CN102292640B - 在来源于CHO细胞的糖蛋白产物中的含有半乳糖-α-1,3-半乳糖的N-聚糖 - Google Patents

在来源于CHO细胞的糖蛋白产物中的含有半乳糖-α-1,3-半乳糖的N-聚糖 Download PDF

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Abstract

本发明提供了评估中国仓鼠卵巢(CHO)细胞群的方法，该方法是通过测量由所述细胞产生的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖来进行的，其中这些CHO细胞没有被基因工程化以表达一种α-半乳糖苷转移酶编码序列。

Description

在来源于CHO细胞的糖蛋白产物中的含有半乳糖-α-1,3-半乳糖的N-聚糖
发明领域
本发明涉及用于检测从哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白质中的特殊聚糖结构的方法和材料。 
发明背景
在哺乳动物细胞培养物例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产了许多重组治疗性生物药物产品。哺乳动物细胞培养物与其他表达系统(例如酵母和原核系统)相比是优选用于生产重组糖蛋白的，主要是因为哺乳动物细胞培养物产生具有糖基化模式的糖蛋白，通常这些糖基化模式是被人类识别和耐受的。 
末端α-连接的半乳糖(gal-α-1，3-gal)连接的潜在不利影响是已知的(Chung et al.，N Engl J Med，358：11(2008))。以前已经报道这类末端α-gal连接在由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞所产生的重组糖蛋白中是不存在的。例如，尽管在NSO(一种从鼠类开发的骨髓瘤细胞系)中产生的抗CDw52抗体(坎帕斯，Campath)包括潜在免疫原性的糖型，这些糖型具有非还原性末端α-连接的半乳糖残基，由CHO细胞产生的坎帕斯主要包含3种糖型，这些糖型与正常的人类IgG是一致的(Sheeley et al.，Analytical Biochemistry 247：102-110(1997))。 
发明概述
本发明部分地是基于以下发现，即由重组CHO细胞产生的糖蛋白包含具有末端半乳糖-α-1，3-半乳糖连接的聚糖结构，这可能对于将这类糖蛋白用于治疗性目的具有有害影响。例如，将具有末端α-gal连接的糖蛋白施用于人类 用于治疗性目的可以导致在患者体内形成针对该重组糖蛋白的单克隆抗体，这样使得随后的给药变得效果更低或甚至在该患者体内引起不利的超敏反应。 
与上述传授的内容相反，诸位申请人令人惊奇地发现在CHO细胞培养物中产生的大部分的重组糖蛋白可以展示出末端gal-α-1，3-gal连接的存在，表明对于施用于患者的蛋白和肽基产物发生不良反应的可能性。 
本发明提供了对于生产和分析来自CHO细胞的重组糖蛋白有用的多种化合物和方法以及包含这类糖蛋白的组合物，其中这些糖蛋白包括调节(例如，减少或在一些情况下增加)水平的末端gal-α-1，3-gal连接。 
因此，在一个第一方面，本发明包括用于对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞群进行评估的方法。在某些实施方案中，该检测方法包括： 
(a)提供来自该群的一个或多个CHO细胞；并且 
(b)对包含由所述细胞生成的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖进行测量，其中这些CHO细胞还没有被基因工程化以表达α-半乳糖苷转移酶编码序列。 
该测量步骤可以包括以下各步骤的任何步骤：(a)分离由这些细胞所产生的糖蛋白并且测量在这些糖蛋白上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(b)分离由这些细胞所产生的特异性糖蛋白成分并且测量在该分离的糖蛋白成分上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(c)从由这些细胞所产生的糖蛋白中分离聚糖，并且测量在这些分离的聚糖中的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(d)从在糖蛋白或该一个或多个CHO细胞上存在的聚糖切割单糖，并且检测来自这些切割的单糖的末端释放α-半乳糖残基，(e)从来自于由这些细胞产生的糖蛋白提供至少一种肽，并且测量该至少一种肽上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，(f)通过测量在该一个或多个CHO细胞的细胞表面上的聚糖对该糖蛋白上的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的相对水平进行测量。用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术可以 包括以下方法中的一种或多种，以及这些方法的任何一种的组合：色谱方法、质谱(MS)法、电泳法(例如，毛细管电泳)、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收法、酶法、以及检测分子(如一种抗体或凝集素)的使用。 
用于步骤2的测量的聚糖的来源可以是选自下组，该组由下列各项组成：CHO细胞群；在这些CHO细胞的表面上表达的糖蛋白或聚糖；通过切割在CHO细胞群中的细胞的表面上存在的蛋白质而得到的肽；在CHO细胞群的表面上存在的聚糖；由CHO细胞群所分泌或表达的糖蛋白、由一个CHO细胞或一个CHO细胞群所表达的分离的糖蛋白表达产物；来源于由一个CHO细胞或一个CHO细胞群所表达的分离的蛋白表达产物的肽；或来源于由一个CHO细胞或直接地由一个CHO细胞群所表达的分离的蛋白表达产物的聚糖。在一些实施方案中，该方法包括用一种或多种外切糖苷酶(包括α-半乳糖苷酶)来处理聚糖或糖蛋白的一种来源，随后对该聚糖群进行分析。 
在一些实施方案中，所使用的方法提供了对包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖进行定量测量。在一些实施方案中，所使用的方法提供了一种定性测量。 
在一些实施方案中，该方法还包括从CHO细胞的培养物制备一种糖蛋白制剂，从该糖蛋白制剂(例如用一种或多种糖苷酶，例如α-1，3-半乳糖苷酶、α-1，4-半乳糖苷酶、或α-1，6-半乳糖苷酶)切割一种或多种聚糖，以及对包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖进行测量。 
在某些实施方案中，该方法是在用于治疗性糖蛋白的生产进行期间通过从该生产线的CHO细胞培养物获得一种样品来进行的，例如在生产期间监测聚糖的结构。在某些实施方案中，随着时间的过去该测量步骤被重复至少一次，例如在培养这些CHO细胞的时间期间，该测量步骤被重复至少一次、两次、三次或更多次。在其他实施方案中，在由CHO细胞产生的糖蛋白产物上进行该方法，例如作为该糖蛋白产物的质量或释放测试的一部分。 
在一些实施方案中，该测量步骤包括将从一个第一CHO细胞群产生的一种第一糖蛋白制剂中的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的水平与从一个第二CHO细胞群产生的一种第二糖蛋白制剂中的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的水平进行比较。在一些这类实施方案中，对来自在不同培养条件下培养的CHO细胞群的糖蛋白制剂的聚糖进行了测定和比较。 
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括将包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的水平与一个参比水平(例如，与一个对照水平、或与产品说明书中的一个范围或值)进行比较的一个步骤。 
在该方法的某些实施方案中，该测量步骤包括使用一种检测分子，该分子能够检测末端α-半乳糖基残基的存在或缺乏。在某些实施方案中，该检测分子包括一种抗体，该抗体能够结合到末端α-半乳糖基表位上。在本发明的其他实施方案中，该检测分子包括一种凝集素。在一些实施方案中，该检测分子可以包括一种荧光部分、或一种放射性同位素部分。 
该CHO细胞群可以包括一种克隆细胞群。例如，该CHO细胞群可以是在培养物中，或者是来自用于制造治疗性糖蛋白的生物反应器中的细胞培养物的一种样品。在某些实施方案中，已经用至少一种编码治疗性糖蛋白的载体转化了该CHO细胞群。该治疗性糖蛋白可以是人、非人或合成起源的。该治疗性糖蛋白可以用于治疗人类或兽医的适应症。 
在一些实施方案中，该方法进一步包括对由该细胞产生的糖蛋白的生物活性进行评估的一个步骤，例如对该糖蛋白的免疫原性可能性的存在或水平进行评估(例如，体外或体内，例如在动物模型中)。 
在一个第二方面，本发明包括用于筛选一个或多个中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在糖蛋白上产生包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的能力的方法，该方法包括： 
(a)提供多个CHO细胞群，其中该多个群中没有一个已经被基因工程化以在这些聚糖上产生末端α-半乳糖基残基(例如，还没有被基因工程化以表达α-半乳糖基转移酶编码序列)； 
(b)在适合用于表达糖蛋白表达产物的条件下，对该多个CHO细胞的每一个进行培养； 
(c)测量由该多个CHO细胞中每一个所产生的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，并且 
(d)基于目标水平的由选定的CHO细胞制剂所产生的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的存在来选择一种或多种CHO细胞制剂。 
可以从由CHO细胞制剂产生的糖蛋白、从CHO细胞制剂的分离的糖蛋白表达产物、从由CHO细胞制剂的糖蛋白表达产物中得到的肽、从CHO细胞制剂的细胞表面聚糖、或从由CHO细胞制剂得到的聚糖制剂或从它们的糖蛋白表达产物来得到和测量包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖。在某些实施方案中，该筛选方法进一步包括从细胞培养物中分离糖蛋白表达产物以及对在由步骤(c)中的细胞所产生的糖蛋白上的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基进行测量的步骤。在某些实施方案中，该细胞筛选方法进一步包括对该糖蛋白表达产物上存在的α-半乳糖基残基的量进行定量的步骤。在某些实施方案中，细胞筛选方法的步骤(b)发生在一个生物反应器中。 
该多个CHO细胞群的每一个可以包含一个不同的CHO株系群、一个不同的克隆细胞群、或在用于治疗性糖蛋白的制造进程中来自一种细胞培养物的不同的样品(例如，随着时间的过去而采取的样品)。在某些实施方案中，已经用至少一个编码治疗性糖蛋白(例如，人治疗性糖蛋白)的载体转化了该CHO细胞群。在细胞筛选方法的某些实施方案中，该糖蛋白表达产物是从CHO细胞表达的一种分泌的糖蛋白。 
该筛选方法的测量步骤可以包括在此所披露的用于鉴定/或定量糖蛋白上的末端α-半乳糖基残基的任何技术。 
在一个第三方面，本发明包括一种用于对CHO细胞宿主体内产生的糖蛋白成分进行评估的方法。该方法包括对存在于糖蛋白成分中的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖的量进行测量，其中该糖蛋白成分是在CHO宿主细胞中生产的，并且其中这些CHO宿主细胞没有被基因工程化以表达α-半乳糖苷转移酶编码序列。 
在某一实施方案中，该方法包括将存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖的水平记录在打印物或计算机可读介质中。 
在一些实施方案中，该方法还包括将测量的存在于该糖蛋白成分中的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖的水平与参比水平(例如，一个对照或参比规格)进行比较。该参比水平可以是一种规格(例如，一个FDA标签或医师的插入物)或包含该糖蛋白成分的药物制剂的质量标准。 
在一些实施方案中，该参比水平或质量标准是不大于糖蛋白组分中存在的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖的5％，例如不大于4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.25％、0.2％、0.1％或更少。可以将存在于糖蛋白成分中的半乳糖-α-1-3-半乳糖的水平测量为相对于在一种样品(例如一种糖蛋白制剂)中的聚糖的总量的包含半乳糖-α-1-3-半乳糖的聚糖的水平。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括色谱法。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括质谱(MS)法。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括电泳法(例如，毛细管电泳)。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括核磁共振(NMR)法。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括单糖分析。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括荧光法。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括UV-VIS吸收。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括酶法。 
在一个实施方案中，用来测量末端gal-α-1，3-gal连接的技术包括并且使用检测分子(例如一种抗体或凝集素)。 
附图简要说明
图1是N-聚糖结构共有的核心五糖的一个图示。 
图2是具有一个末端gal-α-1，3-gal连接的非还原性末端N-聚糖结构的一个图示。 
图3是从阿巴西普得到的聚糖的一部分的荧光色谱图，显具有成分HexNAc4Hex6Fuc1的聚糖种类的检测，该成分可能相应于一种包含半乳糖-α-1-3连接的半乳糖的结构。 
图4展示了从阿巴西普得到的具有成分HexNAc4Hex6Fuc1的聚糖种类的MS2图谱。这些图谱与包含一个非还原性末端半乳糖-α-1-3-半乳糖的聚糖结构相关。 
图5是在用α-半乳糖苷酶进行处理之前和之后，从阿巴西普得到的聚糖的一部分以及一种对照蛋白(也包含具有成分HexNAc4Hex6Fuc1的聚糖)的荧光色谱图。 
图6是具有成分HexNAc4Hex5Fuc1的种类的一个MS2图谱，该成分是通过用α-半乳糖苷酶处理从阿巴西普得到的聚糖部分而产生的。 
图7展示了聚糖的一部分的MALDI-MS图谱，这些聚糖是用不同的外切糖苷酶处理阿巴西普而得到的。 
定义
除非在下文中另外定义，在此所使用的所有术语都是以如本领域普通技术人员所应当理解的它们通常的含义来使用的。 
大致、约、大约：如在此所使用，术语“大致”、“约”或“大约”当应用于一个或多个所感兴趣的值时，是指与一个所陈述的参考值相类似的值。在某些实施方案中，术语“大致”、“约”或“大约”是指落在所陈述的参考值的以下比例之内的数值的范围：25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小。 
检测(Detection)，检测了(Detecting)：如在此所使用的，术语“检测了”、“检测”以及“检测手段”是可以互换地使用的用来指确定在一种化合物、成分、细胞或细胞群之中或之上一种特殊的化学部分(例如，一个末端α-1，3-半乳糖基残基)是存在还是缺乏。检测手段可以包括选择性标记、或可识别的特征(例如荧光或放射性部分)，并且可以涉及对试剂、化合物、细胞或细胞群进行标记。检测还可以指使用这类技术(如质谱法或相关方法、电泳法、核磁共振、色谱法、或上述的组合)对化合物、成分、细胞或细胞群进行分析以确定在化合物、成分、细胞或细胞群之中或之上的一种化学部分的存在或缺乏。检测还可以涉及对被检测的化学部分的绝对水平或相对水平进行定量。 
聚糖：如本领域内已知并且在此所使用，“聚糖”是多种糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但典型地包含至少三个糖，并且可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、等等)和/或经修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺基N-乙酰葡糖胺、等等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和异聚物。术语“聚糖”还涵盖了糖蛋白糖的一个聚糖组分(例如，一种糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等的一个聚糖组分)。该术语还涵盖游离的聚糖，包括从一种糖蛋白中已经被切割的或以别的方式所释放的聚糖。 
聚糖制剂：如在此所使用的术语“聚糖制剂”是指根据一个具体的产生方法而获得的一组聚糖。在一些实施方案中，聚糖制剂是指从一种糖蛋白制剂(见以下糖蛋白制剂的定义)中获得的一组聚糖。在一些实施方案中，一种聚糖制剂包括多种糖蛋白。在一些实施方案中，一种聚糖制剂包括多种释放的聚糖。 
糖蛋白：如在此所使用，术语“糖蛋白”是指一种“蛋白质”(如在此定义的)，该蛋白质包含共价连接至一个或多个糖部分(即，聚糖)上的一个肽主链。如本领域的普通技术人员所理解，这种肽主链典型地包括具有多个氨基酸残基的一个直链。这个或这些糖部分可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这个或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分枝的链或者可以包括一个或多个分枝的链。在某些实施方案中，这些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。可替代地或另外地，这些糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其他烷基修饰。在某些实施方案中，这些糖蛋白包含O-连接的糖部分；在一些实施方案中，这些糖蛋白包含N-连接的糖部分。 
糖蛋白制剂：如在此所使用，术语“糖蛋白制剂”是指一组单个的糖蛋白分子，该组中的每一个包括具有一个特定氨基酸序列(该氨基酸序列包括至少一个糖基化位点)的一种多肽以及共价附连到该至少一个糖基化位点上的至少一种聚糖。在糖蛋白制剂中的一种特定糖蛋白的单个的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可能在该至少一个糖基化位点的占用方面和/或在被连接到该至少一个糖基化位点上的聚糖的一致性方面不同。即，一种糖蛋白制剂可以仅包括一种特定的糖蛋白的一种单一糖型，但是更典型地包括多种糖型。相同的糖蛋白的不同制剂可以在所存在的糖型的一致性方面(例如，在一种制剂中存在的糖型可能是另一种制剂所缺乏的)和/或在不同糖型的相对量方面不同。 
糖苷酶：如在此所使用的术语“糖苷酶”是指一种试剂，该试剂切割位于聚糖中的多个连续的糖之间或糖与主链部分之间(例如，在糖蛋白的糖与 肽主链之间)的一种共价键。在一些实施方案中，糖苷酶是一种酶。在某些实施方案中，糖苷酶是含有一个或多个多肽链的一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶(protein enzyme))。在某些实施方案中，糖苷酶是一种化学切割试剂，例如肼。 
N-聚糖：如在此所使用，术语“N-聚糖”是指多种糖的一种聚合物，该聚合物已经从一种糖蛋白中释放，但是之前通过一个氮连接而连接到一种糖蛋白上(参见以下N-连接的聚糖的定义)。 
N-连接的聚糖：N-连接的聚糖是通过一个氮连接而连接到一种糖蛋白上的聚糖。存在着不同分类的N-连接的聚糖，但是它典型地是基于共同的核心五糖(Man)3(GlcNAc)(GlcNAc)。 
O-聚糖：如在此所使用，术语“O-聚糖”是指多个糖的一个聚合物，该聚合物已经从一种糖缀合物中释放，但是之前通过一个氧连接而连接到该结合糖上(参见以下O-连接的聚糖的定义)。 
O-连接的聚糖：O-连接的聚糖是通过一个氧连接而连接到一种糖缀合物上的聚糖。O-连接的聚糖典型地通过N-乙酰基-D-半乳糖胺(GaINAc)而被附连至糖蛋白上或者通过N-乙酰基-D-葡糖胺(GIcNAc)而被附连至L&#8212；L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Tlir)的羟基基团上。一些O-连接的聚糖还具有多种修饰，如乙酰化和硫酸化。 
调节：术语“调节”，如在此使用的，是指一种作用物在规定的限度内控制参数的值(如存在于糖蛋白成分中的α-半乳糖残基的水平)的能力。因此，在一些实施方案中，可以对α-半乳糖残基的水平进行调节从而它保持在规定的限度内。在一些实施方案中，可以对α-半乳糖残基的水平进行调节从而它不超过存在于糖蛋白成分中的总N-聚糖的5.0％、1.0％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以上。在其他实施方案中，可以对α-半乳糖残基的水平进行调节从而它的改变不超过所规定的或所希望的水平的10.0％、5.0％、1.0％、05％或0.1％。 
蛋白酶：如在此所使用的术语“蛋白酶”是指一种试剂，该试剂切割位于一个多肽链中的多个连续的氨基酸之间的一种肽键。在一些实施方案中，蛋白酶是一种酶(即，一种蛋白质分解酶)。在某些实施方案中，蛋白酶是一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶)，该蛋白质包括一个或多个多肽链。在某些实施方案中，蛋白酶是一种化学切割试剂。 
提供：术语“提供”，如在此使用的，是指从任何来源获得(包括但不限于通过作用物的自身制造或通过该作用物接受来自另一方的项目而获得)一个主体项目(例如CHO细胞、CHO细胞制剂、或糖蛋白制剂)的一种作用物。例如，提供了一种CHO细胞制剂(如果它是由任何机器(machine)、人、或实体制造或接受的话)。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被机器所接受，然后它可以进行糖蛋白制剂的一次或多次测试、处理、或精制。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被人接受。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被一个外界实体所接受。在一些实施方案中，CHO细胞制剂可以被一个人或业务单位(为第二个人或业务单位进行表征服务)所接受。 
某些实施方案的详细说明
尽管用于合成重组糖蛋白的宿主细胞具有用来产生复合糖基化作用的细胞内器，这些细胞并不总是具有与其中自然表达糖蛋白的细胞相同的酶的互补物。细胞系的克隆选择以及在制造条件方面的变化还可以产生在培养的细胞中所表达的糖蛋白的异质性。在糖蛋白活性方面的糖基化作用的功能性作用使得对在这些细胞系中所产生的治疗性产物进行仔细表征成为必要。 
以前已经报道末端gal-α-1，3-gal连接不存在于由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞所产生的重组糖蛋白中(Chung et al.，N Engl J Med，358：11(2008))。本披露至少部分是基于出人意料地发现可以在由CHO细胞所产生的糖蛋白上找到末端α-1，3-半乳糖残基，并且因此当使用CHO细胞来产生治疗性产物时重要的是对聚糖结构的这个方面进行鉴定、监测和控制。 
本披露提供了对在由CHO细胞所产生的糖蛋白上的聚糖的组成进行分析的方法。根据本披露，可以对来自在CHO细胞中所产生的糖蛋白制剂的聚糖进行分析以确定它们是否包括末端α-1，3-半乳糖残基。本披露提供了检测这类修饰的方法，以及生产包括或缺乏这类修饰的糖蛋白的方法。 
聚糖制剂
本披露提供了分析聚糖制剂中单独的聚糖的结构和/或组成的方法，例如评估由CHO细胞产生的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，例如评估在由CHO细胞产生的糖蛋白上的末端-α-半乳糖基残基。聚糖制剂可以通过本领域内的任何一种可供使用的方法从一种细胞制剂或从一种糖蛋白而获得。总体而言，获得一种聚糖制剂包括以下步骤：(1)获得一种细胞或糖蛋白制剂；并且(2)任选地从该细胞或糖蛋白制剂释放聚糖。在一些实施方案中，获得一种聚糖制剂可任选地包括用一种可检测的标记物对该聚糖制剂进行标记。 
糖蛋白制剂
已经描述了用于重组生产糖蛋白的方法。可以通过任何可供使用的手段来分离和纯化由培养的细胞分泌的糖蛋白，例如阴离子交换层析、反相层析、凝胶过滤、免疫亲和层析、以及它们的组合。 
N-连接的聚糖制剂
在一些实施方案中，通过提供一种糖蛋白群并且从该群中的这些糖蛋白移出N-连接的聚糖而获得N-聚糖制剂。 
在一些实施方案中，通过消化从糖蛋白(例如，糖蛋白)移出N-连接的聚糖。总体而言，根据本披露有待使用的聚糖酶在核心的GlcNAc-Asn、GlcNAc-GlcNAc或Man-GlcNAc残基之间进行切割。可用来从糖蛋白中移出N-连接的聚糖的示例性的酶类包括但不限于，N-聚糖酶F和/或N-聚糖酶-A、O-聚糖酶和/或Endo H。 
在一些实施方案中，通过化学切割从糖蛋白中移出N-连接的聚糖。仅给出少数的实例，可以使用肼、硼氢化钠、和/或三氟甲磺酸(TFMS)从糖蛋白中移出聚糖。 
O-连接的聚糖制剂
在一些实施方案中，通过提供一种糖蛋白(例如，糖蛋白)群并且从该群中的这些糖蛋白中移出O-连接的聚糖而获得O-连接的聚糖制剂。 
在一些实施方案中，通过b-消除反应从糖蛋白(例如，糖蛋白)中移出O-连接的聚糖。在一些实施方案中，通过还原性b-消除反应从糖蛋白(例如，糖蛋白)中移出O-连接的聚糖。在一些实施方案中，通过非还原性b-消除反应从糖蛋白(例如，糖蛋白)中移出O-聚糖。 
在一些实施方案中，通过在包括碱性四氢硼酸盐的溶液中孵育一种糖蛋白(例如，糖蛋白)制剂而从该制剂中移出O-连接的聚糖。在一些实施方案中，例如使用四氘硼酸盐(tetradeuterioborate)来结合氘标记从而有助于检测O-连接的聚糖。在不同的示例性的方法中，在42℃-45℃下将糖蛋白制剂在包含0.8-1.0M NaBH4以及0.05-0.1M NaOH的溶液中孵育2-24小时。可以通过加入酸(例如，1.0M HCl)而终止用来移出O-连接的聚糖的反应。 
在一些实施方案中，通过在包括NaOH的溶液中孵育一种糖蛋白制剂而从该制剂中移出O-连接的聚糖。在不同的示例性的方法中，在27℃-45℃下将糖蛋白在包含50-200mM NaOH的溶液中孵育2-48小时。通过加入酸可以终止反应。 
在一些实施方案中，通过在包括NH4OH的溶液中孵育一种糖蛋白制剂而从该制剂中移出O-连接的聚糖。在不同的示例性的方法中，在45℃-60℃下将糖蛋白在包含25％-28％NH4OH的溶液中孵育2-40小时。通过在真空下移除NH4OH可以终止反应。在一些实施方案中，该溶液包括碳酸铵(例如，处于饱和浓度下)。在一些实施方案中，用酸(例如硼酸)来处理该NH4OH处理过的制剂。 
在一些实施方案中，通过在包括乙胺(例如，处于约70％浓度的乙胺)或甲胺(例如，处于约40％浓度的甲胺)的水溶液中孵育一种糖蛋白制剂约4-24小时而从该制剂中移出O-连接的聚糖。 
在一些实施方案中，从已经从中移出N-连接的聚糖的糖蛋白群获得O-连接的聚糖制剂。 
标记聚糖
在一些实施方案中，在从糖蛋白中释放之前或之后可以使这些标记与聚糖结合。N-连接的聚糖或O-连接的聚糖(例如，已经从一种糖蛋白群中移出的N-聚糖)可以与一种或多种可检测的标记物相结合。可检测的标记物典型地与这些聚糖的还原性末端相结合。在一些实施方案中，可检测的标记物是荧光部分。根据本披露可以使用的示例性的荧光团包括但不限于2-氨基苯甲酸(2AA)、2-氨基苯甲酰胺(2AB)、和/或2-氨基嘌呤(2AP)。总体而言，根据本披露而使用的荧光团的特征在于在不损害和/或破坏该聚糖的条件下具有与一种寡糖和/或单糖的还原性末端的反应性。在一些实施方案中，荧光部分被直接附连到还原性末端。例如，直接附连可以通过还原性胺化作用的直接结合而实现。在一些实施方案中，荧光部分被间接地附连到还原性末端。例如，间接附连可以通过一个反应性的连接臂而实现。 
在一些实施方案中，可检测的标记物包括放射性部分或经同位素标记分子。根据本披露可以使用的示例性的放射性部分包括但不限于氚(3H)、氘(2H)、和/或35S。典型地，这些部分被直接附连到该荧光团上或者以别的方式与该荧光团相结合。仅给出一个放射性荧光团的实例，可以对2AP进行修饰这样将所有的氢都被氘化。 
聚糖的释放
本披露提供了改进的确定糖蛋白的糖基化作用模式的方法。此类方法可以涉及将一种聚糖群经受一种或多种外切糖苷酶处理并且分析这些消化产物 的结构和/或组成。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割仅仅一种特定类型的糖苷键。在一些实施方案中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割一种以上的特定类型的糖苷键。在这些外切糖苷酶中，对于本发明可能是有用的是α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶；己糖胺酶、甘露糖苷酶；以及它们的组合(如表1中所描述的)。 
外切糖苷酶
外切糖苷酶是从聚糖的非还原性末端切割末端糖苷键的酶类。它们对于特定的单糖连接以及异头性(anomericity)(α/β)典型地是高度特异性的。在一些实施方案中，相邻的分枝模式可以影响外切糖苷酶的特异性。外切糖苷酶处理通常导致标准的触角连接(antennary linkage)的聚糖被切割成五糖核心(M3N2)(包含3个甘露糖以及2个GlcNAc残基)。然而，异常修饰的种类(例如，触角或核心岩藻糖基化的种类、高甘露糖以及杂聚糖、乳糖胺延长的聚糖、硫酸化聚糖、磷酸化聚糖，等等)对外切糖苷酶处理具有抗性，并且可以用色谱方式分辨出并且相对于M3N2五糖进行定量。 
根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于：唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。可以从任何来源(包括商业来源)或通过从细胞来源(例如，细菌、酵母、植物、等)分离和/或纯化而获得外切糖苷酶。 
在一些实施方案中，外切糖苷酶(例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶)可以被分成多种类别或“亚组”。在一些实施方案中，不同的亚组显示出不同的切割不同类型的连接的能力。表1呈现出了一些示例性的外切糖苷酶，它们的连接特异性、以及从中衍生出每一种外切糖苷酶的生物体。本领域的普通技术人员应当理解这仅仅是一个示例性的而非综合性的外切糖苷酶列表，并且具有任何连接特异性的外切糖苷酶都可以根据本披露进行使用。 
表1.外切糖苷酶 
*“EC#”是指酶学委员会登记号 
根据本披露，聚糖群可以使用任何一外切糖苷酶或任何一组外切糖苷酶进行消化。总体而言，在与酶活性相容的条件下发生外切糖苷酶反应。例如，可以将pH、温度、反应溶液组分以及浓度(例如，盐、洗涤剂、等等)、以及反应时间的长度进行最佳化以便获得所希望水平的外切糖苷酶活性。参见例如WO 2008/130926，它的内容通过引用结合在此。 
聚糖结构和活性的分析
总体上，根据本披露的方法包括使聚糖制剂经受分析以确定该聚糖是否包括一种特定类型的修饰(例如，末端α-1，3-半乳糖残基)。在一些实施方案中，该分析包括将来自一个来源的一种糖蛋白制剂中的聚糖的结构和/或功能与来自另一个来源的至少一种另外的糖蛋白制剂中的聚糖的结构和/或功能进行比较。在一些实施方案中，该分析包括将在一种或多种样品中的聚糖的结构和/或功能与在一种参比样品中的聚糖的结构和/或功能进行比较。 
可以通过任何一种可供使用的方法分析聚糖的结构和组成。在一些实施方案中，聚糖的结构和组成通过以下方法进行分析：色谱法、质谱法(MS)、色谱法后跟随MS、电泳法、电泳法后跟随MS、核磁共振(NMR)法、以及它们的组合。 
在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过色谱法进行分析，包括但不限于，液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)，超高效液相色谱法(UPLC)、薄层色谱法(TLC)、酰胺柱色谱法、以及它们的组合。 
在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过质谱法(MS)以及相关方法进行分析，包括但不限于，串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱法(FTMS)、离子迁移分离与质谱(IMS-MS)、电子转移解离质谱(ETD-MS)、以及它们的组合。 
在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过电泳法进行分析，包括但不限于毛细管电泳法(CE)、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)后跟随蛋白质印迹法(使用识别特异多糖结构的抗体)、以及它们的组合。 
在一些实施方案中，聚糖的结构和组成可以通过核磁共振(NMR)以及相关方法进行分析，包括但不限于，一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关谱磁性角自旋(correlation spectroscopy magnetic-angle spinning)NMR(COSY-NMR)、全相关光谱(total correlated spectroscopy) NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干(heteronuclear single-quantum coherence)NMR(HSQC-NMR)、异核多级量子相干(heteronuclear multiple quantum coherence)NMR(HMQC-NMR)、旋转核奥佛豪塞效应光谱(rotational nuclear overhauser effect spectroscopy)NMR(ROESY-NMR)、核奥佛豪塞效应谱(nuclear overhauser effect spectroscopy)NMR(NOESY-NMR)、以及它们的组合。 
在一些实施方案中，在此说明的技术可以与一种或多种其他技术相结合，用于聚糖或糖蛋白的检测、分析、和/或分离。例如，在一些实施方案中，根据本披露使用一种或多种可供使用的方法对聚糖进行分析(仅给出一些实例，参见Anumula，Anal.Biochem.350(1)：1，2006；Klein et al.，Anal.Biochem.，179：162，1989；和/或Townsend，R.R.Carbohydrate Analysis”High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis.，Ed.Z.El Rassi，pp 181-209，1995，这些文献中的每一个均通过引用以其全部内容结合在此)。例如，在一些实施方案中，使用一种或多种色谱法、电泳法、核磁共振法、以及它们的组合对聚糖进行表征。示例性的此类方法包括例如，NMR、质谱法、液相色谱法、2-维色谱法、SDS-PAGE、抗体染色、凝集素染色、单糖定量、毛细管电泳、荧光辅助糖电泳(FACE)、胶束动电色谱法(MEKC)、外切糖苷酶或内切糖苷酶处理、以及它们的组合。本领域的普通技术人员应当意识到其他技术，这些技术可以与在此所说明的方法一起使用来对聚糖进行表征。 
在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种聚糖的一个群中以低水平存在的聚糖种类(例如，末端α-半乳糖苷基残基)。例如，本方法允许检测在多种聚糖的一个群之内按照以下水平存在的聚糖种类：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、或小于0.01％。 
在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种聚糖的一个群之内以低水平存在的特定结构(例如，末端α半乳糖苷基残基)。例如，本方法允许检测在多种聚糖的一个群之内按照以下水平存在的特定结构：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、或小于0.01％。 
在一些实施方案中，在此所说明的方法允许检测在多种聚糖的一个群之内的单独的聚糖的相对水平。例如，可以测量在液相色谱的每个峰之下的面积并且将其表达为总数的一个百分数。这种分析提供了在多种聚糖的一个群之内的每个聚糖种类的一个相对百分比量。在另一个实例中，从1D-NMR实验中的峰的面积，或者从来自1H-15HSQC谱的交叉峰的大小(例如，具有基于来自标准品的响应的校正)，或者通过比较跨样品的相同的峰经过相对定量从而确定单独的聚糖种类的相对水平。 
在一些实施方案中，评定了糖蛋白制剂(例如，一种糖蛋白制剂)的生物学活性。可以通过任何一种可供使用的方法分析糖蛋白制剂的生物学活性。在一些实施方案中，评定了糖蛋白的结合活性(例如，结合到受体上)。在一些实施方案中，评定了糖蛋白的治疗活性(例如，糖蛋白的在降低疾病或病症的严重性或病症方面或在延缓疾病或病症的症状的出现方面的活性)。在一些实施方案中，评定了糖蛋白的药理学活性(例如，生物利用度、药物代谢动力学、药效动力学)。关于分析糖蛋白治疗剂的生物利用度、药物代谢动力学、以及药效动力学的方法，参见例如Weiner et al.，J Pharm Biomed Anal.15(5)：571-9，1997；Srinivas et al.，J.Pharm.Sci.85(1)：1-4，1996；and Srinivas et al.，Pharm.Res.14(7)：911-6，1997。 
如本领域普通技术人员应当理解的，可以被测试的具体的生物学活性或治疗活性将取决于具体的糖蛋白而改变。 
可以通过任何可供使用的方法分析这些糖蛋白制剂的潜在的不利的活性或毒性(例如，引起高血压、过敏反应、血栓形成事件、癫痫发作、或其他 不利事件的倾向)。在一些实施方案中，评定了糖蛋白制剂的免疫原性，例如通过确定该制剂是否在受试者体内引起抗体应答。 
在不同的实施方案中，将具有末端α-半乳糖苷基残基的糖蛋白制剂的生物学活性、治疗活性等与缺乏末端α-半乳糖苷基残基的糖蛋白制剂进行比较。在不同的实施方案中，将具有末端α-半乳糖苷基残基的糖蛋白制剂的生物学活性、治疗活性等与具有不同水平的末端α-半乳糖苷基残基的糖蛋白制剂进行比较。 
应用
可以利用本披露的方法来分析处于多种状态中的任何一种的来自糖蛋白的聚糖，例如游离聚糖、糖蛋白(例如，糖肽、糖脂、蛋白聚糖、等等)、与细胞结合的聚糖(例如，与细胞核、细胞质、细胞膜结合的聚糖、等等)；与细胞、细胞外、细胞内、和/或亚细胞组分(例如蛋白质)结合的聚糖；在细胞外空间的聚糖(例如，细胞培养基)、等等。 
本披露的方法可以用于针对一种治疗性或其他商业上有关的糖蛋白的生产的过程进展的一个或多个阶段中。可以采用本披露的方法的此类过程进展阶段的非限制性的实例包括细胞选择、克隆选择、培养基最佳化、培养条件、处理条件、和/或纯化操作。本领域的普通技术人员应当知道其他的过程进展阶段。 
还可以利用本披露来监测在一个特定的细胞培养中所发生的糖基化作用的程度和/或类型(例如，在该细胞培养中产生的糖蛋白制剂的末端α-半乳糖苷残基的程度)，由此允许调节或可能终止这种培养，以便(例如)实现一种特定的所希望的糖基化作用模式或避免发展一种特定的所不希望的糖基化作用模式。 
还可以利用本披露来评定细胞或细胞系的糖基化作用特征，这些细胞或细胞系(例如，CHO细胞系)被认为用于产生一种特定的所希望的糖蛋白 (例如，甚至是在这些细胞或细胞系已经被工程化以产生该糖蛋白、或产生一种处于商业有关水平的糖蛋白之前)。 
例如，其中这种目标糖蛋白是一种治疗性糖蛋白，例如在一个或多个国家中已经历了监管审查，经常会希望的是对这些培养物进行监测以便评定它们会产生具有一种糖基化作用模式(尽可能接近于已确立的药物产品的糖基化作用模式(例如，具有一定程度的接近于药物产品的糖基化作用模式的末端α-半乳糖苷残基))的产物的可能性，无论它是否正在通过恰好相同的途径而产生。如在此所使用，“接近”是指一种糖基化作用模式与所确立的药物产品的糖基化作用模式具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的相关。在此类实施方案中，典型地在多个时间点获取这些生产培养物的样品并将它们与一个已确立的标准或与一个对照培养物进行比较以便评定相对的糖基化作用。 
例如，在一些实施方案中，用于监测一种糖蛋白的生产的方法可以包括以下步骤：(i)在一种糖蛋白的生产过程中，从该生产体系中移出至少第一以及第二含聚糖的样品；(ii)将该第一以及第二含聚糖的样品各自经受一个分析以确定是否存在一个特定的修饰(例如末端α-半乳糖苷残基)；并且(iii)将从该第一含聚糖的样品中获得的这些产物与从该第二含聚糖的样品中获得的那些产物进行比较，从而确定了差别并且因此使糖蛋白生产的过程得以监测。在一些实施方案中，该糖蛋白是阿巴西普。在一些实施方案中，该生产系统包括CHO细胞。 
无论是否出于质量控制的目的而监测一种特定的目标蛋白的生产，可以利用本披露来(例如)监测处于特定发展阶段的、或在特定生长条件下的糖基化作用。 
在一些实施方案中，在此所说明的方法可以用来表征、调节和/或控制或比较这些治疗性产品的质量。仅给出一个实例，本发明的方法学可以用来评定在产生一种治疗性蛋白产品的细胞中的糖基化作用。具体而言，假定糖基化作用可经常影响一种治疗性蛋白产品的活性、生物利用度、或其他特征， 则用于在这种治疗性蛋白产品的生产过程中对细胞的糖基化作用进行评定的方法是特别希望的。除其他事项之外，本披露可以促进在用于治疗性蛋白的生产体系中的糖基化作用的实时分析，并且因此可以实现对糖基化作用的调节。 
代表性的治疗性糖蛋白产品(其生产和/或质量可以根据本披露进行监测)包括，例如，多种血液学因子中的任何一种(包括例如，促红细胞生成素、血液凝固因子，等等)、干扰素、集落刺激因子、抗体、酶、以及激素。 
代表性的可商购的糖蛋白产品包括，例如在表2中所呈现的那些糖蛋白产品(如果在CHO细胞中生产的话)： 
表2：示例性的可商购的糖蛋白产品 
Figure BPA00001406845500221
Figure BPA00001406845500231
Figure BPA00001406845500241
在一些实施方案中，本披露提供了多种方法，在这些方法中将来自不同来源的糖蛋白或样品的聚糖彼此进行比较。在一些此类的实例中，随着时间 获得了来自相同来源(例如，来自同一个CHO细胞来源)的多个样品，从而监测了在糖基化作用模式方面的变化(特别是在细胞表面的糖基化作用模式方面)(例如，在末端α-半乳糖基残基的存在或程度方面的变化)。在一些实施方案中，样品之一是一种历史样品或历史样品的一个记录。在一些实施方案中，样品之一是一个参比样品。 
在一些实施方案中，本披露提供了多种方法，在这些方法中将来自由不同细胞来源表达的糖蛋白的聚糖彼此进行比较。在一些实施方案中，这些被比较的细胞来源中的一种或多种是CHO细胞。 
在一些实施方案中，对来自不同的细胞培养样品的聚糖进行比较，这些聚糖在以下条件下进行制备，这些条件在一个或多个所选择的参数方面不同(例如，细胞类型，培养类型[例如，连续进料对比分批进料，等等]、培养条件[例如，培养基的类型、一种或多种具体的培养基中具体成分的存在或浓度、渗透性、pH、温度、一种或多种因素(如渗透性、pH、温度，等等)变换的时间或程度]、培养时间，分离步骤，等等)，但在其他方面是相同的，从而确定所选择的参数对糖基化作用的影响。在某些实施方案中，对来自在一个单一的所选择的参数方面不同的条件下制备的不同的细胞培养样品的聚糖进行了比较，从而确定该单一的所选择的参数对糖基化作用模式的影响(例如存在或缺乏末端α-半乳糖苷残基)。因此，在其他应用中，使用在此所说明的技术可能有助于确定特定的参数对细胞中的糖基化作用模式的影响。 
在一些实施方案中，对来自不同批次的糖蛋白的聚糖(无论是通过相同的方法还是通过不同的方法进行制备，以及无论是同时制备还是分开制备)进行了比较。在这类实施方案中，本披露有助于糖蛋白制剂的质量控制。可替代地或另外地，一些此类的实施方案有助于监测一种产生糖蛋白的特定培养物的进程(例如，当样品在不同的时间点从该培养物中被移出，并对样品进行分析然后将这些样品彼此进行比较时)。在一些实例中，随着时间获得了来自相同来源的多个样品，从而监测了在糖基化作用模式方面的变化。在 一些实施方案中，含聚糖的样品按照以下间隔被移出：约30秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约10小时、约12小时、或约18小时的间隔、或以甚至更长的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以不规则的间隔被移出。在一些实施方案中，含聚糖的样品以5小时的间隔被移出。 
在一些实施方案中，根据本披露的方法可以用来监测糖蛋白在其通过细胞进行生产的过程中的糖基化作用模式。例如，糖蛋白的生产(例如，商业性生产)可以涉及以下步骤：(1)培养产生糖蛋白的细胞，(2)在培养过程中以规则或不规则的间隔获得样品，并且(3)分析在所获得的一种或多种样品中所产生的一种或多种糖蛋白的糖基化作用模式。在一些实施方案中，此类方法可以包括将在所获得的样品中产生的一种或多种糖蛋白的糖基化作用模式彼此进行比较的一个步骤。在一些实施方案中，此类方法可以包括将在所获得的一个或多个样品中产生的一种或多种糖蛋白的糖基化作用模式与一个参比样品的糖基化作用模式进行比较的一个步骤。 
在这些实施方案的任何一个中，可以将这些聚糖分析的特征记录在例如一个质量控制记录中。如以上所指明，在一些实施方案中，与糖蛋白的一个先前的历史记录或标准批次和/或与一个参比样品进行了比较。 
在一些实施方案中，将来自不同批次的特定糖蛋白的聚糖(无论是通过相同的方法还是不同的方法进行制备，以及无论是通过同时制备还是分别制备)彼此之间和/或与一个参比样品进行了比较。在一些实施方案中，批次对批次的比较可包括以下步骤：(i)提供来自一个第一批次的糖蛋白的一种第一聚糖制剂；(ii)提供来自一个第二批次的糖蛋白的一种第二聚糖制剂；(iii)将该第一以及第二聚糖制剂各自经受分析过程；并且(iv)将获自该第一聚糖制剂的分析结果与获自该第二制剂的切割产物进行比较，从而评定了这两个批次的一致性。在一些实施方案中，可以通过从来自一个批次的至少一种糖蛋白中移出至少一种聚糖而提供聚糖制剂，并且可任选地，分离所移出的聚 糖。在一些实施方案中，聚糖制剂可以如在此所说明进行标记(例如，荧光地和/或放射性地；例如，在分离之前和/或之后)。 
在一些实施方案中，本披露促进了糖蛋白制剂的质量控制。聚糖分析的特征可以记录在例如一个质量控制记录中。如以上所指明，在一些实施方案中，与糖蛋白的一个先前的历史记录或标准批次进行了比较。在一些实施方案中，与一种参比糖蛋白样品进行了比较。 
在某些实施方案中，可在多项研究中利用本披露来修饰一种细胞的糖基化作用特征，例如用来建立具有一个或多个所希望的糖基化作用特征的一种细胞系和/或培养条件，例如生产具有或缺乏末端α-半乳糖苷残基的糖蛋白的细胞系。然后，可以利用这种细胞系和/或此类培养条件(如果希望的话)用于产生一种特定的目标糖蛋白，预期这种或此类糖基化作用特征对该目标糖蛋白是有益的。在具体的实施方案中，该细胞是CHO细胞。 
根据本披露，在此说明的技术可以用来检测所希望的或不希望的聚糖，例如用于检测在一种糖蛋白产品中一种或多种污染物的存在或对其进行定量，或用于检测一种或多种活性的或所希望的种类的存在或对其进行定量。 
在一些实施方案中，在此所说明的方法有助于聚糖的检测，这些聚糖在一个来源(例如，一种生物样品，聚糖制剂，等等)中以非常低的水平存在。在此类实施方案中，有可能检测聚糖的水平和/或可任选地对其进行定量，这些聚糖在多种聚糖的一个群之内按照以下水平存在：小于约10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、或0.01％。在一些实施方案中，有可能检测聚糖的水平和/或可任选地对其进行定量，这些聚糖包括在0.1％与5％之间，例如，在0.1％与2％之间，例如，在0.1％与1％之间的一种聚糖制剂。 
在一些实施方案中，在此所说明的方法允许用于检测在多种聚糖的一个群之内以低水平存在的特定连接。例如，本方法允许用于检测在多种特定连接(例如，末端gal-1，3-gal连接)，这些连接按照以下水平存在于多种聚糖的一个群之内：小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于 1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、或小于0.01％。 
在一些实施方案中，在此所说明的方法允许检测在多种聚糖的一个群之内的单独的聚糖种类的相对水平。例如，可以测量在液相色谱的每个峰之下的面积并且将其表达为总数的一个百分数。这种分析提供了在多种聚糖的一个群之内每个聚糖种类的一个相对百分比量。 
参照以下实例将会更明确地阐述本披露。然而，应当理解的是本披露不以任何方式而被这些实例所限制。 
鉴于参考在此提供的说明书的实例，本领域的普通技术人员可以容易地在本发明的范围内想象不同的其他组合。 
实例
实例1：
OrenciaTM(阿巴西普)是一种可溶性融合蛋白，该蛋白由连接到人免疫球蛋白G1(IgG1)的修饰的Fc(铰链、CH2、以及CH3结构域)部分上的人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的细胞外结构域组成。阿巴西普是通过重组DNA技术在哺乳动物细胞表达系统中生产的。阿巴西普的表观分子量是92千道尔顿。阿巴西普被用来治疗类风湿性关节炎的症状，用来减缓关节损伤的进展，并且用来改善身体功能。由它的高度糖基化(3个N-连接的以及2个O-连接的糖基化位点)引起的这种生物治疗药物的高度复杂性需要仔细的生产和表征。因为对蛋白质化学成分的不同的修饰(蛋白质主链修饰、糖基化、等)可以影响糖蛋白的生物学功能，在制造期间确保对该生物治疗药物的化学和物理特性进行良好的控制是重要的。 
典型地，Gal-α1-3Gal表位(“α-gal”)未发现于人类蛋白中并且不期望出现在CHO衍生的产物中。典型地，该表位发现于从猪和小鼠分离的蛋白中。人类具有抗Galα1-3Gal末端的循环抗体，因此重要的是监控在糖蛋白治疗剂 中的这些种类以及理解这是如何与过程发展相关的。本披露表明在阿巴西普(它表达于CHO细胞中)存在α-gal结构。 
用于分析这些聚糖种类的步骤： 
通过用PNGASE-F进行处理随后进行固相萃取纯化从药物物质中分离出N-聚糖。然后将这些聚糖进行2AB标记，并且然后通过LC-MS-MS来对选定的部分进行分析。通过外切糖苷酶、MALDI-MS、以及Lc-MS/MS的组合进一步证实这些聚糖结构。 
这个数据表明在该阿巴西普-CTLA4糖蛋白N-聚糖中存在末端α连接的半乳糖。通过LC-MS/MS来分析OrenciaTM(阿巴西普)的N-连接的聚糖的实例(一种可溶性的融合蛋白，该蛋白由连接到人免疫球蛋白G1(IgG1)的修饰的Fc(铰链、CH2、以及CH3结构域)部分上的人细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原4(CTLA-4)的细胞外结构域组成)。图3显示从阿巴西普衍生的聚糖的一部分的荧光色谱图，显示检测出具有HexNAc4Hex6Fuc1成分的聚糖种类，该成分相应于包含半乳糖-α-1-3半乳糖的结构。 
来自具有HexNAc4Hex6Fuc1成分的OrenciaTM衍生的聚糖种类的MS2谱表明存在非还原端半乳糖-α-1-3连接的半乳糖(图4)，尽管没有消除其他潜在结构(例如杂类聚糖)的可能性。 
使用不同外切糖苷酶处理随后进行LC-ESI-MS/MS以及MALDI-MS的组合获得了该结构的进一步确认。使从OrenciaTM和对照蛋白两者衍生的N-聚糖部分经受外切糖苷酶处理。用(i)α-半乳糖苷酶和(ii)β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶、以及甘露糖苷酶的混合物来处理这两种样品以解析该潜在的非还原端半乳糖-α-1-3连接的半乳糖结构。这两个反应的产物的荧光色谱的比较显示在图5中。 
在α-半乳糖苷酶处理之前和之后在来自对照蛋白的聚糖中没有观察到显著的差异。另一方面，在OrenciaTM中观察到在具有HexNAc4Hex6Fuc1成分的种类方面的明显减少，以及伴随着在HexNAc4Hex5Fuc1成分的种类方面的增 加。具有来自阿巴西普的HexNAc4Hex6Fuc1成分的种类(作为酶处理的结果)的MS2也显示于图6中。 
如通过MALDI-TOF-MS所进行的分析(图7)，从用不同组的外切糖苷酶(β-半乳糖苷酶、己糖胺酶以及甘露糖苷酶)进行处理的结果获得了另外的确认。 
这些数据表明在OrenciaTM中具有HexNAc4Hex6Fuc1成分的种类主要包含非还原端半乳糖-α1-3连接的半乳糖。 
扩展和替代方案
虽然参考具体的例证性实施方案已经对这些方法进行了具体的显示和说明，应当理解的是在形式和细节上可以进行多种改变，而不偏离本披露的精神和范围。因此，在这些方法的范围和精神之内的所有实施方案及其等效物是旨在要求的。本披露的权利要求书、说明书以及这些方法、系统、以及测定的图表不应被解读为限制于这些要素的所描述的顺序，除非对这样的结果进行说明。 
在本申请中引用的所有文献以及类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文、以及网页，无论这类文献和类似材料的形式，都清楚地通过引用以其全部内容结合在此。在这些结合的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾的情况下，包括但不限于定义的术语、术语用途、描述的技术等，以本申请为准。在此所使用的节的标题仅用作组织的目的并且不应被解释为对所描述的主题进行任何形式的限制。尽管结合不同的实施方案以及实例已经说明了这些方法，并不旨在将这些方法限制于这类实施方案或实例。相反，这些方法包括如本领域的普通技术人员所应当理解的不同的替代方案、修改、以及等效物。 

Claims (18)

1.一种用于筛选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生目标重组糖蛋白的能力的方法，该糖蛋白包括包含目标水平的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖表位的聚糖，该方法包括：
(a)在适合由CHO细胞表达目标重组糖蛋白的条件下，通过培养所述CHO细胞，生产包含一个或多个聚糖的所述目标重组糖蛋白，其中所述CHO细胞没有被基因工程化以在聚糖上产生末端α-半乳糖苷残基；
(b)使用一种或多种外切糖苷酶处理所述目标重组糖蛋白的所述一个或多个聚糖；
(c)检测消化的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基，以从而测量由所述CHO细胞所产生的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖，并且
(d)如果测量到目标水平的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基，选择所述CHO细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CHO细胞在一种细胞培养物中。
3.如权利要求1所述的方法，其中对以下中的任一个进行所述检测：从所述CHO细胞分离的所述目标重组糖蛋白、从由所述CHO细胞表达的所述目标重组糖蛋白获得的肽、所述CHO细胞的细胞表面聚糖、从所述CHO细胞获得的聚糖制剂、从由所述CHO细胞表达的所述目标重组糖蛋白获得的聚糖制剂、和其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中该生产步骤进一步包括从所述CHO细胞分离所述目标重组糖蛋白的步骤。
5.如权利要求2所述的方法，其中该细胞培养物是在一个生物反应器中。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括使用选自下述的技术：色谱法、质谱(MS)法、电泳法、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收法、酶法、以及它们的组合。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述目标重组糖蛋白是人类治疗性糖蛋白，并且所述CHO细胞已经用编码所述人类治疗性糖蛋白的载体转化。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括从下列至少之一筛选CHO细胞：至少两个不同的CHO株，至少两个不同的克隆细胞群，以及来自用于治疗性糖蛋白的制造过程行进的细胞培养物的至少两个不同的样品。
9.如权利要求1所述的方法，进一步包括培养选定的CHO细胞以产生一种治疗性糖蛋白产物的步骤。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括从两个或多个CHO细胞群筛选CHO细胞，并且所述方法进一步包括比较由所述两个或多个CHO细胞群的CHO细胞生产的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的水平。
11.如权利要求1所述的方法，进一步包括将由所述CHO细胞生产的包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖水平与一个参比糖蛋白样品进行比较。
12.如权利要求1所述的方法，进一步包括将包含末端半乳糖-α-1-3-半乳糖残基的聚糖的测量水平记录在一种打印物或计算机可读介质中。
13.如权利要求1所述的方法，其中该目标水平是药物制剂的质量标准。
14.如权利要求1所述的方法，其中该目标水平是产品说明书中的范围或值。
15.如权利要求1所述的方法，其中该目标水平是不大于5％的末端半乳糖-α-1-3-半乳糖。
16.如权利要求1所述的方法，其中检测包括检测分子的使用。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种外切糖苷酶选自唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述处理步骤包括用一种或多种外切糖苷酶并且在适合所述一种或多种外切糖苷酶从一个或多个聚糖的非还原性末端切割一个或多个末端糖苷键的条件下，处理一段时间。
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