JP2024065010A - キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンａ２を含む試料の分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】優れた精密性及び正確性で、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積等の割合を算出することができる、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法の提供。【解決手段】カチオン性ポリマーを含むアルカリ性水溶液を用いた、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法であって、以下の工程を含む分析方法。１）キャピラリ電気泳動により試料のエレクトロフェログラムを得る工程、２）Ｘピークの検出時間Ｔｘを特定する工程、３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程、４）Ｙピークの検出時間Ｔｙを特定する工程、５）Ｔｘ、Ｔａ２、及びＴｙの相対関係から、補正係数を算出する工程、６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合を算出する工程、７）補正係数によって、ＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を補正する工程。【選択図】図１
Description
本開示は、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法に関する。
臨床検査の現場においてヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」とも記す。）の分析が日常的に行われている。分析対象となるＨｂ種は検査の目的に応じて異なる。糖尿病の診断や病状把握のための分析対象としてはＨｂＡ１ｃが良く知られている。異常Ｈｂ症の診断のための分析対象としては、ＨｂＳ（鎌状赤血球Ｈｂ）、ＨｂＣ、ＨｂＤ及びＨｂＥなどに代表される変異Ｈｂが使用されている。また、βサラセミアの診断のための分析対象としては、ＨｂＡ２及びＨｂＦ（胎児Ｈｂ）が広く用いられている。
Ｈｂの分析は、イオン交換クロマトグラフィー法等の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）法などにより行われる。
特許文献１には、擬似固定相としてカチオン性ポリマーを含有する溶液を用いた、陰イオン交換動電クロマトグラフィーによる、ＨｂＡ２の分析方法が記載されている。
特許文献２及び特許文献３には、擬似固定相としてアニオン性ポリマーを含有する溶液を用いた、陽イオン交換動電クロマトグラフィーによる、界面到達時点を利用したＨｂＡ１ｃ等の成分を同定する方法の分析方法が記載されている。
特許文献１には、擬似固定相としてカチオン性ポリマーを含有する溶液を用いた、陰イオン交換動電クロマトグラフィーによる、ＨｂＡ２の分析方法が記載されている。
特許文献２及び特許文献３には、擬似固定相としてアニオン性ポリマーを含有する溶液を用いた、陽イオン交換動電クロマトグラフィーによる、界面到達時点を利用したＨｂＡ１ｃ等の成分を同定する方法の分析方法が記載されている。
βサラセミア等の診断においては、キャピラリ電気泳動によりエレクトロフェログラムを取得し、このエレクトロフェログラムから算出される総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合が使用されることがある。
しかしながら、近年、算出される上記ＨｂＡ２ピーク面積の割合はばらつきが生じることがあり、より優れた精密性が求められている。また、エレクトロフェログラムから算出される上記ＨｂＡ２ピーク面積の割合は、対照法により測定される値と乖離してしまう場合があり、優れた正確性も求められている。
しかしながら、近年、算出される上記ＨｂＡ２ピーク面積の割合はばらつきが生じることがあり、より優れた精密性が求められている。また、エレクトロフェログラムから算出される上記ＨｂＡ２ピーク面積の割合は、対照法により測定される値と乖離してしまう場合があり、優れた正確性も求められている。
本開示の一実施形態が解決しようとする課題は、優れた精密性及び正確性で、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積等の割合を算出することができる、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法を提供することである。
本開示の実施形態に係るキャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法は、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性水溶液を用い、以下の工程１）～７）を含む分析方法。
１）キャピラリ電気泳動により前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程、
２）ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する工程、
３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程、
４）ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する工程、
５）Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、及びＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する工程、
６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する工程、
７）前記補正係数によって、前記ＨｂＡ２ピーク面積の割合又は前記Ｙピーク面積の割合を補正する工程。
１）キャピラリ電気泳動により前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程、
２）ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する工程、
３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程、
４）ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する工程、
５）Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、及びＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する工程、
６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する工程、
７）前記補正係数によって、前記ＨｂＡ２ピーク面積の割合又は前記Ｙピーク面積の割合を補正する工程。
本開示の一実施形態によれば、優れた精密性及び正確性で、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積等の割合を算出することができる、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法を提供することができる。
以下、本発明の一例である実施形態について説明する。これらの説明および実施例は、実施形態を例示するものであり、発明の範囲を制限するものではない。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。
組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
本開示において、「工程」という語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても、その工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
本開示において実施形態を図面を参照して説明する場合、当該実施形態の構成は図面に示された構成に限定されない。また、各図における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに限定されない。
組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
本開示において、「工程」という語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても、その工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
本開示において実施形態を図面を参照して説明する場合、当該実施形態の構成は図面に示された構成に限定されない。また、各図における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに限定されない。
[分析方法]
本開示の実施形態に係る分析方法は（以下、「特定分析方法」とも記す。）は、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性水溶液を用いた、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法であって、以下の工程を含む。
１）キャピラリ電気泳動により前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程（以下、「第１工程」とも記す。）、
２）ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する工程（以下、「第２工程」とも記す。）、
３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程（以下、「第３工程」とも記す。）、
４）ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する工程（以下、「第４工程」とも記す。）、
５）Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、及びＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する工程（以下、「第５工程」とも記す。）、
６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する工程（以下、「第６工程」とも記す。）、
７）前記補正係数によって、前記ＨｂＡ２ピーク面積の割合又は前記Ｙピーク面積の割合を補正する工程（以下、「第７工程」とも記す。）。
本開示の実施形態に係る分析方法は（以下、「特定分析方法」とも記す。）は、カチオン性ポリマーを含むアルカリ性水溶液を用いた、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法であって、以下の工程を含む。
１）キャピラリ電気泳動により前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程（以下、「第１工程」とも記す。）、
２）ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する工程（以下、「第２工程」とも記す。）、
３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程（以下、「第３工程」とも記す。）、
４）ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する工程（以下、「第４工程」とも記す。）、
５）Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、及びＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する工程（以下、「第５工程」とも記す。）、
６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する工程（以下、「第６工程」とも記す。）、
７）前記補正係数によって、前記ＨｂＡ２ピーク面積の割合又は前記Ｙピーク面積の割合を補正する工程（以下、「第７工程」とも記す。）。
特定分析方法によれば、優れた精密性及び正確性で、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積等の割合を算出することができる。上記効果が奏される理由は明らかではないが以下のように推測される。
特定分析方法においては、算出された総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を、Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、並びにＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から算出された補正係数により補正する。これにより、算出された総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合の精密性及び正確性が改善されると推測される。
なお、エレクトロフェログラムから算出される上記ＨｂＡ２ピーク面積の割合は、対照法により測定される値と乖離してしまう理由としては、ＨｂＡ２ピークに続くピークによっては、その面積により増大又は減少される場合があるためと推測される。
特定分析方法においては、算出された総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を、Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、並びにＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から算出された補正係数により補正する。これにより、算出された総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合の精密性及び正確性が改善されると推測される。
なお、エレクトロフェログラムから算出される上記ＨｂＡ２ピーク面積の割合は、対照法により測定される値と乖離してしまう理由としては、ＨｂＡ２ピークに続くピークによっては、その面積により増大又は減少される場合があるためと推測される。
好ましい実施形態においては、第１工程の後に、第２工程～第４工程を実施する。第２工程～第４工程の順序は特に限定されるものではない。
好ましい実施形態においては、第２工程～第４工程の後に、第５工程～第６工程を実施する。第５工程～第６工程の順序は特に限定されるものではない。
好ましい実施形態においては、第５工程～第６工程の後に、第７工程を実施する。
好ましい実施形態においては、第２工程～第４工程の後に、第５工程～第６工程を実施する。第５工程～第６工程の順序は特に限定されるものではない。
好ましい実施形態においては、第５工程～第６工程の後に、第７工程を実施する。
（第１工程）
第１工程においては、キャピラリ電気泳動により試料のエレクトロフェログラムを得る。
エレクトロフェログラムは、アルカリ性溶液中において、キャピラリ電気泳動により試料中のＨｂを分離し、分離されたＨｂを検出し、吸光度スペクトルを入手し、吸光度スペクトルの波形を時間について微分することにより得ることができる。
第１工程においては、キャピラリ電気泳動により試料のエレクトロフェログラムを得る。
エレクトロフェログラムは、アルカリ性溶液中において、キャピラリ電気泳動により試料中のＨｂを分離し、分離されたＨｂを検出し、吸光度スペクトルを入手し、吸光度スペクトルの波形を時間について微分することにより得ることができる。
－分離－
Ｈｂの分離は、アルカリ性溶液中において、キャピラリ電気泳動により行う。
試料は、ＨｂＡ２を含有する。試料は、ＨｂＥ、ＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＧ、ＨｂＳ等を含有してもよい。
Ｈｂの分離は、アルカリ性溶液中において、キャピラリ電気泳動により行う。
試料は、ＨｂＡ２を含有する。試料は、ＨｂＥ、ＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＧ、ＨｂＳ等を含有してもよい。
アルカリ性溶液中におけるキャピラリ電気泳動による試料中のＨｂの分離は、キャピラリ流路を備える装置を使用することにより行うことができる。
具体的には、アルカリ性溶液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入し、試料の導入後、キャピラリ流路の全体又は一部に電圧を印加することにより行うことができる。上記電圧の印加により、試料中のＨｂを電気泳動させることができ、分離することができる。
キャピラリ流路への電圧の印加は、キャピラリ流路の試料導入側に負電極を接触させ、アルカリ性溶液供給側に正電極を接触させることにより行うことができる。
具体的には、アルカリ性溶液が充填されたキャピラリ流路に試料を導入し、試料の導入後、キャピラリ流路の全体又は一部に電圧を印加することにより行うことができる。上記電圧の印加により、試料中のＨｂを電気泳動させることができ、分離することができる。
キャピラリ流路への電圧の印加は、キャピラリ流路の試料導入側に負電極を接触させ、アルカリ性溶液供給側に正電極を接触させることにより行うことができる。
キャピラリ流路の断面形状は、特に限定されるものではなく、円形状であってもよく、矩形状であってもよく、その他の形状であってもよい。
矩形状の場合、キャピラリ流路の流路高さ及び流路幅は、それぞれ、１μｍ～１０００μｍであることが好ましく、１０μｍ～２００μｍであることがより好ましく、２５μｍ～１００μｍであることが更に好ましい。円形状の場合、キャピラリ流路の内径は、１０μｍ以上又は２５μｍ以上が好ましく、１００μｍ以下又は７５μｍ以下が好ましい。
キャピラリ流路の流路長は、１０ｍｍ～１５０ｍｍであることが好ましく、２０ｍｍ～６０ｍｍであることがより好ましい。
矩形状の場合、キャピラリ流路の流路高さ及び流路幅は、それぞれ、１μｍ～１０００μｍであることが好ましく、１０μｍ～２００μｍであることがより好ましく、２５μｍ～１００μｍであることが更に好ましい。円形状の場合、キャピラリ流路の内径は、１０μｍ以上又は２５μｍ以上が好ましく、１００μｍ以下又は７５μｍ以下が好ましい。
キャピラリ流路の流路長は、１０ｍｍ～１５０ｍｍであることが好ましく、２０ｍｍ～６０ｍｍであることがより好ましい。
キャピラリ流路の材質としては、ガラス、溶融シリカ、プラスチック等が挙げられる。プラスチックとしては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等が挙げられる。
分離工程においては、上記したキャピラリ流路がマイクロチップ化されたキャピラリ電気泳動チップを使用してもよい。
キャピラリ電気泳動チップは、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有することができ、試料保持槽と泳動液保持槽とはキャピラリ流路により連通する。
キャピラリ電気泳動チップのサイズは、特に限定されるものではなく、適宜調整することが好ましい。キャピラリ電気泳動チップのサイズは、例えば、長さ１０ｍｍ～２００ｍｍ、幅１ｍｍ～６０ｍｍ、厚み０．３ｍｍ～５ｍｍとすることができる。
キャピラリ電気泳動チップは、試料保持槽、泳動液保持槽及びキャピラリ流路を有することができ、試料保持槽と泳動液保持槽とはキャピラリ流路により連通する。
キャピラリ電気泳動チップのサイズは、特に限定されるものではなく、適宜調整することが好ましい。キャピラリ電気泳動チップのサイズは、例えば、長さ１０ｍｍ～２００ｍｍ、幅１ｍｍ～６０ｍｍ、厚み０．３ｍｍ～５ｍｍとすることができる。
試料保持槽及び泳動液保持槽の容積は、キャピラリ流路の内径及び長さに応じて適宜決定されるが、それぞれ、１ｍｍ３～１０００ｍｍ３であることが好ましく、５ｍｍ３～１００ｍｍ３であることがより好ましい。
試料保持槽に充填する試料の量は、特に限定されるものではなく、１μＬ～３０μＬとすることができる。
泳動液保持槽に充填するアルカリ性溶液の量は、特に限定されるものではなく、１μＬ～３０μＬとすることができる。
試料保持槽に充填する試料の量は、特に限定されるものではなく、１μＬ～３０μＬとすることができる。
泳動液保持槽に充填するアルカリ性溶液の量は、特に限定されるものではなく、１μＬ～３０μＬとすることができる。
キャピラリ流路の両端に印加する電圧は、５００Ｖ～１００００Ｖであることが好ましく、５００Ｖ～５０００Ｖであることがより好ましい。
キャピラリ流路内において、負電極側から正電極側に向かう液流を生じさせてもよい。液流としては、電気浸透流等が挙げられる。
キャピラリ流路は、その内壁がカチオン性物質又はアニオン性物質で被覆されていることが好ましい。
カチオン性物質によりキャピラリ流路の内壁を被覆することによって、キャピラリ流路の内壁をプラスに帯電させることができる。その結果、キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。
アニオン性物質によりキャピラリ流路の内壁を被覆した場合、キャピラリ流路の内壁はマイナスに帯電するが、アルカリ性溶液に含有されるカチオン性ポリマーがマイナスに帯電したキャピラリ流路の内壁に結合する。これにより、キャピラリ流路の内壁はプラスに帯電され、上記と同様にキャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。
カチオン性物質によりキャピラリ流路の内壁を被覆することによって、キャピラリ流路の内壁をプラスに帯電させることができる。その結果、キャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。
アニオン性物質によりキャピラリ流路の内壁を被覆した場合、キャピラリ流路の内壁はマイナスに帯電するが、アルカリ性溶液に含有されるカチオン性ポリマーがマイナスに帯電したキャピラリ流路の内壁に結合する。これにより、キャピラリ流路の内壁はプラスに帯電され、上記と同様にキャピラリ流路内に負電極側から正電極側に向かう電気浸透流を容易に生じさせることができる。
カチオン性物質は、特に限定されるものではなく、カチオン性官能基を有するシランカップリング剤等を使用することができる。分離精度を向上する観点から、カチオン性物質は、第４級アンモニウム塩基を有するポリマーであることが好ましく、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドがより好ましい。
アニオン性物質は、特に限定されるものではなく、アニオン性基を有する多糖類、アニオン性官能基を有するシランカップリング剤等を使用することができる。
アニオン性基を有する多糖類としては、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、リン酸化多糖類等が挙げられる。
硫酸化多糖類としては、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、これらの塩等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸、ヒアルロン酸、これらの塩等が挙げられる。
アニオン性基を有する多糖類としては、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、リン酸化多糖類等が挙げられる。
硫酸化多糖類としては、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、これらの塩等が挙げられる。カルボン酸化多糖類としては、アルギン酸、ヒアルロン酸、これらの塩等が挙げられる。
図１Ａ及び図１Ｂに、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す。図１Ａは、キャピラリ電気泳動チップの一実施形態を示す上面図であり、図１Ｂは、図１Ａに示す電気泳動チップの断面図である。
図１Ａ及びＢに示すキャピラリ電気泳動チップは、キャピラリ流路１、試料保持槽２及び泳動液保持槽３を備え、試料保持槽２及び泳動液保持槽３は、キャピラリ流路１により連通している。キャピラリ流路１には検出部４が形成されている。
試料保持槽２及び泳動液保持槽３は、キャピラリ流路１の両端に電圧を印加するための電極をそれぞれ備えていてもよい（図示せず）。具体的には、試料保持槽２（試料導入側）が負電極を備え、泳動液保持槽３（アルカリ性溶液供給側）が正電極を備えることができる。
図１Ａ及びＢに示すキャピラリ電気泳動チップは、キャピラリ流路１、試料保持槽２及び泳動液保持槽３を備え、試料保持槽２及び泳動液保持槽３は、キャピラリ流路１により連通している。キャピラリ流路１には検出部４が形成されている。
試料保持槽２及び泳動液保持槽３は、キャピラリ流路１の両端に電圧を印加するための電極をそれぞれ備えていてもよい（図示せず）。具体的には、試料保持槽２（試料導入側）が負電極を備え、泳動液保持槽３（アルカリ性溶液供給側）が正電極を備えることができる。
検出部４の位置、すなわち、分離に要する長さ（試料保持槽２から検出部４までの距離、図１Ａにおけるｘ）は、キャピラリ流路１の長さ等により適宜決定できる。キャピラリ流路１の長さ（図１Ａにおけるｘ＋ｙ）が１０ｍｍ～１５０ｍｍである場合、試料保持槽２から検出部４までの距離（ｘ）は、５ｍｍ～１４０ｍｍであることが好ましく、１０ｍｍ～１００ｍｍであることがより好ましく、１５ｍｍ～５０ｍｍであることが更に好ましい。
－－アルカリ性溶液－－
本開示において、「アルカリ性」とは、ｐＨ７．０超であることを意味する。アルカリ性溶液のｐＨは、Ｈｂの等電点よりも高いことが好ましく、７．５～１２．０であることが好ましく、８．５～１１．０であることがより好ましく、９．５～１０．５であることが更に好ましい。
なお、本開示において、アルカリ性溶液のｐＨは、２５℃におけるアルカリ性溶液のｐＨであり、電極を浸漬してから３０分経過後にｐＨメータを用いて測定する。ｐＨメータとしては、堀場製作所社製のＦ－７２又はこれと同程度の装置を使用することができる。
本開示において、「アルカリ性」とは、ｐＨ７．０超であることを意味する。アルカリ性溶液のｐＨは、Ｈｂの等電点よりも高いことが好ましく、７．５～１２．０であることが好ましく、８．５～１１．０であることがより好ましく、９．５～１０．５であることが更に好ましい。
なお、本開示において、アルカリ性溶液のｐＨは、２５℃におけるアルカリ性溶液のｐＨであり、電極を浸漬してから３０分経過後にｐＨメータを用いて測定する。ｐＨメータとしては、堀場製作所社製のＦ－７２又はこれと同程度の装置を使用することができる。
－－－カチオン性ポリマー－－－
アルカリ性溶液は、カチオン性ポリマーを含有する。アルカリ性溶液は、カチオン性ポリマーを２種以上含有してもよい。
本開示において、「カチオン性ポリマー」とは、カチオン性基を有するポリマーを意味する。
本開示において、「カチオン性基」とは、カチオン基及びイオン化されてカチオン基となる基を包含する。
カチオン性基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩基、イミノ基等が挙げられる。
アルカリ性溶液は、カチオン性ポリマーを含有する。アルカリ性溶液は、カチオン性ポリマーを２種以上含有してもよい。
本開示において、「カチオン性ポリマー」とは、カチオン性基を有するポリマーを意味する。
本開示において、「カチオン性基」とは、カチオン基及びイオン化されてカチオン基となる基を包含する。
カチオン性基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩基、イミノ基等が挙げられる。
カチオン性ポリマーは、水溶性であることが好ましい。なお、本開示において、「水溶性」とは、対象物質が２５℃の水に対して１質量％以上溶解することを意味する。
第１級～第３級アミノ基又は第１級～第３級アミノ基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリジアリルアミン、ポリメチルジアリルアミン、ポリエチレンイミン、ジアリルアミン－アクリルアミド重合物、ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重合物、アリルアミン－ジアリルアミン重合物等が挙げられる。上記したカチオン性ポリマーは塩の状態であってもよく、塩酸塩等が挙げられる。
イミノ基又はイミノ基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
第４級アンモニウム塩基又は第４級アンモニウム塩基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリクオタニウム、ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重合物、ジメチルアミン－エピクロルヒドリン重合物等が挙げられる。
本開示において「ポリクオタニウム」とは、第４級アンモニウム基を有するモノマーに由来する構成単位を含むカチオン性ポリマーをいう。ポリクオタニウムは、INCI(InternationalNomenclatureforCosmeticIngredients)directoryで確認できる。ポリクオタニウムとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム－６（poly(diallyldimethylammoniumchloride）、ポリクオタニウム－７（copolymerofacrylamideanddiallyldimethylammoniumchloride）、ポリクオタニウム－４（Diallyldimethylammoniumchloride-hydroxyethylcellulosecopolymer）、ポリクオタニウム－２２（copolymerofacrylicacidanddiallyldimethylammoniumchloride）等のポリジアリルジメチルアンモニウム塩、及びポ
リクオタニウム－２（poly[bis(2-chloroethyl)ether-alt-1,3-bis[3-(dimethylamino)propyl]urea]）等が挙げられる。
また、カチオン性ポリマーとしては、上記アンモニウム塩以外にも、一又は複数の実施形態において、ホスホニウム塩、オキソニウム塩、スルホニウム塩、フルオロニウム塩、クロロニウム塩等のオニウム塩のカチオンポリマーも利用できる。
ヒドラジド基又はヒドラジド基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、アミノポリアクリルアミド等が挙げられる。
イミノ基又はイミノ基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
第４級アンモニウム塩基又は第４級アンモニウム塩基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、ポリクオタニウム、ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重合物、ジメチルアミン－エピクロルヒドリン重合物等が挙げられる。
本開示において「ポリクオタニウム」とは、第４級アンモニウム基を有するモノマーに由来する構成単位を含むカチオン性ポリマーをいう。ポリクオタニウムは、INCI(InternationalNomenclatureforCosmeticIngredients)directoryで確認できる。ポリクオタニウムとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム－６（poly(diallyldimethylammoniumchloride）、ポリクオタニウム－７（copolymerofacrylamideanddiallyldimethylammoniumchloride）、ポリクオタニウム－４（Diallyldimethylammoniumchloride-hydroxyethylcellulosecopolymer）、ポリクオタニウム－２２（copolymerofacrylicacidanddiallyldimethylammoniumchloride）等のポリジアリルジメチルアンモニウム塩、及びポ
リクオタニウム－２（poly[bis(2-chloroethyl)ether-alt-1,3-bis[3-(dimethylamino)propyl]urea]）等が挙げられる。
また、カチオン性ポリマーとしては、上記アンモニウム塩以外にも、一又は複数の実施形態において、ホスホニウム塩、オキソニウム塩、スルホニウム塩、フルオロニウム塩、クロロニウム塩等のオニウム塩のカチオンポリマーも利用できる。
ヒドラジド基又はヒドラジド基にイオン化されうるカチオン性基を有するカチオン性ポリマーとしては、アミノポリアクリルアミド等が挙げられる。
分離時間を短縮する観点からは、カチオン性ポリマーの重量平均分子量は、１０，０００～５００，０００であることが好ましい。
本開示において、カチオン性ポリマーの重量平均分子量はカタログ値を参照する。重量平均分子量のカタログ値がない場合、重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により測定されるポリエチレングリコール換算の重量平均分子量とする。
本開示において、カチオン性ポリマーの重量平均分子量はカタログ値を参照する。重量平均分子量のカタログ値がない場合、重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により測定されるポリエチレングリコール換算の重量平均分子量とする。
分離時間を短縮する観点からは、アルカリ性溶液の総質量に対するカチオン性ポリマーの含有率は、０．５質量％～１０質量％であることが好ましく、０．７５質量％～５．０質量％であることがより好ましく、１．０質量％～３．０質量％であることが更に好ましい。
カチオン性ポリマーは、従来公知の方法により合成したものを使用してもよく、市販されるものを使用してもよい。
－－－水－－－
アルカリ性溶液は、水を含有してもよい。水としては、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水等が挙げられる。
アルカリ性溶液の総質量に対する水の含有率は、特に限定されるものではなく、１０質量％～９９．９質量％とすることができる。
アルカリ性溶液は、水を含有してもよい。水としては、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水等が挙げられる。
アルカリ性溶液の総質量に対する水の含有率は、特に限定されるものではなく、１０質量％～９９．９質量％とすることができる。
－－－添加剤－－－
アルカリ性溶液は、非界面活性剤型の両イオン性物質、ｐＨ緩衝物質、微生物の繁殖等を抑制するための保存剤などの添加剤を含有してもよい。保存剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、エチルパラベン、プロクリン等が挙げられる。
アルカリ性溶液は、非界面活性剤型の両イオン性物質、ｐＨ緩衝物質、微生物の繁殖等を抑制するための保存剤などの添加剤を含有してもよい。保存剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、エチルパラベン、プロクリン等が挙げられる。
－試料－
試料はＨｂＡ２を含有する。試料は、ＨｂＥ、ＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＧ、ＨｂＳ等を含有してもよく、これらは、ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークを形成する。Ｙピークについては後述する。
試料はＨｂＡ２を含有する。試料は、ＨｂＥ、ＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＣ、ＨｂＤ、ＨｂＧ、ＨｂＳ等を含有してもよく、これらは、ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークを形成する。Ｙピークについては後述する。
試料の総質量に対するＨｂの含有量の和は、特に限定されるものではなく、０．００１質量％～１００質量％とすることができる。
試料の形態は特に限定されるものではなく、試料原料を調製したものであってもよく、試料原料そのものであってもよい。
試料原料としては、Ｈｂを含む原料、生体試料等が挙げられる。
生体試料としては、血液、赤血球成分等を含む血液由来物等が挙げられる。
血液は、生体から採取された血液が挙げられ、ヒト以外の哺乳類の血液、ヒトの血液等が挙げられる。
赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであり、且つ赤血球成分を含むものが挙げられる。例えば、血漿が除かれた血球画分、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球等が挙げられる。
試料の形態は特に限定されるものではなく、試料原料を調製したものであってもよく、試料原料そのものであってもよい。
試料原料としては、Ｈｂを含む原料、生体試料等が挙げられる。
生体試料としては、血液、赤血球成分等を含む血液由来物等が挙げられる。
血液は、生体から採取された血液が挙げられ、ヒト以外の哺乳類の血液、ヒトの血液等が挙げられる。
赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであり、且つ赤血球成分を含むものが挙げられる。例えば、血漿が除かれた血球画分、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球等が挙げられる。
分離精度を向上する観点から、試料は、カチオン性ポリマーを含有するアルカリ性溶液を含有することが好ましい。
上記アルカリ性溶液を含有する試料は、上記アルカリ性溶液を用いて試料原料を希釈することにより得ることができる。希釈率は、質量基準で、１．２倍～１００倍であることが好ましく、２倍～６０倍であることがより好ましく、３倍～５０倍であることが更に好ましい。希釈に使用する材料は特に限定されるものではなく、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸等）、界面活性剤（例えば、エマルゲンＬＳ－１１０（花王製）等）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、イオン強度調整剤（例えば、塩化ナトリウム等）、屈折率調整剤（例えば、スクロース等の糖類）などが挙げられる。
また、上記アルカリ性溶液は、キャピラリ流路に充填されるアルカリ性溶液と同一であってもよく、異なっていてもよい。
上記アルカリ性溶液を含有する試料は、上記アルカリ性溶液を用いて試料原料を希釈することにより得ることができる。希釈率は、質量基準で、１．２倍～１００倍であることが好ましく、２倍～６０倍であることがより好ましく、３倍～５０倍であることが更に好ましい。希釈に使用する材料は特に限定されるものではなく、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸等）、界面活性剤（例えば、エマルゲンＬＳ－１１０（花王製）等）、防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）、イオン強度調整剤（例えば、塩化ナトリウム等）、屈折率調整剤（例えば、スクロース等の糖類）などが挙げられる。
また、上記アルカリ性溶液は、キャピラリ流路に充填されるアルカリ性溶液と同一であってもよく、異なっていてもよい。
－検出工程－
Ｈｂの検出は、分離されたＨｂに対し波長４１５～４２０ｎｍの光を照射し、縦軸を吸光度、横軸を時間とする吸光度スペクトルを得ることにより行われる。
Ｈｂの分離にキャピラリ電気泳動チップを使用する場合、波長４１５～４２０ｎｍの光は、検出部に照射することが好ましい。
吸光度スペクトルは、アークレイ社製のザラボ００１又はこれと同程度の装置を使用することにより得ることができる。
Ｈｂの検出は、分離されたＨｂに対し波長４１５～４２０ｎｍの光を照射し、縦軸を吸光度、横軸を時間とする吸光度スペクトルを得ることにより行われる。
Ｈｂの分離にキャピラリ電気泳動チップを使用する場合、波長４１５～４２０ｎｍの光は、検出部に照射することが好ましい。
吸光度スペクトルは、アークレイ社製のザラボ００１又はこれと同程度の装置を使用することにより得ることができる。
上記した吸光度スペクトルの波形を時間について微分することによりエレクトロフェログラム（微分波形）を得ることができる。
図１Ａ及び図１Ｂを参照し、上記した分離及び検出の一実施形態を説明する。なお、分離及び検出は以下に説明する方法に限定されない。
まず、キャピラリ電気泳動チップの泳動液保持槽３に、カチオン性ポリマーを含有するアルカリ性溶液を泳動液として充填し、毛細管現象によりアルカリ性溶液をキャピラリ流路１に充填する。
次いで、アルカリ性溶液が充填されたキャピラリ電気泳動チップの試料保持槽２に試料を供給する。この供給は連続的に行われることが好ましい。
試料保持槽２に供給する試料は、試料原料である全血を上記アルカリ性溶液により希釈することにより調製できる。
試料保持槽２に負電極、泳動液保持槽３に正電極を接触させ（図示せず。）、キャピラリ流路１の両端、すなわち、試料保持槽２及び泳動液保持槽３との間に電圧を印加する。これにより、試料保持槽２からキャピラリ流路１に試料が導入され、Ｈｂを含む試料が試料保持槽２から泳動液保持槽３に向かって移動するとともに、Ｈｂの分離が行われる。
そして、検出部４において、波長４１５～４２０ｎｍの光を照射し、吸光度測定装置により、吸光度を測定することにより、Ｈｂの検出を行う。
（第２工程）
第２工程においては、ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する。一実施形態において、Ｘピークは、電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）に起因する。
また、一実施形態において、Ｘピークは、試料と泳動液との界面に起因する界面検出のシグナルであって、より詳細には、当該界面がキャピラリ流路１の検出部４の位置へ到達した時間（界面到達時間）に検出されるピークである。
Ｘピークは、試料に由来するピークのうち、ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるピークであってもよい。
また、Ｘピークは、試料以外に試料保持槽に追加されるマーカーに由来するピークであってもよい。マーカーは、４１５～４２０ｎｍの波長域で光を吸収し、ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるような電荷を有するものであればよく、無機化合物であってもよく、有機化合物であってもよい。
Ｘピークの検出時間Ｔｘは、エレクトロフェログラムから特定することができる。
より具体的には、エレクトロフェログラムにおいて、最初に吸光度変化量が０．１ｍＡｂｓ／ｓｅｃを超えたピークをＸピークとし、特開２０２０－３０１１６号公報に記載の方法により、ピークのトップ及びボトムを決定する。以降のピークについても同様の方法によりピークのトップ及びボトムの決定を行う。
第２工程においては、ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する。一実施形態において、Ｘピークは、電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）に起因する。
また、一実施形態において、Ｘピークは、試料と泳動液との界面に起因する界面検出のシグナルであって、より詳細には、当該界面がキャピラリ流路１の検出部４の位置へ到達した時間（界面到達時間）に検出されるピークである。
Ｘピークは、試料に由来するピークのうち、ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるピークであってもよい。
また、Ｘピークは、試料以外に試料保持槽に追加されるマーカーに由来するピークであってもよい。マーカーは、４１５～４２０ｎｍの波長域で光を吸収し、ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるような電荷を有するものであればよく、無機化合物であってもよく、有機化合物であってもよい。
Ｘピークの検出時間Ｔｘは、エレクトロフェログラムから特定することができる。
より具体的には、エレクトロフェログラムにおいて、最初に吸光度変化量が０．１ｍＡｂｓ／ｓｅｃを超えたピークをＸピークとし、特開２０２０－３０１１６号公報に記載の方法により、ピークのトップ及びボトムを決定する。以降のピークについても同様の方法によりピークのトップ及びボトムの決定を行う。
（第３工程）
第３工程においては、ＨｂＡ２ピークの検出時間を特定する。ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２は、エレクトロフェログラムから特定することができる。
Ｘピークを起点として、最初に検出される面積比率（当該ピーク面積／総ピーク面積）が１％以上の大きさのピークをＨｂＡ２ピークとする。
第３工程においては、ＨｂＡ２ピークの検出時間を特定する。ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２は、エレクトロフェログラムから特定することができる。
Ｘピークを起点として、最初に検出される面積比率（当該ピーク面積／総ピーク面積）が１％以上の大きさのピークをＨｂＡ２ピークとする。
（第４工程）
第４工程においては、ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する。Ｙピークの検出時間Ｔｙは、エレクトロフェログラムから特定することができる。
Ｘピークを起点として、２番目に検出される面積比率（当該ピーク面積／総ピーク面積）が１０％以上の大きさのピークをＹピークとする。
第４工程においては、ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する。Ｙピークの検出時間Ｔｙは、エレクトロフェログラムから特定することができる。
Ｘピークを起点として、２番目に検出される面積比率（当該ピーク面積／総ピーク面積）が１０％以上の大きさのピークをＹピークとする。
（第５工程）
第５工程においては、Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、並びにＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する。
補正係数は、Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙの３つの検出時間の相対的な関係を表す値であればよい。
補正係数は、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２及び電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）であるＸピークの検出時間Ｔｘの差と、Ｙピークの検出時間Ｔｙ及びＴｘの差と、の比であることが好ましい。
具体的には、補正係数は、（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）又は（Ｔａ２－Ｔｘ）／（Ｔｙ－Ｔｘ）で表されることが好ましい。
なお、補正係数は、（Ｔｘ－Ｔａ２）／（Ｔｙ－Ｔａ２）、（Ｔｙ－Ｔａ２）／（Ｔｘ－Ｔａ２）、（Ｔｘ－Ｔｙ）／（Ｔａ２－Ｔｙ）、（Ｔａ２－Ｔｙ）／（Ｔｘ－Ｔｙ）等であってもよい。
なお、補正係数は上記例示に限定されるものではない。
補正係数の算出方法がいずれであっても、後述の第７工程で使用される補正係数、補正式、又は補正係数とは異なる予め定められた係数を調整すれば、ＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を同じように補正することができる。
第５工程においては、Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、並びにＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する。
補正係数は、Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙの３つの検出時間の相対的な関係を表す値であればよい。
補正係数は、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２及び電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）であるＸピークの検出時間Ｔｘの差と、Ｙピークの検出時間Ｔｙ及びＴｘの差と、の比であることが好ましい。
具体的には、補正係数は、（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）又は（Ｔａ２－Ｔｘ）／（Ｔｙ－Ｔｘ）で表されることが好ましい。
なお、補正係数は、（Ｔｘ－Ｔａ２）／（Ｔｙ－Ｔａ２）、（Ｔｙ－Ｔａ２）／（Ｔｘ－Ｔａ２）、（Ｔｘ－Ｔｙ）／（Ｔａ２－Ｔｙ）、（Ｔａ２－Ｔｙ）／（Ｔｘ－Ｔｙ）等であってもよい。
なお、補正係数は上記例示に限定されるものではない。
補正係数の算出方法がいずれであっても、後述の第７工程で使用される補正係数、補正式、又は補正係数とは異なる予め定められた係数を調整すれば、ＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を同じように補正することができる。
（第６工程）
第６工程においては、エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する。
第６工程においては、エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する。
（第７工程）
第７工程においては、補正係数によって、ＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を補正する。
一実施形態において、上記補正は、補正係数、及び補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われる。
補正係数が（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）又は（Ｔａ２－Ｔｘ）／（Ｔｙ－Ｔｘ）で求められる場合、上記係数は、補正係数の値が１から離れるほど、小さくなる。
第７工程においては、補正係数によって、ＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を補正する。
一実施形態において、上記補正は、補正係数、及び補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われる。
補正係数が（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）又は（Ｔａ２－Ｔｘ）／（Ｔｙ－Ｔｘ）で求められる場合、上記係数は、補正係数の値が１から離れるほど、小さくなる。
一実施形態において、補正係数が、１．０１０以上、１．０４７未満の場合、下記式に、ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合、及び補正係数を代入し、補正値を求める。下記式において、予め定められた係数は、－９０及び９５．２である。
補正値（％）＝ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合／（－９０×補正係数＋９５．２）
補正値（％）＝ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合／（－９０×補正係数＋９５．２）
一実施形態において、補正係数が、１．０４７以上、１．２０７未満の場合、下記式に、ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合、及び補正係数を代入し、補正値を求める。下記式において、予め定められた係数は、－３．５及び５．４３である。
補正値（％）＝ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合／（－３．５×補正係数＋５．４３）
補正値（％）＝ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合／（－３．５×補正係数＋５．４３）
一実施形態において、補正係数が、１．２０７以上、１．４５０未満の場合、下記式に、ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合、及び補正係数を代入し、補正値を求める。下記式において、予め定められた係数は、－２．５及び４．２６である。
補正値（％）＝ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合／（－２．５×補正係数＋４．２６）
補正値（％）＝ＨｂＡ２ピーク面積又はＹピーク面積の割合／（－２．５×補正係数＋４．２６）
図２にエレクトロフェログラムを示す。
図２において、Ｘピークの検出時間をＴｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間をＴａ２、Ｙピークの検出時間をＴｙで示す。
図２において、Ｘピークの検出時間をＴｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間をＴａ２、Ｙピークの検出時間をＴｙで示す。
本分析方法は、異常Ｈｂ症、β－サラセミアの予防、診断及び治療等の用途に利用することができる。
本開示は、以下の実施形態に関しうる。
＜１＞ カチオン性ポリマーを含むアルカリ性水溶液を用いた、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法であって、以下の工程１）～７）を含む分析方法。
１）キャピラリ電気泳動により前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程、
２）ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する工程、
３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程、
４）ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する工程、
５）Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、及びＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する工程、
６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する工程、
７）前記補正係数によって、前記ＨｂＡ２ピーク面積の割合又は前記Ｙピーク面積の割合を補正する工程。
＜２＞ 前記補正係数が、（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）又は（Ｔａ２－Ｔｘ）／（Ｔｙ－Ｔｘ）で求められる、前記＜１＞に記載の分析方法。
＜３＞ 前記ＨｂＡ２ピーク面積又は前記Ｙピーク面積の割合の補正が、前記補正係数、及び前記補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われる、前記＜１＞又は＜２＞に記載の分析方法。
＜４＞ 前記予め定められた係数が、前記補正係数の値に応じて変動する、前記＜３＞に記載の分析方法。
＜５＞ 前記ＨｂＡ２ピーク面積又は前記Ｙピーク面積の割合の補正が、前記補正係数、及び前記補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われ、前記補正係数の値が１から離れるほど、前記予め定められた係数が小さくなる、前記＜２＞に記載の分析方法。
＜６＞ キャピラリ電気泳動がキャピラリ流路を備える装置を用いて行われ、
前記キャピラリ流路の内壁が、第４級アンモニウム塩基を含むカチオン性ポリマーで被覆されている、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の分析方法。
＜７＞ 前記キャピラリ流路に前記試料が連続的に供給される、前記＜６＞に記載の分析方法。
＜１＞ カチオン性ポリマーを含むアルカリ性水溶液を用いた、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法であって、以下の工程１）～７）を含む分析方法。
１）キャピラリ電気泳動により前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程、
２）ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する工程、
３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程、
４）ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する工程、
５）Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、及びＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する工程、
６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する工程、
７）前記補正係数によって、前記ＨｂＡ２ピーク面積の割合又は前記Ｙピーク面積の割合を補正する工程。
＜２＞ 前記補正係数が、（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）又は（Ｔａ２－Ｔｘ）／（Ｔｙ－Ｔｘ）で求められる、前記＜１＞に記載の分析方法。
＜３＞ 前記ＨｂＡ２ピーク面積又は前記Ｙピーク面積の割合の補正が、前記補正係数、及び前記補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われる、前記＜１＞又は＜２＞に記載の分析方法。
＜４＞ 前記予め定められた係数が、前記補正係数の値に応じて変動する、前記＜３＞に記載の分析方法。
＜５＞ 前記ＨｂＡ２ピーク面積又は前記Ｙピーク面積の割合の補正が、前記補正係数、及び前記補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われ、前記補正係数の値が１から離れるほど、前記予め定められた係数が小さくなる、前記＜２＞に記載の分析方法。
＜６＞ キャピラリ電気泳動がキャピラリ流路を備える装置を用いて行われ、
前記キャピラリ流路の内壁が、第４級アンモニウム塩基を含むカチオン性ポリマーで被覆されている、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の分析方法。
＜７＞ 前記キャピラリ流路に前記試料が連続的に供給される、前記＜６＞に記載の分析方法。
以下に実施例について説明するが、本開示はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の説明において、特に断りのない限り、「部」及び「％」はすべて質量基準である。
＜分離デバイスと測定機器＞
分離デバイスとしては、図１に示す構造のキャピラリ流路１を有する樹脂製のチップ（流路幅４０μｍ、流路高さ４０μｍ、流路長：３０ｍｍ、試料保持槽２から検出部４までの距離（ｘ）２０ｍｍ）を用いた。試料保持槽２及び泳動液保持槽３の容量は１０μＬとした。キャピラリ流路の内壁は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドで被覆した。
測定装置は、自社製の電気泳動装置を用いた。
分離デバイスとしては、図１に示す構造のキャピラリ流路１を有する樹脂製のチップ（流路幅４０μｍ、流路高さ４０μｍ、流路長：３０ｍｍ、試料保持槽２から検出部４までの距離（ｘ）２０ｍｍ）を用いた。試料保持槽２及び泳動液保持槽３の容量は１０μＬとした。キャピラリ流路の内壁は、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドで被覆した。
測定装置は、自社製の電気泳動装置を用いた。
＜＜実施例１＞＞
下記の各物質を混合して、ｐＨが９．８となるまで、水酸化ナトリウム及び水を加え、アルカリ性溶液（キャピラリ電気泳動用溶液）１を調製した。
（アルカリ性溶液１の組成）
・ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重縮合物（カチオン性ポリマー、センカ製、ユニセンスＫＨＥ １０００Ｌ、重量平均分子量１００，０００～５００，０００） １．５質量％
・アジ化ナトリウム ０．０２質量％
・水酸化ナトリウム
・水
下記の各物質を混合して、ｐＨが９．８となるまで、水酸化ナトリウム及び水を加え、アルカリ性溶液（キャピラリ電気泳動用溶液）１を調製した。
（アルカリ性溶液１の組成）
・ジメチルアミン－アンモニア－エピクロルヒドリン重縮合物（カチオン性ポリマー、センカ製、ユニセンスＫＨＥ １０００Ｌ、重量平均分子量１００，０００～５００，０００） １．５質量％
・アジ化ナトリウム ０．０２質量％
・水酸化ナトリウム
・水
健常者全血を、下記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ａを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
（アルカリ性溶液の組成）
・ポリエチレンイミン（富士フイルム和光純薬製、重量平均分子量７０，０００） １質量％
・エマルゲンＬＳ－１１０（花王製） ０．４質量％
・アジ化ナトリウム ０．０２質量％
・スクロース ７．８７質量％
・塩化ナトリウム ０．２６質量％
・塩酸
・水
（アルカリ性溶液の組成）
・ポリエチレンイミン（富士フイルム和光純薬製、重量平均分子量７０，０００） １質量％
・エマルゲンＬＳ－１１０（花王製） ０．４質量％
・アジ化ナトリウム ０．０２質量％
・スクロース ７．８７質量％
・塩化ナトリウム ０．２６質量％
・塩酸
・水
泳動液保持槽３にアルカリ性溶液１を９μＬ供給し、毛細管現象によりキャピラリ流路１内にアルカリ性溶液１を充填した。
試料保持槽２に試料Ａを９μＬ供給した。
次いで、試料保持槽２に負電極、泳動液保持槽３に正電極を接触させ、７５μＡの定電流制御にて電圧を印加して電気泳動を開始した。
次いで、試料保持槽２に負電極、泳動液保持槽３に正電極を接触させ、７５μＡの定電流制御にて電圧を印加して電気泳動を開始した。
電気泳動が行われている間、検出部４に４１５ｎｍの光を照射し、その吸光度を測定し、吸光度スペクトルを得た。吸光度スペクトルの波形を時間について微分することによりエレクトロフェログラムを得た。なお、電気泳動は９０秒間行った。得られたエレクトロフェログラムを図２に示す。
なお、光の照射、吸光度の測定及びエレクトロフェログラムの取得には、アークレイ社製のザラボ００１を使用した。
なお、光の照射、吸光度の測定及びエレクトロフェログラムの取得には、アークレイ社製のザラボ００１を使用した。
エレクトロフェログラムから、Ｘピーク、ＨｂＡ２ピーク、Ｙピークを特定し、各ピークの検出時間（Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙ）を特定した。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＡピークである。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＡピークである。
補正係数Ｒｙを下記式に基づいて、求めた。
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａ（％）を求めた。
補正係数Ｒｙが、１．２０７以上、１．４５０未満に該当したため、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａを、下記式に基づいて、補正し、補正値Ａ（％）を算出した。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－２．５×Ｒｙ＋４．２６）
補正係数Ｒｙが、１．２０７以上、１．４５０未満に該当したため、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａを、下記式に基づいて、補正し、補正値Ａ（％）を算出した。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－２．５×Ｒｙ＋４．２６）
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａ（％）及び補正値Ａの測定を１６０回行い、補正値Ａの平均値（平均補正値Ａ）及び標準偏差を表１に示す。
＜＜実施例２＞＞
βサラセミア患者全血を、上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｂを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
βサラセミア患者全血を、上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｂを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
試料Ａを試料Ｂに変更した以外は、実施例１と同様にして、平均補正値Ｂ（％）等を求めた。平均補正値Ｂ及び標準偏差を表１に示す。
＜＜比較例１＞＞
実施例１において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａの平均値（１６０回平均）、及び標準偏差を比較例１として、表１に示す。
実施例１において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａの平均値（１６０回平均）、及び標準偏差を比較例１として、表１に示す。
＜＜比較例２＞＞
実施例２において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｂの平均値（１６０回平均）、及び標準偏差を比較例２として、表１に示す。
実施例２において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｂの平均値（１６０回平均）、及び標準偏差を比較例２として、表１に示す。
＜＜精密性評価＞＞
実施例１及び実施例２においては、標準偏差を、平均補正値Ａ又は平均補正値Ｂにより除した後、１００倍することにより、精密性（％）を求めた。結果を表１に示す。
比較例１及び比較例２においては、標準偏差を、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａ又は割合Ｂの平均値（１６０回平均）により除した後、１００倍することにより、精密性（％）を求めた。結果を表１に示す。
実施例１及び実施例２においては、標準偏差を、平均補正値Ａ又は平均補正値Ｂにより除した後、１００倍することにより、精密性（％）を求めた。結果を表１に示す。
比較例１及び比較例２においては、標準偏差を、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ａ又は割合Ｂの平均値（１６０回平均）により除した後、１００倍することにより、精密性（％）を求めた。結果を表１に示す。
＜＜実施例３＞＞
変異ＨｂＥキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｃを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
変異ＨｂＥキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｃを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
実施例１と同様の測定を１回行い、エレクトロフェログラムから、Ｘピーク、ＨｂＡ２ピーク、Ｙピークを特定し、各ピークの検出時間（Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙ）を特定した。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＥピークである。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＥピークである。
補正係数Ｒｙを下記式に基づいて、求めた。
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｃ（％）を求めた。
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｃを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｃ（％）を算出した。結果を表２に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－９０×Ｒｙ＋９５．２）
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｃを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｃ（％）を算出した。結果を表２に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－９０×Ｒｙ＋９５．２）
＜＜比較例３＞＞
実施例３において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｃ（％）を比較例３として、表２に示す。
実施例３において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｃ（％）を比較例３として、表２に示す。
＜＜正確性評価＞＞
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｃについて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１（％）を求めた。
実施例３で求めた補正値Ｃ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表２に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｃ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１]×１００
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｃについて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１（％）を求めた。
実施例３で求めた補正値Ｃ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表２に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｃ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１]×１００
実施例３で求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｃ（％）、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表２に示す。
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＥピーク面積の割合Ｃ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１]×１００
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＥピーク面積の割合Ｃ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ１]×１００
＜＜実施例４＞＞
変異ＨｂＣキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｄを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
変異ＨｂＣキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｄを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
実施例１と同様の測定を１回行い、エレクトロフェログラムから、Ｘピーク、ＨｂＡ２ピーク、Ｙピークを特定し、各ピークの検出時間（Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙ）を特定した。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＣピークである。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＣピークである。
補正係数Ｒｙを下記式に基づいて、求めた。
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄ（％）を求めた。
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｄ（％）を算出した。結果を表３に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－３．５×Ｒｙ＋５．４３）
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｄ（％）を算出した。結果を表３に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－３．５×Ｒｙ＋５．４３）
＜＜比較例４＞＞
実施例４において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄ（％）を比較例４として、表３に示す。
実施例４において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄ（％）を比較例４として、表３に示す。
＜＜正確性評価＞＞
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｄについて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２（％）を求めた。
実施例４で求めた補正値Ｄ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表３に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｄ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２]×１００
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｄについて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２（％）を求めた。
実施例４で求めた補正値Ｄ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表３に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｄ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２]×１００
実施例４で求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄ（％）、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表３に示す。
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２]×１００
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｄ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ２]×１００
＜＜実施例５＞＞
変異ＨｂＤキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｅを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
変異ＨｂＤキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｅを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
実施例１と同様の測定を１回行い、エレクトロフェログラムから、Ｘピーク、ＨｂＡ２ピーク、Ｙピークを特定し、各ピークの検出時間（Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙ）を特定した。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＤピークである。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＤピークである。
補正係数Ｒｙを下記式に基づいて、求めた。
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅ（％）を求めた。
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｅ（％）を算出した。結果を表４に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－３．５×Ｒｙ＋５．４３）
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｅ（％）を算出した。結果を表４に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－３．５×Ｒｙ＋５．４３）
＜＜比較例５＞＞
実施例５において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅ（％）を比較例５として、表４に示す。
実施例５において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅ（％）を比較例５として、表４に示す。
＜＜正確性評価＞＞
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｅのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３（％）を求めた。
実施例５で求めた補正値Ｅ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表４に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｅ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３]×１００
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｅのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３（％）を求めた。
実施例５で求めた補正値Ｅ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表４に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｅ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３]×１００
実施例５で求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅ（％）、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表４に示す。
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３]×１００
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｅ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ３]×１００
＜＜実施例６＞＞
変異ＨｂＳキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｆを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
変異ＨｂＳキャリア全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｆを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
実施例１と同様の測定を１回行い、エレクトロフェログラムから、Ｘピーク、ＨｂＡ２ピーク、Ｙピークを特定し、各ピークの検出時間（Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙ）を特定した。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＳピークである。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＳピークである。
補正係数Ｒｙを下記式に基づいて、求めた。
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆ（％）を求めた。
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｆ（％）を算出した。結果を表５に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－３．５×Ｒｙ＋５．４３）
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｆ（％）を算出した。結果を表５に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－３．５×Ｒｙ＋５．４３）
＜＜比較例６＞＞
実施例６において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆ（％）を比較例６として、表５に示す。
実施例６において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆ（％）を比較例６として、表５に示す。
＜＜正確性評価＞＞
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｆのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４（％）を求めた。
実施例６で求めた補正値Ｆ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表５に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｆ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４]×１００
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｆのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４（％）を求めた。
実施例６で求めた補正値Ｆ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表５に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｆ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４]×１００
実施例６で求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆ（％）、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表５に示す。
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４]×１００
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｆ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ４]×１００
＜＜実施例７＞＞
実施例１とは別の健常者全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｇを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
実施例１とは別の健常者全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｇを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
実施例１と同様の測定を１回行い、エレクトロフェログラムから、Ｘピーク、ＨｂＡ２ピーク、Ｙピークを特定し、各ピークの検出時間（Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙ）を特定した。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＡピークである。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＡピークである。
補正係数Ｒｙを下記式に基づいて、求めた。
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇ（％）を求めた。
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｇ（％）を算出した。結果を表６に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－２．５×Ｒｙ＋４．２６）
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｇ（％）を算出した。結果を表６に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－２．５×Ｒｙ＋４．２６）
＜＜比較例７＞＞
実施例７において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇ（％）を比較例７として、表６に示す。
実施例７において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇ（％）を比較例７として、表６に示す。
＜＜正確性評価＞＞
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｇのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５（％）を求めた。
実施例７で求めた補正値Ｇ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表６に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｇ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５]×１００
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｇのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５（％）を求めた。
実施例７で求めた補正値Ｇ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表６に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｇ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５]×１００
実施例７で求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇ（％）、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表６に示す。
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５]×１００
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｇ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ５]×１００
＜＜実施例８＞＞
βサラセミア患者全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｈを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
βサラセミア患者全血を上記組成のアルカリ性溶液（ｐＨ８．８）により希釈する（希釈率４１倍（質量基準））ことにより試料Ｈを得た。なお、塩酸及び水は、溶液のｐＨが８．８となるまで加えた。
実施例１と同様の測定を１回行い、エレクトロフェログラムから、Ｘピーク、ＨｂＡ２ピーク、Ｙピークを特定し、各ピークの検出時間（Ｔｘ、Ｔａ２、Ｔｙ）を特定した。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＡピークである。
ここで、Ｘピーク＝電気浸透流（ＥＯＦ、ｅｌｅｃｔｒｏ－ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）シグナルピーク（界面検出のシグナル）、Ｙピーク＝ＨｂＡピークである。
補正係数Ｒｙを下記式に基づいて、求めた。
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
Ｒｙ＝（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）
エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈ（％）を求めた。
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｈ（％）を算出した。結果を表７に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－２．５×Ｒｙ＋４．２６）
総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈを、Ｒｙにより下記式に基づいて、補正し、補正値Ｈ（％）を算出した。結果を表７に示す。
補正値＝総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合／（－２．５×Ｒｙ＋４．２６）
＜＜比較例８＞＞
実施例８において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈ（％）を比較例８として、表７に示す。
実施例８において求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈ（％）を比較例８として、表７に示す。
＜＜正確性評価＞＞
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｈのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６（％）を求めた。
実施例８で求めた補正値Ｈ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表７に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｈ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６]×１００
対照法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ ２、Ｓｅｂｉａ社）により、試料Ｈのエレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６（％）を求めた。
実施例８で求めた補正値Ｈ、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表７に示す。
誤差割合（％）＝[｜補正値Ｈ－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６]×１００
実施例８で求めた総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈ（％）、及び総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６を下記式に代入し、誤差割合を算出した。結果を表７に示す。
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６]×１００
誤差割合（％）＝[｜総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｈ（％）－総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６｜／総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合Ｚ６]×１００
上記実施例及び比較例から、本分析方法によれば、優れた精密性及び正確性で、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積等の割合を算出することができることがわかる。
１：キャピラリ流路、２：試料保持槽、３：泳動液保持槽、４：検出部、Ｔｘ：Ｘピークの検出時間、Ｔａ２：ＨｂＡ２ピークの検出時間、Ｔｙ：Ｙピークの検出時間
Claims (7)
- カチオン性ポリマーを含むアルカリ性水溶液を用いた、キャピラリ電気泳動によるヘモグロビンＡ２を含む試料の分析方法であって、以下の工程１）～７）を含む分析方法。
１）キャピラリ電気泳動により前記試料のエレクトロフェログラムを得る工程、
２）ＨｂＡ２ピークよりも早い時間に検出されるＸピークの検出時間Ｔｘを特定する工程、
３）ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２を特定する工程、
４）ＨｂＡ２ピークよりも遅い時間に検出されるＹピークの検出時間Ｔｙを特定する工程、
５）Ｘピークの検出時間Ｔｘ、ＨｂＡ２ピークの検出時間Ｔａ２、及びＹピークの検出時間Ｔｙの相対関係から、補正係数を算出する工程、
６）エレクトロフェログラムにおいて、総ピーク面積に対するＨｂＡ２ピーク面積の割合又はＹピーク面積の割合を算出する工程、
７）前記補正係数によって、前記ＨｂＡ２ピーク面積の割合又は前記Ｙピーク面積の割合を補正する工程。 - 前記補正係数が、（Ｔｙ－Ｔｘ）／（Ｔａ２－Ｔｘ）又は（Ｔａ２－Ｔｘ）／（Ｔｙ－Ｔｘ）で求められる、請求項１に記載の分析方法。
- 前記ＨｂＡ２ピーク面積又は前記Ｙピーク面積の割合の補正が、前記補正係数、及び前記補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われる、請求項１又は請求項２に記載の分析方法。
- 前記予め定められた係数が、前記補正係数の値に応じて変動する、請求項３に記載の分析方法。
- 前記ＨｂＡ２ピーク面積又は前記Ｙピーク面積の割合の補正が、前記補正係数、及び前記補正係数とは異なる予め定められた係数に基づいて行われ、
前記補正係数の値が１から離れるほど、前記予め定められた係数が小さくなる、請求項２に記載の分析方法。 - キャピラリ電気泳動がキャピラリ流路を備える装置を用いて行われ、
前記キャピラリ流路の内壁が、第４級アンモニウム塩基を含むカチオン性ポリマーで被覆されている、請求項１又は請求項２に記載の分析方法。 - 前記キャピラリ流路に前記試料が連続的に供給される、請求項６に記載の分析方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18/379,464 US20240142402A1 (en) | 2022-10-28 | 2023-10-12 | Method for analyzing sample comprising hemoglobin a2 by capillary electrophoresis |
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