JP2007292690A - 糖鎖異性体を分離同定する質量分析法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】糖鎖異性体の混合物を用いてそれぞれの糖鎖異性体を分離同定する質量分析法であって、(1)糖鎖異性体の混合物に対し、基質特異性が判明している酵素反応を行う工程、(2)酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物および最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程、(3)酵素反応を受けたり受けなかったりした糖鎖のm/zを検出する工程、を含むことを特徴とする質量分析法、並びに、それらのデータを搭載したデータベース。
【選択図】なし
Description
(1)糖鎖異性体の混合物に対し、基質特異性が判明している酵素反応を行う工程、
(2)酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、および、最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程、
(3)酵素反応を受けたり受けなかったりした糖鎖のm/zを検出する工程、
を含むことを特徴とする質量分析法を提供するものである。
「基質特異性が判明している酵素反応」とは、糖鎖の特定の結合のみを切断したり、糖鎖の特定の構成糖のみに反応させたり、構成糖の特定の位置に結合させたりする酵素反応を言う。
工程(2)は、酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、および最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程である。
工程(3)は、酵素反応を受けなかった糖鎖のm/z、および/または、酵素反応を受けた糖鎖のm/zを検出する工程である。基質特異性が判明している特定の酵素を用いたときに、所定のm/zにピークが現れたか否かで、結合している構成糖の種類(例えば、ガラクトースなのかグルコースなのか等)、特定の糖鎖の結合の種類(アルファ結合なのかベータ結合なのか)、特定の糖鎖の結合場所(C3位なのかC4位なのか等)等が分かり、糖鎖異性体を個々に同定できる。また、酵素反応を繰り返すことによって個々の段階の情報をくみあわせることによって、個々の異性体糖鎖中の構成糖の配列と結合部位が判明する。
本発明の質量分析法の対象となる糖鎖としては、分子量の等しい構成糖を有するものが前記の理由で好ましい。例えば、(糖タンパク質の)糖鎖の構成糖として、グルコース、ガラクトース、マンノース等の分子量180のヘキソースを有するもの;N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン等の分子量221のアミノ糖を有するもの;グルクロン酸、ガラクツロン酸等の分子量194のウロン酸等が挙げられる。当然のことながら、これらの構成糖を質量測定だけでは区別ができない。
本発明の酵素反応に用いられる酵素としては特に限定はないが、糖分解酵素、糖転移酵素、スルファターゼ、スルフォトランスフェラーゼまたはホスファターゼが好ましい。糖分解酵素および糖転移酵素は、糖鎖の合成や分解に関与する酵素で、基質となる糖鎖構造を他の異性体構造と厳密に見分けて反応を行うものである。さらに、糖転移酵素はその反応生成物として特定の異性体を合成することが可能である。
このようにして質量分析法によって得られた情報はデータベース化することによって、それを使用して、未知の糖鎖異性体の混合物から、特定の糖鎖異性体の存在を同定することができる。データベース化されるデータとしては、酵素の種類、組み合わせおよび反応をかける順序、酵素の糖鎖特異性データ、工程(3)のm/z、反応前後で変化するm/zの差等が挙げられる。かかるデータベースを使用して質量分析する方法も有用であり、かかるデータベースが記録された記録媒体も同様の理由で有用である。
<タイプ2結合の同定>
互いに分子量および組成式が同一で構造異性体の関係にあるピレン標識ラクト−N−ヘキサオース(下記式(1)に示す)、および、ピレン標識ラクト−N−ネオヘキサオース(下記式(2)に示す)の混合物に、肺炎双球菌由来β1,4ガラクトシダーゼ(1.2mU)を加え、酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)10μL中で、37℃20時間反応させた。
ピレン標識ラクト−N−ヘキサオースおよびラクト−N−ネオヘキサオースの混合物をMS測定した結果、1種類の[M−H]−イオンm/z1357.6のみが検出され、区別は不可能であった(図1下)。
互いに分子量および組成式が同一で構造異性体の関係にあるdifucosylated decaose AおよびBの2種の混合物が分離同定された例を示す。試料を実施例1と同様にピレン標識し、MS分析を行うと[M−H]−イオンm/z2379.9が検出された。次に、実施例1と同様にβ1,4ガラクトシダーゼ処理を行った後MS測定を行った。その結果、[M−H]−イオンとしてm/z2379.9の他にガラクトース1分子減少したm/z2217.9が検出された。
実施例2で得られたピレン標識糖鎖試料のβ1,4ガラクトシダーゼ処理混合物に、ひきつづき実施例1と同様にUDP−[13C6]−ガラクトースを用いてβ1,4ガラクトース転移酵素反応を行い、MS測定を行った。その結果、[M−H]−イオンとしてm/z2379.9の他にm/z2385.9が検出された。
実施例2で得られたタイプ1結合を有する異性体である[M−H]−イオンm/z2379.9を選択したMS/MS(図2の上のスペクトル)および実施例3で得られた[M−H]−イオンm/z2379.9を選択したMS/MSを行った(図2の中のスペクトル)。両者からほぼ同様のスペクトルが得られ、m/z2015、1869、1139、1097、672、654等のプロダクトイオンが得られた。
実施例2のピレン標識混合物に対し、酵素処理をせずに得られた[M−H]−イオンm/z=2379.9を選択してMS/MS解析を行った(図3)。両異性体からのプロダクトイオンが混在し、それぞれの構造を同定することは困難であった。
Claims (7)
- 糖鎖異性体の混合物を用いてそれぞれの糖鎖異性体を分離同定する質量分析法であって、
(1)糖鎖異性体の混合物に対し、基質特異性が判明している酵素反応を行う工程、
(2)酵素反応を全く行っていない糖鎖異性体の混合物、および、最後に行った酵素反応後の反応物を質量分析する工程、
(3)酵素反応を受けたり受けなかったりした糖鎖のm/zを検出する工程、
を含むことを特徴とする質量分析法。 - 酵素反応に用いる酵素が、糖分解酵素、糖転移酵素、スルファターゼ、スルフォトランスフェラーゼまたはホスファターゼである請求項1に記載の質量分析法。
- 酵素反応の少なくとも1回が同位体構成糖を付加する酵素反応である請求項1または請求項2に記載の質量分析法。
- 糖分解酵素が、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−シアリダーゼ、α−フコシダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−N−アセチルグルコサミニダーゼ、β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドα−ガラクトシダーゼ、エンドβ−ガラクトシダーゼ、エンドα−シアリダーゼ、エンドα−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、エンドβ−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、エンドα−N−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ、エンドα−マンノシダーゼ、エンドβ−マンノシダーゼ、エンドβ−グルクロニダーゼ、エンドα−グルコシダーゼまたはエンドβ−グルコシダーゼである請求項2に記載の質量分析法。
- 糖転移酵素が、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−フコシルトランスフェラーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β−N−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、α−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−グルクロニルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼまたはβ−グルコシルトランスフェラーゼである請求項2に記載の質量分析法。
- 上記質量分析が、MS、MS/MSまたはMS3である請求項1ないし請求項5の何れかに記載の質量分析法。
- 請求項1ないし請求項6の何れかの請求項に記載の質量分析法によって得られた情報を搭載したデータベース。
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