BR112013033448B1 - Método para produzir uma proteína recombinante com um padrão de glicosilação semelhante ao de humano - Google Patents

Abstract

CÉLULAS DEFICIENTES EM ÁCIDO CMP-N-ACETILNEURAMÍNICO HIDROXILASE E/OU GLICOPROTEÍNA ALFA-1,3-GALACTOSILTRANSFERASE. A presente invenção fornece linhagens celulares de mamífero não humano que são deficientes em CMP-Neu5Ac hidroxilase (Cmah) e/ou glicoproteína alfa-1,3-galactosiltransferase (Ggta1). Também são fornecidos métodos para utilizar as células aqui reveladas para produzir proteínas recombinantes com padrões de glicosilação semelhantes os humanos. 20116591v1

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente revelação refere-se genericamente às células úteis para a produção de proteínas e, em especial proteínas terapêuticas. Mais especificamente, a presente revelação refere-se às células deficientes em certas enzimas de processamento de N-glicano, métodos para produzir as células, e métodos para a utilização das células para produzir proteínas tendo certos padrões de glicosilação.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] Aproximadamente 70% das proteínas terapêuticas, tal como anticorpos, fatores de crescimento, citocinas, hormônios e fatores de coagulação, são glicoproteínas, que são proteínas modificadas pós-tradução pela fixação de glicanos. A maioria das glicoproteínas terapêuticas recombinantes é produzida em sistemas de expressão em mamíferos porque foi demonstrado que a localização, o número e a estrutura de N-glicanos afetam a bioatividade, solubilidade, estabilidade, farmacocinética, imunogenicidade e taxa de liberação de glicoproteínas terapêuticas. Duas diferenças no maquinário de glicosilação de seres humanos e de outros mamíferos explicam as diferenças nos padrões de glicosilação de glicoproteínas produzidas por células humanas e glicoproteínas produzidas por outras células de mamíferos como células de roedores.

[0003] Primeiramente, humanos não podem sintetizar uma fração terminal de galactose alfa-1,3 galactosiltransferase (também conhecida como alfa-Gal ou α-Gal) em N-glicanos. A enzima glicoproteína alfa-1,3-galactosiltransferase (Ggta1) forma a fração α- Gal ligando um resíduo de galactose através de uma ligação glicosídica α-1,3 a uma galactose terminal do N-glicano. Os seres humanos aparentemente têm um gene GGTA1, mas ele é um pseudogene expresso que codifica uma proteína truncada não funcional contendo os primeiros quatro éxons traduzidos, mas faltando os dois éxons catalíticos. Embora os seres humanos não expressem uma enzima Ggta1 funcional e, por conseguinte, não sintetizem frações α-Gal, muitos seres humanos produzem anticorpos contra esta estrutura.

[0004] Em segundo lugar, o ser humano não pode sintetizar o ácido siálico, ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc). Neu5Gc é produzido pela hidroxilação de ácido CMP-N-acetilneuramínico (Neu5Ac) a CMP-Neu5Gc pela enzima CMP-Neu5Ac hidroxilase (Cmah). Embora o gene Cmah humano seja mutado irreversivelmente, impedindo a expressão de Neu5Ac, traços de Neu5Gc foram detectados em soro humano. Parece que Neu5Gc não humano pode ser incorporado metabolicamente em tecidos humanos, a partir de certos alimentos derivados de mamíferos, de modo que, essencialmente, todos os humanos têm anticorpos específicos para Neu5Gc, por vezes em níveis elevados.

[0005] As células de ovário de hamster chinês (CHO), são amplamente utilizadas para a produção de proteínas terapêuticas, em parte, porque foi assumido que elas produzem proteínas com padrões de glicosilação semelhantes aos humanos. Por exemplo, era geralmente aceito que as células CHO não possuíam o maquinário biossintético para produzir glicoproteínas com as frações α-Gal. Além disso, embora as células CHO expressem Cmah e produzem proteínas contendo unidades Neu5Gc, a proporção de unidades de Neu5Gc e Neu5Ac pode ser reduzida modificando as condições da cultura de células CHO. Apesar da aceitação geral de que as células CHO não foram capazes de sintetizar frações α-Gal, CHO ortóloga de Ggta1 foi recentemente identificada (Bosques et al. Nature Biotechnol. 2010, 28(11): 1153-1156). Devido ao potencial de reações de hipersensibilidade às glicoproteínas terapêuticas recombinantes, há uma necessidade de linhagens celulares CHO e outras linhagens celulares de mamíferos não humanos, que produzam as glicoproteínas desprovidas de α-Gal e/ou resíduos Neu5Gc.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Resumidamente, portanto, um aspecto da presente revelação fornece uma linhagem celular de mamífero não humano deficiente em hidroxilase do ácido citidina-monofosfato-N- acetilneuramínico (Cmah). Em uma modalidade, a linhagem celular, compreende uma sequência de codificação cromossômica inativada que codifica Cmah. Em certas modalidades, a sequência cromossômica inativada que codifica Cmah compreende uma deleção de pelo menos um nucelotídeo, uma inserção de pelo menos um nucelotídeo, uma substituição de pelo menos um nucelotídeo, ou combinações das mesmas. Em uma modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Cmah não compreende nenhuma sequência introduzida exogenamente. Em outra modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Cmah é monoalélica e a linhagem celular produz uma quantidade reduzida de Cmah. Em ainda outra modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Cmah é bialélica e a linhagem celular não produz Cmah. Em uma modalidade, a sequência cromossômica é inativada com uma endonuclease de marcação, por exemplo, uma meganuclease, uma TALEN, uma endonuclease específica do sítio, ou uma nuclease dedo de zinco. Em qualquer uma destas modalidades, a linhagem celular pode produzir proteínas desprovidas de resíduos de ácido N- glicolilneuramínico (Neu5Gc).

[0007] Em outro aspecto da presente revelação, a linhagem celular deficiente em Cmah é também deficiente em Ggta1. Em uma modalidade desta linhagem celular, a linhagem celular compreende uma sequência cromossômica inativada que codifica Ggta1. Em certas modalidades, a sequência de cromossômica inativada que codifica Ggta1 compreende uma deleção de pelo menos um nucelotídeo, uma inserção de pelo menos um nucelotídeo, uma substituição de pelo menos um nucelotídeo, ou combinações das mesmas. Em uma modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Ggta1 não compreende nenhuma sequência introduzida exogenamente. Em uma modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Ggta1 é monoalélica e a linhagem celular produz uma quantidade reduzida de Ggta1. Em outra modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Ggta1 é bialélica e a linhagem celular não produz Ggta1. Em outra modalidade, a sequência cromossômica é inativada com uma endonuclease de marcação, por exemplo, uma meganuclease, uma TALEN, uma endonuclease específica do sítio, ou uma nuclease dedo de zinco. Em qualquer uma destas modalidades, a linhagem celular de mamífero não humano pode produzir proteínas que, adicionalmente são desprovidas de resíduos de galactose alfa- 1,3-galactose (alfa-Gal).

[0008] Em uma modalidade, a linhagem celular compreende uma inativação monoalélica da sequência cromossômica que codifica Cmah e uma inativação monoalélica da sequência cromossômica que codifica Ggta1, e a linhagem celular produz uma quantidade reduzida de Cmah e uma quantidade reduzida de Ggta1. Em outra modalidade, a linhagem celular compreende uma inativação bialélica da sequência cromossômica que codifica Cmah e uma inativação bialélica da sequência cromossômica que codifica Ggta1, e a linhagem celular não produz Cmah ou Ggta1. Em uma modalidade particular, a linhagem celular de mamífero não humano produz proteínas desprovidas de resíduos de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) e de resíduos de galactose alfa-1,3-galactose (alfa-Gal).

[0009] Em uma modalidade particular da invenção, a linhagem celular é uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO). Em uma modalidade, a linhagem celular CHO compreende uma inativação monoalélica da sequência cromossômica que codifica Cmah e produz uma quantidade reduzida de Cmah. Em outra modalidade, a linhagem celular CHO compreende uma inativação bialélica da sequência cromossômica que codifica Cmah, e não produz Cmah. Em outra modalidade, a linhagem celular CHO compreende uma inativação monoalélica da sequência cromossômica que codifica Cmah e uma inativação monoalélica da sequência cromossômica que codifica Ggta1, e produz uma quantidade reduzida de Cmah e uma quantidade reduzida de Ggta1. Ainda em outra modalidade, a linhagem celular CHO compreende uma inativação bialélica da sequência cromossômica que codifica Cmah e uma inativação bialélica da sequência cromossômica que codifica Ggta1, e não produz Cmah ou Ggta1. Em uma modalidade, a linhagem celular CHO produz proteínas desprovidas de resíduos de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) e de resíduos de galactose alfa-1,3-galactose (alfa-Gal).

[00010] Em outro aspecto, a revelação inclui métodos para produzir uma linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1. Em uma modalidade, o método compreende introduzir na linhagem celular de uma endonuclease de alvo ou um ácido nucleico que codifica uma endonuclease marcadora direcionada para uma sequência cromossômica que codifica Cmah. Em outra modalidade, o método compreende introduzir em uma linhagem celular que é deficiente em Cmah, uma endonuclease de alvo ou um ácido nucleico que codifica uma endonuclease de alvo direcionada para uma sequência cromossômica que codifica Ggta1. Em outra modalidade, o método compreende introzudir em uma linhagem celular de uma endonuclease de alvo ou um ácido nucleico que codifica uma endonuclease de alvo direcionada para uma sequência cromossômica que codifica Cmah e uma endonuclease de alvo ou um ácido nucleico que codifica uma endonuclease de alvo direcionada para uma sequência cromossômica que codifica Ggta1.

[00011] Outro aspecto da revelação inclui um método para produzir uma proteína recombinante com um padrão de glicosilação semelhante ao humano. O método compreende expressar a proteína em uma linhagem celular de mamífero não humano deficiente em Cmah e/ou Ggta1. Em uma modalidade específica, a linhagem celular é uma linhagem celular de ovário do hamster chinês (CHO). Em uma modalidade, a linhagem celular compreende uma sequência cromossômica inativada que codifica Cmah e/ou uma sequência cromossômica inativada que codifica Ggta1. Em uma modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Cmah e/ou Ggta1 é monoalélica e a linhagem celular produz uma quantidade reduzida de Cmah e/ou Ggta1. Em outra modalidade, a sequência cromossômica inativada que codifica Cmah e/ou Ggta1 é bialélica, e a linhagem celular não produz Cmah e/ou Ggta1. Em outra modalidade, a proteína recombinante é desprovida de resíduos de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) e/ou resíduos de galactose-alfa-1,3-galactose (alfa-Gal). Em uma modalidade, a proteína recombinante contém, pelo menos, uma propriedade que é melhorada em relação a uma proteína recombinante semelhante, produzida por uma linhagem celular comparável não deficiente em Cmah e/ou Ggta1, por exemplo, imunogenicidade reduzida, biodisponibilidade aumentada, eficácia aumentada, estabilidade aumentada, solubilidade aumentada, meia- vida melhorada, depuração melhorada, farmacocinética melhorada e combinações das mesmas. A proteína recombinante pode ser qualquer proteína, incluindo uma proteína terapêutica. Exemplos de proteínas incluem aquelas selecionadas de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um fator de crescimento, uma citocina, um hormônio, um fator de coagulação, e um fragmento funcional ou variantes dos mesmos.

[00012] Outros aspectos e iterações da revelação são descritos em mais detalhes abaixo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00013] A FIG. 1 ilustra a clivagem mediada por ZFN do locus Ggta1 em células CHO. São mostrados os resultados de um ensaio de Cel-1 surveyor nuclease. As setas indicam produtos de clivagem de 215 pb e 100 pb, em células CHO transfectadas com ZFN mRNA (1) ou ZFN DNA (2). Não foram detectados produtos de clivagem em células transfectadas em simulações (3).

[00014] A FIG. 2 documenta clivagem mediada por ZFN do locus Cmah em células CHO, como detectado por um ensaio Cel-1 surveyor nuclease. A seta indica um produto de clivagem.

[00015] A FIG. 3 ilustra a clivagem mediada por ZFN do locus Ggta1 em células Cmah (-/-), como detectado por um ensaio Cel- 1surveyor nuclease. As células transfectadas com ZFN (marcadas "# 1" e "# 2"), mas não as células transfectadas em simulações continham fragmentos de clivagem de 215 pb e 100 pb.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00016] A presente revelação fornece linhagens celulares de mamífero não humano deficientes em Cmah e/ou Ggta1. Em uma modalidade, as linhagens celulares compreendem sequências cromossômicas inativadas que codificam Cmah e/ou Ggta1 de modo que as linhagens celulares produzem quantidades reduzidas de Cmah e/ou Ggta1. Em outra modalidade, as linhagens celulares compreendem sequências cromossômicas inativadas que codificam Cmah e/ou Ggta1 de modo que as linhagens celulares não produzem Cmah e/ou Ggta1. Também são aqui fornecidos métodos para produzir as linhagens celulares aqui reveladas e os métodos para a utilização das linhagens celulares aqui reveladas para produzir proteínas recombinantes com padrões de glicosilação semelhantes aos humanos. Devido ao fato de as linhagens celulares serem deficientes em Cmah e/ou Ggta1, as linhagens celulares produzem as glicoproteínas recombinantes com conteúdo reduzido de Neu5Gc e/ou α-Gal ou glicoproteínas desprovidas de Neu5Gc e/ou α-Gal.

(1) Linhagens Celulares Deficientes em Cmah e/ou Ggtal

[00017] Um aspecto da presente revelação fornece uma linhagem celular de mamífero não humano deficiente em hidroxilase do ácido citidina-monofosfato-N-acetilneuramínico (Cmah) e/ou glicoproteína alfa-1,3-galactosiltransferase (Ggta1).

(a) Cmah e Ggtal

[00018] Cmah e Ggta1 são enzimas envolvidas na geração de N- glicanos em glicoproteínas. Cmah catalisa a conversão do ácido siálico Neu5Ac em seu derivado hidroxilado Neu5Gc. Ggta1 liga um resíduo de galactose através de uma ligação glicosídica α-1,3 a uma galactose em N-glicano para formar uma fração terminal Gal-α-1,3-Gal (ou seja, α-Gal). Em uma modalidade, a linhagem celular é deficiente em Cmah. Em outra modalidade, a linhagem celular é deficiente em Ggta1. Ainda em outra modalidade, a linhagem celular é deficiente em ambos Cmah e Ggta1.

[00019] Em alguns casos, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ter níveis reduzidos de Cmah e/ou Ggta1 em relação à linhagem celular parental. Por exemplo, os níveis de Cmah e/ou Ggta1 podem ser reduzidos em cerca de 5% a cerca de 10%, em cerca de 10% a cerca de 20%, em cerca de 20% a cerca de 30%, em cerca de 30% a cerca de 40%, em cerca de 40% a cerca de 50%, em cerca de 50% a cerca de 60%, em cerca de 60% a cerca de 70%, em cerca de 70% a cerca de 80%, em cerca de 80% a cerca de 90%, ou de cerca de 90% a cerca de 99,9% em relação à linhagem celular parental que não é deficiente em Cmah e/ou Ggta1. A linhagem celular contendo níveis reduzidos de Cmah e/ou Ggta1 geralmente produz proteínas com conteúdo reduzido de Neu5Gc e/ou α-Gal em relação a proteínas produzidas por células comparáveis que não são deficientes em Cmah e/ou Ggta1.

[00020] Em outros casos, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode não produzir essencialmente nenhuma Cmah e/ou Ggta1. Conforme usado aqui, o termo "essencialmente nenhuma Cmah e/ou Ggta1" significa que nenhum mRNA ou proteína de Cmah e/ou Ggta1 pode ser detectado nas células deficientes ou lisados derivados utilizando procedimentos bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de procedimentos adequados para a determinação do nível de mRNA ou proteína incluem PCR, qPCR, Western blotting e ensaios ELISA. Assim, o nível de mRNA e/ou proteína de Cmah e/ou Ggta1 detectado nas células deficientes ou lisados é essencialmente o mesmo que os níveis de fundo. A linhagem celular desprovida de Cmah e/ou Ggta1 geralmente produz proteínas desprovidas de resíduos de Neu5Gc e/ou α-Gal.

[00021] Em algumas modalidades, o genoma da linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser editado de modo que a sequência cromossômica que codifica Cmah e/ou a sequência cromossômica que codifica Ggta1 são inativadas. Conforme usado aqui, o termo "sequência cromossômica inativada" refere-se a uma sequência cromossômica que não é capaz de gerar um produto funcional do gene. Em uma modalidade na qual a linhagem celular compreende células euploides, a sequência cromossômica inativada pode ser monoalélica de modo que a célula produz níveis reduzidos de Cmah e/ou Ggta1. Em outra modalidade na qual a linhagem celular é euploide, a sequência cromossômica inativada pode ser bialélica de modo que a célula não produz essencialmente nenhum Cmah e/ou Ggta1 e a célula pode ser denominada uma célula "knock-out". Alternativamente, em outras modalidades em que a linhagem celular é aneuploide, uma ou mais cópias das sequências cromossômicas que codificam Cmah e/ou Ggta1 é/são inativadas, resultando em uma quantidade reduzida de Cmah e/ou Ggta1. Em outra modalidade na qual a linhagem celular é aneuploide, todas as cópias das sequências cromossômicas que codificam Cmah e/ou Ggta1 são inativadas, resultando em uma perda completa da expressão do gene Cmah e/ou Ggta1.

[00022] A sequência cromossômica inativada que codifica Cmah e/ou Ggta1 pode compreender uma deleção de pelo menos um nucelotídeo, uma inserção de pelo menos um nucelotídeo, ou uma substituição de pelo menos um nucelotídeo. A sequência cromossômica que codifica Cmah e/ou Ggta1 pode ser inativada usando-se a tecnologia de edição de genoma mediada por endonuclease de alvo, conforme detalhado abaixo na seção (II). Em várias modalidades, a sequência cromossômica que codifica Cmah e/ou Ggta1 pode ser inativada por eliminação de toda ou parte da região de codificação exônica, deleção de toda ou parte de uma região de controle, e/ou deleção de um sítio de processamento de modo que a linhagem celular seja incapaz de produzir Cmah e/ou Ggta1. Em outras modalidades, a sequência cromossômica que codifica Cmah e/ou Ggta1 pode ser inativada por meio de supressões, inserções e/ou substituições de nucelotídeos para introduzir um códon de paragem prematuro, novo sítio de processamento, e/ou SNPs na sequência cromossômica de modo que a linhagem celular seja incapaz de produzir Cmah e/ou Ggta1.

[00023] Em uma modalidade, a linhagem celular pode compreender uma sequência cromossômica inativada que codifica Cmah devido a uma deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucelotídeo dentro da sequência cromossômica que codifica Cmah. Por exemplo, a sequência cromossômica que codifica Cmah pode ser inativada devido a uma deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucelotídeo dentro do éxon 5 da sequência sequência cromossômica que codifica Cmah. Em outra moddalidade, a linhagem celular pode compreender uma sequência cromossômica inativada que codifica que codifica Ggta1 devido a uma deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucelotídeo dentro da sequência cromossômica que codifica Ggta1. Por exemplo, a sequência cromossômica que codifica Ggta1 pode ser inativada devido a uma deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucelotídeo dentro do éxon 9 da sequência cromossômica que codifica Ggta1.

[00024] Em algumas modalidades, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 também pode ser deficiente em glutamina sintetase (GS), dihidrofolato redutase (DHFR), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT), ou combinações das mesmas. A linhagem celular compreendendo ainda deficiências em GS, DHFR, e/ou HPRT pode ser deficiente em GS, DHFR e/ou HPRT devido às sequências cromossômicas inativadas que codificam GS, DHFR e/ou HPRT.

(b) tipos de células

[00025] O tipo de linhagem celular que é deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser qualquer um de um número de tipos de células apropriadas. Em geral, a linhagem celular é uma linhagem celular de mamífero não humano. Linhagens celulares de mamíferos não humanos adequados incluem, entre outras, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster bebê (BHK), células de mieloma de camundongo NS0, células 3T3 de fibroblastos embrionários de camundongos, células A20 de linfoma B de camundongo; células B16 de melanoma de camundongo, células C2C12 de mioblastos de camundongo; células SP2/0 de mieloma de camundongo, células C3H-10T1/2 mesenquimais embrionárias de camundongo, células CT26 de carcinoma de camundongo, células DuCuP da próstata de camundongo, células EMT6 de mama de camundongo, células Hepa1c1c7 de hepatoma de camundongo, células J5582 de mieloma de camundongo, células MTD-1A epiteliais de camundongo, células MyEnd de miocárdio de camundongo; células RenCa renais de camundongo; células RIN-5F pancreáticas de camundongo; células X64 de melanoma de camundongo, células YAC-1 de linfoma de camundongo, células 9L de glioblastoma de rato, células RBL de linfoma B de rato, células B35 de neuroblastoma de rato; células de hepatoma de rato (HTC), células BRL 3A de fígado de rato búfalo, células de rim canino (MDCK), células mamárias caninas (CMT), células D17 de osteossarcoma de rato, células DH82 de monócito/macrófago de rato, células de fibroblasto transformado (COS7) de rim de macaco SV-40; células CVI-76 de rim de macaco; e células de rim de macaco verde Africano (VERO-76). Uma extensa lista de linhagens celulares de mamíferos não humanos pode ser encontrada no catálogo da American Type Culture Collection (ATCC, Mamassas, VA). Em uma modalidade, a linhagem celular que é deficiente na Cmah e/ou Ggta1 é outra que não uma linhagem celular murina. Ainda em outra modalidade, a linhagem celular que é deficiente em Cmah e/ou Ggta1 é outra que não uma linhagem celular suína.

[00026] Em algumas modalidades, a linhagem celular é de um tipo que é amplamente utilizado para a produção de proteínas glicol recombinantes. Em uma modalidade exemplar, a linhagem celular é uma linhagem celular CHO. Várias linhagens celulares CHO estão disponíveis através de ATCC e fornecedores comerciais. Linhagens celulares de CHO apropriadas incluem, entre outras, células CHO-K1 e derivados das mesmas, as células CHO-K1SV, células CHO DG44, células CHO-S, células CHO P12, células CHO pro3-, células CHO/DHFR-, células CHO/GS- e células CHO DXB11.

c) ácido nucleico opcional

[00027] Em algumas modalidades, a linhagem celular de mamífero não humano aqui revelada pode ainda compreender pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante. A proteína recombinante pode ser, entre outras, um anticorpo, um fragmento de um anticorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado, um anticorpo quimérico, uma molécula de IgG, uma cadeia pesada de IgG, uma cadeia leve de IgG, uma molécula de IgA,uma molécula de IgD, uma molécula de IgE, uma molécula de IgM, uma glicoproteína, um fator de crescimento, uma citocina, um interferon, uma interleucina, uma hormônio, um fator de coagulação (ou coagulação), um componente do sangue, uma enzima, um proteína terapêutica, uma proteína nutracêutica, uma vacina, um fragmento funcional ou uma variante funcional de qualquer um dos acima mencionados,ou uma proteína de fusão compreendendo qualquer uma das proteínas anteriores e/ou seus fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos.

[00028] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser ligada a uma sequência de ácido nucleico que codifica a hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT), dihidrofolato redutase (DHFR), e/ou glutamina sintetase (GS), de modo que HPRT, DHFR, e/ou GS podem ser utilizados como um marcador selecionável amplificável.

[00029] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser extracromossômica. Isto é, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser transitoriamente expresso a partir de um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial, um minicromossomo e semelhantes. Os especialistas na técnica estão familiarizados com as construções de expressão apropriadas, as sequências de controle de expressão apropriadas e os métodos de introdução de ditas construções em células.

[00030] Em outras modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser cromossomicamente integrada no genoma da célula de modo que a proteína recombinante é expressa de forma estável. Em algumas iterações desta modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser operativamente ligada à uma sequência de controle da expressão heteróloga adequada (ou seja, o promotor). Em outras interações, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser colocada sob o controle de uma sequência de controle da expressão endógena. A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser integrada no genoma da linhagem celular utilizando técnicas bem conhecidas.

[00031] Os métodos, vetores de clonagem e técnicas para preparar e introduzir sequências de ácidos nucleicos exógenos (por exemplo, aqueles que codificam uma proteína recombinante), são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001).

(d) modalidades exemplares

[00032] Em uma modalidade específica, a linhagem celular é uma linhagem celular CHO que compreende uma inativação monoalélica ou bialélica da sequência cromossômica que codifica Cmah. Em outra modalidade específica, a linhagem celular é uma linhagem celular CHO que compreende uma inativação ou monoalélica ou bialélica da sequência cromossômica que codifica Ggta1. Ainda em outra modalidade, a linhagem celular é uma linhagem celular CHO que compreende uma inativação monoalélica ou bialélica da sequência cromossômica que codifica Cmah e uma inativação monoalélica ou bialélica da sequência cromossômica que codifica Ggta1.

(II) Métodos para Preparar Linhagens Celulares Deficientes em Cmah e/ou Ggtal

[00033] A linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser preparada por uma variedade de métodos. Em certas modalidades, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser preparada por um processo de edição de genoma mediado por endonuclease de alvo. Em outras modalidades, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser preparada por métodos de RNAi, mutagênese aleatória, sistemas de recombinação sítio específica, ou outros métodos conhecidos na técnica.

(a) edição de genoma mediado por endonuclease de alvo

[00034] Endonucleases de restrição podem ser usadas para editar (ou seja, inativar ou modificar) uma sequência cromossômica específica. Uma sequência cromossômica específica pode ser inativada por introdução em uma célula de uma endonuclease de alvo ou de um ácido nucleico que codifica a endonuclease de alvo, que é concebida para atingir uma sequência cromossômica específica. Em uma modalidade, a endonuclease de alvo reconhece e se liga à sequência cromossômica específica e introduz uma quebra da cadeia dupla que é reparada por processo de reparação de união terminal não homóloga (NHEJ). Devido a NHEJ ser propensa a erros, uma deleção, inserção ou substituição de pelo menos um nucelotídeo pode ocorrer, interrompendo, assim, a região de leitura da sequência cromossômica de modo que nenhum produto de proteína seja produzido. Em outra modalidade, as endonucleases de alvo podem também ser utilizadas para modificar uma sequência cromossômica através de uma reação de recombinação homóloga através da cointrodução de uma sequência polinucleotídica contendo identidade substancial com uma porção da sequência cromossômica alvo. A quebra da cadeia dupla introduzida pela endonuclease de alvo é reparada por um processo de reparação direcionado por homologia de modo que a sequência cromossômica é trocada com o polinucelotídeo de uma maneira que resulte na sequência cromossômica a ser editada.

(i) endonucleases de alvo

[00035] Uma variedade de endonucleases de alvo pode ser utilizada para modificar a sequência cromossômica. A endonuclease de alvo pode ser uma proteína de ocorrência natural ou uma proteína projetada. Em uma modalidade, a endonuclease de alvo pode ser uma meganuclease. Meganucleases endodeoxiribonucleases são caracterizadas por sequências de reconhecimento longas, ou seja, a sequência de reconhecimento, geralmente varia entre cerca de 12 pares de bases a cerca de 40 pares de bases. Como consequência desta exigência, a sequência de reconhecimento, geralmente ocorre apenas uma vez em dado genoma. Entre meganucleases, a família de endonucleases homing nomeadas LAGLIDADG tornou-se uma ferramenta valiosa para o estudo dos genomas e desenho de genoma. A meganuclease pode ser orientada para uma sequência cromossômica específica, alterando a sua sequência de reconhecimento utilizando técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica.

[00036] Em outra modalidade, a endonuclease de alvo pode ser uma nuclease efetora tipo ativadora de transcrição (TALE). TALE são fatores de transcrição das plantas patógenas Xanthomonas que podem ser facilmente projetadas para ligar novos alvos de DNA. TALE ou versões truncadas da mesma podem estar associadas ao domínio catalítico de endonucleases como FokI para criar endonucleases de alvo chamadas nucleases TALE ou TALENs.

[00037] Ainda em outra modalidade, a endonuclease de alvo pode ser uma endonuclease sítio específico. Em particular, a endonuclease sítio específico pode ser uma endonuclease "cortadora rara" cuja sequência de reconhecimento ocorre raramente em um genoma. Preferencialmente, a sequência de reconhecimento da endonuclease sítio específica ocorre apenas uma vez em um genoma. Em uma modalidade alternativa, a endonuclease de alvo pode ser um agente de quebra de fita dupla de DNA direcionado artificial.

[00038] Em outras modalidades, a endonuclease de alvo pode ser uma nuclease de dedo de zinco (ZFN). Tipicamente, uma nuclease de dedo de zinco compreende um domínio de ligação do DNA (ou seja, o dedo de zinco) e um domínio de clivagem (ou seja, nuclease), ambos descritos abaixo.

[00039] Domínios de ligação de dedo de zinco. Domínios de ligação dedo de zinco podem ser projetados para reconhecer e ligar à qualquer sequência de ácido nucleico de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; e Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814. Um domínio de ligação dedo de zinco projetado pode ter uma especificidade de ligação em comparação com uma proteína dedo de zinco de ocorrência natural. Métodos de engenharia incluem, entre outros, o desenho racional e vários tipos de seleção. Desenho racional inclui, por exemplo, utilizar bases de dados que compõem sequências de nucelotídeos dubleto, tripleto, e/ou quadrupleto e as sequências de aminoácidos dedo de zinco individuais, no qual cada sequência de dupleto, tripleto ou quadrupleto de nucelotídeos está associado com uma ou mais sequências de aminoácidos dedo de zinco que ligam a sequência particular do tripleto ou quadrupleto. Ver, por exemplo, Patentes US 6.453.242 e 6.534.261, cujas revelações estão aqui incorporadas como referência em sua totalidade. Como exemplo, o algoritmo descrito na Patente US 6.453.242 pode ser utilizado para projetar um domínio de ligação dedo de zinco para direcionar uma sequência pré-selecionada. Métodos alternativos, como o desenho racional, utilizando uma tabela de reconhecimento de códigos não degenerados pode também ser utilizada para desenhar um domínio de ligação dedo de zinco para direcionar uma sequência específica (Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). Ferramentas baseadas na web publicamente disponíveis para a identificação de sítios alvo potenciais em sequências de DNA, bem como projetar domínios de ligação dedo de zinco são conhecidos na técnica. Por exemplo, ferramentas para a identificação de sítios alvo potenciais em sequências de DNA podem ser encontradas em http://www.zincfingertools.org. Ferramentas para a criação de domínios de ligação dedo de zinco podem ser encontradas em http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/. (Ver também, Mandell et al (2006) Nuc. Acid Res. 34: W516-W523, Sander et al (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605)

[00040] Um domínio de ligação dedo de zinco pode ser projetado para reconhecer e ligar uma sequência de DNA que varia de cerca de 3 nucelotídeos a cerca de 21 nucelotídeos de comprimento, ou, preferencialmente entre cerca de 9 a cerca de 18 nucelotídeos de comprimento. Em geral, os domínios de ligação dedo de zinco das nucleases dedo de zinco aqui reveladas compreendem, pelo menos, três regiões de reconhecimento dedo de zinco (ou seja, dedo de zincos). Em uma modalidade, o domínio de ligação dedo de zinco compreende quatro regiões de reconhecimento dedo de zinco. Em outra modalidade, o domínio de ligação dedo de zinco compreende cinco regiões de reconhecimento dedo de zinco. Em ainda outra modalidade, o domínio de ligação dedo de zinco compreende seis regiões de reconhecimento dedo de zinco. Um domínio de ligação dedo de zinco pode ser projetado para ligar à qualquer sequência de DNA alvo apropriada. Ver, por exemplo, Patentes US 6.607.882; 6.534.261 e 6.453.242, cujas revelações são aqui incorporadas como referência em sua totalidade.

[00041] Métodos exemplares para selecionar uma região de reconhecimento dedo de zinco podem incluir a sistemas de exibição de fago e de dois híbridos, que são descritos nas Patentes US 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988, 6.013.453, 6.410.248, 6.140.466, 6.200.759, e 6.242.568, bem como em WO 98/37186, WO 98/53057, WO 00/ 27878, WO 01/ 88197 e GB 2.338.237, cada uma das quais está aqui incorporada como referência em sua totalidade. Além disso, o aumento da especificidade de ligação para os domínios de ligação dedo de zinco foi descrito, por exemplo, em WO 02/077227, toda a revelação da qual está aqui incorporada como referência.

[00042] Domínios dedo de zinco e métodos para projetar e construir proteínas de fusão (e polinucleotídeos que codificam as mesmas) são conhecidos pelos especialistas na técnica e estão descritos em detalhes em, por exemplo, Patente US 7.888.121, que está aqui incorporada como referência em sua totalidade. Regiões de reconhecimento dedo de zinco e/ou proteínas dedo de zinco de vários dedos podem ser unidas usando sequências ligantes apropriadas, incluindo, por exemplo, ligantes de cinco ou mais aminoácidos de comprimento. Ver, Patentes US 6.479.626; 6.903.185 e 7.153.949, cujas revelações estão aqui incorporadas como referência em sua totalidade, para exemplos não limitantes de sequências de ligação de seis ou mais aminoácidos de comprimento. Os domínios de ligação dedo de zinco aqui descritos podem incluir uma combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.

[00043] Em algumas modalidades, a nuclease dedo de zinco compreende ainda um sinal ou de sequência de localização nuclear (NLS). Uma NLS é uma sequência de aminoácidos que facilita o direcionamento da proteína da nuclease dedo de zinco da no núcleo introduzir uma quebra na cadeia dupla na sequência alvo no cromossomo. Sinais de localização nucleares são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027.

[00044] Domínio de clivagem. Uma nuclease dedo de zinco também inclui um domínio de clivagem. A porção de clivagem do domínio da nuclease dedo de zinco pode ser obtida de qualquer endonuclease ou exonuclease. Exemplos não limitantes de endonucleases das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, entre outros, enzimas de restrição e endonucleases homing. Ver, por exemplo, New England Biolabs Catalog or Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, S1 Nuclease; nucleasse de broto de fejição; DNase I pancreática; nuclease micrococcal; HO endonuclease de levedura). Ver ainda Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. Uma ou mais destas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser utilizadas como uma fonte de domínios de clivagem

[00045] Um domínio de clivagem também pode ser derivado de uma enzima, ou porção da mesma, como descrito acima, que requer a dimerização para a atividade de clivagem. Duas nucleases dedo de zinco podem ser necessárias para a clivagem, já que cada nuclease compreende um monômero do dímero da enzima ativa. Alternativamente, uma única nuclease dedo de zinco pode compreender ambos os monômeros para criar um dímero de enzima ativa. Conforme usado aqui, um "dímero de enzima ativa" é um dímero de enzima capaz de clivar uma molécula de ácido nucleico. Os dois monômeros de clivagem podem ser derivados da mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais das mesmas), ou cada monômero pode ser derivado de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais da mesma).

[00046] Quando dois monômeros de clivagem são usados para formar um dímero de enzima ativa, os sítios de reconhecimento para as duas nucleases dedo de zinco estão preferencialmente dispostas de modo que a ligação das duas nucleases dedo de zinco com os respectivos sítios de reconhecimento de clivagem coloque os monômeros em uma orientação espacial um em relaçao ao outro que permite aos monômeros de clivagem formar um dímero de enzima ativa, por exemplo, pela dimerização. Como resultado, as extremidades dos próximos sítios de reconhecimento podem estar separadas por cerca de 5 a cerca de 18 nucleotídeos. Por exemplo, as extremidades próximas podem ser separadas por cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos. Será, contudo, entendido que qualquer número inteiro de nucleotídeos ou pares de nucleotídeos pode intervir entre dois sítios de reconhecimento (por exemplo, de cerca de 2 até cerca de 50 ou mais pares de nucleotídeos). As extremidades próximas aos sítios de reconhecimento das nucleases dedo de zinco, como por exemplo, as descritos em detalhes aqui, podem ser separadas por seis nucleotídeos. Em geral, o sítio de clivagem situa-se entre os sítios de reconhecimento.

[00047] As endonucleases de alvo (as enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligar às sequências específicas do DNA (em um sítio de reconhecimento) e de clivagem do DNA no próprio ou perto do sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, tipo IIS) clivam DNA em locais retirados do local do reconhecimento e têm ligação separáveis e domínios de clivagem. Por exemplo, a enzima FokI Tipo IIS catalisa a clivagem de fita dupla de DNA, com 9 nucleotídeos a partir do seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos a partir do seu sítio de reconhecimento na outra. Ver, por exemplo, Patentes US 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982. Assim, uma nuclease dedo de zinco pode compreender o domínio de clivagem de pelo menos um tipo de enzima de restrição IIS e um ou mais domínios de ligação dedo de zinco, os quais podem ou não ser projetados. Exemplos de enzimas de restrição Tipo IIS encontram-se descritos, por exemplo, na Publicação Internacional WO 07/014, 275, cuja revelação está aqui incorporada como referência em sua totalidade. Enzimas de restrição adicionais também contêm domínios de ligação e clivagem dissociáveis, e estas são também contempladas pela presente revelação. Ver, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

[00048] Um exemplo de enzima de restrição Tipo IIS, cujo domínio clivagem é dissociável do domínio de ligação, é FokI. Esta enzima particular é ativa como um dímero (Bitinaite et al (1998) Proc Natl Acad Sci EUA 95. 10, 570-10, 575). Deste modo, para os fins da presente revelação, a porção da enzima FokI usada em uma nuclease dedo de zinco é considerada um monômero de clivagem. Assim, para a clivagem de fita dupla alvo usando um domínio de clivagem FokI, duas nucleases dedo de zinco, cada uma compreendendo um monômero de clivagem FokI, pode ser utilizada para reconstituir um dimero de enzima ativa. Alternativamente, uma única molécula de polipeptídeo contendo um domínio de ligação dedo de zinco e dois monômeros de clivagem FokI também podem ser usados.

[00049] Em certas modalidades, o domínio de clivagem inclui um ou mais monômeros de clivagem projetados que minimizam ou impedem a homodimerização. A título de exemplos não limitantes, resíduos de aminoácidos nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, e 538 de FokI são todos os alvos para influenciar dimerização dos meio-domínios de clivagem de FokI. Exemplos de monômeros de clivagem de FokI projetados que formam heterodímeros obrigatórios incluem um par em que um primeiro monômero de clivagem inclui mutações nas posições de resíduos de amino ácidos 490 e 538 de FokI e um segundo monômero de clivagem que inclui mutações nas posições de resíduos de aminoácidos 486 e 499.

[00050] Assim, em uma modalidade, uma mutação na posição do aminoácido 490 substitui Glu (E) por Lys (K), uma mutação no resíduo de aminoácido 538 substitui Iso (I) por Lys (K), uma mutação no resíduo de aminoácido 486 substitui Gln (Q) por Glu (E) e uma mutação na posição 499 substitui Iso (I) por Lys (K). Especificamente, os monômeros de clivagem projetados podem ser preparados através da mutação da posição 490 de E a K e 538 de I a K em um monômero de clivagem para produzir um monômero de clivagem projetado designado "E490K:I538K" e por mutação das posições 486 a partir de Q para E e 499 de I a L em outro monômero de clivagem para produzir um monômero de clivagem desenahdo designado "Q486E:I499L".Os monômeros de clivagem projetados acima descritos são heterodímeros mutantes obrigatórios em que a clivagem anormal é minimizada ou abolida. Monômeros de clivagem projetados podem ser preparados utilizando um método apropriado, por exemplo, por mutagênese dirigida ao sítio de clivagem de monômeros do tipo selvagem (FokI), como descrito na Patente US 7.888.121, que está aqui incorporada em sua totalidade.

(ii) polinucleotídeo opcional

[00051] O método para a edição de genoma alvo pode ainda compreender a introdução na célula de pelo menos, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência contendo identidade de sequência substancial com uma sequência, pelo menos de um lado do sítio de clivagem alvo. Por exemplo, o polinucleotídeo pode compreender uma primeira sequência contendo identidade de sequência substancial com a sequência em um dos lados do sítio de clivagem alvo e uma segunda sequência contendo substancial identidade de sequência com sequências no outro lado do sítio de clivagem alvo. Alternativamente, o polinucleotídeo pode compreender uma primeira sequência de identidade de sequência substancial com a sequência em um dos lados do sítio alvo de clivagem e uma segunda sequência tendo identidade de sequência substancial com uma sequência localizada longe do sítio de clivagem alvo. A sequência localizada longe do sítio de clivagem alvo pode estar a dezenas, centenas ou milhares de nucleotídeos a montante ou a jusante do sítio de clivagem alvo.

[00052] Os comprimentos das primeira e segunda sequência no polinucleotídeo que contêm identidade de sequência substancial com as sequências na sequência cromossômica podem e irão variar. Em geral, cada uma das primeiras e segundas sequências do polinucleotídeo é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento. Em várias modalidades, as sequências polinucleotídicas contendo identidade de sequência substancial com sequências cromossômicas são de cerca de 15 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, ou mais de 100 nucleotídeos de comprimento.

[00053] A expressão "identidade de sequência substancial" significa que as sequências no polinucleotídeo contêm, pelo menos, cerca de 75% de identidade de sequência com as sequências cromossômicas de interesse. Em algumas modalidades, as sequências no polinucleotídeo contêm cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência cromossômica de interesse.

[00054] O comprimento do polinucleotídeo pode e irá variar. Por exemplo, o polinucleotídeo pode variar de cerca de 20 nucleotídeos de comprimento até cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento. Em várias modalidades, os e polinucleotídeos variam de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 100 nucleotídeos até cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 1000 nucleotídeos a aproximadamente 10.000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 100.000 nucleotídeos de comprimento, ou de cerca de 100.000 a cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento.

[00055] Tipicamente, o polinucleotídeo será DNA. O DNA pode ser de fita simples ou de fita dupla. O polinucleotídeo doador pode ser um plasmídeo de DNA, um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um vetor viral, um pedaço de DNA linear, um fragmento de PCR, um ácido nucleico naked, ou um ácido nucleico complexado com um veículo de liberação como um lipossoma ou poloxâmero.

[00056] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ainda compreender um marcador. Exemplos não limitantes de marcadores apropriados incluem os sítios de restrição, proteínas fluorescentes ou marcadores selecionáveis. Esses marcadores possibilitam a triagem de integrações alvos.

(iii) introdução na célula

[00057] A endonuclease de alvo pode ser introduzida na célula, como uma proteína, ou como ácido nucleico que codifica a endonuclease de alvo. O ácido nucleico que codifica a endonuclease de alvoode ser DNA ou RNA (ou seja, mRNA). Em modalidades em que o ácido nucleico que codifica é mRNA, o mRNA pode ser capeado em 5' e/ou 3' poliadenilado. Em modalidades em que o ácido nucleico que codifica DNA, o DNA pode ser linear ou circular. O DNA pode ser parte de um vetor, em que o DNA que codifica é opcionalmente ligado operativamente a um promotor adequado. Os especialistas na técnica estão familiarizados com vetores apropriados, promotores, outros elementos de controle, e meios de introdução do vetor na célula de interesse.

[00058] A endonuclease de alvo ou ácido nucleico que codifica a endonuclease de alvo e o polinucleotídeo opcional acima descrito podem ser introduzidos na célula através de uma variedade de meios. Meios de distribuição adequados incluem microinjeção, eletroporação, sonoporação, biobalística, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção catiônica, transfecção por lipossomas, transfecção por dendrímeros, transfecção por choque térmico, transfecção por nucleofecção, magnetofecção, lipofecção, impalefection, transfecção óptica, agente proprietária de promoção de captação de ácidos nucleicos, e liberação via lipossomas, imunolipossomas, virossomas, ou vírions artificiais. Em certas modalidades, a molécula de endonuclease de alvo e polinucleotídeos opcionais são introduzidas em uma célula por nucleofecção ou eletroporação.

[00059] Nas modalidades em que mais de uma molécula da endonuclease de alvo e mais de um polinucleotídeo são introduzidas em uma célula, as moléculas podem ser introduzidas simultaneamente ou sequencialmente. Por exemplo, as moléculas da endonuclease de alvo, cada uma específica para um sítio de restrição direcionado (e polinucleotídeos opcionais) podem ser introduzidos ao mesmo tempo. Alternativamente, cada molécula de endonuclease de alvo, bem como os polinucleotídeos opcionais podem ser introduzidos sequencialmente.

[00060] A relação entre a molécula de endonuclease de alvo (ou ácido nucleico que codifica ao polinucleotídeo opcional pode e irá variar. Em geral, a relação da molécula de endonuclease de alvo e de polinucleotídeo pode variar desde cerca de 1:10 a cerca de 10:1. Em várias modalidades, a relação entre a molécula de endonuclease de alvo e o polinucleotídeo é de cerca de 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, ou 10:1. Em uma modalidade, a proporção é de cerca de 1:1.

(b) interferência de RNA

[00061] Em outra modalidade, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser preparada utilizando um agente RNA de interferência (RNAi), que inibe a expressão de um mRNA alvo ou transcrito. O agente RNAi pode conduzir à clivagem do mRNA alvo ou transcrito. Alternativamente, o agente RNAi pode impedir ou interromper a tradução do mRNA alvo em proteína.

[00062] Em algumas modalidades, o agente RNAi pode ser um RNA de interferência curto (siRNA). Em geral, um siRNA compreende uma molécula de RNA de cadeia dupla que varia de cerca de 15 a cerca de 29 nucleotídeos de comprimento. O siRNA pode ser de cerca de 16-18, 17-19, 21-23, 24-27, ou 27-29 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade específica, o siRNA é de cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. O siRNA pode opcionalmente compreender adicionalmente saliências em fita simples ou dupla, por exemplo, uma saliência 3' em uma ou em ambas as extremidades. O siRNA pode ser formado a partir de duas moléculas de RNA que hibridizam em conjunto ou, alternativamente, pode ser gerada a partir de um curto hairpin RNA (shRNA) (ver abaixo). Em algumas modalidades, as duas fitas do siRNA são totalmente complementares, de modo que não há desencontross ou saliências existentes no duplex formado entre as duas sequências. Em outras modalidades, as duas cadeias do siRNA são substancialmente complementares, de forma que um ou mais desencontros ou saliências podem existir no duplex formado entre as duas sequências. Em certas modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' do siRNA contêm um grupo fosfato, enquanto em outras modalidades uma ou ambas as extremidades 5' não contêm um grupo fosfato. Em outras modalidades, uma ou ambas as extremidades 3' do siRNA contêm um grupo hidroxila, enquanto em outras modalidades uma ou ambas as extremidades 5' não contêm um grupo hidroxila.

[00063] Uma fita siRNA, a qual é referida como a "fita antissenso" ou "fita guia", inclui uma porção que hibridiza com o transcrito alvo. Em certas modalidades, a cadeia antissenso do siRNA é completamente complementar à uma região do transcrito alvo, ou seja, hibridiza com o transcrito de um único alvo, sem desencontros ou saliência ao longo de uma região alvo de cerca de 15 e cerca de 29 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente pelo menos 16 nucleotídeos de comprimento, e mais preferencialmente cerca de 18-20 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, a fita antissenso é substancialmente complementar à região alvo, ou seja, um ou mais desencontros e/ou saliências podem existir no duplex formado pela fita antissenso e o transcrito alvo. Normalmente, os siRNAs são direcionados para as sequências exônicas do transcrito alvo. Aqueles especialistas na técnica estão familiarizados com os programas, os algoritmos, e/ou serviços comerciais que projetam os siRNAs para transcritos alvos. Um exemplo é o Rosetta siRNA Algorithm Design (Rosetta Inpharmatics, North Seattle, WA) e MISSION® siRNA (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). Os siRNA podem ser sintetizados enzimaticamente in vitro utilizando métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Alternativamente, o siRNA pode ser quimicamente sintetizado utilizando técnicas de síntese de oligonucleotídeos, que são bem conhecidos na técnica.

[00064] Em outras modalidades, o agente RNAi pode ser um curto hairpin RNA (shRNA). Em geral, um shRNA é uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas porções complementares que hibridizam ou são capazes de hibridizar para formar uma estrutura de fita dupla com comprimento suficiente para mediar a interferência do RNA (como descrito acima), e, pelo menos, uma porção de fita simples que forma um ciclo de ligação das regiões do shRNA que formam o duplex. A estrutura também pode ser chamada de uma estrutura de haste-alça, com a haste sendo a parte do duplex. Em algumas modalidades, a porção da estrutura duplex é completamente complementar, de modo que não há desencontros ou saliências na região do duplex do shRNA. Em outras modalidades, a porção da estrutura duplex é substancialmente complementar, de modo que um ou mais desencontros/ou saliências existem na porção do duplex shRNA. A alça da estrutura pode ser de cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente de cerca de 4 a cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, e mais preferencialmente de cerca de 6 a cerca de 9 nucleotídeos de comprimento. A alça pode estar localizada na extremidade 5' ou 3' da região que é complementar ao transcrito alvo (ou seja, a porção do shRNA antissenso).

[00065] O shRNA pode ainda compreender uma saliência na extremidade 5' ou 3'. A saliência opcional pode ser de cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, e mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 15 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a saliência compreende um ou mais resíduos de U, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 5 resíduos de U. Em algumas modalidades, a extremidade 5' do shRNA contém um grupo fosfato, enquanto em outras modalidades não. Em outras modalidades, a extremidade 3' do shRNA contém um grupo hidroxila, enquanto em outras modalidades não. Em geral, shRNAs são processados em siRNAs pelo maquinário celular conservado de RNAi. Assim, shRNAs são precursores dos siRNAs e são igualmente capazes de inibir a expressão de um transcrito alvo que é complementar de uma porção do shRNA (ou seja, a porção do shRNA antissenso). Os especialistas na técnica estão familiarizados com os recursos disponíveis (como detalhado acima) para o desenho e síntese de shRNAs. Um exemplo é MISSION® shRNAs (Sigma- Aldrich).

[00066] Ainda em outras modalidades, o agente RNAi pode ser um vetor de expressão RNAi. Tipicamente, um vetor de expressão é usado para a síntese RNAi intracelular (in vivo) de agentes RNAi, como os siRNAs ou shRNAs. Em uma modalidade, duas fitas siRNA complementares separadas são transcritas utilizando um único vetor contendo dois promotores, cada um dos quais direciona a transcrição de uma única fita de siRNA (ou seja, cada promotor está operativamente ligado a um molde para o siRNA de modo que a transcrição possa ocorrer). Os dois promotores podem estar na mesma orientação, caso em que cada um está ligado operativamente a um molde para uma das cadeias complementares de siRNA. Alternativamente, os dois promotores podem estar em orientações opostas, flanqueando um único molde de modo a que a transcrição dos promotores resulte na síntese de duas cadeias complementares de siRNA. Em outra modalidade, o vetor de expressão de RNAi pode conter um promotor que direciona a transcrição de uma molécula de RNA que compreende duas regiões complementares, de forma que os transcritos formam um shRNA.

[00067] Os especialistas na técnica apreciarão que é preferencial para os agentes siRNA e shRNA serem produzidos in vivo, via transcrição de mais de uma unidade de transcrição. De um modo geral, os promotores utilizados para direcionar a expressão in vivo de uma ou mais unidades de transcrição de siRNA ou shRNA podem ser promotores para a RNA-polimerase III (Pol III). Alguns promotores Pol III, como U6 ou promotores H1, não necessitam de elementos reguladores cis-atuantes na região transcrita, e assim, são os preferenciais em certas modalidades. Em outras modalidades, os promotores de Pol II podem ser usados para direcionar a expressão de uma ou mais unidades de transcrição de siRNA ou shRNA. Em algumas modalidades, podem ser usados tecido específico, célula específicos, ou os promotores indutíveis Pol II.

[00068] Uma construção que fornece um molde para a síntese de siRNA ou shRNA pode ser produzida utilizando métodos de DNA recombinante padrões e inserida em qualquer um de uma grande variedade de diferentes vetores adequados para expressão em células eucarióticas. Técnicas de DNA recombinante estão descritos em Ausubel et al, supra e Sambrook & Russell, supra. Os especialistas na técnica também apreciarão que os vetores podem compreender sequências reguladoras adicionais (por exemplo, sequência de terminação, sequência de controle da tradução, etc), bem como sequências marcadoras selecionáveis. Plasmídeos de DNA são conhecidos na técnica, incluindo os baseados em pBR322, PUC, e assim sucessivamente. Uma vez que muitos vetores de expressão contêm já um promotor ou promotores adequados, pode ser necessário apenas inserir a sequência de ácido nucleico que codifica o agente de RNAi de interesse em local adequado no que diz respeito aos promotores. Os vetores virais podem igualmente ser usados para fornecer expressão intracelular de agentes RNAi. Vetores virais adequados incluem vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores de vírus adeno-associados, vetores de vírus do herpes, e assim por diante. Em uma modalidade específica, o vetor de expressão RNAi é um vetor baseado em shRNA lentiviral ou partícula lentiviral, como o fornecido por MISSION® TRC shRNA products (Sigma-Aldrich).

[00069] Os agentes RNAi ou vetores de expressão RNAi podem ser introduzidos na célula através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Ditas técnicas são descritas em Ausubel et al. supra, ou Sambrook & Russell, supra, por exemplo. Em certas modalidades, o vetor de expressão RNAi, por exemplo, um vetor viral, é estavelmente integrado no genoma da célula, de modo que a expressão deCmah e/ou Ggta1 é interrompida ao longo das gerações celulares subsequentes.

(c) mutagênese aleatória

[00070] Ainda em outras modalidades, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser preparada utilizando mutagênese aleatória. Em uma modalidade, uma mutação aleatória é gerada por exposição da célula a um produto químico, como N-etil-N-nitrosoureia (ENU), N-etil-N-nitrosoureia (NMU), etil metanossulfonato (EMS), ácido nitroso (NA), ou outro produto químico mutagênico. Em outra modalidade, uma mutação aleatória é gerada utilizando um sistema baseado em transposons para introduzir sequências curtas aleatoriamente no genoma, interrompendo assim a expressão da sequência cromossômica na qual uma sequência é inserida. Em outra modalidade, uma mutação aleatória é gerada usando radiação ionizante.

(d) recombinação sítio específica

[00071] Em modalidades alternativas, a linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser preparada utilizando técnicas de recombinação sítio específica. Por exemplo, técnicas de recombinação sítio específica podem ser usadas para excluir toda ou parte de uma sequência cromossômica de interesse, ou introduzir polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na sequência cromossômica de interesse. Em uma modalidade, a sequência cromossômica de interesse é direcionada através de um sistema de recombinação sítio específica Cre-loxP, de um sistema de recombinação sítio específica FLP-FRT, ou variantes das mesmas. Ditos sistemas de recombinação estão disponíveis comercialmente, e estudos adicionais para estas técnicas são encontrado em Ausubel et al. supra, por exemplo.

(III) Métodos para Produzir Proteínas Recombinantes

[00072] Outro aspecto da presente revelaçã inclui um método para a produção de uma proteína de recombinação com um padrão de glicosilação semelhante ao humano. Em geral, uma glicoproteína com um padrão de glicosilação semelhante ao humano é desprovida de resíduos de α-Gal e/ou de Neu5Gc. O método compreende expressar a proteína de recombinação em uma linhagem de células de mamífero não humano deficiente em Cmah e/ou Ggta1. As linhagens de células deficientes em Cmah e/ou Ggta1 estão descritas acima na seção (I).

[00073] Em uma modalidade exemplar, a linhagem celular pode compreender uma inativação bialélica da sequência cromossômica que codifica Cmah de modo que a linhagem celular não produza nenhum Cmah e a proteína recombinante produzida pela linhagem celular é desprovida de frações α-Gal. Em outra modalidade exemplar, a linhagem celular pode compreender uma inativação bialélica da sequência cromossômica que codifica Ggta1 de modo que a linhagem celular não produz nenhum Ggta1 e a proteína recombinante produzida pela linhagem celular é desprovida de resíduos Neu5Gc. Em outra modalidade exemplar, a linhagem celular pode compreender inativações bialélicas das sequências cromossômicas que codificam Cmah e Ggta1 e de modo que a linhagem celular não produz não Cmah ou Ggta1 e a proteína recombinante produzida pela célula é desprovida de resíduos de α-Gal e de Neu5Gc. Em outra modalidade, na qual a linhagem celular é aneuploide, todas as cópias da sequência cromossômica que codificam Cmah são inativadas de modo que a linhagem celular não produz nenhum Cmah e a proteína recombinante produzida pela linhagem celular é desprovida de frações α-Gal. Em outra modalidade exemplar, na qual a linhagem celular é aneuploide, todas as cópias da sequência cromossômica que codificam Ggta1 são inativadas de modo que a linhagem celular não produz nenhum Ggta1 e a proteína recombinante produzida pela linhagem celular é desprovida resíduos Neu5Gc. Em outra modalidade exemplar, na qual a linhagem celular é aneuploide, todas as cópias da sequência cromossômica que codificam Cmah e todas as cópias da sequência cromossômica que codificam Ggta1 são inativadas de modo que a linhagem celular não produz nenhum Cmah ou Ggta1 e a proteína recombinante produzida pela célula é desprovida de resíduos de α-Gal e de Neu5Gc.

[00074] Em geral, a proteína recombinante produzida pela linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 contém, pelo menos, uma propriedade que é melhorada em relação à mesma proteína produzida por uma linhagem celular comparável que não seja deficiente em Cmah e/ou Ggta1. Exemplos não limitantes de propriedades melhoradas incluem a imunogenicidade reduzida, biodisponibilidade aumentada, eficácia aumentada, estabilidade aumentada, solubilidade aumentada, meia-vida melhorada, depuração melhorada, farmacocinética melhorada e combinações das mesmas. Por exemplo, devido à proteína recombinante ser produzida pelo método revelado aqui e desprovida de resíduos de α -Gal e/ou de Neu5Gc, a proteína recombinante produzida apresentou imunogenicidade reduzida e potencial reduzido para induzir reações de hipersensibilidade em seres humanos, do que e uma proteína comparável contendo resíduos de α- Gal e/ou de Neu5Gc.

[00075] A proteína recombinante produzida na linhagem celular deficiente em Cmah e/ou Ggta1 pode ser qualquer proteína adequada, incluindo proteínas terapêuticas e produtos biológicos da proteína. Por exemplo, a proteína recombinante pode ser, entre outros, um anticorpo, um fragmento de um anticorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado, um anticorpo quimico, uma molécula de IgG, uma IgG de cadeia pesada, uma IgG de cadeia leve, uma molécula de IgA, uma molécula de IgD, uma molécula de IgE, uma molécula de IgM, uma glicoproteína, um fator de crescimento, uma citoquina, um interferon, uma interleucina, um hormônio, um fator dea coagulação (ou coagulação), um componente do sangue, uma enzima, uma proteína nutracêutica, uma vacina, um fragmento funcional ou uma variante funcional de qualquer um dos desistência, ou uma proteína de fusão compreendendo qualquer uma das proteínas anteriores e/ou seus fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos.

[00076] Os métodos para a produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica, e estudos adicionais podem ser fornecidos por Ausubel et al. supra. Em geral, a proteína recombinante é expressa a partir de um ácido nucleico introduzido exogenamente. Como detalhado na seção acima (I)(a), o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser extracromossômico ou o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser integrado no genoma.

[00077] Os métodos para a cultura da linhagem celular de modo que a proteína recombinante seja expressa são bem conhecidos na técnica. Meios apropriados e sistemas de cultura são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. Em uma modalidade, a proteína recombinante é produzida pelas linhagens celulares aqui descritas através de cultura em suspensão livre de soro.

DEFINIÇÕES

[00078] Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o significado normalmente entendido por um especialista na técnica à qual pertence esta invenção. As seguintes referências fornecem ao especialista uma definição geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Conforme usado aqui, os seguintes termos têm os significados a eles atribuídos, salvo especificado em contrário.

[00079] Quando se apresentam os elementos da presente revelação ou as modalidades preferenciais do mesmo, os artigos "um", "uma", "o" e "dito" pretendem significar que há um ou mais dos elementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "contendo" destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais aos elementos listados.

[00080] Conforme usado aqui, o termo "sequência endógena" refere-se a uma sequência cromossômica que é nativa da célula.

[00081] O termo "sequência exógena" refere-se a uma sequência cromossômica que não é nativa da célula, ou de uma sequência cuja localização nativa está em uma localização cromossômica diferente.

[00082] Os termos "editar", "edição do genoma", ou "edição cromossômica" referem-se a um processo pelo qual uma sequência cromossômica específica é alterada. A sequência cromossômica editada pode compreender uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, e/ou uma substituição de pelo menos um nucleotídeo.

[00083] Um "gene", conforme usado aqui, refere-se a uma região de DNA (incluindo éxons e íntrons) do gene que codifica um produto, bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto do gene, sejam tais sequências reguladoras adjacentes ou não às sequências de codificação e/ou transcritas. Assim, um gene inclui, mas não está necessariamente limitado a, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras da tradução, como sítios de ligação ao ribossomo e locais internos de entrada dos ribossomos, potenciadores, silenciadores, isoladores, elementos de ligação, origens de replicação, sítios de ligação da matriz e regiões de controle do locus.

[00084] O termo "heterólogo" se refere a uma entidade que não é nativa da célula ou das espécies de interesse.

[00085] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" referem-se a um polímero desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, em conformação linear ou circular, e em qualquer forma de fita simples ou dupla. Para os fins da presente revelação, estes termos não devem ser interpretados como limitantes com respeito ao comprimento de um polímero. Os termos podem incluir análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, assim como de nucleotídeos que são modificados na base, açúcar e/ou frações de fosfato (por exemplo, esqueletos de fosforotioato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo em particular tem a mesma especificidade para pareamento de bases, ou seja, um análogo de A irá parear com T.

[00086] O termo "nucleotídeo" refere-se aos desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser nucleotídeos padrão (ou seja, a adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina) ou análogos de nucleotídeos. Um análogo de nucleotídeos refere-se a um nucleotídeo que tem uma base purina ou pirimidina modificada ou uma fração de ribose modificada. Um análogo de nucleotídeo pode ser um nucleotídeo que ocorre naturalmente (por exemplo, inosina) ou um nucleotídeo que não ocorre naturalmente. Exemplos não limitantes de modificações nas frações de açúcar ou de bases de um nucleotídeo incluem a adição (ou remoção) de grupos acetil, grupos amino, grupos carboxil, grupos carboximetila, grupos hidroxila, grupos metila, grupos fosforil, e grupos tiol, bem como a substituição dos átomos de carbono e de nitrogênio das bases por outros átomos (por exemplo, 7-deaza purinas). Análogos de nucleotídeos incluem os nucleotídeos dideoxi, 2-O-metilnucleotídeos, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), e morfolinos.

[00087] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados indiferentemente para se referir à um polímero de resíduos de aminoácidos.

[00088] O termo "recombinação" refere-se a um processo de troca de informação genética entre dois polinucleotídeos. Para os fins desta revelação, "recombinação homóloga" refere-se à forma especializada de dita troca que ocorre, por exemplo, durante o reparo de quebras das fitas duplas nas células. Este processo requer similaridade de sequência entre os dois polinucleotídeos, usando uma molécula "doadora" ou de "troca" para modelar o reparo de uma molécula "alvo" (ou seja, aquela que experimentou a quebra na fita dupla), e é também conhecida como "conversão de gene não crossover" ou "conversão de gene de curto trato", porque conduz à transferência de informação genética do doador para o alvo. Sem estar ligado a qualquer teoria em particular, a transferência pode envolver correção de desencontros de DNA em heterodúplex que se forma entre o alvo quebrado o doador, e/ou a "cadeia de síntese dependente de anelamento", no qual o doador é usado para ressintetizar a informação genética que vai tornar-se parte do alvo, e/ou processos relacionados. Dita recombinação homóloga especializada muitas vezes resulta em uma alteração da sequência da molécula alvo de modo que parte ou a totalidade da sequência do polinucleotídeo doador é incorporada no polinucleotídeo alvo.

[00089] Conforme usado aqui, os termos "sítio alvo" ou " sequência alvo" referem-se a uma sequência de ácido nucleico que define uma porção de uma sequência cromossômica a ser editada e a qual uma endonuclease de alvo é concebida para reconhecer, ligar e clivar.

[00090] Os termos "a montante" e "a jusante" referem-se aos locais na sequência de ácido nucleico em relação a uma posição fixa. A montante refere-se à região que é 5' (ou seja, perto da extremidade 5' da fita) para a posição e a jusante refere-se à região que é 3' (ou seja, perto da extremidade 3' da cadeia) para a posição.

[00091] As técnicas para a determinação de identidade de sequência de ácido nucleico e de aminoácidos são conhecidas na técnica. Tipicamente, estas técnicas incluem a determinação da sequência de nucleotídeos do mRNA para um gene e/ou determinar a sequência de aminoácidos codificada por esta e comparando estas sequências a uma segunda sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos. As sequências genômicas podem também ser determinadas e comparadas desta maneira. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata de nucleotídeo para nucleotídeo e de aminoácido para aminoácido de dois polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas, respectivamente. Duas ou mais sequências de (polinucleotídeo ou aminoácido) podem ser comparadas ao determinar a sua percentagem de identidade. A percentagem de identidade de duas sequênciasquer de ácidos nucleicos ou de aminoácidos é o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas divididas pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para as sequências de ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo pode ser aplicado às sequências de aminoácidos utilizando a matriz de pontuação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, e normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res.14(6):6745-6763 (1986). Uma exemplo de implementação deste algoritmo para determinar a percentagem de identidade de uma sequência é fornecido pelo Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin), no aplicativo de utilidade "BestFit". Outros programas adequados para calcular a percentagem de identidade ou de similaridade entre sequências são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é o BLAST, pode ser usado utilizado com os parâmetros default. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados com os seguintes parâmetros default: código genético = padrão; filtro = nenhum; fitas = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matrix = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenar por = HIGH SCORE, Databases = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB+ GenBank CDS translations + Swiss protein+ Spupdate + PIR. Os detalhes destes programas podem ser encontrados no site da GenBank. Com respeito às sequências aqui descritas, a gama de graus desejados de identidade de sequência é de aproximadamente 80% a 100% e qualquer valor inteiro entre os mesmos. Tipicamente as percentagens de identidades entre sequências são pelo menos 70-75%, preferencialmente 80-82%, mais preferencialmente 85-90%, ainda mais preferencialmente 92%, ainda mais preferencialmente 95%, e mais preferencialmente 98% de identidade de sequência.

[00092] Como várias mudanças podiam ser feitas nas células e os métodos acima descritos sem se afastar do escopo da invenção, pretende-se que todo o onjeto contido na descrição acima e nos exemplos apresentados a seguir, deve ser interpretado como ilustrativo e não em um sentido limitante.

EXEMPLOS

[00093] Os exemplos seguintes ilustram certos aspectos da invenção.

Exemplo 1: Células CHO contêm Gene Ggtal

[00094] Para confirmar a presença do gene Ggta1 em células CHO K1, os iniciadores foram projetados para amplificar as regiões dos éxons 8 e 9 do gene Ggta1. DNA murino e as células de mieloma NS0 e CHO K1 foram amplificadas por PCR utilizando um par de iniciadores. Uma banda do tamanho esperado de aproximadamente 300 pb foi detectada em ambas as células de CHO e NS0. Os fragmentos da PCR isolados de células CHO foram sequenciados e alinhados com o gene Ggta1 de camundongo (UniProtKB/Swiss-Prot N.° de Acessão: P23336). A identidade de sequências foi de cerca de 85%.

[00095] PCR quantitativa foi usada para avaliar a expressão de mRNA em células CHO em relação às células de camundongo. Após a normalização utilizando actina, uma comparação dso valores do ciclo limiar (Ct) entre as células de camundongo NS0 e as células CHO sugeriu que a expressão de Ggta1 foi significativamente mais baixa em células CHO do que em células NS0.

Exemplo 2: Geração de células CHO Compreendendo um Locus Ggtal inativado

[00096] Um par de ZFNs foi projetado para direcionar uma região dentro do éxon 9 do gene Ggta1 em células CHO. Sequências Ggta1 foram obtidas a partir de uma sequência de transcriptoma proprietária e verificadas por meio de RT-PCR. ZFNs direcionadas ao gene foram projetadas usando um algoritmo proprietário e, posteriormente, testados. Transcrição in vitro e poliadenilação e nivelamento de mRNA foram produzidos a partir DNA de plasmídeo ZFN, conforme descrito nas informações sobre o produto CompoZr® Knockout Dedo de zinco Nucleases (ZFN). Resumidamente, o DNA de plasmídeo ZFN foi linearizado, e purificado por extração de DNA fenol/clorofórmio. MessageMaxTM T7 ARCA-Capped Message Transcription Kit (Cell Script Inc.) foi utilizado para cobrir o DNA linear. Um Kit poli (A) polimerase Tailing (EpiCenter) foi usado para adicionar uma cauda de poli (A). O mRNA ZFN foi purificado utilizando o MEGAclearTM kit (Ambion).

[00097] A linhagem celular CHOZN (gs-/-) expressando IgG anti- rábica humana recombinante foi usada. Todos os meios de cultura de células, suplementos e outros reagentes utilizados foram adquiridos de Sigma-Aldrich, salvo especificado em contrário. Antes da transfecção, as células foram mantidas como culturas em suspensão em Ex-Cell ® CHO CD Fusion (Sigma-Aldrich) suplementado com 6 mM de L- glutamina. As células foram semeadas a 0,5 □ 106 células/mL em tubos de bioreatores um dia antes da transfecção. Para cada transfecção, 1 □ 106 células em 150 μL de meio de crescimento 5g de cada mRNA ZFN foram usados. As transfecções foram realizadas por eletroporação a 140 V e 950 DF em cubetas de 0,2 centímetros. As células eletroporadas foram colocados em 2 mL de meio de crescimento em uma placa de cultura estática de 6 poços. Células controle foram transfectadas em simulação.

[00098] Nos dias 3 e 10 após a transfecção, as células foram removidas da cultura e o DNA genômico foi isolado utilizando Kit Sigma-Aldrich GeneElute Mammalian Genomic DNA Miniprep. Clivagem induzida de ZFN foi verificada utilizando um ensaio de nuclease Cel- 1, conforme descrito nas informações do produto CompoZr® Knockout ZFN. Este ensaio é realizado para determinar a eficiência da mutação do gene mediada por ZFN, como anteriormente descrito (Miller, JC et al., Nat. Biotechnol.2007, 25:778-785). O ensaio detecta alelos do locus alvo que se afastem do tipo selvagem, como resultado do efeito de união não homóloga (NHEJ) mediada por reparação imperfeita de ZFN DNA induziram quebras na fita dupla. A amplificação por PCR da região alvo a partir de um pool de células ZFN tratadas gera uma mistura de amplicons de tipo selvagem (WT) e mutantes. Fusão e reanelamento desta mistura resultam na formação de desencontros formados entre heteroduplexes dos alelos WT e mutantes. Uma "bolha" de DNA formada no sítio de incompatibilidade é clivada por surveyor nuclease Cel -1, e os produtos de clivagem podem ser resolvidos por eletroforese em gel. Como mostrado na FIG . 1, dois fragmentos de cerca de 215 pb e 100 pb foram observados nas células ZFN transfectadas (pistas 1 e 2), mas ausente nas células de controle transfectadas em simulação

Exemplo 3: Clonagem de Célula Única e Genotipagem de Células Ggta1 Knockout

[00099] Após a confirmação da atividade de ZFN utilizando o ensaio Cel 1, as células ZFN Ggta1 transfectadas foram clonadas para obtenção de células únicas utilizando diluição limitante. Para isso, as células foram plaqueadas a 0,5 células/poço usando uma mistura de 80% de CHO e meios de clonagem isentos de soro, 20% de meio condicionado, e 4 mM de L-glutamina. Formação de clones e crescimento foram verificados microscopicamente nos dias 7 e 14 pós plaqueamento, respectivamente. Clones com crescimento foram expandidos e genotipados por PCR e sequenciamento. Um clone Ggta1 (-/-) e quatro clones Ggta1 (+/-) que levavam deleções de vários comprimentos foram isolados, conforme detalhado na Tabela 1 abaixo. Todas as linhagens celulares exibiram características de crescimento semelhantes aos da linhagem celular parental da qual foram derivadas. Tabela 1. Caracterização genotípica de clones Ggtal knock-out

Exemplo 4: Geração de célu as CHO Compreendendo um Locus Cmah inativado

[000100] Um par de ZFNs foi projetado para direcionar uma região dentro do éxon 5 do locus Cmah em células CHO (UniProtKB/Swiss- Prot N.° de Acessão: Q9WV23; Chinese hamster); A linhagem celular CHO K1 foi transfectada com 20 μg de RNA que codificam as ZFNs utilizando procedimentos padrão e métodos análogos aos descritos no Exemplo 2. As células de controle foram transfectadas com RNA que codifica GFP.

[000101] A eficiência de quebras cromossômicas nas fitas duplas induzidas por ZFN foi determinada utilizando o ensaio de nuclease Cel-1. Como mostrado na FIG. 2, a Cmah ZFNs clivou Cmah alvo em células CHO. A frequência de clivagem mediada por ZFN pode ser estimada por comparação da intensidade relativa dos produtos de clivagem com a intensidade relativa da banda parental. A frequência de clivagem foi calculada pelo software ImageJ como sendo de cerca de 11%.

Exemplo 5: Clonagem de única Célula e Genotipagem de Células Cmah Nocaute

[000102] As células transfectadas ZFN Cmah foram clonadas como única célula utilizando diluição limitante (como descrito acima), ou seleção de células ativadas por fluorescência (FACS). Clones com crescimento foram expandidos e genotipados por PCR e sequenciamento. A genotipagem revelou que todos os 20 clones deste ciclo de trabalho foram Cmah (+/-) que levavam deleções e inserções de vários comprimentos. Subsequentemente, sete clones Cmah (+/-) foram misturados, e novamente transfectados com RNA ZFN Cmah, e clonados como célula utilizando diluição limitante. Seis clones da segunda rodada de trabalho foram verificados por PCR e sequenciados como Cmah (-/-). Os loci Cmah inativados levavam deleções e inserções de vários comprimentos (ver Tabela 2). Os genótipos bialélicos destas linhagens celulares Cmah knockout são listados na Tabela 2. Todas as linhagens celulares exibiram características de crescimento que foram semelhantes aos da linhagem celular parental a partir da qual foram derivadas. Tabela 2. Caracterização genotípica dos clones Cmah (-/-)

Exemplo 6: Geração de Células Cmah/Ggta1 Duplo Knockout

[000103] Uma linhagem celular clonal Cmah (-/-) com um genótipo confirmado(ou seja, AB2) foi transfectada com ZFNs Ggta1 de restrição, essencialmente como acima descrito no Exemplo 2. A atividade de ZFN foi confirmada utilizando o ensaio de nuclease Cel-1. Como mostrado na FIG. 3, foram detectados produtos de clivagem, em que ZFN transfectou as células, mas não as células transfectadas em simulação.

[000104] As células foram clonadas usando célula única por diluição limitante, essencialmente como descrito acima no Exemplo 3. O PCR aninhado foi realizado em 192 clones, e 26 clones foram identificados como potenciais clones duplos knockout com base no tamanho do produto de PCR. DNA genômico foi isolado dos potenciais clones duplo knockout, amplificados por PCR e sequenciados. Quatro clones tinham 2x cobertura de sequência confirmando a exclusão bialélica de Ggta1 no Cmah knockout de fundo. A Tabela 3 apresenta os genótipos do Cmah (-/-) /Ggta1(-/-) clones duplos knockout Tabela 3. Caracterização genotípica de clones Cmah/Ggta1 duploknockout

Claims (11)

1. Método para produzir uma proteína recombinante com um padrão de glicosilação semelhante ao de humano, caracterizado pelo fato de que compreende expressar a proteína recombinante em uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em hidroxilase do ácido citidina-monofosfato-N-acetilneuramínico (Cmah) e glicoproteína alfa-1,3-galactosiltransferase-1 (Ggta1).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem celular compreende uma sequência cromossômica inativada que codifica Cmah e uma sequência cromossômica inativada que codifica Ggta1, e a célula produz uma quantidade reduzida de Cmah e/ou Ggta1.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante tem um teor reduzido de resíduos de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) e resíduos de galactose-alfa-1,3-galactose (alfa-Gal) em comparação com a mesma proteína recombinante produzida por uma linhagem celular comparável não deficiente em Cmah e/ou Ggta1.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que todas as cópias da sequência cromossômica que codifica Cmah e/ou Ggta1 estão inativadas, e a linhagem celular não produz Cmah e/ou Ggta1.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante carece de resíduos de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) e resíduos de galactose-alfa-1,3- galactose (alfa-Gal).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante tem pelo menos uma propriedade que é melhorada em comparação com a mesma proteína recombinante produzida por uma linha celular comparável não deficiente em Cmah e/ou Ggta1.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a propriedade que é melhorada é escolhida dentre redução da imunogenicidade, aumento da biodisponibilidade, aumento da eficácia, aumento da estabilidade, aumento da solubilidade, melhoria da meia-vida, melhoria da depuração e melhoria da farmacocinética.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é escolhida dentre um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um fator de crescimento, uma citocina, um hormônio e um fator de coagulação.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que todas as cópias da sequência cromossômica codificando Cmah estão inativadas, a linhagem celular não produz Cmah e a proteína recombinante é desprovida de resíduos de Neu5Gc.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que todas as cópias da sequência cromossômica codificando Ggta1 estão inativadas, a linhagem celular não produz Ggta1 e a proteína recombinante é desprovida de resíduos de alfa- Gal.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem celular é uma linhagem celular CHO, todas as cópias da sequência cromossômica codificando Cmah e todas as cópias da sequência cromossômica codificando Ggta1 estão inativadas, a linhagem celular não produz Cmah ou Ggta1 e a proteína recombinante é desprovida de resíduos de Neu5Gc e alfa-Gal.

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