JP2022066655A - 質量分析を用いた試料分析方法及び試料分析システム - Google Patents

Abstract

【課題】多変量解析のデータ前処理を簡略化しつつ、精度の高い解析を行う。【解決手段】本発明に係る試料分析方法の一態様は、MS/MS分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である質量分析装置を用い、目的試料又は該目的試料を含む試料に対して所定の基準に沿ったプリカーサーイオンについてのMS/MS分析を実行する第１測定ステップと、得られたMS/MSスペクトルデータからプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンのm/zとプリカーサーイオンのm/zとの組であるMRMトランジションを含む分析制御情報を作成する分析制御情報作成ステップと、トリプル四重極型である質量分析装置を用い、目的試料に対し、上記分析制御情報に基いてMRM法によるMS/MS分析を実行する第２測定ステップと、収集されたMS/MS分析データに対し多変量解析を行い、目的試料に関連する情報又は該目的試料に含まれる化合物に関連する情報を得る解析ステップと、を含む。【選択図】図２

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ｈｔｔｐｓ：／／ｅｖｅｎｔｐｉｌｏｔ．ｕｓ／ｗｅｂ／ｐｌａｎｎｅｒ．ｐｈｐ？ｉｄ＝ＡＳＭＳ２０、令和２年５月６日 〔刊行物等〕 ｈｔｔｐｓ：／／ｅｖｅｎｔｐｉｌｏｔ．ｕｓ／ｗｅｂ／ｐｌａｎｎｅｒ．ｐｈｐ？ｉｄ＝ＡＳＭＳ２０、令和２年６月１日

本発明は、質量分析技術を利用して試料を分析する又は試料中の化合物を分析する方法及びシステムに関する。本発明は、例えばメタボロミクス（メタボローム解析）などに特に有用である。

メタボロミクスは、生命活動によって生じる様々な代謝物の種類や濃度を網羅的に解析する手法であり、様々な分野への応用が期待されている。例えば、医療分野では、疾病の早期発見を目的としたバイオマーカーの探索や疾病の原因物質の特定などへの応用、食品分野では、メーカー間の製品比較や原材料の産地比較などの品質評価や品質予測、或いは、機能性成分の探索などへの応用が可能である。

非特許文献１に開示されているように、質量分析法や、クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせたクロマトグラフ質量分析法は、メタボロミクスにおける代表的な分析手法の一つであり、これらは近年、広く利用されている。また、メタボロミクスにおいて、液体クロマトグラフ質量分析装置等により得られる大量のデータを解析する際には、主成分分析（Principal Component Analysis：ＰＣＡ）や部分的最小二乗法（Partial Least Squares：ＰＬＳ）などの統計解析の手法が広く利用されており、それを実装するための統計解析ソフトウェアにも様々なものがある。

国際公開第２０１９／０１２５８９号

吉田 欣史、ほか２名、「メタボロミクスとメタボノミクス」、日本分析化学会、ぶんせき、2009年7月号、pp.371-378

クロマトグラフ質量分析法では、試料に含まれる複数の成分をクロマトグラフで分離することができるものの、成分数が多い場合には異なる成分の保持時間や質量電荷比（厳密には斜体字の「m/z」であるが、本明細書では慣用的に「質量電荷比」又は「m/z」と記す）が近接していることも多いため、より成分選択性の高いＭＳ／ＭＳ分析を用いることが好ましい。また、質量分析により得られるマススペクトルデータに基く統計解析の精度を向上させるには、マススペクトルの質量精度や質量分解能ができるだけ高いことが好ましい。こうしたことから、最近のメタボロミクスでは、ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって、トリプル四重極型質量分析装置に比べても質量精度、質量分解能が高い四重極－飛行時間型（以下、慣用的に「Ｑ－ＴＯＦ型」という）質量分析装置が質量分析装置として用いられることが多い。

特許文献１に開示されているように、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置では、特定のプリカーサーイオンをターゲットとする所定の質量電荷比範囲のＭＳ／ＭＳスペクトルを繰り返し取得することができる。しかしながら、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置で得られるデータには、十分な信号強度が得られず再現性や定量性が悪いピークも多く含まれ、こうしたノイズピークを本来のデータと併せて多変量解析に供すると解析の精度が低下する。そのため、多変量解析に先立ってノイズピークをできるだけ除去するようなデータ前処理を実施する必要があり、このデータ前処理がかなり煩雑で時間や手間が掛かるという問題がある。特に、目的成分を限定せずに網羅的な分析を行うノンターゲットメタボロミクスでは、液体クロマトグラフ質量分析装置で得られるデータの量が膨大であるため、上述したようなデータ前処理の作業はさらに一層、負荷の掛かる作業である。

本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その主たる目的は、煩雑であるデータ前処理を簡略化するとともに、高い網羅性と信頼性とを実現することができる質量分析を用いた試料分析方法及び試料分析システムを提供することである。

上記課題を解決するためになされた本発明に係る質量分析を用いた試料分析方法の一態様は、
ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である質量分析装置を用い、目的試料又は該目的試料を含む試料に対して所定の基準に沿ったプリカーサーイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実行する第１測定ステップと、
前記第１測定ステップで得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータからプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンの質量電荷比とプリカーサーイオンの質量電荷比との組である多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションを含む分析制御情報を作成する分析制御情報作成ステップと、
トリプル四重極型である質量分析装置を用い、前記目的試料に対し、前記分析制御情報に基いてＭＲＭ法によるＭＳ／ＭＳ分析を実行する第２測定ステップと、
前記第２測定ステップで収集されたＭＳ／ＭＳ分析データに対し多変量解析を行い、前記目的試料に関連する情報又は該目的試料に含まれる化合物に関連する情報を得る解析ステップと、
を含むものである。

また上記課題を解決するためになされた本発明に係る試料分析システムは、上記発明に係る試料分析方法を実施するためのシステムであり、その一態様は、
ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である第１の質量分析装置と、
トリプル四重極型である第２の質量分析装置と、
目的試料又は該目的試料を含む試料に対し、所定の基準に沿ったプリカーサーイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実行するように、前記第１の質量分析装置の動作を制御する第１の制御部と、
前記第１の制御部による制御の下で前記第１の質量分析装置により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータからプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンの質量電荷比とプリカーサーイオンの質量電荷比との組である多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションを含む分析制御情報を作成する分析制御情報作成部と、
前記目的試料に対し、前記分析制御情報に基いてＭＲＭ法によるＭＳ／ＭＳ分析を実行するように、前記第２の質量分析装置の動作を制御する第２の制御部と、
前記第２の制御部による制御の下で前記第２の質量分析装置により収集されたＭＳ／ＭＳ分析データに対し多変量解析を行い、前記目的試料に関連する情報又は該目的試料に含まれる化合物に関連する情報を得る解析部と、
を備えるものである。

本発明の上記態様において、ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である第１の質量分析装置では、初段の質量分離の方式や構成、イオン解離の方式や構成は問わない。第１の質量分析装置としては、例えば、四重極－飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ型）質量分析装置、イオントラップ飛行時間型質量分析装置、などを用いることができる。

また、第１の質量分析装置及び第２の質量分析装置はそれぞれ、単体の質量分析装置ではなく、液体クロマトグラフが前段に接続された液体クロマトグラフ質量分析装置とすることができる。その場合、前段の液体クロマトグラフは、第１の質量分析装置及び第２の質量分析装置とで共用することができる。
また、上記多変量解析は、統計的解析及び機械学習を含む。

本発明に係る試料分析方法及び試料分析システムの上記態様では、例えばＱ－ＴＯＦ型質量分析装置で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータを多変量解析するのではなく、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置において例えばデータ依存性取得（Data Dependent Acquisition：ＤＤＡ）法等の手法により得られたデータに基いて、ＭＲＭ測定のためのＭＲＭトランジションを含む分析制御情報を作成する。そして、この分析制御情報を用い、トリプル四重極型質量分析装置においてＭＲＭ測定を行うことで得られたデータを多変量解析に供する。

Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置等の第１の質量分析装置では、得られるデータにノイズ要素が多いものの、検出の網羅性が高く、試料に含まれる化合物を、高い質量精度及び質量分解能で以て漏れ無く検出することができる。それにより、化合物を網羅的に検出するのに適当であるＭＲＭトランジションを取得することができる。一方、第２の質量分析装置で実施されるＭＲＭによるＭＳ／ＭＳ分析では、特定のＭＲＭトランジションのイオンを高い感度及び高い選択性を以て検出することができる。

本発明によれば、こうして得られた高い信頼性を有するデータを多変量解析に供することができるので、多変量解析に先立つノイズピーク除去等のデータの前処理が不要になるか或いは必要であってもかなり簡略化することができる。一方で、検出する化合物の網羅性は高いので、試料に含まれる化合物の数が多い場合であっても、それら多くの化合物を反映した正確な多変量解析結果を得ることができる。即ち、本発明によれば、高い信頼性と網羅性とを両立した解析を行うことができ、本発明は例えばメタボロミクスなどに好適である。

本発明に係る試料分析システムの一実施形態の要部の構成図。 図１に示したシステムを用いた試料分析方法の一例の説明図。 ３種類の赤ワインを混合したサンプルについて実測により得られたクロマトグラムの一例を示す図。 ３種類の赤ワインについてのＭＲＭ測定結果に基くＰＣＡ解析により得られたスコアプロット及びローディングプロットの一例を示す図。 ３種類の赤ワインにおける代謝物のＡＮＯＶＡ検定結果を示す図。

以下、本発明に係る試料分析方法及び試料分析システムの一実施形態を、添付図面を参照して説明する。

［本実施形態の試料分析システムの構成］
本実施形態の試料分析システムは、試料中の代謝物の網羅的解析、つまりはメタボロミクスを行うシステムである。
図１は、本実施形態の試料分析システムの概略構成図である。

このシステムは、質量分析部がＱ－ＴＯＦ型質量分析装置である第１測定部１０と、質量分析部がトリプル四重極型質量分析装置である第２測定部１００と、第１測定部１０を制御するとともに第１測定部１０で得られたデータを処理する第１制御・処理部２０と、第２測定部１００を制御するとともに第２測定部１００で得られたデータを処理する第２制御・処理部２００と、を含む。

第１測定部１０は、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）１１と、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析部（ＱＴＯＦＭＳ部）１２と、を含む。第２測定部１００は、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）１０１と、トリプル四重極型質量分析部（ＴＱＭＳ部）１０２と、を含む。なお、図１では、第１測定部１０のＬＣ部１１と、第２測定部１００のＬＣ部１０１とは別体であるが、それらを共通化し、共通のＬＣ部から溶出する溶出液を二つの質量分析部の一方に選択的に導入する流路切替部を設けてもよい。或いは、ユーザーが配管を繋ぎ替える作業を行って、共通のＬＣ部からいずれか一方の質量分析部に溶出液が導入されるようにしてもよい。

図示しないが、ＬＣ部１１、１０１はいずれも、移動相容器、送液ポンプ、インジェクター、カラム、カラムオーブンなどのＬＣとしての標準的な構成である。グラジエント溶離を行う場合には、それに合わせた構成が追加される。ＱＴＯＦＭＳ部１２は、特許文献１等に開示されているように、コリジョンセルを挟んで前段に四重極マスフィルター、後段に飛行時間型質量分離器を備える構成であり、イオン源はエレクトロスプレーイオン化等の大気圧イオン化を行うものである。ＴＱＭＳ部１０２は、コリジョンセルを挟んで前段及び後段にそれぞれ四重極マスフィルターを備える構成であり、イオン源はエレクトロスプレーイオン化等の大気圧イオン化を行うものである。

第１制御・処理部２０は、機能ブロックとして、分析制御部２１、データ格納部２２、ＭＳ／ＭＳスペクトル作成部２３、プロダクトイオン選択部２４、ＭＳ／ＭＳ情報出力部２５、を含む。また、第２制御・処理部２００は、機能ブロックとして、ＭＲＭ測定メソッド作成部２０１、分析制御部２０２、データ格納部２０３、多変量解析処理部２０４、解析結果出力部２０５、成分同定・構造解析部２０６、解析用データベース２０７、を含む。

一般に、第１制御・処理部２０及び第２制御・処理部２００の実体はパーソナルコンピューター又はより高性能であるワークステーションと呼ばれるコンピューターであり、該コンピューターに予めインストールされた専用のソフトウェア（コンピュータープログラム）を該コンピューター上で動作させることで上記各機能ブロックの機能が実現されるものとすることができる。その場合、第１制御・処理部２０と第２制御・処理部２００とはそれぞれ異なるソフトウェアとそれら二つのソフトウェアの間でデータ等の入出力を行う別のソフトウェアを組み合わせたものでもよいし、或いは、全てのソフトウェアを一つに統合したものでもよい。

［試料分析システムを用いた分析動作］
上記試料分析システムを用いた試料分析の一例を、図２を参照して説明する。
図２は、同種の三つの試料＃１、＃２、＃３を分析及び解析する場合の例であり、三つの試料の差異を特徴付ける化合物を探索して、該化合物を同定することを目的とする。試料の種類は特に限定されず、例えば後述する実験例のような飲食品以外に、農水産物、生体由来の試料（血液、唾液、尿、細胞組織など）などでもよい。

まず、ユーザーは、三つの試料＃１、＃２、＃３を混合し、分析用の混合試料を調製する。そして、第１測定部１０を用い、この混合試料に対してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実施する。ここでは、混合試料に含まれる化合物は未知である。そこで、化合物を網羅的に分析するために、ＱＴＯＦＭＳ部１２ではＤＤＡ法によるＭＳ／ＭＳ分析を繰り返し行う。
即ち、分析制御部２１は第１測定部１０を制御し、ＬＣ部１１において送液ポンプにより送給される移動相中に所定のタイミングで混合試料を注入する。混合試料は移動相の流れに乗ってカラムに導入され、カラムを通過する間に混合試料中の各種化合物は時間的に分離される。カラムからの溶出液は連続的にＱＴＯＦＭＳ部１２に導入され、溶出液中の化合物はＱＴＯＦＭＳ部１２においてＤＤＡ法によるＭＳ／ＭＳ分析により検出される。

ＤＤＡ法では、まず、所定の質量電荷比範囲に亘る通常のＭＳ分析（四重極マスフィルターでのイオン選択及びコリジョンセルでのイオンの解離操作を実施しない分析）を実行する。図２の例では、保持時間ＲＴ１においてＭＳ分析によるマススペクトルが得られている。このＭＳ分析によるデータはデータ格納部２２に格納される。また、分析制御部２１は、取得されたマススペクトルを即座に解析し、例えばピーク強度が所定の閾値以上である等、予め設定された条件に適合するピークを探索する。一つのマススペクトルにおいて複数のピークが検出された場合にはそれらピークを全て選択してもよいし、例えば強度順にピーク数を制限してもよい。

そして、選択されたピークに対応する質量電荷比をプリカーサーイオンに設定し、引き続き、そのプリカーサーイオンをターゲットとするＭＳ／ＭＳ分析を実行して、所定の質量電荷比範囲に亘るＭＳ／ＭＳスペクトル（プロダクトイオンスペクトル）を取得する。このＭＳ／ＭＳ分析によるデータはＭＳ分析によるデータに関連付けてデータ格納部２２に格納される。図２の例では、保持時間ＲＴ１において得られたマススペクトルにおいて〇印で示すピークが選択されたピークであり、このピークに対応するイオンをプリカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析することでＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる。

マススペクトルにおいて複数のプリカーサーイオンが選択された場合には、各プリカーサーイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実行しＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する。分析制御部２１は、所定の測定時間の終了時点まで、上述したような１回のＭＳ分析と１又は複数回のＭＳ／ＭＳ分析とを一組として、これを所定の時間間隔で繰り返し実行するようにＱＴＯＦＭＳ部１２を制御する。マススペクトルにおいて指定の条件を満たすピークが存在しなかった場合には、そのときのＭＳ分析に対応するＭＳ／ＭＳ分析は実施されない。

第１測定部１０での測定終了後（又は測定途中から）、第１制御・処理部２０においてＭＳ／ＭＳスペクトル作成部２３は、データ格納部２２に格納されたデータに基いて各保持時間におけるＭＳ／ＭＳスペクトルを作成する。プロダクトイオン選択部２４は、各ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて所定の基準に従って一つのプロダクトイオンピークを選択する。例えば、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて検出されるピークの中で、ピークトップの信号強度が最大であるピークを選択するものとすることができる。但し、一つのＭＳ／ＭＳスペクトルから複数のプロダクトイオンピークを選択できるようにしてもよい。これにより、ＭＳ／ＭＳ分析が実施された保持時間において、少なくとも一つのプリカーサーイオンと一つのプロダクトイオンとの組（例えば図２中の（ＲＴ１，Ｍ１，Ｍ２））が求まる。ＭＳ／ＭＳ情報出力部２５は、保持時間、プリカーサーイオンの質量電荷比、及びプロダクトイオンの質量電荷比を一組とするＭＳ／ＭＳ情報を生成し、これを第２制御・処理部２００へ送出する。

第２制御・処理部２００においてＭＲＭ測定メソッド作成部２０１は、上記ＭＳ／ＭＳ情報を受け取り、ＴＱＭＳ部１０２においてＭＲＭ測定を行うためのＭＲＭトランジションを含む測定メソッドを作成する。具体的には、ＭＳ／ＭＳ情報における保持時間に対しその前後に所定の時間的余裕を加えた検出時間範囲を定め、その検出時間範囲の間、当該保持時間に対応するプリカーサーイオンの質量電荷比及びプロダクトイオンの質量電荷比を含むＭＲＭトランジションを実行するように測定メソッドを作成する。例えば、保持時間ＲＴ１に対しその前後に時間的余裕としてそれぞれΔｔを確保したＲＴ１－Δｔ＝ｔ１～ＲＴ１＋Δｔ＝ｔ２を検出時間範囲と定め、その検出時間範囲ｔ１～ｔ２についてＭ１＞Ｍ２（但し、Ｍ１：プリカーサーイオンのm/z、Ｍ２：プロダクトイオンのm/z）をＭＲＭトランジションとすることができる。ここで、Δｔは適宜に決めることができ、例えば１分、０．５分などとすればよい。

なお、一般に、ＭＳ／ＭＳ情報で挙げられる保持時間、プリカーサーイオンの質量電荷比、及びプロダクトイオンの質量電荷比の組の数はかなり多いため、上述のようにして検出時間範囲を定めると、複数の検出時間範囲が重なることになる。ＴＱＭＳ部１０２では、同時に（厳密にいえば時間分割で）多数のＭＲＭ測定を実施することが可能であるので、或る程度の数の検出時間範囲が重なっても実質的に問題とはならないが、重なる検出時間範囲が多いほど一つのＭＲＭトランジションについてのドゥエルタイム（データの取得時間）が短くなり、感度の点で不利である。そのため、重なる検出時間範囲の数を適宜制限するように、検出時間範囲を調整してもよい。或いは、重なる検出時間範囲の数が規定数以下になるように、実施するＭＲＭ測定の数を制限してもよい。

このときの測定メソッドは、３種類の試料＃１、＃２、＃３を混合した試料に対して測定を行った結果に基いて作成されたものであるので、その３種類の試料＃１、＃２、＃３に含まれる種々の化合物を網羅的に検出することが可能な測定メソッドである。

分析制御部２０２は、ＭＲＭ測定メソッド作成部２０１により作成された上記測定メソッドに従ってＴＱＭＳ部１０２の動作を制御しつつ、３種類の試料＃１、＃２、＃３についてそれぞれＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を実行するように第２測定部１００を制御する。即ち、第２測定部１００では、３種類の試料を混合せずに１種類ずつ順番に測定する。このときのＬＣ部１０１の分離条件（移動相の種類、流速（流量）、グラジエント溶出条件、カラム温度など）は、第１測定部１０での混合試料に対する測定時と同じとする。これは、同じ化合物が溶出する時間を概ね揃えるためである。

第２測定部１００での一つの試料＃１に対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は次のように実施される。分析制御部２０２は第２測定部１００を制御し、ＬＣ部１０１において送液ポンプにより送給される移動相中に所定のタイミングで試料＃１を注入する。試料＃１は移動相の流れに乗ってカラムに導入され、カラムを通過する間に該試料＃１中の各種化合物は時間的に分離される。カラムからの溶出液は連続的にＴＱＭＳ部１０２に導入され、溶出液中の化合物はＴＱＭＳ部１０２においてＭＲＭ測定（ＭＳ／ＭＳ分析）により検出される。

ＴＱＭＳ部１０２では測定メソッドに従って、所定の検出時間範囲の間、特定のＭＲＭトランジションのイオン強度を繰り返し取得する。従って、図２に示すように、例えばｔ１～ｔ２の時間の間、ＭＲＭトランジションがＭ１＞Ｍ２であるイオン強度の時間的変化を示すクロマトグラム（抽出イオンクロマトグラム）が得られる。このＭＳ／ＭＳ分析によるデータはデータ格納部２０３に格納される。ＭＲＭトランジション毎に、上述したような所定の検出時間範囲のクロマトグラムデータを得ることができる。上述したように、第１測定部１０のＬＣ部１１における分離条件と第２測定部１００のＬＣ部１０１における分離条件とを全く同一にしたとしても、同一の化合物の溶出時間に多少のずれが生じることは避けられない。それに対し、ここでは、第１測定部１０での測定時における実際の保持時間（溶出時間）に対して十分な時間的余裕を以て検出時間範囲を設定しているので、試料にその保持時間に対応する化合物が含まれていれば、その化合物由来のプロダクトイオンを確実に検出することができる。

上述したように、測定メソッドは３種類の試料＃１、＃２、＃３に含まれる種々の化合物を網羅的に検出することが可能な測定メソッドであるので、同じ測定メソッドを用いて、試料＃１、＃２、＃３にそれぞれ含まれる化合物に対応するクロマトグラムデータを漏れなく且つ高い感度で以て収集することができる。一方で、ＭＲＭ測定では高感度の分析が行えるため、再現性及び定量性が共に良好である信頼性の高いデータを収集することができる。

試料毎にそれぞれ、その試料に含まれる可能性が高い化合物に対応するデータが得られたならば、多変量解析処理部２０４はデータ格納部２０３から適宜データを読み出し、例えば主成分分析、部分的最小二乗法、或いは階層的クラスター解析などの適宜の手法による解析を実行する。また、ディープラーニングを含む機械学習を用いて解析を行ってもよい。解析の目的に応じて、使用する解析手法を適宜選択すればよい。例えば主成分分析を用いると解析結果としてスコアプロットとローディングプロットとを作成することができ、その解析結果基いて、複数の試料を複数のグループに分類し、同時にその分類に寄与する或いは各グループを特徴付ける要素つまりは化合物を推定することができる。

解析結果出力部２０５は、上記多変量解析又は機械学習による解析結果を図示しない表示部に出力する。この解析結果を見たユーザーは、図示しない操作部で所定の操作を行うことにより、着目する化合物を指定するとともに同定処理の実行開始を指示する。すると、成分同定・構造解析部２０６は、指示された化合物に対応するＭＲＭトランジションの情報からその元のＭＳ／ＭＳ情報を辿り、そのＭＳ／ＭＳ情報が得られたときのＭＳ／ＭＳスペクトルを第１制御・処理部２０から取得する。そして、様々な化合物についてのＭＳ／ＭＳスペクトルが収録されている解析用データベース２０７を利用して、実測のＭＳ／ＭＳスペクトルにスペクトルパターンが類似している化合物を検索し、指定され化合物を同定する、又はその化合物の構造情報を得る。解析結果出力部２０５は、こうした同定結果や構造解析結果も表示部に出力する。

以上のようにして、本実施形態の試料分析システムでは、複数種類の試料の差異を特徴付ける化合物を探索して、該化合物を同定したりその化合物の化学構造の情報を取得したりすることができる。

なお、上記説明では、複数の試料を混合して調製した混合試料を第１測定部１０により測定したが、試料を混合することなく個別に第１測定部１０により測定し、それぞれのＭＳ／ＭＳ分析結果に基いてＭＲＭトランジションを求めてもよい。

［実験例］
上記手順に従って実施した実験例について、次に説明する。
この実験では、第１測定部１０として島津製作所製の「LCMS-9030」（ＬＣ部１１は「Nexera X3 system」）、第２測定部１００として島津製作所製の「LCMS-8060NX」を使用した。また、試料として３種類の市販の赤ワイン（ボトルワイン、紙パックワイン、ノンアルコールワイン）を用意した。各ワインに含まれる親水性代謝物を網羅的に分析するため、これら３種類の赤ワインを混合したものを第１測定部１０での分析対象の混合試料とした。試料前処理としては、混合された赤ワインを回転速度：１２０００rpmで５分間遠心分離し、その上清を採取して超純水で１０倍に希釈することにより混合試料を調製した。

この混合試料について、表１に示したＬＣ分析条件及び表２に示したＭＳ分析条件の下で、第１測定部１０を用い代謝物の網羅的分析を実行した。

図３は、上記混合試料についての実測により得られたクロマトグラムの一例を示す図である。図３（Ａ）は正イオンモードにおいて、（Ｂ）は負イオンモードにおいて、それぞれで観測されたイオンの信号強度の時間変化を加算したものである。正イオンモードにおいて１４４３個のピーク、負イオンモードにおいても７５９個のピークを、それぞれプリカーサーイオンとして十分に高い強度で以てＭＳ／ＭＳスペクトルデータを取得することができた。

上述のように第１測定部１０により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータに対し、図２で説明した処理を行うことにより、第２測定部１００でのＬＣ／ＭＳ分析用の測定メソッドを作成した。但し、ここでは正イオンモードで得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータを用い、１４４３個のＭＲＭトランジションを含む測定メソッドを作成した。そして、３種類の赤ワインそれぞれを試料とし、上記測定メソッドを使用して第２測定部１００により各試料のＬＣ／ＭＳ分析を実施した。試料前処理としては、各赤ワインを回転速度：１２０００rpmで５分間遠心分離し、その上清を採取して超純水で１００倍に希釈することにより試料を調製した。

測定終了後、第２測定部１００で得られたＭＳ／ＭＳ分析データに対し、ライフィッス株式会社製のＭＲＭデータ対応多変量解析用ソフトウェアである「Traverse-MS^TM」を使用して、主成分分析及び一元配置分取分析（One-way analysis: One-way ANOVA）を実施した。図４は、主成分分析により得られたスコアプロット（Ａ）及びローディングプロット（Ｂ）である。スコアプロット上の各プロットはそれぞれ試料に対応しており、図４（Ａ）から、３種類の赤ワインが明確に分類されていることが分かる。また、ローディングプロット上の各プロットはそれぞれＭＲＭトランジションつまり化合物に対応しており、図４（Ｂ）から、３種類の赤ワインの分類に寄与しているＭＲＭトランジションが判明する。

図５は、上記の３種類の赤ワインそれぞれにおいて、存在量に有意差があると判定され（ｐ値＜０．０５）、それぞれ同定された代謝物であるオルニチン、グルタチオン、及び４アミノ酪酸におけるピーク高さの比較例である。この結果から、３種類の赤ワインをそれぞれ特徴付ける代謝物、つまりはマーカーが明確になる。
以上の実験例からも、上述した試料分析システムを利用することにより、複数の試料を分類するのに有用な代謝物等の化合物を的確に抽出することが可能であり、その化合物を同定できることが分かる。

上記実施形態の試料分析システムは適宜に変形することができる。例えば、上記実施形態において第１測定部１０及び第２測定部１００はいずれも液体クロマトグラフ質量分析装置であるが、液体クロマトグラフなどの化合物分離手段を質量分析装置の前段に設けることは必須ではない。

また、第１測定部１０において質量分析装置は、ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって、高い質量精度及び質量分解能での質量分離が可能である質量分析装置であれば、Ｑ－ＴＯＦ型質量分析装置に限らない。例えば、前段四重極マスフィルターとコリジョンセルの代わりにイオントラップを用いてイオン選択とイオン解離操作とを行う、イオントラップ飛行時間型質量分析装置などを用いることもできる。一方、第２測定部１００では、高い感度のＭＲＭ測定を行う必要があるため、質量分析装置としてトリプル四重極型質量分析装置を用いる。

また、上記実施形態において、第１測定部１０では網羅的にイオンを検出するために、ＤＤＡ法によるＭＳ／ＭＳ分析を実行していたが、データ非依存性取得（Data Independent Acquisition：ＤＩＡ）法によるＭＳ／ＭＳ分析を実施してもよい。

ＤＩＡ法によるＭＳ／ＭＳ分析では、例えば、或る一定の質量電荷比幅のウインドウをずらしながら、各ウインドウに含まれる複数種のイオンをまとめてプリカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実行しＭＳ／ＭＳスペクトルを取得する、という作業を繰り返す。この場合、ＤＤＡ法よりも検出の網羅性を高めることができるものの、その反面、一つのＭＳ／ＭＳスペクトルは、複数種のイオンに由来するＭＳ／ＭＳスペクトルが混じったものとなる。しかしながら、一般的には、周知のデコンボリューションの手法を用いることで、重なっているＭＳ／ＭＳスペクトルを分離するとともに、そのＭＳ／ＭＳスペクトルに対応するプリカーサーイオンの質量電荷比を推定することができる。したがって、こうしたデータ処理を加えることで、第１測定部１０においてＤＩＡ法によるＭＳ／ＭＳ分析を利用することもできる。

また、上記実施形態及び上述した各種の変形例は本発明の一例であって、本発明の趣旨の範囲で適宜修正、変更、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。

［種々の態様］
上述した例示的な実施形態が以下の態様の具体例であることは、当業者には明らかである。

（第１項）本発明に係る質量分析を用いた試料分析方法の一態様は、
ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である質量分析装置を用い、目的試料又は該目的試料を含む試料に対して所定の基準に沿ったプリカーサーイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実行する第１測定ステップと、
前記第１測定ステップで得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータからプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンの質量電荷比とプリカーサーイオンの質量電荷比との組である多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションを含む分析制御情報を作成する分析制御情報作成ステップと、
トリプル四重極型である質量分析装置を用い、前記目的試料に対し、前記分析制御情報に基いてＭＲＭ法によるＭＳ／ＭＳ分析を実行する第２測定ステップと、
前記第２測定ステップで収集されたＭＳ／ＭＳ分析データに対し多変量解析を行い、前記目的試料に関連する情報又は該目的試料に含まれる化合物に関連する情報を得る解析ステップと、
を含むものである。

（第１０項）また、本発明に係る試料分析システムの一態様は、
ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である第１の質量分析装置と、
トリプル四重極型である第２の質量分析装置と、
目的試料又は該目的試料を含む試料に対し、所定の基準に沿ったプリカーサーイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実行するように、前記第１の質量分析装置の動作を制御する第１の制御部と、
前記第１の制御部による制御の下で前記第１の質量分析装置により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータからプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンの質量電荷比とプリカーサーイオンの質量電荷比との組である多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションを含む分析制御情報を作成する分析制御情報作成部と、
前記目的試料に対し、前記分析制御情報に基いてＭＲＭ法によるＭＳ／ＭＳ分析を実行するように、前記第２の質量分析装置の動作を制御する第２の制御部と、
前記第２の制御部による制御の下で前記第２の質量分析装置により収集されたＭＳ／ＭＳ分析データに対し多変量解析を行い、前記目的試料に関連する情報又は該目的試料に含まれる化合物に関連する情報を得る解析部と、
を備えるものである。

第１項に記載の質量分析を用いた試料分析方法、又は第１０項に記載の試料分析システムによれば、トリプル四重極型質量分析装置におけるＭＲＭ測定で得られた高い信頼性を有するデータを多変量解析に供することができるので、多変量解析までのノイズデータの除去等のデータの前処理が不要になるか或いは必要であっても簡略化することができる。それにより、全体としてデータ処理を簡略化し、解析作業の効率向上を図ることができる。また、ＭＲＭ法によるＭＳ／ＭＳ分析のための制御情報の作成は、検出の網羅性の高い第１の測定ステップによるＭＳ／ＭＳ分析結果を利用しているので、試料に含まれる化合物の数が多い場合であっても、それら多くの化合物を反映した正確な多変量解析結果を得ることができる。即ち、高い信頼性と網羅性とを両立した解析を行うことができ、例えばメタボロミクスなどに好適である。

（第２項）第１項に記載の試料分析方法において、前記第１測定ステップでは四重極－飛行時間型質量分析装置を用いるものとすることができる。

第２項に記載の試料分析方法によれば、第１測定ステップにおいて感度の高いＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができる。それにより、例えば試料に含まれる量が少ない化合物についてもＭＲＭトランジションを作成し、第２測定ステップでのＭＳ／ＭＳ分析の対象とすることができる。

（第３項）第１項又は第２項に記載の試料分析方法において、前記第１測定ステップ及び前記第２測定ステップではいずれも、液体クロマトグラフ質量分析装置を用い、液体クロマトグラフで成分分離された試料に対しＭＳ／ＭＳ分析を行うものとすることができる。

第３項に記載の試料分析方法によれば、試料に含まれる化合物の数が多い場合であっても、前段の液体クロマトグラフでそれら化合物の多くを分離することができるので、例えば第１測定ステップにおいて複数の化合物が同時に質量分析部に導入されにくくなり、同時に導入される複数の化合物のうちの一つしかＭＳ／ＭＳ分析ができない場合でもＭＳ／ＭＳ分析の漏れを軽減することができる。

（第４項）第１項～第３項のいずれか１項に記載の試料分析方法において、前記第１測定ステップでは、質量分析装置においてデータ依存性取得（ＤＤＡ）法によるＭＳ／ＭＳ分析を行うものとすることができる。

前記第１測定ステップでは、質量分析装置においてデータ非依存性取得（ＤＩＡ）法によるＭＳ／ＭＳ分析を行うこともできるものの、その場合には、得られた一つのＭＳ／ＭＳスペクトルを複数のプリカーサーイオンにそれぞれ由来するＭＳ／ＭＳスペクトルに分離するデータ処理が必要になる。これに対し、ＤＤＡ法によるＭＳ／ＭＳ分析を行えば、ＤＩＡ法に比べて網羅性の点では不利であるものの、ＭＳ／ＭＳ分析によって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルから直ぐにプロダクトイオンを抽出することができプリカーサーイオンの質量電荷比を求める計算も不要であるため、データ処理が簡単になる。また、プリカーサーイオンやプロダクトイオンの質量電荷比が正確に求まるので、信頼性の高いＭＲＭトランジションを得ることができる。

（第５項）第１項～第４項のいずれか１項に記載の試料分析方法において、前記分析制御情報作成ステップでは、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて最大の信号強度を示すプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンを含むＭＲＭトランジションを求めるものとすることができる。

第５項に記載の試料分析方法によれば、簡単なデータ処理によって、信頼性の高いＭＲＭトランジションを求めることができる。

（第６項）第１項～第５項のいずれか１項に記載の試料分析方法において、前記解析ステップでは、複数の目的試料についてそれぞれ得られたＭＳ／ＭＳ分析データに対し解析処理を行うことで、該複数の目的試料を分類するのに特徴的である化合物を抽出するものとすることができる。

第６項に記載の試料分析方法によれば、例えば疾病に関連するバイオマーカーや、農水産物等の産地を特定するためのマーカーなど、試料の分類に寄与する重要なマーカーとなる化合物を効率良く見つけることができる。

（第７項）第６項に記載の試料分析方法では、前記特徴的である化合物に由来するイオンをプリカーサーイオンとしたＭＳ／ＭＳスペクトルに基いて、該化合物を同定する、又は該化合物の構造を解析する化合物解析ステップ、をさらに含むものとすることができる。

第７項に記載の試料分析方法では、例えば多数の既知の化合物のＭＳ／ＭＳスペクトルを収録したデータベースを用いたデータベース検索などの手法を利用することができる。第７項に記載の試料分析方法によれば、例えば試料の分類に寄与するマーカーとなる化合物自体を特定したり、その化合物の化学構造を明らかにしたりすることができる。

（第８項）第６項又は第７項に記載の試料分析方法において、前記特徴的である化合物は代謝物であるものとすることができる。

第８項に記載の試料分析方法によれば、本方法をメタボロミクスに利用することができる。

（第９項）第１項～第８項のいずれか１項に記載の試料分析方法において、前記多変量解析は統計的解析又は機械学習であるものとすることができる。

第９項に記載の試料分析方法によれば、複数の試料を高い精度で分類したり、その分類に寄与する化合物を精度良く特定したりすることができる。

１０…第１測定部
１１…ＬＣ部
１２…ＱＴＯＦＭＳ部
１００…第２測定部
１０１…ＬＣ部
１０２…ＴＱＭＳ部
２０…第１制御・処理部
２１…分析制御部
２２…データ格納部
２３…ＭＳ／ＭＳスペクトル作成部
２４…プロダクトイオン選択部
２５…ＭＳ／ＭＳ情報出力部
２００…第２制御・処理部
２０１…ＭＲＭ測定メソッド作成部
２０２…分析制御部
２０３…データ格納部
２０４…多変量解析処理部
２０５…解析結果出力部
２０６…成分同定・構造解析部
２０７…解析用データベース

Claims (10)

1. ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である質量分析装置を用い、目的試料又は該目的試料を含む試料に対して所定の基準に沿ったプリカーサーイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実行する第１測定ステップと、
   前記第１測定ステップで得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータからプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンの質量電荷比とプリカーサーイオンの質量電荷比との組である多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションを含む分析制御情報を作成する分析制御情報作成ステップと、
   トリプル四重極型である質量分析装置を用い、前記目的試料に対し、前記分析制御情報に基いてＭＲＭ法によるＭＳ／ＭＳ分析を実行する第２測定ステップと、
   前記第２測定ステップで収集されたＭＳ／ＭＳ分析データに対し多変量解析を行い、前記目的試料に関連する情報又は該目的試料に含まれる化合物に関連する情報を得る解析ステップと、
   を含む、質量分析を用いた試料分析方法。
2. 前記第１測定ステップでは四重極－飛行時間型質量分析装置を用いる、請求項１に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
3. 前記第１測定ステップ及び前記第２測定ステップではいずれも、液体クロマトグラフ質量分析装置を用い、液体クロマトグラフで成分分離された試料に対しＭＳ／ＭＳ分析を行う、請求項１又は２に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
4. 前記第１測定ステップでは、質量分析装置においてデータ依存性取得（ＤＤＡ）法によるＭＳ／ＭＳ分析を行う、請求項１～３のいずれか１項に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
5. 前記分析制御情報作成ステップでは、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて最大の信号強度を示すプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンを含むＭＲＭトランジションを求める、請求項１～４のいずれか１項に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
6. 前記解析ステップでは、複数の目的試料についてそれぞれ得られたＭＳ／ＭＳ分析データに対し解析処理を行うことで、該複数の目的試料を分類するのに特徴的である化合物を抽出する、請求項１～５のいずれか１項に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
7. 前記特徴的である化合物に由来するイオンをプリカーサーイオンとしたＭＳ／ＭＳスペクトルに基いて、該化合物を同定する又は該化合物の構造を解析する化合物解析ステップ、をさらに含む、請求項６に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
8. 前記特徴的である化合物は代謝物である、請求項６又は７に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
9. 前記多変量解析は統計的解析又は機械学習である、請求項１～８のいずれか１項に記載の質量分析を用いた試料分析方法。
10. ＭＳ／ＭＳ分析が可能であって最終段の質量分離器が飛行時間型質量分離器である第１の質量分析装置と、
    トリプル四重極型である第２の質量分析装置と、
    目的試料又は該目的試料を含む試料に対し、所定の基準に沿ったプリカーサーイオンについてのＭＳ／ＭＳ分析を実行するように、前記第１の質量分析装置の動作を制御する第１の制御部と、
    前記第１の制御部による制御の下で前記第１の質量分析装置により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルデータからプロダクトイオンピークを抽出し、そのプロダクトイオンの質量電荷比とプリカーサーイオンの質量電荷比との組である多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションを含む分析制御情報を作成する分析制御情報作成部と、
    前記目的試料に対し、前記分析制御情報に基いてＭＲＭ法によるＭＳ／ＭＳ分析を実行するように、前記第２の質量分析装置の動作を制御する第２の制御部と、
    前記第２の制御部による制御の下で前記第２の質量分析装置により収集されたＭＳ／ＭＳ分析データに対し多変量解析を行い、前記目的試料に関連する情報又は該目的試料に含まれる化合物に関連する情報を得る解析部と、
    を備える試料分析システム。

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