WO2006106997A1 - 生体試料の解析法及び疾患マーカーの検索法 - Google Patents

生体試料の解析法及び疾患マーカーの検索法 Download PDF

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Junko Amano
Koichi Tanaka
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Definitions

  • the present invention relates to a sugar chain mass spectrometry method, and more specifically, to a technique for elucidating structural information of a sugar chain, which is indispensable for function expression in a living body, by mass spectrometry. Furthermore, the present invention relates to a method for searching for a disease marker and a method for analyzing a sample containing a biomolecule. More specifically, the present invention relates to a technique for elucidating structural information of a biomolecule essential for the expression of the function of the living body by mass spectrometry.
  • Background art
  • Mass spectrometry is a method in which a sample is ionized and the ionized molecules are separated and detected according to mass charge (m / z). Since acidic substances are likely to generate negative ions and neutral substances are likely to generate positive ions, such ions are measured. Biopolymers such as nucleic acids, proteins, and sugar chains are analyzed by performing multi-step MS measurement (MS n measurement). In multi-stage MS measurement, the parent ion generated in the first-stage MS measurement is selected as the precursor ion, the second-stage MS measurement is performed, and the precursor ion is selected from the resulting product ions, and further three-stage MS measurement is performed. Performing MS measurement repeatedly, such as performing MS measurement of the eye.
  • the object of the present invention is to generate negative ions without adding an acidic substance to the matrix, improve the sensitivity of measurement by a mass spectrometer, and generate structure-specific ions with good reproducibility. It is to provide a method for quickly obtaining structural information. Furthermore, the object of the present invention is to generate negative ions stably, improve the sensitivity of the measurement with a quantitative analyzer, and generate structure-specific ions with high reproducibility, so that disease markers can be easily and quickly generated. It is to provide a method for searching and a method for analyzing a sample containing a biomolecule. Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing a specific disease using a disease marker. Summary of the Invention
  • the present inventors have found that by labeling a sugar chain, negative ions can be easily generated and stabilized without adding an acidic substance to the matrix, and the sensitivity of measurement by a mass spectrometer is improved. Furthermore, the negative ions generated in this way are MS . It was also found that the structure-specific ions can be generated well by analysis, and a method for obtaining structural information with high sensitivity, simplicity and speed was completed.
  • the present invention first includes the following ⁇ 1> to ⁇ 19> inventions.
  • the inventions ⁇ 1> to ⁇ 16> below relate to a method for analyzing sugar chains.
  • the sugar chain is labeled with a labeling compound to obtain a labeled sugar chain
  • a method for mass spectrometry of a sugar chain comprising analyzing the sugar chain by MA measuring the labeled sugar chain and measuring negative ions using a DI mass spectrometer.
  • sugar chains (A, B, C,-) that are in a structural isomer relationship with each other, label the sugar chains (A, B, C,-) with a labeling compound, Obtain sugar chains (A ', B', C ',' ⁇ )
  • the labeled sugar chains (A ', B', C ',-) are measured by measuring negative ions using a MALDI mass spectrometer.
  • a method for mass spectrometry of a glycan comprising discriminating the glycans, B, C,-) from each other by detecting ions (a, b, c,-) that are specifically generated from each.
  • each of ions a, ions b, ions c,... Can be generated from one or more corresponding sugarcanes.
  • a method for mass spectrometry of sugar chains comprising analyzing structural isomers of the plurality of kinds of sugar chains.
  • the whole structure or partial structure of each of the structural isomers of the plurality of sugar chains is identified, and / or the detected specifically generated ion
  • Structural analysis is performed on the detected specifically generated ions to identify the entire structure or partial structure of each of the structural isomers of the plurality of sugar chains, and / or the detected specifically generated ions
  • a method for mass spectrometry of a sugar chain wherein the unknown mixing ratio is calculated from the ionic strength of the base material based on the relationship found by the method according to ⁇ 5>.
  • the sugar chain may have a known structure or an unknown structure.
  • the following ⁇ 7> to ⁇ 9> inventions show forms of specific structural identification methods when the sugar chain has an unknown structure.
  • the sugar chain of unknown structure is labeled with a labeling compound to obtain a labeled sugar chain of unknown structure
  • the labeled sugar chain of known structure is measured for negative ions using a M A L D I mass spectrometer,
  • the sugar chain mass spectrometric method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the labeling compound is a compound having an aromatic basic skeleton.
  • the aromatic is selected from the group consisting of pyrene, benzene, and pyridine; ⁇ The method for mass spectrometry of sugar chains according to 10>. ⁇ 1 2>
  • the method for mass spectrometry of a sugar chain according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, wherein the labeling compound is selected from the group consisting of an aromatic amine and an aromatic force sulfonic acid hydrazide.
  • the labeling compound is selected from the group consisting of pyrenebutanoic acid hydrazide, aminobilene, 2-aminopyridine, 2-aminobenzene, aminobenzoic acid, and aminobenzoic acid ester, and any one of 1> to ⁇ 12> Method for mass spectrometry of sugar chains.
  • the method for mass spectrometry of a sugar chain according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>, wherein the sugar chain is a sugar chain having sugar produced by neutralizing fucose and / or acidic sugar.
  • the sugar chain is a sugar chain having fucose and / or acidic sugar, and the labeled sugar chain is obtained by performing the labeling treatment and the neutralization treatment of the acidic sugar.
  • ⁇ 1> to ⁇ 1 The method for mass spectrometry of sugar chains according to any one of 3>.
  • the acidic sugar is selected from the group consisting of sialic acid, sulfate group-containing sugar, and phosphate group-containing sugar.
  • the following ⁇ 17> to ⁇ 19> invention relates to data obtained by the above methods ⁇ 1> to ⁇ 16>.
  • the sugar chain is labeled with a labeling compound to obtain a labeled sugar chain
  • ⁇ 17> is information on the sugar chain obtained from the mass spectrum described in ⁇ 17>, including information on ionic species specifically generated from a specific structural isomer of the sugar chain and structural information on the specific structural isomer. Contains information.
  • the present invention described in ⁇ 1> to ⁇ 19> above by labeling sugar chains without adding an acidic substance to the matrix, negative ions are generated, and the sensitivity of measurement by a mass spectrometer is improved.
  • by generating structure-specific ions with high reproducibility it is possible to provide a simple and quick method for obtaining structural information.
  • the present inventors have found that by labeling a biomolecule, negative ions can be easily generated and stabilized, and the sensitivity of measurement by a mass spectrometer is improved. Furthermore, it has been found that the negative ions generated in this way generate structure-specific ions with high reproducibility by MS n analysis, and a method for detecting disease markers and biomolecules with high sensitivity and ease. Completed a method for analyzing samples containing The present invention further includes the following ⁇ 20> to ⁇ 32> inventions.
  • ⁇ 20> to ⁇ 27> below relate to a method for searching for a disease marker.
  • a sample containing a biomolecule X derived from a person suffering from a specific disease is prepared, the biomolecule X is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule X ′, and the label Measured negative ions with MA LD I mass spectrometer,
  • the biomolecule Y is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule Y ′, and the labeled biomolecule Y ′ is measured for negative ions with a MA LD I mass spectrometer,
  • the mass spectrum of the labeled biomolecule Y ′ differs in mass / charge and is included in the mass spectrum of the labeled biomolecule X ′ and / or information obtained from the mass spectrum. And / or not included in the information obtained from the mass spectrum, or
  • the mass spectrum of the labeled biomolecule X ′ and / or the information obtained from the mass spectrum of the labeled biomolecule X ′ is the same mass / charge but different in ionic strength. Analyzing the structure related to the development of the specific disease from the mass spectrum and / or detected with an ionic strength stronger than the information obtained from the mass spectrum,
  • the specific disease is a disease caused by an autoimmune disease and correlates with a blood group, and the biomolecule is a fucoid and / or sialic acid-containing sugar chain or a blood group antigen.
  • the method for searching for a disease marker according to any one of ⁇ 20> to ⁇ 25>, wherein the labeling compound is selected from the group consisting of a pyrene derivative, a benzene derivative, and a pyridine derivative.
  • Marker search method The following ⁇ 28> to ⁇ 30> relate to analysis methods for samples containing biomolecules.
  • ⁇ 28> and ⁇ 29> relate to sample analysis methods using mass spectrometry.
  • the biomolecule Z is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule Z ′, and the labeled biomolecule Z ′ is measured for negative ions with a MALDI mass spectrometer,
  • the mass spectrum of the disease marker and / or information obtained from the mass spectrum as an index, the mass spectrum of the labeled biomolecule Z ′ obtained and / or Alternatively, a method for analyzing a sample containing a biomolecule, wherein the presence or absence of the specific disease in the subject or the degree of the expression is determined from information obtained from the mass spectrum.
  • the biomolecule Z is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule Z ′, and the labeled biomolecule Z ′ is measured for negative ions with a MA LD I mass spectrometer,
  • the disease marker is labeled with a labeling compound to obtain a labeled disease marker, and the labeled biomolecule Z ′ is measured for negative ions using a MALDI mass spectrometer.
  • a method for analyzing a sample containing a biomolecule comprising comparing a spectrum and / or information obtained from the mass spectrum to determine whether or not a specific disease has occurred in the subject or the degree of the expression.
  • a disease marker in the method for analyzing a sample containing the biomolecule of ⁇ 28> and ⁇ 29> above a disease marker found by the method according to any one of ⁇ 20> to ⁇ 2>, or The disease marker described in ⁇ 31> or ⁇ 32> below can be used.
  • the disease marker described in ⁇ 31> or ⁇ 32> below can be used as the disease marker in the method for analyzing a sample containing the biomolecule of ⁇ 30>.
  • ⁇ 31> and ⁇ 32> below relate to disease markers.
  • ⁇ 19> A marker for a disease found by the method according to any one of ⁇ 20> to ⁇ 27>, having a sugar chain structure containing fucose and / or sialic acid.
  • ⁇ 20>- ⁇ 27> A disease marker found by the method according to any one of the above, wherein the disease marker has a blood group antigen sugar chain structure. Furthermore, the present invention also includes the following ⁇ 33> to ⁇ 35> related to a disease diagnosis method. Of these, ⁇ 33> and ⁇ 34> relate to a method for diagnosing diseases using mass spectrometry. ⁇ 33>
  • the biomolecule Z is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule Z ′, and the labeled biomolecule Z ′ is measured for negative ions with a MALDI mass spectrometer,
  • the disease marker mass spectrum and / or information obtained from the mass spectrum As an index, from the obtained mass spectrum of the labeled biomolecule Z ′ and / or the information obtained from the mass spectrum, the presence or absence of the specific disease in the subject or the degree of the expression is determined. By diagnosing the presence / absence, progress of the specific disease, and / or the degree of therapeutic outcome for the specific disease, a method for diagnosing the disease.
  • the biomolecule z is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule z ′, and the labeled biomolecule Z ′ is measured for negative ions with a MA LD I mass spectrometer,
  • the disease marker is labeled with a labeling compound, a labeled disease marker is obtained, the labeled biomolecule Z ′ is MA, and negative ions are measured with a DI mass spectrometer,
  • a sample containing a biomolecule derived from a subject is prepared, and using the disease marker found by the method according to any one of ⁇ 20> to ⁇ 27>, presence or absence of expression of a specific disease in the subject or A method for diagnosing a disease, wherein the presence or absence of the specific disease, the degree of progression, and / or the degree of treatment outcome for the specific disease are diagnosed by determining the degree of expression.
  • the disease marker described in ⁇ 31> or ⁇ 32> can be used as a disease marker in the method for analyzing a sample containing the biomolecule of ⁇ 35>.
  • Figure 1 shows the negative ion MS spectrum (a) of pyrene-labeled LNF-1II and the negative ion MS spectrum (b) of aminopyridine-labeled LNF-III.
  • Figure 2 is a pyrene-labeled MFLNH-1 negative ion MS 2 spectra (a), pyrene-labeled MFLNH-II negative ion MS 2 spectra (b), ⁇ Pi, pyrene-labeled MFLNH-III Negative Ion MS 2 spectrum of Torr (c).
  • Figure 3 shows the positive ion MS 2 spectrum of pyrene-labeled MFLNH-I (a). Down labeled MFLNH-II positive ion MS 2 spectra (b), and a pyrene-labeled MFLNH-III positive ion MS 2 spectra (c).
  • Figure 4 shows the negative ion MS 3 spectrum (a) of pyrene-labeled MFLNH-II and the negative ion MS 3 spectrum (b) of pyrene-labeled MFLNH-III.
  • Figure 5 is a negative ion MS 2 scan Bae pyrene-labeled sugar chain containing amino de sialic acid vector (a), and, pyrene-labeled sugar chain containing a non-amine-de sialic acid Negati Buion MS 2 spectra ( b)
  • Figure 6 shows a negative sample of a sample containing pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III in a ratio of 10: 0.
  • MS 2 spectrum (a) negative of a mixed sample containing 8: 2.
  • Ibuion MS 2 spectra (b) and, 6: a mixed sample containing a ratio of 4 negative ion-MS 2 spectra (c).
  • Figure 7 shows the negative ion of the sample containing pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III in the ratio of 4: 6 MS 2 spectrum (d), negative ion of the mixed sample containing the ratio of 2: 8 MS 2 spectrum (e), and negative ion MS 2 spectrum (f) of the mixed sample containing 0:10.
  • a sample containing a sugar chain is prepared, the sugar chain is labeled with a labeling compound, and the labeled sugar chain is subjected to negative ion measurement by mass spectrometry. More specifically, in the present invention, a neutral sugar chain is labeled to obtain a labeled sugar chain, and the labeled sugar chain is subjected to negative ion measurement with a mass spectrometer.
  • the method includes labeling an acidic sugar chain, then neutralizing the acidic sugar in the sugar chain to obtain a labeled sugar chain, and measuring the labeled sugar chain for negative ions.
  • sugar chain mainly refers to a sugar chain (oligosaccharide, polysaccharide), but for convenience, it refers to all saccharides including monosaccharides.
  • a neutral sugar chain refers to a sugar chain having no charge.
  • the sugar chain of the present invention may be a naturally occurring sugar chain or a sugar chain prepared by a chemical or enzymatic method, and the structure thereof may be known or unknown. Therefore, specific examples of “samples containing sugar chains” include samples prepared from fractions containing sugar chains from biological samples (eg, cells, tissues, secretions, body fluids, etc.), chemical synthesis and enzyme synthesis. The sample etc. which contain the sample with a known structure obtained by these are mentioned.
  • sugar chains prepared by chemical or enzymatic methods include those obtained by releasing from complex carbohydrates and those obtained by neutralizing acidic sugar chains.
  • the complex carbohydrates include glycoproteins and glycolipids.
  • the present invention can be carried out by subjecting the sugar chain moiety to release from the glycoconjugate using a chemical method or an enzymatic method in advance.
  • the neutralization treatment of the acidic sugar residue may be performed before the labeling, or may be performed after the labeling and before the mass spectrometry.
  • the acidic sugar chain include those containing acidic sugars such as sialic acid, sulfate group-containing sugars and phosphate group-containing sugars as constituent sugars.
  • neutralization methods for acidic sugar chains include a method of chemically or enzymatically modifying or releasing sialic acid, sulfate group, phosphate group and the like.
  • Specific examples of sugar chains to be analyzed include N-linked sugar chain mother nucleus structure (high mannose type, hybrid type, complex type) bonded to Asn and 0-linked sugar chain mother nucleus bonded to Thr / Ser.
  • Examples of the structure and their mother nucleus structure include sugar chains in which sugar chains are linear or branched and elongated.
  • the sugar chain having biological activity is a side chain part extending from the above mother nucleus structure, Gal) 8 1-3GlcNAc, Gal ⁇ 1-4GIcNAc, GlcNAc81-6 (GIcNAcjS 1-3) Gal, GalNAc) ⁇ 1-4Gal, GlcNAc 1-4Gal, GalNAc jS 1-4GlcNAc, Gal 1-3Gal, GalNAc a? 1-3Gal, Fucc-2Gal, Fuc 1-3GlcNAc, Fuc a 1-4GlcNAc, Fuc a 1-6GlcNAc, etc.
  • a sugar chain related to a specific disease is an analysis target.
  • the sugar chain related to a specific disease include a sugar chain containing fucose, a sugar chain containing fucose and / or the above acidic sugar (particularly sialic acid), and the like.
  • the sugar chain containing fucose is directly subjected to the labeling and mass spectrometry process of the present invention.
  • Acid sugar As described above, the sugar chain to be contained is neutralized before labeling and used for the labeling and mass analysis process of the present invention, or neutralization of acidic sugar residues after labeling. Processed and used for mass spectrometry.
  • sugar chains associated with specific diseases include ABO blood group antigens and Lewis blood group antigens. Some Lewis blood group antigens are conjugated with sialic acid. These sugar chain antigens are involved in various biological activities and diseases. These sugar chains (sugar chains containing fucose and / or sialic acid, or blood group antigen sugar chains) are expressed not only on the surface of blood cells but also on sugar chains, glycolipids, glycoproteins, etc. in the epidermal tissue and secretions It has important relationships with inflammatory diseases, autoimmune diseases, allergic diseases, viral diseases, cancerous diseases, infectious diseases, heart diseases, hypercholesterolemia, and the like.
  • infectious diseases such as Vibrio cholerae, Salmonella, Helicobacter pylori, Campylobacter, influenza virus, Norwalk virus, Renovirus, and Ecovirus have been reported to correlate with blood type.
  • infectious diseases such as Vibrio cholerae, Salmonella, Helicobacter pylori, Campylobacter, influenza virus, Norwalk virus, Renovirus, and Ecovirus have been reported to correlate with blood type.
  • direct interactions between many pathogenic microorganisms, sugar chains containing fucose and / or sialic acid, and blood group antigen sugar chains have been confirmed. Changes in the expression of fucose and / or sialic acid-containing antigens and blood group antigens have been observed in cancers such as colorectal cancer, stomach cancer, bladder cancer, lung cancer, breast cancer, liver cancer, and vaginal cancer.
  • the change in expression occurs from a precancerous state, is closely related to disease progression and treatment, and is highly correlated with the disease state.
  • the risk of heart disease also correlates with blood type.
  • Blood cholesterol, LDL, and blood pressure correlate with blood group, and blood coagulation factor activity is influenced by blood group antigen It is said that this is a factor.
  • diseases in which specific diseases are caused by autoimmune diseases and are correlated with blood types include childhood steatosis, non-insulin dependent diabetes, Graves' disease, and ankylosing spondylosis. It is done.
  • sugar chains that are related to a specific disease but do not contain fucose include GalNAC) 8 1-4GlcNAc.
  • sugar chain is found in pituitary hormones, and is reported to regulate blood clearance and to reduce the abundance of this structure in breast cancer.
  • sugar chains containing GlcNAco-4Gal have been shown to have an activity of inhibiting the growth of H. pylori.
  • various antigens including fucose and / or sialic acid are expressed at specific stages of development and differentiation, which may be important for the functional expression of cells.
  • the “ ⁇ -labeled compound” is a compound that can generate negative ions from a sugar chain in mass spectrometry by binding itself to the sugar chain.
  • the labeling compound has a reactive group capable of covalently bonding to a sugar chain and a molecular skeleton that absorbs light or emits fluorescence.
  • a compound having an aromatic basic skeleton can be mentioned as a labeling compound.
  • the aromatic basic skeleton is not particularly limited, and examples thereof include pyrene, benzene, and pyridine.
  • aromatic amines aromatic carboxylic acid hydrazides
  • the labeling compound include aromatic compound derivatives such as Examples thereof include pyrenebutanoic acid hydrazide (PBH), aminopyrene, 2-aminoviridine, 2-aminobenzene, aminobenzoic acid, and ester of aminobenzoic acid.
  • PBH pyrenebutanoic acid hydrazide
  • aminopyrene aminopyrene
  • 2-aminoviridine aminobenzene
  • aminobenzoic acid aminobenzoic acid
  • ester of aminobenzoic acid 2-aminoviridine or PBH
  • PBH pyrenebutanoic acid hydrazide
  • the labeling method is not particularly limited, and for example, a labeling method such as a conventional pyridylamination method can be applied or appropriately applied.
  • those other than PBH can be reacted by reacting the labeling compound with dry sugar in the presence of an acid and then reducing with a reducing agent.
  • Conditions such as a reagent, a solvent, a reaction temperature, and a reaction time are not particularly limited and can be appropriately determined by those skilled in the art. Therefore, examples of reaction conditions include hydrochloric acid and acetic acid as the above acid; NaBH 3 CN and NaBH 4 as the reducing agent; methanol as the solvent, and a reaction temperature of about 80 to 90 ° C.
  • the reaction time can be about 10 to 60 minutes for the reaction between the sugar chain and the labeled compound, and about 10 to 60 minutes for the reduction reaction.
  • the above reducing agent is not necessarily required.
  • the labeled sugar chain can be extracted by reacting the dried sugar chain with a labeled compound in the presence of an acid, followed by neutralization. Specifics in this case An example of a typical method is described in D. SUGAHARA, J. AMANO, and T. IRIMURA, ANALYTICAL SCIENCE, 19, 167-169 (2003).
  • a reducing agent solution can be added and allowed to react at room temperature to 40 ° C for about 10 to 60 minutes. In this case, it is more preferable to newly add a reducing agent solution and perform the reaction in the same manner.
  • the labeled sugar chain obtained is measured in a negative mode using a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) mass spectrometer.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • —cyano 4-hydroxykehynoic acid, norharman, 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA), etc. are used as the matrix.
  • measurement is preferably performed using a MALDI-QIT-TOF type mass spectrometer that uses DHBA as a matrix and combines a quadrupole ion trap (Qrr) and a time-of-flight type (TOF).
  • a measurement method using a mass spectrometer methods such as PSD measurement, ISD measurement, MS "measurement (multi-stage MS measurement; including tandem mass measurement), etc. are used.
  • mass spectrometry is used.
  • the first measurement performed by the instrument is MS measurement, and specific ions (such as molecular weight related ions) are selected from the spectrum ion peaks obtained in the MS measurement, and the selected specific ions are used as precursors.
  • MS 2 parses the due analysis be performed MS 2 measurement (MS / MS measurement) (MS / MS analysis; tandem mass analysis Similarly, from the ion peak of the spectrum obtained in MS M measurement MS n measurement is the measurement of the nth measurement by selecting a specific ion and using the selected specific ion as a precursor ion, and the analysis by performing MS “measurement” is expressed as “MS” analysis. Glycan analysis is performed based on the mass number and relative intensity of the negative ions in the measured mass spectrum. In the present invention, the analysis of sugar chains includes structural analysis and quantitative analysis.
  • Quantitative analysis includes the detection of ionic species that can quantify a specific sugar chain, or the ionic species that arise specifically from specific structural isomers of the sugar chain, and the ionic strength and ionic strength of the ionic species in the sample. Derivation of the relationship with the relative amount; including quantification of a specific sugar chain or a specific structural isomer of a sugar chain.
  • a sugar chain can have a plurality of structural isomers having the same molecular weight and the same monosaccharide composition.
  • the sugar chains associated with the specific diseases described above are sugar chains in which structural isomers may exist. For example, if one fucose is bound to a sugar chain, at least four types of binding are possible at one binding position of fucose (that is, the position of the sugar residue to which fucose is bound in the sugar chain).
  • the sugar chain has such a structural isomer.
  • Each structural isomer may be contained in a separate independent sample, or a plurality of structural isomers may be contained in the same sample. In either case, as described below, it is possible to identify structural isomers of each other and analyze the structural isomers. For example, when the sugar chains (A, B, C,%) That are structural isomers of each other are analyzed, the structural analysis can be performed as follows.
  • Labeled sugar chains (A ', B', C ',-) are obtained from B, C,-), respectively.
  • C,- can be distinguished from each other. More specifically, when two sugar chains, sugar chain A and sugar chain B, which are in a structural isomer relationship with each other, are analyzed, the structure analysis can be performed as follows. Monkey.
  • a labeled chain A ′ is obtained from sugar chain A
  • a labeled sugar chain B ′ is obtained from sugar chain B.
  • At least one of the product ions b is not generated from the labeled sugar chain A ′, and at least one of the product ions a is not generated from the labeled sugar chain B ′; and the product ion a and Product ion b has a different combination of mass numbers.
  • negative ions are generated reflecting the difference in fine structure. This makes it possible to easily identify structural isomers that were not possible with mass spectrometry.
  • this specific ion can usually be detected by MS 2 analysis.
  • MS 3 analysis or further MS n analysis New specific ions may be detected.
  • sugar chains contained in a sample are sugar chains having different molecular weights
  • analysis can be easily performed.
  • multiple types of fucose-containing sugar chains are included in the sample, one fucose residue is bonded to one sugar chain, and two fucose residues are bonded to the other sugar chain.
  • sugar chains having different numbers of fucose bonds have different molecular weights, and therefore can be easily identified, identified and quantified by mass spectrometry.
  • a sugar chain may have multiple structural isomers having the same molecular weight and the same monosaccharide composition.
  • the present invention is particularly useful when a plurality of types of sugar chains contained in a sample are in a structural isomer relationship with each other.
  • the presence of other molecules in the measurement sample does not affect the phenomenon in which a specific product ion is specifically generated from a specific structural isomer. That is, ionization occurs specifically and independently for each structural isomer. Therefore, in this case as well, analysis may be performed based on the method described above. In other words, if product ions that arise specifically from specific structural isomers are detected, quantification is possible along with identification of structural isomers. Is possible. For example, analysis can be performed by the following method.
  • the example of the analysis method described below describes the quantification method
  • the information on the product ion specifically generated from a specific structural isomer is mainly used, so that the overall structure of the sugar chain or As described above, the partial structure can be identified.
  • a sample containing a plurality of kinds of structural isomers of sugar chains in a known mixing ratio is prepared.
  • a plurality of sugar chains are labeled with the labeling compound to obtain a plurality of types of labeled structural isomers.
  • Mass spectrometric measurements detect specific ions for each of the multiple types of labeled structural isomers. This.
  • the ion specific to structural isomers obtained by the present invention makes it possible to distinguish multiple types of structural isomers.
  • MS n analysis when MS n analysis is used in the present invention, specific ions can usually be detected by MS 2 analysis. However, depending on the case, MS 3 analysis or further MS n analysis can be performed. It is also preferable to obtain more detailed information by detecting more specific ions.
  • the presence of other molecules in the measurement sample does not affect the phenomenon that a specific product ion is specifically generated from a specific structural isomer.
  • each detected specific ion is detected at an ionic strength ratio that reflects the mixing ratio of the structural isomers contained in the sample.
  • the structure Ions specifically generated from isomers can be used as ions for the quantification of structural isomers. Therefore, in quantitative analysis, specifically, ions specifically generated from structural isomers are determined as ions for quantitative determination of structural isomers, and a plurality of structural isomers contained in the sample are analyzed. Based on the known mixing ratio, the relationship between the ionic strength of the ions for quantification and the known mixing ratio can be found.
  • the specific ion X and the structural isomer Y generated from the structural isomer X The intensity ratio of the generated specific ion y is always the same; if the relative amount of structural isomer X to structural isomer Y in the sample changes, the relative ionic strength of ion X to ion y is relative It can be found that the mixing amount changes in proportion to the changing magnification.
  • the determination of ions for quantification and finding the relationship between the ionic strength and the abundance ratio of structural isomers in the sample is that multiple structural isomers are present in the sample. It is useful for quantitative analysis when it exists in unknown mixing ratio. For example, the unknown mixture ratio can be calculated as follows. A sample containing a plurality of types of sugar chain structural isomers in an unknown mixing ratio is prepared.
  • the structural isomers of a plurality of sugar chains can be quantified.
  • a mass analysis result is obtained according to the method of the present invention for the sugar chain of the unknown structure, and This can be done by comparing the results of mass spectrometry of sugar chains. Examples of forms for structure identification in this way are shown below, but the forms shown here also include cases in which structural isomers of multiple types of sugar chains are analyzed. It is.
  • the sugar chain of unknown structure is labeled with a labeling compound to obtain a labeled sugar chain of unknown structure.
  • the labeled sugar chain having an unknown structure is measured in a negative mode using a M A L D I mass spectrometer.
  • the sugar chain with a known structure is labeled with a labeling compound to obtain a labeled sugar chain with a known structure.
  • the labeled sugar chain having a known structure is measured in a negative mode using a M A L D I mass spectrometer.
  • the information obtained from the mass spectrum includes the structure information of the product ion itself, the position on the precursor ion where the fragmentation that produces the product ion occurs, and the estimated information on the liberated neutral molecule. Information derived from a combination of information is included.
  • the entire mass spectrum of the labeled sugar chain with an unknown structure and / or the entire information obtained from the mass spectrum, and the mass spectrum of the labeled sugar chain with the known structure If the entire peak and / or the entire information obtained from the mass spectrum match, the sugar chain with the unknown structure can be determined to have the same structure as the sugar chain with the known structure.
  • the peaks to be compared are indispensable for the main structural analysis (ie, peaks detected with a certain level of ionic strength) and / or the overall structure of sugar chains. It only has to include a peak.
  • the information to be compared includes at least information essential to the overall structure of the sugar chain. In the case of coincidence, an error within the measurement range of the mass spectrometer is allowed when comparing the mass number and ion intensity of the generated ions. In addition, when comparing structural information such as sugar chain sequences and positions on sugar chains, a perfect match is required. In the above method, the structure of the entire sugar chain can be determined. However, while sugar chains of unknown structure have a wide variety of structures, the types of sugar chains of known structure that can be obtained as standard substances are limited.
  • the partial structure can be determined as follows. That is, in the step (3), the specific peak of the mass spectrum of the labeled sugar chain with an unknown structure and / or the specific information obtained from the mass spectrum, and the labeled sugar chain with the known structure of the labeled sugar chain. If a specific peak of a mass spectrum and / or specific information obtained from the mass spectrum match, the sugar chain of unknown structure and the sugar chain of known structure are a specific part of the structure.
  • the sugar chain with the unknown structure has the same structure as the sugar chain with the known structure. It can be determined as having a partial structure.
  • the data obtained by the method of the present invention will be described below.
  • Mass spectrum obtained by the method of the present invention (that is, a mass spectrum obtained by labeling sugar chains and measuring the obtained labeled sugar chains using a MALDI mass spectrometer with negative ions) Provides important information about sugar chains, such as the structure information of product ions, including product ions that are specifically generated from structural isomers, and the precursors where the fragmentation that generates the product ions occurred. Position, estimated information about free neutral molecules, a combination of these information Structural information derived by ⁇ Quantitative information. Mass spectra containing such important information can be used as data on sugar chains.
  • various mass spectra are obtained using the method of the present invention, and the obtained mass spectra and / or information obtained from the mass spectra are stored as a data collection. I can leave. Further, such a data collection may include mass spectrum and / or information obtained from the mass spectrum whose structure has been clarified by the method of the present invention. For example, as described above, the data stored in the data collection is compared when the unknown structure is determined by comparing the mass analysis result of the sugar chain of unknown structure with the mass analysis result of the sugar chain of known structure. It can be used as structural data for sugar chains of known structure for control purposes. The effects of the present invention are described below.
  • the method of the present invention is applied to a sugar chain associated with a specific disease as described in the present specification, it can be used for diagnosis of various diseases. For example, when analyzing fucose-containing glycans using the method of the present invention, clarifying the position of fucose binding can be said to be sufficiently useful for diagnosis of diseases associated with the fucose-containing glycans. . In addition, based on information obtained from fucose-containing sugar chains with a clear structure, it is possible to clarify whether a sugar chain with an unknown structure contains a specific fucose bond. It becomes possible.
  • the present invention includes a basic process of preparing a sample containing a biomolecule, labeling the biomolecule with a labeling compound, and measuring the obtained labeled biomolecule by mass spectrometry.
  • a sample containing the sugar chain is prepared, the sugar chain is labeled with a labeling compound, and the labeled sugar chain is subjected to negative ion measurement by mass spectrometry.
  • a neutral sugar chain is labeled to obtain a labeled sugar chain and the labeled sugar chain is subjected to negative ion measurement with a mass spectrometer; a neutral sugar obtained by neutralizing an acidic sugar chain
  • a neutral sugar obtained by neutralizing an acidic sugar chain
  • knowing the neutral sugar chain to obtain a labeled sugar chain, and measuring the labeled sugar chain with negative ions; and labeling the acidic sugar chain, and then adding the acidic sugar in the sugar chain This includes the case where a labeled sugar chain is obtained by oxidization treatment and the labeled sugar chain is subjected to negative ion measurement.
  • the disease marker one search method and the mass spectrometry method of the sample containing a biomolecule of the present invention are performed by applying this basic process.
  • biomolecule j means a protein having a modification of a sugar chain, protein 'peptide, sugar chain, etc.'peptide, nucleic acid, glycolipid, etc. These biomolecules may be naturally occurring or chemically. Alternatively, it may be prepared by an enzymatic method, and its structure may be known or unknown, and therefore, as a specific example of “a sample containing a biomolecule”, a sample derived from a living body (eg, cell, tissue, secretion) Samples containing fractions containing biomolecules from liquids, body fluids, etc.) and samples containing samples of known structure obtained by chemical synthesis or enzymatic synthesis. These biomolecules function correctly with controlled expression levels depending on time and place.
  • a sample containing a biomolecule a sample derived from a living body (eg, cell, tissue, secretion) Samples containing fractions containing biomolecules from liquids, body fluids, etc.) and samples containing samples of known structure obtained by chemical synthesis or enzymatic synthesis
  • glycoproteins have different sugar chain structures at the time of disease even if they have the same peptide chain as normal.
  • glycan changes vary depending on the degree of progression of the disease state, whether it is acute or chronic, benign or malignant, or the course of treatment for the disease. Therefore, more accurate pathological information can be obtained by taking into account not only the presence or absence of protein expression but also its sugar chain structural changes.
  • the preparation of the sample containing the biomolecule is described in the above [1] to ⁇ 19> [Glycan chain analysis method and obtained by the method Data], as described in ⁇ Preparation of samples containing sugar chains>.
  • a “labeled compound” is a compound that can generate negative ions from a biomolecule in mass spectrometry by binding itself to the biomolecule.
  • the labeling compound has a reactive group capable of covalently bonding to a biomolecule and a molecular skeleton that absorbs light or emits fluorescence.
  • the labeling method is not particularly limited, and a labeled biomolecule can be obtained by appropriately using a conventional method.
  • the labeling compound and the labeling method are described in [Method of analyzing a sugar chain and data obtained by the method] described in ⁇ 1> to ⁇ 19> above. This is as described in “Labeling sugar chains using a labeling compound”. ⁇ Measurement by mass spectrometry and analysis of biomolecules> The obtained labeled biomolecule is measured in a re-negative mode with a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) mass spectrometer.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • ⁇ -cyanol 4-hydroxykehynoic acid norharman, 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) and the like are used.
  • measurement is preferably performed using a MALDI-Qrr-TOF type mass spectrometer that uses DHBA as a matrix and combines a quadrupole ion trap (QIT) and a time-of-flight type (TOF).
  • Measurement methods using a mass spectrometer include PSD measurement, 'ISD measurement, and MS. Methods such as measurement (multi-stage MS measurement; including tandem mass measurement) are used.
  • the analysis of biomolecules is performed based on the mass number and relative intensity of the negative ions of the measured mass spectrum.
  • the analysis of biomolecules includes structural analysis and quantitative analysis.
  • structural analysis for example, it is possible to know the structure of a biomolecule related to a specific disease, so that it is possible to search for a disease marker. Since the abundance can be known, it is possible to diagnose the presence / absence of a specific disease or the degree of expression thereof, that is, the presence / absence of a specific disease, the degree of progression, and the degree of treatment outcome for a specific disease.
  • structural analysis includes the assignment of the detected ionic species; the ionic species specifically generated from a specific structural isomer of the sugar chain. Detection and assignment (identification of structural isomers); identification of the binding position of a specific sugar; identification of the partial structure of a sugar chain: identification of the overall structure of the sugar chain, etc.
  • Quantitative analysis includes specific sugar chains Detection of ion species specifically generated from specific structural isomers of glycans or ionic species, and the difference between the ionic strength of the ionic species and the relative amount in the sample Derivation of a function; quantification of a specific sugar chain or a specific structural isomer of a sugar chain is included.
  • a method for analyzing a biomolecule will be described by taking as an example the case where the biomolecule is a sugar chain.
  • structural analysis and quantitative analysis can be performed in the same manner as the following sugar chain analysis method.
  • a sugar chain can have a plurality of structural isomers having the same molecular weight and the same monosaccharide composition.
  • the sugar chains associated with the specific diseases described above are sugar chains in which structural isomers may exist.
  • one fucose is bound to a sugar chain
  • at least four types of binding are available at one binding position of fucose (ie, the position of the sugar residue to which fucose is bound in the sugar chain). (Ie, 1-2, 1-3, 1-4, and 1-6 glucoside linkages).
  • a considerable number of structural isomers are candidates. If the number of fusoses connected is two, the number of combinations will increase. This basic process can be usefully used particularly when the sugar chain can have such a structural isomer.
  • each structural isomer may be contained in a separate independent sample, or a plurality of structural isomers may be contained in the same sample. It may be included. In either case, as described below, it is possible to identify structural isomers and analyze them.
  • sugar chains (A, B, C, ' ⁇ ) having a structural isomer relationship with each other are analyzed as the sugar chains
  • the structural analysis can be performed as follows. In the same manner as described above, labeled sugar chains (A ', B', C ', ⁇ ⁇ ) are obtained from sugar chains (A, B, C,-) by labeling with the above-mentioned labeling compounds. .
  • the structural isomers (A, B, C,-) can be distinguished from each other. More specifically, as the sugar chains, the sugar chains that are in a structural isomer relationship with each other.
  • the structural analysis can be performed as follows.
  • a labeled sugar chain A ′ is obtained from sugar chain A
  • a labeled sugar chain B ′ is obtained from sugar chain B.
  • the relationship between product ions a and b is as follows: Become. That is, at least one of the product ions b is not generated from the labeled sugar chain A ′, and at least one of the product ions a is not generated from the labeled sugar chains B ′; and the product ion a And product ion b have different mass number combinations. Thus, negative ions are generated reflecting the difference in fine structure. This makes it possible to easily identify structural isomers that were not possible with mass spectrometry.
  • this specific ion can usually be detected by MS 2 analysis, but depending on the case, MS 3 analysis or further MS n analysis can be performed. It is also preferable to obtain more detailed information by detecting more specific ions as described above, and structural isomerism.
  • identifying the body it is possible to identify part or all of the structure of the structurally heterogeneous substance from the information of the detected ions, in particular, analyzing ions specifically generated from structural isomers In the chain, it may contribute to the determination of important partial structures such as the structure that becomes the determinant of the antigen and the minimum structure that is the key to functional expression.
  • the biological sample is a mixture of various sugar chains.
  • a plurality of sugar chains contained in a sample are sugar chains having different molecular weights, analysis can be easily performed. For example, when multiple types of fucose-containing sugar chains are included in the sample, one fucose residue is bonded to one sugar chain, and two fucose residues are bonded to the other sugar chain.
  • sugar chains having different numbers of fucose bonds have different molecular weights, and therefore can be easily identified, identified and quantified by mass spectrometry.
  • a sugar chain can have multiple structural isomers having the same molecular weight and the same monosaccharide composition.
  • This basic process is particularly useful when a plurality of types of sugar chains contained in a sample are in a structural isomer relationship with each other. In this basic process, the presence of other molecules in the measurement sample does not affect the phenomenon in which specific product ions are specifically generated from specific structural isomers. That is, ionization occurs specifically and independently for each structural isomer. Therefore, in this case as well, analysis may be performed based on the method described above.
  • the structural isomer can be identified and quantified.
  • analysis can be performed by the following method. Although the examples of analysis methods described below describe quantification methods, the entire glycan chain is mainly obtained by using mainly the information of puddle ions generated specifically from specific structural isomers. As described above, the structure or partial structure can be identified. A sample containing a plurality of kinds of structural isomers of sugar chains in a known mixing ratio is prepared. In the same manner as described above, a plurality of sugar chains are labeled with the labeling compound to obtain a plurality of types of labeled structural isomers.
  • MS n analysis when MS n analysis is used in this basic process, specific ions can usually be detected by MS 2 analysis. However, depending on the case, MS 3 analysis or further MS “analysis can be performed. It is also preferable to detect more specific ions to obtain more detailed information, as described above.In this basic process, the presence of other molecules in the measurement sample This does not affect the phenomenon that specific product ions are specifically generated from the structural isomers of each other, so each detected specific ion reflects the mixing ratio of the structural isomers contained in the sample. Based on this, ions generated specifically from structural isomers can be used as ions for quantification of structural isomers.
  • ions specifically generated from structural isomers are determined as ions for quantification of structural isomers, and a known mixture of multiple structural isomers contained in the sample is determined. Based on the ratio, the relationship between the ionic strength of the ions for quantification and the known mixing ratio can be found, for example, the structural isomer X and the structural isomer Y in the sample have the same ratio as the known mixing ratio.
  • the intensity ratio between the specific ion X resulting from the structural isomer X and the specific ion y arising from the structural isomer Y is always the same; If the relative amount of structural isomer X in structural isomer X in relation to structural isomer Y changes, the relationship that the relative ionic strength of ions to ion y changes in proportion to the change ratio of the relative mixing amount can be found. it can.
  • the ion information obtained by determining the ion for quantification and finding the relationship between the ionic strength and the abundance ratio of the structural isomer in the sample indicates that multiple structural isomers are present in the sample. It is useful for quantitative analysis when it exists in unknown mixing ratio. For example, the unknown mixture ratio can be calculated as follows. A sample containing a plurality of types of sugar chain structural isomers in an unknown mixing ratio is prepared.
  • the structural isomers of a plurality of sugar chains can be quantified.
  • the mass analysis result for the sugar chain of unknown structure is obtained according to this basic process. This can be done by comparing the mass analysis results of the chains.
  • the following is an example of a form for identifying the structure in this way. The form shown includes the case where structural isomers of multiple types of sugar chains are to be analyzed as described above.
  • the sugar chain of unknown structure is labeled with a labeling compound to obtain a labeled sugar chain of unknown structure.
  • the labeled sugar chain having an unknown structure is measured in a negative mode using a M A L D I mass spectrometer.
  • the sugar chain with a known structure is labeled with a labeling compound to obtain a labeled sugar chain with a known structure.
  • the labeled sugar chain having the known structure is measured in a negative mode using a M A L D I mass spectrometer.
  • the information obtained from the mass spectrum includes the structure information of the product ion itself, the position on the precursor ion where the fragmentation that generates the product ion occurred, and the estimated information about the neutral molecule that has been released. Information derived from a combination of information is included.
  • the step (3) in the mass spectrum of the labeled sugar chain of unknown structure and / or the entire information obtained from the mass spectrum, and the mass spectrum of the labeled sugar chain of known structure. When the entire peak obtained from the above and / or the entire information obtained from the mass spectrum match, the sugar chain with the unknown structure becomes the sugar chain with the known structure. It can be determined that they have the same structure.
  • the peaks to be compared are at least the main peaks (that is, peaks detected at a certain ionic strength) and / or indispensable for the overall structure analysis of sugar chains. It only has to include a peak.
  • the information to be compared includes at least information essential to the overall structure of the sugar chain. In the case of coincidence, an error within the measurement range of the mass spectrometer is allowed when comparing the mass number and ion intensity of the generated ions.
  • a perfect match is required. In the above method, the structure of the entire sugar chain can be determined.
  • the partial structure can be determined as follows. That is, in the step (3), the specific peak of the mass spectrum of the labeled sugar chain with an unknown structure and / or the specific information obtained from the mass spectrum, and the labeled sugar chain with the known structure of the labeled sugar chain.
  • a specific peak of a mass spectrum and / or specific information obtained from the mass spectrum match, the sugar chain with the unknown structure and the sugar chain with the known structure are a specific part of the structure.
  • a partial peak of the mass spectrum of the labeled sugar chain with an unknown structure and / or a part of information obtained from the mass spectrum, and the labeled sugar chain with the known structure If the entire peak of the mass spectrum and / or the entire information obtained from the mass spectrum match, the sugar chain of unknown structure has a partial structure that faces the sugar chain of known structure. Can be determined to have as.
  • the data obtained by this basic process will be described.
  • the mass spectrum obtained by this basic process (for example, by labeling sugar chains and measuring the labeled sugar chains obtained by measuring negative ions using a MALDI mass spectrometer).
  • Important information on sugar chains For example, the structure information of product ions, including product ions specifically generated from structural isomers, the position on the precursorion where the fragmentation that generates the product ions occurred, the estimated information on the free neutral molecules, This includes structural information and quantitative information derived from information combinations.
  • Mass spectra containing such important information can be used as data on sugar chains. For example, with regard to sugar chains of various known structures, various mass spectra are obtained using this basic process, and the obtained mass spectra and / or information obtained from the mass spectra are stored as a data collection. I can keep it.
  • Such data collections can also include information obtained from the mass spectrum and / or mass spectrum of which the structure has been clarified by this basic process.
  • the data stored in the data collection is, for example, the quality of sugar chains of unknown structure as described above.
  • an unknown structure is determined by comparing a quantitative analysis result with a mass spectrometry result of a sugar chain of a known structure, it can be used as structure data of a sugar chain of a known structure for comparison.
  • negative ions can be generated stably, so that sufficient precursor ions can be generated to enable multi-step MS measurement, and mass spectrometry with high sensitivity is possible.
  • negative ions of labeled sugar chains have stable ⁇ -glycoside bonds such as fucose and neutralized sialic acid, so the production amount of product ions from which these sugar chains are eliminated is relatively low. As a result, information on these coupling positions can be obtained.
  • the biomolecule to be analyzed is a sugar chain
  • negative ions of the labeled sugar chain are generated reflecting the fine structure, which is very useful for identifying complex and many types of isomeric structures. Being able to distinguish structural isomers means that important information is available that a specific bond is attached to a specific position in a sugar chain. Therefore, biomolecules associated with specific diseases such as those described herein are
  • the fucose-containing sugar chain can be analyzed using this basic process to clarify the binding position of fucose, so that a marker of a disease associated with the fucose-containing sugar chain can be found.
  • a marker of a disease associated with the fucose-containing sugar chain can be found.
  • it is possible to clarify whether or not a specific fucose bond is contained in a sugar chain whose structure is unknown based on information on a disease marker it is possible to easily diagnose a disease.
  • Biomolecule analysis structural analysis and quantitative analysis
  • Analysis of a sample containing a sample determination of the presence or extent of a specific disease, ie, the presence or absence of the specific disease, the degree of progression, and / or the degree of treatment outcome for the specific disease
  • a method for searching for a disease marker to which the above-described biomolecule analysis method is applied will be described.
  • biomolecule X derived from a person with a specific disease.
  • the biological sample collected from the affected person may be used as it is, or as already described in the basic process, the biological molecule X is obtained from such a biological sample using a chemical or enzymatic method. You may use the sample prepared by performing the suitable process for obtaining.
  • a biomolecule derived from a person suffering from a specific disease is referred to as biomolecule X.
  • the molecule X may contain a plurality of biomolecules derived from the affected person.
  • the biomolecule X is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule X ′.
  • the labeling compound and labeling method have already been described in the basic process.
  • the labeled biomolecule X ′ is measured for negative ions with a M A L D I mass spectrometer.
  • the equipment and matrix used for the measurement, and the measurement method have already been described in the basic process.
  • the biological sample collected from the non-affected person may be used as it is, or as already described in the basic process, the biological molecule Y is obtained from such a biological sample using a chemical or enzymatic method.
  • a sample prepared by carrying out an appropriate treatment for obtaining the above may be used.
  • the biomolecule Y may contain a plurality of biomolecules derived from the non-affected person. Note that the sample containing the biomolecule Y is preferably a sample corresponding to the sample containing the biomolecule X.
  • a sample collected from the same site in the affected person's body and the non-affected person's body and preferably a sample prepared by performing the same treatment as necessary.
  • the biomolecule Y is labeled with a labeling compound as in the case of the biomolecule X to obtain a labeled biomolecule Y ′.
  • the labeled biomolecule Y ′ is subjected to measurement of line negative ions by a MALDI mass spectrometer as in the case of the biomolecule X ′.
  • the information obtained from the mass spectrum includes the structural information of the product ions themselves and the fragment maintenance that generates the product ions, as described in the basic process.
  • the step (3) when the mass spectra and / or the information obtained from the mass spectra are different from each other, that is, when the specific mass spectra and / or specific information are different from each other, the occurrence of a specific disease It can be confirmed that there is a structure related to.
  • the mass spectrum peak and / or the information different from each other in both samples includes both different in mass / charge and different in ionic strength with the same mass / charge.
  • the mass spectrum of the labeled biomolecule Y ′ is included in the information obtained from the mass spectrum of the labeled biomolecule X ′ and / or the mass spectrum. What is not included in the information obtained from and / or mass spectra teaches the structure involved in the development of a particular disease.
  • the information obtained from the mass spectrum and / or mass spectrum of the labeled biomolecule X ′ is the mass spectrum and / or mass spectrum of the labeled biomolecule Y ′. Obtained from the spectrum Those that are detected more strongly than the information reported also teach structures involved in the development of specific diseases.
  • the labeling biomolecule X ′ is detected to be extremely strong in the mass spectrum and / or information obtained from the mass spectrum. It can be done as appropriate. From such mass spectrum and / or information obtained from the mass spectrum, a disease marker can be found by analyzing the structure related to the development of the disease. Specifically, the structure related to the expression of a specific disease or the structure of biomolecule X having the structure analyzed as described above can be determined as the structure of a disease marker.
  • the disease marker obtained by the method of the present invention can be usefully used for analysis of a sample containing a biomolecule as described below, for example.
  • the disease marker of the present invention can be used for diagnosis of various diseases as described in detail in the explanation of biomolecules using sugar chains as an example.
  • the disease marker of the present invention includes sugar chains related to the various diseases.
  • sugar chains include fucose and / or sialic acid-containing sugar chains, blood group antigen sugar chains, and the like.
  • Specific examples include ABO blood group antigen sugar chains and Lewis blood group antigen sugar chains.
  • the presence / absence or degree of expression of a specific disease can be judged by the disease strength in this way, the presence / absence, progression, or treatment of a specific disease. It is possible to diagnose the outcome of.
  • the following describes the analysis method for samples containing biomolecules.
  • the sample containing the biomolecule of the present invention it may be analyzed by mass spectrometry, or may be analyzed by a method other than mass spectrometry. That is, in the method for analyzing a sample containing a biomolecule of the present invention, a sample containing a biomolecule derived from a subject is prepared, and the presence or absence of the expression of a specific disease in the subject or the expression of the expression using a disease marker is prepared. Judge the degree.
  • a disease marker in a method for analyzing a sample containing a biomolecule using the following mass spectrometry the disease marker found by the above-described disease marker search method of the present invention can be used, and Disease markers found by methods other than the method of the present invention can also be used.
  • the following persons are included as subjects. A person who is uncertain whether or not he / she is affected by a specific disease; a person who is affected by a specific disease and whose degree of progression is unknown; Included are affected individuals who are undergoing treatment and whose outcome is unknown.
  • the biomolecule cage may contain a plurality of biomolecules derived from the subject.
  • the biomolecule z is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule Z ′.
  • the labeled biomolecule Z ′ is measured for negative ions using a MALDI mass spectrometer.
  • the mass spectrum of the disease marker and / or information obtained from it is obtained from the mass spectrum of the labeled biomolecule Z ′ and / or from it as an indicator of the presence or absence and / or the degree of expression of the specific disease.
  • the molecular spectrum of biomolecule Z 'and / or the information obtained from it include the same mass spectrum peak and / or information as the disease marker. The presence or absence of expression can be determined.
  • the mass spectrum of biomolecule Z ′ and / or the information obtained from it include the same as the mass spectrum peak of the disease marker and / or its information, the ionic strength indicates the specific disease.
  • the degree of expression of can also be judged.
  • labeling is also performed on the disease marker, and the judgment is made by comparing the obtained mass spectrum and / or the information obtained from it. Also good. In the method shown below, the details of each process are as described above.
  • the biomolecule z is labeled with a labeling compound to obtain a labeled biomolecule z ′.
  • the labeled biomolecule Z ′ is measured for negative ions using a MALDI mass spectrometer. (2) Prepare disease markers separately.
  • the disease marker is labeled with a labeling compound to obtain a labeled disease marker.
  • the labeled biomolecule Z ′ is MA and the negative ion is measured with a DI mass spectrometer.
  • Example 1 mass spectrometry was performed on lacto-N-fucopentaose III.
  • the eluate was dried to obtain pyrene-labeled sugar.
  • the obtained pyrene label was stored at ⁇ 30 ° C. protected from light.
  • the obtained pyrene-labeled sugar is purified with pure water to 1 pmol / microL. Dissolved in.
  • DH A was used as the matrix.
  • DHBA is 40 v / v of acetonitrile to 12.5 mg / mL. / Dissolved in 0 pure aqueous solution, 0.5 microL was mixed with each labeled sugar solution on the plate and then dried.
  • FIG. 1 shows the mass spectrum obtained at this time.
  • Fig. 1 (a) shows the MS spectrum of pyrene-labeled sugar
  • Fig. 1 (b) shows the MS spectrum of aminoviridine-labeled sugar.
  • the horizontal axis represents (mass / charge) (m / z)
  • the vertical axis represents the relative intensity of ions (hereinafter the same for all mass spectra described in this specification).
  • concentration plate further improves the sensitivity by 10 to 20 times, so it can be said that it can be sufficiently applied to the analysis of a very small amount of biological sample.
  • Example 2 mass spectrometry was performed on three structural isomers of monofucosyl lacto-N-hexaose.
  • the structural isomers of monofucosyl lacto-N-hexaose MFLNH-I (formula (ii)), MFLNH-IU (formula (iii)) and MFLNH-III (formula (iv)) were converted into Labeling and MS measurement and MS ZM S measurement in negative mode using MALDI-QIT-TOF mass spectrometer were performed.
  • Figure 2 shows the mass spectrum obtained by MS / MS measurement using the ion m / z 1503 detected by MS measurement as a precursor ion.
  • Figure 2 (a) is the MS / MS spectrum of pyrene-labeled MFLNH-I
  • Figure 2 (b) is the MS / MS spectrum of pyrene-labeled MFLNH-ll
  • Figure 2 (c) is the MS of pyrene-labeled MFLNH-IU. Indicates the / MS spectrum. As these spectra show, each MS / MS spectrum showed a very different peak pattern.
  • Table 1 shows the m / z values of the major ions detected in Fig. 2 (a) to (c).
  • product ion m / z 424 was generated from pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-II
  • product ion m / z 570 was generated from pyrene-labeled MFLNH-III. It was confirmed that these product ions are generated when a side chain is bonded to the 6-position of galactose.
  • the difference between the product ion m / z 424 generated from pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-II and the product ion m / z 570 generated from pyrene-labeled MFLNH-III is equivalent to one fucose residue.
  • the product ion of m / z 424 does not have a fucose residue
  • the product ion of m / z 570 has one fucose residue.
  • the fucose residue is not bound to the 6 side chain of the precursor ion that produced the product ion of m / z 424, and the product ion of m / z 570 It was found that one fucose residue was bound to the 6-side chain of the precursor ion that produced the ON.
  • the m / z 1177 product ion generated from pyrene-labeled MFLNH-I alone is the ion generated by losing Fuc-Gal from the m / z difference from the precursor ion. That is, it can be seen that the precursor ion that produced such a product ion has a Fuco-2Gal bond.
  • Comparative Example 1 the same operation as in Example 2 was performed, except that MS measurement and MS / MS measurement were performed with positive ions.
  • Figure 3 shows the mass spectrum obtained by MS / MS measurement using the ion m / z 1528 detected by MS measurement as a precursor ion.
  • Figure 3 (a) shows the MS / MS spectrum of pyrene-labeled MFLNH-I
  • Figure 3 (b) shows the MS / MS spectrum of pyrene-labeled MFLNH-II
  • Figure 3 (c) shows the MS / MS of pyrene-labeled MFLNH-III.
  • the product ion species m / z 1381 having a common structure in which fucose was released was remarkably detected in all three types of MS / MS spectra obtained. This indicates that the fucose bond is extremely unstable with positive ions.
  • the other product ions generated from the three isomers were almost the same except for the relative intensities. This proved difficult to distinguish between the three isomers.
  • Example 3 more detailed mass spectrometry was performed on two structural isomers of monofucosyl lacto-N-hexaose.
  • Example 4 mass spectrometry was performed on the following sialic acid-containing sugar chain (V).
  • the sugar chain was labeled by the same method as in Example 1 to obtain a pyrene-labeled sugar.
  • the following neutralization treatment was performed on the obtained pyrene-labeled sugar. That is, 1 ⁇ of a 10 pmol / ⁇ aqueous solution of pyrene-labeled sugar is added to 12.5 ⁇ of 1 NH 4 CI aqueous solution, and 1 of 4 (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) A 7.5-M aqueous solution of 4-methylmorpholinum mouth was added and reacted at 50 ° C for 24 hours.
  • the hydroxyl group of sialic acid was amidated and converted to a powerful rubermoyl group.
  • Samples for mass spectrometry are prepared on MS plates by performing the same operations as in Example 1 above for the neutralized sugar chains, and MS measurements are performed in negative mode using a mass spectrometer. It was. M / z 2505.9 was detected as [MH]-ions. Further, when m / z 2505.9 was selected as a precursor ion and MS / MS measurement was performed, as shown in (a) of FIG. 5, C-series ions (m / z 672.1), B containing amidated sialic acid Ions important for structure identification, such as series ions (m / z 816.4) and A series ions (m / z 876.4), were obtained. Thus, the usefulness of performing negative MS / MS measurement after neutralizing glycan containing sialic acid was demonstrated. [Comparative Example 2]
  • Example 2 the same operation as in Example 4 was performed, except that the sialic acid-containing sugar chain (V) was not neutralized.
  • m / z 2507.9 was detected as [ ⁇ - ⁇ ion.
  • MS / MS measurement was performed, as shown in Fig. 5 (b), only sialic acid released molecules were mainly generated. No mass spectrum was obtained that would yield useful structural information.
  • Example 5 mass spectrometry was performed on a mixture containing at least one of two structural isomers of monofucosyl lacto-N-hexaose (MFLNH-I and MFLNH-III).
  • MFLNH-I has a blood group H antigen structure and contains fucose binding of a cancer cell-derived prostate cancer antigen PSA.
  • MFLNH-H1 has a Lewis X antigen structure and contains fucose bonds expressed in haptoglobin and CA125, which are glycoproteins derived from ovarian cancer patients.
  • MFLNH-I and MFLNH-III were hyalene-labeled by the method described in Example 1 to obtain pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III.
  • the measurement sample contains pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III in the ratios of 10: 0, 8: 2, 6: 4, 4: 6, 2: 8, and 0:10.
  • a sample prepared as described above was used.
  • a specific disease is accompanied by the expression of the Lewis X sugar chain structure, and the progression and malignancy of the disease state are correlated with the expression level.
  • a sample derived from a subject not suffering from a specific disease Lewis X expression 20%
  • a sample derived from a subject who developed a specific disease Lewis X expression 40%
  • a subject suffering from a specific disease and progressing in pathology Three types of samples (derived from Louis X 80%) are assumed.
  • the mixed samples of pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III prepared above are 8: 2, 6: 4 and 2: 8, respectively.
  • a sample derived from a subject suffering from a specific disease (blood type H expression 80%), a sample derived from a subject who developed a specific disease (blood type H expression 60%), and suffering from a specific disease
  • blood group H expression 20% three types of specimens (non-subjects) (blood group H expression 20%). Focusing on the blood group H antigen structure in this way, for example, the 8: 2, 6: 4 and 2: 8 mixed samples of pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III prepared above are respectively assumed. It can be said that it corresponds to a subject sample with different expression state of blood group H antigen.
  • FIG. 6 shows the MS / MS spectrum of the sample containing only pyrene-labeled MFLNH-I.
  • Fig. 6 (b) shows the mixture ratio of pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III in an 8: 2 ratio.
  • the MS / MS spectrum of the mixed sample, Fig. 6 (c) shows pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III.
  • Figure 7 (d) shows a sample of a mixed sample containing pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III in a 4: 6 mixing ratio.
  • MS / MS spectrum Fig. 7 (e) shows the MS / MS spectrum of the mixed sample containing pyrene-labeled MFLNH-I and pyrene-labeled MFLNH-III in a mixing ratio of 2: 8.
  • Fig. 7 (f) shows Pyrene-labeled! MS / MS spectrum of a sample containing only IFLNH-III. As shown in FIGS. 6 (a) to (c) and FIGS.
  • the ionic strength of specific ions is changed by changing the mixing ratio of the mixed sample.
  • Product ions m / z 1177, 508, 424 (marked with a downward arrow in the figure), etc., have a reduced ionic strength as the abundance ratio of pyrene-labeled MFLNH-I decreases. If attention is paid, it can be determined to be inversely correlated with the progression of a specific disease.
  • product ions m / z 1275, 1138, 764, 570 (marked with an upward arrow in the figure), etc., have increased ion intensity as the abundance ratio of pyrene-labeled MFLNH-III increases.
  • Lewis X When focusing on the sugar chain structure, it can be determined that it correlates with the progression of a specific disease.
  • ions that are found in pyrene-labeled MFLNH-III but not in pyrene-labeled MFLNH-I are m / z 1343, 1305, 1275, 1138, 1117, 794, 764, 672, 654, 600, 570, 364.
  • the ions whose ion intensity increased as the abundance ratio of pyrene-labeled MFLNH-III in FIGS. 6 and 7 originated from pyrene-labeled MFLNH-III, It can be confirmed that the ion whose ionic strength decreased as the abundance ratio of pyrene-labeled MFLNH-I decreased was derived from pyrene-labeled MFLNH-I.
  • the correlation between the ion intensity and the abundance ratio in the mixture shows that the presence of other molecules in the measurement sample is specific to specific product ions from specific structural isomers. Indicates that it does not affect the phenomenon that occurs.
  • structural isomers can be separated and quantified from the specific product ions and their intensities. For example, detecting different product ions between samples containing the above-mentioned biologically important antigen structures can be an indicator of the progression of a specific disease and the course of treatment, and at the same time, By analyzing, remarker molecules can be identified. Furthermore, it is possible to separate and quantify structural isomers, that is, to determine the degree of disease manifestation, from such specifically generated ion species and their intensities. Specific methods for estimating the abundance of each structural isomer from the measurement results include Brown, CW, et al. Anal. Chem., Vol. 54, No. 9, pp1472 (1982), and Yasuo Iida.

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Description

明 細 書 生体試料の解析法及び疾患マーカーの検索法 技術分野
本発明は、 糖鎖の質量分析方法に関し、 より具体的には、 生体の機能発現に必 須である糖鎖の構造情報を質量分析法によって解明する技術に関する。 さらに、 本発明は、 疾患マーカーの検索法及び生体分子を含む試料の解析法に関し、 より 具体的には、 生体の機能発現に必須である生体分子の構造情報を質量分析法 ど によって解明する技術に関する。 背景技術
「質量分析法」 とは、 試料をイオン化し、 イオン化した分子を質量 電荷 (m/z) に従って分離し検出する方法である。 酸性物質はネガティブイオンを、 中性物質 はポジティブイオンを生じやすいので、そのようなィォンがそれぞれ測定される。 核酸、.タンパク質、 糖鎖などの生体高分子は、 多段階 M S測定 （M S n測定） を行うことによって解析される。 多段階 M S測定とは、 一段目の M S測定で生成 した親イオンをプリカーサ一イオンに選んで二段目の M S測定を行い、 それによ リ生じたプロダクトイオンからプリカーサ一イオンを選んでさらに三段目の M S 測定を行う、 というように、 繰り返し M S測定を行うことをいう。 この多段階 M S測定によってより詳細な構造情報が得られるが、 多段階 M S測定を行うために はプリカーサ一イオンが十分に発生することが必要である。 —方、 SUGAHARA, D et al., ANALYTICAL SCIENCE, 19, pp. 167-169 (2003) には、 オリゴ糖を蛍光標識し、 「 法ゃ曰1_ I S A法により測定することが記載 されている。
また、 Brown, C. W, et al., Analytical Chemistry, Vol. 54, No. 9， pp. 1472 (1982) や飯田康夫ら， BUNSEKI KAGAKU, Vol. 32, pp. 401 (1983)には、 吸光光度法に関 する定量方法が記載されている。 さらに一方、 iclas G. Karlsson et al., Rapid Communications in Mass
Spectrometry, 18, pp. 2282-2292 (2004)には、 L G— nano— E S I - M S (ネガ ティブモード測定） によリ、 中性糖の M S 2スぺクトルの構造特異性が上がった ことが報告されている。 発明の開示
発明の目的
一般に中性糖鎖などの中性分子はポジティブイオンが安定であるため、 MS/MS 解析には [M+Na]+や [Μ+ΗΓをプリカーサ一イオンとして解析を行う。 しかし、 例 えば疾患マーカーとして注目されているフコーズ含有糖鎖をポジティブモードで 解析すると、 フコースが優先的に脱落したイオンが多く生成する。 そして、 同じ 組成を有する構造異性体間では、 同じ組成の （すなわち同じ質量数の） プロダク トイオンがイオン強度のみを異にして生成するために、 それらプロダクトイオン を識別することが困難である。 このため、 正確な構造の同定や、 疾患マ一カーの 槟索を行うことができない。 非標識中性糖鎖を、 エレクトロスプレーイオン化法 （ESI) によりネガティブ イオンを生成させて MS/MSで測定することは公知である。 しかしながら、 一般 に ESIでは多価イオンが生成するため解析が複雑になることや、 非標識で感度が 低いことから、 診断に応用するには実用的でない。
—方、 ノルハルマンなど特殊なマトリクスを使用したり、或いは HCIや H2S04 などの酸性物質を過剰に添加したりすることによって、 比較的単純な構造の非標 識オリゴ糖について、 M A L D I質量分析装置によるネガティブイオン測定が試 みられてきた。 しかし、 親イオンとなる [Μ-ΗΓ、 [M+CI]\ 或いは [M+HS04]-の 生成量が少なく、 むしろ一部が切断されたイオン種が多く生成されるため感度が 低いことや、 マトリクスピークと重なってしまうことなどが原因となり、 満足な 結果は得られなかった。 本発明の目的は、 マトリクスに酸性物質を添加せずにネガティブイオンを生成 させ、 質量分析装置による測定の感度を向上させるとともに、 構造特異的なィォ ンを再現性良く生成させることによって、 簡便、 迅速に構造情報を得る方法を提 供することである。 さらに、 本発明の目的は、 ネガティブイオンを安定に生成させ、 賨量分析装置 による測定の感度を向上させるとともに、 構造特異的なイオンを再現性良く生成 させることによって、 簡便、 迅速に疾患マーカーを検索する方法及び生体分子を 含む試料を解析する方法を提供することである。 また、 本発明の目的は、 疾患マ —力一を用いて特定の疾患を診断する方法を提供することである。 発明の概要
本発明者らは、糖鎖を標識することによって、マトリクスに酸性物質を添加せずに、 容易にネガティブイオンを生成、安定化させ、質量分析装置による測定の感度を向上 させることを見いだした。 さらに、 このようにして生じたネガティブイオンが、 M S 。解析によって 現性よく構造特異的なイオンを生成させることも見いだし、 高感度 で、 簡便、 迅速に構造情報を得る方法を完成させた。 本発明は、 まず、 以下の < 1 >〜< 1 9 >の発明を含む。
以下の < 1 >〜< 1 6 >の発明は、 糖鎖の解析方法に関する。
< 1 >
糖鎖を含む試料を用意し、
前記糖鎖を、 標識化合物を用いて標識を行い、 標識糖鎖を得て、
前記標識糖鎖を、 MAし D I質量分析装置を用いてネガティブイオンを測定するこ とによって、 前記糖鎖の解析を行うことを含む、 糖鎖の質量分析方法。
<2>
互いに構造異性体の関係にある糖鎖 （A、 B、 C、 -) を含む試料を用意し、 前記糖鎖（A、 B、 C、 -) を、標識化合物を用いて標識を行い、標識糖鎖（A '、 B '、 C '、 '■■) を得て、
前記標識糖鎖 、 、 B '、 C '、 ···） を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガ ティブイオンを測定することによって、 前記標識糖鎖 （A '、 B '、 C '、 -) から それぞれ特異的に生じるイオン （a、 b、 c、 -) を検出することによって、 前記糖 鎖 、 B、 C、 -) を互いに識別することを含む、 糖鎖の質量分析方法。
ここで、 イオン a、 イオン b、 イオン c、 …はそれぞれ、 対応する標識糖鑪から 1 種又は複数種生じうる。
<3>
前記イオン （3、 b、 C、 ■■■) についてそれぞれ構造解析を行うことによって、 前 記糖鎖 （A、 B、 C、 ■·■) の全体構造又は部分構造をそれぞれ同定する、 <2>に記 載の質量分析方法。 < 4 >
複数種の糖鎖の構造異性体がそれぞれ既知混合比で含まれる試料を用意し、 前記複数種の糖鎖の構造異性体を、標識化合物を用いて標識を行い、複数種の標識 された構造異性体を得て、
前記複数種の標識された構造異性体を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティ ブイオンを測定し、前記複数種の標識された構造異性体それぞれから特異的に生じる イオンを検出することによつて、前記複数種の糖鎖の構造異性体の解析を行うことを 含む、 糖鎖の質量分析方法。
< 5 >
前記検出された特異的に生じるィオンについて構造解析を行うことによって、前記 複数の糖鎖の構造異性体それぞれの全体構造又は部分構造を同定し、 及び/又は、 前記検出された特異的に生じるイオンを、前記複数種の構造異性体の定量のための イオンとして決定し、前記決定されたイオンのィオン強度と前記既知混合比との関係 を見出す、 < 4 >に記載の糖鎖の質量分析方法。
< 6 >
前記複数種の糖鎖の構造異性体が未知混合比で含まれる試料を用意し、 前記複数の構造異性体を、標識化合物を用いて標識を行い、複数種の標識された構 造異性体を得て、
前記複数種の標識された構造異性体を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティ ブイオンを測定し、前記複数種の標識された構造異性体それぞれから特異的に生じる イオンを検出することによって、前記複数種の糖鎖の構造異性体の解析を行うことを 含み、
前記検出された特異的に生じるイオンについて構造解析を行うことによって、前記 複数の糖鎖の構造異性体それぞれの全体構造又は部分構造を同定し、 及び/又は、 前記検出された特異的に生じるイオンのイオン強度から、 < 5 >に記載の方法によ つて見出された関係に基づいて、 前記未知混合比を算出する、 糖鎖の質量分析方法。 なお、上記く 1 >〜<6>の発明においては、糖鎖は既知構造のものであっても未 知構造のものであっても良い。 以下の <7>~<9>の発明は、糖鎖が未知構造であ る場合の具体的な構造の同定法の形態を示したものである。
<7>
(1 ) 構造未知の一種又は複数種の糖鎖を含む試料を用意し、
前記構造未知の糖鎖を、標識化合物を用いて標識を行い、構造未知の標識糖鎖を得 て、
前記構造未知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブイオンを 測定し、
(2) 別途、 構造既知の一種又は複数種の糖鎖を含む試料を用意し、 ' 前記構造既知の糖鎖を、標識化合物を用いて標識を行い、構造既知の標識糖鎖を得 て、
前記構造既知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブイオンを 測定し、
(3) 前記 （1 ) で得られた、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺク トル及び/又 は前記マススぺク トルから得られる情報と、 前記 （2) で得られた、 前記構造既知の 標識糖鎖のマススぺク トル及び/又は前記マススぺク トルから得られる情報との比較 を行うことによって、前記構造未知の糖鎖の解析を行うことを含む、糖鎖の質量分析 方法。 <8>
前記 （3) において、前記構造未知の標識糖鎖のマススぺク トルのピーク全体及び /又は前記マススぺク トルから得られる情報の全体と、 前記構造既知の標識糖鎖のマ ススぺク トルのピーク全体及び/又は前記マススぺク トルから得られる情報の全体と がー致することを確認することにより、前記構造未知の糖鎖は、前記構造既知の糖鎖 と同じ構造を有すると決定する、 < 7 >に記載の糖鎖の質量分析方法。 <9>
前記 （3) において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺクトルの特定のピーク及 び/又は前記マススぺク トルから得られる特定の情報と、 前記構造既知の標識糖鎖の マススぺク トルの特定のピーク及び/又は前記マススぺク トルから得られる特定の情 報とがー致することを確認することによリ、前記構造未知の糖鎖は、前記構造既知の 糖鎖と同じ構造を部分構造として有すると決定する、 < 7 >に記載の糖鎖の質量分析 方法。 以下の < 1 0>〜<1 3>は、 標識化合物について記載する。 < 1 0 >
前記標識化合物が、 芳香族の基本骨格を有する化合物である、 < 1 >〜<9> のいずれかに記載の糖鎖の質量分析方法。
< 1 1 >
前記芳香族が、 ピレン、 ベンゼン、 及びピリジンからなる群から選ばれる、 < 1 0>に記載の糖鎖の質量分析方法。 < 1 2>
前記標識化合物が、 芳香族ァミン及び芳香族力ルポン酸ヒドラジドからなる群 から選ばれる、 < 1 >~< 1 1 >のいずれかに記載の糖鎖の質量分析方法。
< 1 3>
前記標識化合物が、 ピレンブタン酸ヒドラジド、 アミノビレン、 2—ァミノピ リジン、 2—ァミノベンゼン、 ァミノ安息香酸、 及びアミノ安息香酸エステルか らなる群から選ばれる、 く 1 >~< 1 2>のいずれかに記載の糖鎖の質量分析方 法。 以下のく 14>〜<1 6>は、 糖鎖について記載する。 < 1 4>
前記糖鎖が、フコース及び/又は酸性糖を中性化処理して生ぜしめた糖を有する 糖鎖である、 <1 >〜<1 3 >のいずれかに記載の糖鎖の質量分析方法。
< 1 5>
前記糖鎖が、 フコース及び/又は酸性糖を有する糖鎖であり、 前記標識糖鎖は、 前記標識処理と、 前記酸性糖の中性化処理とを行うことによって得る、 <1 >〜 < 1 3 >のいずれかに記載の糖鎖の質量分析方法。
< 1 6>
前記酸性糖が、 シアル酸、 硫酸基含有糖、 及びリン酸基含有糖からなる群から 選ばれる、 < 1 4 >又は < 1 5 >に記載の糖鎖の質量分析方法。 以下の < 1 7 >〜< 1 9 >の発明は、 上記の < 1 >〜< 1 6 >の方法によって 得られるデータに関する。
< 1 7 >
糖鎖を、 標識化合物を用いて標識を行い、 標識糖鎖を得て、
前記標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブイオンを測定す ることによって得られたマススぺク卜ル。
< 1 8 >
< 1 7〉に記載のマススぺクトルから得られる糖鎖の情報であって、 糖鎖の特 定の構造異性体から特異的に生じるイオン種の情報及び前記特定の構造異性体の 構造情報を含む情報。
< 1 9 >
< 1 7 >に記載のマススぺク トル及び/又は < 1 8 >に記載の情報を含むデー タ集。 上記 < 1 >〜く 1 9 >に記載の本発明によると、マトリクスに酸性物質を添加せず に糖鎖を標識することによって、ネガティブイオンを生成させ、質量分析装置による 測定の感度を向上させるとともに、構造特異的なイオンを再現性良く生成させること によって、簡便、迅速に構造情報を得る方法を提供することができる。 また、上記 < 1 >〜< 1 9 >に記載の本発明によると、構造異性体を有しうる糖鎖が関連する疾患 の診断に有用に用いることができる方法を提供することができる。 さらに、 本発明者らは、 生体分子を標識することによって、 容易にネガティブ イオンを生成、 安定化させ、 質量分析装置による測定の感度の感度を向上させる ことを見いだした。 さらに、 このようにして生じたネガティブイオンが、 MSn 解析によって再現性よく構造特異的なイオンを生成させることも見いだし、 高感 度で、 .簡便、 迅速に疾患マーカーを検索する方法及び生体分子を含む試料を解析 する方法を完成させた。 本発明は、 さらに以下の <20>~<32 >の発明を含む。
以下の < 20 >〜< 27 >は、 疾患マ一カーの検索法に関する。
<20>
(1 ) 特定の疾患の罹患者に由来する、 生体分子 Xを含む試料を用意し、 前記生体分子 Xを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 X 'を得て、 前記標識された生体分子 X 'を MA LD I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
(2) 別途、前記特定の疾患の非罹患者に由来する、 生体分子 Yを含む試料を用意 し、
前記生体分子 Yを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 Y 'を得て、 前記標識された生体分子 Y 'を MA LD I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
(3) 前記 （1 ) で得られた前記標識された生体分子 X 'のマススペクトル及び/ 又は前記マススぺクトルから得られる情報と、前記 （2) で得られた前記標識された 生体分子 Y 'のマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報とを 比較し、 互いに異なるマススぺクトルピーク及び/又は情報を見出すことによって、 前記特定の疾患の発現に関わる構造の存在を確認する、 疾患マーカーの検索法。 6981
11
< 2 1 >
前記見出された異なるマススペクトルピーク叉は情報のうち、
質量/電荷において異なり、 且つ、 前記標識された生体分子 X 'のマススぺクトル 及び/又は前記マススぺク トルから得られる情報に含まれて、 前記標識された生体分 子 Y 'のマススぺクトル及び/叉は前記マススぺク トルから得られる情報には含まれ ないもの、 又は、
同一の質量/電荷であってイオン強度において異なり、 且つ、 前記標識された生体 分子 X 'のマススぺク トル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報に、 前記 標識された生体分子 Y 'のマススぺクトル及び/又は前記マススぺク トルから得られ る情報よりも強いイオン強度で検出されているものから、前記特定の疾患の発現に関 わる構造を解析し、
前記特定の疾患の発現に関わる構造又は前記生体分子 Xの構造を疾患マーカーの 構造として決定する、 < 2 0 >に記載の疾患マーカーの検索法。 < 2 2 >
前記生体分子が糖鎖である、 < 2 0 >又は < 2 1 >に記載の疾患マーカ一の検索法。 < 2 3 >
前記特定の疾患が癌であり、 前記生体分子がフコース及び/又はシアル酸含有糖鎖 又は血液型抗原である、 < 2 0 >〜く 2 2 >のいずれかに記載の疾患マーカーの検索 法。
< 2 4 >
前記特定の疾患が自己免疫疾患に起因し且つ血液型と相関を示す疾患であリ、前記 生体分子がフコ一ス及び/又はシアル酸含有糖鎖又は血液型抗原である、 < 2 0 > ~ <22 >のいずれかに記載の疾患マーカ一の検索法。 < 25>
前記待の疾患が心臓疾患又は高コレステ口ール血症であり、前記生体分子がフコ一 ス及び/又はシアル酸含有糖鎖又は血液型抗原である、 <20>〜<22>のいずれ かに記載の疾患マーカーの検索法。
<26>
前記標識化合物が、 ピレン誘導体、 ベンゼン誘導体、 及びピリジン誘導体からなる 群から選ばれる、 <20>〜<25>のいずれかに記載の疾患マーカーの検索法。
<27>
前記標識化合物が、 ピレンブタン酸ヒドラジド、 アミノビレン、 2—アミノビリジ ン、 2—ァミノベンゼン、 ァミノ安息香酸、 及びアミノ安息香酸エステルからなる群 から選ばれる、 < 20>〜< 26 >のいずれかに記載の疾患マーカーの検索法。 以下の <28>〜<30>は、 生体分子を含む試料の解析法に関する。
このうち、 <28>及び<29>は、 質量分析を用いた試料の解析法に関する。
<28>
被験者に由来する、 生体分子 Zを含む試料を用意し、
前記生体分子 Zを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 Z 'を得て、 前記標識された生体分子 Z 'を MA L D I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
疾患マーカーのマススぺク トル及び/又は前記マススぺク トルから得られる情 報を指標として、 得られた前記標識された生体分子 Z 'のマススぺク トル及び/ 又は前記マススぺクトルから得られる情報から、 前記被験者における特定の疾患 の発現の有無又は前記発現の程度を判断する、 生体分子を含む試料の解析法。
<29>
(1 ) 被験者に由来する、 生体分子 Zを含む試料を用意し、
前記生体分子 Zを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 Z 'を得て、 前記標識された生体分子 Z 'を MA LD I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
(2) 別途、 疾患マーカ一を用意し、
前記疾患マーカーを、標識化合物を用いて標識し、標識された疾患マ一力一を得て、 前記標識された生体分子 Z 'を MA L D I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
(3) 前記 （1 ) で得られた前記標識された生体分子 Z 'のマススペクトル及 び/又は前記マススぺクトルから得られる情報と、前記 （2) で得られた疾患マー カーのマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報とを比較 し、前記被験者における特定の疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断する、 生体分子を含む試料の解析法。 上記 <28 >及び < 29 >の生体分子を含む試料の解析法における疾患マーカー としては、上記 <20>〜<2フ >のいずれかに記載の方法によって見出された疾患 マ一カー、又は下記 < 3 1 >又は <32 >に記載の疾患マーカ一を用いることができ る。
<30>
被験者に由来する、生体分子を含む試料を用意し、 <20>〜<27>のいずれか に記載の方法によって見出された疾患マーカ一を用いて、前記被験者における特定の 疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断する、 生体分子を含む試料の解析法。 上記 < 30 >の生体分子を含む試料の解析法における疾患マーカ一としては、下記 <31 >又は <32 >に記載の疾患マーカーを用いることができる。 以下の <31 >及び <32>は、 疾患マ一カーに関する。
<31 >
< 20>~< 27 >のいずれかに記載の方法によって見出された疾患マーカーで あって、 フコース及び/又はシアル酸を含む糖鎖構造を有するマーカ一。
<32>
< 20 >〜< 27 >のいずれかに記載の方法によって見出された疾患マーカーで あって、 血液型抗原糖鎖構造を有する疾患マーカー。 さらに本発明は、以下の < 33 >〜< 35 >の、疾患の診断法に関する発明も含む。 このうち、 <33>及び<34>は、 質量分析を用いた疾患の診断法に関する。 < 33 >
被験者に由来する、 生体分子 Zを含む試料を用意し、
前記生体分子 Zを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 Z 'を得て、 前記標識された生体分子 Z 'を MA L D I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
疾患マーカーのマススぺク トル及び/又は前記マススぺク トルから得られる情報を 指標として、 得られた前記標識された生体分子 Z 'のマススぺク トル及び/又は前記 マススぺク トルから得られる情報から、前記被験者における特定の疾患の発現の有無 又は前記発現の程度を判断することによって、前記特定の疾患の罹患の有無、進行度、 及び/又は前記特定の疾患に対する治療成果の程度を診断する、 疾患の診断法。
<34>
(1 ) 被験者に由来する、 生体分子 Zを含む試料を用意し、
前記生体分子 zを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 z 'を得て、 前記標識された生体分子 Z 'を MA LD I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
(2) 別途、 疾患マーカ一を用意し、
前記疾患マ一カーを、標識化合物を用いて標識し、標識された疾患マーカ一を得て、 前記標識された生体分子 Z 'を MAし D I質量分析装置によりネガティブイオン 測定し、
(3) 前記 （1 ) で得られた前記標識された生体分子 Z 'のマススぺク トル及び/ 又は前記マススぺクトルから得られる情報と、前記 （2) で得られた疾患マ一カーの マススぺク トル及び/又は前記マススぺク トルから得られる情報とを比較し、 前記被 験者にお る特定の疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断することによって、 前記特定の疾患の罹患の有無、 進行度、 及び/又は前記特定の疾患に対する治療成果 の程度を診断する、 疾患の診断法。 上記く 33 >及びく 34 >の診断法における疾患マーカーとしては、上記 <20> ~< 27 >のいずれかに記載の方法によって見出された疾患マーカー、又は上記 < 3 1 >又は <32 >に記載の疾患マーカーを用いることができる。 <35>
被験者に由来する、生体分子を含む試料を用意し、 <20>〜<27>のいずれか に記載の方法によって見出された疾患マーカーを用いて、前記被験者における特定の 疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断することによって、前記特定の疾患の罹 患の有無、 進行度、 及び/又は前記特定の疾患に対する治療成果の程度を診断する、 疾患の診断法。 上記 < 35 >の生体分子を含む試料の解析法における疾患マ一カーとしては、上記 <31 >又は <32 >に記載の疾患マーカーを用いることができる。 上記 < 20>〜< 35 >に記載の本発明によると、生体分子を標識することによつ て、 容易にネガティブイオンを生成、安定化させ、 質量分析装置による測定の感度の 感度を向上させるとともに、構造特異的なイオンを再現性良く生成させることによつ て、簡便、迅速に疾患マーカーを検索する方法及び生体分子を含む試料を解析する方 法を提供することができる。また、本発明により得られた疾患マーカーを用いて特定 の疾患を診断する方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
図 1は、ピレン標識 LNF-1II のネガティブイオン MSスペク トル（a)、及び、 アミノピリジン標識 LNF-IIIのネガティブイオン MSスペク トル （b) である。
図 2は、 ピレン標識 MFLNH-1のネガティブイオン MS 2スペク トル （a)、 ピレン標識 MFLNH-IIのネガティブイオン MS2スペク トル （b)、 及ぴ、 ピレン 標識 MFLNH-IIIのネガティブイオン MS2スペク トル （c) である。
図 3は、 ピレン標識 MFLNH-Iのポジティブイオン MS 2スペクトル （a)、 ピレ ン標識 MFLNH-IIのポジティブイオン MS2スペク トル （b)、 及び、 ピレン標識 MFLNH-IIIのポジティブイオン MS2スペク トル （c) である。
図 4は、 ピレン標識 MFLNH-IIのネガティブイオン MS3スペク トル （a)、 及 び、 ピレン標識 MFLNH-IIIのネガティブイオン MS3スペク トル （b) である。
図 5は、 アミ ド化シアル酸を含有するピレン標識糖鎖のネガティブイオン MS2 スぺクトル （a)、 及び、 非アミ ド化シアル酸を含有するピレン標識糖鎖のネガティ ブイオン MS2スペクトル （b) である。
図 6は、 ピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-IIIとを 10:0の割合で含む 試料のネガティブイオン MS 2スぺク トル （a)、 8:2の割合で含む混合試料のネガ亍 イブイオン MS2スペク トル （b)、 及び、 6:4の割合で含む混合試料のネガティブイ オン MS2スペクトル （c) である。
図 7は、 ピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-IIIとを 4:6の割合で含む試 料のネガティブイオン MS 2スぺクトル （d)、 2:8の割合で含む混合試料のネガティ ブイオン MS2スペク トル （e)、 及び、 0:10の割合で含む混合試料のネガティブイ オン MS2スペク トル （ f ) である。
発明を実施するための形態 [糖鎖の解析方法、 及び当該方法によって得られるデータ] まず、 上記 < 1 >〜く 1 9>の本発明について、 以下に説明する。
本発明では、 糖鎖を含む試料を用意し、 糖鎖を標識化合物で標識し、 標識糖鎖 を質量分析によりネガティブイオン測定する。 より詳しくは、 本発明では、 中性 糖鎖を標識して標識糖鎖を得て、 標識糖鎖を質量分析装置でネガティブイオン測 定する場合：酸性糖鎖を中性化処理して得た中性糖鎖を用意し、 中性糖鎖を標識 して標識糖鎖を得て、 標識糖鎖をネガティブイオン測定する場合：及び、 酸性糖 鎖を標識し、 その後、 糖鎖中の酸性糖を中性化処理して標識糖鎖を得て、 標識糖 鎖をネガティブイオン測定する場合を含む。
以下、 本発明について詳述する。
<糖鎖を含む試料の用意 >
本発明において糖鎖と記載するときは、 主として糖鎖 （オリゴ糖、 多糖） をい うが、 便宜上、 単糖も含めた糖類全般.をいうものとする。 また、 中性糖鎖とは、 電荷を持たない糖鎖をいう。 本発明の糖鎖は、 天然に存在する糖鎖でも、 化学的或いは酵素学的手法により 調製された糖鎖でも良く、その構造については既知及び未知を問わない。従って、 「糖鎖を含有する試料」 の具体例としては、 生体由来試料 （例えば細胞、 組織、 分泌液、 体液など） から糖鎖が含まれる画分を調製した試料や、 化学合成や酵素 合成などによつて得られた構造既知の標品を含有する試料などが挙げられる。 化学的或いは酵素学的手法により調製された糖鎖としては、 複合糖質から遊離 させて得られたもの、 酸性糖鎖を中性化して得られたものなどが含まれる。 上記複合糖質としては、 糖タンパク質や糖脂質などが挙げられる。 質量分析し たい試料にこのような複合糖質が含まれている場合は、 予め糖鎖部分を複合糖質 から化学的手法又は酵素学的手法を用いて遊離させる処理を行うことによって、 本発明の試料を調製する。 上記の糖鎖を遊離する処理によって酸性糖鎖を生じる場合など、 質量分析した い試料に酸性糖鎖が含まれている場合は、 糖鎖中の酸性糖残基に対して中性化処 理を行う。 酸性糖残基の中性化処理は、 標識の前の段階で行っても良いし、 標識 の後、 質量分析の前に行っても良い。 上記酸性糖鎖としては、 シアル酸、 硫酸基 含有糖、リン酸基含有糖などの酸性糖を構成糖として含むものなどが挙げられる。 酸性糖鎖の中性化の方法としては、 シアル酸、 硫酸基、 リン酸基などの修飾又は 遊離を、 化学的又は酵素学的に行う方法などが挙げられる。 解析すべき糖鎖の具体例としては、 Asnに結合した N-結合型糖鎖母核構造（高 マンノース型、 ハイブリツド型、複合型） や Thr/Serに結合した 0-結合型糖鎖母 核構造、 およびそれらの母核構造に、 さらに糖鎖が直鎖状にあるいは分岐して伸 長した糖鎖などが挙げられる。 また、 生物活性を持つ糖鎖は、 上記母核構造から伸長した側鎖部分として、 Gal )8 1-3GlcNAc 、 Gal ^ 1-4GIcNAc 、 GlcNAc 8 1-6(GIcNAcjS 1-3)Gal 、 GalNAc )δ 1-4Gal、 GlcNAc 1-4Gal、 GalNAc jS 1-4GlcNAc、 Gal 1-3Gal、 GalNAc a? 1-3Gal、 Fucc -2Gal、 Fuc 1-3GlcNAc、 Fuc a 1-4GlcNAc、 Fuc a 1-6GlcNAc などの糖鎖、 及びこれらが組み合わされた糖鎖などを有する。 特に、 本発明の実用的な例においては、 特定の疾患に関連する糖鎖が解析対象 となる。 特定の疾患に関連する糖鎖として、 フコースを含有する糖鎖、 フコース及び/ 又は上記の酸性糖 （特にシアル酸） を含む糖鎖などが挙げられる。 フコースを含 有する糖鎖は、 そのまま本発明の標識及び質量分析の工程に供される。 酸性糖を 含む糖鎖は、 上述のように、 標識の前に中性化処理を行い、 本発明の標識及び質 量分析の工程に供されるか、 又は、 標識の後に酸性糖残基の中性化処理を行い、 質量分析の工程に供される。 特定の疾患に関連する糖鎖としては、具体的には、 ABO式血液型抗原や Lewis 式血液型抗原がある。 Lewis式血液型抗原には、シアル酸が結合したものがある。 これら糖鎖抗原は様々な生物活性や疾患に関与している。 これらの糖鎖 （フコー ス及び/又はシアル酸を含む糖鎖、又は血液型抗原糖鎖） は血球表面だけでなく上 皮組織や分泌液中の糖鎖、 糖脂質、 糖タンパク質などにも発現し、 炎症性疾患、 自己免疫性疾患、 アレルギー性疾患、 ウィルス性疾患、 癌性疾患、 感染性疾患、 心臓疾患、 高コレステロール血症等と重要な関係にある。 例えば、 コレラ菌、 サルモネラ菌、 へリコパクターピロリ菌、 カンピロバクタ ー菌、 インフルエンザウイルス、 ノーウォークウィルス、 リノウィルス、 ェコゥ ィルスなどの感染症で、 血液型との相関が報告されている。 ここに挙げた例を含 め、 多くの病原性微生物と、 フコース及び/又はシアル酸を含む糖鎖や血液型抗原 糖鎖との直接の相互作用が確認されている。 大腸癌、 胃癌、 膀胱癌、 肺癌、 乳癌、 肝癌、 塍癌などの癌でも、 フコース及び/ 又はシアル酸を含む抗原や血液型抗原の発現変化が認められている。 その発現変 化は前癌状態から起こり、 病気の進行や治療と密接に関連し、 病態と高い相関が める。 また、 心臓疾患のリスクも血液型と相関する。 血中コレステロールや LDL値、 血圧が血液型と相関することや、 血液凝固因子の活性が血液型抗原によって影響 することが要因であるとされる。 さらに、 特定疾患が自己免疫疾患に起因しており且つ血液型と相関があるとさ れている疾患の例として、 小児脂肪症、 インスリン非依存型糖尿病、 グレーブス 病、 硬直性脊椎症などが挙げられる。 特定の疾患に関連する糖鎖であるがフコースを含有しない糖鎖としては、 GalNAC)8 1-4GlcNAcが挙げられる。 この糖鎖は、 下垂体ホルモンに見いだされ、 血中クリアランスの調節を担っていることや、 乳癌でこの構造の存在量が低下す ることが報告されている。 一方、 GlcNAc o -4Gal を含む糖鎖はピロリ菌の増殖 阻害活性があることが示されている。 そのほかにも、 発生や分化の特定の段階でフコース及び/又はシアル酸を含む 様々な抗原が発現することが明らかになつており、 細胞の機能発現に重要である と思われる。
<標識化合物を用いた糖鎖の標識 >
本発明において Γ標識化合物」 とは、 自身が糖鎖に結合することによって、 質 量分析測定において糖鎖からネガテイブイオンを発生させることができる化合物 である。 標識化合物は、 糖鎖と共有結合できる反応基と、 光を吸収あるいは蛍光 を発する分子骨格とを有する。 具体的には、^香族の基本骨格を有する化合物が標識化合物として挙げられる。 芳香族の基本骨格としては特に限定されず、 例えばピレン、 ベンゼン、 ピリジン などが挙げられる。 より具体的には、 芳香族ァミン、 芳香族カルボン酸ヒドラジ ドなどの芳香族化合物誘導体が標識化合物として挙げられる。 例えば、 ピレンブ タン酸ヒドラジド （pyrenebutanoic acid hydrazide(PBH))、 アミノピレン、 2— アミノビリジン、 2—ァミノベンゼン、 ァミノ安息香酸およびアミノ安息香酸の エステル体などが挙げられる。これら標識化合物のうちでも、本発明においては、 好ましくは、 2—アミノビリジンまたは PBH、最も好ましくは、 PBHを用いる。 標識の方法としては特に限定されず、 例えば従来から行われてきたピリジルァ ミノ化法などの標識法を適用又は適宜応用することができる。 . 例えば上に挙げた標識化合物のうち、 PBH以外については、乾固した糖鎖に対 して標識化合物を酸の存在下で反応させ、 その後、 還元剤を用いて還元すること によって行うことができる。 試薬、 溶媒、 反応温度、 反応時間などの条件は特に 限定されず、 当業者が適宜決定することができる。 従って、 反応条件の例として は、 上記酸として塩酸や酢酸など；還元剤として NaBH3CN、 NaBH4など；溶媒 してメタノールなどを用いることができ、 反応温度として約 8 0 ~ 9 0 °C；反応 時間として、 糖鎖と標識化合物との反応で約 1 0 ~ 6 0分、 還元反応で約 1 0〜 6 0分とすることができる。このように還元を行うことは、糖鎖の標識が安定し、 後に記載する質量分析において親イオンのイオン強度が大きくなるので、 多段階 M S測定の感度という観点から好ましい。 上に例示した標識化合物のうち PBH を用いる場合については、 上記還元剤は 必ずしも必要とはしない。 還元を用いない場合は、 乾固した糖鎖に対して標識化合物を酸の存在下で反応 させ、 その後、 中和を行い、 標識糖鎖を抽出することができる。 この場合の具体 的な方法の一例は、 D. SUGAHARA, J. AMANO, and T. IRIMURA, ANALYTICAL SCIENCE, 19, 167-169 (2003)に記載されている。
還元剤を用いる場合は、前記中和を行った後、還元剤溶液を加え、室温〜 40°C で 1 0〜60分程度反応させることができる。 この場合、 新たに還元剤溶液を加 え、 同様に反応を行うとより好ましい。
以上のようにして、 標識糖鎖を得る。
<質量分析による測定及び糖鎖の解析 >
得られた標識糖鎖をマトリクス支援レーザー脱離イオン化 （MALDI) 質量分析 装置によりネガティブモードで測定する。
マトリクスとしては、 —シァノ一4—ヒドロキシケィヒ酸、 ノルハルマン、 2, 5—ジヒドロキシ安息香酸 （DHBA) などが使用される。
本発明においては、 好ましくは、 マトリクスとして DHBAを使用し、 四重極ィ オントラップ （Qrr)及び飛行時間型 （TOF) を組み合わせた MALDI-QIT-TOF型 質量分析装置を用いて測定が行われる。 質量分析装置を用いた測定法としては、 PSD測定、 I SD測定、 MS "測定 (多段階 MS測定；タンデムマス測定を含む） などの方法が用いられる。 なお、本明細書においては、質量分析装置によって行われる測定の 1回目を M S測 定とし、 MS測定において得られたスぺクトルのイオンピークから特定のイオン（分 子量関連イオンなど）を選択し、選択された特定のイオンをプリカーサ一イオンとし て 2回目の測定を行うことを MS2測定 （MS/MS測定） とし、 MS2測定 （MS/ MS測定） を行うことによる解析を MS2解析 （MS/MS解析；タンデムマス解析） と表記する。 同様に、 MSM測定において得られたスぺク小ルのイオンピークから 特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサ一イオンとして n回目 の測定を行うことを M S n測定とし、 M S "測定を行うことによる解析を M S "解析と 表記する。 糖鎖の解析は、 測定されたマススペクトルのネガティブイオンの質量数及び相 対強度に基づいて行う。 本発明において、 糖鎖の解析には、 構造解析及び定量解 析を含む。 構造解析には、 検出されたイオン種の帰属；糖鎖の特定の構造異性体 から特異的に生じるイオン種の検出及び帰属（構造異性体の識別）；特定の糖の結 合位置の同定；糖鎖の部分構造の同定；糖鎖の全体構造の同定などが含まれる。 定量解析には、 特定の糖鎖の定量を行うことができるイオン種、 又は糖鎖の特定 の構造異性体から特異的に生じるイオン種の検出、 及び、 当該イオン種のイオン 強度と試料中における相対量との関係の導出；特定の糖鎖又は糖鎖の特定の構造 異性体の定量を行うことなどが含まれる。 糖鎖には、 分子量が同じで且つ単糖組成が同じである構造異性体が複数存在し 得る。 上述した特定の疾患に関連する糖鎖なども、 構造異性体が存在しうる糖鎖 である。 例えば糖鎖にフコースが 1個結合している場合、 フコースの 1個の結合 位置 （すなわち、 糖鎖中の、 フコースが結合している糖残基の位置〉 にっき少な くとも 4種類の結合様式 （すなわち、 1—2、 1—3、 1—4、 及び 1—6グル コシド結合） の可能性がある。 このように結合様式と結合位置との組み合わせを 考慮すると、 かなりの数の構造異性体が候補になる。 もし、 結合しているフコー スの数が 2個になれば、 さらにその組み合わせは増えることになる。 本発明は、 特に、 糖鎖がこのような構造異性体を有しうる場合に有用に用いる ことができる。 なお、 本発明において複数の構造異性体を解析対象とする場合、 それぞれの構造異性体は別々の独立した試料中に含まれていても良いし、 複数の 構造異性体が同じ試料中に含まれていても良い。 いずれの場合も、 以下に記載す るように、 互いの構造異性体を識別するとともにそれら構造異性体の解析を行う ことが可能である。 例えば、 前記糖鎖として、 互いに構造異性体の関係にある糖鎖 （A、 B、 C、 …； を解析対象とする場合、 以下のように構造解析を行うことができる。
前述と同様に、前記の標識化合物を用いて標識を行うことによって、糖鎖（A、
B、 C、 -) から標識糖鎖 （A '、 B '、 C '、 -) をそれぞれ得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 ネガティブイオンの M S測定を行うことによって、 それぞれの構造異性体から 同一の （m/z) 値を有する分子イオンが生じる。 さらにその分子イオンをプリカ —サ一イオンとして M S/M S (又は M S 3以上の多段階 M S ) 測定すると、 それ ぞれの構造異性体について特異的なイオン （a、 b、 c、 ■·■) が検出される。 こ こで、 特異的なイオンは、 1種の構造異性体から 1種又は複数種生じうる。 すな わち、 標識された糖鎖 A 'からは 1種又は複数種のプロダクトイオン aが生じ、 標識された糖鎖 B 'からは 1種又は複数種のプロダクトイオン bが、 標識された 糖鎖 C 'からは 1種又は複数種のプロダクトイオン cが、 というように、 それぞ れの標識された糖鎖から特異的にプロダクトイオンが生じる。
このようなプロダクトイオンを検出することによって、 構造異性体 （A、 B、
C、 -) は互いに識別が可能になる。 より具体的に、 前記糖鎖として、 互いに構造異性体の関係にある糖鎖 Aと糖鎖 Bとの 2種の糖鎖を解析対象とする場合、 以下のように構造解析を行うことがで さる。
前述と同様に、 前記の標識化合物を用いて標識を行うことによって、 糖鎖 Aか らは標識された耱鎖 A 'を、 糖鎖 Bからは標識された糖鎖 B 'を得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 ネガティブイオンの M S測定を行うことによって、 それぞれの構造異性体から は同一の （m/z) 値を有する分子イオンが生じる。 この分子イオンをプリカーサ 一イオンとして M S/M S (又は M S 3以上の多段階 M S ) 測定すると、 それぞれ の構造異性体について特異的なイオンが検出される。 標識された糖鎖 A 'からは 1種又は複数種のプロダクトイオン aが生じ、 標識された糖鎖 B 'からは 1種又 は複数種のプロダクトイオン bが生じるとすれば、 プロダクトイオン aと bとの 関係は以下のようになる。 すなわち、 標識された糖鎖 A 'からはプロダクトイォ ン bの少なくとも 1つは生じず、 標識された糖鎖 B 'からはプロダクトイオン a の少なくとも 1つは生じず；なお且つ、 プロダクトイオン aとプロダクトイオン bとは質量数の組み合わせが異なる。 このように、 ネガティブイオンは微細な構 造の差異を反映して生じる。 このため、 従来は質量分析では不可能であった構造 異性体の識別を簡単に行うことが可能となる。 なお、本発明において M S n解析を用いる場合は、 通常、 M S 2解析によってこ の特異的なイオンを検出することができるが、 場合により、 M S 3解析或いはさ らなる M S n解析を行うことによって、 新たに特異的なイオンが検出されること もある。 このように、 より多くの特異的なイオンを検出することによって、 より 詳細な情報を得ることも好ましい。 そして、 構造異性体を識別するとともに、 検出されたイオンの情報から構造異 性体の構造の一部又は全体を同定することができる。 特に、 構造異性体から特異 的に生じたイオンを解析することは、 糖鎖の中で、 抗原の決定基となる構造や機 能発現に鍵となる構造などの最小構造といった、 重要な部分構造の決定に寄与す ることがある。 もちろん、 このような特異的なイオンについてだけでなく、 構造 異性体に共通して検出されるイオンの解析などをあわせて行い、 構造異性体の全 体構造を同定することも可能である。 以下に、試料に複数種の糖鎖が含まれている場合についてよリ詳しく説明する。 多くの場合、 生体試料は多様な糖鎖の混合物である。 試料中に含まれている複 数の糖鎖が、 互いに分子量が異なる糖鎖である場合は、 容易に解析を行うことが 可能である。 たとえば、 複数種のフコース含有糖鎖が試料中に含まれている場合 で、 ある糖鎖にはフコースが 1残基結合しており、 他の糖鎖にはフコースが 2残 基結合しているとする。 このように、 フコース結合数が互いに異なる糖鎖は、 分 子量が互いに異なるため、 質量分析により容易に識別、 同定及び定量することが 可能である。 しかし、 すでに述べたように、 糖鎖には、 分子量が同じで且つ単糖組成が同じ である構造異性体が複数存在し得る。 本発明は、 特に、 試料に含まれている複数 種の糖鎖が互いに構造異性体の関係にあるときに有用に用いられる。 本発明の方 法において、 測定試料中の他の分子の存在は、 特定の構造異性体から特定のプロ ダクトイオンが特異的に生じる現象に影響を与えるものではない。すなわち、個々 の構造異性体について独立して特異的にイオン化が起こる。従って、この場合も、 上述した方法に基づいて解析を行えばよい。 すなわち、 特定の構造異性体から特 異的に生じるプロダクトイオンを検出すれば、 構造異性体の同定とともに定量が 可能である。 例えば、 以下の方法で解析を行うことができる。 なお、 以下に記載する解析方 法の例では定量方法について記載しているが、 特定の構造異性体から特異的に生 じるプロダクトイオンの情報を主に用いることによって、 糖鎖の全体構造又は部 分構造の同定ができることは上述の通リである。 複数種の糖鎖の構造異性体がそれぞれ既知混合比で含まれる試料を用意する。 前述と同様に、複数数の糖鎖を、前記の標識化合物を用いて標識を行い、複数種の 標識された構造異性体を得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 質量分析測定によって、複数種の標識された構造異性体それぞれについて特異的な イオンを検出する。本.発明によって得られる、構造異性体について特異的なイオンに よって、 複数種の構造異性体の識別が可能になる。 なお、 上述したように、 本発明において M S n解析を用いる場合は、 通常、 M S 2 解析によって特異的なイオンを検出することができるが、 場合により、 M S 3解析或 いはさらなる M S n解析を行うことによって、 より多くの特異的なィォンを検出して より詳細な情報を得ることも好ましい。 すでに述べたように、本発明においては、測定試料中の他の分子の存在は、特定の 構造異性体から特定のプロダクトイォンが特異的に生じる現象に影響を与えるもの ではない。従って、検出された特異的なイオンはそれぞれ、試料中に含まれていた構 造異性体の混合比を反映したイオン強度比で検出される。 このことに基づいて、構造 異性体から特異的に生じるイオンを、構造異性体の定量のためのィオンとして用いる ことができる。 ， 従って、定量解析においては、具体的には、構造異性体から特異的に生じたイオン を構造異性体の定量のためのイオンとして決定し、試料中に含まれていた複数の構造 異性体の既知混合比に基づいて、定量のためのイオンのイオン強度と既知混合比との 関係を見出すことができる。例えば、試料中における構造異性体 Xと構造異性体 Yと が前記の既知混合比と同じ比で含まれていれば、構造異性体 Xから生じた特定のィォ ン Xと構造異性体 Yから生じた特定のイオン yとの強度比は常に同じであり；試料中 における構造異性体 Xの、 構造異性体 Yに対する相対量が変化すれば、 イオン Xの、 イオン yに対する相対イオン強度は、相対混合量の変化した倍率に比例して変化する、 という関係を見出すことができる。 このように、 定量のためのイオンの決定及びそのイオン強度と構造異性体の試 料中存在比との関係を見出すことにより得られた当該イオンの情報は、 複数の構 造異性体が試料中に未知混合比で存在する場合の定量解析に有用に用いられる。 例えば、 以下のようにして未知混合比を算出することができる。 複数種の糖鎖の構造異性体が未知混合比で含まれる試料を用意する。
前述と同様に、複数の構造異性体を、標識化合物を用いて標識を行い、複数種の標 識された構造異性体を得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 複数種の標識された構造異性体それぞれについて特異的なイオンを検出する。これ により検出されたイオンと前記定量のためのイオンとで質量数が同じもの同士を比 鲛して、前述の方法によって見出された、定量のためのイオンのイオン強度と試料中 混合比との関係に基づいて、検出されたイオンのイオン強度から未知混合比を算出す る。
以上のようにして、 複数の糖鎖の構造異性体について定量を行うことができる。 なお、 本発明における未知構造の糖鎖について構造の同定を行う場合は、 例え ば、 前記未知構造の糖鎖について本発明の方法に従って質量分析結果を得て、 こ の質量分析結果と既知構造の糖鎖の質量分析結果とを比較することで行うことが できる。 以下に、 このようにして構造の同定を行う形態の例を示すが、 ここに示 す形態には、 すでに述べたような、 複数種の糖鎖の構造異性体を解析対象にする 場合も含まれる。
J 1 ) 構造未知の糖鎖を含む試料を用意する。
前記構造未知の糖鎖を、 標識化合物を用いて標識し、 構造未知の標識糖鎖を得る。 前記構造未知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブモードで 測定する。
( 2 ) 別途、 構造既知の糖鎖を含む試料を用意する。
前記構造既知の糖鎖を、 標識化合物を用いて標識し、 構造既知の標識糖鎖を得る。 前記構造既知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブモ一ドで 測定する。
( 3 ) 前記 （1 ) で得られた、 前記構造未知の標識糖鎖のマススペクトル及び/又 は前記 ススぺクトルから得られる情報と、前記 （2 ) で得られた、前記構造既知の 標識糖鎖のマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報との比較 を行う。 ここで、 マススペクトルから得られる情報には、 プロダクトイオンそのものの 構造情報、 そのプロダク卜イオンを生じるフラグメンテーションが起こったプリ カーサ一イオン上の位置、 及び遊離した中性分子に関する推定情報、 これらの情 報の組み合わせにより導き出される情報などが含まれる。 前記 （3 ) の工程において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺクトルのピー ク全体及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報の全体と、前記構造既知の 標識糖鎖のマススぺクトルのピーク全体及び/又は前記マススぺクトルから得ら れる情報の全体とがー致すれば、 前記構造未知の糖鎖は、 前記構造既知の糖鎖と 同じ構造を有すると決定することができる。 なお、 マススペク トルの全体という場合は、 比較の対象となるピークが、 少な くとも、 主要なピーク （すなわちある程度のイオン強度で検出されたピーク） 及 び/又は糖鎖の全体構造解析に不可欠なピークを含んでいれば良い。また、マスス ぺクトルから得られる情報の全体という場合は、 比較の対象となる情報が、 少な くとも、 糖鎖の全体構造に不可欠な情報を含んでいれば良い。 また、 一致という場合は、 生成したイオンの質量数やイオン強虔を比較する場 合は、 質量分析装置の測定範囲内の誤差が許容される。 また、 糖鎖配列や糖鎖上 の位置など、 構造に関する情報を比較する場合は、 完全一致が求められる。 上述の方法では、 糖鎖全体の構造を決定することができる。 しかしながら、 構 造未知の糖鎖は極めて多種多様な構造をとる一方で、 標準物質として入手できる 構造既知の糖鎖の種類は限られている。 また、 糖鎖の全体構造を明らかにしなく ても、 糖鎖の中で、 抗原の決定基となる構造や機能発現に鍵となる構造などの最 小構造を決定するだけで良い場合もある。 このような部分構造を決定することは 重要である。 本発明においては、 次のようにして、 部分構造を決定することがで る。 すなわち、 前記 （3 ) の工程において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺク トルの特定のピーク及び/又は前記マススぺクトルから得られる特定の情報と、前 記構造既知の標識糖鎖のマススぺクトルの特定のピーク及び/又は前記マススぺ クトルから得られる特定の情報とがー致すれば、 前記構造未知の糖鎖と前記構造 既知の糖鎖とは、 その構造の特定の部分で共通構造を有すると決定することがで きる。 例えば、 前記 ( 3 ) の工程において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺク卜 ルの一部のピーク及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報の一部と、前記 構造既知の標識糖鎖のマススぺクトルのピーク全体及び/叉は前記マススぺク ト ルから得られる情報の全体とがー致すれば、 前記構造未知の糖鎖は、 前記構造既 知の糖鎖と同じ構造を部分構造として有すると決定することができる。 以下に、 本発明の方法によって得られるデータについて述べる。 本発明の方法によって得られたマススぺクトル（すなわち、糖鎖を標識し、得られ た標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブイオンを測定することに よって得られたマススぺクトル〉からは、糖鎖に関する重要な情報が得られる。たと えば、構造異性体から特異的に生じるプロダクトイオンを含むプロダクトイオンの構 造情報、そのプロダクトイオンを生じるフラグメン亍ーシヨンが起こったプリカーサ —イオン上の位置、遊離した中性分子に関する推定情報、 これらの情報の組み合わせ により導き出される構造情報■定量的情報などである。 このような重要な情報を含む マススぺクトルは、 糖鎖に関するデータとして活用することができる。 例えば、 さまざまな既知構造の糖鎖に関し、 本発明の方法を用いてさまざまな マススぺクトルを得て、得られたマススぺクトル及び/又はマススぺクトルから得 られる情報をデータ集として保存しておくことができる。 さらに、 このようなデ ータ集には、 本発明の方法によって構造が明らかになったもののマススぺクトル 及び/又はマススぺクトルから得られる情報も含ませることができる。 データ集に収められたデータは、 例えば上述したように、 未知構造の糖鎖の質 量分析結果を、 既知構造の糖鎖の質量分析結果と比較することによって未知構造 を決定する場合に、 比較対照のための既知構造の糖鎖の構造データとして用いる ことができる。 以下に、 本発明の効果について記載する。 まず、 質量分析において、 ネガティブイオンの安定な発生が可能になるため、 多段階 M S測定が可能となる程度に十分な量のプリ力一サ一イオンの発生と、 感 度の高い質量分析とが可能になる。 さらに、 標識糖鎖のネガティブイオンでは、 フコ一スゃ中性化後のシアル酸などの αグリコシド結合が安定であるため、 これ らの糖鎖が脱離したプロダクトィオンの生成量が相対的に少なくなることによつ て、 これらの結合位置に関する情報を得ることができる。 また、 標識糖鎖のネガティブイオンは、 微細な構造を反映して生成するので、 複雑で多種類の異性体構造体の識別に威力を発揮する。 構造異性体の識別が可能 であるということは、 糖鎖中の特定の位置に特定の結合で付加しているという重 要な情報を入手できることである。 従って、 本明細書中に述べたような特定の疾患に関連する糖鎖について本発明 の方法を適用すれば、 さまざまな疾患の診断に用いることができる。 例えば本発 明の方法を用いてフコース含有糖鎖の解析を行う場合に、 フコースの結合位置を 明らかにすることは、 そのフコース含有糖鎖が関連する疾患の診断に十分有用に 用いられるといえる。 また、 構造が明らかなフコース含有糖鎖から得られる情報 を基にして、 構造未知の糖鎖に特定のフコース結合が含まれるかどうかを明らか にすることができるため、 新しい簡便な診断法として用いることも可能になる。 さらに特筆すべき点は、 本発明を適用すれば、 試料中に複数種の糖鎖の構造異 性体が含まれていても、 構造特異的なイオンの検出によって構造異性体の同定お よび定量が可能になる点である。 疾患の診断において必要となるのは、 構造異性 体の有無ではなく、 どの構造異性体がどれだけ存在するかを明確にすることであ るが、 従来、 糖鎖異性体の分離操作も極めて複雑で専門的技術を要する。 特に微 量な生体試料を用いる診断では、 複雑で時間のかかる分離操作は不適である。 し たがって、 本発明の方法は、 搆造異性体を混合物のまま、 高い感度で同定および 定量できるため、 疾患の診断への実用性が高いといえる。
[疾患マーカーの検索法及び当該方法によって見出された疾患マーカー、 生体試 料の解析法、 及び疾患の診断法] 次に、 上記く 2 0 > ~ < 3 5 >に記載の本発明について、 以下に説明する。 本発明は、生体分子を含む試料を用意し、前記生体分子を標識化合物で標識し、 得られた標識生体分子を質量分析により測定するという基本工程を含む。例えば、 生体分子が糖鎖である場合、 糖鎖を含む試料を用意し、 糖鎖を標識化合物で標識 し、 標識糖鎖を質量分析によりネガティブイオン測定する。 より詳しくは、 中性 糖鎖を標識して標識糖鎖を得て、 標識糖鎖を質量分析装置でネガ亍イブイオン測 定する場合；酸性糖鎖を中性化処理して得た中性糖鎖を用意し、 中性糖鎖を檁識 して標識糖鎖を得て、 標識糖鎖をネガティブイオン測定する場合；及び、 酸性糖 鎖を標識し、 その後、 糖鎖中の酸性糖を中性化処理して標識糖鎖を得て、 標識糖 鎖をネガ亍ィブイオン測定する場合を含む。 そして、本発明の疾患マーカ一検索法及び生体分子を含む試料の質量分析法は、 この基本工程を応用することにより行われる。
まず、 本発明の基本工程について、 以下に詳述する。 <生体分子を含む試料の用意 >
本発明において 「生体分子 j とは、 糖鎖、 タンパク質 'ペプチド、 糖鎖などの 修飾を有するタンパク質 'ペプチド、 核酸、 糖脂質などをいう。 これら生体分子 は、 天然に存在するものでも、 化学的或いは酵素学的手法により調製されたもの でも良く、その構造については既知及び未知を問わない。従って、 「生体分子を含 有する試料」 の具体例としては、 生体由来試料 （例えば細胞、 組織、 分泌液、 体 液など） から生体分子が含まれる画分を調製した試料や、 化学合成や酵素合成な どによって得られた構造既知の標品を含有する試料などが挙げられる。 これらの生体分子は、 時と場によって発現量が制御されて正しく機能する。 ま た、その分子の一部の構造が欠損したり変化したりするだけでも機能不全に陥る。 従って、 これら生体^子の構造変化の解明によって、 疾患の予防、 診断および治 療が可能になる。 特に、 糖タンパク質においては、 健常時と同じペプチド鎖を有 していても、 疾患時の糖鎖構造が異なることが報告されている。 さらに、 病態の 進行の度合い、 急性疾患か慢性疾患か、 良性疾患か悪性疾患か、 あるいは疾患に 対する治療経過によって、 糖鎖変化が異なることも報告されている。 そこで、 タ ンパク質の発現の有無だけでなく、 その糖鎖構造変化を加味することで、 より正 確な病態情報が得られる。 例えば、 生体分子が糖鎖である場合、 生体分子を含む試料の用意については、 上記く 1 > ~ < 1 9 >の発明を説明した [糖鎖の解析方法、 及び当該方法によつ て得られるデータ] の <糖鎖を含む試料の用意 >に述べたとおりである。
<標識化合物を用いた生体分子の標識 >
本発明において「標識化合物」とは、自身が生体分子に結合することによって、 質量分析測定において生体分子からネガティブイオンを発生させることができる 化合物である。 標識化合物は、 生体分子と共有結合できる反応基と、 光を吸収あ るいは蛍光を発する分子骨格とを有する。 標識の方法としては特に限定されず、 従来から行われてきた方法を適宜用いる ことによって、 標識された生体分子を得ることができる。
例えば、 生体分子が糖鎖である場合、 標識化合物及び標識法については、 上記 < 1 > ~ < 1 9 >の発明を説明した [糖鎖の解析方法、 及び当該方法によって得 られるデータ] のく標識化合物を用いた糖鎖の標識 >に述べたとおりである。 <質量分析による測定及び生体分子の解析 > 得られた標識生体分子をマトリクス支援レーザー脱離イオン化 （MALDI) 質量 分析装置によリネガティブモ一ドで測定する。
マトリクスとしては、 α—シァノー 4—ヒ ドロキシケィヒ酸、 ノルハルマン、 2 , 5—ジヒドロキシ安息香酸 （DHBA) などが使用される。
本発明においては、 好ましくは、 マトリクスとして DHBAを使用し、 四重極ィ オントラップ（QIT) 及び飛行時間型 （TOF) を組み合わせた MALDI-Qrr-TOF型 質量分析装置を用いて測定が行われる。 質量分析装置を用いた測定法としては、 P S D測定、 ' I S D測定、 M S。測定 (多段階 M S測定； タンデムマス測定を含む） などの方法が用いられる。
生体分子の解析は、 測定されたマススぺクトルのネガティブイオンの質量数及 び相対強度 (こ基づいて行う。 本基本工程において、 生体分子の解析には、 構造解 析及ぴ定量解析を含む。 構造解析を行うことにより、 例えば特定疾患に関わる生 体分子の構造を知ることができるため、疾患マーカーの検索が可能になる。また、 定量解析を行うことにより、 例えば特定疾患に関わる生体分子の存在量を知るこ とができるため、 特定の疾患の発現の有無又は発現の程度、 すなわち特定の疾患 の有無、 進行度、 特定の疾患に対する治療成果の程度などを診断することが可能 になる。 例えば生体分子として糖鎖の場合、 より具体的には、 構造解析には、 検出され たイオン種の帰属；糖鎖の特定の構造異性体から特異的に生じるイオン種の検出 及び帰属（構造異性体の識別）；特定の糖の結合位置の同定；糖鎖の部分構造の同 定：糖鎖の全体構造の同定などが含まれる。 定量解析には、 特定の糖鎖の定量を 行うことができるィォン種、 又は糖鎖の特定の構造異性体から特異的に生じるィ オン種の検出、 及び、 当該イオン種のイオン強度と試料中における相対量との闋 係の導出；特定の糖鎖又は糖鎖の特定の構造異性体の定量を行うことなどが含ま れる。 以下に、生体分子が糖鎖である場合を例に挙げて生体分子の解析法を説明する。 その他の生体分子についても以下の糖鎖の解析法と同様に、 構造解析及び定量解 析を行うことが可能である。 糖鎖には、 分子量が同じで且つ単糖組成が同じである構造異性体が複数存在し 得る。 上述した特定の疾患に関連する糖鎖なども、 構造異性体が存在しうる糖鎖 である。 例えば糖鎖にフコースが 1個結合している場合、 フコースの 1個の結合 位置 （すなわち、 糖鎖中の、 フコースが結合している糖残基の位置） にっき少な くとも 4種類の結合様式 （すなわち、 1—2、 1—3、 1一 4、 及び 1一 6グル コシド結合） の可能性がある。 このように結合様式と結合位置との組み合わせを 考慮すると、 かなりの数の構造異性体が候補になる。 もし、 結合しているフコー スの数が 2個になれば、 さらにその組み合わせは増えることになる。 本基本工程は、 特に、 糖鎖がこのような構造異性体を有しうる場合に有用に用 いることができる。 なお、 本基本工程において複数の構造異性体を解析対象とす る場合、それぞれの構造異性体は別々の独立した試料中に含まれていても良いし、 複数の構造異性体が同じ試料中に含まれていても良い。 いずれの場合も、 以下に 記載するように、 互いの構造異性体を識別するとともにそれら構造異性体の解析 を行う.ことが可能である。 例えば、 前記糖鎖として、 互いに構造異性体の関係にある糖鎖 （A、 B、 C、 '■■) を解析対象とする場合、 以下のように構造解析を行うことができる。 前述と同様に、前記の標識化合物を用いて標識を行うことによって、糖鎖（ A、 B、 C、 -) から標識糖鎖 （A '、 B '、 C '、 ·■■) をそれぞれ得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 ネガティブイオンの M S測定を行うことによって、 それぞれの構造異性体から 同一の ( m/z) 値を有する分子イオンが生じる。 さらにその分子イオンをプリカ ーサーイオンとして M S /M S (又は M S 3以上の多段階 M S ) 測定すると、 それ ぞれの構造異性体について特異的なイオン （a、 b、 c、 -) が検出される。 こ こで、 特異的なイオンは、 1種の構造異性体から 1種又は複数種生じうる。 すな わち、 標識された糖鎖 A 'からは 1種又は複数種のプロダクトイオン aが生じ、 標識された糖鎖 B 'からは 1種又は複数種のプロダクトイオン が、 標識された 糖鎖 C 'からは 1種又は複数種のプロダクトイオン cが、 というように、 それぞ れの標識された糖鎖から特異的にプロダクトイォンが生じる。
このようなプロダクトイオンを検出することによって、 構造異性体 （A、 B、 C、 -) は互いに識別が可能になる より具体的に、 前記糖鎖として、 互いに構造異性体の関係にある糖鎖 Aと糖鎖 Bとの 2種の糖鎖を解析対象とする場合、 以下のように構造解析を行うことがで さる。
前述と同様に、 前記の標識化合物を用いて標識を行うことによって、 糖鎖 Aか らは標識された糖鎖 A 'を、 糖鎖 Bからは標識された糖鎖 B 'を得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 ネガティブイオンの M S測定を行うことによって、 それぞれの構造異性体から は同一の （m/z) 値を有する分子イオンが生じる。 この分子イオンをプリカーサ —イオンとして M S/M S (又は M S 3以上の多段階 M S ) 測定すると、 それぞれ の構造異性体について特異的なイオンが検出される。 標識された糖鎖 A 'からは
1種又は複数種のプロダクトイオン aが生じ、 標識された糖鎖 B 'からは 1種又 は複数種のプロダクトイオン bが生じるとすれば、 プロダクトイオン aと bとの 関係は以下のようになる。 すなわち、 標識された糖鎖 A 'からはプロダクトイォ ン bの少なくとも 1つは生じず、 標識された.糖鎖 B 'からはプロダクトイオン a の少なくとも 1つは生じず；なお且つ、 プロダクトイオン aとプロダクトイオン bとは質量数の組み合わせが異なる。 このように、 ネガティブイオンは微細な構 造の差異を反映して生じる。 このため、 従来は質量分析では不可能であった構造 異性体の識別を簡単に行うことが可能となる。 なお、 本基本工程において M S "解析.を用いる場合は、 通常、 M S 2解析によつ てこの特異的なイオンを検出することができるが、 場合により、 M S 3解析或い はさらなる M S n解析を行うことによって、 新たに特異的なイオンが検出される こともある。 このように、 より多くの特異的なイオンを検出することによって、 より詳細な情報を得ることも好ましい。 そして、 構造異性体を識別するとともに、 検出されたイオンの情報から構造異 性体の構造の一部又は全体を同定することができる。 特に、 構造異性体から特異 的に生じたイオンを解析することは、 糖鎖の中で、 抗原の決定基となる構造や機 能発現に鍵となる構造などの最小構造といった、 重要な部分構造の決定に寄与す ることがある。 もちろん、 このような特異的なイオンについてだけでなく、 構造 異性体に共通して検出されるイオンの解析などをあわせて行い、 構造異性体の全 体構造を同定することも可能である。 . 以下に、試料に複数種の糖鎖が含まれている場合についてより詳しく説明する。 多くの場合、 生体試料は多様な糖鎖の混合物である。 試料中に含まれている複 数の糖鎖が、 互いに分子量が異なる糖鎖である場合は、 容易に解析を行うことが 可能である。 たとえば、 複数種のフコース含有糖鎖が試料中に含まれている場合 で、 ある糖鎖にはフコースが 1残基結合しており、 他の糖鎖にはフコースが 2残 基結合しているとする。 このように、 フコース結合数が互いに異なる糖鎖は、 分 子量が互いに異なるため、 質量分析により容易に識別、 同定及び定量することが 可能である。 しかし、 すでに述べたように、 糖鎖には、 分子量が同じで且つ単糖組成が同じ である構造異性体が複数存在し得る。 本基本工程は、 特に、 試料に含まれている 複数種の糖鎖が互いに構造異性体の関係にあるときに有用に用いられる。 本基本 工程において、 測定試料中の他の分子の存在は、 特定の構造異性体から特定のプ ロダクトイオンが特異的に生じる現象に影響を与えるものではない。 すなわち、 個々の構造異性体について独立して特異的にイオン化が起こる。 従って、 この場 合も、 上述した方法に基づいて解析を行えばよい。 すなわち、 特定の構造異性体 から特異的に生じるプロダクトイオンを検出すれば、 構造異性体の同定とともに 定量が可能である。 例えば、 以下の方法で解析を行うことができる。 なお、 以下に記載する解析方 法の例では定量方法について記載しているが、 特定の構造異性体から特異的に生 じるプ ダク卜イオンの情報を主に用いることによって、 糖鎖の全体構造又は部 分構造の同定ができることは上述の通りである。 複数種の糖鎖の構造異性体がそれぞれ既知混合比で含まれる試料を用意する。 前述と同様に、複数数の糖鎖を、前記の標識化合物を用いて標識を行い、複数種の 標識された構造異性体を得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 質量分析測定によって、複数種の標識された構造異性体それぞれについて特異的な イオンを検出する。本基本工程によって得られる、構造異性体について特異的なィォ ンによって、 複数種の構造異性体の識別が可能になる。
なお、 上述したように、 本基本工程において M S n解析を用いる場合は、 通常、 M S 2解析によって特異的なイオンを検出することができるが、 場合により、 M S 3解 析或いはさらなる M S "解析を行うことによって、 より多くの特異的なイオンを検出 してより詳細な情報を得ることも好ましい。 すでに述べたように、本基本工程においては、 測定試料中の他の分子の存在は、 特 定の構造異性体から特定のプロダク トイオンが特異的に生じる現象に影響を与える ものではない。従って、検出された特異的なイオンはそれぞれ、試料中に含まれてい た構造異性体の混合比を反映したイオン強度比で検出される。 このことに基づいて、 構造異性体から特異的に生じるイオンを、構造異性体の定量のためのイオンとして用 いることができる。 従って、 定量解析においては、 具体的には、 構造異性体から特異的に生じたイオン を構造異性体の定量のためのイオンとして決定し、試料中に含まれていた複数の構造 異性体の既知混合比に基づいて、定量のためのイオンのイオン強度と既知混合比との 関係を見出すことができる。例えば、試料中における構造異性体 Xと構造異性体 Yと が前記の既知混合比と同じ比で含まれていれば、構造異性体 Xから生じた特定のィォ ン Xと構造異性体 Yから生じた特定のイオン yとの強度比は常に同じであり；試料中 における構造異性体 Xの、 構造異性体 Yに対する相対量が変化すれば、 イオンズの、 イオン yに対する相対イオン強度は、相対混合量の変化した倍率に比例して変化する、 という関係を見出すことができる。 このように、 定量のためのイオンの決定及びそのイオン強度と構造異性体の試 料中存在比との関係を見出すことにより得られた当該ィオンの情報は、 複数の構 造異性体が試料中に未知混合比で存在する場合の定量解析に有用に用いられる。 例えば、 以下のようにして未知混合比を算出することができる。 複数種の糖鎖の構造異性体が未知混合比で含まれる試料を用意する。
前述と同様に、複数の構造異性体を、標識化合物を用いて標識を行い、複数種の標 識された構造異性体を得る。
前述と同様に、 質量分析装置でネガティブイオンを測定する。 複数種の標識された構造異性体それぞれについて特異的なイオンを検出する。これ により検出されたイオンと前記定量のためのイオンとで質量数が同じもの同士を比 較して、前述の方法によって見出された、定量のためのイオンのイオン強度と試料中 混合比との関係に基づいて、検出されたイオンのイオン強度から未知混合比を算出す る。
以上のようにして、 複数の糖鎖の構造異性体について定量を行うことができる。 なお、 本基本工程における未知構造の糖鎖について構造の同定を行う場合は、 例えば、 前記未知構造の糖鎖について本基本工程に従って質量分析結果を得て、 .この質量分析結果と既知構造の糖鎖の質量分析結果とを比較することで行うこと ができる。 以下に、 このようにして構造の同定を行う形態の例を示すが、 ここに 示す形態には、 すでに述べたような、 複数種の糖鎖の構造異性体を解析対象にす る場合も含まれる。
( 1 ) 構造未知の糖鎖を含む試料を用意する。
前記構造未知の糖鎖を、 標識化合物を用いて標識し、 構造未知の標識糖鎖を得る。 前記構造未知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブモードで 測定する。
( 2 ) 別途、 構造既知の糖鎖を含む試料を用意する。
前記構造既知の糖鎖を、 標識化合物を用いて標識し、 構造既知の標識糖鎖を得る。 前記構造既知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブモードで 測定する。
( 3 ) 前記 （1 ) で得られた、 前記構造未知の標識糖鎖のマススペクトル及び/又 は前記マススぺクトルから得られる情報と、 前記 （2 ) で得られた、前記構造既知の 標識糖鎖のマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報との比較 を行う。
ここで、 マススペクトルから得られる情報には、 プロダクトイオンそのものの 構造情報、 そのプロダクトイオンを生じるフラグメンテーシヨンが起こったプリ カーサ—イオン上の位置、 及び遊離した中性分子に関する推定情報、 これらの情 報の組み合わせにより導き出される情報などが含まれる。 前記. ( 3 ) の工程において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺクトルのピー ク全体及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報の全体と、前記構造既知の 標識糖鎖のマススぺクトルのピーク全体及び/又は前記マススぺクトルから得ら れる情報の全体とがー致すれば、 前記構造未知の糖鎖は、 前記構造既知の糖鎖と 同じ構造を有すると決定することができる。 なお、 マススペクトルの全体という場合は、 比較の対象となるピークが、 少な くとも、 主要なピーク （すなわちある程度のイオン強度で検出されたピーク） 及 び/又は糖鎖の全体構造解析に不可欠なピークを含んでいれば良い。また、マスス ベクトルから得られる情報の全体という場合は、 比較の対象となる情報が、 少な くとも、 糖鎖の全体構造に不可欠な情報を含んでいれば良い。 また、 一致という場合は、 生成したイオンの質量数やイオン強度を比較する場 合は、 質量分析装置の測定範囲内の誤差が許容される。 また、 糖鎖配列や糖鎖上 の位置など、 構造に関する情報を比較する場合は、 完全一致が求められる。 上述の方法では、 糖鎖全体の構造を決定することができる。 しかしながら、 構 造未知の糖鎖は極めて多種多様な構造をとる一方で、 標準物質として入手できる 構造既知の糖鎖の種類は限られている。 また、 糖鎖の全体構造を明らかにしなく ても、 糖鎖の中で、 抗原の決定基となる構造や機能発現に鍵となる構造などの最 小構造を決定するだけで良い場合もある。 このような部分構造を決定することは 重要である。 本基本工程においては、 次のようにして、 部分構造を決定すること ができる。 すなわち、 前記 （3 ) の工程において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺク トルの特定のピーク及び/又は前記マススぺクトルから得られる特定の情報と、前 記構造既知の標識糖鎖のマススぺク トルの特定のピーク及び/又は前記マススぺ クトルから得られる特定の情報とがー致すれば、 前記構造未知の糖鎖と前記構造 既知の糖鎖とは、 その構造の特定の部分で共通構造を有すると決定することがで ぎる。 例えば、 前記 （3 ) の工程において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススぺクト ルの一部のピーク及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報の一部と、前記 構造既知の標識糖鎖のマススぺクトルのピーク全体及び/又は前記マススぺク ト ルから得られる情報の全体とが一致すれば、 前記構造未知の糖鎖は、 前記構造既 知の糖鎖と向じ構造を部分構造として有すると決定することができる。 ここで、 本基本工程によって得られるデータについて述べる。
本基本工程によって得られたマススぺクトル（例えば、糖鎖を標識し、得られた標 識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブイオンを測定することによつ て得られたマススぺク トル） からは、 糖鎖に関する重要な情報が得られる。 例えば、 構造異性体から特異的に生じるプロダクトイオンを含むプロダクトイオンの構造情 報、そのプロダクトイオンを生じるフラグメンテーシヨンが起こったプリカーサ一ィ オン上の位置、遊離した中性分子に関する推定情報、これらの情報の組み合わせによ リ導き出される構造情報，定量的情報などである。 このような重要な情報を含むマス スペクトルは、 糖鎖に関するデータとして活用することができる。 例えば、 さまざまな既知構造の糖鎖に関し、 本基本工程を用いてさまざまなマ ススぺクトルを得て、得られたマススぺクトル及び/又はマススぺクトルから得ら れる情報をデータ集として保存しておくことができる。 さらに、 このようなデ一 タ集には、本基本工程によつて構造が明らかになつたもののマススペクトル及び/ 又はマススぺクトルから得られる情報も含ませることができる。 データ集に収められたデータは、 例えば上述したように、 未知構造の糖鎖の質 量分析結果を、 既知構造の糖鎖の質量分析結果と比較することによつて未知構造 を決定する場合に、 比較対照のための既知構造の糖鎖の構造データとして用いる ことができる。 以下に、 本基本工程の効果について記載する。
まず、 質量分析において、 ネガティブイオンの安定な発生が可能になるため、 多段階 M S測定が可能となる程度に十分な量のプリカーサーイオンの発生と、 感 度の高い質量分析とが可能にする.。 さらに、 標識糖鎖のネガティブイオンでは、 フコースや中性化後のシアル酸などの αグリコシド結合が安定であるため、 これ らの糖鎖が脱離したプロダクトイオンの生成量が相対的に少なくなることによつ て、 これらの結合位置に関する情報を得ることができる。 特に、 解析する生体分子が糖鎖である場合、 標識糖鎖のネガティブイオンが、 微細な構造を反映して生成するので、 複雑で多種類の異性体構造体の識別に威力 を発揮する。 構造異性体の識別が可能であるということは、 糖鎖中の特定の位置 に特定の結合で付加しているという重要な情報を入手できることである。 従って、 本明細書中に述べたような特定の疾患に関連する生体分子について本 ι
基本工程に記載の方法を応用することで、 さまざまな疾患に関連するマーカーの 検索や、 さまざまな疾患の診断を行うことが可能になる。 例えば本基本工程を用 いてフコース含有糖鎖の解析を行い、 フコースの結合位置を明らかにすることが できるため、 そのフコース含有糖鎖が関連する疾患のマーカーを見出すことがで きる。 また、 疾患マーカーの情報を基にして、 構造未知の糖鎖に特定のフコース 結合が含まれるかどうかを明らかにすることができるため、 簡単に疾患の診断を 行うことができる。 W
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さらに特筆すべき点は、 本基本工程を用いれば、 試料中に複数種の糖鎖の構造 異性体が含まれていても、 構造特異的なイオンの検出によつて構造異性体の同定 および定量が可能になる点である。 疾患の診断において必要となるのは、 構造異 性体の有無ではなく、 どの構造異性体がどれだけ存在するかを明確にすることで あるが、 従来、 糖鎖異性体の分離操作は極めて複雑で専門的技術を要する。 特に 微量な生体試料を用いる診断では、 複雑で時間のかかる分離操作は不適である。 従って、 本基本工程を応用する本発明の方法は、 構造異性体を混合物のまま、 高 い感度で同定および定量できるため、 疾患の発現の差による微小な変化を捉える ことができる。 また、 生体試料量を減らすことができるため、 被験者の負担も減 少する。 このように、 本発明の方法は、 大変実用性の高い方法といえる。 以下、 本発明の疾患マーカーの検索及び生体分子を含む試料の質量分析につい て詳しく述べる。 これまで述べてきた基本工程により、 生体分子の解析 （構造解 析及び定量解析） を行うことができるが、 この基本工程を、 以下のように応用す ることによって、 疾患マーカーの検索及び生体分子を含む試料の質量分析 （特定 の疾患の発現の有無又は程度の判断すなわち前記特定の疾患の有無、 進行度、 及 び/又は前記特定の疾患に対する治療成果の程度の診断）を行うことが可能になる。 上述の生体分子の解析法を適用した疾患マーカーの検索法を述べる。
( 1 ) 特定の疾患の罹患者に由来する、生体分子 Xを含む試料を用意する。 このと き、前記罹患者から採取した生体試料をそのまま用いても良いし、すでに基本工程で 述べたように、そのような生体試料から、化学的又は酵素学的手法を用いて生体分子 Xを得るための適当な処理を行うことにより調製した試料を用いても良い。また、 こ こでは、特定の疾患の罹患者に由来する生体分子を生体分子 Xと記載しており、生体 分子 Xには、 前記罹患者に由来する複数の生体分子を含んでいる場合もある。 生体分子 Xを、 標識化合物を用いて標識を行い、 標識された生体分子 X 'を得る。 標識化合物及び標識法については、 すでに基本工程で述べた通リである。
標識された生体分子 X 'を M A L D I質量分析装置によりネガティブイオンを測 定する。測定に用いる装置及びマトリックス、及び測定法については、 すでに基本ェ 程で述べたとおりである。
( 2 ) 別途、 前記特定の疾患の非罹患者に由来する、 生体分子 Yを含む試料を用意 する。 このときも、 前記非罹患者から採取した生体試料をそのまま用いても良いし、 すでに基本工程で述べたように、 そのような生体試料から、化学的又は酵素学的手法 を用いて生体分子 Yを得るための適当な処理を行うことにより調製した試料を用い ても良い。また生体分子 Yには、前記非罹患者に由来する複数の生体分子を含んでい る場合もある。 なお、生体分子 Yを含む試料は、生体分子 Xを含む試料に対応する試料であること が好ましい。例えば、前記罹患者の体と前記非罹患者の体とにおける同一の部位から 採取された試料であり、必要に応じ同様の処理を行うことによつて調製された試料で あることが好ましい。 前記生体分子 Yを、生体分子 Xの場合と同様に標識化合物を用いて標識を行い、標 識された生体分子 Y 'を得る。
前記標識された生体分子 Y 'を、生体分子 X 'の場合と同様に M A L D I質量分析 装置によリネガ亍イブイオンを測定する。 ( 3 ) 前記 （1 ) で得られた標識された生体分子 X 'のマススペク トル及び/ 又は前記マススペクトルから得られる情報と、 前記 （2 ) で得られた標識された 生体分子 Y 'のマススぺクトル及び/又はそれから得られる情報とを比較する。 マススペクトルから得られる情報には、 すでに基本工程で述べたとお y、 プロ ダクトイオンそのものの構造情報、 そのプロダクトイオンを生じるフラグメンテ
—シヨンが起こったプリカ一サ一イオン上の位置、 及び遊離した中性分子に関す る推定情報、これらの情報の組み合わせにより導き出される情報などが含まれる。 前記 （3 ) の工程において、双方のマスススぺクトル及び/又はマススぺクトル から得られる情報が互いに異なるとき、すなわち特定のマススぺクトル及び/又は 特定の情報において互いに異なるとき、 特定の疾患の発現に関わる構造が存在す ることが確認できる。 ここで、マススぺクトルピーク及び/又は情報が双方の試料で互いに異なるとは、 質量/電荷において異なることと、 同一質量/電荷であってイオン強度において異 なることとの両方を含む。 そして、 質量/電荷において異なるマススぺクトルピーク及び/又は情報のうち、 標識生体分子 X 'のマススぺクトル及び/又はマススぺクトルから得られる情報 に含まれて、標識生体分子 Y 'のマススぺクトル及び/又はマススぺクトルから得 られる情報には含まれないものは、 特定の疾患の発現に関わる構造を教示する。 また、 イオン強度において異なるマススぺクトルピーク及び/又は情報のうち、 標識生体分子 X 'のマススぺクトル及び/又はマススぺクトルから得られる情報 において、標識生体分子 Y 'のマススぺクトル及び/又はマススぺクトルから得ら れる情報よりも強く検出されているものに含まれるものも、 特定の疾患の発現に 関わる構造を教示する。 この場合、標識生体分子 X 'のマススぺクトル及び/又は マススぺクトルから得られる情報において著しく強く検出されていることが好ま しいが、 このときのイオン強度の程度に関わる判断は、 当業者が適宜行うことが できる。 このようなマススぺクトル及び/又はマススぺクトルから得られる情報から、疾 患の発現に関わる構造を解析することによって、 疾患マーカ一を見出すことがで きる。具体的には、そのようにして解析された、特定の疾患の発現に関わる構造、 又はその構造を有する生体分子 Xの構造を、 疾患マーカーの構造として決定する ことができる。 本発明の方法によって得られる疾患マーカーは、 例えば以下に述べるような、 生体分子を含む試料の解析に有用に用いることができる。 本発明の疾患マーカー は、 糖鎖を例とした生体分子の説明において詳述したような、 さまざまな疾患の 診断に用いることができる。 従って、 本発明の疾患マーカーには、 前記のさまざ まな疾患に関連する糖鎖が含まれる。 このような糖鎖としては、 フコース及び/ 又はシアル酸を有する糖鎖、血液型抗原糖鎖などが挙げられる。具体的には、 ABO 式血液型抗原糖鎖や Lewis式血液型抗原糖鎖などが挙げられる。 このようにして見出された疾患マーカーを用いて生体分子を含む試料の解析を 行うと、 特定の疾患に関して罹患しているか否かが不明の被験者、 又は特定の疾 患に関する罹患の程度が不明の被験者について、 特定の疾患の発現の有無又は発 現の程度を判断することができる。 すでに述べたように、 生体分子は時と場によ つて発現量が制御されて正しく機能し、 その分子の一部の構造が欠損したり変化 したりすると機能不全に陥り、 疾患を発現させる。 従って、 このように疾患マー 力一によって特定の疾患の発現の有無又は発現の程度を判断することができると いうことは、 特定の疾患の罹患の有無、 進行度、.或いは特定の疾患に対する治療 の成果を診断することができるということである。 以下、 生体分子を含む試料の解析法を以下 ίこ述べる。 本発明の生体分子を含む 試料の解析においては、 質量分析法によって解析しても良いし、 質量分析以外の 方法によって解析しても良い。 すなわち、 本発明の生体分子を含む試料の解析法では、 被験者に由来する、 生 体分子を含む試料を用意し、 疾患マーカーを用いて、 前記被験者における特定の 疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断する。 以下、 質量分析法を用いて生体分子の解析を行う場合について述べる。 以下の 質量分析法を用いた生体分子を含む試料の解析法における疾患マーカーとしては、 上述した本発明の疾患マーカーの検索方法によリ見出された疾患マーカ一を利用 することができるとともに、 本発明の方法以外の方法によリ見出された疾患マー カーを利用することもできる。 被験者に由来する、 生体分子 Ζを含む試料を用意する。 ここで、 被験者につい ては、 以下の者が含まれる。 すなわち、 .特定の疾患に関して罹患しているか否か が不明である者；特定疾患の罹患者であって、 病態の進行程度が不明である者； 特定疾患の罹患者であリ且つ特定疾患に対する治療を受けている罹患者であって、 治療成果の程度が不明である者などが含まれる。 また、 生体分子 Ζには、 前記被 験者に由来する複数の生体分子を含んでいる場合もある。 生体分子 zを、 標識化合物を用いて標識を行い、 標識された生体分子 Z 'を得る。 標識された生体分子 Z 'を M A L D I .質量分析装置によりネガティブイオンを測 定する。 疾患マーカーのマススぺク トル及び/又はそれから得られる情報を、 特定疾患の発 現の有無及び/又は発現の程度の指標として、 標識された生体分子 Z 'のマススぺク トル及び/又はそれから得られる情報について検討する。 例えば、 生体分子 Z 'のマ ススぺク トル及び/又はそれから得られる情報に、 疾患マ一カーのマススぺクトルピ ーク及び/又はその情報と同じものが含まれているか否かで、 特定疾患の発現の有無 を判断することができる。 また、 生体分子 Z 'のマススぺク トル及び/又はそれから 得られる情報に、 疾患マーカーのマススぺク トルピーク及び/又はその情報と同じも のが含まれている場合は、イオン強度から、特定疾患の発現の程度を判断することも できる。 特定疾患の発現の有無又は程度を判断する際、すでに取得された疾患マーカーにつ いてのマススぺクトル及び/又はそれから得られる情報を用い、 それに基づいて判断 しても良いし、 以下の^うに、 被験者由来の試料に対する標識■測定の操作と平行し て疾患マーカーに対しても標識'測定を行い、 得られたマススぺクトル及び/又はそ れから得られる情報を比較することにより判断しても良い。以下に示した方法におい て、 各工程の詳細はすでに述べたとおりである。
( 1 ) 被験者に由来する、 生体分子 Zを含む試料を用意する。
生体分子 zを、 標識化合物を用いて標識を行い、 標識された生体分子 z 'を得る。 標識された生体分子 Z 'を M A L D I質量分析装置によりネガティブイオンを測 定する。 ( 2 ) 別途、 疾患マーカーを用意する。
疾患マ一力一を、標識化合物を用いて標識を行い、標識された疾患マーカーを得る。 標識された生体分子 Z 'を M Aし D I質量分析装置によりネガティブイオンを測 定する。
( 3 ) 前記 （1 ) で得られた前記標識された生体分子 Z 'のマススぺクトル及 び/又は前記マススぺクトルから得られる情報と、 前記 （2 ) で得られた疾患マー カーのマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報とを比較 し、 前記被験者における前記特定の疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断 する。 質量分析以外の方法 （例えば、 組織染色法、 免疫学的測定法など） によって生 体分子の解析を行う場合は、 本発明の疾患マーカーの検索法によって見出された 疾患マーカーを用いる以外は、 公知の方法を用いて解析を行うと良い。
実施例
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれにより限 定されるものではない。 [実施例 1 ]
本実施例 1では、 lacto-N-fucopentaose IIIについて質量分析を行った。
(糖鎖の標識）
中性糖である lacto-N-fucopentaose III (式 (i)) の標識を行った。 標識には、 D. SUGAHARA, J. AMANO, and T. IRIMURA, ANALYTICAL SCIENCE, 19, 167-169 (2003)の方法を改良した以下の方法を用いた。
Gal l— 4GICNAC 1— 3Gai i— 4Glc
3
I
Fucc
( i ) 中性糖 1 nmolをねじふすこ付きガラス反応管に加え乾固した。 この反応管に、 PBH( olecular Probes) 500 nmolをメタノ一ル 20 microLに溶解した溶液と、 メ タノールで希釈した酢酸 （メタノール：酢酸 1 :8 (v/v)) 2 microLとを加え、 ふ たを完全に閉めた。反応管中の反応液をよく撹拌した後、 80 ¾で 20分間加熱し、 1 M NaOHを加えることにより中和した。 さらに、 反応管に 1.7M NaBH4溶液を 30 microL加えて 40°Cで 30分間反応させ、 さらに 1.7M NaBH4溶液を 10 microL 加えて 40°Cで 30分間反応させた。 反応管に純水 400microL及びクロ口ホルム 400microLを加えてよく振り、 その後静置した。 下層のクロ口ホルムを捨て、 新 しいクロ口ホルム 400mk;roLを加えて、 再度同様の抽出を行つ'た。 上層を取り乾 固させて、 乾固した反応生成物を得た。 Sep-pak C18カートリッジを、 メタノー ル、 続いて純水で洗浄し、 乾固した反応生成物を純水に溶解して、 カートリッジ に通した。 純水でカートリッジを洗浄し、 次に、 ァセトニトリル一純水 （ァセト 二トリル：純水 = 6:4 (v/v))で溶出し、 目的のピレン標識糖を含む溶出液を得た。 溶出液を乾固し、 ピレン標識糖を得た。得られたピレン標識は、遮光して- 30°Cに 保存した。
(質量分析）
測定試料として、 得られたピレン標識糖を、 1 pmol/microL になるように純水 に溶解した。
別途、 もう 1つの測定試料として市販ァミノピリジン標識糖 （タカラバイオ） を ffl意した。 このアミノビリジン標識糖も、 同様に 1 pmol/microLになるように 純水に溶解した。
ピレン標識糖溶液 0.4 microL(ピレン標識糖 400 fmol)と、 アミノビリジン標識 糖溶液 0.4 microL (ァミノピリジン標識糖 400 fmol)とをそれぞれ MALDIタ一ゲッ トプレートに塗布した。 マトリクスとしては DH Aを用いた。 DHBAは、 12.5 mg/mLになるようにァ セトニトリルの 40v/v。/0純水溶液に溶解し、 その 0.5 microLをプレー卜上のそれ ぞれの標識糖溶液と混合し、 その後乾固した。 得られた MALDI ターゲットプレートを MALDI-QIT-TOF 質量分析装置、 AXIMA-QIT(Shimadzu/Kratos)に導入し、 ネガティブモ一ドで M S測定した。 このとき得られたマススペクトルを図 1に示す。 図 1 ( a ) は、 ピレン標識糖 の M Sスペクトル、 図 1 ( b ) は、 アミノビリジン標識糖の M Sスペクトルを示 す。 両スぺクトルとも、 横軸に （質量/電荷） （m/z)、 縦軸にイオンの相対強度を 表す （以下、本明細書で説明する全てのマススぺクトルにおいて同じ。） また図 1 においては、 ピレン標識糖の分子イオン [M-H]'のイオン強度を 100として、 全て のピークが表わされている。 これらのスぺクトルが示すように、図 1 ( a )では分子イオン m/z 1138 [Μ-Η]\ 図 1 ( b ) では分子イオン m/z 930 [Μ-ΗΓのみが強く検出され、 分解されたィォ ンはほとんど検出されなかった。 すなわち、 より詳細な構造情報を得るための Μ S / S測定に用いるためのプリカーサ一イオンが十分に発生したことが示され た。 また、 これらのスペクトルのうちピレン標識糖の図 1 ( a ) を例にとると、 測 定結果の S/N比から、 検出限界として 10fmol程度まで検出可能であることが想 定できる。 これに対して、 非標識糖鎖の従来の検出限界は 10 pmolであるから、 従来の 1/1000量でも検出が可能になったとし.、える。 このように、 従来のようにマトリクスに酸性物質を添加することを行うことな くネガ亍ィブ分子ィォン [M-H]-を検出することができ、 且つ非標識糖鎖の従来の 検出限界の 1/1000量でも検出が可能になったのは、 ピレン標識化によって、 高 効率なイオン化であり且つ安定なイオンを生ぜしめるイオン化が実現したためで あると, 11われる。
また、 市販の濃縮プレートを使用することによって、 さらに 10~20倍感度が 向上するので、 微量な生体試料の解析に十分応用できるといえる。
[実施例 2 ]
本実施例 2では、 monofucosyl lacto-N-hexaose の構造異性体 3種について、 質量分析を行った。 monofucosyl lacto-N-hexaose の構造異性体 MFLNH-I (式 (ii))、 MFLNH-IU (式 (iii)) 及び MFLNH-III (式 (iv)) をそれぞれ、 実施例 1と同様に、 ピレン標識、 及 び MALDI-QIT-TOF質量分析装置を用いたネガティブモードでの M S測定及び M S ZM S測定を行った。 Gal l— 4GlcNAcpl
6
Gal l— 4Glc
Fucal— 2Gal l— 3GlcNAc rノ
II
Gal l— 4ΘΙοΝΑοβ1^
ΘβΙβΙ— 3Θ1οΝΑοβ1'
4
Fucal
Fucal
Figure imgf000060_0001
(iv)
MS測定の結果、 いずれのスぺクトルにおいても、 唯一の親イオンとして m/z03 [M-H]—が強く検出され、一方、分解されたイオンはほとんど検出されなかつ た （データ示さず）。
MS測定で検出されたイオン m/z 1503をプリカーサ一イオンとして行った、 MS/MS測定によって得られたマススぺクトルを、 図 2に示す。 図 2 (a) はピ レン標識 MFLNH-I の MS/MSスぺクトル、 図 2 (b) はピレン標識 MFLNH-ll の MS/MSスペクトル、 図 2 (c) はピレン標識 MFLNH-IUの MS/MSスぺク トルを示す。 これらのスぺクトルが示すように、 MS/MSスぺクトルにおいてはそれぞれま つたく異なるピークパターンを示した。 図 2 (a) 〜 （c) で検出された主なィ オンの m/z値を、 表 1に示した。 表 1中、 +はそのイオンが 1 0%以上のイオン 強度で検出されたことを示し、 土はそのイオンが 1 0%未満のイオン強度で検出 されたことを示す。 表 1が示すように、 例えば m/z 1177のプロダクトイオンは ピレン標識 MFLNH-I のみから、 m/z 1138 のプロダク 卜イオンはピレン標識 MFLNH-IIIのみから検出されている。このように、他の異性体からは生成しない、 それぞれの異性体に対して特有のィォン種が観察された。 後述の比較例 1で述べるが、 本実施例のようにネガティブイオン測定ではなく ポジティブイオン測定を行うと、 フコースが遊離したプロダクトイオンが主とし て検出される。 仮に、 本実施例 2のネガティブイオン測定でこのようなフコース 遊離したプロダク卜イオン種が生成するとすれば、 そのイオン種は m/z 1357に 検出されるはずである。 しかしながら、 本実施例 2ではそのようなイオン種は全 く検出されなかった。
このように、 ネガティブイオンの測定を行うと、 それぞれの異性体に特有のィ オン種が観察されることから、 ネガティブイオンを測定すれば異性体構造が容易 に判別 '同定できることが判明した。 W
表 1
Figure imgf000062_0001
さらに、 一般的な構造同定に有用な情報も得られた。
例えば、 表 1が示すように、 ピレン標識 MFLNH-I 及ぴピレン標識 MFLNH-II からプロダクトイオン m/z 424が、 ピレン標識 MFLNH-IIIからプロダクトイオン m/z 570が生じた。 これらのプロダクトイオンは、 ガラクトースの 6位に側鎖が 結合した際に生じるものであることを確認した。 さらに、ピレン標識 MFLNH-I及びピレン標識 MFLNH-IIから生じたプロダクト イオン m/z 424と、 ピレン標識 MFLNH-IIIから生じたプロダクトイオン m/z 570 との差は、 フコース残基 1個に相当することがわかる。 すなわち、 m/z 424のプ ロダクトイオンはフコース残基を有さず、 m/z 570のプロダク卜イオンはフコー ス残基を一個有する。 従って、 m/z 424のプロダクトイオンを生じたプリカーサ 一イオンの 6側鎖にはフコース残基が結合しておらず、 m/z 570のプロダクトイ オンを生じたプリカーサーイオンの 6側鎖にはフコース残基が 1個結合していた ことがわかった。 ピレン標識 MFLNH-Iのみから生じた m/z 1177のプロダクトイオンは、 プリカ —サーイオンとの m/z差から、 Fuc-Galを失うことにより生成したイオンである ことがわかる。 すなわち、 このようなプロダクトイオンを生じたプリカーサーィ オンが、 Fuco -2Gal結合を有していることがわかる。 したがって、 ピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-IIとの判別も容易に行うことができる。 従って、 異性体から特異的に生じるプロダクトイオンの識別、 及びプリカーサ 一イオンとプロダクトイオンとの m/z差の算出を行うことによって、糖鎖構造の 同定を行うことが見出された。
[比較例 1 ]
本比較例 1では、ポジ亍ィブイオンで MS測定及び MS/MS測定を行った以外 は、 実施例 2と同様の操作を行った。
MS測定の結果、 いずれのスぺクトルにおいても、 親イオンとして m/z 1528 [M+Nafが検出された。
MS測定で検出されたイオン m/z 1528をプリカーサ一イオンとして行った、 MS/MS測定によって得られたマススペクトルを、 図 3に示す。 図 3 (a) はピ レン標識 MFLNH-I の MS /MSスペクトル、 図 3 (b) はピレン標識 MFLNH-II の MS/MSスペクトル、 図 3 (c) はピレン標識 MFLNH-IIIの MS/MSスぺク トルを示す。 図 3が示すように、得られた MS/MSスぺク卜ル 3種全てにおいて、 フコース が遊離した共通構造を有するプロダクトイオン種 m/z 1381が顕著に検出された。 これは、 ポジティブイオンではフコース結合が極めて不安定であることを表して いる。 また、 3種の異性体からそれぞれ生じたその他のプロダクトイオンについ ても、 相対強度が異なる以外はほとんど同じものが検出された。 このため、 3種 の異性体の識別は困難であることが判明した。
[実施例 3 ]
本実施例 3では、 monofucosyl lacto-N-hexaose の構造異性体 2種について、 さらに詳細な質量分析を行った。
MFLNH-II及び MFLNH-IIIを用い、 実施例 2と同じ方法で M S/M S測定までの 操作をそれぞれ行った。得られた MS/MSスぺク トルにおいて最も高いイオン強 度で且つ共通して得られたプロ クトイオン m/z 992をプリカーサ一イオンとし て、 MS 3測定をそれぞれ行った。 得られたマススぺクトルを、 図 4に示す。 図 4 (a) はピレン標識 MFLNH-II の MS 3スぺクトル、 図 4 (b) はピレン標識 MFLNH-IIIの MS3スペクトルを示す。 図 4 (a) が示すように、 ピレン標識 MFLNH-IIに由来するプロダクトイオン として m/z 388、 424、 447などが検出され、 一方図、 4 (b) が示すように、 ピ レン標識 MFLNH-IIIに由来するプロダクトイオンとして m/z 447、 627、 812など が検出.された。 これらスペクトルから一見して明らかなように、 顕著に現れるプ 口ダク！ ^イオンの組み合わせは両異性体間で異なり、 容易に識別可能である。 M S/MS測定で検出された m/z 992のイオンは、異性体に共通に検出されるが、質 量数が同じであることを除いては、 プリカーサ一イオンにおける異なる位置でフ ラグメンテ一シヨンが起こることにより生じた、 異なる構造を有するイオンであ ることが示された。 このことから、 ネガティブイオンは微細な構造の差異を反映 して生じることがより明確に示された。 [実施例 4 ]
実施例 4では、 下記のシアル酸含有糖鎖 (V)について質量分析を行った。
NANAa2-6Gaipi-4GlcNAcpi-2Manal
ゝ β
Man 1-4GlcNAc 1-4GlcNAc
NANAa2-6Gai i-4GlcNAc i-2Mana1/
( V )
糖鎖の標識は、上記実施例 1と同様の方法によって行い、ピレン標識糖を得た。 得られたピレン標識糖に対し、 次の中性化処理を行った。 すなわち、 ピレン標識 糖の 10 pmol/μΙ水溶液 1μΙを、 1Μの N H 4 C I水溶液 12.5μΙに添加し、 1Μの 4 一 （4， 6—ジメトキシー 1 , 3 , 5—トリアジン一2—ィル） 一 4ーメチルモ ルホリニゥムク口リド水溶液 7.5μΙを加え、 50°Cで 24時間反応を行った。 この中 性化処理により、 シアル酸の水酸基をアミド化して力ルバモイル基に変換した。 中性化処理された糖鎖に対し、 上記実施例 1と同様の操作を行うことによって、 M Sプレート上に質量分析用試料を調製し、 質量分析装置を用いネガティブモ一 ドで M S測定を行った。 [M-H]-イオンとして、 m/z 2505.9が検出された。さらに、 m/z 2505.9をプリカーサイオンとして選択し、 M S/M S測定を行うと、 図 5の ( a ) に示すように、 アミド化シアル酸を含む、 C系列イオン （m/z 672.1)、 B 系列イオン （m/z 816.4)、 A系列イオン （m/z 876.4) など、 構造同定に重要なィ オンが得られた。 このように、 シアル酸を含む糖鎖を中性化処理後ネガティブ M S/MS測定を行うことの有用性が示された。 [比較例 2]
比較例 2では、 シアル酸含有糖鎖 (V)について、 中性化処理を行わなかったこと を除いては実施例 4と同様の操作を行った。 MS測定の結果、 [Μ-ΗΓイオンとし て、 m/z 2507.9が検出された。 さらに、 m/z 2507.9をプリカーサイオンとして選 択し、 MS/MS測定を行うと、 図 5の （b) に示すように、 シアル酸が一分子遊 離したイオンが主に生成したのみで、 有用な構造情報を得るようなマススぺクト ルは観察されなかった。
[実施例 5]
本実施例 5では、 monofucosyl lacto-N-hexaose の構造異性体 2種 （MFLNH-I 及び MFLNH-III) のうち少なくとも一方を含む混合物の質量分析を行った。
MFLNH-Iは、 血液型 H抗原構造を有し、 癌細胞由来の前立腺癌抗原 PSAのフ コース結合を含む。 MFLNH-H1は、 ルイス X抗原構造を有し、 卵巣癌患者由来糖 タンパク質である八プ卜グロビンや CA125に発現しているフコース結合を含む。 MFLNH-Iと MFLNH- IIIとについて、それぞれ実施例 1に記載の方法によりヒ°レ ン標識を行い、 ピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-III とを得た。 測定サ ンプルは、 ピレン標識 MFLNH-I とピレン標識 MFLNH-III とを、 1 0 : 0、 8 ： 2、 6 : 4、 4 : 6、 2 : 8、 0 : 1 0のそれぞれの割合で含むように調製した 試料とした。 ここで、 ある特定疾患がルイス X糖鎖構造の発現を伴い、 病態の進行や悪性度 とその発現量が相関すると仮定する。 そして、 特定疾患に罹患していない被験者 由来試料 （ルイス X発現 20%)、 特定疾患を発症した被験者由来試料 （ルイス X 発現 40%)、 及び、 特定疾患に罹患し病態が進行している被験者由来試料 （ルイ ス X発現 80%)の 3種の試料を想定する。 このようにルイス X糖鎖構造に着目す ると、 たとえぼ、 上記調製したピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-III と の 8 ： 2、 6 ： 4及び 2 ： 8の混合試料は、 それぞれ、 これら想定したルイス X 抗原の発現状態の異なる被験者試料に相当する。 一方、 ある特定疾患が血液型 H抗原構造の発現を伴い、 病態の進行や悪性度と その発現量が相関すると仮定する。 そして、 特定疾患に罹患し病態が進行してい る被験者由来試料（血液型 H発現 80%)、特定疾患を発症した被験者由来試料（血 液型 H発現 60%)、 及び、 特定疾患に罹患していない被験者由来試料 （血液型 H 発現 20%)の 3種の試料を想定する。このように血液型 H抗原構造に着目すると、 たとえば、 上記調製したピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-III との 8 ： 2、 6 ： 4及び 2 ： 8の混合試料は、 それぞれ、 これら想定した血液型 H抗原の 発現状態の異なる被験者試料に相当する、 ともいえる。 この 6種の測定サンプルについて、 実施例 1と同じ方法により M S /M S測定 (プリカーサ一イオン： m/z 1503) を行った。 得られたマススペクトルを、 図 6及び図 7に示す。 図 6 ( a ) は、 ピレン標識 MFLNH-I のみを含む試料の M S /M Sスペクトル、 図 6 ( b ) は、 ピレン標識 MFLNH-I とピレン標識 MFLNH-III とを 8 ： 2の混合比で含む混合試料の M S/M Sスペクトル、 図 6 ( c ) は、 ピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-III と を 6 ： 4の混合比で含む混合試料の M S/M Sスぺクトル、 図 7 ( d ) は、 ピレン 標識 MFLNH-I とピレン標識 MFLNH-III とを 4 ： 6の混合比で含む混合試料の M S/M Sスぺクトル、図 7 ( e ) は、 ピレン標識 MFLNH-Iとピレン標識 MFLNH-III とを 2 ： 8の混合比で含む混合試料の M S/M Sスペクトル、 図 7 ( f ) は、 ピレ ン標識! IFLNH-IIIのみを含む試料の M S/M Sスぺク トルである。 図 6 ( a ) ~ ( c ) 及び図 7 ( d ) ~ ( f ) が示すように、 混合試料の混合比 が変わることによって、 特定のイオンについてイオン強度が変化している。 プロ ダクトイオン m/z 1177、 508、 424 (図中、 下向き矢印でマーク） などは、 ピレ ン標識 MFLNH-I の存在比が減少するに従ってイオン強度が小さくなつており、 ルイス X耱鎖構造に着目した場合は、 特定疾患の病態進行と逆相関すると判定で きる。 また、 プロダクトイオン m/z 1275、 1138、 764、 570 (図中、 上向き矢印 でマーク） などは、 ピレン標識 MFLNH-IIIの存在比が増加するに従ってイオン強 度が大きくなつておリ、 ルイス X糖鎖構造に着目した場合は、 特定疾患の病態進 行と相関すると判定できる。
—方、 この結果の確認のために、 前述の実施例 2で得られたマススペクトルの うち、 ピレン標識 MFLNH-I単独試料とピレン標識 MFLNH-III単独試料とのマス スぺクトル （図 2 ( a ) 及び （c〉） についてより精しく検証すると、 1 8種のィ オンの有無に違いが認められた。 すなわち、 ピレン標識 MFLNH-I にあってピレ ン標識 MFLNH-IIIに見いだされないイオンは、 m/z 1177、 1087、 932、 508、 424、 382であった。 一方、 ピレン標識 MFLNH-IIIにあってピレン標識 MFLNH-Iに見 いだされないイオンは、 m/z 1343、 1305、 1275、 1138、 1117、 794、 764、 672、 654、 600、 570、 364であった。
従って、 図 6及び 7においてピレン標識 MFLNH-IIIの存在比が増加するに従つ てィォン強度が上昇したイオンは、ピレン標識 MFLNH-IIIから生じたものであり、 ピレン標識 MFLNH-I の存在比が減少するに従ってイオン強度が減少したイオン は、 ピレン標識 MFLNH-Iから生じたものであることが確認できる。 また、このように、ィォン強度と混合物中の存在比との間で相関性を示すのは、 測定試料中の他の分子の存在が、 特定の構造異性体から特定のプロダクトイオン が特異的に生じる現象に影響を与えるものではないことを示す。 個々の構造異性 体について独立して特異的にイオン化が起こるということから、 たとえ測定試料 が構造異性体の混合物であっても、 特定の構造異性体から特異的に生じるプロダ クトイオンを検出すれば、 構造異性体の同定が可能である。.例えば生物学的に重 要な抗原構造を含むサンプル間において、 それぞれ異なったプロダクトイオンを 得ることが可能であることが見出される。 そして、 そのようなプロダクトイオン を得ることによって、 特定疾患のマ一カーとなる分子が試料に存在すると決定で さる。
さらに、 特異的に生じるプロダクトイオンとその強度とから、 構造異性体につ いて分離定量が可能である。 例えば、 上記生物学的に重要な抗原構造を含むサン プル間において、 それぞれ異なったプロダクトイオンを検出することは、 特定疾 患の病態進行や治療経過の指標となりうると同時に、 それらの構造情報を解析す ることによリマーカー分子の同定が可能となる。 さらに、 そのような特異的に生 じるイオン種とその強度とから、 構造異性体についての分離定量、 すなわち疾患 の発現の程度の判断が可能となる。 なお、 測定結果から各構造異性体の存在量を推定する具体的な方法としては、 Brown, C.W, et al.Anal.Chem., Vol. 54, No. 9, pp1472 (1982)や、 飯田康夫ら、 BUNSEKI KAGAKU、Voし 32, pp401 (1983)に記載の方法を準じて行うことが可能 である。 すなわち、 これら文献は吸光光度法に関する定量方法を記載したもので あるが、 これら文献の記載において、 波長を質量数に、 吸光度をイオン強度に置 き換えることによって、 当該方法はそのまま質量分析に適用することができる。 この方法を用いると、 N個の成分に対しても適応できる （すなわち、 2以上の構 造異性体を含む混合試料についても適応できる）。 以上のこ;！:から、 ルイス X抗原が発現する肺癌や卵巣癌患者から実際に採取し た試料と、 非癌患者から実際に採取した試料とについて、 それぞれ同様に標識及 びネガティブイオン測定を行っても、 図 6及び 7のように双方の質量分析結果に おいて異なるプロダクトイオンが検出され、 疾患マーカーの情報が得られること がわかる。
また、 特定疾患の罹患状態について不明な被験者について、 同様の標識及びネ ガティブイオン測定を行っても、 疾患マーカーの情報を元に、 上述の分離定量な どを行うことによって、 疾患の情報 （疾患の罹患又は非罹患、 疾患の進行程度、 或いは治療成果の程度などに関する情報） が得られることがわかる。 なお、 比較例 1ですでに示したように、 ピレン標識 MFLNH-I 及びピレン標識 FLNH-IIIのポジティブイオンの測定結果によると、 両者のスぺクトルで同じプ 口ダクトイオンが検出されている。 より詳しく検証すると、 検出された 2 0種の イオン全てが共通であった。 従って、 本実施例のような試料についてポジティブ イオンを測定しても、 イオン強度と混合物中の存在比との間で相関性を示すプロ ダクトイオンは生成しない。 従ってこの場合は、 マーカ一探索は困難である。 上記実施例においては、 本発明の具体的な形態について示したが、 本発明は、 これらに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。 その ため、 上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、 限定的に解釈してはなら ない。 さらに、 特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、 すべて本発明の範囲 内のものである。

Claims

1 .
糖鎖を含む試料を用意し、
前記糖鎖を、 標識化合物を用いて標識を行い、 標識糖鎖を得て、
前記標識糖鎖を、 M A L D I請質量分析装置を用いてネガティブイオンを測定す ることによって、 前記糖鎖の解析を行うことを含む、 糖鎖の質量分析方法。
の
範
2 .
囲
互いに構造異性体の関係にある糖鎖 （A、 B、 C、 …） を含む試料を用意し、 前記糖鎖（A、 B、 C、 -) を、標識化合物を用いて標識を行い、標識糖鎖（A '、 B '、 C '、 ■■■) を得て、
前記標識糖鎖 、 、 B '、 C '、 …） を、 M A L D I質量分析装置を用いて ネガティブイオンを測定することによって、 前記標識糖鎖 （A '、 B '、 C '、 …） からそれぞれ特異的に生じるイオン （a、 b、 c、 -) を検出することによ つて、 前記糖鎖 （A、 B、 C、 …） を互いに識別することを含む、 糖鎖の質量分 析方法。
3 .
前記イオン（a、 b、 c、…） についてそれぞれ構造解析を行うことによって、 前記糖鎖 （A、 B、 C、 …） の全体構造又は部分構造をそれぞれ同定する、 請求 の範囲第 2項に記載の質量分析方法。
4 .
複数種の糖鎖の構造異性体がそれぞれ既知混合比で含まれる試料を用意し、 前記複数種の糖鎖の構造異性体を、 標識化合物を用いて標識を行い、 複数種の 標識された構造異性体を得て、
前記複数種の標識された構造異性体を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガ ティブイオンを測定し、 前記複数種の標識された構造異性体それぞれから特異的 に生じるイオンを検出することによって、 前記複数種の糖鎖の構造異性体の解析 を行うことを含む、 糖鎖の質量分析方法。
5 .
前記検出された特異的に生じるイオンについて構造解析を行うことによって、 前記複数の糖鎖の構造異性体それぞれの全体構造又は部分構造を同定し、 及び/ 又は、
前記検出された特異的に生じるイオンを、 前記複数種の構造異性体の定量のた めのイオンとして決定し、 前記決定されたイオンのイオン強度と前記既知混合比 との関係を見出す、 請求の範囲第 4項に記載の'糖鎖の質量分析方法。
6 .
前記複数種の糖鎖の構造異性体が未知混合比で含まれる試料を用意し、 前-記複数の構造異性-体-を ^標識化合物を用いで標識を待-い-、 -複数種の標識され -- た構造異性体を得て、
前記複数種の標識された構造異性体を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガ ティブイオンを測定し、 前記複数種の標識された構造異性体それぞれから特異的 に生じるイオンを検出することによって、 前記複数種の糖鎖の構造異性体の解析 を行うことを含み、
前記検出された特異的に生じるイオンについて構造解析を行うことによって、 前記複数の糖鎖の構造異性体それぞれの全体構造又は部分構造を同定し、 及び/ 又は、
前記検出された特異的に生じるイオンのィォン強度から、 請求の範囲第 5項に 記載の方法によって見出された関係に基づいて、 前記未知混合比を算出する、 糖 鎖の質量分析方法。
( 1 ) 構造未知の 1種又は複数種の糖鎖を含む試料を用意し、
前記構造未知の糖鎖を、 標識化合物を用いて標識を行い、 構造未知の標識糖鎖 を得て、
前記構造未知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブィォ ンを測定し、
( 2 ) 別途、 構造既知の 1種又は複数種の糖鎖を含む試料を用意し、 前記構造既知の糖鎖を、 標識化合物を用いて標識を行い、 構造既知の標識糖鎖 を得て、
前記構造既知の標識糖鎖を、 M A L D I質量分析装置を用いてネガティブィォ ンを測定し、
( 3 ) 前記 （1 ) で得られた、前記構造未知の標識糖鎖のマススぺクトル及び/ 又は前記マススぺクトルから得られる情報と、 前記 （2 ) で得られた、 前記構造 既知の標識糖鎖のマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情 報との比較を行うことによって、 前記構造未知の糖鎖の解析を行うことを含む、 糖鎖の質量分析方法。
8 .
前記 （3 ) において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススペク トルのピーク全体 及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報の全体と、前記構造既知の標識糖 鎖のマススぺクトルのピーク全体及び/又は前記マススぺクトルから得られる情 報の全体とがー致することを確認することにより、 前記構造未知の糖鎖は、 前記 構造既知の糖鎖と同じ構造を有すると決定する、.請求の範囲第 7項に記載の糖鎖 の質量分析方法。
9 .
前記 ( 3 ) において、 前記構造未知の標識糖鎖のマススペクトルの特定のピー ク及び/又は前記マススぺクトルから得られる特定の情報と、前記構造既知の標識 糖鎖のマススぺクトルの特定のピーク及び/又は前記マススぺク トルから得られ る特定の情報とがー致することを確認することにより、 前記構造未知の糖鎖は、 前記構造既知の糖鎖と同じ構造を部分構造として有すると決定する、 請求の範囲 第 7項に記載の糖鎖の質量分析方法。
1 0 .
前記標識化合物が、 芳香族の基本骨格を有する化合物である、 請求の範囲第 1 項に記載の糖鎖の質量分析方法。
前記芳香族が、 ピレン、 ベンゼン、 及びピリジンからなる群から選ばれる、 請 求の範囲第 1 0項に記載の糖鎖の質量分析方法。
1 2 .
前記標識化合物が、 芳香族アミン及ぴ芳香族カルボン酸ヒドラジドからなる群 から選ばれる、 請求の範囲第 1項に記載の糖鎖の質量分析方法。
1 3 .
前記標識化合物が、 ピレンブタン酸ヒドラジド、 アミノビレン、 2—アミノビ リジン、 2—ァミノベンゼン、 ァミノ安息香酸、 及びァミノ安息香酸エステルか らなる群から選ばれる、 請求の範囲第 1項に記載の糖鎖の質量分析方法。
1 4 .
前記糖鎖が、フコース及び/又は酸性糖を中性化処理して生ぜしめた糖を有する 糖鎖である、 請求の範囲第 1項に記載の糖鎖の質量分析方法。 1 5 .
前記糖鎖が、 フコース及び/又は酸性糖を有する糖鎖であり、 前記標識糖鎖は、 前記標識処理と、 前記酸性糖の中性化処理とを行うことによって得る、 請求の範 囲第 1項に記載の糖鎖の質量分析方法。 1 6 .
前記酸性糖が、 シアル酸、 硫酸基含有糖、 及びリン酸基含有糖からなる群から 選ばれる、 請求の範囲第 1 4又は 1 5項に記載の糖鎖の質量分析方法。
1 7 .
糖鎖を、 標識化合物を用いて標識を行い、 標識糖鎖を得て、
前記標識糖鎖を、 M A L D ί質量分析装置を用いてネガティブイオンを測定す ることによって得られたマススぺク トル。
1 8 .
請求の範囲第 1 7項に記載のマススぺクトルから得られる糖鎖の情報であって、 糖鎖の特定の構造異性体から特異的に生じるイオン種の情報及び前記特定の構造 異性体の構造情報を含む情報。
1 9.
請求の範囲第 1 7項に記載のマススぺクトル及び/又は請求の範囲第.1 8項に 記載の情報を含むデータ集。
20.
(1 ) 特定の疾患の罹患者に由来する、 生体分子 Xを含む試料を用意し、 前記生体分子 Xを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 X 'を得 て、
前記標識された生体分子 X 'を M A L D〖質量分析装置によリネガティブイォ ン測定し、
(2) 別途、 前記特定の疾患の非罹患者に由来する、 生体分子 Yを含む試料を 用意し、
前記生体分子 Yを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 Y 'を得 て、
前記標識された生体分子 Y 'を MALD I質量分析装置によりネガティブイォ ン測定し、
(3) 前記 （1) で得られた前記標識された生体分子 X 'のマススペクトル及 び/又は前記マススぺクトルから得られる情報と、 前記 （2) で得られた前記標識 された生体分子 Y 'のマススぺクトル及び/叉は前記マススペクトルから得られ る情報とを比較し、互いに異なるマススぺクトルピーク及び/又は情報を見出すこ とによって、 前記特定の疾患の発現に関わる構造の存在を確認する、 疾患マーカ 一の検索法。
2 1 .
前記見出された異なるマススぺクトルピーク又は情報のうち、
質量/電荷において異なり、且つ、前記標識された生体分子 X 'のマススぺクト ル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報に含まれて、前記標識された生 体分子 Y 'のマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報に は含まれないもの、 又は、
同一の質量/電荷であってイオン強度において異なり、且つ、前記標識された生 体分子 X 'のマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情報に、 前記標識された生体分子 Y 'のマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルか ら得られる情報よりも強いィォン強度で検出されているものがら、 前記特定の疾 患の発現に関わる構造を解析し、
前記特定の疾患の発現に関わる構造又は前記生体分子 Xの構造を疾患マーカー の構造として決定する、 請求の範囲第 2 0項に記載の疾患マーカーの検索法。
2 2 .
前記生体分子が糖鎖である、 請求の範囲第 2 0項に記載の疾患マーカーの検索 法。 2 3 .
前記特定の疾患が癌であり、前記生体分子がフコース及び/又はシアル酸含有糖 鎖又は血液型抗原である、 請求の範囲第 2 0項に記載の疾患マ一カーの検索法。
2 4.
前記特定の疾患が自己免疫疾患に起因し且つ血液型と相関を示す疾患であり、 前記生体分子がフコース及び/又はシアル酸含有糖鎖又は血液型抗原である、請求 の範囲第 2 0項に記載の疾患マーカ一の検索法。
2 5 .
前記特定の疾患が心臓疾患又は高コレステロール血症であり、 前記生体分子が フコ一ス及び/又はシアル酸含有糖鎖又は血液型抗原である、請求の範囲第 2 0項 に記載の疾患マーカーの検索法。
2 6 .
前記標識化合物が、 ピレン誘導体、 ベンゼン誘導体、 及びピリジン誘導体から なる群から選ばれる、 請求の範囲第 2 0項に記載の疾患マーカーの検索法。
2 7 .
前記標識化合物が、 ピレンブタン酸ヒドラジド、 アミノビレン、 2—ァミノピ リジン、 2—ァミノベンゼン、 ァミノ安息香酸、 及びアミノ安息香酸エステルか らなる群から選ばれる、 請求の範囲第 2 0項に記載の疾患マーカーの検索法。
2 8 .
被験者に由来する、 生体分子 Zを含む試料を用意し、
前記生体分子 Zを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 Z 'を得 て、
前記標識された生体分子 Z 'を M A L D I質量分析装置によりネガティブィォ ン測定し、
疾患マーカーのマススぺクトル及び/又は前記マススぺクトルから得られる情 報を指標として、 得られた前記標識された生体分子 Z 'のマススペク トル及び/ 又は前記マススぺクトルから得られる情報から、 前記被験者における特定の疾患 の発現の有無又は前記発現の程度を判断する、 生体分子を含む試料の解析法。
29.
(1 ) 被験者に由来する、 生体分子 Zを含む試料を用意し、
前記生体分子 Zを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された生体分子 Z 'を得 て、
前記標識された生体分子 Z 'を MA L D I質量分析装置によリネガティブイォ ン測定し、
(2) 別途、 疾患マーカーを用意し、
前記疾患マーカーを、 標識化合物を用いて標識し、 標識された疾患マーカーを 得て、
前記標識された生体分子 Z 'を MALD I質量分析装置によりネガティブィォ ン測定し、
(3) 前記 （1 ) で得られた前記標識された生体分子 Z 'のマススペクトル及 び/又は前記マススペクトルから得られる情報と、 前記 （2) で得られた疾患マー 力一のマススぺクトル及び/又は前記マススぺク トルから得られる情報とを比較 し、前記被験者における特定の疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断する、 生体分子を含む試料の解析法。
30.
被験者に由来する、 生体分子を含む試料を用意し、 請求の範囲第 20~27項 のいずれか 1項に記載の方法によって見出された疾患マーカーを用いて、 前記被 験者における特定の疾患の発現の有無又は前記発現の程度を判断する、 生体分子 を含む試料の解析法。
3 1 .
請求の範囲第 2 0 ~ 2 7項のいずれか 1項に記載の方法によって見出された疾 患マーカーであって、フコース及び/又はシアル酸を含む糖鎖構造を有するマーカ
3 2 .
請求の範囲第 2 0〜 2 7項のいずれか 1項に記載の方法によって見出された疾 患マーカーであって、 血液型抗原糖鎖構造を有する疾患マーカー。
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