JP4854502B2 - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。

ヘモグロビン（Ｈｂ）類、特に糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
従来から、このＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。

一方、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定精度及び測定時間の点で問題があるため、糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。

これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能とされており、例えば、特許文献１には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高く、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。

また、特許文献２には、キャピラリー電気泳動法において、キャピラリーにカチオン性ポリマーを通液することによって、キャピラリー内面にカチオン性ポリマーを動的にコーティングし、硫酸化多糖類を含む緩衝液を用いる方法が開示されている。この方法によれば、１０分間程度で測定することができ、ゲル電気泳動法と比較して短時間で測定することが可能となる。

しかしながら、このような動的コーティング法は、特定の試料についての測定終了後、次の試料測定時に再びコーティングを行う必要がある。このように毎測定時に同じコーティング状態とするためには、洗浄操作によりコーティング層を剥がした上で、再びコーティング操作を行うことにより、一度初期の状態に戻す必要が生じる。すなわち、連続測定する際には、測定の間に洗浄及びコーティング操作を挿入しなければならないため、測定時間の延長を招いていた。また、このような洗浄及びコーティング操作は、測定誤差が発生する要因となっており、加えて、コーティング用の試薬を測定時に具備する必要があるため、コスト的にも不利となっていた。更に、連続測定を行わない場合であっても、１０分程度の測定時間はＨＰＬＣ法と比較して非常に長く、臨床検査に適用するには不充分であった。

更に、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃの中でも糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを分離して、不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類の影響を排除しなければならない。しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示された方法によって得られるエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法に記載の技術範囲では安定型ＨｂＡ１ｃを分離することは困難であった。
特表平９−５１０７９２号公報 特開平９−１０５７３９号公報

本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。

本発明は、キャピラリー電気泳動法又はマイクロチップ電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面にイオン性ポリマーを固定化した泳動路と、電気泳動時に前記泳動路の内部に満たされる、アニオン性基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液とを用いるヘモグロビン類の測定方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討した結果、電気泳動法によるヘモグロビン類の測定において、内面にイオン性ポリマーを固定化した泳動路と、アニオン性基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液とを用いて電気泳動を行うことによって、高精度の測定を短時間に行うことが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明のヘモグロビン類の測定方法において用いる電気泳動法としては特に限定されず、例えば、キャピラリー電気泳動法、マイクロチップ電気泳動法等が挙げられる。

図１に、本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いるキャピラリー電気泳動装置の一例を示す。図１に示すように、キャピラリー電気泳動装置１１は、陽極槽１２、陰極槽１３、キャピラリー１４、高圧電源１５、検出器１６、及び、一対の電極１７、１８からなる。キャピラリー１４の両端は陽極槽１２内、及び、陰極槽１３内の緩衝液に浸され、管状のキャピラリー１４の内部は緩衝液で満たされている。また、電極１７及び１８は高圧電源１５と電気的に接続されている。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、泳動路であるキャピラリー１４の内面にイオン性ポリマーが固定化されている。陽極槽１２内、陰極槽１３内又はキャピラリー１４内の緩衝液は、アニオン性基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液である。
そして、ヘモグロビン類を測定する際には、キャピラリー１４の一方より試料を注入して、高圧電源１５から所定の電圧を印加することにより、キャピラリー１４内を移動する目的成分を検出器１６によって測定する。

本発明のヘモグロビン類の測定方法は、電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、内面にイオン性ポリマーを固定化した泳動路を用いる。このような泳動路を用いることによって、動的コーティング法のような測定毎のコーティング操作や洗浄操作等の工程を必要とすることなく、短時間での測定が可能となるとともに、コーティング試薬を測定系に具備する必要がないことからコスト面でも非常に有利となる。

上記泳動路とは、電気泳動が行われる際に、試料が移動及び／又は分離する部位（試料が注入される部位から検出される部位まで）のことをいう。具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリー内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいう。
上記泳動路の内面とは、具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリーの泳動路内面のことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝の泳動路内面のことをいう。

上記泳動路を構成する素材としては特に限定されず、例えば、ガラス、金属、樹脂等が挙げられる。
上記泳動路は、内部に充填剤粒子等の固形物質を有していてもよい。

上記泳動路の長さの好ましい下限は１０ｍｍ、好ましい上限は３００ｍｍである。１０ｍｍ未満であると、充分に試料が分離されないため、正確な測定をすることができないことがある。３００ｍｍを超えると、測定時間の延長や得られるエレクトロフェログラムにおいてピーク形状の変形が生じることによって、正確な測定をすることができないことがある。

上記泳動路の直径の好ましい下限は１μｍ、好ましい上限は１００μｍである。１μｍ未満であると、検出器により検出するための光路長が小さく、測定精度が低下することがある。１００μｍを超えると、泳動路内で試料が拡散することにより得られるエレクトロフェログラムにおいてピークがブロードになり、測定精度が低下することがある。

本明細書において、上記泳動路内面に固定化されるイオン性ポリマーとは、分子内にイオン性の官能基を有するポリマーを意味する。
上記イオン性ポリマーは、イオン性の種類により、アニオン性ポリマーと、カチオン性ポリマーとに大別される。

上記アニオン性ポリマーは、分子内にアニオン性の官能基を有するポリマーである。

上記アニオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、アニオン性基含有多糖類、アニオン性基含有有機合成高分子等が挙げられる。
上記アニオン性の官能基としては、特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。

上記アニオン性基含有多糖類としては特に限定されず、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等のスルホン酸基含有多糖類、及び、その塩類；アルギン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、その誘導体へのアニオン性基導入化物、及び、その塩類等の公知のアニオン性基含有多糖類等が挙げられる。

上記アニオン性基含有有機合成高分子としては特に限定されず、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸（以下、（メタ）アクリル酸ともいう）、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル重合体、スルホン酸基含有（メタ）アクリル酸重合体、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸重合体、及び、これらの共重合物等の公知のアニオン性基含有有機合成高分子等が挙げられる。

上記カチオン性ポリマーは、分子内にカチオン性の官能基を有するポリマーである。
上記カチオン性ポリマーとしては特に限定されず、例えば、アミノ化多糖類、アミノ基含有有機合成高分子等が挙げられる。
上記カチオン性の官能基としては、特に限定されず、例えば、１〜４級のアミノ基等が挙げられる。
上記カチオン性ポリマーは、親水性を有することが好ましい。

上記アミノ化多糖類としては特に限定されず、例えば、キチン、キトサン等のキトサン誘導体、及び、その塩類；アミノセルロース、Ｎ−メチルアミノセルロース等のＮ−置換セルロースの誘導体、及び、その塩類；デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、及び、その誘導体へのアミノ基導入化物、及び、その塩類等、公知のアミノ化多糖類等が挙げられる。

上記アミノ基含有有機合成高分子としては特に限定されず、例えば、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ポリ２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド等のアミノ基含有（メタ）アクリレート及び共重合物等、公知のアミノ基含有有機合成高分子等が挙げられる。

上記イオン性ポリマーの重量平均分子量の好ましい下限は５００である。５００未満であると、泳動路の内面を充分に被覆することが困難となり、ヘモグロビン類の分離性能が不充分となることがある。

上記泳動路に上記イオン性ポリマーを固定化する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、上記イオン性ポリマーを上記泳動路の内面に接触させて、疎水性的又は静電気的な相互作用等を利用することによって、上記イオン性ポリマーを上記泳動路の内面に物理的に吸着させて固定化する方法；上記泳動路内面と上記イオン性ポリマーとを、それぞれの物質が有する官能基や他の物質等を介して共有結合により固定化する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、上記泳動路内部に上記イオン性ポリマーを含有する溶液を通液し、該泳動路に空気を注入することによって該溶液を追い出した後、加熱・乾燥等の処理をすることを繰り返す方法等が挙げられる。これらの方法を用いた場合、加熱工程、乾燥工程等の処理を経ることにより、剥離しにくく、繰り返し測定が可能なイオン性ポリマーの固定化が可能となる。

上記泳動路に上記イオン性ポリマーを固定化する際、上記イオン性ポリマーは、その種類や固定化の方法にもよるが、上記イオン性ポリマー溶液として固定化方法に供されることが好ましい。
上記イオン性ポリマー溶液の濃度としては、好ましい下限が０．０１％、好ましい上限が２０％である。０．０１％未満であると、固定化が不充分となることがある。２０％を超えると、上記イオン性ポリマーからなる層を均一に形成することができず、ヘモグロビン類の測定途中に剥離し、再現性低下の原因となることがある。

上記泳動路は、最内面に上記イオン性ポリマーが固定化されていれば、上記泳動路内面と上記イオン性ポリマー層との間に、別種の層を形成してもよい。

本発明のヘモグロビン類の測定方法は、アニオン性基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液を用いる。
上記緩衝液は、電気泳動時に上記泳動路の内部に満たされる緩衝液、電気泳動時に上記泳動路の両端に設置される陽極槽及び陰極槽に満たされる緩衝液、上記泳動路の内部を洗浄する緩衝液、試料を溶解希釈する溶血希釈液等に用いられる。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、これら全ての緩衝液がアニオン性基を有するアクリル系ポリマーを含有するものであってもよく、一部の緩衝液のみがアニオン性基を有するアクリル系ポリマーを含有するものであってもよい。

上記緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等が挙げられる。
上記緩衝液には、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等、一般的に用いられる添加剤を適宜添加してもよい。

上記アクリル系ポリマーは、アニオン性の官能基を有する。
上記アニオン性基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の従来公知のアニオン性を有する官能基である。なかでも、スルホン酸基を有することが好ましい。
上記アクリル系ポリマーは、分子中に、上記アニオン性基を複数有していてもよく、異なる種類の上記アニオン性基を有していてもよい。

上記アクリル系ポリマーは、水溶性である。
上記アクリル系ポリマーは、使用時に上記緩衝液に完全に溶解した状態であればよいが、水に対する溶解度の好ましい下限が１ｇ／Ｌである。１ｇ／Ｌ未満であると、アクリル系ポリマーを低濃度でしか用いることができないため効果が現れにくく、測定精度が不充分となることがある。より好ましい下限は５ｇ／Ｌである。

上記アクリル系ポリマーとしては特に限定されず、従来公知のアクリル系ポリマーを用いることができる。
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、上記アクリル系ポリマーとは、（メタ）アクリル酸、その誘導体類、及び、エステル類等を主成分とするポリマーをいう。

上記アクリル系ポリマーとしては特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸等のカルボキシル基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート等のリン酸基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（メタ）アクリルアミドプロパンスルホン酸、スルホプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシナフタレンスルホン酸等のスルホン酸基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー等が挙げられる。

上記アクリル系ポリマーは、アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマーと、アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーとの共重合体であってもよい。
上記アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーとしては、上記アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマーと共重合が可能な（メタ）アクリルモノマーであれば特に限定されないが、例えば、親水性を有する（メタ）アクリル酸エステル類が好ましい。上記非イオン性及び親水性を有する（メタ）アクリル酸エステル類としては特に限定されず、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート；グリシジル（メタ）アクリレート、シアノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。

上記アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーの配合量は、得られる共重合体が水溶性であれば特に限定されないが、上記アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマー１００重量部に対して、好ましい上限は１０００重量部である。１０００重量部を超えると、得られる共重合体が水溶性とならないことがある。

上記緩衝液において、上記アクリル系ポリマーの含有量の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は１０重量％である。０．０１重量％未満であると、上記アクリル系ポリマーを配合することによる効果を発現しにくく、分離が不充分となることがある。１０重量％を超えると、測定時間時間の延長、分離不良等を引き起こすことがある。

本発明のヘモグロビン類の測定方法において、測定対象となるヘモグロビン類としては特に限定されず、例えば、従来公知のヘモグロビン類が挙げられる。具体的には例えば、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２；アセチル化Ｈｂ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾ヘモグロビン；ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常ヘモグロビン等が挙げられる。なかでも、安定型ＨｂＡ１ｃを好適に測定することが可能である。

本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。具体的には、電気泳動法という簡易かつ低コストな方法を用いながら、特に安定型ＨｂＡ１ｃの測定において、１試料当たり数分という短時間に、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％程度という高精度で測定することができる。そのため、電気泳動法によって糖尿病患者のＨｂＡ１ｃの数値の管理を好適に行うことが可能となる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）泳動路のコーティング
アニオン性ポリマーであるデキストラン硫酸（和光純薬社製）を０．２重量％含有する水溶液を調製した。次いで、フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）に、０．２ＮのＮａＯＨ水溶液、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ水溶液をこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、得られたデキストラン硫酸水溶液を２０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入してデキストラン硫酸水溶液を追い出し、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再びデキストラン硫酸水溶液を注入し、空気の注入及び乾燥を５回繰り返すことによって、キャピラリー内面をコーティングした。
得られた内面をコーティングしたキャピラリーを、キャピラリー電気泳動装置（ＰＡＣ／Ｅ ＭＤＱ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）にセットした。

（２）緩衝液の調製
アニオン性基を有するアクリル系モノマーとして２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（和光純薬社製）３．０ｇ及びアニオン性基を有しないアクリル系モノマーとしてヒドロキシエチルメタクリレート（和光純薬社製）２．０ｇを５０ｍＬのイオン交換水に溶解して、溶液を作製した。得られた溶液に、過硫酸カリウム０．０５ｇを添加し、窒素雰囲気下で攪拌しながら８０℃に昇温して重合した。１０時間重合後、得られた内容物の全量を透析チューブ（三光純薬社製：ＵＣ Ｃ６５−５０）に移し、イオン交換水中にて１２時間透析を行うことによって、緩衝液に用いるアクリル系ポリマーを得た。
得られたアクリル系ポリマーを２．０重量％含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）をキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。

（３）健常人血の測定
健常人血よりヘパリン採血した健常人全血７０μＬに、上述の（２）緩衝液の調製で得られたアクリル系ポリマーを２重量％含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μＬを添加して溶血希釈したものを試料として用いた。
キャピラリーの一方から試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に２０ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、ヒト血液中の安定型ＨｂＡ１ｃのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。
図２は、実施例１において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図２中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。実施例１では、約１．５分の電気泳動時間で、安定型ＨｂＡ１ｃの分離を行うことができた。

（４）修飾Ｈｂを含む試料の測定
健常人血よりヘパリン採血した健常人全血に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、修飾Ｈｂの一種である不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含む試料を人為的に調製した。
キャピラリーの一方から試料を注入し、キャピラリーの両端の緩衝液に２０ｋＶの電圧をかけて電気泳動を行い、４１５ｎｍの可視光における吸光度変化を測定することにより、ヒト血液中の安定型ＨｂＡ１ｃのキャピラリー電気泳動法による測定を行った。
図３は、実施例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図３中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図３に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃとが良好に分離された。

（実施例２）
デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、アニオン性ポリマーであるポリメタクリル酸の０．５重量％水溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法よって、キャピラリー内面をコーティングした。
その後、アニオン性基を有するアクリル系モノマーとしてスルホプロピルメタクリレート（メルク社製）３．０ｇ及びアニオン性基を有しないアクリル系モノマーとしてポリエチレングリコールメタクリレート（新中村化学社製）２．０ｇを用いた以外は、実施例１と同様の方法によって重合し、緩衝液に用いるアクリル系ポリマーを得た。
実施例１におけるアクリル系ポリマーを２重量％含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用いた代わりに、得られたアクリル系ポリマー２．０重量％含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用いた以外は、実施例１と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。

（実施例３）
ガラス製マイクロチップ（５０ｍｍ×７５ｍｍ×３ｍｍ）にクロス十字型の泳動路を作製し、該泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、アニオン性ポリマーであるコンドロイチン硫酸の１重量％水溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法によって泳動路をコーティングした。実施例１で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、１０００Ｖのマイクロチップ電気泳動法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
図４は、実施例３において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図４中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。図５は、実施例３において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムを示す模式図である。図５中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図５に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃとが良好に分離された。
なお、実施例３では、約６０秒の電気泳動時間で、安定型ＨｂＡ１ｃの分離を行うことができた。

（実施例４）
デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、カチオン性ポリマーであるキトサン（キトサン１００、和光純薬社製）を０．２重量％含有する０．２Ｎ塩酸溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法よって、キャピラリー内面をコーティングした。実施例１で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。

（実施例５）
キトサン溶液を用いた代わりに、カチオン性ポリマーであるポリブレン（ナカライテスク社製）の０．５重量％水溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法によって、キャピラリー内面のコーティングを行った。実施例２で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。

（実施例６）
ガラス製マイクロチップ（５０ｍｍ×７５ｍｍ×３ｍｍ）にクロス十字型の泳動路を作製し、該泳動路の両端に緩衝液槽を設置した。デキストラン硫酸水溶液を用いた代わりに、実施例１で得られたアクリル系ポリマーの０．５重量％水溶液を用いた以外は、実施例１と同様の方法によって泳動路をコーティングした。実施例１で用いたアクリル系ポリマー含有緩衝液と同様の緩衝液を用いて、１０００Ｖのマイクロチップ電気泳動法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。健常人血の測定では、図４と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂを含む試料の測定では、図５と同様のエレクトロフェログラムが得られた。

（比較例１）
フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）に０．２ＮのＮａＯＨ水溶液、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の順で通液してキャピラリー内を洗浄した。実施例１で用いたデキストラン硫酸（アニオン性ポリマー）水溶液を１分間通液して、キャピラリー内を動的にコーティングした。次に、実施例２で得られたアクリル系ポリマーを２．０重量％含有するリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）をキャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。
実施例１と同様の方法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。いずれの試料の測定の場合も、得られたエレクトロフェログラムには、ピークが検出されなかった。すなわち、固定化コーティング法を用いずに、動的コーティング法を用いた場合は、ヘモグロビン類の測定ができないことがわかった。

（比較例２）
フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス製：内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）を０．２ＮのＮａＯＨ水溶液、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ水溶液の順で通液してキャピラリー内を洗浄した。０．５重量％のウマ血清アルブミン（カチオン性ポリマー）を含むリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を１分間通液して、キャピラリー内を動的にコーティングした。次に、０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製：非アクリル系ポリマー）を含むリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を上記キャピラリーの両端にセットし、キャピラリー内に満たした。
得られたキャピラリー電気泳動装置と、緩衝液とを用いた以外は、実施例１と同様の方法により、キャピラリー電気泳動法によって、健常人血の測定及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。
図６は、比較例２において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
図６中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図６に示すように、得られたエレクトロフェログラムにおいて、安定型ＨｂＡ１ｃを示すピーク１と修飾Ｈｂを示すピーク３とが重なっている。固定化コーティング法ではなく動的コーティング法を用い、かつ、アクリル系ポリマー含有緩衝液を用いなかった場合は、安定型ＨｂＡ１ｃが修飾Ｈｂと分離できず、安定型ＨｂＡ１ｃの正確な測定ができなかった。

（比較例３）
実施例４におけるアクリル系ポリマー含有クエン酸緩衝液（実施例１で調製したもの）の代わりに、アクリル系ポリマーを含まないクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用いた以外は、実施例４と同様の方法によって、健常人血及び修飾Ｈｂを含む試料の測定を行った。いずれの試料の測定の場合も、得られたエレクトロフェログラムには、ピークが検出されなかった。すなわち、アクリル系ポリマー含有緩衝液を用いずに、アクリル系ポリマーを含有しない緩衝液を用いた場合は、ヘモグロビン類の分離ができないことがわかった。

（評価）
実施例１〜６及び比較例２の測定条件について、以下の評価を行った。
なお、比較例１及び比較例３の測定条件では、上述のようにピークが検出されず、ヘモグロビン類の測定ができなかったため、評価から除外した。

（１）修飾Ｈｂの分離性能試験
実施例１〜６及び比較例２について、健常人血試料と、該健常人血試料と同一の健常人血を元に調製した修飾Ｈｂ含有試料、すなわち、実施例１（４）修飾Ｈｂを含む試料の測定において調製した健常人血にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られた不安定型ＨｂＡ１ｃ含有試料と、更に、他の修飾Ｈｂ含有試料、すなわち、健常人血にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたアセチル化Ｈｂ含有試料と、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたカルバミル化Ｈｂ含有試料とを調製し、各試料における安定型ＨｂＡ１ｃ値を求めた。
なお、各試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出した。
得られた修飾Ｈｂ含有試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値から、得られた健常人血試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値を差し引いた値を求めた。
結果を表１に示した。

実施例１〜６の測定条件においては、修飾Ｈｂを含まない健常人血試料と、修飾Ｈｂ含有試料との安定型ＨｂＡ１ｃの測定値の差はほとんどなく、測定値差は０．２％以下であり、修飾Ｈｂ類の存在下においても、安定型ＨｂＡ１ｃが正確に測定できることがわかった。一方、比較例２の測定条件では、修飾Ｈｂ類が存在すると安定型ＨｂＡ１ｃ値が大きく変動し、正確な測定ができないことがわかった。

（２）同時再現性試験
実施例１〜６及び比較例２について、健常人血試料の同一試料を１０回連続して測定した場合の安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を測定した。
なお、ＣＶ値は（標準偏差／平均値）を算出することにより求めた。
また、比較例２では、１回の測定が終了した時点で、０．２ＮのＮａＯＨで１分間、０．２重量％のコンドロイチン硫酸を含むリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）で２分間順次送液して洗浄した。また、次の試料を測定する前には、比較例２において行ったのと同様にして動的コーティングを再び行ったうえで連続測定を実施し、同時再現性試験を行った。
結果を表２に示した。

（３）耐久性試験
実施例１〜６及び比較例２の測定条件を用いて、健常人血試料の同一試料を１００回連続して測定して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値の最大値と最小値との差（Ｒ値）を算出した。
結果を表２に示した。

表２に示すように、実施例１〜６では、同時再現性試験において、バラツキ度合いを示すＣＶ値が１％前後であり良好な結果であった。また、耐久性試験における連続１００試料測定時のバラツキ幅についても、０．２〜０．３％と非常に小さくなっていた。
この結果から、実施例１〜６の測定条件を用いた場合、優れた測定再現性を有し、多数回の繰り返し測定においても良好な測定値安定性を示すことがわかった。また、上述の評価において得られたエレクトロフェログラムは図２又は図４と同等のものであり、繰り返し測定後も良好な状態を保ったままであった。更に、動的コーティング法のように、測定毎の洗浄、コーティング操作等が不要であるため、より短時間の測定が可能であった。

比較例２について、同時再現性試験では、ＣＶ値が極めて大きく、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理する上で全く不充分な値となっていた。耐久性試験では、連続繰り返し測定２０回目以降はピークが暫時小さくなり、３０回目以降はピークが検出されず、測定不能となった。これはコーティングが剥離したか、試料中のＨｂが泳動路内に吸着したためであると推定される。

本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。

本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いる電気泳動装置の一例を示す模式図である。 実施例１、２、４及び５において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。 実施例１、２、４及び５において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。 実施例３及び６において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。 実施例３及び６において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。 比較例２において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。

符号の説明

１１ キャピラリー電気泳動装置
１２ 陽極槽
１３ 陰極槽
１４ キャピラリー
１５ 高圧電源
１６ 検出器
１７ 電極
１８ 電極
１ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
２ ＨｂＡ０のピーク
３ 修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）のピーク

Claims (2)

1. キャピラリー電気泳動法又はマイクロチップ電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、
   内面にイオン性ポリマーを固定化した泳動路と、電気泳動時に前記泳動路の内部に満たされる、アニオン性の官能基を有する水溶性アクリル系ポリマーを含有する緩衝液とを用いる
   ことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
2. 水溶性アクリル系ポリマーが有するアニオン性の官能基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。

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