제작하는 것이 좋다. 따라서, 하부 블록(500)에 고정된 프릿(400), 멤브레인(300), 채널의 공간을 형성하는 하나 이상의 스페이서(200) 및 상부 블록(100)을 순서적으로 맞물려 조립한다.

상기 하부 블록(500)의 재질은 특별히 제한하지는 않으나 아크릴 또는 루싸이트를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 단백질 분리장치는 단백질 분리 시 필요한 교차흐름을 통과시키기 위해, 즉, 단백질이 분리된 후 폐기물이 멤브레인을 통하여 유입되도록 하부 블록(500)에 소정 깊이의 프릿(400)을 설치하는 것이 바람직하다.

상기 프릿(400)은 세라믹 입자들을 압축하여 가공된 투과성 프릿인 것이 바람직하다.

상기 프릿의 공극 크기는 원활한 교차흐름의 통과를 위해 1 내지 10 ㎛인 것이 바람직하다.

또한, 상기 멤브레인(300)은 단백질 시료의 손실을 차단하기 위한 용도로 사용되며, 일반적으로 시료의 최저 분자량보다 작은 투과한계를 갖는 반투과막이면 특별히 제한하지 않는다. 바람직하게는 10 내지 30 kDa의 분자량투과한계를 갖는 셀룰로오즈, 폴리술폰, 또는 폴리프로필렌 등을 단독 또는 2종 이상 사용하여 제조 한 고분자 막이 좋다.

또한, 상기 스페이서(200)는 2종 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 12개의 리본을 잘라놓은 듯한 모양으로 제작하되, 입구부분에서 채널 길이의 5 내지 30% 길이 영역의 위치에서 등전집중이 수행되도록 서로 열린 구간으로 제작하는 것이 바람직하다.

상기 스페이서(200)는 유체가 통과될 때 잠시 저장되면서 전체적으로 압력을 유지할 수 있는 공간을 형성하기 위해 50 내지 500㎛의 두께를 갖는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 단백질 분리장치에 있어서, 각 채널의 흐름장-흐름분획부는 입구 폭이 넓은 채널 구조에서 출구 폭이 좁아지는 사다리꼴(trapezoidal) 구조를 갖거나, 폭이 같은 직사각형(rectangular) 구조를 가질 수 있다. 바람직하게는, 유입구 폭이 1 내지 3cm이고, 유출구 폭이 0.3 내지 3cm인 채널이 하나 이상 병렬로 연결된 구조인 것이 좋다.

또한, 상기 상부 블록은 프릿이 설치되지 않으며, 유체의 출입을 위해 드릴을 이용하여 하기의 유입포트(131∼136, 121∼126)와 배출포트(151∼156)를 제조하며, 각 포트는 튜브 연결을 위한 연결부재를 포함하고 있다:

제1공급펌프(31)와 연결되는 유체유입포트(131∼136);

단백질 시료 및 양쪽성 전해질의 혼합물을 공급하기 위한 유입포트(114) 및 용매 배출을 위한 배출포트(115);

제2공급펌프(32)와 연결되는 집중흐름유입포트(121∼126);

분석이 완료된 단백질의 배출포트(151∼156); 및

양전해질(11) 또는 음전해질(12) 저장부와 연결되는 유입포트(111, 112)를 포함한다.

상기 튜브 연결을 위한 각 포트의 연결부재는 PEEK 재질의 유니온을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 유체유입포트(131∼136) 또는 집중흐름유입포트(121∼126)는 멀티웨이 매니폴드(multi-way manifold) 방식으로, 즉, 1개의 입구가 2개 이상의 출구와 연결되는 방식으로 제1공급펌프(31) 또는 제2공급펌프(32)와 연결되는 것이 바람직하다.

각 포트와 펌프의 연결은 바람직하게는 테프론 튜브가 좋다.

상기 전해질 저장부(11, 12)와 연결되는 유입포트(111, 112)는 단백질 시료가 전해질 저장부로 유출되는 것을 제어하기 위해 10kDa 이하의 반투과막을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 반투과막은 셀룰로오즈, 폴리술폰, 또는 폴리프로필렌 등을 단독 또는 2종 이상 사용하여 제조한 고분자 막이 좋다.

본 발명은 또한

본 발명의 단백질 분리장치; 및

상기 분리장치에서 분리된 단백질을 분석하는 단백질 검출기를 포함하는 단백질 분석장치에 관한 것이다.

상기 단백질 검출기는 본 발명의 단백질 분리장치의 채널 하단에 테프론 튜브를 통해 상부 블록(100)의 단백질 배출포트(151∼156)와 연결된다.

상기 검출기의 종류는 분리된 단백질을 분석하기 위해 사용되는 당업계의 통상적인 검출기라면 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 자외선 검출기를 사용하는 것이 좋다.

또한, 본 발명의 단백질 분석장치는 본 발명의 단백질 분리장치에서 분리된 단백질들을 분자량 영역별로 분취하고, 분취한 단백질 분취액을 효소처리하여 펩타이드화한 뒤 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법(nanoflow LC-ESI-MS-MS, nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry)을 이용하여 펩타이드를 분리하고, 질량 스펙트럼을 단백질 데이터베이스와 비교하여 단백질을 식별하기 위해, 단백질 검출기 출구에 분취액분취기를 추가로 연결할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 분석장치는 단백질 분리장치를 구성하는 공급펌프, 밸브 및 압력밸브 등을 컴퓨터에 연결시켜 제어할 수 있도록 구성한 뒤 최종적으로 단백질이 분리되어 통과하는 다중채널 출구를 자동 분취기에 연결할 경우, 단백질을 pI 및 분자량에 따라 자동분리 할 수 있으며, 채널의 출구를 모세관, 바람직하게는 실리카 모세관을 이용하여 전자분무이온화(electrospray ionization, ESI) 질량분석기(mass spectrometry, MS)와 온라인 연결할 수 있다.

상기 전자분무이온화-질량분석기(ESI-MS)는 단백질의 질량분석과 함께 탠덤질량분석법을 사용할 경우 단백질 사슬에 대한 구조분석이 가능하여 단백질 식별에 응용할 수 있고, 단백질 시료가 다중채널에서 분리되는 과정 중 등전집중부로부터 유입된 양쪽성 전해질은 시료이완-집중과정과 분리과정 중 교차흐름과 함께 배출되므로 양쪽성 전해질의 자동적인 제거가 가능하게 된다.

또한, 본 발명에 따른 각 장치의 구성요소에 있어서, 단백질 시료, 전해질 용액 및 완충용액 등이 흐르는 이동경로는 전술한 물질들과 반응하지 않는 당업계에서 통상적으로 사용되는 재질의 관을 사용한다면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 테프론 튜브를 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 일 실시예를 참고하여 본 발명의 단백질 분리장치의 제조방법을 구체적으로 설명하면,

아크릴 또는 루싸이트(lucite) 블록(500)에 프릿(400)을 고정하고, 프릿 위에는 멤브레인(300), 채널의 공간을 형성하는 스페이서(200), 그리고 상부 블록(100)을 순서적으로 맞물려 조립하여 다중채널의 기본 골격을 제조한다.

채널 윗벽, 즉 상부 블록(100)은 프릿이 설치되지 않으며, 유체의 출입을 위한 유로를 드릴로 생성하고, 채널 윗벽의 외관은 튜브의 연결을 위한 연결부재를 갖는다. 다중채널은 2개 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 12개의 리본형태 다중 채널이 병렬로 연결된 구조를 바탕으로 하고 50 내지 500㎛ 두께의 다중채널 스페이서(200) 를 도3에서와 같은 여러 개의 리본을 잘라 놓은 듯한 모양으로 제작하되 입구부분에서 채널 길이의 5 내지 30% 길이 영역의 위치에서 등전집중이 수행되도록 서로 열린 구간으로 제작한다.

다중채널내의 각 채널은 유입구 폭은 1 내지 3cm, 유출구 폭은 0.3 내지 3cm, 채널 길이는 등전집중부를 지난 위치에서부터 약 10cm로 제조한다.

상기 등전집중부는 일 종단과 흐름장-흐름분획부의 유입구까지의 거리가 0.2 내지 2cm 의 범위를 갖도록 제조한다. 상기 등전집중부는 테프론 튜브로 연결되어 양전해질 음전해질이 각각 채워져 있는 전해질 저장부(11, 12)에 연결되며 각 전해질 저장부(11, 12)는 백금전극으로 각각 연결되어 양극과 음극으로 연결되어 있다.

상기에서 제조된 다중채널의 기본 골격과 상부 블록(100)은 볼트로 조여 완성한다.

본 발명은 또한

단백질 시료 및 양쪽성 전해질 용액의 혼합물을 펌프에 채운 다음 등전집중부에 공급하고, 전기장을 걸어 등전집중시켜 pI별로 단백질을 분리하는 단계; 및

등전집중된 단백질 시료를 흐름장-흐름분획부로 유입하여 분자량에 따라 단 백질을 분리하는 단계를 포함하는 제1항의 단백질 분리장치를 이용한 단백질의 분리방법에 관한 것이다.

상기 pI별 단백질 분리단계는 분리 분석하고자 하는 단백질 시료와 양쪽성 전해질 용액 혼합물을 시린지펌프(21)에 채우고, 등전집중부 좌측에 테프론 튜브로 연결된 연결부재를 통하여 시료 유입포트(114)로 상기 혼합물을 주입하는 단계이다(시료주입단계, 도 5a 참조).

상기 단백질 시료는 특별히 제한하지는 않으며, 바람직하게는 미오글로빈(myoglobin), 트립시노겐(trypsinogen), 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase), 소혈청알부민(bovine serum albumin), 시토크롬-C, 아포페리틴, 또는 이스트 알코올 디하이드로게나아제(yeast alcohol dehydrogenase)등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.

상기 양쪽성 전해질은 pH 3 내지 10의 0.5 내지 3%의 농도를 갖는 양쪽성 전해질 용액인 것이 바람직하다.

상기 양쪽성 전해질 용액은 등전집중을 위하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 양쪽성 전해질 용액이라면 특별히 제한하지는 않는다.

또한, 상기 양쪽성 전해질의 농도는 시료 공급부로 유입되는 시료 용액 중 양쪽성 전해질이 차지하는 부피 비율을 뜻하는 것으로, 농도가 0.5% 미만에서는 양쪽성 전해질의 완충능력이 부족하여 정확한 pH 구배를 형성하기 어렵게 되어 등전점 분리가 잘 일어나지 않고, 3%를 초과하는 농도에서는 전기적 힘에 의해 이동하는 양쪽성 전해질 분자들이 너무 많게 되어, 상대적으로 단백질 분자들의 이동이 저하된다. 또한, 양쪽성 전해질 용액은 물보다 점도가 높아 농도를 높일 경우, 용액의 점성이 증가하여 분자들의 이동을 방해한다. 따라서, 완충능력을 유지할 수 있으면서 단백질의 이동을 방해하지 않는 1%의 농도가 가장 바람직하다.

상기 양쪽성 전해질은 단백질 시료 100 중량부에 대하여 1 내지 2 중량부로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 범위가 1 중량부 미만인 경우, pH 구배를 형성하여 등전점 분리를 행하는 데 많은 시간이 소요되고, 전해질의 완충능력이 충분하지 못하며, 2 중량부를 초과하면, 양쪽성 전해질 분자들의 수가 단백질에 비해 상대적으로 너무 많아 단백질의 이동을 방해한다.

또한, 상기 단백질을 등전집중시키는 단계는 단백질 시료 및 양쪽성 전해질의 혼합물을 주입한 등전집중부에 1 내지 20분간 0.1 내지 1 kV/cm의 전기장을 걸어 등전집중시킨 뒤 pI 분리가 완료되면 전기장을 중단하는 단계이다(등전집중단계, 도 5b 참조).

상기 전압의 세기는 가하는 전압의 세기가 강할수록 등전점 분리를 단시간 내에 행할 수 있으나, 지나치게 강한 전압을 가할 경우 열이 많이 발생하고, 양극액과 채널을 연결하는 튜브 안에서 기포가 발생하여 전류의 흐름을 차단하는 단점이 있어, 0.1 내지 1 kV/cm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100 내지 600 V/cm이 좋다.

상기 분자량에 따라 단백질을 분리하는 단계는 유체저장부의 일측에 연결설치된 제1공급펌프(31)를 작동시켜 유체저장부에 저장된 완충용액을 채널입구의 유체유입포트(131∼136)와 집중흐름유입포트(121∼126)의 양측으로 전달하여 단백질 분취액을 인접한 다중채널(도 5b 참조)로 이동시키되 유속의 조절을 통하여 시료이완-집중선에서 평형을 유지하는 것이 바람직하다.

등전집중이 완료되면 다중채널의 유체유입포트(131∼136)와 집중흐름유입포트(121∼126)로 유체를 전달하되 유속을 달리하여 등전집중 분리된 단백질 시료 밴드가 해당 채널로 주입되어 도 5c에 나타낸 시료이완-집중선의 위치(등전집중부로부터 약 0.5cm)에 집중될 수 있도록 유속의 비를 조절하며 시료들이 충분한 이완과정을 통하여 평형상태에 이를 수 있는 시간 동안(채널 부피의 1 내지 3배 정도의 유체가 교차흐름으로 빠져나갈 수 있는 시간) 이완과정을 수행한다 (시료이완-집중단계, 도 5c 참조).

또한, 상기 시료이완과정을 위하여 채널 전체 길이(등전집중이 끝나는 부분부터 채널출구의 10 내지 50% 위치에서 시료들을 집적시키는 것이 바람직한데, 이를 위해 채널의 유체유입포트(131∼136)와 집중흐름유입포트(121∼126)를 통하여 유입되는 유체의 속도를 1:9 내지 5:5로 조절하되 전체길이의 10 내지 50%가 되는 위치, 바람직하게는 10% 위치에서 시료는 평형상태를 얻으며 집적되게 된다. 이와 동시에, 상기 다중채널로 유입된 완충용액과 등전집중에 사용된 양쪽성 전해질은 채널바닥의 막 공극을 따라 막 외부로 배출된다.

또한, 상기 단계에서 등전집중된 단백질의 부피는 1 내지 70㎕, 바람직하게는 약 10㎕로 조절하되 원하는 pI 영역의 크기만큼 부피를 조절한다. 이때, 사용된 양쪽성 전해질의 pH 영역이 3 내지 10인 경우, 다중 채널 중 어느 한 채널의 경우 1/6에 해당하므로 pI간격은 1.17 pI 간격에 해당된다.

또한, 상기 단계로부터 평형이 종료된 후 유체저장부 내 완충용액이 다중채널의 유체유입포트(131∼136)로만 유입되도록 하여 흐름장흐름분획법으로 분자량이 작은 단백질로부터 분자량이 큰 단백질 순서로 단백질을 분리한다.

시료의 이완-집중이 완료되면 집중흐름유입포트(121∼126)로의 유체 유입을 차단함과 동시에 제1공급펌프(31)로부터의 유속을 상승하여 분리에 필요한 유속만큼 채널입구의 유체유입포트(131∼136)로만 전달하되 그 유속은 교차흐름유속과 출구흐름유속의 합에 해당되는 유속으로 전달한다. 이때 집중흐름유입포트(121∼126)는 밸브를 사용하여 차단하거나 펌프와 연결될 경우 그냥 두어도 무방하다. 이 단계에서 단백질들은 분자량 순서로 분리되어 각 채널의 출구로 빠져나간다(분리단계, 도 5d 참조).

본 발명은 또한

본 발명의 단백질 분리방법에 따라 단백질을 분리하는 단계; 및

상기에서 분리된 단백질을 단백질 검출기에서 분석하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 분리장치를 단백질 검출기에 연결하거나 용리되는 단백질을 분취액분취기를 이용하여 시간별 또는 원하는 시간간격만큼 단백질을 분취하여 단백질을 분석할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 분리장치의 후단에 분취액분취기를 연결설치하여 단백질을 분석할 수 있다.

상기 분취액분취기를 검출기에 연결설치할 경우 단백질들을 분자량 영역별로 분취할 수 있으며, 분취한 단백질 분취액은 효소분해 처리하여 펩타이드화한 뒤 나노유속 액체크로마토그래피-전자분무이온화-탠덤질량분석법(nanoflowLC-ESI-MS-MS, nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry)을 이용하여 펩타이드를 분리하고, 질량 스펙트럼을 단백질 데이터베이스와 비교하여 단백질을 식별할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 분리장치의 단백질 배출포트(151∼156)를 전자분무이온화 질량분석기에 모세관 연결하여 단백질을 분석할 수 있다.

본 발명의 단백질 분리장치를 구성하는 주입펌프, 공급펌프, 밸브 및 압력밸브 등을 컴퓨터에 연결시켜 제어할 수 있도록 구성한 뒤 최종적으로 단백질이 분리되어 통과하는 다중채널 출구를 자동 분취기에 연결시킬 경우, 단백질을 pI 및 분자량에 따라 자동분리 할 수 있으며, 채널의 출구를 모세관, 바람직하게는 실리카 모세관을 이용하여 전자분무이온화(electrospray ionization, ESI) 질량분석 기(mass spectrometry, MS)와 온라인 연결할 수 있다.

또한, 상기 전자분무이온화-질량분석기(ESI-MS)는 단백질의 질량분석과 함께 탠덤질량분석법을 사용할 경우 단백질 사슬에 대한 구조분석이 가능하여 단백질 식별에 응용할 수 있고, 단백질 시료가 다중채널에서 분리되는 과정 중 등전집중부로부터 유입된 양쪽성 전해질은 시료이완-집중과정과 분리과정 중 교차흐름과 함께 배출되므로 양쪽성 전해질의 자동적인 제거가 가능하게 된다.

상기의 방법 중 어느 하나를 이용하여 분리된 단백질 시료로부터 프로테옴을 분석할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 단백질 분리장치의 제조

다중채널의 튜브 연결은 6개의 입구와 6개의 출구, 그리고 6개의 집중흐름부로 유체를 입출입하기 위한 연결부재를 가지며 등전집중부에는 시료의 입출입을 위한 2개의 연결부재, 전극과의 연결을 위한 튜브 연결 2개 모두 22개의 연결부재는 도 4에 나타난 바와 같이 동일한 PEEK 재질의 Nut (Upchurch Scientific, 미국)를 사용하였다. 채널 입구부분의 여섯 개 테프론 튜브는 6-웨이 매니폴드(1개의 입구와 6개의 출구를 갖는 port, Upchurch Scientific, 미국) 를 사용하여 제1공급펌프 와 연결하고 펌프는 HPLC 펌프를 사용하였다. 마찬가지로 집중흐름을 전달하는 집중흐름 입구(채널의 중간부분의 여섯 개 입구) 와의 연결은 채널 입구와 동일한 방법으로 연결하고 테프론 튜브와 6-웨이 매니폴드를 사용하여 제2공급펌프와 연결하였다. 채널출구의 각 6개 연결부는 동일한 PEEK Nut 를 사용하되 출구의 경우는 교차흐름과 출구흐름의 속도를 조절하기 위하여 출구 연결튜브는 실리카모세관 (내경 75㎛, 외경 360㎛) 의 길이를 조절하여 압력을 걸어주는 것과 동시에 검출기[UV730D, 영린기기, 한국]로 연결하였다. 다음으로, 검출기 출구는 분취액분취기를 연결하여 분리된 단백질을 시간대별로 회수하였다. 교차흐름의 경우 채널의 바닥 부분에 하나의 출구를 통하여 배출되는데 마찬가지로 테프론 튜브와 PEEK재질의 연결부재를 사용하여 연결하고 유체가 방출되도록 하였다.

다중채널의 등전집중부 가운데 두 개의 연결부재 중 일측에 테프론 튜브를 이용하여 시린지펌프[Harvard Apparatus 22, Harvard Apparatus, 미국]를 연결하고 시린지 펌프에 단백질 시료[myoglobin (15 kDa, pI 6.8), trypsinogen (24 kDa. pI 9.3), carbonic anhydrase (29 kDa, pI 5.85), bovine serum albumin (BSA, 66 kDa, pI 4.8), yeast alcohol dehydrogenase (YADH, 150 kDa. pI 6.23)] 및 pH 3 내지 10의 양쪽성 전해질 용액[Ampholyte High Resolution, Fluka, 스위스]을 채웠다. 테프론 튜브와 채널의 연결부위는 PEEK재질의 nut (Upchurch Scientific) 를 사용하였다.

다음으로, 등전집중부 양끝에 전극을 연결하되 전극은 백금 전극으로서 양전해질과 음전해질을 저장하는 플라스틱 전해질 저장부에 담가 연결하되 각 저장부재 로부터 등전집중부 양 끝으로 테프론 튜브를 통하여 연결하였다. 이때 양전해질 용액으로서 0.10㎛ 분리막 필터로 여과한 초순수(>18MΩ)로 제조된 20mM H₃PO₄ 용액을, 이에 대향되는 타측에 음전해질 용액으로서 0.10㎛ 분리막 필터로 여과한 초순수(>18MΩ)로 제조된 20mM NaOH 용액이 채워진 전해질 저장부재[Cross, Upchurch scientific, 미국]를 연결 설치하였다. 테프론 튜브와 채널의 연결부위는 PEEK재질의 nut를 사용하며 nut와 채널 접촉부위에는 작은 막(분자량 투과 10kDa)을 삽입하여 단백질이 전극 방향으로 즉 채널 밖으로 이동하지 못하도록 함이며, 전극은 플라스틱 용기에 직접 백금전극을 설치한 뒤 전원을 연결하였다.

다음으로, 상기 2 개의 HPLC펌프는 완충용액이 채워져 있는 유체저장부[5L 삼각플라스크, Schott Duran, 독일]의 일측에 연결시켜 전체 단백질 분리장치를 제조하였다.

<실시예 2> 단일 단백질 표준물에 대한 등전집중 장치의 분리

실시예 1에 따라 제조된 단백질 분리장치(등전집중-흐름장흐름분획다중채널 장치) 중 등전집중 효과를 확인하기 위하여 시토크롬-C(cytochrome-C, 12.7kDa, pI 10.25) 를 단독으로 분리하되 시료가 지닌 자체의 빨간색을 육안으로 확인하기 위하여 과량 (30㎍) 을 양쪽성 전해질 용액과 혼합하여 시린지펌프에서 다중채널로 주입한 다음 3분간 2kV, 1.25mA에서 등전집중을 수행하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 단백질 밴드가 좁은 선으로 나타나게 됨을 확인할 수 있다. 도 6의 좌측은 양극, 우측은 음극방향이며 도시된 상단 좌우에 나타난TSms 연결부위는 시료의 주입 연결부재에 해당한다.

또한, 등전집중되는 단백질 시료는 양전극 사이에서 전기적 중성이 되면서 단백질이 가지는 pI영역과 주위의 양쪽성 전해질의 pH 값과 같은 위치에서 더 이상 전극방향으로 전기영동되지 않고 얇은 선으로 밴드를 이루게 되는 것이 등전집중의 원리가 되며 도 6에서는 과량의 시료를 주입하였어도 시료의 밴드 폭이 좁은 형태로 유지되는 것을 볼 수 있다. 다만 시료의 양이 과량 주입되어 양쪽 방향으로부터 등전점까지 정기영동되어 온 시료들이 채널의 입구와 출구 방향으로 확산되어 길게 띠를 이루며 나타났지만 이 또한 다중 채널의 경우 문제가 되지 않는 것이 등전집중이 완료된 다음 시료들은 흐름장-흐름분획법에 의한 분자량 분리를 위하여 도6의 방향으로는 아래쪽 다중채널 6개 채널 방향으로 이동시킨 다음 시료이완 집중을 통하여 다시 다중채널의 입구위치(6개 채널이 시작되는 부분)에서 유체의 이완-집중 작동을 통하여 다시 횡축으로(도 6의 횡축) 집중되는 과정을 거치기 때문에 아랫방향으로의 확산은 문제가 되지 않는다.

<실시예 3> 등전집중시 전압 변화에 의한 단일 단백질의 등전집중 차이

실시예 1의 분리장치를 이용하여 등전집중 과정에서 사용전압의 차이에 따른 등전집중분리의 효율을 검토하였다. 도 7에는 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase, Carbonic Anhydrase, 29kDa, pI 5.8) 1 ㎍을 주입한 뒤 등전집중시 사용한 전압을 1.0, 2.0, 2.5, 3.0kV 조건에서 비교하였고, 도 7에는 1.0 및 3.0kV 조건에서의 결과를 도시하였다.

도 7 에 나타난 바와 같이, 3.0kV 을 가한 경우, 소혈청알부민 시료가 주어진 시간 내에 집중이 완료되어 채널 3번에서만 분리되어 나타나는 것으로 확인되었다. 반면 1.0kV를 사용하였을 경우 단백질이 2, 3, 4번에 걸쳐서 분리되어 나옴을 확인할 수 있었는데, 이것은 단백질이 등전집중될 때, 도 6에서와 같이 얇은 띠를 이루지 못하고 넓게 퍼지는 것을 의미하며 100초의 시간 내에 단백질이 충분히 집중되지 못하였음을 의미한다. 반면 2.5kV를 사용하였을 경우 주어진 시간 내에 집중이 완료되어 소혈청 단백질이 2번 채널에서 분리되어 나오고 3번 채널에서는 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 이 실험으로부터 등전집중에 사용할 전압은 최소 2.5kV 이상을 사용하는 것이 효과적임을 확인하였다.

<실시예 4> 양쪽성 전해질의 농도차이에 의한 단백질의 등전집중 차이

실시예 1의 분리장치를 이용하여 등전집중과정에서 사용된 양쪽성 전해질의 농도차이에 따른 등전집중분리의 효율을 검토하였다.

도 8에는 소혈청알부민 (BSA, 66kDa, pI 4.8) 1㎍을 주입하여 분리할 경우 단백질시료용액 20㎕ 주입시 혼합하는 양쪽성 전해질의 농도를 1%로 하였을 경우와 0.5% 로 하였을 경우 나타나는 분리효율의 차이를 나타내주고 있다. 상기 농도는 시료 용액 중 양쪽성 전해질이 차지하는 부피 비율을 뜻한다.

도 8에 나타난 바와 같이, 1.0%의 농도를 사용하였을 때 3번 채널에서 소혈청알부민이 전적으로 분리되어 나오는 것을 확인할 수 있다. 반면, 양쪽성 전해질 의 농도를0.5%로 사용하였을 때 pH 구배가 충분히 이루어지지 않아 pH 3-10의 양쪽성 전해질 용액을 사용함에도 불구하고 가장 낮은 pH 영역인 채널 1번에 시료 단백질이 분리되어 나오는 것을 미루어 보아 0.5%의 농도가 적합하지 않음을 확인할 수 있다.

<실시예 5> 단백질 혼합표준물에 대한 등전집중-흐름장흐름분획 장치의 분리

실시예 1에 따라 제조된 단백질 분리장치(등전집중-흐름장흐름분획 다중채널 장치)의 분리능을 평가하기 위하여 세 가지 단백질 표준물들을 혼합하여 단백질 혼합물 시료를 준비하였다. 여기서, 상기 단백질 표준물들의 혼합물 조성은 표 1과 같았다.

표 1에 따른 조성을 갖는 단백질 혼합물과 양쪽성 전해질(1%, v/v)의 혼합용액을 실시예 1에 따라 제조된 단백질 분리장치의 시린지 펌프에 장착한 뒤 그 시린지 펌프를 작동시켜 테프론 모세관으로 상기 혼합용액을 공급한 후 약 1.5분간 357 V/cm의 전기장을 걸어 등전집중시킨 후 제1공급펌프와 제2공급펌프를 작동하되 단백질 시료가 등전집중부를 벗어나 여섯 개의 채널로 이동하도록 하며 이때 유속의 비율은 여섯 개의 채널 초입부에서 단백질이 모이도록 조절함과 동시에 전기장은 중단하였다.

시료의 경우 6개의 채널로 나뉘어 이동하는바, 즉 pI 구간 3-4.17, 4.17-5.33, 5.33-6.5, 6.5-7.67, 7.67-8.83 및 8.83-10으로 나뉘어 흐름장흐름분획 분리에 사용한 것이 된다. 이때 용액의 흐름은 도 5c에서와 같이 집중흐름의 일부는 시료이완 집중선으로 다른 일부는 채널 출구로 가되 이는 검출기에 유속흐름을 일정부분 유지함으로써 검출기 바탕선의 흔들림을 줄이기 위한 것이었다. 또한 완충용액의 일부는 채널입구로 유입되어 시료이완-집중선에서 멈추게 되며 채널내에 유입된 완충용액은 등전집중에 사용된 양쪽성 전해질과 함께 교차흐름으로 채널 바닥의 막을 통하여 배출되게 된다.

시료이완-집중은 채널의 전체 부피의 1 내지 3배 되는 부피가 채널바닥 방향의 교차흐름으로 빠져나가는 시간만큼 유지하되 본 실시예에서는 1분 30초를 사용하였고 이때 사용된 교차흐름은 총 9.6mL/min 이 되었다. 시료이완-집중이 완료된 직후 흐름장-흐름분획을 위하여 제2공급펌프로부터 전달되는 집중흐름은 중지되고 제1공급펌프부터 총 10.0mL/min의 완충용액이 채널 입구로만 전달되도록 하였으며(도 5d), 이때 교차흐름의 유속은 시료이완-집중 때와 마찬가지로 9.6mL/min을 사용하고 여섯 개의 채널출구로 통과되는 유속은 각각 0.067mL/min가 되었다.

이 과정에서 pI분리되어 각 채널로 유입된 단백질은 분자량 크기 순서에 따라 분리가 이루어지는데 그 결과를 도 9에 나타내었다.

이때, 레인 1은 1번 채널을 의미하며 레인 1에서는 해당 pI 영역(pI 3.0-4.17) 단백질이 없으며, 2번 채널에서는 소혈청알부민 (BSA, pI 4.8)과 아포페리틴, 3번 채널은 카보닉 안하이드라아제와 이스트 알코올 디하이드로게나아제(yeast alcohol dehydrogenase), 4, 5, 6번 채널은 해당 영역의 단백질이 없어 각각 두 개의 채널에서 해당 단백질 분리된 것으로 보인다. 3번 채널의 경우 해당 채널에서 분리되어 나올 수 있는 단백질은 pI영역으로 5.5-6.5 정도로 추정할 수 있는데, 현재 도 9에 나타난 아포페리틴의 경우 pI가 5.4이며 아포페리틴의 pI값이 경계보다 약간 높은 수치를 갖는 데에도 불구하고 2번 채널에서 아포페리틴의 일부가 나타나지 않은 것으로 추정할 수 있어 본 발명의 채널이 갖는 등전집중의 정확성이 매우 높은 것으로 추정할 수 있다. 각 레인마다 초기 분리시 틈새 피크 (void peak) 가 분리시작 직후 나타나게 되는데 이것은 흐름장-흐름분획법 장치에서 일반적으로 나타나는 것으로서 그 원인은 자세하게 밝혀지지는 않았으나 시료이완-집중 직후 분리시작 단계에서 나타나는 유속의 변화에 따른 압력 변화 등이 원인으로 나타나는 피크이다. 각각의 단백질 pI값은 각 채널이 가질 수 있는 해당 pH 영역내에 포함되며 이것은 단백질이 등전집중부에서의 등전집중분리가 성공적으로 진행되어 흐름장-흐름분획 다중채널에서 분자량별 분리가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

도 1 및 2는 종래의 단백질 분리장치의 채널 구조를 도시한 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 단백질 분리장치를 나타내는 구성도를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 단백질 분리장치의 연결양태를 나타내는 사진도이다.

도 5는 본 발명의 단백질 분리장치를 이용하여 단백질을 분리하는 공정도를 나타낸 것으로, 도 5a는 시료주입단계의 구성도, 도 5b는 등전집중단계의 구성도, 도 5c는 시료이완-집중단계의 구성도, 도 5d는 장흐름분획법의 분리단계의 구성도를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 단백질 분리장치를 이용하여 단백질 단일시료로, 시토크롬-C를 등전집중시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 단백질 분리장치를 이용하여 단백질 단일시료로, 소혈청알부민을 등전집중 시 전압변화에 따른 등전집중 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 단백질 분리장치를 이용하여 단백질 단일시료로, 카보닉 안하이드라아제를 등전집중 시 시료와 함께 공급하는 양쪽성 전해질의 농도변화에 따른 등전집중 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명의 단백질 분리장치를 이용하여 단백질 혼합시료를 등전집중시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.

<도면의 주요한 부분에 대한 부호의 설명>

11: 양전해질 저장부 12: 음전해질 저장부

21: 시료 공급부 31: 제1공급펌프

32: 제2공급펌프 100: 상부 블록

111, 112: 전해질 유입포트 114: 시료 유입포트

115: 용매 배출포트 121∼126: 집중흐름유입포트

131~136: 유체유입포트 151∼156: 단백질 배출포트

200: 스페이서 210: 등전집중부

211~216: 유체 채널의 입구 221∼226: 유체 채널의 흐름장-흐름분획부

300: 멤브레인 400: 프릿

500: 하부 블록

Claims (26)

1. 단백질 시료를 pI별로 1차 분리하는 등전집중부 및 1차 분리된 단백질을 2차로 분자량 별로 분리하는 흐름장-흐름분획부로 구분된 유체 채널을 둘 이상 포함하되,

   각 채널의 등전집중부는 서로 연결되어 있고, 흐름장-흐름분획부는 일정 거리로 이격되어 병렬 배치되어 있으며, 각 흐름장-흐름분획부의 하단에 구비된 단백질 배출포트를 통해 단백질 분취액을 얻고,

   상기 등전집중부 양끝에 전해질 유입포트가 위치하고 있어 튜브연결을 통해 상기 채널 외부에 위치한 전해질 공급부로부터 양 전해질 및 음전해질이 각각 등전집중부로 공급되는 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
2. 제 1 항에 있어서, 단백질 분리 장치는

   하부 블록;

   하부 블록 상에 배치된 멤브레인;

   멤브레인 상에 배치되며, 소정 길이를 갖는 적어도 하나의 절개부가 형성되어 있는 스페이서; 및

   스페이서 상에 배치되며, 하부 블록과 체결되는 상부 블록을 포함하여,

   스페이서에 형성된 각 절개부는 상부 블록 및 하부 블록에 의하여 유체 채널을 형성하되, 유체 채널은 이웃하는 유채 채널과 연결된 등전집중부 및 이웃하는 유체 채널과 분리된 흐름장-흐름분획부로 구분된 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
3. 제 2 항에 있어서, 단백질 분리 장치는,

   등전집중부의 유체 채널에 단백질 시료를 공급하는 시료 공급부;

   등전집중부와 흐름장-흐름분획부의 경계부에 음전해질과 양전해질을 각각 공급하는 제 1 및 제 2 전해질 공급부; 및

   등전집중부의 유체 채널 및 흐름장-흐름분획부의 유체 채널에 완충 용액을 각각 공급하는 펌프를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분리 장치.
4. 제 1 항에 있어서,

   상부 블록은 유체 채널에 대응하는 위치에 장착된 다수의 유입포트 및 배출포트를 포함하되, 유입포트는 시료 공급부, 제 1 및 제 2 전해질 공급부, 펌프와 유체 채널을 연결하며, 배출포트는 흐름장-흐름분획부의 유체 채널에 대응하는 것을 특징으로 하는 단백질 분리 장치.
5. 제1항에 있어서,

   등전집중부의 일 종단과 흐름장-흐름분획부의 유입구까지의 거리는 0.2 내지 2cm 인 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
6. 제2항에 있어서,

   상부 블록 및 하부 블록은 아크릴 또는 루싸이트로 제조된 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
7. 제2항 또는 제6항에 있어서,

   하부 블록은 1 내지 10㎛ 깊이의 프릿이 형성되어 있어 단백질이 분리된 후 폐기물이 멤브레인을 통하여 프릿 내로 유입되는 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
8. 제2항에 있어서,

   멤브레인은 10 내지 30 kDa의 분자량 투과한계를 갖는 반투과 멤브레인인 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
9. 제2항 또는 제 8 항에 있어서,

   멤브레인은 셀룰로오즈, 폴리술폰 및 폴리프로필렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 고분자로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
10. 제2항에 있어서,

    스페이서는 50 내지 500㎛의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
11. 제1항에 있어서,

    흐름장-흐름분획부를 구성하는 유체 흐름 채널은 그 유입구 폭이 1 내지 3cm이고, 유출구 폭이 0.3 내지 3cm인 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
12. 제4항에 있어서,

    전해질 저장부와 연결되는 유입포트는 단백질 시료의 유출을 제어하기 위한 10kDa 이하의 반투과막을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분리장치.
13. 제1항에 따른 단백질 분리장치; 및

    상기 분리장치에서 분리된 단백질을 분석하는 단백질 검출기를 포함하는 단백질 분석장치.
14. 제13항에 있어서,

    단백질 분리장치의 배출 포트에 연결된 분취액분취기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분석장치.
15. 제13항에 있어서,

    단백질 분리장치의 배출 포트에 연결된 전자분무이온화 질량분석기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분석장치.
16. 단백질 시료 및 양쪽성 전해질 용액의 혼합물을 펌프에 채운 다음 등전집중부에 공급하고, 전기장을 걸어 등전집중시켜 pI별로 단백질을 분리하는 단계; 및

    등전집중된 단백질 시료를 흐름장-흐름분획부로 유입하여 분자량에 따라 단 백질을 분리하는 단계를 포함하는 제1항의 단백질 분리장치를 이용한 단백질의 분리방법.
17. 제 16항에 있어서,

    단백질 시료는 미오글로빈(myoglobin), 트립시노겐(trypsinogen), 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase), 소혈청알부민(bovine serum albumin), 시토크롬-C, 아포페리틴 및 이스트 알코올 디하이드로게나아제(yeast alcohol dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 단백질의 분리방법.
18. 제16항에 있어서,

    양쪽성 전해질 용액은 pH 3 내지 10의 0.5 내지 3%의 농도를 갖는 양쪽성 전해질 용액인 것을 특징으로 하는 단백질의 분리방법.
19. 제16항에 있어서,

    양쪽성 전해질 용액은 단백질 시료 100 중량부에 대하여 1 내지 2 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리방법.
20. 제16항에 있어서,

    단백질을 분자량에 따라 분리하는 단계는 유체저장부의 일측에 연결설치된 제1공급펌프를 작동시켜 유체저장부에 저장된 완충용액을 유체유입포트에 공급하여 분리된 단백질 밴드를 흐르장-흐름분획부로 공급하면서, 또한 제2공급펌프를 작동시켜 완충용액을 집중흐름유입포트에 공급하여 시료이완-집중 및 평형을 유지하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리방법.
21. 제20항에 있어서,

    흐름장-흐름분획부의 유체유입포트와 집중흐름유입포트로 유입되는 유체의 속도의 비율은 1:9 내지 5:5인 것을 특징으로 하는 단백질의 분리방법.
22. 제20항에 있어서,

    흐름장-흐름분획부의 유체유입포트와 집중흐름유입포트로 유입되는 유체는 각각 등전집중부와 흐름장-흐름분획부 전체 길이의 10 내지 50%가 되는 위치에서 집중하면서 평형을 이루게 되는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리방법.
23. 제20항에 있어서,

    단백질을 분자량에 따라 분리하는 단계는 시료의 이완-집중 및 평형이 종료된 후 제2공급펌프의 유속을 중단하고, 유체저장부의 완충용액을 제1공급펌프를 통해 유체유입포트로만 유입되도록 하여 흐름장-흐름분획법으로 분자량이 작은 단백질로부터 분자량이 큰 단백질 순서로 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분리방법.
24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따라 단백질을 분리하는 단계; 및

    상기에서 분리된 단백질을 단백질 검출기에서 분석하는 단계를 포함하는 단백질의 분석방법.
25. 제24항에 있어서,

    단백질 분리장치의 단백질 배출포트를 전자분무이온화 질량분석기에 모세관 연결하여 단백질을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분석방법.
26. 제24항에 있어서,

    단백질 분리장치에서 분리된 단백질 시료를 회수하여 프로테옴을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분석방법.

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