CN115989409A - 酰基肉毒碱分析方法以及酰基肉毒碱分析装置 - Google Patents
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Abstract
本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的一个方式是使用串联型质谱分析装置来分析C5酰基肉毒碱的方法,所述酰基肉毒碱分析方法包括:测定步骤,对检查体实施基于m/z 246>187、m/z 246>57、m/z 246>41以及m/z 246>29中的至少一个MRM母子离子对的MRM测定;以及处理步骤,使用在测定步骤中得到的测定结果,来识别检查体中的异戊酰基肉毒碱和作为其异构体的新戊酰基肉毒碱,或者判定检查体中的C5酰基肉毒碱中是否包含新戊酰基肉毒碱。由此,能够良好地识别以往难以识别的异戊酰基肉毒碱和新戊酰基肉毒碱。
Description
技术领域
本发明涉及酰基肉毒碱的分析方法以及使用该方法的分析装置。
背景技术
为了在早期发现新生儿的先天性代谢异常病等并进行治疗,正在广泛实施新生儿筛查。最近,随着质谱分析技术的急速发展,利用串联型质谱分析装置的新生儿大规模筛查也普及,对新生儿的先天性代谢异常病的早期发现发挥了非常大的威力(参照非专利文献1、2)。
作为这样的新生儿大规模筛查之一,存在用于诊断有机酸/脂肪酸代谢异常病的酰基肉毒碱分析。酰基肉毒碱是体内积蓄的肉毒碱与源自有机酸或脂肪酸的酰基键合而成的,酰基的链长不同的各种结构的酰基肉毒碱成为分析的对象。
如非专利文献2所公开那样,在通常的酰基肉毒碱分析中,利用串联型质谱分析装置中的多反应监测(Multiple Reaction Monitoring:MRM)测定,实施了将源自质荷比(严格的是斜体字的“m/z”,但本说明书中用习惯使用的“质荷比”或“m/z”)根据酰基的链长而不同的酰基肉毒碱分子的前体离子与m/z 85(准确的是84.95)的特征产物离子组合的定量分析。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:野町祥介、ほか8名、“タンデム質量分析計による新生児マス·スクリーニングの試験研究2008年度(4年目)実施成績”、札幌市衛研年報、Vol.36、2009年、pp.42-48
非专利文献2:重松陽介、“質量分析法による新生児マススクリーニングの実相”、日本質量分析学会、Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan、Vol.64、No.4、2016年、pp.127-131
发明内容
发明要解决的问题
然而,在以往的酰基肉毒碱分析方法中存在下面那样的问题。
在新生儿大规模筛查中,需要迅速分析大量的检查体,因此不进行利用液相色谱仪(LC)的分离,而是利用流动注射分析法(Flow Injection Analysis:FIA)与MRM测定的组合。因此,无法区别MRM母子离子对(transition)(前体离子的质荷比与产物离子的质荷比的组合)相同的异构体。
例如,如非专利文献2中也指出的那样,C5酰基肉毒碱(具有碳数为5的酰基的酰基肉毒碱)除了包含异戊酰基肉毒碱(Isovalerylcarnitine)之外,还包含新戊酰基肉毒碱(Pivaloylcarnitine)等异构体。异戊酰基肉毒碱为先天性疾病相关的代谢物,与此相对地,新戊酰基肉毒碱主要是源自药剂的代谢物,该药剂源自一部分抗菌剂所包含的匹伏基(pivoxil group)。因此,即使在通过酰基肉毒碱分析而检测到C5酰基肉毒碱的异常增加而成为筛选阳性的情况下,也有可能并不是原本想要检测的先天因素而是不需要检测的药剂的影响导致的假阳性。上述抗菌剂是以比较高的频率针对新生儿配的药剂,因此,比较多地出现源自该药剂的假阳性。
据此,在关于C5酰基肉毒碱而为筛选阳性的情况下,需要实施利用液相色谱质谱分析等其它分析法的追加检查,来确定是否是先天因素。在通常的新生儿筛查中,从新生儿进行采血来制备试样,因此上述那样的追加检查的实施特别是对于新生儿而言是很大的身体负担。另外,当在筛查中为阳性时,使新生儿的父母背负非常大的心理负担。因此,重要的是,尽可能地减少假阳性,并且,即使需要追加检查,也能够告知父母存在源自药剂的暂时性假阳性的可能性。
上述的问题不限于C5酰基肉毒碱,例如C4酰基肉毒碱也是同样的,该C4酰基肉毒碱包括作为短链酰基CoA脱氢酶缺乏症、戊二酸血症II型等先天性疾病相关的代谢物而被知晓的丁酰基肉毒碱(Butyrylcarnitine)以及作为其异构体的异丁酰基肉毒碱(Isobutyrylcarnitine)。
另外,在上述的异构体的情况下分子量完全相同,但若分子量不同却相当接近,则由于质谱分析装置的性能的制约,有时无法根据质量识别不同的酰基肉毒碱。
例如,关于作为戊二酸血症I型等先天性疾病相关的代谢物而被知晓的戊二酰基肉毒碱(Gultarylcarnitine)以及羟基己酰基肉毒碱(Hydroxyhexanoylcarnitine),虽然化学式不同,但整数质量相同,无法通过质量分辨率比较低的质谱分析装置来进行识别。另外,关于作为丙二酸血症等先天性疾病相关的代谢物而被知晓的丙二酰基肉毒碱(Malonylcarnitine)以及作为3-羟基酰基CoA脱氢酶缺乏症等先天性疾病相关的代谢物而被知晓的3-羟基丁酰基肉毒碱(3-Hydroxybutyrylcarnitine),虽然化学式不同,但整数质量相同,无法通过质量分辨率比较低的质谱分析装置来进行识别。
关于这样的整数质量相同的多个酰基肉毒碱的识别,虽然通常大多能够通过液相色谱质谱分析装置进行,但效率差,不适于筛查。
本发明的一个方式是为了解决上述问题而完成的,其目的在于提供能够在新生儿大规模筛查等中对C5酰基肉毒碱中所包含的由先天因素造成的酰基肉毒碱以及主要源自药剂的异构体进行识别的、酰基肉毒碱的分析方法以及分析装置。
另外,本发明的另一方式是为了解决上述问题而完成的,其目的在于提供能够在新生儿大规模筛查等中效率良好且精度良好地识别质量完全相同或实质相同的多个酰基肉毒碱的、酰基肉毒碱的分析方法以及分析装置。
用于解决问题的方案
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的一个方式是使用串联型质谱分析装置来分析C5酰基肉毒碱的方法,其中,所述C5酰基肉毒碱是具有碳数为5的酰基的酰基肉毒碱,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,对检查体实施基于m/z 246>187、m/z 246>57、m/z 246>41以及m/z 246>29中的至少一个多反应监测(MRM)母子离子对的MRM测定;以及
处理步骤,使用在所述测定步骤中得到的测定结果,来识别所述检查体中的异戊酰基肉毒碱和作为其异构体的新戊酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的C5酰基肉毒碱中是否包含新戊酰基肉毒碱。
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的另一方式是使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,对检查体实施针对使信号强度最大的MRM母子离子对的第一MRM测定、以及针对与所述使信号强度最大的MRM母子离子对不同的MRM母子离子对的第二MRM测定,来获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息;以及
处理步骤,基于确认离子比,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者,所述确认离子比为通过所述第一MRM测定得到的信号强度与通过所述第二MRM测定得到的信号强度之比。
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的又一方式是使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,对检查体实施针对互不相同的特定的MRM母子离子对的MRM测定,来获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息,其中,所述互不相同的特定的MRM母子离子对是针对所述多个不同的酰基肉毒碱而分别决定的;以及
处理步骤,基于通过所述测定步骤得到的针对特定的MRM母子离子对的信号强度,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的又一方式是,一种酰基肉毒碱分析方法,其是使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,针对检查体一边在特定的MRM母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施MRM测定,分别获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息;以及
处理步骤,基于在所述测定步骤中得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
另外,为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的一个方式具备:
测定部,其是对检查体实施基于m/z 246>187、m/z 246>57、m/z 246>41以及m/z246>29中的至少一个多反应监测(MRM)母子离子对的MRM测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其使用通过所述测定部得到的测定结果,来识别所述检查体中的异戊酰基肉毒碱和作为其异构体的新戊酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的C5酰基肉毒碱中是否包含新戊酰基肉毒碱,其中,所述C5酰基肉毒碱是具有碳数为5的酰基的酰基肉毒碱。
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的另一方式具备:
测定部,其是对检查体实施针对使信号强度最大的MRM母子离子对的第一MRM测定、以及针对与所述使信号强度最大的MRM母子离子对不同的MRM母子离子对的第二MRM测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其基于确认离子比,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者,所述确认离子比为通过所述测定部中的所述第一MRM测定得到的信号强度与通过所述第二MRM测定得到的信号强度之比。
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的又一方式具备:
测定部,其是对检查体实施针对互不相同的特定的MRM母子离子对的MRM测定的串联型质谱分析装置,所述互不相同的特定的MRM母子离子对是针对所述多个不同的酰基肉毒碱而分别决定的;以及
处理部,其基于通过所述测定部得到的针对特定的MRM母子离子对的信号强度,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
为了解决上述问题而完成的本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的又一方式具备:
测定部,其是针对检查体一边在特定的MRM母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施MRM测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其基于通过所述测定部得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
此处,“质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱”有可能存在例如为异构体那样质量完全相同的酰基肉毒碱的情况、以及为虽然严格的质量互不相同但例如其差异是无法通过所使用的质谱分析装置来进行区别的程度例如整数质量相同的酰基肉毒碱的情况。
另外,在本发明的上述方式中,串联型质谱分析装置典型的是能够设为三重四极杆型质谱分析装置或四极杆-飞行时间型(Q-TOF型)质谱分析装置。
此处,基于m/z A>B的MRM母子离子对的MRM测定是通过前级质量分离器选择具有m/z A的前体离子、检测源自该m/z A的前体离子的m/z B的产物离子的测定。因而,在进行该MRM测定的串联型质谱分析装置为三重四极杆型质谱分析装置的情况下,利用前级四极滤质器使m/z A的前体离子选择性通过,利用后级四极滤质器使源自该m/z A的前体离子的具有m/z B的产物离子选择性通过并进行检测。另外,在进行该MRM测定的串联型质谱分析装置为Q-TOF型质谱分析装置的情况下,利用前级四极滤质器(Q)使具有m/z A的前体离子选择性通过,利用后级的飞行时间型质量分离器(TOF)和离子检测器来检测源自该m/z A的前体离子的产物离子中的、包含m/z B在内的产物离子。
另外,本发明的上述一个方式中的MRM母子离子对中的质荷比的值m/z246、m/z187、m/z 57、m/z 41、m/z 29以及后述的MRM母子离子对中的质荷比的值m/z 85为整数值,但若表示到小数点后2位,则分别为m/z 246.15、m/z 187.05、m/z 57.00、m/z 41.10、m/z29.15以及m/z 84.95,通常其为最期望的(即想要设为目标的)值。
其中,实际上,由四极滤质器等质量分离器选择的离子的质荷比值当然依赖于所使用的装置的性能。因而,在本说明书和权利要求书中例如记载为m/z 246的情况下,虽然最期望的离子的质荷比值为m/z 246.15,但在期望的离子中也能够包含m/z 246.15±0.1、m/z 246.15±0.2、m/z 246.15±0.3或m/z246.15±0.4的范围内的离子。换言之,在设为用整数值表示质荷比值时,能够设为包含应表述为m/z 246的离子,不包含应表述为m/z 245和m/z 247的离子。对于其它质荷比值也是同样的。
发明的效果
在本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法及酰基肉毒碱分析装置的一个方式中,不将以往通常在酰基肉毒碱的定量中利用的m/z 85的能够以高灵敏度进行检测的产物离子,而是将与其相比检测灵敏度较低的、m/z 187、m/z 57、m/z 41、m/z 29这4种产物离子中的任一种或多种用于新戊酰基肉毒碱的识别或判定。当然,也可以组合使用该4种产物离子与以往使用的m/z 85的产物离子。
根据本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法和酰基肉毒碱分析装置的一个方式,能够在不进行由液相色谱仪的柱进行的成分分离的情况下进行以往困难的异戊酰基肉毒碱与新戊酰基肉毒碱的识别、或者在检测到的C5酰基肉毒碱中是否有可能含有新戊酰基肉毒碱的判定。由此,能够减少针对C5酰基肉毒碱的筛查中的假阳性。另外,即使在针对C5酰基肉毒碱的筛查中为阳性的情况下,也能够告知用户其主要原因有可能是源自药剂的新戊酰基肉毒碱。其结果,能够对新生儿减轻身体负担,或减轻对在筛查中为阳性的新生儿的父母的心理负担。
另外,根据本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法和酰基肉毒碱分析装置的另一方式,能够在不进行由液相色谱仪的柱进行的成分分离的情况下容易地进行以往困难的分子量完全相同的作为异构体的酰基肉毒碱彼此的识别、或者因质谱分析装置的质量分辨率的制约等而难以区分的整数质量相同的酰基肉毒碱彼此的识别。由此,能够高效且精度良好地进行因遗传因素导致的先天性代谢异常病等的筛查。
附图说明
图1为本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的一个实施方式的主要部分的结构图。
图2为示出MRM母子离子对:m/z 246.15>187.05下的、关于异戊酰基肉毒碱(i-C5)和新戊酰基肉毒碱(p-C5)的碰撞能量与峰强度的关系的曲线图。
图3为示出MRM母子离子对:m/z 246.15>84.95下的、关于i-C5和p-C5的碰撞能量与峰强度的关系的曲线图。
图4为示出MRM母子离子对:m/z 246.15>57.00下的、关于i-C5和p-C5的碰撞能量与峰强度的关系的曲线图。
图5为示出MRM母子离子对:m/z 246.15>41.10下的、关于i-C5和p-C5的碰撞能量与峰强度的关系的曲线图。
图6为示出MRM母子离子对:m/z 246.15>29.15下的、关于i-C5和p-C5的碰撞能量与峰强度的关系的曲线图。
图7为示出判定为在试样中不含有p-C5的情况下的色谱图波形的实测例的图。
图8为示出判定为在试样中存在含有p-C5的可能性的情况下的色谱图波形的实测例的图。
图9为示出将MRM母子离子对:m/z 246.15>84.95设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 246.15>187.05设为确认离子时的、关于i-C5和p-C5的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图10为示出使用MRM母子离子对:m/z 246.15>84.95及m/z246.15>187.05、分别实测i-C5和p-C5的标准试样而得到的色谱图波形的图。
图11为示出使用MRM母子离子对:m/z 246.15>84.95及m/z246.15>187.05的情况下的、针对i-C5和p-C5的标准试样的色谱图波形的比较的图。
图12为示出使用MRM母子离子对:m/z 246.15>187.05的情况下的、试样中的i-C5的比例与确认离子比的关系的图。
图13为示出将MRM母子离子对:m/z 232>85设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z232>173设为确认离子时的、关于丁酰基肉毒碱(BCA)和异丁酰基肉毒碱的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图14为示出将MRM母子离子对:m/z 232>85设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z232>57设为确认离子时的、关于丁酰基肉毒碱(BCA)和异丁酰基肉毒碱的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图15为示出将MRM母子离子对:m/z 232>85设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z232>41设为确认离子时的、关于丁酰基肉毒碱(BCA)和异丁酰基肉毒碱(IBCA)的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图16为示出将MRM母子离子对:m/z 232>85设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z232>29设为确认离子时的、关于BCA和IBCA的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图17为示出对含有戊二酰基肉毒碱(C5-DC)的试样进行m/z 276>87、m/z276>69的MRM母子离子对下的实测的色谱图波形的图。
图18为示出对含有羟基己酰基肉毒碱(C6-OH)的试样进行m/z 276>87、m/z 276>69的MRM母子离子对下的实测的色谱图波形的图。
图19为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>189.1设为确认离子时的、关于丙二酰基肉毒碱(C3-DC)和3-羟基丁酰基肉毒碱(C4-OH)的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图20为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>144.1设为确认离子时的、关于C3-DC和C4-OH的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图21为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>103.1设为确认离子时的、关于C3-DC和C4-OH的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图22为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>58.1设为确认离子时的、关于C3-DC和C4-OH的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图23为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>57.1设为确认离子时的、关于C3-DC和C4-OH的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图24为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>45.1设为确认离子时的、关于C3-DC和C4-OH的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图25为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>43.1设为确认离子时的、关于C3-DC和C4-OH的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
图26为示出将MRM母子离子对:m/z 248.2>85.1设为定量离子、将MRM母子离子对:m/z 248.2>29.2设为确认离子时的、关于C3-DC和C4-OH的确认离子比的碰撞能量依赖性的曲线图。
具体实施方式
以下,参照附图来说明本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法和酰基肉毒碱分析装置的一个实施方式。
[本实施方式的酰基肉毒碱分析装置的结构]
图1为本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的一个实施方式的概要结构图。
该酰基肉毒碱分析装置主要用于新生儿筛查中的用于诊断先天性有机酸/脂肪酸代谢异常病的酰基肉毒碱分析。本分析装置包括试样导入部1、测定部2、数据处理部3、分析控制部4、中央控制部5、输入部6以及显示部7。
试样导入部1为基于FIA法进行试样导入的装置,试样导入部1包括贮存有流动相(溶剂)的流动相容器11、从流动相容器11抽吸流动相并输送的送液泵12、向流动相中注入试样的喷射器(injector)13。一般而言,这些各结构要素能够使用液相色谱仪中的单元。另外,虽然未图示,但通常使自动进样器连接于喷射器13,以依次分析多个检查体。此外,在一般的新生儿筛查的情况下,如非专利文献2也记载的那样,试样是从滤纸血提取/制备而成的。但是,试样不限于此,也能够是从尿或其它体液等制备而成的。
测定部2是作为串联型质谱分析装置的一种的三重四极杆型质谱分析装置,测定部2具备:维持为大致大气压的电离室201、以及分别利用真空泵(未图示)进行真空排气的第一中间真空室202、第二中间真空室203及高真空室204。在电离室201设置有通过电喷雾电离(ElectroSpray Ionization:ESI)法进行电离的ESI喷雾器21,用脱溶剂管22连接电离室201与下级的第一中间真空室202之间。在第一中间真空室202内配置有一边使离子收敛一边输送离子的离子引导件23,通过形成于分离器(skimmer)24的顶部的小孔连通第一中间真空室202与下级的第二中间真空室203之间。在第二中间真空室203内也配置有一边使离子收敛一边输送离子的多极型离子引导件25。
在高真空室204内,沿着离子的流动配置有前级四极滤质器26、碰撞池(collisioncell)27、后级四极滤质器28以及离子检测器29。在碰撞池27的内部配置有四极型的离子引导件。前级四极滤质器26和后级四极滤质器28分别具有使具有规定的质荷比的离子选择性通过的功能。具有从外部向碰撞池27的内部导入氩等惰性的碰撞诱导解离(Collision-Induced Dissociation:CID)气体、通过使被导入的离子与CID气体接触而发生解离并生成产物离子的功能。
数据处理部3接受来自离子检测器29的检测数据,并基于该数据进行处理,数据处理部3包括数据收集部31、峰强度计算部32、成分判定部33作为功能块。分析控制部4根据存储在分析条件存储部41中的分析条件文件,来控制试样导入部1和测定部2的动作。中央控制部5主要执行统一控制以及通过输入部6、显示部7等的用户接口。
一般而言,数据处理部3、分析控制部4和中央控制部5的实体为个人计算机或更高性能的被称为工作站的计算机,通过使预先安装于该计算机的专用的软件(计算机程序)在该计算机上动作,从而能够实现上述各功能块的功能。
[MRM测定动作的概要说明]
在图1所示的酰基肉毒碱分析装置中,在分析酰基肉毒碱时,使用测定部2反复实施针对规定的MRM母子离子对的MRM测定。概要地说明该MRM测定时的动作。
在试样导入部1中,送液泵12从流动相容器11抽吸流动相,并将流动相以大致恒定流速送至喷射器13。喷射器13在规定的时刻向流动相中注入规定量的试样(检查体)。试样随着流动相的流动而到达测定部2的ESI喷雾器21。在到达ESI喷雾器21为止的流路中,试样沿前后方向扩散。因此,导入到ESI喷雾器21中的试样的量虽然起初极少,但迅速增加,当超过最大点时迅速减少而变为零。即,该试样的浓度分布相对于时间经过呈接近高斯分布的峰状。
在ESI喷雾器21中,试样以微细的带电液滴的形式被喷雾到电离室201内。带电液滴与残留气体分子接触而发生分裂,在该液滴中的溶剂气化的过程中,试样中的化合物分子被电离。所生成的离子经过脱溶剂管22被送至第一中间真空室202,进而经过离子引导件23、分离器24的小孔、多极型离子引导件25被送至高真空室204。源自试样的离子被导入到前级四极滤质器26中,仅具有与施加到构成前级四极滤质器26的电极的电压对应的规定的质荷比的离子作为前体离子选择性穿过。射入到碰撞池27中的前体离子与CID气体接触而发生解离,生成各种产物离子。
所生成的各种产物离子被导入到后级四极滤质器28中,仅具有与施加到构成后级四极滤质器28的电极的电压对应的规定的质荷比的产物离子选择性穿过,到达离子检测器29。离子检测器29生成与所入射的离子的量相应的检测信号,由未图示的模拟数字转换器进行了数字化后的检测数据被输入至数据处理部3。
分析控制部4控制测定部2,以使与作为目标的MRM母子离子对相应的电压分别施加到前级四极滤质器26和后级四极滤质器28的电极。由此,得到表示源自试样中所含有的化合物的离子中、与特定的MRM母子离子对对应的离子、即具有特定的质荷比的前体离子解离而生成的具有特定的质荷比的产物离子的离子强度的检测数据。
[C5酰基肉毒碱的分析方法的原理]
接着,对本实施方式的酰基肉毒碱分析装置的特征性的分析方法的原理进行说明。
在测定部2中,前体离子在碰撞池27内被CID解离,但其解离的方式根据前体离子所具有的动能而不同。该动能为碰撞能量(CE)。碰撞能量由碰撞池27的入口端与其前级(在图1中为前级四极滤质器26,但也有时为其它的离子透镜等离子光学元件)的直流电位差决定,因此通常碰撞能量由该电位差表示。因而,能够利用对前级四极滤质器26以及其前级的离子光学元件中的任一者或两者施加的直流偏置电压来调整碰撞能量。
如上所述,当使碰撞能量发生变化时,前体离子的解离的方式发生变化,多种产物离子的生成模式发生变化。为了提高检测灵敏度,期望选择离子强度尽可能大的产物离子(即MRM母子离子对)。因此,在以往的C5酰基肉毒碱分析中,使离子强度最大的m/z 246.15>84.95的MRM母子离子对被用作用于判定有无该成分或计算含量的定量离子。然而,如已经描述那样,在m/z246.15>84.95下,无法区分与先天性的代谢异常相关的异戊酰基肉毒碱与主要源自抗菌剂的新戊酰基肉毒碱。因此,本发明人针对与C5酰基肉毒碱相关的各种MRM母子离子对,通过实验仔细地调查了碰撞能量与离子强度的关系。
图2~图6为示出通过实验求出的、各不相同的MRM母子离子对下的、关于异戊酰基肉毒碱(以下有时省略为“i-C5”)和新戊酰基肉毒碱(以下有时省略为“p-C5”)的碰撞能量与峰强度的关系的曲线图。
上述实验通过如下过程来进行。
从i-C5和p-C5的标准品中分别使用超纯水来制备100μg/L水溶液,并将其作为试样。作为质谱分析装置,使用岛津制作所制的LCMS-8060,首先,对i-C5与p-C5的共同的前体离子(m/z 246.15)实施产物离子扫描测定,搜索出各个化合物中特有的产物离子。其结果,知晓了:未观测到源自各个化合物的特有的产物离子,作为能够得到某种程度高的峰强度的代表性的产物离子,存在m/z 187.05、m/z 84.95、m/z 57.00、m/z 41.10、m/z 29.15这5种。
接着,对该5种产物离子分别测定了使碰撞能量的设定值以5V为步长在-100V~-10V的范围内发生变化时的峰强度。图2~图6示出了其结果。其中,在图2~图6中,为了容易比较相对于碰撞能量的变化的峰强度图案,将图案进行了标准化,以在i-C5和p-C5的各峰强度图案中使峰强度的最大值为1。
在用于以往的C5酰基肉毒碱的定量的、图3所示的MRM母子离子对:m/z 246.15>84.95的情况下,i-C5和p-C5中的峰强度图案几乎不能看出差异。与此相对地,在m/z246.15>57.00、m/z 246.15>41.10、m/z 246.15>29.15这3种MRM母子离子对的情况下,i-C5和p-C5中的峰强度图案能看出差异。特别是在m/z 246.15>41.10的情况下,在碰撞能量的几乎整个范围内,峰强度都能看出明确的差异。在其以外的m/z 246.15>57.00、m/z 246.15>29.1的情况下,根据碰撞能量,峰强度能看到充分的差异。根据这种实验性的见解,知晓了:通过利用这些特定的MRM母子离子对下的i-C5和p-C5中的峰强度或峰强度图案的差异,从而能够进行i-C5与p-C5的识别。
[i-C5与p-C5的识别方法的具体例]
如上所述,仅从图2~图6来看,在i-C5和p-C5中产生最大的差异的MRM母子离子对为m/z 246.15>41.10。因此,在上述实施方式的酰基肉毒碱分析装置中,在分析控制部4的控制下测定部2对相同的未知试样分别反复实施CE=-22V、m/z 246.15>84.95下的MRM测定、以及CE=-45V、m/z 246.15>41.10下的MRM测定。从由喷射器13注入试样的时刻起到经过规定的时间的时刻为止反复实施MRM测定。由此,在数据收集部31中存储作为各个MRM测定结果的、构成表示离子强度数据的时间经过的色谱图波形的数据。
峰强度计算部32根据数据收集部31中存储的数据,来制作与上述2种MRM母子离子对分别对应的色谱图波形,在该波形上进行峰检测来求出峰顶的值(峰强度值)。此外,此处使用峰强度值作为用于后述的运算处理的信号强度,但也可以计算从峰起始点至结束点为止的峰的面积值并将其用作信号强度,来代替峰强度值。
在未知试样中所含有的C5酰基肉毒碱为i-C5的情况以及未知试样中所含有的C5酰基肉毒碱为p-C5的情况下,m/z 246.15>84.95的MRM母子离子对下的信号强度A1几乎没有差异。与此相对地,在为i-C5的情况以及为p-C5的情况下,m/z 246.15>41.10的MRM母子离子对下的信号强度A2有充分的差异。因此,成分判定部33计算m/z 246.15>84.95的MRM母子离子对下的信号强度A1与m/z 246.15>41.10的MRM母子离子对下的信号强度A2之间的强度比A2/A1。
此外,若将m/z 246.15>84.95的MRM母子离子对下检测的离子设为定量离子,将m/z 246.15>41.10的MRM母子离子对下检测的离子设为确认离子,则上述强度比A2/A1为所谓的确认离子比。因此,以下将该强度比A2/A1称为确认离子比。
由图5可知,在CE=-45V的情况下,i-C5的峰强度比p-C5的峰强度更大。因而,若C5酰基肉毒碱为i-C5(不含有p-C5),则上述确认离子比的值较大,若C5酰基肉毒碱为p-C5或含有p-C5,则确认离子比的值相对较小。
因此,关于确认离子比预先决定被视为i-C5的判定范围,成分判定部33判定基于实测结果计算出的确认离子比是否处于该判定范围内。而且,在确认离子比的值处于判定范围内的情况下,判定为未知试样中所含有的C5酰基肉毒碱是i-C5。另一方面,在确认离子比的值偏离了判定范围的情况下,判定为试样中所含有的C5酰基肉毒碱中含有p-C5。也就是说,即使在通过C5酰基肉毒碱的检测而判定为阳性的情况下,也判定为有可能假阳性。中央控制部5接收成分判定部33的判定结果,并将其显示在显示部7的画面上。
如上所述,即使在判定为试样中所含有的C5酰基肉毒碱中含有p-C5的情况下,也无法判断为不含有i-C5,因此需要再检查。然而,确认到该结果的医生能够根据例如对被检者(新生儿)的用药历史记录等而判断为所检测到的C5酰基肉毒碱源自抗生素的可能性较高。因而,即使在筛查中为阳性的情况下,也能够向新生儿的父母进行起因于抗生素而非先天因素的可能性较高这样的建议。
根据本发明人的实验,在上述的装置的种类、分析条件下能够选定1.4%~2.6%的范围作为确认离子比的值的判定范围。这是将中心值设定为2%、将允许幅度设定为±30%而得到的。在该情况下,若基于实测数据的确认离子比的值处于1.4%~2.6%的范围内,则能够判定为未知试样中所含有的C5酰基肉毒碱为i-C5,若该确认离子比的值偏离了1.4%~2.6%的范围,则能够判定为未知试样中所含有的C5酰基肉毒碱有可能为p-C5。当然,该判定范围依赖于装置的种类、分析条件等。因而,需要事先通过实验等来决定适当的判定范围。
图7和图8为示出对是否正确判定i-C5和p-C5进行实验所得到的结果的色谱图波形图,图7为针对含有i-C5的试样的色谱图波形图,图8为针对含有p-C5的试样的色谱图波形图。成分浓度均为100μg/L。m/z 246.15>41.00的峰的强度比m/z 246.15>84.95的峰的强度小而难以看到,因此,在图7和图8中,将m/z 246.15>41.00的色谱图的纵轴(强度轴)扩大30倍后示出。
在图7所示的例子中,确认离子比的值处于1.4%~2.6%的判定范围内,因此判定为是i-C5。另外,在图8所示的例子中,确认离子比的值偏离1.4%~2.6%的判定范围,因此判定为有可能是p-C5。这样,在实验上确认了能够通过使用上述的2种MRM母子离子对下的信号强度之比、即确认离子比来准确地识别i-C5与p-C5。
[i-C5与p-C5的识别方法的其它例]
只要看到图5可知,对于i-C5与p-C5而言,相对于碰撞能量的变化的峰强度图案明确不同。另外,峰强度显示为最大的碰撞能量值本身不同。因此,也能够利用该现象来识别i-C5与p-C5。
具体而言,在分析控制部4的控制下,测定部2针对未知试样一边在m/z246.15>41.10的MRM母子离子对下使碰撞能量以规定步长幅度进行变化一边获取离子强度数据。在数据处理部3中,峰强度计算部32基于所得到的数据,制作图5所示那样的峰强度图案。成分判定部33通过将该峰强度图案与针对i-C5和p-C5分别预先求出的峰强度图案进行比较,从而判定是仅为i-C5还是有可能为p-C5。
或者,在数据处理部3中,峰强度计算部32根据峰强度图案求出离子强度成为峰(最大)的碰撞能量值。然后,成分判定部33通过调查所得到的碰撞能量值是否符合针对i-C5和p-C5分别预先求出的显示峰强度最大的碰撞能量值中的任一者、或者是否与任一者相近,从而判定是仅为i-C5还是有可能为p-C5。
另外,在基于上述实施方式的装置的说明中,利用了在i-C5与p-C5中峰强度图案存在最大差异的MRM母子离子对:m/z 246.15>41.10,但由图4和图6可知,在其它2种MRM母子离子对(m/z 246.15>57.00、m/z 246.15>29.15)下,在i-C5与p-C5中峰强度也根据碰撞能量的值而出现充分的差异。因而,即使使用这些MRM母子离子对(m/z 246.15>57.00、m/z246.15>29.15)来代替m/z246.15>41.10,也能够识别i-C5与p-C5。
在图2所示的峰强度图案中,在m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对下,i-C5与p-C5未出现明确的差异。与此相对地,绘制出将在m/z 246.15>84.95的MRM母子离子对下检测的离子设为定量离子、将在m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对下检测的离子设为确认离子的确认离子比的碰撞能量依赖性的图为图9。
另外,图10为示出使用MRM母子离子对:m/z 246.15>84.95和m/z246.15>187.05分别实测i-C5和p-C5的标准试样而得到的色谱图波形的图。在图10的(a)所示的i-C5的色谱图中,确认离子比((b1/a1)×100)为17.5%,与此相对地,在图10的(b)所示的p-C5的色谱图中,确认离子比((b2/a2)×100)为25.5%,存在明确的差异。
由这些结果可知,i-C5与p-C5在将m/z 246.15>187.05设为确认离子的确认离子比方面也存在明确的差异。即,除了上述的3种MRM母子离子对之外,m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对也能够用于i-C5与p-C5的识别。
图11为示出使用m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对和m/z246.15>41.10的MRM母子离子对的情况下的、针对i-C5和p-C5的标准试样的色谱图波形之间的比较的图。碰撞能量设定为在各个MRM母子离子对下灵敏度最高的值。
由该实测结果可知,m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对与m/z246.15>41.10的MRM母子离子对相比,关于i-C5的检测灵敏度高约9倍,关于p-C5的检测灵敏度高约18倍。即,通过使用m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对,从而能够以比其它MRM母子离子对更高的灵敏度识别i-C5与p-C5。
图12为示出根据实测结果求出的、使用m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对的情况下的、试样中的i-C5的比例与确认离子比的关系的图。如图12所示,试样中的i-C5的比例与确认离子比为由一次方程、即直线表示的关系。因此,在上述实施方式的装置中,将预先实验得到的上述关系设为标准曲线并存储于成分判定部33,能够使用该标准曲线根据从对试样的实测得到的确认离子比,来估计i-C5或p-C5的比例。这样的利用确认离子比的i-C5或p-C5的比例的估计也能够使用除m/z 246.15>187.05以外的MRM母子离子对来实施。
但是,若i-C5或p-C5的检测灵敏度低,则难以确保充分的精度。与此相对地,如上所述,在m/z 246.15>187.05的MRM母子离子对下,检测灵敏度比其它MRM母子离子对高,因此能够提高i-C5或p-C5的比例的估计精度。
另外,在上述说明中,基于仅1种MRM母子离子对的测定结果来识别出i-C5与p-C5,但也能够通过组合在多种MRM母子离子对下得到的离子强度的信息来提高判定的可靠度。
对异戊酰基肉毒碱与作为其异构体的新戊酰基肉毒碱的识别进行了说明,但也能够通过同样的方法来识别其它酰基肉毒碱。对其若干例进行说明。
[BCA与IBCA的识别]
C4酰基肉毒碱(具有碳数为4的酰基的酰基肉毒碱)除了包含丁酰基肉毒碱(以下有时省略为“BCA”)还包含异丁酰基肉毒碱(以下有时省略为“IBCA”)等异构体。丁酰基肉毒碱作为短链酰基CoA脱氢酶缺乏症、戊二酸血症II型等先天性疾病相关的代谢物而被知晓,但由于除了与作为其异构体的异丁酰基肉毒碱质量相同之外还不具有通过解离而生成的产物离子的特异性,因此难以进行识别。
图13~图16为示出针对BCA和IBCA实测将基于灵敏度最高的m/z232>85的MRM母子离子对的产物离子设为定量离子、将其以外的主要4种MRM母子离子对(m/z 232>173、m/z232>57、m/z 232>41、m/z 232>29)下的产物离子设为确认离子时的确认离子比的碰撞能量依赖性而得到的结果的曲线图。
由该结果可知,在m/z 232>173、m/z 232>57、m/z 232>41、m/z 232>29这4种MRM母子离子对中的任一者下,对于BCA与IBCA而言在特定的碰撞能量下确认离子比均存在充分的差异。据此,与i-C5和p-C5的识别同样地,能够通过利用确认离子比来识别BCA与IBCA。另外,若考虑色谱图中观测的峰强度的大小、即检测灵敏度以及针对BCA和IBCA的确认离子比之差的大小,则可以说在上述的4种MRM母子离子对之中优选m/z 232>173作为确认离子。
[C5-DC与C6-OH的识别]
上述例子均为用于识别由于化合物的化学式相同而质量完全相同的酰基肉毒碱彼此的例子,但即使是化学式不同的酰基肉毒碱彼此,也存在由于质量差极其微小而无法依靠整数质量进行区分的情况。
例如,戊二酰基肉毒碱(以下有时省略为“C5-DC”)作为戊二酸血症I型等先天性疾病相关的代谢物而被知晓,精确的分子量为275.1368806。另一方面,虽然羟基己酰基肉毒碱(以下有时省略为“C6-OH”)的精确的分子量为275.173264而能够通过小数点以下的精确的质量与C5-DC进行识别,但是,无法使用在上述实施方式的装置中使用的一般的三重四极杆型质谱分析装置根据质量进行识别。另外,对于C5-DC和C6-OH而言,灵敏度最好的MRM母子离子对都是m/z 276>85,也难以根据该MRM母子离子对下的离子峰强度进行识别。
因此,判明了:在针对C5-DC和C6-OH分别一边使碰撞能量进行变化一边将前体离子设为m/z 276来实施产物离子扫描测定时,在特定的碰撞能量下分别能观测到特异性的产物离子。具体而言,在碰撞能量为-30V附近时,对于C5-DC而言能特异性地检测到m/z 276>87的MRM母子离子对下的产物离子,对于C6-OH而言能特异性地检测到m/z 276>69的MRM母子离子对下的产物离子。
图17和图18为示出针对分别含有C5-DC和C6-OH的试样进行m/z276>87、m/z 276>69这2种MRM母子离子对下的实测得到的色谱图波形的图。在各图中,针对C5-DC和C6-OH还一并示出了以往用作定量离子的m/z276>85的MRM母子离子对下的实测得到的色谱图波形。
如图17中的A、B所示,对于C5-DC而言,在m/z 276>87的MRM母子离子对下观测到明确的峰,与此相对地,在m/z 276>69的MRM母子离子对下未观测到峰。反之,如图18中的C、D所示,对于C6-OH而言,在m/z 276>69的MRM母子离子对下观测到明确的峰,与此相对地,在m/z 276>87的MRM母子离子对下未观测到峰。因而,能够基于这两个MRM母子离子对、即m/z276>69和m/z 276>87的峰强度,来识别试样中所含有的酰基肉毒碱是C5-DC还是C6-OH。
这样,对于整数质量相同的C5-DC和C6-OH,不是利用两者共同的定量离子,而是能够利用特异性的确认离子的信号强度来进行识别。
[C3-DC和C4-OH的识别]
作为另一例,丙二酰基肉毒碱(以下有时省略为“C3-DC”)作为丙二酸血症等先天性疾病相关的代谢物而被知晓,精确的分子量为247.1055822。另一方面,3-羟基丁酰基肉毒碱(以下有时省略为“C4-OH”)作为3-羟基酰基CoA脱氢酶缺乏症等先天性疾病相关的代谢物而被知晓,精确的分子量为247.1419656。虽然能够根据小数点以下的精确的质量来识别C3-DC和C4-OH,但与上述例同样地无法进行根据整数质量的识别。另外,灵敏度最好的MRM母子离子对都是m/z 248>85,也难以进行根据该峰强度的识别。
如上述例那样,在C3-DC和C4-OH中确认了有无特异性的产物离子,但并不存在在C5-DC与C6-OH之间发现的特异性的产物离子。因此,研究了是否能够使用上述的特定的碰撞能量下的确认离子比的差异来进行识别。
图19~图26为示出针对C3-DC和C4-OH实测将基于灵敏度最高的m/z248.2>85.1的MRM母子离子对的产物离子设为定量离子、将其以外的主要8种MRM母子离子对(m/z 248.2>189.1、m/z 248.2>144.1、m/z 248.2>103.1、m/z 248.2>58.1、m/z 248.2>57.1、m/z 248.2>45.1、m/z 248.2>43.1、m/z248.1>29.2)下的产物离子设为确认离子时的、确认离子的碰撞能量依赖性而得到的结果的曲线图。
由该结果可知,在m/z 248.2>189.1、m/z 248.2>144.1、m/z 248.2>103.1、m/z248.2>58.1、m/z 248.2>57.1、m/z 248.2>45.1、m/z 248.2>43.1、m/z248.1>29.2这8种MRM母子离子对中的任一者下,对于C3-DC和C4-OH而言,在特定的碰撞能量下确认离子比均存在充分的差异。据此,与BCA和IBCA的识别同样地,能够通过利用规定的确认离子下的确认离子比来识别C3-DC和C4-OH。
如上所述,根据本实施方式的酰基肉毒碱分析装置及其变形例,能够容易地识别i-C5和p-C5、BCA和IBCA等分子量完全相同的酰基肉毒碱彼此或C5-DC和C6-OH、或者C3-DC和C4-OH等整数质量相同的酰基肉毒碱彼此。作为该识别中可利用的信息,为特定的碰撞能量下的定量离子的信号强度与确认离子的信号强度之比、即确认离子比、特定的确认离子下的与碰撞能量的变化对应的峰强度的变化的图案、以及各酰基肉毒碱中观察到特异性的确认离子的信号强度中的任一者。
另外,上述实施方式的酰基肉毒碱分析装置能够如下面那样进行变形。即,在上述实施方式的装置中,采用了利用流动注射分析法的试样导入,在该流动注射分析法中,在喷射器13与ESI喷雾器21之间不设置柱,向利用送液泵12输送的流动相中注入试样液,在不使用柱进行成分分离的情况下将试样液导入到ESI喷雾器21,但是,也可以使用液相色谱仪将试样中的成分分离后导入到三重四极杆型质谱分析装置。
即,在图1所示的装置中,可以在喷射器13与ESI喷雾器21之间设置柱,将包含用柱分离出的各成分的试样液(洗脱液)导入到ESI喷雾器21。通常,i-C5与p-C5能够通过液相色谱仪进行分离,但由于它们的保留时间相近,因此根据情况有时无法充分分离。即使在这种情况下,如上所述利用针对特定的MRM母子离子对的MRM测定结果,由此也能够准确地识别i-C5和p-C5等酰基肉毒碱。
这种使用液相色谱质谱分析装置的分析经常在再检查中使用,但此时通过使用上述方法,能够提高再检查中的识别精度。
另外,上述实施方式及各种变形例为本发明的一例,即使在本发明的主旨的范围内适当进行修正、变更、追加,也显然包括在本申请权利要求书之内。
另外,在上述的实施方式的说明中,有时将表示MRM母子离子对下的质荷比的数值的小数点后的位数设为1位或2位,但如已经说明那样,质荷比值的精度依赖于装置的质量精度、质量分辨率。因而,以相对于例如以小数点后1位或2位表示的质荷比值包含在±0.1、±0.2、±0.3或±0.4的范围内的离子作为目标的MRM母子离子对在实质上也相当于本申请权利要求书中记载的MRM母子离子对。
[各种方式]
对于本领域技术人员显而易见的是,上述的例示性的实施方式为以下的方式的具体例。
(第1项)本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的一个方式为使用串联型质谱分析装置来分析C5酰基肉毒碱的方法,其包括:
测定步骤,对检查体实施基于m/z 246>187、m/z 246>57、m/z 246>41以及m/z 246>29中的至少一个多反应监测(MRM)母子离子对的MRM测定;以及
处理步骤,使用在所述测定步骤中得到的测定结果,来识别所述检查体中的异戊酰基肉毒碱和作为其异构体的新戊酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的C5酰基肉毒碱中是否包含新戊酰基肉毒碱。
(第16项)本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的一个方式为能够实施第1项所述的酰基肉毒碱分析方法的装置,其具备:
测定部,其是对检查体实施基于m/z 246>187、m/z 246>57、m/z 246>41以及m/z246>29中的至少一个MRM母子离子对的MRM测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其使用通过所述测定部得到的测定结果,来识别所述检查体中的异戊酰基肉毒碱和作为其异构体的新戊酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的C5酰基肉毒碱中是否包含新戊酰基肉毒碱,其中,所述C5酰基肉毒碱是具有碳数为5的酰基的酰基肉毒碱。
根据第1项所述的酰基肉毒碱分析方法、或第16项所述的酰基肉毒碱分析装置,能够在不利用液相色谱仪进行成分分离的情况下准确地进行以往困难的异戊酰基肉毒碱与新戊酰基肉毒碱的识别、或在检测到的C5酰基肉毒碱中是否有可能含有新戊酰基肉毒碱的判定。由此,能够减少针对C5酰基肉毒碱的筛查中的假阳性。另外,即使在针对C5酰基肉毒碱的筛查中为阳性的情况下,也能够向用户告知其原因有可能是源自药剂的新戊酰基肉毒碱。其结果,能够对新生儿减轻再检查造成的身体负担,或减轻对在筛查中为阳性的新生儿的父母的心理负担。
(第2项)在第1项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:
在所述测定步骤中,对检查体实施针对m/z 246>187、m/z 246>57、m/z246>41及m/z 246>29中的一个MRM母子离子对的第一MRM测定、以及针对m/z 246>85的MRM母子离子对的第二MRM测定,来获取源自C5酰基肉毒碱的离子的强度信息,
在所述处理步骤中,基于确认离子比来评价含有新戊酰基肉毒碱的可能性,所述确认离子比为通过所述第一MRM测定得到的信号强度与通过所述第二MRM测定得到的信号强度之比。
根据第2项所述的酰基肉毒碱分析方法,无论试样中所含有的C5酰基肉毒碱是异戊酰基肉毒碱还是新戊酰基肉毒碱,都能够以示出大致相同的离子强度的MRM母子离子对(m/z 246>85)为基准来评价含有新戊酰基肉毒碱的可能性。因而,处理步骤中的评价(包含识别或判定)的精度不易受到分析条件的变动或测定环境的变动等的影响,总是能够实施准确的评价。
(第3项)在第2项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:所述第一MRM测定的MRM母子离子对为m/z 246>187或m/z 246>41。
m/z 246>41为异戊酰基肉毒碱与新戊酰基肉毒碱中峰强度的差异最大的MRM母子离子对。另一方面,m/z 246>187为与m/z 246>41相比针对异戊酰基肉毒碱和新戊酰基肉毒碱的灵敏度相当高的MRM母子离子对。因而,根据第3项所述的酰基肉毒碱分析方法,能够进一步提高处理步骤中的评价的精度。
(第4项)在第1项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:
在所述处理步骤中,利用预先求出的表示确认离子比与检查体中的异戊酰基肉毒碱或新戊酰基肉毒碱的存在比例之间的关系的信息,来估计作为目标的检查体中所包含的异戊酰基肉毒碱或新戊酰基肉毒碱的存在比例。
根据第4项所述的酰基肉毒碱分析方法,不仅能够识别异戊酰基肉毒碱与新戊酰基肉毒碱,而且能够估计各化合物的存在比例。
(第5项)另外,在第1项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:
在所述测定步骤中,针对检查体一边在m/z 246>41的MRM母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施MRM测定,分别获取源自C5酰基肉毒碱的离子的强度信息,
在所述处理步骤中,基于在所述测定步骤中得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来评价含有新戊酰基肉毒碱的可能性。
根据第5项所述的酰基肉毒碱分析方法,即使在例如因某种理由而无法执行针对上述的m/z 246>85的MRM母子离子对的MRM测定的情况下,也能够判定检测到的C5酰基肉毒碱中是否含有新戊酰基肉毒碱。
(第6项)另外,在第1项~第5项中的任1项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:利用流动注射分析法将检查体导入到所述串联质谱分析装置中。
根据第6项所述的酰基肉毒碱分析方法,不需要使用柱进行成分分离,因此能够缩短针对一个检查体的测定时间,适于要求迅速性的筛查。
(第7项)在第6项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:
在所述测定步骤中,反复实施MRM测定,
在所述处理步骤中,使用源自C5酰基肉毒碱的表示离子强度在时间上的变化的峰的峰顶值或峰面积值作为测定结果。
通过使用峰的高度(峰顶的值)作为测定结果,从而能够进行迅速的处理,能够提高筛选的效率。另一方面,通常,与峰的高度相比,峰面积值的定量性更优异,因此通过使用峰面积值作为测定结果,从而能够实施精度更高的识别或判定。
(第8项)在第1项~第5项中的任1项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:利用液相色谱仪将检查体中所包含的成分分离并导入到所述串联质谱分析装置中。
根据第8项所述的酰基肉毒碱分析方法,也能够利用使用柱的成分分离,因此与仅使用特定的MRM母子离子对的测定结果的识别或判定相比,能够进一步提高其精度。
在第1项所述的酰基肉毒碱分析方法及第16项所述的酰基肉毒碱分析装置中采用的方法不限定于异戊酰基肉毒碱和新戊酰基肉毒碱的识别,还能够广泛用于其以外的以往难以识别的酰基肉毒碱彼此的识别。
(第9项)本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的另一方式为使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,其包括:
测定步骤,对检查体实施针对使信号强度最大的MRM母子离子对的第一MRM测定、以及针对与所述使信号强度最大的MRM母子离子对不同的MRM母子离子对的第二MRM测定,来获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息;以及
处理步骤,基于确认离子比,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者,所述确认离子比为通过所述第一MRM测定得到的信号强度与通过所述第二MRM测定得到的信号强度之比。
(第10项)在第9项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:所述多个不同的酰基肉毒碱包含异戊酰基肉毒碱以及作为其异构体的新戊酰基肉毒碱。
(第11项)另外,在第9项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:所述多个不同的酰基肉毒碱包含丁酰基肉毒碱以及作为其异构体的异丁酰基肉毒碱。
(第17项)本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的另一方式为能够实施第9项所述的酰基肉毒碱分析方法的装置,其具备:
测定部,其是对检查体实施针对使信号强度最大的MRM母子离子对的第一MRM测定、以及针对与所述使信号强度最大的MRM母子离子对不同的MRM母子离子对的第二MRM测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其基于确认离子比,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者,所述确认离子比为通过所述测定部中的所述第一MRM测定得到的信号强度与通过所述第二MRM测定得到的信号强度之比。
如已经描述那样,此处所说的“质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱”有可能存在例如为异构体那样质量完全相同的酰基肉毒碱的情况、以及为虽然严格的质量互不相同但例如其差异是无法通过所使用的质谱分析装置来进行区别的程度例如整数质量相同的酰基肉毒碱的情况。异戊酰基肉毒碱与新戊酰基肉毒碱为前者的一例,戊二酰基肉毒碱和羟基己酰基肉毒碱为后者的一例。
根据第9项所述的酰基肉毒碱分析方法和第17项所述的酰基肉毒碱分析装置,通过使用将特定的产物离子设为确认离子的确认离子比,从而能够准确地识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱。另外,无需使用液相色谱仪的柱进行成分分离,因此能够迅速且效率良好地进行识别,特别适于因遗传因素导致的先天性代谢异常病等的筛查。
(第12项)另外,本发明所涉及的酰基肉毒碱分析方法的又一个方式为使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,其包括:
测定步骤,对检查体实施针对互不相同的特定的MRM母子离子对的MRM测定,来获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息,其中,所述互不相同的特定的MRM母子离子对是针对所述多个不同的酰基肉毒碱而分别决定的;以及
处理步骤,基于通过所述测定步骤得到的针对特定的MRM母子离子对的信号强度,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
(第13项)在第12项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:所述多个不同的酰基肉毒碱包含戊二酰基肉毒碱以及羟基己酰基肉毒碱。
(第18项)本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的又一个方式为能够实施第12项所述的酰基肉毒碱分析方法的装置,其具备:
测定部,其是对检查体实施针对互不相同的特定的MRM母子离子对的MRM测定的串联型质谱分析装置,所述互不相同的特定的MRM母子离子对是针对所述多个不同的酰基肉毒碱而分别决定的;以及
处理部,其基于通过所述测定部得到的针对特定的MRM母子离子对的信号强度,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
根据第12项所述的酰基肉毒碱分析方法和第18项所述的酰基肉毒碱分析装置,通过使用各酰基肉毒碱中特有地观测到的产物离子的强度信息,从而能够准确且用意地识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱。另外,无需使用液相色谱仪的柱进行成分分离,因此能够迅速且效率良好地进行识别,特别适于因遗传因素导致的先天性代谢异常病等的筛查。
(第14项)另外,本发明的酰基肉毒碱分析方法的又一个方式为使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,其包括:
测定步骤,针对检查体一边在特定的MRM母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施MRM测定,分别获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息;以及
处理步骤,基于在所述测定步骤中得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
(第15项)在第14项所述的酰基肉毒碱分析方法中,能够设为:所述多个不同的酰基肉毒碱包含丙二酰基肉毒碱以及3-羟基丁酰基肉毒碱。
(第19项)本发明所涉及的酰基肉毒碱分析装置的又一个方式为能够实施第14项所述的酰基肉毒碱分析方法的装置,其具备:
测定部,其是针对检查体一边在特定的MRM母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施MRM测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其基于通过所述测定部得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
根据第14项所述的酰基肉毒碱分析方法和第19项所述的酰基肉毒碱分析装置,通过使用将特定的产物离子设为确认离子的确认离子比的碰撞能量依赖性、或该确认离子的信号强度的碰撞能量依赖性,从而能够准确且用意地识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱。特别地,即使在不存在各酰基肉毒碱中特有地观测到的产物离子的情况、特定的碰撞能量下的确认离子比看不到充分差异的情况下,根据第12项所述的酰基肉毒碱分析方法和第18项所述的酰基肉毒碱分析装置,也能够适当进行识别。另外,无需使用液相色谱仪的柱进行成分分离,因此能够迅速且效率良好地进行识别,特别适于因遗传因素导致的先天性代谢异常病等的筛查。
附图标记说明
1:试样导入部;11:流动相容器;12:送液泵;13:喷射器;2:测定部;201:电离室;202:第一中间真空室;203:第二中间真空室;204:高真空室;21:ESI喷雾器;22:脱溶剂管;23:离子引导件;24:分离器;25:多极型离子引导件;26:前级四极滤质器;27:碰撞池;28:后级四极滤质器;29:离子检测器;3:数据处理部;31:数据收集部;32:峰强度计算部;33:成分判定部;4:分析控制部;41:分析条件存储部;5:中央控制部;6:输入部;7:显示部。
Claims (19)
1.一种酰基肉毒碱分析方法,其是使用串联型质谱分析装置来分析C5酰基肉毒碱的方法,其中,所述C5酰基肉毒碱是具有碳数为5的酰基的酰基肉毒碱,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,对检查体实施基于m/z 246>187、m/z 246>57、m/z 246>41以及m/z 246>29中的至少一个多反应监测母子离子对的多反应监测测定;以及
处理步骤,使用在所述测定步骤中得到的测定结果,来识别所述检查体中的异戊酰基肉毒碱和作为其异构体的新戊酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的C5酰基肉毒碱中是否包含新戊酰基肉毒碱。
2.根据权利要求1所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
在所述测定步骤中,对检查体实施针对m/z 246>187、m/z 246>57、m/z246>41及m/z246>29中的一个多反应监测母子离子对的第一多反应监测测定、以及针对m/z 246>85的多反应监测母子离子对的第二多反应监测测定,来获取源自C5酰基肉毒碱的离子的强度信息,
在所述处理步骤中,基于确认离子比来评价含有新戊酰基肉毒碱的可能性,所述确认离子比为通过所述第一多反应监测测定得到的信号强度与通过所述第二多反应监测测定得到的信号强度之比。
3.根据权利要求2所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
所述第一多反应监测测定的多反应监测母子离子对为m/z 246>187或m/z 246>41。
4.根据权利要求2所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
在所述处理步骤中,利用预先求出的表示确认离子比与检查体中的异戊酰基肉毒碱或新戊酰基肉毒碱的存在比例之间的关系的信息,来估计作为目标的检查体中所包含的异戊酰基肉毒碱或新戊酰基肉毒碱的存在比例。
5.根据权利要求1所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
在所述测定步骤中,针对检查体一边在m/z 246>41的多反应监测母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施多反应监测测定,分别获取源自C5酰基肉毒碱的离子的强度信息,
在所述处理步骤中,基于在所述测定步骤中得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来评价含有新戊酰基肉毒碱的可能性。
6.根据权利要求1所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
利用流动注射分析法将检查体导入到所述串联质谱分析装置中。
7.根据权利要求6所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
在所述测定步骤中,反复实施多反应监测测定,
在所述处理步骤中,使用源自C5酰基肉毒碱的表示离子强度在时间上的变化的峰的峰顶值或峰面积值作为测定结果。
8.根据权利要求1所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
利用液相色谱仪将检查体中所包含的成分分离并导入到所述串联质谱分析装置中。
9.一种酰基肉毒碱分析方法,其是使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,对检查体实施针对使信号强度最大的多反应监测母子离子对的第一多反应监测测定、以及针对与所述使信号强度最大的多反应监测母子离子对不同的多反应监测母子离子对的第二多反应监测测定,来获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息;以及
处理步骤,基于确认离子比,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者,所述确认离子比为通过所述第一多反应监测测定得到的信号强度与通过所述第二多反应监测测定得到的信号强度之比。
10.根据权利要求9所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
所述多个不同的酰基肉毒碱包含异戊酰基肉毒碱以及作为其异构体的新戊酰基肉毒碱。
11.根据权利要求9所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
所述多个不同的酰基肉毒碱包含丁酰基肉毒碱以及作为其异构体的异丁酰基肉毒碱。
12.一种酰基肉毒碱分析方法,其是使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,对检查体实施针对互不相同的特定的多反应监测母子离子对的多反应监测测定,来获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息,其中,所述互不相同的特定的多反应监测母子离子对是针对所述多个不同的酰基肉毒碱而分别决定的;以及
处理步骤,基于通过所述测定步骤得到的针对特定的多反应监测母子离子对的信号强度,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
13.根据权利要求12所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
所述多个不同的酰基肉毒碱包含戊二酰基肉毒碱以及羟基己酰基肉毒碱。
14.一种酰基肉毒碱分析方法,其是使用串联型质谱分析装置来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱的分析方法,所述酰基肉毒碱分析方法包括:
测定步骤,针对检查体一边在特定的多反应监测母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施多反应监测测定,分别获取源自作为目标的酰基肉毒碱的离子的强度信息;以及
处理步骤,基于在所述测定步骤中得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来识别所述多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的所述作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
15.根据权利要求14所述的酰基肉毒碱分析方法,其中,
所述多个不同的酰基肉毒碱包含丙二酰基肉毒碱以及3-羟基丁酰基肉毒碱。
16.一种酰基肉毒碱分析装置,具备:
测定部,其是对检查体实施基于m/z 246>187、m/z 246>57、m/z 246>41以及m/z 246>29中的至少一个多反应监测母子离子对的多反应监测测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其使用通过所述测定部得到的测定结果,来识别所述检查体中的异戊酰基肉毒碱和作为其异构体的新戊酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的C5酰基肉毒碱中是否包含新戊酰基肉毒碱,其中,所述C5酰基肉毒碱是具有碳数为5的酰基的酰基肉毒碱。
17.一种酰基肉毒碱分析装置,具备:
测定部,其是对检查体实施针对使信号强度最大的多反应监测母子离子对的第一多反应监测测定、以及针对与所述使信号强度最大的多反应监测母子离子对不同的多反应监测母子离子对的第二多反应监测测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其基于确认离子比,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者,所述确认离子比为通过所述测定部中的所述第一多反应监测测定得到的信号强度与通过所述第二多反应监测测定得到的信号强度之比。
18.一种酰基肉毒碱分析装置,具备:
测定部,其是对检查体实施针对互不相同的特定的多反应监测母子离子对的多反应监测测定的串联型质谱分析装置,所述互不相同的特定的多反应监测母子离子对是针对所述多个不同的酰基肉毒碱而分别决定的;以及
处理部,其基于通过所述测定部得到的针对特定的多反应监测母子离子对的信号强度,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
19.一种酰基肉毒碱分析装置,具备:
测定部,其是针对检查体一边在特定的多反应监测母子离子对下使碰撞能量进行变化一边实施多反应监测测定的串联型质谱分析装置;以及
处理部,其基于通过所述测定部得到的离子强度的碰撞能量依赖性,来识别质量实质相同的多个不同的酰基肉毒碱,或者判定所述检查体中的作为目标的酰基肉毒碱中是否包含所述多个不同的酰基肉毒碱中的某一者。
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