JP4393270B2 - 質量分析装置および異性体分析方法 - Google Patents

Description

本発明は質量分析装置に係り、特に、マススペクトルデータのデータ処理に関する。

未知の混合試料内に含まれる成分を同定する方法として、クロマトグラフ等の分離手段と質量分析装置を接続し、その結果得られたマススペクトルを既知化合物のマススペクトルを格納したデータベースで検索する方法が広く行われている。マススペクトルのデータベース検索法は、特開平１１−６４２８５号公報（特許文献１），特開２００１−50945号公報（特許文献２），特開平８−１２４５１９号公報（特許文献３），特開２００１−２４９１１４号公報（特許文献４）や米国特許６,６２４,４０８（特許文献５）などに開示されている。

上記分離手段の一つである液体クロマトグラフ（ＬＣ）は、未知の混合試料を分離カラムへ導入して吸着させ、複数の溶媒の混合比を変化させながら分離カラムへ送液し、各化合物と分離カラムとの相互作用の違いによって成分毎に分離する装置である。ＬＣによって分離された試料を質量分析装置（ＭＳ）に連続的に導入し、検出を行う装置が液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）である。ＬＣから試料が溶媒と共に順次ＭＳへ導入されると、イオン源でイオン化されて、その化合物イオンの質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に応じて分離し、検出される。検出結果はＬＣの保持時間毎に蓄積され、保持時間とマススペクトルを持ったクロマトグラムとなる。

混合試料内の各成分は、クロマトグラムにピークとして表示される。このピークが持つマススペクトルをマススペクトルデータベースで検索すると、各ピークが示す化合物の構造が明らかになる。また、クロマトグラムのピーク面積値により、各成分の定量が可能である。

特開平１１−６４２８５号公報 特開２００１−５０９４５号公報 特開平８−１２４５１９号公報 特開２００１−２４９１１４号公報 米国特許６,６２４,４０８

混合試料内の成分をマススペクトルデータベース検索によって正しく同定・定量するためには、ＭＳへ導入する前の分離手段で各成分を単離することが重要である。

しかし、試料中に異性体が含まれる場合、例えば光学異性体同士のように、分離カラムとの相互作用が非常に似た化合物同士の場合、それらを分離することは非常に困難である。仮に、それらの分離が不十分なまま質量分析を行うと、それらは質量数が等しいため、化合物の質量数を基にマスクロマトグラムを描いても、マスクロマトグラム上では区別することが出来ない。そのため、データベース検索を用いて同定する場合には、異性体同士を識別することは不可能であった。上記従来文献においても、異性体に関するデータベースの検索については、何れも考慮されていない。

上記のように、光学異性体が試料に含まれる場合は、分析にあたっては、分離条件の検討に多大な時間が必要であった。また、分離条件の検討は、条件を変えながら試料を測定して分離状態を確かめるため、同一試料を複数回測定する必要があり、試料の消費量が多かった。

本発明は、分離手段での分離が困難で、且つＭＳでも識別不可能な混合化合物においても、その存在比を明らかにすることが可能な質量分析装置および異性体分析方法を提供することを目的としたものである。

上記目的を達成するための本発明の特徴は、試料を成分ごとに分離する分離手段から溶出される試料をイオン化し、任意の質量数のイオンを開裂させ、質量分析するＭＳⁿ 分析を行う質量分析装置において、異性体存在比とマススペクトル内の特定イオン強度比との相関情報が異性体ごとに格納されたデータベースを備えたことである。

上記データベースは、本発明者らが新たに見出した特性が示されたものであり、これを用いることにより、質量数が同じ異性体が試料に含まれていたとしても、異性体の組成
（存在比）を明らかにすることができる。

本発明により、光学異性体同士のように分離手段での分離が困難で、質量分析装置でも識別不可能な混合試料中の異性体比を明らかにすることができる。

また、分離手段で分離せずに異性体の存在比を明確に出来ることから、従来分離条件の検討に要していた時間を大幅に短縮し、かつ試料を節約することができる。

以下、本発明の実施例を説明する。

本実施例では、分析対象試料として糖鎖試料を用いる。図１に、本実施例で用いる糖鎖試料の構造を示す。アナリティカル・バイオケミストリー、１９８８年、１７１号、７３ページ（Anal. Biochem. 1988, 171, pp73）に掲載されている高橋らによる命名法に基づき、これらの糖鎖はそれぞれ２１１.２（図１ａ）及び２１１.３（図１ｂ）と呼ばれる。これらは中央のマンノース（Ｍａｎ）からの分岐鎖が異なる光学異性体同士であるため、双方の質量数は等しい。従って、ＭＳ¹ 分析で検出されるイオンは、共に偽分子イオンｍ／ｚ９６５のみである。

図２に、各糖鎖のＭＳ¹ 分析結果の偽分子イオンｍ／ｚ９６５を親イオンとして、それぞれのＭＳ² 分析を行った結果を示す。２１１.２，２１１.３共に、末端のＦｕｃが脱離したｍ／ｚ８９２のフラグメントイオンと、Ｍａｎからの一つの分岐鎖末端のGlcNAcが脱離したｍ／ｚ１７２５のフラグメントイオンが検出された。この二つのイオンの相対強度は、２１１.２と２１１.３とで異なる。ｍ／ｚ８９２のＦｕｃは各糖鎖異性体の共通部位に結合していたため、２１１.２と２１１.３の双方で脱離傾向はほぼ等しい。一方、ｍ／ｚ１７２５のGlcNAcは、各糖鎖異性体の構造上の相違点である分岐鎖に結合していたため、２１１.２と２１１.３では脱離傾向が異なる。このように、本発明者らは、ｍ／ｚ1725のような各糖鎖異性体の構造上の相違部分に関係するフラグメントイオンは、その異性体特有の強度で検出されることを見出した。

更に、様々な異性体比で混合した２１１.２と２１１.３の混合試料のＭＳ² 分析結果について、ｍ／ｚ８９２のイオン強度でｍ／ｚ１７２５のイオン強度を規格化した値を調べた。その結果、図３のようにイオン強度比と異性体比との間に、直線的な相関があることを見出した。

この関係は、その他の糖鎖異性体でも確認できた。図４に示すように、糖鎖２１０.２と２１０.３ の異性体同士ではｍ／ｚ７９０とｍ／ｚ１５２２の比に、また、図５に示すように、糖鎖２００.２と２００.３の異性体同士ではｍ／ｚ１２８０とｍ／ｚ１３７６との比に、それぞれ異性対比との相関が見られた。

この関係を利用することで、ＬＣ等で分離不十分な異性体がＭＳに導入されたとしても、異性体のそれぞれの組成を、マススペクトルから明らかにすることが可能である。図６に、本実施例で用いる質量分析装置（ＭＳ）の構成を示す。尚、本実施例は、分離手段としてＬＣが接続された液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）の例で説明が、分離手段としては、ＬＣ以外でも、試料を成分毎に分離する装置（例えばガスクロマトグラフなど）であれば良い。

本実施例のＬＣ／ＭＳは、複数の溶媒１，２を選択し、時間と共にそれらの組成を変えて混合しながら送液できる機能を持ったポンプ３と、試料を流路内に導入するサンプルインジェクタ４と、試料を分離するカラム５と、カラム５で分離された試料をイオン化するためのイオン源６と、生成したイオンを質量分離し、かつＭＳⁿ が可能なイオントラップ形の質量分離部７と、質量分離されたイオンを検出する検出器８と、これらを制御するコントローラ９と、データ処理部１０と、それらをつなぐ信号線１１と、測定データや検索結果を表示する表示部１２を備える。

インジェクタ４より流路へ注入された試料は、カラム５で分離され、イオン源６へ導入される。イオン源６でイオン化された試料イオンは、質量分離部７へ導入される。質量分離部７では、試料イオンを質量分離する。また、測定者の設定に従って、任意の質量数のイオンを開裂させ、質量分析を行うＭＳⁿ （ｎ＝２，３，４・・・）分析を順次行う。質量分離されたイオンは検出器８へ送られ、マススペクトルとして検出される。マススペクトルは信号線１１を経てデータ処理部１０へ送られて処理され、表示部１２に表示される。尚、ここでは質量分離部７にイオントラップ形を示したが、ＭＳⁿ 分析を行えるものであれば、それ以外のタイプのものでも構わない。

次に、上記ＬＣ／ＭＳでの分析シーケンスの例について説明する。当該分析シーケンスを図１０に示し、以下これに沿って説明する。

まず、装置の条件設定（ＭＳⁿ 分析の乗数設定など）を行い、設定に基づいた分析を行って試料のマススペクトルを取得する。（Ｓ１，Ｓ２）本実施例では、糖タンパク質であるヒト免疫グロブリンから切り出した糖鎖混合物を分析対象の試料とし、ＭＳ² まで分析を行うものとする。

上記試料をＬＣ／ＭＳで分析した時のベースイオンクロマトグラムと、各ピークのマスクロマトグラムを図７に示す。各成分がＬＣのカラム５により分離され、図７Ａ中のａからｇのピークとして検出された。

この糖鎖混合物には、先に述べた２種類の糖鎖２１１.２及び２１１.３も含まれる。しかし、これらはＬＣのカラム５での分離が困難であり、図７では単一ピークｆに２種の混合物として検出される。またこれらは質量数が等しいため、マスクロマトグラム上でも判別できない。

このピークｆのＭＳ¹ 及びＭＳ² スペクトルを図８に示す。ＭＳ¹には偽分子イオンｍ／ｚ９６５が検出された。このイオンを親イオンとしたＭＳ² スペクトルでは、Ｆｕｃのフラグメントイオンｍ／ｚ８９２とＧｌｃＮＡｃのフラグメントイオンｍ／ｚ１７２５が検出された。

本実施例のデータ処理部１０には、各化合物の標準的なＭＳ² スペクトルが格納されたデータベースと、各化合物の標準的なクロマトグラム保持時間情報（ＧＵインデックス）が格納されたデータベース、及び、先述の異性体組成とマススペクトルの特定イオン強度比との相関情報が異性体ごとに格納されたデータベースとを記憶してある。

そこでデータ処理部１０は、検出した各ピークの保持時間を元に、まず、クロマトグラム保持時間情報データベースから、検出したピーク毎の保持時間に対して一定の範囲内に保持時間を持つ化合物を検索する（Ｓ３）。ここで一定の範囲内の化合物とは、各ピークの保持時間に対して、予め測定者が許容される誤差を考慮して設定した保持時間範囲に入るもの全てとする。異性体が含まれるピークｆに対する検索結果としては、図９に示す
「化合物」に表示された糖鎖２１１.２，糖鎖３１０.２，糖鎖３１０.３，糖鎖２１１.３等がピークｆの保持時間範囲に入る化合物として検索された。

次に、検索した化合物のマススペクトルについて、各ピークのＭＳ² スペクトルと比較し類似化合物の検索を行う（Ｓ４）。具体的には、前述の標準的なＭＳ² スペクトルが格納されたデータベースから、Ｓ３で検索したＭＳ² スペクトルを読み出し、各ピークの
ＭＳ² スペクトルと比較し、類似度を算出する。類似度としては、相関係数やサイン係数を用いる。本実施例では相関係数を用いる。その結果、ピークｆのＭＳ² スペクトルに関しては、図９（Ａ）に示すように、糖鎖２１１.２のスペクトルと０.９４５という高い相関係数を示した。それ以外にも、糖鎖３１０.２と３１０.３がそれぞれ０.８５２と
０.７４３という相関係数で検索結果に表示された。一方、このピークｆに２１１.２と共に含まれている異性体２１１.３は０.５５９と相関係数が低く、マススペクトルの比較ではこの２１１.３が試料中に含まれる可能性は低かった。

続いてデータ処理部１０は、検索した化合物について、再度保持時間情報データベースを検索する（Ｓ５）。すると、ピークｆにおいては、図９（Ｂ）に示されるように、マススペクトル検索結果で最も高い相関を示した２１１.２ には、ＧＵインデックスが等しい異性体２１１.３ が存在すると検索される。これにより、２１１.２と２１１.３はクロマトグラフィーで同時に溶出してくることが判り、ピークｆにはこれら２種類の糖鎖が混在する可能性があることが判る。また、異性体同士であるため、マスクロマトグラム上でも判別不可能であることが判る。尚、異性体を含まない他のピークにおいては、ＧＵインデックスが等しい化合物が存在しないため、改めて異性体無しと判断し、マススペクトルの検索結果を表示部１２に表示して処理を終了する。

ＧＵインデックスが等しい化合物がある場合、データ処理部１０は、それら異性体の存在比についてさらに検証する。図９（Ｃ）に示すように、検索された二種類の糖鎖異性体
２１１.２及び２１１.３について、糖鎖異性体組成とマススペクトルの特定イオン強度比との相関情報データベースを検索する（Ｓ６）。このデータベースには、組成を明らかにしたい二種類の異性体の組み合わせに対応して、強度比を求めるべき二種類のイオンと、それらの強度比と異性体組成との相関が化合物ごとに格納されている。２１１.２ と
２１１.３ の検索によって判明した二種類のイオン（ｍ／ｚ１７２５，ｍ／ｚ８９２）について、ＭＳ²分析結果での強度比を算出すると、この二つのイオンの強度比は０.７３５であった。この値を基に異性体組成を求めると、２１１.２：２１１.３＝８８：１２という異性体比が得られた。

最後に、明らかとなった異性体比を、マススペクトルデータベース検索結果と併せて表示部１２上に表示する。これにより処理を終了する。

上記に示すように、本実施例においては、上記に示す各種データベースを備えることで、ＬＣで分離できなかった異性体も検出することが出来、且つそれらの存在比を明確にすることが可能となる。

本実施例に用いた試料の構造を示した図である。 本実施例に用いた試料のＭＳ² 分析で得られたマススペクトルである。 本実施例で用いた試料の異性体比とマススペクトル内の特定イオンの強度比との相関を示した図である。 糖鎖２１０.２と２１０.３のＭＳ² 分析で得られたマススペクトルと、異性体比とマススペクトル内の特定イオンの強度比との相関を示した図である。 糖鎖２００.２と２００.３のＭＳ² 分析で得られたマススペクトルと、異性体比とマススペクトル内の特定イオンの強度比との相関を示した図である。 本実施例であるＬＣ／ＭＳの概略構成図である。 ヒト免疫グロブリンのＬＣ／ＭＳ分析結果である。 ピークｆのマスクロマトグラム及びマススペクトルである。 本実施例であるデータベース検索結果である。 本実施例の分析シーケンスの例である。

符号の説明

１，２…溶媒、３…送液ポンプ、４…サンプルインジェクタ、５…カラム、６…イオン源、７…質量分離部、８…検出器、９…コントローラ、１０…データ処理部、１１…信号線、１２…表示部。

Claims (3)

1. 試料を成分ごとに分離する液体クロマトグラフから溶出される試料をイオン化し、任意の質量数のイオンを開裂させ、質量分析するＭＳⁿ分析を行う質量分析装置において、
   複数の化合物の各保持時間情報が記憶された第１のデータベースと、異性体存在比とマススペクトル内の特定イオン強度比との相関情報が異性体ごとに格納された第２のデータベースと、複数の化合物のＭＳ ² スペクトルが格納された第３のデータベースとを備え、
   試料のＭＳ ² 分析を行ったマススペクトルを得て、
   前記得られたマススペクトルを元に、前記第３のデータベースを検索し、前記得られたマススペクトルと前記第３のデータベース内の各化合物との類似度を算出し、
   前記第１のデータベースを用いて、前記類似度を算出した化合物の保持時間を検索し、保持時間が同じ化合物を算出し、
   前記保持時間が同じ化合物らを異性体と判別し、前記得られたマススペクトルを元に前記第２のデータベースを用いて異性体の存在比を算出することを特徴とする質量分析装置。
2. 試料を成分ごとに分離可能な分離装置と、任意の質量数のイオンを開裂させ質量分析するＭＳ ⁿ 分析機能を有し、且つ複数の化合物の各保持時間情報が記憶された第１のデータベースと、異性体存在比とマススペクトル内の特定イオン強度比との相関情報が異性体ごとに格納された第２のデータベースと、複数の化合物のＭＳ ² スペクトルが格納された第３のデータベースとを備えた質量分析装置を用いた異性体分析方法において、
   試料のＭＳ ² 分析を行ったマススペクトルを得て、
   前記得られたマススペクトルを元に、前記第３のデータベースを検索し、前記得られたマススペクトルと前記第３のデータベース内の各化合物との類似度を算出し、
   前記第１のデータベースを用いて、前記類似度を算出した化合物の保持時間を検索し、保持時間が同じ化合物を算出し、
   前記保持時間が同じ化合物らを異性体と判別し、前記得られたマススペクトルを元に前記第２のデータベースを用いて異性体の存在比を算出することを特徴とする異性体分析方法。
3. 請求項２において、
   前記類似度を算出する前に、
   ＭＳ ² 分析を行ったマススペクトルが得られた保持時間を元に、前記第１のデータベースから類似度を算出すべき化合物の候補を選定することを特徴とする異性体分析方法。

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