JP4808542B2 - 糖鎖異性体を分離同定する質量分析法 - Google Patents

Description

本発明は、糖鎖異性体を分離同定する質量分析法に関し、さらに詳しくは、酵素反応を用い、糖鎖異性体の混合物を用いてそれぞれの糖鎖異性体を分離同定する質量分析法に関するものである。

「質量分析法」とは、分子を含む試料をイオン化し、イオン化した分子を質量／電荷（以下、「ｍ／ｚ」と略記する）に従って分離し検出することによって構造情報を得る方法であり、近年、生体高分子の解析にも応用されつつある。

ペプチドやタンパク質の一次構造は質量分析を駆使することによって容易に判明しプロテオミクスがさかんである。しかし、糖、糖鎖、タンパク質（ペプチドを含む）や脂質等に結合した糖鎖は、分子量および組成が同一の単糖が複数存在したり、配列が同じでも結合の異なる異性体が存在したりするので、アミノ酸配列を推定する手法を糖鎖の構造解析にそのまま応用できない。さらに、糖鎖の構造異性体は多数存在するので、生体試料中の微量な個々の異性体を単離することはきわめて難しい。

非特許文献１〜２には、生体試料中の糖鎖の構造異性体を分離する方法が記載されてはいるが、様々な分離操作を組み合わせるため時間がかかり、また試料量が多く必要であり、さらにあるものは完全に単離できず混合物のままであるという問題があった。従って、かかる公知技術では不十分であり、さらなる技術が望まれていた。

Amano J., et.al. J. Biol. Chem., 266, 11461-11477 (1991) Amano J., et al., Glycoconjugate J., 2, 121-135 (1985)

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、糖鎖の異性体混合物を用い、その混合物中の各糖鎖異性体を分離同定し、その構造情報をより簡便かつ迅速に得ることができる質量分析法を提供することである。

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、糖鎖の異性体混合物中の個々の異性体に特異的に酵素反応を行うことによって、分子量を変化させ、分離操作を行うことなく混合物のまま質量分析を可能にできることを見いだした。さらに、試料中の異性体または個々の異性体より新しく生じた分子を選択してＭＳ^ｎ（ｎは自然数）解析等によって構造を同定することによって、各異性体の構造情報をより簡便かつ迅速に得ることができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、糖鎖異性体の混合物を用いてそれぞれの糖鎖異性体を分離同定する質量分析法であって、
（１）糖鎖異性体の混合物に対し、酵素の基質となる糖鎖異性体のみが別の分子量をもつ分子に変化し、酵素の基質にならない糖鎖異性体は別の分子量をもつ分子に変化しない、又は酵素の基質となる糖鎖異性体が複数存在して酵素反応を受けて分子量が変化する部位の個数がそれぞれ異なる、といった基質特異性が判明している酵素反応を行って、酵素反応を受けた糖鎖異性体と酵素反応を受けなかった糖鎖異性体の混合物、又は酵素反応を受けた部位の個数がそれぞれ異なり分子量も異なる糖鎖異性体の混合物を得る工程、
（２）酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、および、最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程、
（３）酵素反応を受けた糖鎖からのｍ／ｚと、酵素反応を受けなかった糖鎖からのｍ／ｚとを、又は酵素反応を受けた部位の個数が異なり分子量も異なる複数の糖鎖からのｍ／ｚを、検出する工程、
を含むことを特徴とする質量分析法を提供するものである。

また、酵素反応に用いる酵素が、糖分解酵素、糖転移酵素、スルファターゼ、スルフォトランスフェラーゼまたはホスファターゼである上記の質量分析法を提供するものである。

また、本発明は、酵素反応の少なくとも１回が同位体構成糖を付加する酵素反応である上記の質量分析法を提供するものである。

また、本発明は、上記の質量分析法によって得られた情報を搭載したデータベースを提供するものである。

本発明によると、糖鎖の異性体混合物を含む試料に酵素反応を行うことによって個々の異性体から異なる分子を生成させ、それぞれの分子のＭＳ^ｎ解析を行うことで元の異性体構造を決定し、単離精製することなく、含有する個々の異性体の構造情報を容易に得ることができる。また、本発明によると、分離操作をすることなく、生体試料由来の微量な糖鎖異性体混合物の糖鎖構造が判明するので、糖タンパク質等の糖鎖を含有する物質の機能解明や、さらには病態の解明に有用な情報を得ることができる。

本発明は、糖鎖異性体の混合物を用いてそれぞれの糖鎖異性体を分離同定する質量分析法である。糖鎖の異性体混合物を含む試料にそのまま酵素反応を行うことで、その酵素の基質となる異性体のみが別の分子量をもつ分子に変化するため、変化しなかった異性体との識別、すなわち分離同定が可能となり、それぞれの分子のＭＳ^ｎ解析を行うことができるようになることに基づいている。ここで、「ＭＳ^ｎ解析」とは、ＭＳ、ＭＳ^２（ＭＳ／ＭＳ）、ＭＳ^３、ＭＳ^４等の質量分析を意味する。すなわちｎは自然数を意味し、ｎ＝１の場合も含めて「ＭＳ^ｎ解析」という。

糖鎖は、構成糖が直鎖状または分岐して結合したものである。例えば、糖タンパク質糖鎖の構成糖として、グルコース、ガラクトース、マンノース等があるが、これらは全てヘキソースで分子量は１８０である。また、アミノ糖としてＮ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラクトサミン等も含まれるが、これらの分子量は２２１と同一である。このように、構成糖自身が多くの異性体を持つので、糖組成が異なる異性体が存在する。また、一分子中に結合部位が複数存在するので、糖組成が同一でも結合様式が異なった異性体が数多く存在する。

質量測定のみではこれらの糖鎖異性体の識別は不可能であるが、近年、ＭＳ^ｎ解析を行うことによって、配列や結合様式が異なる異性体を、マススペクトルのプロダクトイオンの種類および相対量等を標準糖鎖と比較することによって識別することが行われつつある。

しかしながら、単離された個々の糖鎖異性体の質量分析を行い、互いのマススペクトルを比較して識別することは当然のことながら行われていたが、分離同定の目的で、異性体の混合物試料をそのまま質量分析することはなかった。

また、例えば、１つの糖タンパク質として分離精製できたとしても、分離精製した糖タンパク質に、たった一種類の糖鎖異性体が結合していることはまれであり、また、糖タンパク質から糖鎖を遊離して糖鎖異性体を単離精製することも、微量生体試料等を用いる場合極めて困難である。

本発明は、糖鎖異性体の混合物を用いて、それぞれの糖鎖異性体を分離同定する質量分析法であって、（１）糖鎖異性体の混合物に対し、基質特異性が判明している酵素反応を行う工程、（２）酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、および、最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程、（３）酵素反応を受けたり受けなかったりした糖鎖のｍ／ｚを検出する工程、を含むことを特徴とする。本発明によれば、糖鎖異性体の混合物を用いて、酵素反応を行うことによって、微量生体試料等を用いる場合であっても、糖鎖異性体の混合物中に含まれるそれぞれの糖鎖異性体を同定できる。

＜工程（１）について＞
「基質特異性が判明している酵素反応」とは、糖鎖の特定の結合のみを切断したり、糖鎖の特定の構成糖のみに反応させたり、構成糖の特定の位置に結合させたりする酵素反応を言う。

「糖鎖異性体の混合物」とは、少なくとも２以上の異性体糖鎖を含有するものを言い、「糖鎖異性体」には、既に酵素反応（工程（１））を行った糖鎖異性体をも含むものとする。すなわち、「糖鎖異性体の混合物」とは、前段階の糖鎖異性体の混合物に対し、基質特異性が判明している酵素反応を行って、酵素反応を受けずに残った糖鎖異性体の混合物だけでなく、酵素反応を受けた結果新たに生じた糖鎖異性体の混合物をも指すものとする。つまり、工程（１）は１回だけでもよいが、複数回繰り返し行われる場合も本発明に含まれる。そのとき、続けて同じ基質特異性を有する酵素反応は行わず、直前の酵素反応とは別の基質特異性であることが判明している酵素反応を行うことが好ましい。

酵素反応の操作は特に限定されず、基質特異性が判明している公知の酵素を用いて、常法に従って行われる。

「酵素反応を行う」とは上記の操作を行うことを意味し、糖鎖が酵素反応を受ける場合と受けない場合の両方を含む。すなわち、酵素反応を行うことによって、糖鎖異性体の混合物中の、ある糖鎖は酵素反応を受け、また、他の糖鎖は酵素反応を受けない。また、一般には酵素反応後は反応液を煮沸したり、膜でろ過して酵素タンパク質を除いたりして反応を停止させる。その後、工程（１）の別の酵素反応を行ったり、工程（２）に進む。

本発明に用いられる、「基質特異性が判明している酵素」については後で詳述するが、糖分解酵素、糖転移酵素、スルファターゼ、スルフォトランスフェラーゼ、ホスファターゼ等が好ましいものとして挙げられる。糖転移酵素の場合、糖供与体としてＵＤＰ−［^１３Ｃ_６］−ガラクトース等の同位体元素を有しているものを用いることも好ましい。また、これらの酵素のうちのある酵素反応を行い、引き続き別の酵素反応を行うことによって工程（１）が２回以上繰り返されることも好ましい。例えば糖分解酵素等の酵素反応を行い、引き続き糖供与体としてＵＤＰ−［^１３Ｃ_６］等の同位体元素を有しているものを用いる糖転移酵素反応を行うことも好ましい。

＜工程（２）について＞
工程（２）は、酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、および最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程である。

ここで、「質量分析法」とは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、レーザー脱離（ＬＤ）法、高速電子衝撃（ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学（ＡＰＣＩ）法等のイオン化方法によって分子を含む試料をイオン化し、次いで、飛行時間法（タイムオブフライト法、ＴＯＦ法）、二重収束法、四重極集束法等を用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記する）に従って分離し検出する方法である。

本発明においてイオン化法は特に限定されないが、好ましくはＥＳＩ法またはＭＡＬＤＩ法であり、より好ましくはＭＡＬＤＩ法である。

また、質量分析は、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ^３等のＭＳ^ｎ解析をすることにより行われる。

酵素反応を行っていない糖鎖異性体の混合物および酵素反応を行った後の反応物を質量分析する。酵素反応を行っていない糖鎖異性体の混合物の質量分析は、酵素反応を行う前に行ってもよい。ここで、工程（１）が２回以上行われる場合は、その酵素反応物毎に質量分析を行ってもよい。すなわち、「糖鎖異性体の混合物」が、既に工程（１）を行って得た糖鎖異性体の混合物である場合は、酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、酵素反応を１回行った酵素反応物、酵素反応を２回行った酵素反応物のそれぞれについて質量分析を行う。３回以上酵素反応を行った場合も同様である。すなわち、これは、本発明の工程（１）、（２）及び（３）を、２回以上繰り返すことを意味する。

または、酵素反応を２回以上引き続いて行い、最後の酵素反応後に質量分析を行ってもよい。酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物と、最終の酵素反応を行った後の反応物の計２回のみ質量分析することが、生体試料等のように試料が微量の場合に、糖鎖異性体の混合物（試料）の消費をできるだけ防止する上で好ましい。適切な酵素を用いることによって、混合物（試料）の消費を防ぎつつ、糖鎖異性体の分離同定が可能である。

＜工程（３）について＞
工程（３）は、酵素反応を受けなかった糖鎖のｍ／ｚ、および／または、酵素反応を受けた糖鎖のｍ／ｚを検出する工程である。基質特異性が判明している特定の酵素を用いたときに、所定のｍ／ｚにピークが現れたか否かで、結合している構成糖の種類（例えば、ガラクトースなのかグルコースなのか等）、特定の糖鎖の結合の種類（アルファ結合なのかベータ結合なのか）、特定の糖鎖の結合場所（Ｃ３位なのかＣ４位なのか等）等が分かり、糖鎖異性体を個々に同定できる。また、酵素反応を繰り返すことによって個々の段階の情報をくみあわせることによって、個々の異性体糖鎖中の構成糖の配列と結合部位が判明する。

工程（１）で酵素反応が引き続いて２回以上行われる場合は、工程（３）は、そのうちのいくつかの酵素反応を受けたり受けなかったりした糖鎖のｍ／ｚを検出する工程であり、常法に従い質量分析スペクトルから糖鎖のｍ／ｚを検出する。

以下に、具体的物質等について説明するが、本発明は以下の具体的物質や具体的態様だけに限定されるわけではない。

＜本発明の質量分析法の対象となる糖鎖異性体＞
本発明の質量分析法の対象となる糖鎖としては、分子量の等しい構成糖を有するものが前記の理由で好ましい。例えば、（糖タンパク質の）糖鎖の構成糖として、グルコース、ガラクトース、マンノース等の分子量１８０のヘキソースを有するもの；Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン等の分子量２２１のアミノ糖を有するもの；グルクロン酸、ガラクツロン酸等の分子量１９４のウロン酸等が挙げられる。当然のことながら、これらの構成糖を質量測定だけでは区別ができない。

また、基質特異性が判明している酵素で酵素反応させることによって、結合している構成糖の種類（ガラクトースなのかグルコースなのか等）、特定の糖鎖の結合の種類（アルファ結合なのかベータ結合なのか）、特定の糖鎖の結合場所（Ｃ３位なのかＣ４位なのか等）等が分かり、質量測定だけでは判明しない糖鎖異性体の特定の構造、結合を識別できる。

質量測定だけでは判明しないが本発明で識別できるものとしては、構成糖の種類が同一であるが、結合が異なる異性体が挙げられる。具体的には、例えば、「Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ」（以下、「タイプ１結合」と略記する）と「Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ」（以下、「タイプ２結合」と略記する）の識別；「Ｈ抗原構造Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ」、「ルイスａ抗原構造Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ」および「ルイスｘ抗原構造Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ」等の異性体構造の識別；「ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ」と「ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ」の識別；「Siaα２−３Ｇａｌ」と「Siaα２−６Ｇａｌ」の識別等、生物機能発現に関連する重要な異性体の識別が好ましいものとして挙げられる。このような糖鎖異性体の識別が可能になると、標準糖鎖の確保、生物機能解明や疾患の診断等に有用である。

異性体混合物を質量分析（ＭＳ^ｎ解析（１≦ｎ））することによって、特異的なプロダクトイオンが検出され、特定の部分構造が存在することが明らかになっても、分岐構造が複数存在するとその組み合わせが複数できるので、それぞれの異性体の全構造は不明の場合がある。そこで、本発明によれば、通常の質量分析では識別できない異性体のうち、ある異性体のみに反応する特異性をもった酵素を用いることで、その異性体だけを別の分子量に変え、質量分析で識別することができる。

＜酵素反応に用いられる酵素＞
本発明の酵素反応に用いられる酵素としては特に限定はないが、糖分解酵素、糖転移酵素、スルファターゼ、スルフォトランスフェラーゼまたはホスファターゼが好ましい。糖分解酵素および糖転移酵素は、糖鎖の合成や分解に関与する酵素で、基質となる糖鎖構造を他の異性体構造と厳密に見分けて反応を行うものである。さらに、糖転移酵素はその反応生成物として特定の異性体を合成することが可能である。

本発明に用いられる糖分解酵素は特に限定されないが、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−シアリダーゼ、α−フコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドα−ガラクトシダーゼ、エンドβ−ガラクトシダーゼ、エンドα−シアリダーゼ、エンドα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、エンドβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、エンドα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドα−マンノシダーゼ、エンドβ−マンノシダーゼ、エンドβ−グルクロニダーゼ、エンドα−グルコシダーゼ、エンドβ−グルコシダーゼ等が挙げられる。

特に好ましくは、β１、４ガラクトシダーゼ、β１、３ガラクトシダーゼ、α１、２フコシダーゼ、α１、３／４フコシダーゼ、α２、３シアリダーゼ、α２、６シアリダーゼまたはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミ二ダーゼである。

また、本発明に用いられる糖転移酵素は特に限定されないが、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−グルクロニルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼ、β−グルコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。

特に好ましくは、β１、４ガラクトシダーゼ反応を行い、さらに糖供与体として安定同位体ＵＤＰ−［^１３Ｃ_６］ガラクトースを用いたＧｌｃＮＡｃ：β１、４ガラクトース転移酵素反応を行うものである。

糖分解酵素、糖転移酵素は糖鎖の合成や分解を行い、基質となる糖鎖構造を他の異性体構造と見分けて反応を行う。さらに、糖転移酵素は特定の異性体を合成する。例えば、β１、４ガラクトシダーゼは、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合（タイプ２結合）を切断するが、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ結合（タイプ１結合）には作用しない。したがって、Ｇａｌβ１−４Ｒ１およびＧａｌβ１−３Ｒ２という２種の糖鎖異性体混合物に、β１、４ガラクトシダーゼを作用させると、切断されて分子量が１６２減少したＲ１、および、切断を受けずにそのままのＧａｌβ１−３Ｒ２の混合物になるので、ＭＳ測定で容易に識別できるようになる。

ＧｌｃＮＡｃ：β１、４ガラクトース転移酵素は、ＵＤＰ−Ｇａｌ存在下でＧｌｃＮＡｃ−Ｒを基質としてＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成するが、ＧａｌＮＡｃ−Ｒを基質とせず、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを合成することもない。そこで、先のＲ１およびＧａｌβ１−３Ｒ２の混合物に、この酵素およびＵＤＰ−［^１３Ｃ_６］−ガラクトースを作用させると、６Ｄa増加した［^１３Ｃ_６］Ｇａｌβ１−４Ｒ１、および、そのままのＧａｌβ１−３Ｒ２の混合物に変化するので、それぞれを区別することが可能になる。このように、酵素の基質特異性および生成物特異性を利用することによって質量を測定しただけでは識別できない異性体を別の分子に変換できる。

この同位体元素の入った分子に変換する利点は、新たに結合した構成糖が糖鎖のどこに結合したのかの目印になることや酵素反応を受けなかった異性体とどの部分が異なるのか等が明確になることである。

＜データベース＞
このようにして質量分析法によって得られた情報はデータベース化することによって、それを使用して、未知の糖鎖異性体の混合物から、特定の糖鎖異性体の存在を同定することができる。データベース化されるデータとしては、酵素の種類、組み合わせおよび反応をかける順序、酵素の糖鎖特異性データ、工程（３）のｍ／ｚ、反応前後で変化するｍ／ｚの差等が挙げられる。かかるデータベースを使用して質量分析する方法も有用であり、かかるデータベースが記録された記録媒体も同様の理由で有用である。

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
＜タイプ２結合の同定＞
互いに分子量および組成式が同一で構造異性体の関係にあるピレン標識ラクト−Ｎ−ヘキサオース（下記式（１）に示す)、および、ピレン標識ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース（下記式（２）に示す)の混合物に、肺炎双球菌由来β１，４ガラクトシダーゼ（１．２ｍＵ）を加え、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）１０μＬ中で、３７℃２０時間反応させた。

［式（１）および式（２）中、ＰＢＨは、１−ピレンブタン酸ヒドラジドを反応させた残基を示す。］

なお、上記「ピレン標識」は以下のように行った。すなわち、試料をねじふた付きガラス反応管に加え乾固させ、５００ｎｍｏｌの１−ピレンブタン酸ヒドラジド（以下、「ＰＢＨ」と略記する）をメタノール２０μＬに溶解して反応管に加え、更に、メタノールで希釈した酢酸（酢酸とメタノールの比は体積比で１：８）２μＬを加えてふたを完全に閉めた。よく撹拌後、８０℃で２０分間加熱し、１ＭのＮａＯＨ水溶液加えて中和した。１．７ＭのＮａＢＨ_４溶液３０μＬを加えて４０℃で３０分間反応させ、更に１．７ＭのＮａＢＨ_４溶液１０μＬを加えて４０℃で３０分間反応させた。

次いで、過剰の試薬を除去するために以下の操作を行った。純水４００μＬ及びクロロホルム４００μＬを加えてよく振った後静置した。下層のクロロホルムを捨て、新しいクロロホルム４００μＬを加えてもう一度抽出した。上層を取り乾固させた。Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｃ_１８カートリッジをメタノール続いて純水で洗浄し、乾固した反応物を純水に溶解してカートリッジに通した。純水でカートリッジを洗浄し、次に、アセトニトリル−純水（体積比６：４）で溶出することによって、ＰＢＨで標識、還元された、上記のピレン標識ラクト−Ｎ−ヘキサオース混合物を得た。

前記の肺炎双球菌由来β１，４ガラクトシダーゼ反応溶液を１００℃で５分処理し、ＵＤＰ−［^１３Ｃ_６］−ガラクトースを１ｎｍｏｌおよびβ１，４ガラクトース転移酵素０．８ｍＵを、２０ｍＭ ＭｎＣｌ_２含有１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）の５μＬ中で、３７℃２０時間反応させた。

２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）をマトリクスとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ社製））によって、ＭＳ分析を行った。

その結果、ガラクトースが１個分の６Ｄa増加した分子より生じた［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ１３６３．８およびガラクトース２個分の１２Ｄa増加した分子より生じた［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ１３６９．８が検出された（図１上）。

タイプ２結合１個を有するラクト−Ｎ−ヘキサオースおよびタイプ２結合２個を有するラクト−Ｎ−ネオヘキサオースを分離操作を行わずにＭＳ測定で識別することができた。

比較例１
ピレン標識ラクト−Ｎ−ヘキサオースおよびラクト−Ｎ−ネオヘキサオースの混合物をＭＳ測定した結果、１種類の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ１３５７．６のみが検出され、区別は不可能であった（図１下）。

実施例２
互いに分子量および組成式が同一で構造異性体の関係にあるdifucosylated decaose ＡおよびＢの２種の混合物が分離同定された例を示す。試料を実施例１と同様にピレン標識し、ＭＳ分析を行うと［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ２３７９．９が検出された。次に、実施例１と同様にβ１，４ガラクトシダーゼ処理を行った後ＭＳ測定を行った。その結果、［Ｍ−Ｈ］⁻イオンとしてｍ／ｚ２３７９．９の他にガラクトース１分子減少したｍ／ｚ２２１７．９が検出された。

また、この試料をβ１，４およびβ１，３結合の両方を切断するガラクトシダーゼ処理を行った後、［Ｍ−Ｈ］⁻イオンとしてｍ／ｚ２２１７．９のみを検出した。したがって、この試料にはタイプ２結合を一個有する異性体およびタイプ１結合を一個有する異性体が含まれることが判った。

実施例３
実施例２で得られたピレン標識糖鎖試料のβ１，４ガラクトシダーゼ処理混合物に、ひきつづき実施例１と同様にＵＤＰ−［^１３Ｃ_６］−ガラクトースを用いてβ１，４ガラクトース転移酵素反応を行い、ＭＳ測定を行った。その結果、［Ｍ−Ｈ］⁻イオンとしてｍ／ｚ２３７９．９の他にｍ／ｚ２３８５．９が検出された。

実施例２と実施例３の結果、タイプ１結合を有する異性体はβ１，４ガラクトシダーゼで切断されないので［Ｍ−Ｈ］⁻イオンとしてｍ／ｚ２３７９．９を示し、タイプ２結合を有する異性体はこれとは異なる［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ２３８５．９に変化するので、ＭＳ上で分離することができた。

実施例４
実施例２で得られたタイプ１結合を有する異性体である［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ２３７９．９を選択したＭＳ／ＭＳ（図２の上のスペクトル）および実施例３で得られた［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ２３７９．９を選択したＭＳ／ＭＳを行った（図２の中のスペクトル）。両者からほぼ同様のスペクトルが得られ、ｍ／ｚ２０１５、１８６９、１１３９、１０９７、６７２、６５４等のプロダクトイオンが得られた。

さらに、ｍ／ｚ１０９７イオンを選択してＭＳ^３解析を行うとｍ／ｚ３６４が生じたこと、ｍ／ｚ２０１５イオンを選択してＭＳ^３解析を行うとｍ／ｚ３２５が生じたことより、下記異性体Ｂで示す構造であることが判明した。

実施例３で得られたタイプ２結合を有する異性体から生じた２３８５．９を選択してＭＳ／ＭＳ解析を行った（図２の下のスペクトル）。その結果、ｍ／ｚ２０６０（２０５４＋６）、１８７６（１８６９＋６）、１１４５（１１３９＋６）、１１０３（１０９７＋６）、７２９、５９２（５８６＋６）等のプロダクトイオンが得られた。

以上の結果およびｍ／ｚ１１０３イオンを選択してＭＳ^３解析を行うとｍ／ｚ３２５が生じたことより、下記異性体Ａで示す構造であることが判明した。

異性体Ａ

異性体Ｂ

比較例２
実施例２のピレン標識混合物に対し、酵素処理をせずに得られた［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ＝２３７９．９を選択してＭＳ／ＭＳ解析を行った（図３）。両異性体からのプロダクトイオンが混在し、それぞれの構造を同定することは困難であった。

本発明の質量分析法は、微量の試料で糖鎖異性体の構造が判明するため、各種解析法の標準糖鎖の確保、生物機能解明や疾患の診断等の分野に広く利用されるものである。そして、これらの情報を搭載したデータベースは、かかる分野に好適に利用できるものである。

実施例１および比較例１において得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルである。 上のスペクトル：実施例１、下のスペクトル：比較例１。 実施例２および実施例３において得られたＭＳ／ＭＳスペクトルである。上は実施例２の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ＝２３７９．９から得られたスペクトルを示し、中は実施例３の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ＝２３７９．９から得られたスペクトルを示し、下は実施例３の［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ＝２３８５．９から得られたスペクトルを示す。 比較例２において［Ｍ−Ｈ］⁻イオンｍ／ｚ＝２３７９．９から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。

Claims (6)

1. 糖鎖異性体の混合物を用いてそれぞれの糖鎖異性体を分離同定する質量分析法であって、
   （１）糖鎖異性体の混合物に対し、酵素の基質となる糖鎖異性体のみが別の分子量をもつ分子に変化し、酵素の基質にならない糖鎖異性体は別の分子量をもつ分子に変化しない、又は酵素の基質となる糖鎖異性体が複数存在して酵素反応を受けて分子量が変化する部位の個数がそれぞれ異なる、といった基質特異性が判明している酵素反応を行って、酵素反応を受けた糖鎖異性体と酵素反応を受けなかった糖鎖異性体の混合物、又は酵素反応を受けた部位の個数がそれぞれ異なり分子量も異なる糖鎖異性体の混合物を得る工程、
   （２）酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、および、最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程、
   （３）酵素反応を受けた糖鎖からのｍ／ｚと、酵素反応を受けなかった糖鎖からのｍ／ｚとを、又は酵素反応を受けた部位の個数が異なり分子量も異なる複数の糖鎖からのｍ／ｚを、検出する工程、
   を含むことを特徴とする質量分析法。
2. 酵素反応に用いる酵素が、糖分解酵素、糖転移酵素、スルファターゼ、スルフォトランスフェラーゼまたはホスファターゼである請求項１に記載の質量分析法。
3. 酵素反応の少なくとも１回が同位体構成糖を付加する酵素反応である請求項１または請求項２に記載の質量分析法。
4. 糖分解酵素が、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−シアリダーゼ、α−フコシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドα−ガラクトシダーゼ、エンドβ−ガラクトシダーゼ、エンドα−シアリダーゼ、エンドα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、エンドβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、エンドα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドα−マンノシダーゼ、エンドβ−マンノシダーゼ、エンドβ−グルクロニダーゼ、エンドα−グルコシダーゼまたはエンドβ−グルコシダーゼである請求項２に記載の質量分析法。
5. 糖転移酵素が、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−グルクロニルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼまたはβ−グルコシルトランスフェラーゼである請求項２に記載の質量分析法。
6. 上記質量分析が、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳ^３である請求項１ないし請求項５の何れかに記載の質量分析法。

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