JP2012515922A - CHO細胞由来の糖タンパク質産物におけるガラクトース−α−1,3−ガラクトース含有N−グリカン - Google Patents
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Abstract
Description
(a)上記の集団から1つ以上のCHO細胞を提供し、
(b)前記細胞によって産生される末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することを含み、CHO細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない。
(a)複数のCHO細胞集団であって、複数のうちいずれもグリカン上で末端α−ガラクトシル残基を発現するよう遺伝子操作されていない(α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されていないなど)細胞集団を提供し、
(b)複数のCHO細胞の各々を、糖タンパク質発現産物の発現に適した条件下で培養し、
(c)複数のCHO細胞各々によって産生される末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定し、
(d)選択されたCHO細胞調製物によって産生される末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基の標的レベルの存在に基づいて、複数のCHO細胞調製物のうちの1つ以上を選択することを含む、方法を含む。
以下に明示的に定義しないかぎり、本明細書で使用する用語はいずれも、当業者であれば理解できるであろう通常の意味で用いられる。
組換え糖タンパク質の合成に用いる宿主細胞は、複雑なグリコシル化を生成するための細胞内機構を有するが、これらの細胞は糖タンパク質が天然に発現される細胞と常に同じ酵素の相補体を持つわけではない。製造条件で細胞系や変種をクローン選択することで、培養細胞で発現される糖タンパク質における異種性が生じることもある。糖タンパク質活性におけるグリコシル化の機能的な役割には、細胞系で産生される治療用産物の慎重な特徴付けが必要である。
本開示は、CHO細胞によって産生される糖タンパク質上の末端α−ガラクトシル残基を評価するといった、CHO細胞によって産生される末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを評価することなど、グリカン調製物中の個々のグリカンの構造および/または組成を分析する方法を提供するものである。グリカン調製物は、従来技術において利用できる任意の方法で、細胞調製物から得られるものであってもよいし、糖タンパク質から得られるものであってもよい。通常、グリカン調製物を得ることは、(1)細胞または糖タンパク質調製物を得るステップと、(2)場合によって、細胞または糖タンパク質調製物からグリカンを放出するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、グリカン調製物を得ることが、場合によって、グリカン調製物を検出可能な標識で標識することを含む。
糖タンパク質の組換え生成用の方法については説明がなされている。培養細胞によって分泌される糖タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ゲル濾過、イムノアフィニティクロマトグラフィ、これらの組み合わせなどの利用可能な任意の手段で単離・精製可能なものである。
いくつかの実施形態では、糖タンパク質集団を提供し、集団中の糖タンパク質からN−結合型グリカンを除去することでN−グリカン調製物が得られる。
いくつかの実施形態では、糖タンパク質(糖タンパク質など)集団を提供し、集団においてO−結合型グリカンを糖タンパク質から除去することで、O−結合型グリカン調製物を得る。
いくつかの実施形態では、糖タンパク質からの放出の前または後にグリカンを標識と会合させることが可能である。N−結合型グリカンまたはO−結合型グリカン(糖タンパク質集団から除去されたN−グリカンなど)を1つ以上の検出可能な標識と会合させることが可能である。検出可能な標識は一般に、N−グリカンの還元末端に会合する。いくつかの実施形態では、検出可能な標識が蛍光部分である。本開示に基づいて使用可能なフルオロフォアの例として、2−アミノ安息香酸(2AA)、2−アミノベンズアミド(2AB)および/または2−アミノプリン(2AP)があげられるが、これに限定されるものではない。通常、本開示に基づいて用いられるフルオロフォアには、グリカンを損傷および/または破壊しない条件下でオリゴ糖および/または単糖の還元末端との反応性があるという特徴がある。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、還元末端に直接的に結合される。たとえば、この直接結合を還元的アミノ化による直接的な共役によって達成可能である。いくつかの実施形態では、蛍光部分が還元末端に間接的に結合される。たとえば、この間接結合を反応性リンカーアームによって達成可能である。
本開示は、糖タンパク質のグリコシル化パターンを判断する改良された方法を提供するものである。このような方法は、グリカン集団を1種類以上のエキソグリコシダーゼに曝露し、消化産物の構造および/または組成を分析することを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼが、特定の1つのタイプのグリコシド結合だけを認識および切断する。いくつかの実施形態では、本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼが、特定の2以上のタイプのグリコシド結合を認識および切断する。エキソグリコシダーゼのうち、本発明に有用となり得るのは、表1に示すように、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ;ヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ;これらの組み合わせである。
エキソグリコシダーゼは、末端グリコシド結合をグリカンの非還元末端から切断する酵素である。この酵素は一般に、特定の単糖結合およびアノマ性(α/β)に対して極めて特異性が高い。いくつかの実施形態では、隣り合った分岐パターンがエキソグリコシダーゼの特異性に影響することがある。エキソグリコシダーゼ処理によって、通常は、標準的な分岐型結合が五糖コア(M3N2)(3マンノースおよび2GlcNAc残基を含む)に切断されたグリカンが得られる。しかしながら、異常修飾種(分岐型またはコアフコシル化種、高マンノースおよびハイブリッド型グリカン、ラクトサミン伸長グリカン、硫酸化グリカン、リン酸化グリカンなど)は、エキソグリコシダーゼ処理がきかないため、クロマトグラフ的に分離してM3N2五糖に対して定量化することが可能である。本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼの例としては、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼがあげられるが、これに限定されるものではない。エキソグリコシダーゼについては、商業的供給源をはじめとするどのような供給源から入手することも、または細胞源(細菌、酵母、植物など)からの単離および/または精製により入手することも可能である。いくつかの実施形態では、エキソグリコシダーゼ(シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼおよびマンノシダーゼなど)を複数のカテゴリすなわち「サブセット」に分けることが可能である。いくつかの実施形態では、サブセットが違えば、異なるタイプの結合を切断するための機能も異なる。表1に、エキソグリコシダーゼ、その結合特異性、由来となった生物体の例をいくつかあげておく。このエキソグリコシダーゼの一覧は一例にすぎず、包括的なものではない旨、また、どのような結合特異性を持つ、どのようなエキソグリコシダーゼでも本開示に基づいて使用できる旨は、当業者であれば理解できよう。
通常、本開示に基づく方法は、グリカン調製物を分析し、グリカンが特定タイプの修飾(末端α−1,3−ガラクトース残基など)を含むか否かを判断することを含む。いくつかの実施形態では、分析が、ある起源由来のひとつの糖タンパク質調製物におけるグリカンの構造および/または機能を、別の起源由来の少なくとも1種類の他の糖タンパク質調製物におけるグリカンの構造および/または機能と比較することを含む。いくつかの実施形態では、分析が、1つ以上の試料におけるグリカンの構造および/または機能を、基準試料のグリカンの構造および/または機能と比較することを含む。
本開示の方法を利用して、たとえば遊離グリカン、糖タンパク質(糖ペプチド、糖脂質、プロテオグリカンなど)、細胞関連グリカン(核関連グリカン、細胞質関連グリカン、細胞膜関連グリカンなど);細胞、細胞外、細胞内および/または細胞内(subcellular)成分に関連したグリカン(タンパク質など);細胞外間隙のグリカン(細胞培養液など)などを含む、多岐にわたる状態のいずれでも糖タンパク質からのグリカンを分析することが可能である。
Orencia(商標)(アバタセプト)は、ヒト免疫グロブリンG1(IgG1)の修飾されたFc(ヒンジ、CH2、CH3ドメイン)部分に結合されるヒト細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA−4)の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質である。アバタセプトは、哺乳類細胞発現系で組換えDNA技術によって生成される。アバタセプトの見かけの分子量は92キロダルトンである。アバタセプトを使用して、関節リウマチの症候を治療する、関節損傷の進行を示す、物理的機能を改善する。この生物治療薬でグリコシル化(3つのN−結合型と2つのO−結合型グリコシル化部位)がゆえに生じる大幅な複雑さがゆえに、慎重な生成と特徴付けが必要とされる。タンパク質化学組成物に対する異なる修飾(タンパク質骨格修飾、グリコシル化など)によって糖タンパク質の生物学的機能に影響する可能性があるため、製造時にこの生物治療薬の化学的および物理的特性に対する良好な制御を保証することが重要である。
PNGASE−Fで処理した後、固相抽出精製によって、薬剤物質からN−グリカンを単離した。次に、グリカンを2AB標識した後、選択された画分をLC−MS−MSで分析した。エキソグリコシダーゼ、MALDI−MS、Lc−MS/MSの組み合わせによって、グリカン構造をさらに確認した。
以上、本方法を具体的な例示の実施形態を参照しつつ特に図示し、説明してきたが、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく形態および詳細にさまざまな変更をほどこし得ることは理解されたい。したがって、本方法の範囲および主旨に包含されるすべての実施形態ならびにその等価物も、権利請求されることを意図している。本開示の方法、系、アッセイについての特許請求の範囲、説明、図面は、説明した要素の順序に限定的なものとして読まれるべきではない(その効果が明記される場合を除く)。
Claims (50)
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞集団を評価するための方法であって、
(a)前記集団から1つ以上のCHO細胞を提供し、
(b)前記細胞によって産生される末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することを含み、
前記CHO細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない、方法。 - 前記測定するステップが、
(a)前記CHO細胞から産生される糖タンパク質を単離し、末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを前記糖タンパク質上で測定する、
(b)前記CHO細胞から産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、前記単離された糖タンパク質組成物からの末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
(c)前記CHO細胞から産生される糖タンパク質調製物または単離された糖タンパク質からグリカン調製物を得て、前記グリカン調製物中の末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
(d)前記CHO細胞から産生される糖タンパク質上に存在するグリカンから、または前記1つ以上のCHO細胞の表面におけるグリカンから、単糖を切断し、前記切断された単糖から末端放出α−ガラクトース残基を検出する、
(e)前記CHO細胞から産生される糖タンパク質調製物から少なくとも1つのペプチドを提供し、前記少なくとも1つのペプチド上の末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
(f)前記1つ以上のCHO細胞の前記細胞表面上のグリカンからの末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することのいずれかを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記CHO細胞集団がクローン細胞集団である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)で測定したレベルと基準レベルまたは規格とを比較するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 測定することが、クロマトグラフによる方法、質量分析(MS)法、電気泳動法、核磁気共鳴(NMR)法、単糖分析、蛍光法、UV−VIS吸光度、酵素による方法、検出分子の使用、これらの組み合わせからなる群から選択される、末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを同定または定量化するための方法を使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CHO細胞集団が、治療用糖タンパク質を製造するためのバイオリアクタ内の細胞培養物からの試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記提供および測定するステップを、時間の経過とともに少なくとも1回繰り返す、請求項1に記載の方法。
- 前記測定するステップが、ガラクトース−α−1−3−ガラクトースエピトープに結合する検出分子を用いることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出分子が、ガラクトース−α−1−3−ガラクトースエピトープに結合できるレクチンを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記検出分子が、ガラクトース−α−1−3−ガラクトースエピトープに対する抗体を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記検出分子が、標識された部分を含む分子を含むか、これに結合される、請求項8に記載の方法。
- 前記測定するステップの結果を印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記CHO細胞が、細胞培養物に存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記CHO細胞が、ヒト治療用糖タンパク質をコードするベクターで形質転換されている、請求項1に記載の方法。
- 前記CHO細胞上に存在する、末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースエピトープまたは前記エピトープを含有するグリカンの量を定量化するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 測定することが、前記CHO細胞から産生される糖タンパク質を単離し、前記糖タンパク質上の末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 測定することが、前記CHO細胞から産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、前記単離された糖タンパク質組成物からの末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 測定することが、前記CHO細胞から産生される糖タンパク質調製物または単離された糖タンパク質からグリカン調製物を得て、前記グリカン調製物中の末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記測定することが、(d)前記CHO細胞から産生される糖タンパク質上に存在するグリカンから、あるいは、前記1つ以上のCHO細胞の表面のグリカンから、単糖を切断し、前記末端を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 測定することが、前記CHO細胞から産生される糖タンパク質調製物から少なくとも1つのペプチドを提供し、前記少なくとも1つのペプチド上で末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 測定することが、前記1つ以上のCHO細胞の前記細胞表面における複合糖質上の末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記測定するステップが、クロマトグラフによる方法を実施することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記測定するステップが、質量分析(MS)法を実施することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記測定するステップが、電気泳動法を実施することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記測定するステップが、核磁気共鳴(NMR)法を実施することを含む、請求項1に記載の方法。
- −α−1−3−ガラクトースエピトープを含有するグリカンを含む糖タンパク質を産生する機能について、1つ以上のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞をスクリーニングするための方法であって、
(a)複数のCHO細胞集団であって、前記複数のうちいずれもグリカン上で末端α−ガラクトシル残基を産生するよう遺伝子操作されていない細胞集団を提供し、
(b)前記複数のCHO細胞集団の各々を、糖タンパク質発現産物の発現に適した条件下で培養し、
(c)前記複数のCHO細胞各々によって産生される末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定し、
(d)前記選択されたCHO細胞調製物によって産生される末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基の標的レベルの存在に基づいて、前記複数のCHO細胞調製物のうちの1つ以上を選択することを含み、前記CHO細胞が、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列でトランスフェクトされていない、方法。 - 前記複数のCHO細胞集団の各々が細胞培養物にある、請求項26に記載の方法。
- 末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記CHO細胞調製物の単離された糖タンパク質発現産物上で測定する、請求項26に記載の方法。
- 末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記CHO細胞調製物の糖タンパク質発現産物から得られるペプチド上で測定する、請求項26に記載の方法。
- 末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記CHO細胞調製物の細胞表面グリカンから測定する、請求項26に記載の方法。
- 末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記CHO細胞調製物またはその糖タンパク質発現産物から得られるグリカン調製物上で測定する、請求項26に記載の方法。
- 前記測定するステップが、(i)前記複数のCHO細胞集団の各々から糖タンパク質発現産物を単離するステップと、(ii)前記末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を前記糖タンパク質発現産物上で測定するステップと、を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞培養物がバイオリアクタ内にある、請求項27に記載の方法。
- 測定することが、クロマトグラフによる方法、質量分析(MS)法、電気泳動法、核磁気共鳴(NMR)法、単糖分析、蛍光法、UV−VIS吸光度、酵素による方法、検出分子の使用、これらの組み合わせからなる群から選択される、末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトース残基を含有するグリカンを同定または定量化するための技術を使用することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記複数のCHO細胞集団の少なくとも1つが、ヒト治療用糖タンパク質をコードするベクターで形質転換されている、請求項26に記載の方法。
- 複数のCHO細胞集団が、治療用糖タンパク質の製造過程トレインからの少なくとも2種類の異なるCHO株、少なくとも2種類の異なるクローン細胞集団、少なくとも2種類の異なる試料からなる群から選択される少なくとも1つの特徴を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記選択されたCHO細胞調製物を培養して治療用糖タンパク質産物を生成するステップをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- CHO細胞宿主で産生される糖タンパク質組成物を評価するための方法であって、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することを含み、
前記糖タンパク質組成物は、CHO宿主細胞で産生されたものであり、前記CHO宿主細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない、方法。 - 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースのレベルを、印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録することをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの測定されたレベルを基準レベルと比較することをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記基準レベルが、前記糖タンパク質組成物を含有する製剤調製物の規格または品質基準である、請求項40に記載の方法。
- 前記基準レベルが、グリカン/総グリカンベースで末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースが5%以下である、請求項40に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、クロマトグラフによる方法を実施することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、質量分析(MS)法を実施することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、核磁気共鳴(NMR)法を実施することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、単糖分析を実施することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、蛍光法を実施することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、UV−VIS吸光度による方法を実施することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、酵素による方法を実施することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−1−3−ガラクトースの量を測定することが、検出分子を使用することを含む、請求項38に記載の方法。
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