KR20140045398A - Cmp-n-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제가 결핍된 세포 - Google Patents

Cmp-n-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제가 결핍된 세포 Download PDF

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난 린
헨리 제이. 조지
조아퀴나 마스카레냐스
트레버 엔. 콜링우드
케빈 제이. 카이저
케서린 아크티엔
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시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 CMP-Neu5Ac 하이드록실라제(Cmah) 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(Ggta1)가 결핍된 비인간 포유동물 세포주를 제공한다. 글라이코실화의 인간형 패턴을 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위해 본 명세서에 개시된 세포를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

CMP-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제가 결핍된 세포{CELLS DEFICIENT IN CMP-N-ACETYLNEURAMINIC ACID HYDROXYLASE AND/OR GLYCOPROTEIN ALPHA-1,3-GALACTOSYLTRANSFERASE}
본 개시내용은 일반적으로 단백질, 특히 치료학적 단백질의 제조에 유용한 세포에 관한 것이다. 더 특히, 본 개시내용은 특정한 N-글라이칸 과정 효소가 결핍된 세포, 이 세포의 제조 방법 및 특정한 글라이코실화 패턴을 갖는 단백질을 생산하기 위한 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
대략 70%의 치료학적 단백질, 예컨대 항체, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및 응고 인자가 글라이칸의 부착에 의해 번역 후 단백질 변형된 당단백질이다. N-글라이칸의 위치, 수 및 구조가 치료학적 당단백질의 생물활성, 용해도, 안정성, 약동학, 면역원성 및 청소률에 영향을 미치는 것으로 나타나므로, 대부분의 재조합 치료학적 당단백질은 포유동물 발현 시스템에서 생산된다. 인간 및 다른 포유동물의 단백질 글라이코실화 기계의 2의 차이는 인간 세포에 의해 생산된 당단백질 및 설치류 세포와 같은 다른 포유동물 세포에 의해 생산된 당단백질의 글라이코실화 패턴의 차이를 설명한다.
우선, 인간은 N-글라이칸에서 말단 갈락토스-알파-1,3-갈락토스 모이어티(알파-Gal 또는 α-Gal로도 공지됨)를 합성할 수 없다. 효소인 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(Ggta1)는 α-1,3 글라이코시드 결합을 통해 N-글라이칸의 말단 갈락토스에 갈락토스 잔기를 연결시켜 α-Gal 모이어티를 형성한다. 인간은 명확히 GGTA1 유전자를 갖지만, 이는 처음 4개의 번역된 엑손을 포함하지만 2개의 촉매 엑손이 손실된 비작용성 절두형 단백질을 코딩하는 발현된 위유전자이다. 인간이 작용성 Ggta1 효소를 발현하지 않고, 따라서 α-Gal 모이어티를 합성하지 않더라도, 많은 인간은 이 구조에 대해 항체를 생산하지 않는다.
둘째로, 인간은 시알산, N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc)을 형성할 수 없다. Neu5Gc는 효소 CMP-Neu5Ac 하이드록실라제(Cmah)에 의해 CMP-N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac)의 CMP-Neu5Gc로의 하이드록실화에 의해 생산된다. 인간 CMAH 유전자는 비가역적으로 돌연변이되지만, Neu5Ac의 발현을 방지하여, 미량의 Neu5Gc가 이 인간 혈청에서 검출되었다. 비인간 Neu5Gc가 특정한 포유동물 유래 음식으로부터 인간 조직으로 대사로 도입될 수 있어서, 모든 인간은 필수적으로 Neu5Gc 특이적 항체를 때때로 높은 수준으로 갖는 것으로 보인다.
부분적으로 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포가 인간형 글라이코실화 패턴을 갖는 단백질을 생산하는 것으로 추정되므로, 이는 단백질 치료제의 제조를 위해 널리 사용된다. 예를 들면, CHO 세포가 α-Gal 모이어티를 갖는 당단백질을 생산하기 위해 생합성 기계가 결여된 것으로 일반적으로 인정된다. 더욱이, CHO 세포가 Cmah를 발현하고 Neu5Gc 단위를 갖는 단백질을 생산하더라도, CHO 세포 배양 조건을 변형함으로써 Neu5Gc 대 Neu5Ac 단위의 비가 감소될 수 있다. CHO 세포가 α-Gal 모이어티를 합성할 수 없다는 일반적 인식에도 불구하고, Ggta1의 CHO 오솔로그가 최근 확인되었다(Bosques et al. Nature Biotechnol., 2010, 28(11):1153-1156). 재조합 치료학적 당단백질에 대한 과민성 반응의 가능성으로 인해, α-Gal 및/또는 Neu5Gc 잔기가 없는 당단백질을 생산하는 CHO 세포주 및 다른 비인간 포유동물 세포주에 대한 수요가 존재한다.
간단히 말하면, 따라서, 본 개시내용의 일 양태는 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제(Cmah)가 결핍된 비인간 포유동물 세포주를 개시한다. 일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 외인성으로 도입된 서열을 포함하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 단일대립유전자성이고, 상기 세포주는 감소된 양의 Cmah를 생산한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 양쪽 대립유전자성이고, 상기 세포주는 Cmah를 생산하지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 염색체 서열은 표적화 엔도뉴클레아제, 예를 들면 메가뉴클레아제, TALEN, 부위 특이적 엔도뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 불활화된다. 임의의 이러한 실시양태에서, 상기 세포주는 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 잔기가 결여된 단백질을 생산할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양태에서, 상기 Cmah가 결핍된 세포주는 Ggta1이 또한 결핍된다. 이 세포주의 일 실시양태에서, 상기 세포주는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 외인성으로 도입된 서열을 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 단일대립유전자성이고, 상기 세포주는 감소된 양의 Ggta1을 생산한다. 다른 실시양태에서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 양쪽 대립유전자성이고, 상기 세포주는 Ggta1을 생산하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 염색체 서열은 표적화 엔도뉴클레아제, 예를 들면 메가뉴클레아제, TALEN, 부위 특이적 엔도뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 불활화된다. 임의의 이러한 실시양태에서, 상기 비인간 포유동물 세포주는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파-Gal) 잔기가 추가로 결여된 단백질을 생산할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 불활화 및 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 불활화를 포함하고, 상기 세포주는 감소된 양의 Cmah 및 감소된 양의 Ggta1을 생산한다. 다른 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화 및 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화를 포함하고, 상기 세포주는 Cmah 또는 Ggta1을 생산하지 않는다. 특정한 실시양태에서, 상기 비인간 포유동물 세포주는 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 잔기 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파-Gal) 잔기가 결여된 단백질을 생산한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 상기 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 일 실시양태에서, 상기 CHO 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 불활화를 포함하고, 감소된 양의 Cmah를 생산한다. 다른 실시양태에서, 상기 CHO 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화를 포함하고, Cmah를 생산하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 CHO 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 불활화 및 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 불활화를 포함하고, 감소된 양의 Cmah 및 감소된 양의 Ggta1을 생산한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 CHO 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화 및 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화를 포함하고, Cmah 또는 Ggta1을 생산하지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 CHO 세포주는 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 잔기 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파-Gal) 잔기가 결여된 단백질을 생산한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 생산하는 방법을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 표적화 엔도뉴클레아제 또는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열과 관련된 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 상기 세포주에 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 표적화 엔도뉴클레아제 또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열과 관련된 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 Cmah가 결핍된 세포주에 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 표적화 엔도뉴클레아제 또는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열과 관련된 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 표적화 엔도뉴클레아제 또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열과 관련된 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포주에 도입하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 다른 양태는 인간형 글라이코실화 패턴을 갖는 재조합 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 비인간 포유동물 세포주에서 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 특정한 일 실시양태에서, 상기 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열 및/또는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 단일대립유전자성이고, 상기 세포주는 감소된 양의 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산한다. 다른 실시양태에서, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 양쪽 대립유전자성이고, 상기 세포주는 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 재조합 단백질은 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 잔기 및/또는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파-Gal) 잔기가 결여된다. 일 실시양태에서, 상기 재조합 단백질은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍되지 않은 필적하는 세포주에 의해 생산된 유사한 재조합 단백질과 비교하여 면역원성 감소, 생체이용률 증가, 효율 증가, 안정성 증가, 용해도 증가, 반감기 개선, 청소률 개선, 약동학 개선 및 이들의 조합과 같은 적어도 하나의 개선된 특성을 갖는다. 상기 재조합 단백질은 치료학적 단백질을 포함하는 임의의 단백질일 수 있다. 예시적인 단백질은 항체, 항체 단편, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 응고 인자 및 이들의 작용성 단편 또는 변이체로부터 선택되는 것을 포함한다.
본 개시내용의 다른 양태 및 반복은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
도 1은 CHO 세포에서 Ggta1 유전좌위의 ZFN 매개 분할을 나타낸 것이다. Cel-1 전달자(surveyor) 뉴클레아제 검정의 결과가 도시되어 있다. 화살표는 ZFN mRNA로 형질감염된 CHO 세포에서 215bp 및 100bp의 분할 생산물(1) 또는 ZFN DNA(2)를 나타낸다. 거짓 형질감염된 세포에서 절단 생산물이 검출되지 않았다(3).
도 2는, Cel-1 전달자 뉴클레아제 검정에 의해 검출되는 것처럼, CHO 세포에서 Cmah 유전좌위의 ZFN 매개 분할을 도시한 것이다. 화살표는 분할 생산물을 나타낸다.
도 3은, Cel-1 전달자 뉴클레아제 검정에 의해 검출되는 것처럼, Cmah (-/-) 세포에서 Ggta1 유전좌위의 ZFN 매개 분할을 나타낸 것이다. 거짓 형질감염된 세포가 아니가 ZFN 형질감염된 세포("1호" 및 "2호" 마크)가 215bp 및 100bp의 분할 단편을 가졌다.
본 개시내용은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 비인간 포유동물 세포주를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함하여 상기 세포주는 감소된 양의 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산한다. 다른 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함하여 상기 세포주는 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산하지 않는다. 본 명세서에 개시된 세포주를 제조하기 위한 방법 및 글라이코실화의 인간형 패턴을 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위해 본 명세서에 개시된 세포주를 사용하는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 상기 세포주가 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍되므로, 상기 세포주는 Neu5Gc 및/또는 α-Gal 함량이 적은 재조합 당단백질 또는 Neu5Gc 및/또는 α-Gal이 결여된 당단백질을 생산한다.
(Ⅰ) Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주
본 개시내용의 일 양태는 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제(Cmah) 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(Ggta1)가 결핍된 비인간 포유동물 세포주를 제공한다.
(a) Cmah 및 Ggta1
Cmah 및 Ggta1은 당단백질에서 N-글라이칸의 생산에 관련되는 효소이다. Cmah는 시알산 Neu5Ac의 이의 하이드록실화 유도체 Neu5Gc로의 전환을 촉매화한다. Ggta1은 α-1,3 글라이코시드 결합을 통해 N-글라이칸에서 갈락토스에 갈락토스 잔기를 연결하여 말단 Gal-α-1,3-Gal(즉, α-Gal) 모이어티를 형성한다. 일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah가 결핍된다. 다른 실시양태에서, 상기 세포주는 Ggta1이 결핍된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah 및 Ggta1 둘 다가 결핍된다.
몇몇 경우에, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주는 모 세포주에 비해 감소된 수준의 Cmah 및/또는 Ggta1을 가질 수 있다. 예를 들면, Cmah 및/또는 Ggta1의 수준은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍되지 않은 모 세포주에 비해 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99.9% 감소할 수 있다. 감소된 수준의 Cmah 및/또는 Ggta1을 갖는 세포주는 일반적으로 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍되지 않은 필적하는 세포에 의해 생산된 단백질에 비해 Neu5Gc 및/또는 α-Gal 함량이 적은 단백질을 생산한다.
다른 경우에, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주는 필수적으로 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산하지 않을 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "필수적으로 Cmah 및/또는 Ggta1이 없는"은 Cmah 및/또는 Ggta1 mRNA 또는 단백질이 결핍된 세포 또는 이로부터 유도된 용해물에서 당해 분야에 널리 공지된 절차를 이용하여 검출될 수 없다는 것을 의미한다. mRNA 또는 단백질의 수준을 결정하기 위한 적합한 절차의 비제한적인 예는 PCR, qPCR, 웨스턴 블로팅 및 ELISA 검정을 포함한다. 따라서, 결핍된 세포 또는 용해물에서 검출된 Cmah 및/또는 Ggta1 mRNA 및/또는 단백질의 수준은 배경 수준과 필수적으로 동일하다. 상기 Cmah 및/또는 Ggta1이 없는 세포주는 일반적으로 Neu5Gc 및/또는 α-Gal 잔기가 결여된 단백질을 생산한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주 게놈을 편집할 수 있어서 Cmah를 코딩하는 염색체 서열 및/또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열이 불활화된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "불활화 염색체 서열"은 작용성 유전자 생산물을 생산할 수 없는 염색체 서열을 의미한다. 상기 세포주가 정배수체 세포를 포함하는 일 실시양태에서, 상기 불활화 염색체 서열은 단일대립유전자성일 수 있어서 상기 세포는 감소된 수준의 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산한다. 상기 세포주가 정배수체인 다른 실시양태에서, 상기 불활화 염색체 서열은 양쪽 대립유전자성일 수 있어서 상기 세포는 필수적으로 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산하지 않고, 상기 세포는 "넛아웃" 세포라 칭할 수 있다. 대안적으로, 상기 세포주가 정배수체인 다른 실시양태에서, Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열(들)의 하나 이상의 카피(copy)가 불활화되어 Cmah 및/또는 Ggta1의 양이 감소한다. 상기 세포주가 정배수체인 다른 실시양태에서, Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열(들)의 모든 카피가 불활화되어 Cmah 및/또는 Ggta1 유전자 발현이 완전 소실된다.
상기 Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환을 포함할 수 있다. 하기 섹션 (Ⅱ)에 기재된 표적화 엔도뉴클레아제 매개 게놈 편집 기술을 이용하여 Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열을 불활화할 수 있다. 다양한 실시양태에서, Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열은 엑손 코딩 부위의 전부 또는 일부의 결실, 조절 부위의 전부 또는 일부의 결실 및/또는 스플라이스 부위(splice site)의 결실에 의해 불활화될 수 있어서 상기 세포주는 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산할 수 없다. 다른 실시양태에서, Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열은 이 염색체 서열에 조기 정지 코돈, 새로운 스플라이스 부위 및/또는 SNP를 도입하기 위한 결실, 삽입 및/또는 뉴클레오타이드 치환을 통해 불활화될 수 있어서 상기 세포주는 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산할 수 없다.
일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열 내에 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및/또는 치환으로 인해 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, Cmah를 코딩하는 염색체 서열은 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 5 엑손 내에 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및/또는 치환으로 인해 불활화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 세포주는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열 내에 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및/또는 치환으로 인해 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, Ggta1을 코딩하는 염색체 서열은 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 9 엑손 내에 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및/또는 치환으로 인해 불활화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주는 또한 글루타민 신타제(GS), 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT), 또는 이들의 조합이 결핍될 수 있다. GS, DHFR 및/또는 HPRT의 결핍증을 추가로 포함하는 세포주는 GS, DHFR 및/또는 HPRT를 코딩하는 불활화 염색체 서열로 인해 GS, DHFR 및/또는 HPRT가 결핍될 수 있다.
(b) 세포 유형
Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주의 유형은 임의의 여러 적합한 세포 유형일 수 있다. 일반적으로, 상기 세포주는 비인간 포유동물 세포주이다. 적합한 비인간 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포; 마우스 골수종 NS0 세포, 마우스 배아 섬유아세포 3T3 세포, 마우스 B 림프종 A20 세포; 마우스 흑색종 B16 세포; 마우스 근아세포 C2C12 세포; 마우스 골수종 SP2/0 세포; 마우스 배아 중간엽 C3H-10T1/2 세포; 마우스 암종 CT26 세포, 마우스 전립선 DuCuP 세포; 마우스 유방 EMT6 세포; 마우스 간암 Hepa1c1c7 세포; 마우스 골수종 J5582 세포; 마우스 상피 MTD-1A 세포; 마우스 심근 MyEnd 세포; 마우스 신장 RenCa 세포; 마우스 췌장 RIN-5F 세포; 마우스 흑색종 X64 세포; 마우스 림프종 YAC-1 세포; 랫트 교모세포종 9L 세포; 랫트 B 림프종 RBL 세포; 랫트 신경아세포종 B35 세포; 랫트 간암 세포(HTC); 버팔로 랫트 간 BRL 3A 세포; 개과 신장 세포(MDCK); 개과 유방(CMT) 세포; 랫트 골육종 D17 세포; 랫트 단핵구/대식세포 DH82 세포; 원숭이 신장 SV-40 변형 섬유아세포(COS7) 세포; 원숭이 신장 CVI-76 세포; 및 아프리칸 녹색 원숭이 신장(VERO-76)세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비인간 포유동물 세포주의 광범위한 목록을 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 카달로그(ATCC, 미국 버지니아주 마마사스)에서 확인할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주는 마우스 세포주와 다르다. 또 다른 실시양태에서, Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주는 돼지 세포주와 다르다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포주는 재조합 글라이콜 단백질의 제조에 널리 사용되는 유형이다. 예시적인 실시양태에서, 상기 세포주는 CHO 세포주이다. 다양한 CHO 세포주가 ATCC 및 상업용 판매업자로부터 구입 가능하다. 적합한 CHO 세포주는 CHO-K1 세포 및 이의 유도체, CHO-K1SV 세포, CHO DG44 세포, CHO-S 세포, CHO P12 세포, CHO pro3- 세포, CHO/DHFR- 세포, CHO/GS- 및 CHO DXB11 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
(c) 임의의 핵산
몇몇 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 포유동물 세포주는 재조합 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 단백질은 항체, 항체 단편, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간화 단일클론 항체, 키메라 항체, IgG 분자, IgG 중쇄, IgG 경쇄, IgA 분자, IgD 분자, IgE 분자, IgM 분자, 당단백질, 성장 인자, 사이토카인, 인터페론, 인터류킨, 호르몬, 응고(또는 응집) 인자, 혈액 성분, 효소, 치료학적 단백질, 식품의약품 단백질, 백신, 임의의 상기한 것의 작용성 단편 또는 작용성 변이체, 또는 임의의 상기한 단백질 및/또는 이들의 작용성 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT), 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및/또는 글루타민 신타제(GS)를 코딩하는 핵산 서열에 연결되어, HPRT, DHFR 및/또는 GS가 선택 가능한 증폭형 마커로서 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 과잉염색체일 수 있다. 즉, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체 등으로부터 일시적으로 발현될 수 있다. 당해 분야의 당업자는 적합한 발현 구성체, 적절한 발현 조절 서열 및 상기 구성체를 세포에 도입하는 방법에 익숙할 것이다.
다른 실시양태에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 세포 게놈에 염색체로 통합되어 재조합 단백질은 안정하게 발현된다. 이 실시양태의 몇몇 반복에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 적절한 이종 발현 조절 서열(즉, 프로모터)에 작동적으로 연결될 수 있다. 다른 반복에서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 내생 발현 조절 서열의 조절 하에 위치할 수 있다. 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 널리 공지된 기술을 이용하여 세포주 게놈에 통합될 수 있다.
외인성 핵산 서열(예를 들면, 재조합 단백질을 코딩하는 것)을 제조하고 도입하기 위한 방법, 벡터 및 클로닝 기술은 당해 분야에서 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003] 또는 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001] 참조).
(d) 예시적인 실시양태
특정한 일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 또는 양쪽 대립유전자 불활화를 포함하는 CHO 세포주이다. 다른 특정 실시양태에서, 상기 세포주는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 또는 양쪽 대립유전자 불활화를 포함하는 CHO 세포주이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 또는 양쪽 대립유전자 불활화 및 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 단일대립유전자 또는 양쪽 대립유전자 불활화를 포함하는 CHO 세포주이다.
(Ⅱ) Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 제조하는 방법
다양한 방법에 의해 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 제조할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 매개 게놈 편집 과정에 의해 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 제조할 수 있다. 다른 실시양태에서, RNAi 방법, 무작위 돌연변이 유발, 부위 특이적 재조합 시스템 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법에 의해 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 제조할 수 있다.
(a) 표적화 엔도뉴클레아제 매개 게놈 편집
특이적 염색체 서열을 편집(즉, 불활화 또는 변형)시키기 위해 표적화 엔도뉴클레아제를 사용할 수 있다. 특이적 염색체 서열을 표적화하기 위해 조작된 표적화 엔도뉴클레아제 또는 이 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하여 특이적 염색체 서열을 불활화할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 특이적 염색체 서열을 인식하여 이에 결합하고 비상동 말단 결합(non-homologous end-joining: NHEJ) 보수 과정에 의해 보수되는 이중 가닥 절단을 도입한다. NHEJ가 오차에 취약하므로, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환이 일어나서 염색체 서열의 리딩 프레임을 파괴하여 단백질 생산물이 생산되지 않는다. 다른 실시양태에서, 표적화된 염색체 서열의 일부와 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 동시 도입하여 상동성 재조합 반응을 통해 염색체 서열을 편집하기 위해 상기 표적화 엔도뉴클레아제를 또한 사용할 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중 가닥 절단은 상동성 지정 보수 과정에 의해 보수되어 편집하고자 하는 염색체 서열을 생산시키는 방식으로 염색체 서열이 폴리뉴클레오타이드와 교환된다.
(ⅰ) 표적화 엔도뉴클레아제
염색체 서열을 편집하기 위해 다양한 표적화 엔도뉴클레아제를 사용할 수 있다. 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 천연 단백질 또는 조작된 단백질일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제는 긴 인식 서열을 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이고, 즉 인식 서열은 일반적으로 약 12개의 염기쌍 내지 약 40개의 염기쌍 범위이다. 이러한 요건의 결과로서, 인식 서열은 일반적으로 임의의 소정의 게놈에서 오직 한번 발생한다. 메가뉴클레아제 중에서, LAGLIDADG라 칭하는 귀소 엔도뉴클레아제의 패밀리가 게놈 및 게놈 조작의 연구를 위한 귀중한 도구가 된다. 메가뉴클레아제는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 인식 서열을 변형시킴으로써 특이적 염색체 서열에 표적화될 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 전사 활성화인자 유사 효과인자(transcription activator-like effector: TALE) 뉴클레아제일 수 있다. TALE는 새로운 DNA 표적에 결합하도록 용이하게 조작될 수 있는 식물 병원균 잔토모나스(Xanthomonas) 기원의 전사 인자이다. TALE 또는 이의 절두형 버전은 FokI와 같은 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인에 연결되어 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN이라 칭하는 표적화 엔도뉴클레아제를 생산할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 부위 특이적 엔도뉴클레아제일 수 있다. 특히, 상기 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 게놈에서 인식 서열이 드물게 발생하는 "희귀 절단(rare-cutter)" 엔도뉴클레아제일 수 있다. 바람직하게는, 상기 부위 특이적 엔도뉴클레아제의 인식 서열은 게놈에서 오직 한번 발생한다. 대안적인 추가의 실시양태에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 인공 표적화 DNA 이중 가닥 절단 유도제일 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)일 수 있다. 통상적으로, 아연 핑거 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인(즉, 아연 핑거) 및 분할 도메인(즉, 뉴클레아제)을 포함하고, 이들 둘 다 하기 기재되어 있다.
아연 핑거 결합 도메인 . 선택된 임의의 핵산 서열을 인식하여 이에 결합하도록 아연 핑거 결합 도메인을 조작할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 및 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814]을 참조한다. 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 천연 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합당한 설계 및 다양한 선택 유형을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 합당한 설계는 예를 들면 이중항, 삼중항 및/또는 사중항 뉴클레오타이드 서열 및 각각의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하고, 각각의 이중항, 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 서열은 특정한 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들면, 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하고, 이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 예로서, 미리 선택된 서열을 표적화하기 위해 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위해 미국 특허 제6,453,242호에 기재된 알고리즘을 이용할 수 있다. 특이적 서열을 표적화하기 위해 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위해 비축퇴성 인식 코드표를 사용하는 합당한 설계와 같은 대안적인 방법을 또한 이용할 수 있다(Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). DNA 서열에서 잠재적 표적 부위를 확인하고 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위한 공개적으로 이용 가능한 웹 기반 도구가 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, DNA 서열에서 잠재적 표적 부위를 확인하기 위한 도구는 http://www.zincfingertools.org에서 확인할 수 있다. 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위한 도구는 http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/에서 확인할 수 있다. (또한, 문헌[Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605]을 참조한다).
약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 21개의 길이의 뉴클레오타이드 또는 바람직하게는 약 9개 내지 약 18개의 길이의 뉴클레오타이드 범위의 DNA 서열을 인식하여 이에 결합하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 아연 핑거 뉴클레아제의 아연 핑거 결합 도메인은 적어도 3개의 아연 핑거 인식 부위(즉, 아연 핑거)를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 아연 핑거 결합 도메인은 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 아연 핑거 결합 도메인은 5개의 아연 핑거 인식 부위를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 아연 핑거 결합 도메인은 6개의 아연 핑거 인식 부위를 포함한다. 임의의 적합한 표적 DNA 서열에 결합하도록 아연 핑거 결합 도메인을 설계할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,607,882호; 제6,534,261호 및 제6,453,242호를 참조하고, 이의 개시내용이 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
아연 핑거 인식 부위를 선택하는 예시적인 방법은 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 및 WO 제98/37186호; WO 제98/53057호; WO 제00/27878호; WO 제01/88197호 및 GB 제2,338,237호(이들 각각이 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 파지 디스플레이 및 2원 하이브리드 시스템을 포함할 수 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성 증대는 예를 들면 WO 02/077227에 기재되어 있고, 이의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
아연 핑거 결합 도메인 및 융합 단백질(및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구성을 위한 방법은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제7,888,121호(이는 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 자세히 기재되어 있다. 아연 핑거 인식 부위 및/또는 다중 핑거의 아연 핑거 단백질은 예를 들면 5개 이상의 길이의 아미노산의 링커를 포함하는 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 6개 이상의 길이의 아미노산의 링커 서열의 비제한적인 예를 위해 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조하고, 이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함된다. 본 명세서에 기재된 아연 핑거 결합 도메인은 단백질의 각각의 아연 핑거 사이의 적합한 링커의 조합을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 아연 핑거 뉴클레아제는 핵 국소화 신호 또는 핵 국소화 서열(nuclear localization signal 또는 nuclear localization sequence: NLS)을 추가로 포함한다. NLS는 염색체에서 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 도입하기 위해 아연 핑거 뉴클레아제 단백질을 핵에 표적화하는 것을 수월하게 하는 아미노산 서열이다. 핵 국소화 신호는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027]을 참조한다.
분할 도메인 . 아연 핑거 뉴클레아제는 분할 도메인을 또한 포함한다. 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 아연 핑거 뉴클레아제의 분할 도메인 부분을 얻을 수 있다. 분할 도메인이 유도될 수 있는 엔도뉴클레아제의 비제한적인 예는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 문헌[New England Biolabs Catalog or Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 분할하는 추가의 효소가 공지되어 있다(예를 들면, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코칼 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). 또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]을 참조한다. 분할 도메인의 공급원으로서 이러한 효소 중 하나 이상(또는 이의 작용성 단편)을 사용할 수 있다.
분할 도메인은 분할 활성에 대한 이합체화를 요하는, 상기 기재된 바와 같은, 효소 또는 이의 일부로부터 또한 유도될 수 있다. 각각의 뉴클레아제가 활성 효소 이합체의 단량체를 포함하므로, 2개의 아연 핑거 뉴클레아제가 분할에 필요할 수 있다. 대안적으로, 단일 아연 핑거 뉴클레아제는 활성 효소 이합체를 생산하기 위해 단량체 둘 다를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "활성 효소 이합체"는 핵산 분자를 분할할 수 있는 효소 이합체이다. 2개의 분할 단량체는 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 작용성 단편)로부터 유도될 수 있거나, 각각의 단량체는 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 작용성 단편)로부터 유도될 수 있다.
활성 효소 이합체를 형성하기 위해 2개의 분할 단량체를 사용할 때, 각각의 인식 부위에 대한 2개의 아연 핑거 뉴클레아제의 결합이, 분할 단량체가 예를 들면 이합체화에 의해 활성 효소 이합체를 형성하게 하는 서로에 대한 공간 배열로 분할 단량체를 위치시키도록 2개의 아연 핑거 뉴클레아제를 위한 인식 부위가 배치되는 것이 바람직하다. 그 결과, 인식 부위의 근처 엣지가 약 5개 내지 약 18개의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 예를 들면, 근처 엣지는 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 그러나, 2개의 인식 부위 사이에 임의의 정수의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍(예를 들면, 약 2개 내지 약 50개 이상의 뉴클레오타이드 쌍)이 개재될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 본 명세서에서 자세히 기재된 것과 아연 핑거 뉴클레아제의 인식 부위의 근처 엣지는 6개의 뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다. 일반적으로, 분할 부위는 인식 부위 사이에 놓여 있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에서 존재하고 (인식 부위에서) DNA에 대해 서열 특이적 결합을 하고, 결합 부위에서 또는 그 근처에서 DNA를 분할할 수 있다. 특정한 제한 효소(예를 들면, IIS형)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 분할하고 분리 가능한 결합 및 분할 도메인을 갖는다. 예를 들면, IIS형 효소 FokI는 하나의 가닥에서 이의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오타이드 및 다른 가닥에서 이의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 분할을 촉매화한다. 예를 들면, 미국 특허 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 및 문헌[Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982]을 참조한다. 따라서, 아연 핑거 뉴클레아제는, 조작되거나 조작되지 않을 수 있는, 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인 및 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터의 분할 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 IIS형 제한 효소가 예를 들면 국제 공보 WO 제07/014,275호(이의 개시내용은 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소는 또한 분리 가능한 결합 및 분할 도메인을 포함하고, 이는 또한 본 개시내용에 의해 고려된다. 예를 들면, 문헌[Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
분할 도메인이 결합 도메인으로부터 분리 가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 FokI이다. 이 특정한 효소는 이합체로서 활성이다(Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575). 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 아연 핑거 뉴클레아제에서 사용되는 FokI 효소의 일부는 분할 단량체로 고려된다. 따라서, FokI 분할 도메인을 사용하는 표적화된 이중 가닥 분할의 경우, 활성 효소 이합체를 재구성하기 위해 FokI 분할 단량체를 각각 포함하는 2개의 아연 핑거 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 분할 단량체를 포함하는 단일의 폴리펩타이드 분자를 또한 사용할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 분할 도메인은 호모이합체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 분할 단량체를 포함한다. 비제한적인 예의 방식으로, FokI의 446번, 447번, 479번, 483번, 484번, 486번, 487번, 490번, 491번, 496번, 498번, 499번, 500번, 531번, 534번, 537번 및 538번 위치에서의 아미노산 잔기는 FokI 분할 도메인 절반의 이합체화에 영향을 미치는 모든 표적이다. 불가피한 헤테로이합체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 분할 단량체는 제1 분할 단량체가 FokI의 490번 및 538번의 아미노산 잔기 위치에서 돌연변이를 포함하고 제2 분할 단량체가 486번 및 499번의 아미노산 잔기 위치에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 일 실시양태에서, 490번 아미노산 위치에서의 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 대체하고; 538번 아미노산 잔기에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체하고; 486번 아미노산 잔기에서의 돌연변이는 Gln(Q)을 Glu(E)로 대체하고; 499번 위치에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체한다. 구체적으로, "E490K:I538K"라 칭하는 조작된 분할 단량체를 생산하기 위해 1개의 분할 단량체에서 490번 위치에서 E로부터 K로 돌연변이시키고 538번 위치에서 I로부터 K로 돌연변이시키고, "Q486E:I499L"이라 칭하는 조작된 분할 단량체를 생산하기 위해 다른 분할 단량체에서 486번 위치에서 Q로부터 E로 돌연변이시키고 499번 위치에서 I로부터 L로 돌연변이시킴으로써 상기 조작된 분할 단량체를 제조할 수 있다. 상기 기재된 조작된 분할 단량체는 비정상 분할이 최소화되거나 없는 불가피한 헤테로이합체 돌연변이체이다. 미국 특허 제7,888,121호(본 명세서에 그 전문이 포함됨)에 기재된 바대로 야생형 분할 단량체(FokI)의 부위 지정 돌연변이 유발과 같은 적합한 방법을 이용하여 조작된 분할 단량체를 제조할 수 있다.
(ⅱ) 임의의 폴리뉴클레오타이드
표적화된 게놈 편집 방법은 표적화된 분할 부위의 적어도 하나의 측에 특정 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 분할 부위의 일측에 특정 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 서열 및 표적화된 분할 부위의 다른 측에 특정 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 분할 부위의 일측에 특정 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 서열 및 표적화된 분할 부위로부터 먼 특정 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 서열을 포함할 수 있다. 표적화된 분할 부위로부터 먼 서열은 표적화된 분할 부위이 상류 또는 하류에 있는 수십, 수백 또는 수천개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
염색체 서열에서 특정 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드에서 제1 서열 및 제2 서열의 길이는 변할 수 있고 변한다. 일반적으로, 폴리뉴클레오타이드에서의 각각의 제1 서열 및 제2 서열은 적어도 약 10개 길이의 뉴클레오타이드이다. 다양한 실시양태에서, 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열은 약 15개 길이의 뉴클레오타이드, 약 20개 길이의 뉴클레오타이드, 약 25개 길이의 뉴클레오타이드, 약 30개 길이의 뉴클레오타이드, 약 40개 길이의 뉴클레오타이드, 약 50개 길이의 뉴클레오타이드, 약 100개 길이의 뉴클레오타이드 또는 100개 초과 길이의 뉴클레오타이드이다.
구문 "실질적인 서열 동일성"은 폴리뉴클레오타이드에서의 서열이 관심 대상의 염색체 서열과 적어도 약 75%의 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드에서의 서열이 관심 대상의 염색체 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다.
폴리뉴클레오타이드의 길이는 변할 수 있고 변한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는 약 20개 길이의 뉴클레오타이드 내지 약 200,000개 길이의 뉴클레오타이드 범위일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 약 20개 길이의 뉴클레오타이드 내지 약 100개 길이의 뉴클레오타이드, 약 100개 길이의 뉴클레오타이드 내지 약 1000개 길이의 뉴클레오타이드, 약 1000개 길이의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개 길이의 뉴클레오타이드, 약 10,000개 길이의 뉴클레오타이드 내지 약 100,000개 길이의 뉴클레오타이드 또는 약 100,000개 길이의 뉴클레오타이드 내지 약 200,000개 길이의 뉴클레오타이드 범위이다.
통상적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 도너 폴리뉴클레오타이드는 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome: YAC), 바이러스 벡터, 선형 DNA, PCR 단편, 네이키드 핵산 또는 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클와 복합체화된 핵산일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 마커를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 마커의 비제한적인 예는 제한 부위, 형광 단백질 또는 선택 가능한 마커를 포함한다. 이러한 마커는 표적화된 통합을 위한 스크리닝이 가능하게 한다.
(ⅲ) 세포로의 도입
상기 표적화 엔도뉴클레아제를 단백질로서 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산으로서 세포에 도입할 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA(즉, mRNA)일 수 있다. 코딩 핵산이 mRNA인 실시양태에서, mRNA는 5' 캡핑 및/또는 3' 폴리아데닐화될 수 있다. 코딩 핵산이 DNA인 실시양태에서, DNA는 선형 또는 원형일 수 있다. DNA는 벡터의 일부일 수 있고, 코딩 DNA가 적합한 프로모터에 작동적으로 임의로 연결된다. 당해 분야의 당업자는 적절한 벡터, 프로모터, 다른 조절 요소 및 관심 대상의 세포로 벡터를 도입하기 위한 수단에 익숙할 것이다.
표적화 엔도뉴클레아제 또는 이 표적화 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 및 상기 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 다양한 수단에 의해 세포에 도입할 수 있다. 적합한 전달 수단은 마이크로주사, 전기천공, 초음파천공, 유전자총법(biolistics), 인산칼슘 매개 형질전환, 양이온 형질전환, 리포솜 형질전환, 덴드리머 형질전환, 열 충격 형질전환, 뉴클레오펙션(nucleofection) 형질전환, 자기주입(magnetofection), 리포펙션(lipofection), 임팔펙션(impalefection), 광학 형질전환, 핵산의 독점 물질 흡수 증진, 및 리포솜, 면역리포솜, 비로좀(virosome) 또는 인공 비리온을 통한 전달을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자 및 임의의 폴리뉴클레오타이드를 뉴클레오펙션 또는 전기천공에 의해 세포에 도입한다.
1개 초과의 표적화 엔도뉴클레아제 분자 및 1개 초과의 폴리뉴클레오타이드가 세포로 도입되는 실시양태에서, 분자를 동시에 또는 순차로 도입할 수 있다. 예를 들면, 표적화된 분할 부위(및 임의의 폴리뉴클레오타이드)에 각각 특이적인 표적화 엔도뉴클레아제 분자를 동시에 도입할 수 있다. 대안적으로, 각각의 표적화 엔도뉴클레아제 분자 및 임의의 폴리뉴클레오타이드(들)를 순차로 도입할 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제(또는 코딩 핵산) 분자 대 임의의 폴리뉴클레오타이드의 비는 변할 수 있고 변한다. 일반적으로, 표적화 엔도뉴클레아제 분자 대 폴리뉴클레오타이드의 비는 약 1:10 내지 약 10:1 범위일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자 대 폴리뉴클레오타이드의 비는 약 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1이다. 일 실시양태에서, 그 비는 약 1:1이다.
(b) RNA 간섭
다른 실시양태에서, 표적 mRNA 또는 전사체의 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNA interference: RNAi) 물질을 사용하여 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 제조할 수 있다. RNAi 물질은 표적 mRNA 또는 전사체를 분할할 수 있다. 대안적으로, RNAi 물질은 단백질로의 표적 mRNA의 번역을 방지하거나 방해할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, RNAi 물질은 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA: siRNA)일 수 있다. 일반적으로, siRNA는 약 15개 내지 약 29개 길이의 뉴클레오타이드 범위의 이중 가닥 RNA 분자를 포함한다. siRNA는 약 16개 내지 18개, 17개 내지 19개, 21개 내지 23개, 24개 내지 27개 또는 27개 내지 29개 길이의 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 실시양태에서, siRNA는 약 21개 길이의 뉴클레오타이드이다. siRNA는 일 말단 또는 양 말단에 1개 또는 2개의 단일 가닥 오버행(overhang), 예를 들면 3' 오버행을 임의로 추가로 포함할 수 있다. siRNA는 함께 하이브리드화하는 2개의 RNA 분자로부터 형성될 수 있거나, 대안적으로, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로부터 생산될 수 있다(하기 참조). 몇몇 실시양태에서, siRNA의 2개의 가닥은 완전히 상보적이여서, 2개의 서열 사이에 형성되는 듀플렉스(duplex)로서 미스매치 또는 벌지(bulge)가 존재하지 않는다. 다른 실시양태에서, siRNA의 2개의 가닥은 실질적으로 상보적이여서, 2개의 서열 사이에 형성되는 듀플렉스로서 하나 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 존재할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, siRNA의 5' 말단의 일 말단 또는 양 말단이 포스페이트 기를 갖는 반면, 다른 실시양태에서, 5' 말단의 일 말단 또는 양 말단은 포스페이트 기가 결여된다. 다른 실시양태에서, siRNA의 3' 말단의 일 말단 또는 양 말단이 하이드록실 기를 갖는 반면, 다른 실시양태에서, 5' 말단의 일 말단 또는 양 말단은 하이드록실 기가 결여된다.
"안티센스 가닥(antisense strand)" 또는 "가이드 가닥(guide strand)"이라 칭하는 siRNA의 일 가닥은 표적 전사체와 하이브리드화하는 부분을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 전사체의 부위와 완전히 상보적이고, 즉 이것이 표적 부위에 걸쳐 약 15개 내지 약 29개 길이의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 16개 길이의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 18개 내지 20개 길이의 뉴클레오타이드 사이에 단일 미스매치 또는 벌지 없이 표적 전사체로 하이브리드화한다. 다른 실시양태에서, 안티센스 가닥은 표적 부위에 실질적으로 상보적이고, 즉 안티센스 가닥 및 표적 전사체에 의해 형성되는 듀플렉스로서 하나 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 존재할 수 있다. 통상적으로, siRNA는 표적 전사체의 엑손 서열에 표적화된다. 당해 분야의 당업자는 표적 전사체에 siRNA를 설계하기 위한 프로그램, 알고리즘 및/또는 상업용 서비스에 익숙할 것이다. 예시적인 예는 로제타(Rosetta) siRNA 설계 알고리즘(서호주주 노스 시애틀에 소재하는 로제타 인파르마틱스(Rosetta Inpharmatics)) 및 미시온(MISSION)(등록상표) siRNA(미국 미조리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich))이다. 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 실험실내 효소로 siRNA를 합성할 수 있다. 대안적으로, 당해 분야에 널리 공지된 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 siRNA를 화학적으로 합성할 수 있다.
다른 실시양태에서, RNAi 물질은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)일 수 있다. 일반적으로, shRNA는 (상기 기재된 바대로) RNA 간섭을 중재하기에 충분히 긴 이중 가닥 구조 및 듀플렉스를 형성하는 shRNA의 부위를 연결하는 루프를 형성하는 적어도 하나의 단일 가닥 부분을 형성하도록 하이브리드화하거나 하이브리드화할 수 있는 적어도 2개의 상보적 부분을 포함하는 RNA 분자이다. 이 구조는 또한 줄기 루프 구조라 불릴 수 있고, 줄기는 듀플렉스 부분이다. 몇몇 실시양태에서, 이 구조의 듀플렉스 부분은 완전히 상보적이여서, shRNA의 듀플렉스 부위에 미스매치 또는 벌지가 존재하지 않는다. 다른 실시양태에서, 이 구조의 듀플렉스 부분은 실질적으로 상보적이여서, shRNA의 듀플렉스 부분에 하나 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 존재한다. 이 구조의 루프는 약 1개 내지 약 20개 길이의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 4개 내지 약 10개 길이의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 6개 내지 약 9개 길이의 뉴클레오타이드일 수 있다. 루프는 표적 전사체에 상보적인 부위의 5' 또는 3' 말단(즉, shRNA의 안티센스 부분)에 위치할 수 있다.
shRNA는 5' 또는 3' 말단에 오버행을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 오버행은 약 1개 내지 약 20개 길이의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 2개 내지 약 15개 길이의 뉴클레오타이드일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 오버행은 하나 이상의 U 잔기, 예를 들면 약 1개 내지 약 5개의 U 잔기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, shRNA의 5' 말단이 포스페이트 기를 갖는 반면, 다른 실시양태에서는 그렇지 않다. 다른 실시양태에서, shRNA의 3' 말단이 하이드록실 기를 갖는 반면, 다른 실시양태에서는 그렇지 않다. 일반적으로, shRNA를 보존된 세포 RNAi 기계에 의해 siRNA로 처리한다. 따라서, shRNA는 siRNA의 전구체이고 shRNA의 부분에 상보적인 표적 전사체(즉, shRNA의 안티센스 부분)의 발현을 유사하게 억제할 수 있다. 당해 분야의 당업자는 shRNA의 설계 및 합성을 위한 (상기 기재된 바와 같은) 이용 가능한 자원에 익숙할 것이다. 예시적인 예는 미시온(등록상표) shRNA(시그마-알드리히)이다.
또 다른 실시양태에서, RNAi 물질은 RNAi 발현 벡터일 수 있다. 통상적으로, RNAi 발현 벡터를 RNAi 물질, 예컨대 siRNA 또는 shRNA의 세포내 (생체내) 합성에 사용한다. 일 실시양태에서, 2개의 별개의 상보적 siRNA 가닥은 2개의 프로모터를 포함하는 단일 벡터를 사용하여 전사되고, 각각의 프로모터는 단일 siRNA 가닥의 전사를 지시한다(즉, 각각의 프로모터는 siRNA에 대한 주형에 작동적으로 연결되어 전사가 발생할 수 있음). 2개의 프로모터는 동일한 배향일 수 잇고, 이런 경우 각각의 프로모터는 상보적 siRNA 가닥 중 하나에 대한 주형으로 작동적으로 연결된다. 대안적으로, 2개의 프로모터는 반대 배향일 수 있고, 단일 주형을 플랭킹하여 프로모터를 위한 전사는 2개의 상보적 siRNA 가닥을 합성시킨다. 다른 실시양태에서, RNAi 발현 벡터가 2개의 상보적 부위를 포함하는 단일 RNA 분자의 전사를 구동하는 프로모터를 포함할 수 있어서 전사체가 shRNA를 형성한다.
당해 분야의 당업자는 siRNA 및 shRNA 물질이 1개 초과의 전사 단위의 전사를 통해 생체내 생산되는 것이 바람직하다고 이해할 것이다. 일반적으로 말해서, 하나 이상의 siRNA 또는 shRNA 전사 단위의 생체내 발현을 지시하기 위해 사용되는 프로모터는 RNA 중합효소 III(Pol III)를 위한 프로모터일 수 있다. 특정한 Pol III 프로모터, 예컨대 U6 또는 H1 프로모터는 전사된 부위 내에 시스 작용 조절 요소를 요하지 않고, 따라서, 특정한 실시양태에서 바람직하다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 siRNA 또는 shRNA 전사 단위의 발현을 구동하기 위해 Pol II를 위한 프로모터를 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조직 특이적, 세포 특이적 또는 유도성 Pol II 프로모터를 사용할 수 있다.
siRNA 또는 shRNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 구성체를 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여 생산할 수 있거나 진핵 세포에서의 발현에 적합한 임의의 다양한 상이한 벡터에 삽입할 수 있다. 재조합 DNA 기술이 상기 아우수벨(Ausubel) 등의 문헌 및 상기 삼브룩 및 루셀(Sambrook & Russell)의 문헌에 기재되어 있다. 당해 분야의 당업자는 또한 벡터가 추가의 조절 서열(예를 들면, 종결 서열, 번역 조절 서열 등) 및 선택한 가능 마커 서열을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. pBR322, PUC 등에 기초한 것을 비롯한 DNA 플라스미드가 당해 분야에 공지되어 있다. 많은 발현 벡터가 적합한 프로모터 또는 프로모터들을 이미 포함하므로, 프로모터(들)와 관련하여 적절한 위치에서 관심 대상의 RNAi 물질을 코딩하는 핵산 서열을 삽입하는 것만이 필요할 수 있다. RNAi 물질의 세포내 발현을 제공하기 위해 바이러스 벡터를 또한 사용할 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNAi 발현 벡터는 예컨대 미시온(등록상표) TRC shRNA 제품(시그마-알드리히)에 포함된 것과 같은 shRNA 렌티바이러스계 벡터 또는 렌티바이러스 입자이다.
당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 RNAi 물질 또는 RNAi 발현 벡터를 도입할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들면 상기 아우수벨 등의 문헌 및 상기 삼브룩 및 루셀의 문헌에 기재되어 있다. 몇몇 실시양태에서, RNAi 발현 벡터, 예를 들면 바이러스 벡터는 세포 게놈에 안정하게 통합되어, Cmah 및/또는 Ggta1 발현이 후속 세포 생산에 걸쳐 파괴된다.
(c) 무작위 돌연변이 유발
또 다른 실시양태에서, 무작위 돌연변이 유발을 이용하여 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 제조할 수 있다. 일 실시양태에서, N-에틸-N-나이트로소우레아(ENU), N-에틸-N-나이트로소우레아(NMU), 에틸 메탄설포네이트(EMS), 아질산(NA) 또는 다른 돌연변이유발 화학물질과 같은 화학물질에 세포를 노출시켜 무작위 돌연변이를 생산시킨다. 다른 실시양태에서, 게놈에서 짧은 서열을 무작위로 삽입하여 서열이 삽입된 염색체 서열의 발현을 파괴함으로써 전이인자 기반 시스템을 이용하여 무작위 돌연변이를 생산한다. 다른 실시양태에서, 이온화 방사선을 이용하여 무작위 돌연변이를 생산한다.
(d) 부위 특이적 재조합
대안적인 실시양태에서, 부위 특이적 재조합 기술을 이용하여 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주를 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 염색체 서열의 전부 또는 일부를 결실시키거나, 관심 대상의 염색체 서열에 단일 뉴클레오타이드 다형(single nucleotide polymorphism: SNP)을 도입하기 위해 부위 특이적 재조합 기술을 이용할 수 있다. 일 실시양태에서, Cre-loxP 부위 특이적 재조합 시스템, Flp-FRT 부위 특이적 재조합 시스템 또는 이의 변이체를 이용하여 관심 대상의 염색체 서열을 표적화한다. 이러한 재조합 시스템은 상업적으로 구입 가능하고, 이러한 기술의 추가의 교시를 예를 들면 상기 아우수벨 등의 문헌에서 확인할 수 있다.
(Ⅲ) 재조합 단백질을 생산하는 방법
본 개시내용의 추가의 양태는 인간형 글라이코실화 패턴을 갖는 재조합 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 인간형 글라이코실화 패턴을 갖는 당단백질은 α-Gal 및/또는 Neu5Gc 잔기가 결여된다. 상기 방법은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 비인간 포유동물 세포주에서 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주는 상기 섹션 (Ⅰ)에 기재되어 있다.
예시적인 일 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화를 포함할 수 있어서, 상기 세포주는 Cmah를 생산하지 않고 이 세포주에 의해 생산된 재조합 단백질은 α-Gal 모이어티가 결여된다. 다른 예시적인 실시양태에서, 상기 세포주는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화를 포함할 수 있어서, 상기 세포주는 Ggta1을 생산하지 않고 이 세포주에 의해 생산된 재조합 단백질은 Neu5Gc 잔기가 결여된다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 상기 세포주는 Cmah 및 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 양쪽 대립유전자 불활화를 포함할 수 있어서, 상기 세포주는 Cmah 또는 Ggta1을 생산하지 않고 이 세포에 의해 생산된 재조합 단백질은 α-Gal 및 Neu5Gc 잔기가 결여된다. 세포주가 이수체인 다른 실시양태에서, Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되어, 상기 세포주는 Cmah를 생산하지 않고 이 세포주에 의해 생산된 재조합 단백질은 α-Gal 모이어티가 결여된다. 세포주가 이수체인 다른 예시적인 실시양태에서, Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되어, 상기 세포주는 Ggta1을 생산하지 않고 이 세포주에 의해 생산된 재조합 단백질은 Neu5Gc 잔기가 결여된다. 세포주가 이수체인 추가의 예시적인 실시양태에서, Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피 및 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되어, 상기 세포주는 Cmah 또는 Ggta1을 생산하지 않고 이 세포에 의해 생산된 재조합 단백질은 α-Gal 및 Neu5Gc 잔기가 결여된다.
일반적으로, Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주에 의해 생산된 재조합 단백질은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍되지 않은 필적하는 세포주에 의해 생산된 동일한 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 특성을 갖는다. 개선된 특성의 비제한적인 예는 면역원성 감소, 생체이용률 증가, 효율 증가, 안정성 증가, 용해도 증가, 반감기 개선, 청소률 개선, 약동학 개선 및 이들의 조합을 포함한다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 재조합 단백질이 α-Gal 및/또는 Neu5Gc 잔기가 결여되므로, 생산된 재조합 단백질은 면역원성 감소 및 α-Gal 및/또는 Neu5Gc 잔기를 포함하는 필적하는 단백질보다 인간 피험체에서 과민성 반응을 유도하기 위한 가능성 감소를 갖는다.
Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍된 세포주에 의해 생산된 재조합 단백질은 치료학적 단백질 및 단백질 생물의약품을 포함하는 임의의 적합한 단백질일 수 있다. 예를 들면, 재조합 단백질은 항체, 항체 단편, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간화 단일클론 항체, 키메라 항체, IgG 분자, IgG 중쇄, IgG 경쇄, IgA 분자, IgD 분자, IgE 분자, IgM 분자, 당단백질, 성장 인자, 사이토카인, 인터페론, 인터류킨, 호르몬, 응고(또는 응집) 인자, 혈액 성분, 효소, 식품의약품 단백질, 백신, 임의의 상기한 것의 작용성 단편 또는 작용성 변이체, 또는 임의의 상기한 단백질 및/또는 이들의 작용성 단편 또는 변이체를 포함하는 융합 단백질일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
재조합 단백질을 생산하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 추가의 교시가 상기 아우수벨 등의 문헌에 제공된다. 일반적으로, 재조합 단백질은 외인성으로 도입된 핵산으로부터 발현된다. 상기 섹션 (Ⅰ)(a)에 기재된 바대로, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 과잉염색체일 수 있거나, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 게놈에 통합될 수 있다.
재조합 단백질이 발현되도록 세포주를 배양하는 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 적절한 배지 및 배양 시스템이 당해 분야에 공지되어 있고 상업적으로 구입 가능하다. 일 실시양태에서, 혈청 비함유 현탁 배양을 통해 본 명세서에 개시된 세포주에 의해 재조합 단백질을 생산한다.
정의
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자가 통상 이해하는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 당업자에게 본 발명에 사용되는 많은 용어의 일반적 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본 명세서에 사용되는 바대로, 하기 용어는 달리 기재되지 않은 한 이에 부여된 의미를 갖는다.
본 개시내용의 구성요소 또는 이의 바람직한 실시양태(들)를 소개할 때, 단수 용어, 지시어 및 "상기"는 하나 이상의 구성요소가 있다는 것을 의미하기 위해 의도된다. 용어 "포함하는", "함유하는" 및 "갖는"은 포괄적으로 의도되고 기재된 구성요소 이외의 추가의 구성요소가 존재할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "내생 서열"은 세포에 자연 존재하는 염색체 서열을 의미한다.
용어 "외인성 서열"은 세포에 자연 존재하지 않는 염색체 서열, 또는 자연 위치가 다른 염색체 위치에 있는 염색체 서열을 의미한다.
용어 "편집", "게놈 편집" 또는 "염색체 편집"은 특이적 염색체 서열이 변하는 과정을 의미한다. 편집된 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "유전자"는 유전자 생산물을 코딩하는 DNA 부위(엑손및 인트론 포함) 및, 이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사 서열에 인접하든 인접하지 않든, 유전자 생산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 부위를 의미한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 인설레이터(insulator), 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위, 및 유전좌위 조절 부위를 포함하지만, 반드시 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "이종"은 관심 대상의 세포 또는 종에 자연 존재하지 않는 집합체를 의미한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 선형 또는 원형 입체형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이 용어는 중합체의 길이와 관련하여 제한으로 해석되어서는 안 된다. 상기 용어는 중성 뉴클레오타이드, 및 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(예를 들면, 포스포로티오에이트 골격)에서 변형된 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정한 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 갖고; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍이다.
용어 "뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 의미한다. 뉴클레오타이드는 표준 뉴클레오타이드(즉, 아데노신, 구아노신, 사이티딘, 티미딘 및 우리딘) 또는 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. 뉴클레오타이드 유사체는 천연 뉴클레오타이드(예를 들면, 이노신) 또는 비천연 뉴클레오타이드일 수 있다. 뉴클레오타이드의 당 또는 염기 모이어티에서의 변형의 비제한적인 예는 아세틸 기, 아미노 기, 카복실 기, 카복시메틸 기, 하이드록실 기, 메틸 기, 포스포릴 기 및 티올 기의 첨가(또는 제거) 및 염기의 탄소 및 질소 원자의 다른 원자에 의한 치환(예를 들면, 7-데아자 퓨린)을 포함한다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 다이데옥시 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA), 펩타이드 핵산(PNA) 및 모폴리노를 포함한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교환되어 사용되어 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다.
용어 "재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전 정보의 교환 과정을 의미한다. 이 개시내용의 목적을 위해, "상동성 재조합"은 예를 들면 세포에서 이중 가닥 절단의 보수 동안 일어나는 이러한 교환의 특수 형태를 의미한다. 이 과정은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 유사성을 요하고, "표적" 분자의 주형 보수에 "도너" 또는 "교환" 분자(즉, 이중 가닥 절단을 경험한 것)를 사용하고, 이것이 도너로부터 표적으로 유전 정보를 전달하므로 "비교차 유전자 전환(non-crossover gene conversion)" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환(short tract gene conversion)"으로 다양하게 공지되어 있다. 임의의 특정 이론에 구속됨이 없이, 이러한 전달은 절단된 표적과 도너 사이에 형성되는 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 보정 및/또는 "합성 의존 가닥 어닐링"(표적의 일부가 되는 유전 정보를 재합성하기 위해 도너가 사용됨) 및/또는 관련 과정을 포함할 수 있다. 이러한 특수 상동성 재조합은 대개 표적 분자의 서열을 교대시켜 도너 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오타이드에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 인식, 결합 및 분할하도록 표적화 엔도뉴클레아제가 조작되는, 편집하고자 하는, 염색체 서열의 부분을 한정하는 핵산 서열을 의미한다.
용어 "상류" 및 "하류"는 고정 위치에 대한 핵산 서열의 위치를 의미한다. 상류는 위치에 있어 5'인 부위(즉, 가닥의 5' 말단 근처)를 의미하고, 하류는 위치에 있어 3'인 부위(즉, 가닥의 3' 말단 근처)를 의미한다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고/하거나 이렇게 코딩된 아미노산 서열을 결정하는 단계 및 이 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 이러한 방식으로 게놈 서열을 또한 결정하고 비교할 수 있다. 일반적으로, 동일성은 각각 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 정확한 뉴클레오타이드 대 뉴클레오타이드 또는 아미노산 대 아미노산 관련성을 의미한다. 이의 동일성(%)을 결정하여 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)을 비교할 수 있다. 2개의 서열의 동일성(%)은, 핵산이든 또는 아미노산 서열이든, 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열에 대한 근사 정렬은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 데이호프, 아틀라스(Dayhoff, Atlas)에 의해 개발된 점수 매트릭스[Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and normalized by Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성(%)을 결정하기 위한 이 알고리즘의 예시적인 실행이 "BestFit" 유틸리티 어플리케이션에서 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(미국 위스콘신주 매디슨)에 의해 제공된다. 서열 사이의 동일성(%) 또는 유사성(%)을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램이 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 다른 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들면, 하기 디폴트 매개변수를 시용하여 BLASTN 및 BLASTP를 사용할 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 무; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 디스크립션스 = 50 서열; 분류 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비과구동(non-redundant), GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. 이 프로그램의 상세내용은 진뱅크(GenBank) 웹사이트에서 확인할 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열과 관련하여, 서열 동일성의 원하는 정도의 범위는 대략 80% 내지 100% 및 이 사이의 임의의 정수 값이다. 통상적으로, 서열 사이의 동일성(%)은 적어도 70 내지 75%, 바람직하게는 80 내지 82%, 더 바람직하게는 85 내지 90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성이다.
본 발명의 범위를 벗어남이 없이 상기 기재된 세포 및 방법에 다양한 변화가 이루어질 수 있으므로, 상기 설명 및 하기 제공된 예에 포함된 모든 대상은 예시로서 해석되고 제한 의미가 아닌 것으로 의도된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정한 양태를 예시한 것이다.
실시예 1: CHO 세포는 Ggta1 유전자를 포함한다
CHO K1 세포에서 Ggta1 유전자의 존재를 확인하기 위해, Ggta1 유전자의 8 및 9 엑손 부위를 증폭하도록 프라이머를 설계하였다. 한쌍의 프라이머를 사용하여 쥐과 골수종 NS0 및 CHO K1 세포로부터의 DNA를 PCR 증폭하였다. 약 300bp의 예상된 크기의 밴드가 NS0 및 CHO 세포 둘 다에서 검출되었다. CHO 세포로부터 단리된 PCR 단편을 서열분석하고 마우스 Ggta1 유전자(UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 P23336호)와 정렬하였다. 서열 동일성은 대략 85%였다.
마우스 세포에 대해 CHO 세포에서 mRNA 발현을 평가하기 위해 정량적 PCR을 사용하였다. 액틴을 사용하여 정규화한 후, 마우스 NS0 세포와 CHO 세포 사이의 역치 주기(threshold cycle: Ct) 값의 비교는 Ggta1 발현이 NS0 세포에서보다 CHO 세포에서 상당히 감소한다는 것을 제시한다.
실시예 2: 불활화 Ggta1 유전좌위를 포함하는 CHO 세포의 생산
CHO 세포에서 Ggta1 유전자의 9 엑손 내의 부위를 표적화하기 위해 한쌍의 ZFN을 설계하였다. Ggta1 서열을 독점적 전사체 서열로부터 얻고 RT-PCR을 이용하여 검증하였다. 유전자를 표적화하는 ZFN을 독점적 알고리즘을 이용하여 설계하고, 이후 시험하였다. 실험실내 전사 및 mRNA 폴리-아데닐화 및 캡핑을 캄포제트알(CompoZr)(등록상표) 넛아웃 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 제품 정보에 기재된 바대로 ZFN 플라스미드 DNA로부터 생산하였다. 간단히 말하면, 플라스미드 ZFN DNA를 선형화하고, 페놀/클로로포름 DNA 추출을 통해 정제하였다. 선형화된 DNA를 캡핑하기 위해 메시지맥스(MessageMax)(상표명) T7 ARCA 캡트 메시지 전사 키트(Cell Script Inc.)를 사용하였다. 폴리(A) 꼬리를 첨가하기 위해 폴리(A) 폴리머라제 테일링 키트(Poly(A) Polymerase Tailing Kit)(EpiCenter)를 사용하였다. 메가클리어(MEGAclear)(상표명) kit(Ambion)를 사용하여 ZFN mRNA을 정제하였다.
재조합 항광견병 인간 IgG를 발현하는 CHOZN (gs -/-) 세포주를 사용하였다. 달리 기재되지 않은 한, 사용된 모든 세포 배양 배지, 보충제 및 다른 시약을 시그마-알드리히로부터 구입하였다. 형질전환 전에, 세포를 6mM L-글루타민이 보충된 엑스-셀(EX-CELL)(등록상표) CHO CD 퓨전(시그마-알드리히)에서 현탁 배양액으로서 유지시켰다. 형질전환 하루 전에 세포를 생물반응기 관 내에서 0.5×106개의 세포/㎖로 시딩하였다. 각각의 형질전환을 위해, 150㎕의 성장 배지 내에 1×106개의 세포 및 각각의 ZFN mRNA 5㎍을 사용하였다. 0.2㎝ 큐벳트 내에서 140V 및 950μF에서 전기천공에 의해 형질전환을 수행하였다. 6웰 플레이트 정지 배양에서 2㎖의 성장 배지 내에 전기천공된 세포를 위치시켰다. 대조군 세포를 거짓 형질감염시켰다.
형질전환 3일 및 10일 후, 세포를 배양액으로부터 제거하고, 게놈 DNA를 시그마-알드리히 진일루트 포유동물 게놈 DNA 미니프렙 키트(Sigma-Aldrich GeneElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit)를 사용하여 단리하였다. 캄포제트알(등록상표) 넛아웃 ZFN 제품 정보에 기재된 바대로 Cel-1 뉴클레아제 검정을 이용하여 ZFN 유도 분할을 검증하였다. 전에 기재된 바대로(Miller JC et al., Nat. Biotechnol. 2007, 25:778-785) ZFN 매개 유전자 돌연변이의 효율을 측정하기 위해 이 검정을 수행하였다. 이 검정은 ZFN 유도 DNA 이중 가닥 절단의 비상동 말단 결합(NHEJ) 매개 불완전 보수의 결과로서 야생형으로부터 유도된 표적화된 유전좌위의 대립유전자를 검출한다. ZFN 치료 세포의 풀로부터의 표적화된 부위의 PCR 증폭은 야생형(WT) 암플리콘과 돌연변이체 암플리콘의 혼합물을 생산시켰다. 이 혼합물의 용융 및 재어닐링은 WT 대립유전자와 돌연변이체 대립유전자의 헤테로듀플렉스 사이에 형성되는 미스매치를 발생시켰다. 미스매치 부위에서 형성된 DNA "버블"이 전달자 뉴클레아제 Cel-1에 의해 분할되고, 분할 생산물은 겔 전기영동에 의해 분해될 수 있다. 도 1에 도시된 바대로, 약 215bp 및 100bp의 2개의 단편이 ZFN 형질감염된 세포(1 레인 및 2 레임)에 존재할 수 있지만 거짓 형질감염된 대조군 세포에서는 부재하였다.
실시예 3: Ggta1 넛아웃 세포의 단일 세포 클로닝 및 유전자형 분석
Cel1 검정을 이용하여 ZFN 활성을 확인하기 위해, 한계 희석을 이용하여 Ggta1 ZFN 형질감염된 세포를 단일 세포 클로닝하였다. 이를 위해, 80% CHO 혈청 비함유 클로닝 배지, 20% 조건 배지 및 4mM L-글루타민의 혼합물을 사용하여 세포를 0.5개의 세포/웰로 평판 배양하였다. 평판 배양 7일 및 14일 후 클론성 및 성장을 각각 현미경으로 검정하였다. 성장하는 클론을 확장시키고 PCR 및 서열분석으로 유전자형 분석하였다. 하기 표 1에 기재된 바대로 다양한 길이의 결실을 갖는 1개의 Ggta1 (-/-) 및 4개의 Ggta1 (+/-) 클론을 단리하였다. 모든 세포주는 이들이 유도된 모 세포주와 유사한 성장 특징을 나타냈다.
Figure pct00001
실시예 4: 불활화 Cmah 유전좌위를 포함하는 CHO 세포의 생산
CHO 세포(UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 Q9WV23호; 중국 햄스터)에서 Cmah 유전좌위의 5 엑손 내의 부위를 표적화하기 위해 한쌍의 ZFN을 설계하였다. CHO K1 세포주를 실시예 2에 기재된 것과 유사한 표준 절차 및 방법을 이용하여 ZFN을 코딩하는 20㎍의 RNA로 형질감염시켰다. 대조군 세포를 GFP를 코딩하는 RNA로 형질감염시켰다.
Cel-1 뉴클레아제 검정을 이용하여 ZFN 유도 이중 가닥 염색체 절단의 효율을 결정하였다. 도 2에 도시된 바대로, Cmah ZFN은 CHO 세포에서 Cmah 표적을 분할하였다. 모 밴드의 상대 강도에 대한 분할 생산물의 상대 강도를 비교하여 ZFN 매개 분할의 빈도를 추정할 수 있다. 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어에 의해 분할 빈도가 약 11%인 것으로 계산되었다.
실시예 5: Cmah 넛아웃 세포의 단일 세포 클로닝 및 유전자형 분석
Cmah ZFN 형질감염된 세포는 (상기 기재된 바의) 제한희석 또는 형광 활성 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting: FACS)를 이용하여 클로닝된 단일 세포였다. 성장하는 클론을 확장시키고 PCR 및 서열분석으로 유전자형 분석하였다. 유전자형 분석은 이러한 작업 회차로부터의 모든 20개의 클론이 다양한 길이의 결실 및 삽입을 갖는 Cmah (+/-)라는 것을 나타낸다. 이후, 7개의 Cmah (+/-) 클론을 풀에 넣고, Cmah ZFN RNA로 재형질감염시키고, 한계 희석에 의해 단일 세포 클로닝하였다. 이러한 2회 작업으로부터의 6개의 클론은 PCR 및 서열분석에 의해 Cmah (-/-)인 것으로 검증되었다. 불활화 Cmah 유전좌위는 다양한 길이의 결실 및 삽입을 가졌다(표 2 참조). 이러한 Cmah 양쪽 대립유전자 넛아웃 세포주의 유전자형이 또한 표 2에 기재되어 있다. 모든 세포주는 이들이 유도된 모 세포주와 유사한 성장 특징을 나타냈다.
Figure pct00002
실시예 6: Cmah/Ggta1 이중 넛아웃 세포의 생산
확인된 Cmah (-/-) 유전자형(즉, AB2)을 갖는 클론 세포주를 필수적으로 상기 실시예 2에 기재된 바대로 ZFN 표적화 Ggta1로 형질감염시켰다. Cel-1 뉴클레아제 검정을 이용하여 ZFN 활성을 확인하였다. 도 3에 도시된 바대로, 분할 생산물은 ZFN 형질감염된 세포에서 검출되었지만, 거짓 형질감염된 세포에서 검출되지 않았다.
필수적으로 상기 실시예 3에 기재된 바대로 한계 희석을 이용하여 세포를 단일 세포 클로닝하였다. 192개의 클론에서 네스티드 PCR을 수행하고, 26개의 클론이 PCR 생산물의 크기에 기초하여 잠재적 이중 넛아웃 클론으로 확인되었다. 게놈 DNA를 잠재적 이중 넛아웃 클론으로부터 단리하고, PCR 증폭하고, 서열분석하였다. 4개의 클론은 2x 서열 피복률을 갖고, 이는 Cmah 넛아웃 배경에서 Ggta1의 양쪽 대립유전자 결실을 확인시켜준다. 표 3은 Cmah (-/-)/Ggta1 (-/-) 이중 넛아웃 클론의 유전자형을 제시한다.
Figure pct00003

Claims (33)

  1. 인간형 글라이코실화 패턴을 갖는 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제(Cmah) 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제-1(Ggta1)이 결핍된 비인간 포유동물 세포주에서 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열 및/또는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함하고, 상기 세포는 감소된 양의 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산하는 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍되지 않은 필적하는 세포주에 의해 생산된 동일한 재조합 단백질과 비교하여 감소된 함량의 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 잔기 및/또는 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파-Gal) 잔기를 갖는 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 Cmah 및/또는 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피(copy)는 불활화되고, 상기 세포주는 Cmah 및/또는 Ggta1을 생산하지 않는 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 N-글라이콜릴뉴라민산/또는(Neu5Gc) 잔기 및 갈락토스-알파-1,3-갈락토스(알파-Gal) 잔기가 결여된 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Cmah 및/또는 Ggta1이 결핍되지 않은 필적하는 세포주에 의해 생산된 동일한 재조합 단백질과 비교하여 적어도 하나의 개선된 특성을 갖는 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 개선된 특성은 면역원성 감소, 생체이용률 증가, 효율 증가, 안정성 증가, 용해도 증가, 반감기 개선, 청소률 개선 및 약동학 개선으로부터 선택되는 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항체, 항체 단편, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및 응고 인자로부터 선택되는 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주인 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 CHO 세포주이고, 상기 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되며, 상기 세포주는 Cmah를 생산하지 않고, 상기 재조합 단백질은 Neu5Gc 잔기가 결여된 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 CHO 세포주이고, 상기 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되며, 상기 세포주는 Ggta1을 생산하지 않고, 상기 재조합 단백질은 알파-Gal 잔기가 결여된 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 CHO 세포주이고, 상기 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피 및 상기 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되며, 상기 세포주는 Cmah 또는 Ggta1을 생산하지 않고, 상기 재조합 단백질은 Neu5Gc 및 알파-Gal 잔기가 결여된 것인, 재조합 단백질을 제조하는 방법.
  13. 사이티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 하이드록실라제(Cmah)가 결핍된 비인간 포유동물 세포주.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포주는 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 염색체 서열은 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 불활화된 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  17. 제16항에 있어서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease)인 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 외인성으로 도입된 서열을 포함하지 않는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 단일대립유전자성(monoallelic)이고, 상기 세포주는 감소된 양의 Cmah를 생산하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  20. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cmah를 코딩하는 불활화 염색체 서열은 양쪽 대립유전자성(biallelic)이고, 상기 세포주는 Cmah를 생산하지 않는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 감소된 함량의 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 잔기를 갖거나 이를 갖지 않는 적어도 하나의 단백질을 생산하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제-1(Ggta1)이 추가로 결핍된 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포주는 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열을 포함하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  24. 제23항에 있어서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 염색체 서열은 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 불활화된 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  26. 제25항에 있어서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제인 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 외인성으로 도입된 서열을 포함하지 않는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 단일대립유전자성이고, 상기 세포주는 감소된 양의 Ggta1을 생산하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  29. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ggta1을 코딩하는 불활화 염색체 서열은 양쪽 대립유전자성이고, 상기 세포주는 Ggta1을 생산하지 않는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 감소된 함량의 N-글라이콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 잔기를 갖거나 이를 갖지 않는 적어도 하나의 단백질을 생산하는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  31. 제13항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주인 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  32. 제13항에 있어서, 상기 세포주는 CHO 세포주이고, 상기 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되며, 상기 세포주는 Cmah를 생산하지 않는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
  33. 제22항에 있어서, 상기 세포주는 CHO 세포주이고, 상기 Cmah를 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피 및 상기 Ggta1을 코딩하는 염색체 서열의 모든 카피는 불활화되며, 상기 세포주는 Cmah 또는 Ggta1을 생산하지 않는 것인, 비인간 포유동물 세포주.
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