TWI516767B - 藉由毛細管電泳進行之糖化血紅素分析及測定、用於毛細管電泳之緩衝液組合物及套組 - Google Patents
藉由毛細管電泳進行之糖化血紅素分析及測定、用於毛細管電泳之緩衝液組合物及套組 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI516767B TWI516767B TW099121568A TW99121568A TWI516767B TW I516767 B TWI516767 B TW I516767B TW 099121568 A TW099121568 A TW 099121568A TW 99121568 A TW99121568 A TW 99121568A TW I516767 B TWI516767 B TW I516767B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- heme
- biological sample
- group
- compound
- acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44791—Microapparatus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本申請案係關於藉由毛細管電泳之糖化血紅素(具體而言血紅素A1c)之分析及測定領域。
本發明係關於一種藉由生物試樣之毛細管電泳來進行分析之方法,該生物試樣包含一種或若干種血紅素且具體而言一種或若干種糖化血紅素,以及係關於用於該分析之適當緩衝液組合物、及用於藉由毛細管電泳之糖化血紅素之分析及測定的套組。
血紅素(Hb)係通常包含四個亞單元之球形分子,各亞單元由結合至亞鐵血紅素部分之多肽鏈構成。多肽鏈籠統地由名稱血紅素分子之「珠蛋白部分」指示。
所有人類血紅素由四條多肽鏈構成,兩條相同鏈為一組分成兩組。在成年人類中,通常存在三種類型之血紅素:血紅素A(HbA),其佔絕大多數(其通常代表成年人中之約97%血紅素),其由2條α鏈及兩條β鏈構成(血紅素α2β2);血紅素A2(HbA2,其通常代表成年人中之約1-3%血紅素),其由兩條α鏈及兩條δ鏈構成(血紅素α2δ2);及胎兒血紅素(HbF),其由兩條α鏈及兩條γ鏈構成(血紅素α2γ2),其僅存在痕量(在成年人中通常小於1%血紅素)且仍限於限制細胞群體(「F細胞」)。
血紅素含有稱為次要物質之物質;其係糖化血紅素。
糖化血紅素(亦稱為糖基化血紅素或糖基血紅素)對應於藉由在珠蛋白之胺官能團(NH2)上結合糖(主要為葡萄糖)來修飾之血紅素分子組;血紅素之NH2基團與源自還原糖之醛基團發生縮合。隨後藉由Amadori重排穩定此非酶促反應。潛在糖化位點係血紅素之四條珠蛋白鏈(端視血紅素之類型為α鏈及β、δ、或γ鏈)的N-端胺基酸及血紅素之珠蛋白鏈中的游離胺基-胺基己酸基團(具體而言彼等離胺酸殘基)。
存在許多形式之糖化血紅素;其端視結合糖之數量、珠蛋白鏈及該等鏈上所結合糖之性質及該等糖於珠蛋白鏈上之位置而定。
當考慮任一NH2殘基上之糖化血紅素分子時,使用術語「總糖化血紅素」。
術語「血紅素A1(HbA1)」係指有一個糖分子鍵結至蛋白質一或兩條β鏈之N-端胺基酸的血紅素A分子。非均相之A1部分具體而言包含次要部分A1a、A1b及尤其A1c。血紅素A1a(HbA1a)包括血紅素A1a1(HbA1a1)(其中鍵結至N-端胺基酸之糖係1,6-二磷酸果糖)及血紅素A1a2(HbA1a2)(其中鍵結至N-端胺基酸之糖係葡萄糖-6-磷酸酯)。在血紅素A1b(HbA1b)之情形下,鍵結至N-端胺基酸之糖係丙酮酸根。最終,鍵結至血紅素A1c(HbA1c)之β鏈之N-端胺基酸的糖係葡萄糖;HbA1c係藉由使一個葡萄糖分子與β鏈之N-端纈胺酸的NH2基團縮合獲得,源自先前形成之不穩定醛亞胺(指示為不穩定HbA1c或preA1c)的重排(Amadori重排)形成穩定酮-胺。
最終,術語血紅素A0(HbA0)通常涵蓋不包含鍵結至β鏈之N-端位置處之胺基酸的糖之非糖化A血紅素及糖化A血紅素。
蛋白質糖化(尤其包括糖化血紅素且具體而言血紅素A1c)係由血液中過高濃度之糖造成(如同糖尿病之情形一般)。蛋白質之糖化會改變其功能,從而造成細胞損傷、組織損傷及血管老化,並參與若干疾病(例如,動脈硬化、腎能不全、糖尿病性視網膜病及白內障)之發展。血紅素一旦糖化則不能充分運輸氧。
在所包括之所有血紅素群及亞群中,HbA1c尤其令人感興趣,此乃因其用作患者之糖尿病狀態的長效標記。HbA1c之形成取決於血糖(血液中之葡萄糖濃度)。其參與紅血細胞之壽命的整個過程,通常為120天。因而,HbA1c之血液濃度指示測定前2-3個月期間之平均血糖。HbA1c之血液濃度的評價可指示該階段期間之長期高血糖症。HbA1c之血液濃度並不受血液葡萄糖量之短期波動的影響。因而,藉由量測兩個日期之間之HbA1c含量,可監測糖尿病之演化。
在糖尿病患者中,目的係獲得與特徵為良好血糖平衡之圖表盡可能接近之HbA1c含量。在血液中,與A血紅素(糖化血紅素及非糖化血紅素)之總濃度相比,具有正常血糖之非糖尿病人類之參照值係4%至6% HbA1c(即,20-42 mmol/莫耳;Panteghini等人,2007)。
因而,人們對糖化血紅素之檢測、具體而言HbA1c含量升高之檢測用於診斷糖尿病(1型或2型)或監測糖尿病患者、具體而言用於評價抵抗糖尿病(1型或2型)之治療功效的應用十分關注HbA1c含量。
然而,闡釋結果偶爾可較為困難,此乃因許多因素(具體而言異常血紅素之存在)可竄改該等結果。
實際上,在某些患者中出現稱為「異常」或變體、具體而言由字母S、C、D、E、H及J表示之血紅素。血紅素A部分或完全由一種或若干種異常血紅素替代。具體而言,其源自某些珠蛋白鏈之合成減少及/或藉由另一胺基酸取代一胺基酸來修飾α、β、γ或δ鏈之結構。因而,β鏈之修飾可(例如)產生S或C血紅素(其中β鏈中6位置之麩胺酸分別經纈胺酸或離胺酸取代之α2β2血紅素)。
該等異常血紅素亦容易發生糖化。因而,存在與HbA1c一樣包含一個鍵結至β鏈上之N-端纈胺酸之葡萄糖分子的血紅素S1c(HbS1c)及C1c(HbC1c)(Abraham等人,1984)。
糖化血紅素且具體而言血紅素HbA1c之分析及測定方法可分為2大類。
第一類(主要類)包括諸如免疫測定或親和層析等方法。其係基於鍵結至血紅素之糖分子的結構特徵。作為一實例,Wilson等人之1993之公開案及專利US 6,162,645闡述一種藉由親和層析測定人類血樣中發現之糖化血紅素的方法。該方法係基於使用經由聚陰離子化合物(例如,聚丙烯酸)偶聯至酸(boronic acid)、苯基酸、硼酸(boric acid)或類似酸根基化合物之固體帶正電相。當用該固相培育欲分析血樣時,使該試樣中存在之糖化血紅素分子的葡萄糖殘基與酸根基化合物複合。由此將糖化血紅素分子接枝於固相上。隨後可相對於未固定血紅素之比例對固定於固相上之糖化血紅素的比例進行定量。藉由量測螢光之消光度(Wilson等人,1993)或藉由使用針對人類血紅素之標記抗體(US 6,162,645)實施此測定。
用於糖化血紅素分析及測定之第二類方法包括離子交換層析或電泳。其利用分子之理化特性且係基於糖化蛋白質與非糖化蛋白質之間存在之電荷差。
在闡述於文獻中之可測定糖化血紅素的各種分析方法中,電泳方法分成若干類:凝膠分析包括聚丙烯醯胺凝膠等電聚焦分析(Beccaria,1978;Simon,1982;Stickland,1982;Bosisio,1994)及瓊脂糖凝膠分析(US 5,246,558;US 4,222,836;Menard,1980)。毛細管電泳分析包括等電聚焦分析(Molteni,1994;Hempe,1994)、使用抗-A1c抗體之自由溶液分析(US 5,431,793)、使用裸毛細管之自由溶液分析(US 5,599,433)及使用動態塗佈之自由溶液分析(EP 0 733 900 A2;US 5,611,903)。
藉由生物試樣之電泳來進行之分析可分離試樣中存在之各種蛋白質、具體而各種血紅素,且使得能夠測定生物試樣中之一種或若干種目標蛋白質的量及/或比例。在毛細管電泳中,在填充有電解質之毛細管中,生物試樣之蛋白質隨其質量及其電荷之變化在電場效應下自陽極遷移至陰極。其由此產生包含一系列峰(亦稱為部分)之電泳遷移曲線,該等峰之每一者對應於一種或若干種蛋白質。異常血紅素(例如HbS、HbC及HbE)具有不同於HbA之電泳遷移率。此外,由於鍵結至β鏈之N-端胺基酸的糖殘基,HbA1具有減少之等電點且因此具有稍微不同於其他HbA0型血紅素之電荷。因而,在電泳領域中或在離子交換樹脂中,HbA1之遷移速率不同於HbA0之遷移速率,此使得可分離具有不同電荷之HbA1與HbA0。
毛細管電泳之優勢亦在於以下事實:僅需要極少量欲分析之生物試樣。此外,藉由此技術之分離可極為快速,此乃因在分離期間可使用高電壓而不會造成試樣加熱過度。
在經塗佈毛細管中實施藉由等電聚焦之分析(Molteni,1994;Hempe,1994)。使用甲基纖維素進行塗佈。所用陰極電解質係氫氧化鈉(NaOH)且陽極電解質係磷酸(H3PO4)。藉由使用兩性電解質,此分析使得能夠分離血紅素之各種變體,包括HbA1c,其之峰極其接近HbA之峰(ΔpI<0.10)。儘管此方法之功能良好,但按常規並不易於實施且需極大精確度、具體而言關於兩性電解質之pH範圍(HbA1c之等電點(pI)極為接近HbA0之等電點)。
在鹼性pH(pH 8-10)之硼酸鹽緩衝液中使用已與抗HbA1c單株抗體反應之試樣以抗-HbA1c抗體實施自由溶液分析(US 5,431,793)。更確切而言,使用未預先與抗-HbA1c抗體反應之工作試樣產生第一電泳圖。獲得單峰,面積為x,其含有所有血紅素(包括HbA1c)。藉由分析已與抗-HbA1c抗體接觸之工作試樣獲得第二電泳圖。由此分離未結合之抗-HbA1c抗體、抗-HbA1c抗體/HbA1c複合物及未複合抗體之血紅素。隨後藉由第一電泳圖之峰下面積與第二電泳圖中未複合抗-HbA1c抗體之血紅素之峰下面積(面積為y)之間之差值(即x-y值)來測定HbA1c之量。由此證明此方法實施起來耗時且複雜。
使用裸毛細管之自由溶液分析方法(US 5,599,433)於鹼性pH(pH 9-12)下包括結合至血紅素之糖複合劑(硼酸鹽)及兩性緩衝液(CAPS)。在所述條件下獲得之曲線(示於本申請案之圖1中)顯示HbA1之峰(在專利US-5,599,433中闡述為HbA1c之峰)與HbA0之峰(參見實例1)之分離相當小。此外,純化次要部分之分析顯示HbA1a、A1b部分與HbA1c共遷移,此會干擾最終測定結果(參見本申請案之實例2及圖2)。事實上,該技術分離HbA0與HbA1部分,但不分離HbA1部分本身。
利用動態雙塗佈之毛細管分析的技術(EP 0 733 900 A2;US 5,611,903)僅用於基於市售毛細管電泳(Analis CEofixTM HbA1c套組)之測試。其由用含有多價陽離子之「起始劑」(存於溶液中,pH 4.6)首次洗滌毛細管組成,從而用該多價陽離子塗佈毛細管壁。隨後利用含有聚陰離子之分析緩衝液(pH 4.6)實施第二次洗滌,其具有藉由與多價陽離子相互作用提供第二塗佈層之效應。則毛細管內壁上存在之負電荷的量甚至比裸毛細管上者高,從而產生更高電滲回流。所分析各種形式血紅素(包括糖化A1血紅素)之間獲得之拆分係令人滿意的,分析時間較短。自實踐角度來講,必須在每一分析之間使用由套組製造商提供之精確程序重新施加此雙重塗佈,但該程序僅針對單毛細管設備((P/ACE,Beckman),不適於常規分析)闡述。
因而,業內需要可有效分離糖化血紅素(具體而言HbA1c)與含有其他血紅素之生物試樣中存在之其他血紅素、變體、干擾形式(不穩定形式、乙醯基化形式、胺甲醯化形式)及其他次要部分(尤其HbA1a及HbA1b)之試劑及簡單實踐方法。理想地,此一方法可直接自所得電泳曲線實施糖化血紅素(具體而言HbA1c)之半定量或定量測定。
本發明提出一種替代性毛細管電泳方法,其使得可對一種或若干種糖化血紅素實施半定量或定量分析,該(等)糖化血紅素包含於包含(具體而言)其他血紅素(糖化及/或非糖化)之生物試樣中且包含至少一條珠蛋白鏈,該珠蛋白鏈包含鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基。本發明之該方法利用鍵結至該等糖化血紅素之葡萄糖分子的結構特性及試樣之各種血紅素之間存在的電荷差。
本發明者已顯示,藉由使用特定緩衝液組合物可獲得糖化血紅素之大大改良之分離、且更具體而言HbA1c之大大改良之分離,該(等)糖化血紅素包含鍵結至至少一條珠蛋白鏈上、且具體而言鏈β上之N-端位置處的胺基酸之葡萄糖殘基。
本發明方法之優勢之一係:由於使用該緩衝液組合物,故對應於存於生物試樣中之一種或若干種類型之目標糖化血紅素(一種或若干種類型之血紅素,其包含鍵結至至少一條珠蛋白鏈N-端位置處的胺基酸之葡萄糖殘基,例如HbA1c)之電泳峰相對於不使用緩衝液組合物時可獲得之峰位置發生位移。此位移並不干擾試樣中其他蛋白質、具體而言其他血紅素(糖化及/或非糖化)的分離。具體而言,此使得可分離HbA1c與其他次要HbA1(具體而言HbA1a及HbA1b)。因此,意味著分析結果可可靠地讀取且可使得準確測定一種或若干種目標糖化血紅素,該(等)糖化血紅素包含一個或若干個葡萄糖殘基,其中一個葡萄糖鍵結至至少一條珠蛋白鏈之N-端位置處的胺基酸(例如,血紅素A1c)。
因而,本發明方法係用於確認糖尿病之診斷或監測糖尿病患者、具體而言用於評價抗糖尿病治療效力之所選方法。
因而,本申請案提供一種藉由糖化血紅素(一種或若干種糖化血紅素)之毛細管電泳來進行分析之方法,該(等)糖化血紅素包含包含於包含一種或若干種血紅素之生物試樣中的一個或若干個葡萄糖殘基,該方法包含使用包含至少一種化合物之緩衝液組合物,該化合物能夠專一性複合生物試樣之糖化血紅素(一種或若干種糖化血紅素)的葡萄糖殘基(一個或若干個殘基)並亦提供於鹼性pH(即大於7之pH)下具有若干負電荷之該等糖化血紅素。
本申請案上下文中所用術語「若干」意指至少兩個、即兩個或兩個以上,例如,2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上。
本申請案上下文中所用術語「至少一」意指一或若干。
本申請案上下文中所用術語「血紅素」意指血紅素之任一形式或部分(包括次要部分)(不管其正常或異常)、以及該等血紅素之許多變體(已闡述至少1000種血紅素變體)。
本申請案上下文中所用術語「糖化血紅素」意指任何藉由將一個或若干個糖(具體而言,一個或若干個葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸酯、1,6-二磷酸果糖或丙酮酸根)結合至一條或若干條珠蛋白鏈(任何珠蛋白鏈)來修飾之血紅素。可將該(等)糖鍵結至珠蛋白鏈上之N-端位置處的胺基酸及/或鍵結至具有游離胺基酸基團之胺基酸(例如,離胺酸)。
本申請案中所用術語「珠蛋白鏈」意指熟習此項技術者已知之任一珠蛋白鏈、具體而言選自alpha(α)、beta(β)、delta(δ)及gamma(γ)鏈之鏈(不管其正常或異常)、或該等鏈中之一者的變體。根據一特定實施例,該「珠蛋白鏈」係β鏈,例如A1血紅素(具體而言A1c、S或C)之β鏈。
當在本發明實施例中提及「糖化血紅素」時,應瞭解,該等實施例對本申請案中引用之每一特定類型之糖化血紅素具有特定應用。
除非另有說明,否則本申請案中指示之每一實施例皆可獨立地及/或與任何一個或若干個其他所述實施例組合使用。
本發明之毛細管電泳分析方法適用於包含至少一種糖化血紅素之生物試樣,該糖化血紅素包含一個或若干個葡萄糖殘基且必須包含鍵結至一條或若干條珠蛋白鏈上且具體而言在β鏈上N-端位置處的胺基酸之葡萄糖殘基。在本申請案中,該等血紅素稱為「在N-端位置糖化之血紅素」。
該方法使得可分離一種或若干種在N-端位置糖化之血紅素與其他糖化血紅素(即,其中珠蛋白鏈無鍵結至N-端位置處的胺基酸之葡萄糖殘基的糖化血紅素)或非糖化血紅素(其可存在於分析之生物試樣中)。
根據一特定實施例,β鏈上N-端位置處之胺基酸係纈胺酸。
在一較佳實施例中,本發明之分析方法欲用於分析包含血紅素A1c之生物試樣。具體而言,其適於分離血紅素A1c與所分析生物試樣中可存在之其他血紅素或其他血紅素(以不同方式糖化或非糖化)、及(具體而言)其他次要部分(例如HbA1a及HbA1b)。
根據一特定實施例,本發明之分析方法可分離血紅素S1c及/或血紅素C1c與所分析生物試樣中可存在之其他血紅素(不同糖化或非糖化)。
術語「緩衝液組合物」意指儘管添加少量酸或鹼或儘管稀釋仍保留大約相同pH之組合物、具體而言溶液。
在本申請案中使用術語「複合」(「to complex」或「complexing」)表示在兩個實體之間、具體而言在兩個分子(例如,小分子及大分子)之間經由官能團發生聯合(化學或簡單物理聯合)。
在一較佳實施例中,該兩個實體中之一者(能夠複合葡萄糖殘基之化合物)與來自另一實體(糖化血紅素)之葡萄糖殘基之順式-二醇基團、具體而言兩個鄰位羥基組合(例如,與其反應)。
如可在「實例」部分中所述,「專一性複合一種或若干種糖化血紅素之葡萄糖殘基並使該(等)糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷」在本申請案中意指本發明上下文中所用化合物使得對應於在N-端位置由葡萄糖糖化之血紅素的電泳遷移峰可位移出對應於在N-端位置由另一糖(例如,葡萄糖-6-磷酸酯、1,6-二磷酸果糖或丙酮酸根)糖化之血紅素的電泳遷移區以外,且較佳可位移出對應於試樣中其他血紅素之電泳遷移峰區域以外。因而,不包含與β鏈(具體而言A1a及A1b部分)之N-端胺基酸鍵結的任一葡萄糖殘基之次要部分並不干擾本發明方法之HbA1c分析。
作為一實例,在本發明上下文中,可使用以下測試證實化合物專一性複合一種或若干種糖化血紅素之葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷之能力:將含有糖化血紅素之各種純化部分且具體而言A0及A1c部分或A0、A1b及A1a部分之參考試樣(例如,「HbA1a、HbA1b混合物」、「A1c」及「A0」,來自Exocell,USA)引入含有以下緩衝液組合物之毛細管電泳毛細管中:200 mM CHES、20 mM腐胺、10 mM與120 mM之間(例如,30 mM或50 mM)之測試化合物、(若需要)2.5 g/l氯化鈉、水、及(若需要)將pH值調節至大於9(例如9.4)的鹼。隨後使用(例如)(Sebia)設備於415 nm之波長下實施裸毛細管自由溶液毛細管電泳。其後,研究所得電泳曲線;若對應於HbA1c之峰與對應於HbA0之峰之間(或者端視所用試樣之類型,對應於HbA1c之峰與對應於HbA0、HbA1b及HbA1a之峰之間)的分離完全,則在本發明意義上,測試化合物被視為能夠專一性複合葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷。相反,若對應於HbA1c之峰及對應於HbA1b之峰(或者端視所用試樣之類型,對應於HbA1c之峰及對應於HbA0、HbA1b及HbA1a之峰)疊置或重疊,則該測試化合物不被視為適用於實施本發明。
上文所指示測試中之測試化合物的濃度僅以指示方式給出;若在上文所指示測試上下文中濃度為10 mM至120 mM之測試化合物不可在對應於HbA1c之峰與對應於試樣之其他血紅素之峰之間產生足夠分離,則為獲得對應於HbA1c之峰的最佳分離可超出此濃度範圍。
在本發明上下文中可使用任一化合物(即,通常為有機分子)、任一抗體、多肽、肽、或在本發明意義上能夠專一性複合葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷之任一其他化合物。可使用熟習此項技術者已知之任一方法產生適當抗體且其可為(例如)多株或單株抗體、嵌合抗體或抗體片段(例如,Fab片段)。
如可在「實例」部分中所述,硼酸並非在本發明意義上能夠專一性複合葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷之化合物,此乃因其並不使得可實施可靠分析且具體而言糖化血紅素且(具體而言)HbA1c之可靠測定。下文更詳細定義適當化合物之實例。
與能夠專一性複合葡萄糖殘基之化合物複合的每一葡萄糖殘基與不同化合物分子相互作用。
根據一特定實施例,當該化合物以足量存於本發明緩衝液組合物中時,其尤其能夠專一性複合糖化血紅素之N-端葡萄糖殘基,即對於包含鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基的每一珠蛋白鏈(具體而言β鏈)而言,能夠專一性複合該葡萄糖殘基。因而,該化合物能夠專一性複合在A1c血紅素或S1c或C1c血紅素之β鏈N-端位置處鍵結之每一葡萄糖殘基。
根據一特定實施例,當在本發明緩衝液組合物中存在足量該化合物時,其能夠專一性複合在N-端位置處由葡萄糖糖化之血紅素的所有葡萄糖殘基。
根據一特定實施例,當在本發明緩衝液組合物中存在足量該化合物時,不管其在珠蛋白鏈上之位置如何,該化合物均能夠專一性複合血紅素之所有葡萄糖殘基。因而,當該化合物在本發明緩衝液組合物中存在足量時,包含數量為x之葡萄糖殘基的血紅素分子可結合數量為x之該化合物分子。
藉由與生物試樣中糖化血紅素之一個或若干個葡萄糖殘基專一性複合,該化合物使該(等)糖化血紅素在鹼性pH下具有若干負電荷,即,使得該等糖化血紅於鹼性pH下能夠帶有額外負電荷。
該化合物可使與其複合之相同血紅素的每一葡萄糖殘基皆於鹼性pH下帶有若干負電荷。由於在鹼性pH下此提供負電荷,故由於包含至少一個葡萄糖殘基之血紅素與該化合物複合,其電泳遷移率得以改良。此係在電泳曲線上藉由對應於糖化血紅素之電泳峰之位移來表現,該等糖化血紅素包含一個或若干個葡萄糖殘基且存在於所分析生物試樣中。
包含至少一個葡萄糖殘基且存於生物試樣中的所有血紅素與複合葡萄糖並於鹼性pH下提供負電荷之化合物形成複合物(當然,前提條件為該化合物存在足量以與該等血紅素之每一者複合)。然而,不同血紅素且具體而言包含至少一個葡萄糖殘基之不同血紅素均具有不同等電點(由於其珠蛋白鏈之性質、彼等珠蛋白鏈上之葡萄糖殘基的數量及位置、及可鍵結至該血紅素之其他糖的數量、性質及位置)。由於藉由每一葡萄糖殘基與該化合物複合而在鹼性pH下產生負電荷,該等不同血紅素之間之電荷差異在其呈與該化合物複合之形式時甚至更顯著。
包括鍵結至糖化血紅素之珠蛋白鏈之至少一者上(具體而言在β鏈上)之N-端位置處的胺基酸之葡萄糖殘基的糖化血紅素由此比其他血紅素(不同糖化或非糖化)多至少一個葡萄糖。具體而言,血紅素A1c在β鏈上比血紅素A1之其他次要部分多至少一個葡萄糖。因此,該等在N-端位置處糖化之血紅素當根據本發明與該化合物複合時在鹼性pH下載有比其他血紅素(不包含鍵結至珠蛋白鏈之N-端胺基酸之葡萄糖殘基的糖化血紅素或非糖化血紅素)更多之負電荷。
因而,藉由增大包含葡萄糖之不同血紅素之間及/或包含葡萄糖之一種或若干種血紅素與所分析生物試樣中存在之其他血紅素之間存在的電泳遷移率之差,可在N-端位置處糖化之一種或若干種血紅素與該試樣中可能存在之其他血紅素之間、具體而言在血紅素A1c與該試樣中可能存在之血紅素A1血紅素之其他次要部分之間達成更好分離。
因而,本發明方法可有效分離在N-端位置糖化之血紅素(具體而言HbA1c)與含有其他血紅素之生物試樣中存在之其他血紅素、某些變體及其他次要部分。此外,習用干擾分子(例如,不穩定、乙醯基化或胺甲醯化形式)並不干擾使用本發明方法之HbA1c的測定。具體而言,本發明方法使得能夠在電泳分離步驟期間避免干擾,該等干擾可能係在鹼性pH下不存在藉由複合提供之負電荷時由血紅素A1c及生物試樣中存在之血紅素A1(包括HbA1a及HbA1b)的其他次要部分的共遷移所致。
隨後可在所分析生物試樣中可存在之另一或其他血紅素存在下測定N-端位置處糖化之經分離血紅素。因而,作為一實例,可在血紅素A1之其他次要部分存在下且具體而言在HbA1a及/或HbA1b存在下測定HbA1c,且所分析生物試樣中存在之該等其他次要部分不干擾該測定。
本申請案中之術語「測定」(「to assay」或「assay」)意指可能在所分析生物試樣之一種或若干種其他血紅素存在下測定目標血紅素之量及/或測定該(等)目標血紅素相對於該試樣中存在之血紅素總量或某些血紅素之量的比例。
在本發明上下文中實施之測定可為半定量測定,因而,量測給定血紅素相對於該試樣中存在之另一血紅素或其他血紅素之量的百分比。因而,在HbA1c情形下,通常量測HbA1c相對於一種或若干種其他A血紅素之量的百分比;通常用對應於HbA1c之電泳峰面積除以對應於HbA0之峰面積或除以(對應於HbA1c之峰面積+對應於HbA0之峰面積)之和、或除以所有HbA峰面積之和或除以(對應於HbA1c之峰面積+對應於HbA0之峰面積+對應於HbA2之峰面積)之和、或甚至除以電泳曲線之總表面積。
測定亦可為定量測定;隨後以該生物試樣中存在之給定血紅素之毫莫耳數(mmol)/莫耳另一血紅素或其他血紅素、例如以HbA1c之毫莫耳數/莫耳HbA來表示該等結果。
根據本發明之一特定實施例,專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並使該等糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷之化合物包含若干官能團、具體而言兩個或兩個以上官能團。
該等官能團之至少一者藉由與(例如)葡萄糖殘基之順式-二醇基團、具體而言兩個鄰位羥基相互作用而專一性複合葡萄糖殘基(具體而言,鍵結至珠蛋白鏈N-端位置處之胺基酸的葡萄糖殘基)。作為一實例,該(該等)基團可為酸根基團、具體而言如本申請案中所定義之酸根基團。
該(等)葡萄糖複合基團可使糖化血紅素中每個複合葡萄糖殘基皆在鹼性pH下具有一個負電荷,即使每個複合血紅素分子皆在鹼性pH下具有一個或若干個負電荷(若血紅素分子僅包含一個葡萄糖殘基則有一個負電荷,且若血紅素分子包含n個葡萄糖殘基則有n個負電荷)。
該化合物之另一官能團、其他官能團中之一者、或其他官能團(即,不與葡萄糖複合之官能團)可使糖化血紅素中之該血紅素分子之每個經複合葡萄糖殘基皆在鹼性pH下具有一個或若干個負電荷。
因而,在本發明之此特定實施例中,每個根據本發明專一性複合葡萄糖殘基之化合物分子皆包含至少一個能夠複合糖化血紅素之葡萄糖殘基(且具體而言在糖化血紅素N-端位置的N-端葡萄糖殘基)之官能團及至少一個並不複合葡萄糖但使得該糖化血紅素能夠在鹼性pH下帶有多個額外負電荷的官能團,此乃因該官能團使該糖化血紅素在鹼性pH下具有一個或若干個補加負電荷。能夠複合葡萄糖之官能團亦可在鹼性pH下提供負電荷。
根據本發明之一特定實施例,專一性複合葡萄糖殘基並於鹼性pH下提供負電荷之化合物(更確切而言該化合物之每一分子)可使糖化血紅素分子(且具體而言在N-端位置處糖化之血紅素)中該糖化血紅素分子之每一經複合葡萄糖殘基皆在鹼性pH下具有若干負電荷。較佳地,其使一個糖化血紅素分子中之每一複合葡萄糖殘基皆在鹼性pH下具有至少兩個(具體而言2個、3個、4個、5個或6個)負電荷。
根據本發明之一特定實施例,專一性複合葡萄糖殘基之一官能團或官能團中之至少一者在鹼性pH下帶有負電荷。
根據本發明之一特定實施例,能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並能使該等糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷之化合物包含一個或若干個可在鹼性pH下離子化(具體而言可陰離子化)之基團。該化合物可為各種類型。舉例而言,該化合物可包含一個或若干個羧酸根、羧基、磺酸根及/或磺醯基。具體而言,該化合物可為多羧酸、具體而言二羧酸或三羧酸。該化合物亦可為聚磺酸,具體而言二磺酸或三磺酸。
根據本發明之一特定實施例,可使糖化血紅素分子中該糖化血紅素分子之每一複合葡萄糖殘基在鹼性pH下具有一個或若干個負電荷之基團、多個基團中之一者或多個基團包含一個或若干個可在如本申請案中所定義鹼性pH下離子化之基團且具體而言一個或若干個(具體而言2個或3個)羧酸根、羧基、磺酸根及/或磺醯基或由其組成。
根據本發明之一特定實施例,專一性複合葡萄糖殘基之一基團、該等基團中之一者或該等基團包含一個或若干個酸根基團或由其組成。
在本申請案中,術語「酸根基團」意指具有下式之基團:
其中D1及D2彼此獨立地選自羥基及易於在水溶液中、具體而言在鹼性pH下水解以產生羥基之基團。
在本發明之一特定實施例中,該酸根基團係基團-B(OH)2(亦稱作酸基)或離子化形式(具體而言-B(OH)- 3)。
在本發明之一特定實施例中,能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並能使該等糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷之化合物係:
(i)酸根基化合物,其具有通式RB(OH)2(亦稱作酸之化合物)或具有通式RB(OH)- 3,其中基團R包含至少一個芳基及/或烷基(直鏈、具支鏈或環狀)及/或芳烷基及/或其組合,且該基團R可使糖化血紅素中與酸根基團複合之每一葡萄糖殘基在鹼性pH下具有一個或若干個負電荷;或
(ii)該酸根基化合物之鹽。
因而,在鹼性pH下,除在鹼性pH下由酸根基化合物或其鹽之酸基或酸根提供之負電荷外,基團R亦可使糖化血紅素中之與酸基或酸根基團複合之每一葡萄糖殘基具有一個或若干個補加負電荷。
在本申請案上下文中,術語「具有通式RB(OH)2之化合物」亦意指與其平衡之任一離子形式(具體而言RB(OH)- 3)、或端視介質之條件能夠與其平衡之任一形式。
在本申請案上下文中,術語「鹽」表示任一鹽且具體而言鈉鹽、鋰鹽或鉀鹽。
除芳基、烷基、芳烷官能團或其組合之一者外,本發明之酸根基化合物的基團R亦可包括其他官能團及/或雜原子。
根據一特定實施例,對於與本發明酸根基化合物或其鹽之酸基或酸根基團複合之每一葡萄糖殘基而言,在鹼性pH下基團R提供兩個或更多個(較佳兩個)負電荷。
根據一特定實施例,基團R由一個或若干個芳基、烷基(直鏈、具支鏈或環狀)及/或芳烷基及/或其組合組成。
根據一特定實施例,本發明酸根基化合物之基團R中存在的芳基、烷基、芳烷基或其他官能團及/或雜原子或其組合可經取代。
本申請案中所用術語「經取代」可表示經單取代或(相反)經多取代,例如,經二-、三-、四-、五-或六-取代。
具體而言,取代基可為在如本申請案中所定義鹼性pH下可離子化(具體而言,可陰離子化)之基團。基團R可包括一個或若干個雜原子、或其他官能團。
根據本發明之一特定實施例,酸根基化合物之基團R使糖化血紅素分子中之每一複合葡萄糖殘基在鹼性pH下具有一個或若干個負電荷。較佳地,其使糖化血紅素中之每一複合葡萄糖殘基在鹼性pH下具有一個、兩個、三個或四個負電荷。
如上文所定義酸根基化合物具體而言包含酸、且具體而言苯基酸。
根據本發明之一特定實施例,能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並能使該等糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷之化合物係經多取代之苯基酸酯、具體而言經二取代之苯基酸酯(例如經羧基及/或磺醯基二取代)。
根據本發明之一特定實施例,酸根基化合物或其鹽之基團R係二酸,具體而言二羧酸。根據本發明之一特定實施例,酸根基化合物係二羧基苯基酸、較佳選自3,5-二羧基苯基酸及3,4-二羧基苯基酸。
因而,舉例而言,所用酸根基化合物可為3,5-二羧基苯基酸(3,5-dCPBA)。此化合物可自(具體而言)供應商Combi-blocks公司(San Diego,USA)以商品名3,5-二羧基苯基酸及自Apollo Scientific有限公司(Cheshire,United Kingdom)以商品名3,5-二羧基苯酸購得。
在本發明緩衝液組合物中,能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並能使該等糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷之化合物的濃度通常相對於蛋白質之總量、具體而言相對於生物試樣中存在之所有血紅素之總量或相對於生物試樣中存在之所有包含葡萄糖的血紅素之總量在化學計量上過量。因而,當試樣或一等份該試樣稀釋於緩衝液組合物中時,此化合物在緩衝液組合物中之量大於試樣中存在之血紅素的所有葡萄糖殘基被該化合物複合所需之量。因而,對於包含分析生物試樣中存在之葡萄糖的每一糖化血紅素分子而言,緩衝液組合物中之該化合物之分子數量至少與此糖化血紅素分子中存在之葡萄糖殘基之數量一樣多。此使得可完全分離糖化血紅素或目標糖化血紅素與分析生物試樣中亦存在之其他血紅素。
根據本發明之一特定實施例,在本發明緩衝液組合物中,能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並能使該等糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷之化合物的濃度在0.10 mM至100 mM範圍內、較佳在10 mM至60 mM範圍內、且更佳在20 mM至50 mM範圍內,例如30 mM或50 mM。
本申請案中所用表達「在x至y範圍內」意指界限x及y包括於所指示範圍x-y內。
根據一特定實施例,本發明之緩衝液組合物另外包含:
- 緩衝化合物,pKa在8.0至11.0範圍內;及/或
- 阻流劑;及/或
- 鹼;及/或
- 鹽;及/或
- 適當稀釋溶液,例如水。
因而,本發明之緩衝液組合物包含以下或由以下組成:(i)能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並能使該等糖化血紅素在鹼性pH下具有負電荷之化合物,及(ii)選自以下之一種或若干種且具體而言所有化合物:pKa在8.0至11.0範圍內之緩衝化合物、阻流劑、鹼、鹽、適當稀釋溶液(例如水)及其混合物。
緩衝化合物較佳係兩性離子化合物。具體而言,其可選自AMP、AMPD、AMPSO、二甘胺酸、CABS、CAPS、CAPSO、CHES、HEPBS、甲胺、TABS、TAPS、胺基乙磺酸、三(羥甲基)甲基甘胺酸及Tris;具體而言,選擇CAPS、CAPSO或CHES,較佳為CHES。該等化合物於目標pH(pH 8-11)下具有高緩衝能力且特別適用於獲得血紅素之良好聚焦。
緩衝化合物在本發明緩衝液組合物中之濃度通常在20 mM至500 mM範圍內、較佳在50 mM至400 mM範圍內、且更佳在100 mM至350 mM範圍內或在150 mM至300 mM範圍內,例如約200 mM或約300 mM。
阻流劑意欲增強電荷差之效應以獲得各種血紅素之間分離的良好拆分。此類型化合物藉由降低電滲透流量起作用,其會阻礙不同部分遷移且可增大其分離。所用阻流劑可為脂肪族二胺、具體而言選自1,3-二胺基丙烷、1,4-二胺基丁烷(腐胺)、1,5-二胺基戊烷(屍胺)、1,6-二胺基己烷、精胺及DETA之脂肪族二胺、或該脂肪族二胺之衍生物或其混合物。
本文所用術語「衍生物」意指脂肪族聚胺、環狀聚胺、鹽(例如鈉鹽)或其混合物中之一者。
根據本發明之一特定實施例,阻流劑係選自腐胺、其衍生物及其混合物。
根據本發明之一特定實施例,阻流劑係腐胺。具體而言,腐胺係呈純淨形式,視情況添加鹽。
根據本發明之另一特定實施例,阻流劑係腐胺鹽酸鹽(或腐胺-2HCl)。
在本發明之緩衝液組合物中,阻流劑之濃度有利地在0.10 mM至40 mM範圍內、較佳在10 mM至30 mM範圍內且更佳在15 mM至25 mM範圍內,例如20 mM。
視情況向緩衝液組合物中添加之鹼可調節該組合物之pH。具體而言,可使用屬於氫氧化物家族之鹼,具體而言選自以下之鹼:氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銣、氫氧化銫、氫氧化鈁、單-、二、三-或四-烷基銨氫氧化物、及其混合物。
根據本發明之一特定實施例,視情況向緩衝液組合物中添加之鹼係氫氧化鈉。
有利地,向緩衝液組合物中添加足夠鹼以使其pH係9.0或更大、較佳在9.0至11.0範圍內且更佳在9.0至10.0範圍內、例如在9.3至9.5範圍內、且仍更佳pH為9.4或9.5。9以上之鹼性pH可產生帶負電荷之血紅素部分(血紅素之等電點在6.05至7.63範圍內)。
根據本發明之一特定實施例,本發明緩衝液組合物中視情況存在之鹽係鈉鹽、較佳氯化鈉。緩衝液組合物可包含(例如)2.5 g/l氯化鈉。
根據本發明之一特定實施例,當緩衝液組合物包含腐胺、具體而言純腐胺時,其另外包含鹽(具體而言鈉鹽)、較佳氯化鈉、例如2.5 g/l氯化鈉。
根據本發明之另一特定實施例,緩衝液組合物包含腐胺鹽酸鹽、不包含氯化鈉且較佳不包含任一鹽。
根據本發明之一特定實施例,緩衝液組合物包含以下或由以下組成:
- 200 mM CAPSO;
- 10 mM腐胺(例如,腐胺-2HCl或純腐胺及氯化鈉);
- 50 mM 3,5-二羧基苯基酸;
- 水;及
- 若需要,鹼(例如氫氧化鈉),以將pH調節至(例如)大於9或10之值、且較佳調節至10.2之值;
或者,更佳地,由以下組成:
- 200 mM CAPSO;
- 15 mM腐胺(例如,腐胺-2HCl或純腐胺及氯化鈉);
- 100 mM 3,5-二羧基苯基酸;
- 水;及
- 若需要,鹼(例如氫氧化鈉),以將pH調節至(例如)大於9或10之值、且較佳調節至10.2之值;
或者,仍更佳地,由以下組成:
- 200 mM CHES;
- 20 mM腐胺(例如,腐胺-2HCl或純腐胺及氯化鈉);
- 30 mM 3,5-二羧基苯基酸;
- 水;及
- 若需要,鹼(例如氫氧化鈉),以將pH調節至(例如)大於9之值、且較佳調節至9.4之值。
根據本發明之另一特定實施例,緩衝液組合物包含上文所指示濃度之上文所指示組份、及一種或若干種鹽(具體而言鈉鹽、尤其氯化鈉、例如2.5 g/l氯化鈉)或由其組成。
如實例部分中所闡釋,該等緩衝液組合物使得能以自由溶液毛細管電泳領域中之獨特方式完美分離所分析生物試樣中存在之血紅素HbA1c與其他血紅素、以及相互分離各種次要部分(包括HbA1a、HbA1b及HbA1c)。
本申請案中所用術語「生物試樣」意指包含紅血細胞之任一生物流體。該生物流體可源自健康或患病人類患者(例如,糖尿病患者)或為(具體而言)源自非人類哺乳動物(健康或患病)之動物起源。該生物液體(人類或非人類哺乳動物)可為(例如)血液、具體而言正常或不正常血液、經洗滌、經傾析、經離心、經溶血血液或全血。生物試樣亦可為合成或純化起源。
本發明在血樣之分析中具有特定應用、具體而言用於源自糖尿病患者或源自糖尿病非人類哺乳動物之血樣的分析。
根據一特定實施例,該生物試樣包含以下或由以下組成:若干血紅素、具體而言包含鍵結至至少一條珠蛋白鏈上(例如在β鏈上)之N-端位置處的胺基酸之葡萄糖殘基的若干糖化血紅素、且更具體而言血紅素A1c。
可在藉由毛細管電泳分析之前用適宜稀釋溶液(例如,溶血溶液及/或分析緩衝溶液(具體而言本發明緩衝液組合物))稀釋所用生物試樣。較佳地,使用溶血血液試樣實施分析。
根據另一特定實施例,最初在溶血溶液中、隨後在本發明緩衝液組合物中稀釋生物試樣。
本申請案中所用術語「溶血溶液」表示能夠造成紅血細胞溶血、即破壞紅血細胞且由此釋放血紅素之溶液。端視其組成,其可視情況藉由利用小的額外機械動作(渦旋、攪拌等)實施紅血細胞之總裂解。溶血溶液可包括細胞裂解之常用添加劑,例如,Triton X100,其通常以1 g/L之濃度使用。溶血溶液亦可視情況包括能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並提供在如本申請案中所定義鹼性pH下具有負電荷之該等糖化血紅素的化合物。
舉例而言,溶血溶液可選自由以下組成之群:來自Sebia之溶血溶液血紅蛋白(e)、來自Sebia之溶血溶液MINICAP血紅蛋白(e)、來自Sebia之溶血溶液Hydragel HbA1c、純水、補充有表面活性劑之水、具體而言補充有Triton X100之水(例如,1 g/L Triton X100)及其混合物。
根據一特定實施例,藉由本發明毛細管電泳之分析方法包含以下步驟:
a) 將本發明之緩衝液組合物及生物試樣引入電泳毛細管中;及
b) 藉由毛細管電泳分離該生物試樣之各成份。
該兩個步驟通常在於(例如)溶血溶液中稀釋生物試樣之步驟之後。具體而言,此稀釋步驟可在試樣載體、例如在 (Sebia)稀釋段或MINICAP (Sebia)試樣杯中實施。
在步驟a)中,本發明之緩衝液組合物及生物試樣可單獨(同時或不同時)引入同一電泳毛細管中,隨後在毛細管中產生混合物。作為一實例,可首先引入本發明之緩衝液組合物,隨後將試樣引入電泳毛細管中。
或者,可在步驟a)中將呈與本發明緩衝液組合物之混合物形式的生物試樣引入電泳毛細管中。
端視所用毛細管電泳設備之類型及欲實施分析之數量的變化,使用單一毛細管或並列之若干毛細管。當使用單一毛細管時,此毛細管通常連續使用若干次以實施若干分析。當然,當使用若干毛細管時,若需要可在並列使用若干毛細管期間連續實施若干電泳遷移。
藉由毛細管電泳分離生物試樣之各成份的步驟(具體而言)由以下組成:向毛細管施加具有足夠電壓之電場以分離一種或若干種目標糖化血紅素與生物試樣中可存在之其他蛋白質且(具體而言)其他血紅素。
實施液體毛細管電泳之條件係熟習此項技術者針對將試樣及緩衝液組合物引入毛細管並藉由電泳遷移分離試樣之各成份的步驟之常用條件。所施加電場可為(例如)約400 V/cm。其通常包含用洗滌溶液洗滌毛細管、用分析所用緩衝液組合物洗滌、視情況將試樣稀釋一或多次、將試樣引入毛細管中、遷移及檢測。可藉由自動機器實施該等步驟。
實施毛細管電泳之條件係(例如)適於使用來自Sebia之自動機器或來自之MINICAP的條件。
通常在分離生物試樣中各成份之步驟之後實施檢測一種或若干種蛋白質、具體而言生物試樣中存在之一種或若干種血紅素、且更具體而言生物試樣中存在之一種或若干種目標糖化血紅素(例如血紅素A1c)之步驟。
具體而言,可藉由在(例如)約415 nm之波長下(其對血紅素具有專一性)量測吸光率來實施此檢測步驟;可在約200 nm之波長下分析血紅素,但為了避免干擾血漿蛋白,具體而言,較佳可在415 nm之波長下對其進行分析。
在本發明上下文中,可如實例中所闡釋呈自與所檢測血紅素之量成正比的檢測信號產生之電泳曲線的形式提供電泳分離之結果。因而,本發明方法通常另外包含自檢測信號產生電泳圖之步驟。
如上文所指示,當所分析生物試樣中存在目標血紅素時,可對其進行定量。為此,測定對應於該血紅素之峰的表面積。
因而,該方法通常亦包含以下步驟:具體而言自電泳圖測定生物試樣中所存在一種或若干種血紅素之量及/或生物試樣中所存在一種或若干種血紅素相對於生物試樣中存在之蛋白質總量、血紅素總量及/或某些血紅素之量(例如,相對於HbA或HbA0之量)之比例。具體而言,可測定生物試樣中存在之糖化血紅素A1c、S1c及/或C1c相對於生物試樣中存在之所有血紅素總量或相對於某些血紅素之量(例如,分別相對於A、S及/或C血紅素之總量)的比例。
在本發明之一個特定實施例中,可直接自電泳曲線獲得此測定。
根據本發明之一特定實施例,該分析方法亦包含相對於一種或若干種標準化校正劑(例如,一種或若干種參考生物試樣)對所分析生物試樣中存在之一種或若干種血紅素進行定量之步驟;此使得可使結果標準化。
因而,為在測定期間獲得高精確位準,通常在每次運轉電泳設備時使用參考生物試樣(例如,含有已知濃度之不同天然及/或合成糖化血紅素部分之標準試樣,若需要經純化)校正每一毛細管。作為一實例,為測定HbA1c,通常使用至少兩種校正劑,例如,包含已知高濃度HbA1c之第一校正劑及包含已知低濃度HbA1c之第二校正劑。隨後,利用電泳設備之每一毛細管量測每一毛細管中存在之HbA1c之量。此使得能夠為每一毛細管建立回歸曲線(在至少兩個點上),且因而可歸一化使用各種毛細管實施之量測。此亦使得可藉由使用由毛細管之此方法測定之HbA1c值相對於參考方法來標準化所得結果。
根據本發明之一特定實施例,所實施之毛細管電泳係自由溶液毛細管電泳,具體而言係裸毛細管自由溶液毛細管電泳。
自毛細管所用材料角度來講,利用彼等對毛細管電泳正常者。專家能夠改變毛細管之性質及分析所需之其尺寸。
作為一實例,在一特定實施例中,電泳毛細管係熔融氧化矽。
本發明亦係關於本發明之毛細管電泳分析方法的用途,其用於分離一種或若干種包含葡萄糖之糖化血紅素、更確切而言一種或若干種各自在一條或若干條珠蛋白鏈上(例如,β鏈上)包含與N-端位置處之胺基酸鍵結之一個或若干個葡萄糖殘基的糖化血紅素與生物試樣中存在之其他蛋白質、具體而言至少一種另一血紅素、較佳其他血紅素,及(若適當)測定該(等)糖化血紅素。
本發明亦係關於適於生物試樣之毛細管電泳分析之緩衝液組合物,該生物試樣包含血紅素且具體而言一種或若干種糖化血紅素、更具體而言一種或若干種包含一條或若干條珠蛋白鏈上(例如,在β鏈上)之一個或若干個葡萄糖的糖化血紅素。該緩衝液組合物包含至少一種能夠專一性複合物糖化血紅素之葡萄糖殘基亦及能使該(等)血紅素在鹼性pH下具有若干負電荷之化合物。
具體而言,該緩衝液組合物用於實施本申請案中所提供生物試樣之毛細管電泳的方法。
具體而言,根據本發明之一特定實施例,緩衝液組合物包含多羧酸酸、具體而言二羧酸或三羧酸(例如3,5-二羧基苯基酸)作為可專一性複合葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷之化合物。
根據本發明之另一特定實施例,除能夠專一性複合葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷之化合物外,緩衝液組合物亦包含以下:
- 阻流劑;及/或
- 緩衝化合物,pKa在8.0至11.0範圍內;及/或
- 鹼;及/或
- 鹽(具體而言鈉鹽,例如氯化鈉);及/或
- 適當稀釋溶液,例如水。
該等各種成份可如本申請案中所定義。
根據本發明之一特定實施例,緩衝液組合物之pH為9.0或更大、較佳地pH在9.0至11.0範圍內且更佳地pH在9.0至10.0範圍內,例如pH在9.3至9.5範圍內且仍更佳地pH為9.4。具體而言,該pH可藉由提供足量如上文所定義鹼而獲得。
本發明之緩衝液組合物係以分析緩衝液組合物之常用方式、即藉由將呈液體形式或呈欲稀釋之固體形式的成份提供至可接受之載體來製備。通常,載體係蒸餾或去礦物質水。
本發明亦係關於一種套組,其包含本發明之緩衝液組合物及(若適當)使用說明以實施電泳分析。換言之,本發明之套組可包含本發明之緩衝液組合物及包裝材料及(若適當)使用說明或由其組成。
因而,本發明之套組(具體而言)包含能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並在如本申請案中所定義鹼性pH下提供負電荷之化合物。當該套組除該化合物外亦包含其他化合物、具體而言選自以下之一種或若干種化合物時,該套組之各種化合物可經包裝用以臨時混合,或相反可包裝在一起(具體而言在相同組合物中,呈混合物形式):pKa在8.0至11.0範圍內之緩衝化合物、阻流劑、鹼、鹽(具體而言鈉鹽,例如氯化鈉)、適當稀釋溶液(例如水)及其混合物。或者,該套組之某些化合物可單獨包裝,而其他化合物可包裝在一起(具體而言呈混合物形式)。
根據本發明之一特定實施例,提供一份或若干份本發明緩衝液組合物,在分析之前由使用者對其進行重構。因此,可克服當(例如)該組合物之所有組份或一些組份以混合物形式包裝時可能產生之關於穩定性的問題。
本發明之套組亦可包含一種或若干種洗滌毛細管用溶液及/或一種或若干種稀釋段及/或一種或若干種適於稀釋欲分析生物試樣之溶液(例如,溶血溶液、具體而言如本申請案中所定義溶血溶液)及/或一種或若干種使得能夠校正各毛細管之參考生物試樣(例如,天然及/或合成糖化部分,若需要可純化)。
本發明亦係關於如本申請案中所定義之緩衝液組合物的用途及/或本發明套組,其用於藉由毛細管電泳分析包含一個或若干個葡萄糖殘基之(一種或若干種)糖化血紅素,具體而言包含一種或若干種血紅素之生物試樣中所含之A1c、S1c及C1c血紅素。
本發明亦係關於如本申請案中所定義緩衝液組合物及/或本發明套組及/或能夠專一性複合糖化血紅素(一種或若干種糖化血紅素)之葡萄糖殘基(一個或若干個)並能使該或該等糖化血紅素在鹼性pH下具有若干負電荷之化合物的用途,其用於藉由毛細管電泳分離包含鍵結至至少一條珠蛋白鏈上(例如,在β鏈上)之N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基的一種或若干種糖化血紅素,且更具體而言藉由毛細管電泳分離血紅素A1c與生物試樣中存在之其他蛋白質、具體而言至少一種另一血紅素及較佳其他血紅素及(若適當)測定該(等)血紅素。
具體而言,本發明之緩衝液組合物、本發明之套組及/或能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並在如本申請案中所定義鹼性pH下提供負電荷之化合物適用於(例如)本發明方法之上下文中用於診斷人類或非人類哺乳動物之糖尿病及/或用於監測人類或非人類哺乳動物(具體而言糖尿病個體)之血糖平衡、具體而言評價抵抗糖尿病之治療功效及/或適應糖尿病個體之糖尿病治療。隨後所分析之該(等)生物試樣源自該人類或非人類哺乳動物。
本申請案中所用術語「糖尿病」表示1型及/或2型糖尿病。
本發明亦係關於本發明之緩衝液組合物、本發明之套組及/或能夠專一性複合糖化血紅素之葡萄糖殘基並在如本申請案中所定義鹼性pH下提供負電荷之化合物的用途,其用於製造診斷性套組。具體而言,該診斷性套組可用於診斷人類或非人類哺乳動物之糖尿病及/或監測人類或非人類哺乳動物(具體而言糖尿病個體)之血糖平衡。該套組由此可評價抵抗患有糖尿病之人類或非人類哺乳動物之糖尿病的治療功效及/或可適應抵抗糖尿病個體之糖尿病的治療。
人類非糖尿病中之HbA1c含量通常在4%至6%範圍內(即,在血液中20-42毫莫耳HbA1c/莫耳血紅素),且在糖尿病患者(未治療)中為7%以上。
倘若HbA1c含量在6%至7%範圍內(即,在血液中之濃度為42-53毫莫耳HbA1c/莫耳血紅素),建議開始抗糖尿病治療。
倘若超過8%之閾值(其等效於血液中64毫莫耳HbA1c/莫耳血紅素之濃度)(Panteghini及John,2007),則患者發生糖尿病併發症(微血管病、大血管病等)中之一者之風險增大。則建議可修改患者之抗糖尿病治療。
自闡釋本發明之以下實例及圖可明瞭本發明之其他特徵及優勢。
分離原則係於鹼性pH(pH>9)下之自由溶液毛細管電泳以獲得帶負電荷之血紅素部分(血紅素之等電點在6.05至7.63範圍內)。
在提供有8個熔融氧化矽毛細管(內徑為25微米、有用長度為16 cm且總長度為18 cm)之毛細管電泳設備((Sebia)毛細管電泳系統)上、或在提供有一個熔融氧化矽毛細管(內徑為25微米、有用長度為24 cm且總長度為32 cm)之毛細管電泳設備上(來自Agilent Technologies之3DCE毛細管電泳系統)實施生物試樣之毛細管電泳。
在425 nm之波長下實施檢測。在溶血溶液(存於水中之1 g/L Triton X100)中稀釋血樣並藉由流體動力注射進行注射。在每次分析之前用0.25 M氫氧化鈉、隨後用緩衝液組合物洗滌毛細管。
實施毛細管電泳之緩衝液組合物包含水、pKa在8至11範圍內之緩衝化合物(端視情形為CAPS、CAPSO或CHES)、可將pH調節至期望值之鹼、可選阻流劑(腐胺)、及可選硼酸化合物(硼酸)或酸鹽。
自Combi-blocks公司(San Diego,USA)及Apollo Scientific有限公司(Cheshire,United Kingdom)獲得3,5-二羧基苯基酸(3,5-dCPBA)。
藉由穩定的BoroChem SAS(Caen,France)合成3,4-二羧基苯基酸(3,4-dCPBA)。
實例1
自在溶血溶液(溶解於去礦物質水中之1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6之正常人類血液(包含血紅素HbA0、HbA1及HbA2)使用專利US 5,599,433中所述分析緩衝液來實施毛細管電泳,該分析緩衝液含有100 mM CAPS及300 mM硼酸,pH為11。所得電泳圖展示於圖1中。血紅素之各峰之間的分離較不明顯。
實例2
自含有糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣(Exocell,USA)使用專利US 5,599,433中所述分析緩衝液實施毛細管電泳,該分析緩衝液含有100 mM CAPS及300 mM硼酸,pH為10.20。所得A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖2中。HbA1c與HbA1a、A1b血紅素之間之分離不夠清晰;HbA1c電泳峰覆蓋HbA1a/HbA1b峰。
實例3
自含有糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣(Exocell,USA)使用緩衝液組合物實施毛細管電泳,該緩衝液組合物含有200 mM CAPSO及10 mM腐胺(pH 10.20),但不含硼酸化合物亦不含酸根基化合物。所得A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖3中。對應於HbA1c之峰與HbAo之峰共遷移。
實例4
自含有糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣(Exocell,USA)使用含有200 mM CAPSO、10 mM腐胺及50 mM硼酸鹽之緩衝液組合物(pH 10.20)實施毛細管電泳。所得A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖4中。對應於HbA1c之峰位於對應於HbAo及HbA1a/HbA1b之峰之間且太靠近對應於其他HbA1之峰以致於不能可靠測定HbA1c。
實例5
自含有糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣(Exocell,USA)使用含有200 mM CAPSO、10 mM腐胺及50 mM 3-羧基苯基酸之緩衝液組合物(pH 10.20)實施毛細管電泳。所得A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖5中。對應於HbA1c之峰位於對應於HbA1b及HbA1a之峰之間。
實例6
自含有糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣(Exocell,USA)使用含有200 mM CAPSO、10 mM DAB及50 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(pH 10.20)實施毛細管電泳。所得A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖6中。對應於HbA1c之峰位於對應於HbA1b及HbA1a之峰之後。
實例7
自含有糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣(Exocell,USA)使用含有200 mM CAPSO、15 mM阻流劑(腐胺)及100 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(pH 10.20)實施毛細管電泳。所得A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖7中。對應於HbA1c之峰位於對應於HbA1b及HbA1a之峰之後且不同於該等峰;血紅素HbA1c與血紅素HbA1a及HbA1b之間之分離極佳。
實例8
自含有HbA0及/或糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣使用含有200 mM CHES、20 mM阻流劑(腐胺)及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)實施毛細管電泳。所得A0、A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖8中。對應於HbA1c之峰位於對應於HbA0、HbA1b及HbA1a之峰之後且明顯不同於該等峰;血紅素HbA1c與HbA1a及HbA1b血紅素之間之分離極佳。
實例9
自含有HbA0及/或糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣使用含有200 mM CHES、20 mM阻流劑(腐胺)及30 mM 3,4-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)實施毛細管電泳。所得A0、A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖9中。可看出,對應於HbA1c之峰位於對應於HbA0、HbA1b及HbA1a之峰之後且明顯不同於該等峰;血紅素HbA1c與HbA1a及HbA1b血紅素之間之分離極佳。
藉由比較實例8及9之電泳曲線,可看出,3,5-二羧基苯基酸可在分離與其他部分相比之HbA1c方面產生稍微較好結果,而3,4-二羧基苯基酸可獲得聚焦方面之稍微較好結果。
實例10
自含有糖化血紅素之不同純化部分(部分A0及A1c或部分A0、A1b及A1a)的參考試樣(Exocell,USA)使用含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)在(Sebia)上實施毛細管電泳。所得A1a、A1b及A1c之標準電泳曲線展示於圖10中。可看出,對應於HbA1c之峰位於對應於HbA1b及HbA1a之峰之後且明顯不同於該等峰;血紅素HbA1c與HbA1a及HbA1b血紅素之間之分離極佳。
實例11
使用含有200 mM CAPSO緩衝液、10 mM腐胺及50 mM 3,5-二羧基苯基酸(於pH 10.20下)、或200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸(於pH 9.40下)之緩衝液組合物對在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6的正常人類血液實施藉由毛細管電泳之分析。在(Sebia)上使用未經塗佈之熔融氧化矽毛細管獲得的電泳圖分別展示於圖11A及11B中。在兩種情形下,觀察到血紅素HbA1c與其他血紅素形式完全分離。
實例12
研究緩衝液組合物中之3,5-二羧基苯基酸的濃度對A1c與Ao血紅素之間之分離的影響。所用緩衝液組合物含有200 mM CAPSO、15 mM腐胺及0-120 mM 3,5-二羧基苯基酸。結果展示於圖12中。A1c/Ao分離隨著3,5-二羧基苯基酸濃度之增大而增大。
實例13
在(Sebia)上使用在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6之四種不同試樣實施毛細管電泳:包含HbE變體之正常人類血液(圖13)、AFSC對照(圖14)、包含F及Bart變體之正常血液集合(圖15)及包含HbD變體之正常人類血液(圖16)。在含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)中使用未經塗佈之熔融氧化矽毛細管實施毛細管電泳
圖13至16顯示血紅素之主要變體(E、F、S、C、D及Bart)不干擾HbA1c部分。然而,應注意,在Bart血紅素之情形下,Hb Bart與HbA1c部分之間之拆分並不完全。因此,為了能夠在Hb Bart存在下測定HbA1c,該兩個部分應能夠使用適宜整合方法進行定量。若不可能進行此定量,則需要就此警告使用者,以防其觀察到此類在預期峰上具有峰肩之曲線。
實例14
將藉由本發明方法使用(Sebia)分析儀藉由毛細管電泳獲得之結果與利用參考技術中之一者:利用Variant II (Bio-Rad)分析儀之HPLC獲得的結果進行比較。
在含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物中於pH 9.40下自在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)稀釋至1/6之全血實施毛細管電泳。
圖17顯示藉由毛細管電泳之分析的此新穎技術與藉由利用來自Bio-Rad之Variant II 之HPLC的HbA1c分析的之極好關聯。在使用2種校正劑(稀A1c及濃A1c)校正EC數據之後,藉由本發明方法獲得之值極為接近彼等藉由參考方法獲得者。
實例15:使用本發明方法證實HbA1c之不穩定部分不干擾HbA1c之測定的研究。
假定本發明分析方法中所用之複合葡萄糖及在鹼性pH下提供負電荷之化合物能夠干擾血液葡萄糖(此干擾係假定的且未經證實),則如下實施游離葡萄糖對HbA1c之血液結果的任一干擾的研究:於37℃下將正常血液用不同濃度之葡萄糖(0-50 g/L)培育3小時以產生HbA1c之不穩定形式(在分子重排(Amadori重排)之前獲得之形式)。在實施培育後,對血樣進行離心並在生理水中重新構成所得顆粒且隨後使用來自Sebia之自動機器(HbA1c凝膠)及使用(Sebia)技術使用含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)並列分析溶血溶液(15 μL顆粒+25 μL生理水+160 μL溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)。
藉由在自動機器上分析獲得之HbA1c凝膠(參見圖18A)證實形成不穩定HbA1c部分,其遷移至與HbA1c相同之位準且在與血液一起培育期間濃度隨著葡萄糖濃度增大而增大。應注意,在凝膠中,在由Sebia界定之正常使用條件下,不穩定部分由於(具體而言)溶血溶液之酸性pH而並不出現。
相反,在(Sebia)上利用本發明緩衝液組合物(200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸,於pH 9.40下)對相同血樣實施之分析顯示,不管研究範圍內之培育葡萄糖的濃度如何(0-50 g/L),測定均不受游離葡萄糖之存在的干擾:HbAlc之曲線及值不變(參見圖18B及18C)。
Abraham,E.C.;Cameron,B.F.;Abraham,A.;Stallings,M.,「Glycosylated hemoglobins in heterozygotes and homozygotes for hemoglobin C with or without diabetes」,Journal of Laboratory and Clinical Medicine,104,602-609,1984。
Beccaria,L.;Chiumello,G.;Gianazza,E.;Luppis,B.;Righetti,PG.,「Hemoglobin A1c separation by isoelectric focusing」,American Journal of Hematology,4,367-374,1978。
Bosisio,A.;Righetti,P.,「Determination of glycated haemoglobin by isoelectric focusing in non-linear pH gradients」,Journal of Chromatography,307,103-110,1984。
Doelman,C;Siebelder,C;Nijhof,W.;Weykamp,W.;Janssens,J.;Penders,T.,「Capillary electrophoresis system for hemoglobin A1c determinations evaluated」,Clinical Chemistry,43,4,644-648,1997。
Hempe,JM.;Craver,RD.,「Quantification of hemoglobin variants by capillary isoelectric focusing」,Clinical Chemistry,40,12,2288-2295,1994。
Hempe,JM.;Granger,JN.;Craver,RD.,「Capillary isoelectric focusing of hemoglobin variants in the pediatric clinical laboratory」,Electrophoresis,18,1785-1795,1997。
Janssens,J.,「Capillary electrophoresis detection and/or analysis method and unit」,EP 0 733 900 A2,1996。
Janssens,J.;Chevigne,P.;Louis,P.,「Capillary electrophoresis method using initialized capillary and polyanion-containing buffer and chemical kit therefore」,美國專利5,611,903,1997。
Menard,L;Dempsey,M.;Blankstein,L;Aleyassine,H.;Wacks,M,;Soeldner,J.,「Quantitative determination of glycosylated hemoglobin A1 by agar gel electrophoresis」,Clinical Chemistry,26,11,1598-1602,1980。
Molteni,S.;Frischknecht,H.;Thormann,W.,「Application of dynamic capillary isoelectric focusing to the analysis of human hemoglobin variants」,Electrophoresis,15,22-30,1994。
Panteghini,M. John,W.G.,代表IFCC Scientific Division,「Implementation of haemoglobin A1c results traceable to the IFCC reference system: the way forward」,Clin Chem Lab Med.,45(8),942-4,2007。
Simon,M.;Cuan J.,「Hemoglobin Aie by isoelectric focusing」,Clinical Chemistry,28,1,9-12,1982。
Siren,H.;Laitinen,P.;Turpeinen,U.;Karppinen,P.,「Direct monitoring of glycohemoglobin A1c in the blood samples of diabetic patients by capillary electrophoresis. Comparison with an immunoassay method」,Journal of Chromatography A,979,201-207,2002。
Stickland,M.;Perkins,C;Wales,J,,「The measurement of haemoglobin A1c by isolectric focusing in diabetic patients」,Diabetologia,22,315-317,1982。
Wilson,D.H.,Bogacz,J.P.,Forsythe,C.M.,Turk,P.J.,Lane,T.L.,Gates,R.C.,Brandt,D.R. 「Fully automated assay of glycohemoglobin with the Abbott IMx analyzer: novel approaches for separation and detection」,Clin Chem.,39(10),2090-7,1993。
圖1:在CE Agilent上自正常人類血樣使用專利US 5,599,433中所述分析緩衝液獲得之電泳圖,該分析緩衝液含有100 mM CAPS及300 mM硼酸(pH:11.00;溫度:24℃;電壓:6.1 kV,即190 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖2:在CE Agilent上自含有糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用專利US 5,599,433中所述分析緩衝液獲得之A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線,該分析緩衝液含有100 mM CAPS及300 mM硼酸(pH:11;溫度:24℃;電壓:6.1 kV,即190 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖3:在CE Agilent上自含有糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用緩衝液組合物獲得之A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線,該緩衝液組合物含有200 mM CAPSO及10 mM腐胺,但不含硼酸化合物或酸根基化合物(pH:10.20;溫度:24℃;電壓:6.1 kV,即190 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖4:在CE Agilent上自含有糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用含有200 mM CAPSO、10 mM腐胺及50 mM硼酸鹽之緩衝液組合物獲得之A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線(pH:10.20;溫度:24℃;電壓:6.1 kV,即190 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖5:在CE Agilent上自含有糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用含有200 mM CAPSO、10 mM腐胺及50 mM 3-羧基苯基酸之緩衝液組合物獲得之A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線(pH:10.20;溫度:24℃;電壓:6.1 kV,即190V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖6:在CE Agilent上自含有糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用含有200 mM CAPSO、10 mM腐胺及50 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物獲得之A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線(pH:10.20;溫度:24℃;電壓:6.1 kV,即190 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖7:在CE Agilent上自含有糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用含有200 mM CAPSO、15 mM腐胺及100 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物獲得之A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線(pH:10.20;溫度:30℃;電壓:10 kV,即310 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖8:在CE Agilent上自含有HbA0及/或糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用含有200 mM CHES、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物於pH 9.40下獲得之A0、A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線。熔融氧化矽毛細管,未經塗佈(溫度:34℃;電壓:17.3 kV,即520 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖9:在CE Agilent上自含有HbA0及/或糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用含有200 mM CHES、20 mM腐胺及30 mM 3,4-二羧基苯基酸之緩衝液組合物於pH 9.40下獲得之A0、A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線。熔融氧化矽毛細管,未經塗佈(溫度:34℃;電壓:17.3 kV,即520 V/cm;注射:50毫巴,20 s)。
圖10:在 (Sebia)上自含有糖化血紅素之不同純化部分的參考試樣使用含有200 mM CHES、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物於pH 9.40下獲得之A1a、A1b及A1c的標準電泳曲線。熔融氧化矽毛細管,未經塗佈(溫度:34℃;電壓:9.4 kV,即520 V/cm;注射:20毫巴,6 s)
圖11:在 (Sebia)上自在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6的正常人類血樣使用緩衝液組合物獲得之電泳圖,該緩衝液組合物含有(A) 200 mM CAPSO緩衝液、10 mM腐胺及50 mM 3,5-二羧基苯基酸(pH 10.2),或(B) 200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸(於pH 9.40下)。熔融氧化矽毛細管,未經塗佈(溫度:34℃;電壓:9.4 kV,即520 V/cm;注射:8毫巴,6 s)。
圖12:緩衝液組合物中之3,5-二羧基苯基酸的濃度對A1c與Ao血紅素之間之分離的影響之研究(溫度:30℃;電壓:10 kV,即310 V/cm)。
圖13:在(Sebia)上自包含變體HbE且在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6之正常人類血樣使用含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)及未經塗佈熔融氧化矽毛細管(溫度:34℃;電壓:9.4 kV,即520 V/cm;注射:8毫巴,6 s)獲得之電泳圖。
圖14:在(Sebia)上自在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6之對照AFSC使用含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)及未經塗佈熔融氧化矽毛細管(溫度:34℃;電壓:9.4 kV,即520 V/cm;注射:8毫巴,6 s)獲得之電泳圖。
圖15:在(Sebia)上自包含F及Bart變體且在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6的正常血樣集合使用含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)及未經塗佈熔融氧化矽毛細管(溫度:34℃;電壓:9.4 kV,即520 V/cm;注射:8毫巴,6 s)獲得之電泳圖。
圖16:在(Sebia)上自包含HbD變體且在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6的正常人類血樣使用含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)及未經塗佈熔融氧化矽毛細管(溫度:34℃;電壓:9.4 kV,即520 V/cm;注射:8毫巴,6 s)獲得之電泳圖。
圖17:對本發明者使用(Sebia)分析儀藉由毛細管電泳獲得之結果與使用Variant II (Bio-Rad)分析儀藉由HPLC獲得之結果進行的比較。
圖18A:在(Sebia)自動機器上實施之HbA1c的瓊脂糖凝膠。泳道1及2:稀(5.0%)A1c校正劑及濃(10.8%)A1c校正劑。泳道3至9:在37℃下將正常全血與具有以下濃度之葡萄糖一起培育3 h:0 g/L(參照;泳道3)、1 g/L(泳道4)、5 g/L(泳道5)、10 g/L(泳道6)、20 g/L(泳道7)、30 g/L(泳道8)及50 g/L(泳道9)。
圖18B:用(Sebia)分析儀以圖18A之試樣獲得之毛細管電泳曲線。然而,並不對含有1 g/L葡萄糖之試樣實施分析,此乃因其在凝膠中無可見差別(圖18A)。將試樣在溶血溶液(水+1 g/L Triton X100)中稀釋至1/6,且使用含有200 mM CHES緩衝液、20 mM腐胺及30 mM 3,5-二羧基苯基酸之緩衝液組合物(於pH 9.40下)及未經塗佈之熔融氧化矽毛細管(溫度:34℃;電壓:9.4 kV,即520 V/cm;注射:8毫巴,6 s)。
圖18C:匯總在瓊脂糖凝膠上利用用於圖18A及18B中所展示血液分析之(Sebia)分析儀獲得之HbA1c值的表格。
(無元件符號說明)
Claims (41)
- 一種藉由一種或若干種糖化血紅素之毛細管電泳來進行分析之方法,該(等)糖化血紅素包含於含有血紅素之生物試樣中且包含至少一條β珠蛋白鏈,該β珠蛋白鏈包含鍵結至β珠蛋白鏈之N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基,該方法包含使用包含至少一種化合物之緩衝液組合物,該化合物係專一性複合該生物試樣中該(等)鍵結至糖化血紅素中該N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基,並在鹼性pH下提供該(等)糖化血紅素若干負電荷,其中該化合物包含兩個或兩個以上官能團,該(等)官能團中之至少一者專一性複合一個或若干個葡萄糖殘基,藉此提供每個經複合之葡萄糖殘基一個負電荷,沒有複合該(等)葡萄糖殘基的另一官能團、其他官能團中之一者或所有其他官能團,在鹼性pH下提供該葡萄糖殘基之各者一個或若干個額外的負電荷。
- 如請求項1之方法,其用於藉由毛細管電泳分析包含於含有血紅素之生物試樣中的血紅素A1c。
- 如請求項1或2之方法,其中該專一性複合一個或若干個葡萄糖殘基的該等官能團與葡萄糖殘基之兩個鄰位羥基相互作用。
- 如請求項1或2之方法,其中該專一性複合該生物試樣中糖化血紅素之葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷的化合物包含一個或若干個可在鹼性pH下陰離子化之基團係一個或若干個羧酸根、羧基、磺酸根及/或磺醯基。
- 如請求項1或2之方法,其中該專一性複合該生物試樣中糖化血紅素之葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷的化合物包含至少一個酸基(boronyl)及/或酸根基團(boronate group),且係:(i)酸根基(boronate)化合物,其具有通式RB(OH)2或RB(OH)3 -,其中基團R包含至少一個選自於直鏈、具支鏈或環狀的芳基及/或烷基及/或芳烷基及/或其他官能團或雜原子、及/或其組合,且其中該基團R可使糖化血紅素中與該酸根基團複合之每一葡萄糖殘基在鹼性pH下具有一個或若干個負電荷;或(ii)該酸根基化合物之鹽。
- 如請求項5之方法,其中該酸根基化合物係經多取代之苯基酸酯(phenylboronate)。
- 如請求項6之方法,其中該酸根基化合物係經二取代之苯基酸酯。
- 如請求項7之方法,其中該酸根基化合物係經羧基及/或磺醯基二取代之苯基酸酯。
- 如請求項8之方法,其中該基團R為二酸。
- 如請求項9之方法,其中該基團R為二羧酸。
- 如請求項5之方法,其中該酸根基化合物係二羧基苯基酸(dicarboxyphenylboronic acid)。
- 如請求項11之方法,其中該酸根基化合物係選自3,4-二羧基苯基酸(3,4-dicarboxyphenylboronic acid)及3,5-二羧基苯基酸(3,5-dicarboxyphenylboronic acid)。
- 如請求項1或2之方法,其中在該緩衝液組合物中該專一性複合該生物試樣中糖化血紅素之葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷之化合物的濃度相對於蛋白質之總量、相對於該生物試樣中存在之所有血紅素之總量或相對於該生物試樣中存在之所有包含葡萄糖的血紅素之總量在化學計量上過量。
- 如請求項1或2之方法,其中在該緩衝液組合物中該專一性複合該生物試樣中糖化血紅素之葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷之化合物的濃度在0.10mM至100mM範圍內。
- 如請求項1或2之方法,其中該緩衝液組合物另外包含阻流劑。
- 如請求項15之方法,其中該阻流劑係脂肪族二胺。
- 如請求項16之方法,其中該阻流劑係選自以下之脂肪族二胺:1,3-二胺基丙烷、1,4-二胺基丁烷(腐胺)、1,5-二胺基戊烷(屍胺)、1,6-二胺基己烷、精胺、DETA、脂肪族聚胺、環狀聚胺或脂肪族二胺鹽、或其混合物中之一者。
- 如請求項15之方法,其中該緩衝液組合物中之阻流劑的濃度在0.10mM至40mM範圍內。
- 如請求項1或2之方法,其中該緩衝液組合物另外包含:緩衝化合物,其pKa在8.0至11.0範圍內;及/或鹼;及/或鹽;及/或 稀釋溶液。
- 如請求項19之方法,其中該緩衝化合物係兩性離子化合物,其係選自AMP、AMPD、AMPSO、二甘胺酸、CABS、CAPS、CAPSO、CHES、HEPBS、甲胺、TABS、TAPS、胺基乙磺酸、三(羥甲基)甲基甘胺酸及Tris。
- 如請求項20之方法,其中該緩衝化合物係CHES、CAPS或CAPSO。
- 如請求項19之方法,其中該緩衝液組合物中之該緩衝化合物的濃度在20mM至500mM範圍內。
- 如請求項1或2之方法,其中該緩衝液組合物之pH為9或更大。
- 如請求項1或2之方法,其包含以下步驟:a)將該緩衝液組合物及生物試樣引入電泳毛細管中;及b)藉由毛細管電泳分離該生物試樣之各成份。
- 如請求項24之方法,其中在分離該生物試樣中各成份之步驟後實施檢測該生物試樣中所存在一種或若干種血紅素之步驟。
- 如請求項24之方法,其另外包含自與所檢測血紅素之量成正比之檢測信號產生電泳圖的步驟。
- 如請求項1或2之方法,其另外包含如下步驟:測定該生物試樣中所存在一種或若干種血紅素之量及/或該生物試樣中所存在一種或若干種血紅素相對於該生物試樣中存 在之蛋白質總量、血紅素之總量或某些血紅素之量之比例。
- 如請求項1或2之方法,其另外包含相對於一種或若干種標準化校正劑對該生物試樣中存在之一種或若干種血紅素進行定量之步驟。
- 如請求項1或2之方法,其中該生物試樣係血樣。
- 如請求項1或2之方法,其中將該生物試樣稀釋於溶血溶液。
- 如請求項30之方法,其中該溶血溶液係選自由以下組成之群之溶血溶液:溶血溶液Capillaries®血紅蛋白(e);溶血溶液Hydragel® HbA1c;溶血溶液MINICAP®血紅蛋白(e);純水;補充有表面活性劑之水;及其混合物。
- 一種適於藉由毛細管電泳分析一種或若干種糖化血紅素之緩衝液組合物,該(等)糖化血紅素包含鍵結至包含於含有一種或若干種血紅素之生物試樣中該等糖化血紅素的β珠蛋白鏈上N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基,其中該緩衝液組合物包含至少一種化合物,該化合物係專一性複合該(等)葡萄糖殘基,並在鹼性pH下提供該(等)糖化血紅素若干負電荷,其中該化合物包含兩個或兩個以上官能團,該(等)官能團中之至少一者專一性複合一 個或若干個葡萄糖殘基,藉此提供每個經複合之葡萄糖殘基一個負電荷,沒有複合該(等)葡萄糖殘基的另一官能團、其他官能團中之一者或所有其他官能團,在鹼性pH下提供該葡萄糖殘基之各者二個或二個以上之額外的負電荷,且其中該化合物包含至少一個酸基(boronyl)及/或酸根基團(boronate group),且係:(i)酸根基(boronate)化合物,其具有通式RB(OH)2或RB(OH)3 -,其中基團R包含至少一個選自於直鏈、具支鏈或環狀的芳基及/或烷基及/或芳烷基及/或其他官能團或雜原子、及/或其組合,且其中該基團R可使糖化血紅素中與該酸根基團複合之每一葡萄糖殘基在鹼性pH下具有二個或二個以上之負電荷;或(ii)該酸根基化合物之鹽。
- 一種套組,其包含如請求項32之緩衝液組合物以及使用說明。
- 一種如請求項32之緩衝液組合物的用途,其用於製造診斷人類或非人類哺乳動物之糖尿病及/或監測人類或非人類哺乳動物之血糖平衡的產品。
- 一種如請求項33之套組的用途,其用於製造診斷人類或非人類哺乳動物之糖尿病及/或監測人類或非人類哺乳動物之血糖平衡的產品。
- 一種如請求項32所定義之專一性複合生物試樣中糖化血紅素之葡萄糖殘基並在鹼性pH下提供負電荷的化合物的用途,其用於藉由毛細管電泳分離一種或若干種糖化血 紅素與生物試樣中存在之其他蛋白質,該(等)糖化血紅素包含至少一條珠蛋白鏈,該珠蛋白鏈含有鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基。
- 如請求項36之用途,其用於藉由毛細管電泳分離一種或若干種糖化血紅素與生物試樣中存在之至少一種另一血紅素,該(等)糖化血紅素包含至少一條珠蛋白鏈,該珠蛋白鏈含有鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基。
- 一種如請求項32之緩衝液組合物的用途,其用於藉由毛細管電泳分離一種或若干種糖化血紅素與生物試樣中存在之其他蛋白質,該(等)糖化血紅素包含至少一條珠蛋白鏈,該珠蛋白鏈含有鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基。
- 如請求項38之用途,其用於藉由毛細管電泳分離一種或若干種糖化血紅素與生物試樣中存在之至少一種另一血紅素,該(等)糖化血紅素包含至少一條珠蛋白鏈,該珠蛋白鏈含有鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基。
- 一種如請求項33之套組的用途,其用於藉由毛細管電泳分離一種或若干種糖化血紅素與生物試樣中存在之其他蛋白質,該(等)糖化血紅素包含至少一條珠蛋白鏈,該珠蛋白鏈含有鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基。
- 如請求項40之用途,其用於藉由毛細管電泳分離一種或若干種糖化血紅素與生物試樣中存在之至少一種另一血紅素,該(等)糖化血紅素包含至少一條珠蛋白鏈,該珠蛋白鏈含有鍵結至N-端位置處之胺基酸之葡萄糖殘基。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0903220A FR2947632B1 (fr) | 2009-07-01 | 2009-07-01 | Analyse et dosage d'hemoglobines glyquees par electrophorese capillaire, compositions tampon et kits pour electrophorese capillaire |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201104254A TW201104254A (en) | 2011-02-01 |
TWI516767B true TWI516767B (zh) | 2016-01-11 |
Family
ID=41572618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW099121568A TWI516767B (zh) | 2009-07-01 | 2010-06-30 | 藉由毛細管電泳進行之糖化血紅素分析及測定、用於毛細管電泳之緩衝液組合物及套組 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9222913B2 (zh) |
EP (1) | EP2449370B1 (zh) |
JP (1) | JP5568636B2 (zh) |
CN (1) | CN102498392B (zh) |
AU (1) | AU2010267910B2 (zh) |
BR (1) | BRPI1010229B1 (zh) |
CA (1) | CA2765210C (zh) |
DK (1) | DK2449370T3 (zh) |
ES (1) | ES2785723T3 (zh) |
FR (1) | FR2947632B1 (zh) |
IL (1) | IL217184A (zh) |
PT (1) | PT2449370T (zh) |
RU (1) | RU2608911C2 (zh) |
TW (1) | TWI516767B (zh) |
WO (1) | WO2011001045A1 (zh) |
ZA (1) | ZA201109222B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI774827B (zh) * | 2017-08-18 | 2022-08-21 | 美商雷傑納榮製藥公司 | 使用影像毛細管等電聚焦以分析樣品基質中蛋白質變異體之方法 |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2343544B1 (en) * | 2009-12-25 | 2015-03-11 | Arkray, Inc. | Method for analyzing hemoglobin by electrophoresis |
EP2732278A4 (en) | 2011-07-14 | 2014-12-03 | Dgel Electrosystem Inc | ELECTROPHORESE BUFFER TO EXTEND THE ELECTROPHORESE USE OF AN ELECTROPHORIC SOLE |
KR101207418B1 (ko) * | 2012-02-10 | 2012-12-04 | 주식회사 아이센스 | 효소법을 이용하는 당화혈색소 정량분석용 용혈시약 조성물 |
GB201305114D0 (en) * | 2013-03-20 | 2013-05-01 | Univ Bath | Materials and methods for analysing glycation |
EP2993467A1 (en) * | 2014-09-04 | 2016-03-09 | ARKRAY, Inc. | Analysis method and analysis system |
US10545117B2 (en) | 2015-01-15 | 2020-01-28 | Arkray, Inc. | Sample analysis method and solution therefor |
JP6579948B2 (ja) * | 2015-12-24 | 2019-09-25 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 生体ポリマを分析するための測定試薬及び分析デバイス |
US10543299B2 (en) | 2016-10-03 | 2020-01-28 | Microvention, Inc. | Surface coatings |
DE102016123458B3 (de) * | 2016-12-05 | 2018-03-15 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin | Verfahren zur Herstellung transparenter biologischer Präparate für eine lichtmikroskopische Untersuchung |
WO2019060633A2 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | Prozyme, Inc. | USE OF POLYAMINES AS RESOLUTION AGENTS FOR CAPILLARY ELECTROPHORESIS OF GLYCANES MARKETED USING GELS |
CN108445071B (zh) * | 2018-02-08 | 2021-03-30 | 中国计量科学研究院 | 一种高准确度糖化血红蛋白标准物质定值方法 |
CN109298059A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-02-01 | 深圳市慧思基因科技有限公司 | 一种采用毛细管区带电泳技术测定人精浆蛋白的方法 |
ES2977287T3 (es) * | 2019-02-15 | 2024-08-21 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc | Calibradores y controles para la determinación del porcentaje de hemoglobina glicosilada en una muestra de prueba líquida de un paciente |
CN112198212B (zh) * | 2019-06-21 | 2024-04-12 | 爱科来株式会社 | 稳定型A1c的测定方法 |
JP2024040968A (ja) | 2022-09-13 | 2024-03-26 | アークレイ株式会社 | 試料分析方法、キャピラリ電気泳動用溶液、及び試料分析用キット |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4222836A (en) | 1979-06-01 | 1980-09-16 | Corning Glass Works | Acidic agar gel electrochromatography of glycohemoglobins |
US4861728A (en) * | 1987-07-24 | 1989-08-29 | Becton, Dickinson And Company | Immunoassay of glycosylated hemoglobin using a labeled boron reagent |
GB9024771D0 (en) | 1990-11-14 | 1991-01-02 | Axis Research | Assay |
BE1004336A3 (fr) | 1991-01-15 | 1992-11-03 | Analis Sa | Procede de separation et de quantification de l'hemoglobine glycosylee hb a1c. |
US5120413A (en) * | 1991-05-31 | 1992-06-09 | Beckman Instruments, Inc. | Analysis of samples utilzing capillary electrophoresis |
US5631364A (en) | 1994-03-31 | 1997-05-20 | Axis Biochemicals Asa | Labelled boronic acid derivatives |
US5431793A (en) | 1994-07-29 | 1995-07-11 | Beckman Instruments, Inc. | Quantitative analysis of glycosylated hemoglobin by immunocappillary electrophoresis |
US5599433A (en) * | 1995-01-17 | 1997-02-04 | Beckman Instruments, Inc. | Capillary electrophoresis of glycosylated proteins |
US5611903A (en) | 1995-03-22 | 1997-03-18 | Analis S. A. | Capillary electrophoresis method using initialized capillary and polyanion-containing buffer and chemical kit therefor |
US6162645A (en) | 1997-03-13 | 2000-12-19 | Abbott Laboratories | Determination of % glycated hemoglobin |
DE19843094A1 (de) | 1998-09-21 | 2000-03-23 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von glykiertem Hämoglobin |
US6835545B2 (en) * | 2000-05-08 | 2004-12-28 | President And Fellows Of Harvard College | Methods, products and treatments for diabetes |
FR2819888B1 (fr) * | 2001-01-19 | 2003-09-12 | Sebia Sa | Procede de separation de proteines par electrophorese capillaire et compositions de tampon pour electrophorese capillaire |
JP2004275168A (ja) * | 2003-03-17 | 2004-10-07 | Koji Hayade | フルクトシルアミン酸化酵素 |
FR2869995B1 (fr) * | 2004-05-10 | 2006-09-22 | Sebia Sa | Procede ameliore de separation de proteines par electrophorese capillaire et compositions de tampon pour electrophorese capillaire |
FR2878033B1 (fr) * | 2004-11-18 | 2007-05-04 | Sebia Sa | Procede d'analyse de l'hemoglobine par electrophorese capillaire, trousse pour electrophorese capillaire et utilisation de ralentisseur de flux dans un tel procede |
EP2060913B1 (en) * | 2006-09-04 | 2016-11-02 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Method for analysis of sample by capillary electrophoresis |
JP4172806B2 (ja) | 2006-09-06 | 2008-10-29 | 三菱重工業株式会社 | 常温接合方法及び常温接合装置 |
CN102640002B (zh) * | 2009-05-20 | 2015-08-05 | 瑞莱诊断体系股份有限公司 | 检测糖化血红蛋白百分比的系统和方法 |
-
2009
- 2009-07-01 FR FR0903220A patent/FR2947632B1/fr active Active
-
2010
- 2010-06-30 AU AU2010267910A patent/AU2010267910B2/en active Active
- 2010-06-30 ES ES10734185T patent/ES2785723T3/es active Active
- 2010-06-30 WO PCT/FR2010/000481 patent/WO2011001045A1/fr active Application Filing
- 2010-06-30 CA CA2765210A patent/CA2765210C/fr active Active
- 2010-06-30 CN CN201080038819.7A patent/CN102498392B/zh active Active
- 2010-06-30 JP JP2012518106A patent/JP5568636B2/ja active Active
- 2010-06-30 BR BRPI1010229-9A patent/BRPI1010229B1/pt active IP Right Grant
- 2010-06-30 PT PT107341851T patent/PT2449370T/pt unknown
- 2010-06-30 TW TW099121568A patent/TWI516767B/zh active
- 2010-06-30 EP EP10734185.1A patent/EP2449370B1/fr active Active
- 2010-06-30 US US12/827,795 patent/US9222913B2/en active Active
- 2010-06-30 DK DK10734185.1T patent/DK2449370T3/da active
- 2010-06-30 RU RU2011149973A patent/RU2608911C2/ru active
-
2011
- 2011-12-14 ZA ZA2011/09222A patent/ZA201109222B/en unknown
- 2011-12-25 IL IL217184A patent/IL217184A/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-11-18 US US14/945,108 patent/US10119933B2/en active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI774827B (zh) * | 2017-08-18 | 2022-08-21 | 美商雷傑納榮製藥公司 | 使用影像毛細管等電聚焦以分析樣品基質中蛋白質變異體之方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK2449370T3 (da) | 2020-05-18 |
EP2449370A1 (fr) | 2012-05-09 |
FR2947632A1 (fr) | 2011-01-07 |
US20110000788A1 (en) | 2011-01-06 |
PT2449370T (pt) | 2020-06-01 |
US20160077052A1 (en) | 2016-03-17 |
US10119933B2 (en) | 2018-11-06 |
CN102498392B (zh) | 2014-11-05 |
ES2785723T3 (es) | 2020-10-07 |
AU2010267910B2 (en) | 2015-05-07 |
IL217184A0 (en) | 2012-02-29 |
BRPI1010229A2 (pt) | 2016-03-22 |
JP2012531609A (ja) | 2012-12-10 |
BRPI1010229B1 (pt) | 2020-08-04 |
CA2765210C (fr) | 2019-03-26 |
RU2011149973A (ru) | 2013-08-10 |
JP5568636B2 (ja) | 2014-08-06 |
IL217184A (en) | 2017-01-31 |
ZA201109222B (en) | 2012-08-29 |
WO2011001045A1 (fr) | 2011-01-06 |
RU2608911C2 (ru) | 2017-01-26 |
US9222913B2 (en) | 2015-12-29 |
EP2449370B1 (fr) | 2020-03-11 |
CN102498392A (zh) | 2012-06-13 |
FR2947632B1 (fr) | 2011-11-11 |
TW201104254A (en) | 2011-02-01 |
AU2010267910A1 (en) | 2012-01-19 |
CA2765210A1 (fr) | 2011-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI516767B (zh) | 藉由毛細管電泳進行之糖化血紅素分析及測定、用於毛細管電泳之緩衝液組合物及套組 | |
Gahoual et al. | Cutting-edge capillary electrophoresis characterization of monoclonal antibodies and related products | |
JP4832057B2 (ja) | キャピラリー電気泳動法によるヘモグロビンの分析方法、キャピラリー電気泳動キット及び該方法における流れ阻害剤の使用 | |
Cao et al. | Charge profiling and stability testing of biosimilar by capillary isoelectric focusing | |
JP6172163B2 (ja) | 検体中のヘモグロビンA1cの免疫測定方法 | |
Lin et al. | A high‐resolution capillary isoelectric focusing method for the determination of therapeutic recombinant monoclonal antibody | |
JP2012531609A5 (zh) | ||
US20090200166A1 (en) | Method of Analyzing Hemoglobin by Capillary Eletrophoresis | |
Caslavska et al. | Monitoring of alcohol markers by capillary electrophoresis | |
Caslavska et al. | Monitoring of transferrin isoforms in biological samples by capillary electrophoresis | |
KR20210087678A (ko) | 당화 알부민 측정용 시약 키트 및 이를 이용한 당화 알부민 비율 측정법 | |
Cieniewski-Bernard et al. | Multiplexed detection of O-GlcNAcome, phosphoproteome, and whole proteome within the same gel | |
Tukhmetova et al. | Development of an Online Isotope Dilution CE/ICP–MS Method for the Quantification of Sulfur in Biological Compounds | |
RU2734412C2 (ru) | Аналитический способ идентификации по меньшей мере одной гликоформы белка трансферрина | |
Khan et al. | Challenges in Hemoglobin A1C Measurement in 183 Patients with Diabetes having Hemoglobin Variants and Chemically Modified Derivatives | |
CN116381252A (zh) | 一种糖化血红蛋白测定试剂盒 | |
Warren et al. | Anti‐CD30 (Ber‐H2) epitope requires structural elements as shown by mass spectroscopy and dual‐site associated kinetics | |
Backer et al. | Autoantibodies to lactate dehydrogenase in serum identified by use of immobilized protein G and immobilized jacalin, a jackfruit lectin. | |
Wenz | Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by Capillary Isoelectric Focusing on the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System | |
WO2014083637A1 (ja) | 標的物質-レセプター複合体と遊離レセプターとを分離する方法 | |
Khan et al. | Challenges in Hemoglobin A1C Measurement in Patients with Diabetes having Hemoglobin Variants and Chemically Modified Derivatives | |
CN111108209A (zh) | 多胺作为分离剂在带标记聚糖的使用凝胶的毛细管电泳中的用途 |