JP2004073012A

JP2004073012A - 癌の診断方法

Info

Publication number: JP2004073012A
Application number: JP2002234156A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Taniguchi; 谷口　直之; Hidetomo Miyoshi; 三善　英知; Katsuhisa Noda; 野田　勝久
Original assignee: JGS KK
Current assignee: JGS KK
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2004-03-11

Abstract

【課題】新規な腫瘍マーカーを用いた新たな癌の診断方法を提供すること。
【解決手段】生体から分離した試料中のＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量することを含む癌の診断方法を提供した。ＧＤＰ−Ｌ−フコースの定量は、公知の方法や、ＧＤＰ−Ｌ−フコシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドα１−６フコシルトランスフェラーゼの存在下で前記試料を標識オリゴサッカライドと反応させてＬ−フコシル基を該標識オリゴサッカライドに結合させ、次いで、生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分析することにより行うことができる。
【効果】癌の診断に有用な新規な腫瘍マーカーを利用した、新規な癌の診断方法が提供された。本発明の方法は、とりわけ、肝臓癌や膵臓癌の検出に有用であり、特に膵臓癌では血清を試料として利用できる利点がある。
【選択図】　図６

Description

【０００１】
【従来の技術】
癌は日本人の死因の第１位であり、死亡総数の約３０％を占める。死因２位の心疾患や３位の脳血管性疾患が横ばいまたは下降傾向であるのに対してこの数十年増加の傾向にある。
【０００２】
癌の診断のため、しばしば胃カメラ・内視鏡等を用いた検査やバイオプシー（組織生検）が行われるが、患者にとっては負担が大きい。一方腫瘍マーカー検査はほとんどが末梢血を検体として用いるので患者負担が少ない。
【０００３】
腫瘍マーカーは、癌細胞が産生する特異な成分で、その成分の検査が癌の診断・治療に役立つとされているものである。これまで報告されている腫瘍マーカーは、胎児性蛋白質（ＡＦＰ、ＣＥＡ等）、糖鎖抗原（ＣＡ１９−９、シリアルＴｎ等）、異所産生物質（ホルモンや癌性アイソザイム等）のように、その物質を検出することによって情報が得られるものと、癌遺伝子（ｒａｓ、ｅｒｂＢ等）、癌抑制遺伝子（ｐ５３等）、遺伝子再構成（ＢＣＲ−ＡＢＬ等）のように遺伝子の変異や組換えを検出することによって情報が得られるものとに分けられる。いずれも遺伝子産物である蛋白質に異常がおこり癌を引き起こすと考えられるが、それぞれどのような機序によるものかは必ずしも明確にはなっていない（臨床検査ガイド２００１−２００２、文光堂）。
【０００４】
一方、糖鎖と癌の関係は以前から示されている。例えば臨床で消化器癌のマーカーとして確立しているＣＡ１９−９は、もともと大腸癌培養細胞ＳＷ１１１６を免疫して作成したモノクロール抗体によって認識される物質として見出されたが、その正体は［Ｇａｌ１−３ＧｌｃＮＡｃ］の繰り返し構造（Ｉ型糖鎖）を基本骨格とするルイスＡ（Ｌｅ^ａ）にシアル酸が結合したもの（シアリルルイスａ；ｓＬｅ^ａ）である。
【０００５】
シアリルルイスａは、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃのＧａｌにまずシアル酸がα２−３結合で転移され、この反応で作成されたＳＡα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（ｓＬｅ^ｃ）に、ＧＤＰ−Ｌ−フコースをα１−４結合で転移してｓＬｅ^ａ（ＣＡ１９−９）エピトープＳＡα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃが合成される。このエピトープがどのような生理的機能を持ち、どのように癌に関わっているのかは長い間不明であったが、血管内皮細胞に発現される接着因子Ｅ−セレクチンのリガンドであることが見出され、癌との因果関係が示唆されている。
【０００６】
上記ｓＬｅ^ａ（ＣＡ１９−９）の合成の最終段階でフコースを付加する反応はフコース転移酵素によって行われる。フコース転移酵素にはＦＵＴ１からＦＵＴ９まで９種類あり、上記反応はそのうちの１種であるＦＵＴ３によるものである。９種類のフコース転移酵素の受容基質はそれぞれ異なるが、供与基質はすべてＧＤＰ−フコースである（成松　蛋白質核酸酵素　Ｖｏｌ４３、Ｎｏ１６、２３９４−２４０３、１９９８）。
【０００７】
ｓＬｅ^ａ（ＣＡ１９−９）が腫瘍マーカーであることが示されて以来、研究者らは新たな腫瘍マーカーや癌治療薬の可能性を求めてそのカスケード周辺の探索を行ってきた。特にカスケードの中間生成物やフコース転移酵素の活性を中心とした研究が進められてきたが、これまでに、ｓＬｅ^ａ（ＣＡ１９−９）の前駆体であるｓＬｅ^ｃ（ＤＵ−ＰＡＮ−２）がやはり膵癌を中心とした消化器癌で上昇することが見られたのみであった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規な腫瘍マーカーを用いた新たな癌の診断方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＧＤＰ−Ｌ−フコースが腫瘍マーカーとして有用であり、これを利用して癌に罹患している可能性を判定することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、生体から分離した試料中のＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量することを含む癌の診断方法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
下記実施例において具体的に記載されるように、本願発明者らは、癌細胞や癌患者血清中において、ＧＤＰ−Ｌ−フコース（グアノシンジホスホ−Ｌ−フコピラノシド）の濃度が正常細胞中や健常人血清中の濃度よりも有意に高まることを見出した。従って、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを腫瘍マーカーとして利用することができ、その濃度を測定することにより癌の診断を行うことができる。
【００１２】
本発明の方法により診断できる癌の種類は、特に限定されるものではなく、好ましい例として肝臓癌及び膵臓癌を挙げることができる。
【００１３】
本発明の方法に供される、生体から分離された試料は、特に限定されないが、各種組織や血清又は血漿のような血液試料を好ましく用いることができる。固形癌の診断には、癌を診断する対象組織から採取した生検試料を用いることができる。例えば、肝臓癌の診断のためには、肝臓の生検試料を好ましく用いることができる。また、膵臓癌の診断のためには、血清や血漿を好ましく用いることができる。
【００１４】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの定量方法自体は、種々の方法が公知であり（例えばＪａｒｋｋｏ　Ｒａｂｉｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８６，　１７３−１７８（２０００）；及びＮｏｂｏｒｕ　Ｔｏｍｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９３，　１２９−１３７（２００１）、これらの公知の方法を用いてＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量することができる。これらの公知の方法に加え、本願発明者らが独自に開発した、簡便、正確なＧＤＰ−Ｌ−フコースの定量方法を用いることもできる。以下、この方法について説明する。
【００１５】
この新規な定量方法は、ＧＤＰ−Ｌ−フコシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドα１−６フコシルトランスフェラーゼ（以下、「α１−６フコ−ス転移酵素」又は「α１−６ＦｕｃＴ」と言うことがある）の存在下で前記試料を標識オリゴサッカライドと反応させてＬ−フコシル基を該標識オリゴサッカライドに結合させ、次いで、生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析することによりＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量するものである。反応式の一例を図１に示す。図１に示されるように、この方法では、α１−６ＦｕｃＴの作用により、ＧＤＰ−Ｌ−フコース中のフコシル基を、標識オリゴサッカライドに転移させる。フコシル基が結合した標識オリゴサッカライド（フコシル化標識オリゴサッカライド）は、フコシル基が結合していない標識オリゴサッカライドとは分子量が異なるので、高速液体クロマトグラフィーにより分離可能であり、また、高速液体クロマトグラフィーにより検出される分子は、標識されているので、容易に正確に検出することができる。検出されたピークの面積から、定量すべきフコシル化標識オリゴサッカライドの量を測定することができる。試料中に含まれるＧＤＰ−Ｌ−フコースの量に依存して、生成されるフコシル化標識オリゴサッカライドの量が変化するので、上記方法により試料中のＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量することができる。
【００１６】
この新規な定量方法に供される試料としては、特に限定されないが、細胞のミクロソーム画分及び血清又は血漿が好ましい。細胞のミクロソーム画分は、周知の常法により調製することができる。
【００１７】
この定量方法に用いられるα１−６ＦｕｃＴは、Ｎ−グリカンに、α１−６結合を介してフコースを転移する公知の酵素であり、周知の方法により調製することができるし（例えばＹａｎａｇｉｄａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１２１，　６２６−６３３（１９９７））、市販もされているので、市販品を好ましく用いることもできる。
【００１８】
オリゴサッカライドとしては、α１−６ＦｕｃＴの作用によりフコシル基を結合されるものであればいずれのＮ−グリカンであってもよい。オリゴサッカライドとしては、α１−６ＦｕｃＴのＰｒｏｄｕｃｔのピークを一定にするため、均一のものが望ましい。なお、α１−６ＦｕｃＴの種々のオリゴサッカライドに対する基質特異性は、１９９１年Ｖｏｙｎｏｗによって検討されており（ＪＢＣ　２６６，　２１５７２−２１５７７）、それによると、末端のシアル酸やガラクトースが存在するとα１−６ＦｕｃＴの基質とならず、Ｏ型糖鎖やハイマンノース型糖鎖にも反応しないので、これらの反応しないサッカライドは用いない。図１には好ましい一具体例が示されているが、これに限定されるものではない。オリゴサッカライドのサイズは、特に限定されないが、あまりに大きいと、フコシル基が転移したものと、未結合のもののピークが分離しにくくなるので、オリゴサッカライドのサイズは、糖単位の数として３〜１０程度が適当である。このようなオリゴサッカライドは、一般には天然物から分離して調整する。この場合には、構造が不定で、サイズの異なる分子種の混合物になる場合が多いが、ゲル濾過等で同一サイズのオリゴサッカライドを精製し、検量線の作成又は対照実験と定量試験とにおいて同じオリゴサッカライドを用いれば、問題なく本発明の診断方法に用いることができる。本発明では一例としてウシγグロブリン（糖鎖を有する）を蛋白分解酵素（プロナーゼ）およびアミノペプチド分解酵素（アミノペプチダーゼ）で分解した、サッカライドサイズやアミノ酸残基の異なるオリゴサッカライドをひとまとめに標識し、その後ゲル濾過によって精製する方法をとっている。この方法によるとγグロブリンを修飾しているオリゴサッカライドを利用して、基質を大量に調整することが可能である。
【００１９】
オリゴサッカライドに結合される標識は、続く高速液体クロマトグラフィーにおいて検出できる標識であれば何ら限定されるものではなく、好ましい例として蛍光標識を挙げることができる。下記実施例では、好ましい蛍光物質である４−（２−ピリジルアミノ）ブチルアミン（ＰＡＢＡ）（図１参照）を用いているがこれに限定されるものではない。このような標識物質をオリゴサッカライドに結合させるのは、周知の方法に基づき容易に行うことができる。例えば、通常γグロブリンをプロナーゼ処理したオリゴサッカライドにはアスパラギン（Ａｓｎ）が結合しているが、このアスパラギンのアミノ基を介して標識物質を結合することができる。なお、下記実施例に、Ａｓｎが結合したオリゴサッカライドを調整し、これにＰＡＢＡを結合する方法が具体的に記載されている。
【００２０】
この定量方法において、細胞のミクロソーム画分を試料として用いる場合、用いる標識オリゴサッカライドの量は、特に限定されないが、測定時の蛋白量１５０μｇ以下の条件で、ミクロソーム画分中のタンパク量１μｇ当たり、０．２５ｐｍｏｌ〜０．５０ｐｍｏｌ程度が適当であり、血清や血漿を試料として用いる場合、測定時の使用試料量１５μｌ以下の条件で、試料１μｌ当たり０．４ｐｍｏｌ〜０．８ｐｍｏｌ程度が適当である。また、用いるα１−６ＦｕｃＴの量は、ミクロソーム画分中のタンパク量１μｇ当たり３５〜４５単位程度が適当であり、血清や血漿を試料として用いる場合、試料１μｌ当たり４０〜８０単位程度が適当である。反応温度は、特に限定されないが、酵素の至適温度である３７℃近傍（好ましくは３７℃±３℃）で行うことが好ましく、また、反応時間は、特に限定されないが、１時間〜３時間程度、特に約２時間程度が適当である。
【００２１】
反応後、反応生成物をＨＰＬＣにかけ、溶出物の蛍光を測定する。これらは市販の装置を用いる常法により行うことができ、具体的な条件の一例は下記実施例に具体的に記載されている。
【００２２】
下記実施例に具体的に記載するように、癌細胞や癌患者血清中において、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの濃度が正常細胞中や健常人血清中の濃度よりも有意に高くなっている。特に、肝臓癌では、肝臓細胞中のＧＤＰ−Ｌ−フコースの含量が周辺正常組織よりも有意に高く、また、膵臓癌患者では、血清中のＧＤＰ−Ｌ−フコースの含量が健常人よりも有意に高い。従って、試料中のＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量することにより、癌に罹患している可能性の高低を判定すること、すなわち癌の診断を行うことができる。ＧＤＰ−Ｌ−フコースが有力な腫瘍マーカーであることは本発明により見出されたが、他の腫瘍マーカーと組み合わせて利用することにより、診断の感度をより高めることができ、好ましい。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
１　　ＧＤＰ−Ｌ−フコースの安定性試験
ラット肝臓サンプルを用いて室温におけるＧＤＰ−フコースの安定性を調べた。摘出したラット肝臓を室温（２５℃）ないし３７℃で３０分置いた場合、ＧＤＰ−フコースは検出感度以下となった。この結果から、サンプル採取後の迅速な測定が必要であることが示された。
【００２５】
２　　供与基質の調製
供与基質であるＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）　Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＡ　（以下ＧｎＧｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＰＡＢＡ）は以下のステップの合成によって作成した（Ｕｏｚｕｍｉら、Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１２０，　３８５−３９２，　１９９６）。その手順を以下に簡単に述べる。
【００２６】
ステップ１：蛍光物質であるＰＡＢＡ（４−（２−ピリジルアミノ）ブチルアミン）を合成した。即ち、Ｎ−エチルカルボニルファサルイミド（Ｎ−Ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎｙｌｐｈａｔｈａｌｉｍｉｄｏ）（ナカライテスク社製）８．０４ｇを４０ｍｌのＴＨＦ　（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）　に溶解し、そこに４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタル（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌａｌｄｅｈｙｄｅｄｉｅｔｈｙｌａｃｅｔａｌ）（和光純薬）５．６３ｇとトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）　３．８９ｇを加え、２時間反応させた。反応終了後、蒸発させ、エチルアセテート抽出及び水での洗浄後エチルアセテート相を乾燥させて、中間物質Ｉを９．４１ｇ得た。上記中間物質Ｉ（９．４１ｇ）をアセトン９３ｍｌに溶解し、１Ｍ塩酸６３ｍｌを加え１５分還流しながら混和した。溶媒を蒸発後エーテルで抽出、水での洗浄の後、エーテル相を乾燥してこの反応によって生成された中間物質ＩＩ７．５ｇを得た。中間物質ＩＩ（７．５ｇ）をメタノール３０８ｇに溶解し、２−アミノピリジン（２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（和光純薬）３．７０６ｇと酢酸１３．８６ｍｌを加え混和した。４時間の反応の後ボランジメチルアミン（ｂｏｒａｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）コンプレックスと酢酸１２．２ｍｌを加え、中間物質ＩＩＩをトルエンとアセトンの混合液（１：１）で抽出し、５．３１ｇを得た。
上記中間物質ＩＩＩを１０４ｍｌのエタノールに溶解し、ヒドラジンヒドレート（ｈｙｄｒａｚｉｎｅｈｙｄｒａｔｅ）２．５２ｇを加え、２時間還流しながらインキュベーションを行った。溶媒を蒸発させ、生成されたＰＡＢＡをエチルアセテートで抽出し、濾過後抽出相を蒸発させた。ＰＡＢＡ２．２８ｇを得た。
【００２７】
ステップ２：オリゴサッカライド−Ａｓｎ−　Ａｌｏｃの作成
ウシγ−グロブリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）をプロナーゼ（生化学工業社製）で常法により消化し、オリゴサッカライド−Ａｓｎ−ＯＨを得た（オリゴサッカライドの構造は不定）。これをジエチルエーテル１ｍｌ、トリエチルアミン６．０８μｌ、水１ｍｌに溶解し、アリルクロロフォルメイト（ａｌｌｙｌｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍａｔｅ；Ａｌｏｃ）３．６３μｌを加え６時間混和した後乾燥させた。乾燥生成物を水で溶解し、ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ａｍｉｄｅ−８０　カラム（２１．５ｍｍｘ３０ｍｍ）（トーソー社製）に通し、８０％アセトニトリルでカラム洗浄した後０．１％ＴＦＡでリニアグラジエントによる抽出を行った。オリゴサッカライド−Ａｓｎ−Ａｌｏｃを含むフラクションを集めたところ、オリゴサッカライド−Ａｓｎ−Ａｌｏｃを４．２ｍｇ得た。
【００２８】
ステップ３：オリゴサッカライド−Ａｓｎ−ＰＡＢＡの生成
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）０．４７ｍｇ、ＤＭＦ１ｍｌ、上記オリゴサッカライド−Ａｓｎ−Ａｌｏｃ４．２ｍｇ、１−ハイドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ；　ＨＯＢｔ）１．０１ｍｇ、上記で作成したＰＡＢＡ３．７５μｍｏｌを混和した。６時間室温で反応させた後ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ａｍｉｄｅ−８０　カラムに通し、８０％アセトニトリルでカラム洗浄した後０．１％ＴＦＡでリニアグラジエントによる抽出を行った。中間体であるオリゴサッカライド−（Ａｌｏｃ）−Ａｓｎ−ＰＡＢＡを含むフラクションを集めて乾燥させ、ＤＭＦ１ｍｌとジエチルアミン１００μｌに溶解させ、還元触媒Ｐｄ［Ｐ　Ｐｈ］_４を２０ｍｇ加えてＡｌｏｃの残渣を取り除いた。生成物の溶媒を蒸発させ、水で溶解して再度ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ａｍｉｄｅ−８０　カラム（商品名）に通し、８０％アセトニトリルでカラム洗浄した後０．１％ＴＦＡでリニアグラジエントによる抽出を行って、オリゴサッカライド−Ａｓｎ−ＰＡＢＡ１．９５ｍｇを得た。
【００２９】
ステップ４：ＧｎＧｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＰＡＢＡの生成
上記オリゴサッカライド−Ａｓｎ−ＰＡＢＡをＴＳＫ　ｇｅｌ　ＯＤＳ−　８０ＴＭ　カラム（４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ）（トーソー社製）に通し、０．１％ブタノールを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．０で抽出してＧｎＧｎＦ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＰＡＢＡ　（ＧｌｃＮＡｃβ１−　２Ｍａｎα１−　６（ＧｌｃＮＡｃβ１−　２Ｍａｎα１−３）　Ｍａｎβ１−　４ＧｌｃＮＡｃβ１−　４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ　−　Ａｓｎ　　ＰＡＢＡ）を得た。これをウシ腎臓フコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）で７日間消化して、ＴＳＫ　ｇｅｌ　ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ）によるＨＰＬＣを行い、最終目的物であるＧｎＧｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＰＡＢＡを、　０．１％ブタノールを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．０で抽出した。
【００３０】
３　　サンプルの調製
測定対象組織を約１００ｍｇを乳鉢で液体窒素を用いて粉状になるまで粉砕し、０．２５Ｍスークロースバッファーを８倍容量入れて、氷上でＤｏｕｃｅのホモジナイザーで３０回ホモジナイズした。このホモジナイズしたサンプルを４℃で１０分間６００ｘｇで遠心して固形物を取り除いた後、上澄を４℃で１０分間、１０００ｘｇで遠心し、沈殿したミトコンドリア部分を取り除いた。最後に上澄を４℃で１０５０００ｘｇ、１時間超遠心し（Ｏｐｔｉｍａ　ＴＬ　Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ及びＴＬＡ−４５ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社）ミクロソームフラクションを得た。このフラクションをＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）で蛋白量を定量した。また、血液については、末梢血を採取後、４℃で１５００回転１５分遠心し、血清を分離し、サンプルとした。
【００３１】
４　ＧＤＰ−Ｌ−フコースの定量法の検証
（１）　測定方法
組織サンプルについてはミクロソームフラクションを蛋白量として約８０μｇとり、冷やしたＭＥＳ−ＮａＯＨ（ＭＥＳ；　２−（Ｎ−Ｍｏｒｈｏｌｉｎｏ）　ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）ｐＨ７．０で２５μｌとした。また血清の場合は血清１５μｌに冷やしたＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を６．５μｌと水７μｌで２５μｌとした。これらの組織又は血清サンプルを１００℃で２０秒ボイルして、サンプル中のα１−６フコース転移酵素、及びＧＤＰ−Ｌ−フコースを使用するかまたは分解する恐れのあるフコースの受容体または酵素を不活性化した。サンプルをただちに氷につけ、２分間おいた後に４℃で１２０００ｘｇ、１０分間遠心した。この上清に１０％トライトンＸ−１００を１μｌ、７３．５μＭ／μｌの受容体（ＧｎＧｎ−ｂｉ−Ａｓｎ−ＰＡＢＡ）を０．５μｌ、α１−６フコース転移酵素（２５０μＵ／μｌ）（東洋紡社）を５μｌ加え、冷水を加えて３５μｌとして（受容体とα１−６フコ−ス転移酵素の最終濃度はそれぞれ１０５０ｎＭと３５．７μＵ／μｌとなる）、３７℃で２時間インキュベートした。時間終了後反応液を１００℃で１分間加熱して反応を終了させ、１２０００ｘｇ１０分間遠心して上清を得た。そのうちの１０μｌを、ＴＳＫ　ｇｅｌ　ＯＤＳ−　８０ＴＭ　カラム（４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ）（トーソー社製）によるＨＰＬＣで、０．１％ブタノールを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．０で５５℃で溶出した。溶出液中にＰＡＢＡによる蛍光が現れる領域を蛍光光度計（モデルＲＦ−１０ＡＸＬ、島津社）を用いて励起光３２０ｎｍ、発光４００ｎｍで測定し、溶出パターンを得た。蛍光強度を標準曲線によりＧＤＰ−Ｌ−フコースの濃度に換算した。
【００３２】
（２）　ＨＰＬＣ溶出パターンの確認
ラットの肝臓組織を用いて、上記方法でＧＤＰ−Ｌ−フコースを測定した。負の対照として、反応液中にα１−６フコース転移酵素を入れないものも測定したところ、転移酵素が入ったものは約１１分と約２３分の二つの部分にピークが、転移酵素なしでは約１１分にのみピークが見られ、約２３分のピークが、受容体にフコースが転移したものであることが推定された（図２）。またこの結果はこれまでの報告とも一致するものであった（Ｕｏｚｕｍｉら、Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１２０，　３８５−３９２，　１９９６）。
【００３３】
（３）　標準曲線の作成
０から２０００μＭの範囲で、様々な濃度のＧＤＰ−Ｌ−フコース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を上記方法によって測定し、生成物であるフコシルＰＡＢＡの標準曲線を作成した。測定可能な最小濃度は２０ｎＭで、濃度２０ｎＭから１０００ｎＭまではＧＤＰ−Ｌ−フコースの濃度に比例してフコシルＰＡＢＡが増加することが示された（図３）。
【００３４】
（４）　α１−６フコース転移酵素の濃度の検証
本測定方法においては、α１−６フコース転移酵素が過剰に反応液に含まれていることが前提である。そこで培養細胞Ｈｕｈ７（ヒト肝癌由来、ＡＴＣＣより購入）を用いて、反応液中のα１−６フコース転移酵素を０、３１３、６２５、１２５０μＵ（反応液中の濃度は０、８．９、１６．０、３５．７、７１．４μＵ／μｌ）としてそれぞれ生成物の量を測定した。その結果３５．７μＵ／μｌ以上でフコシルＰＡＢＡの生成が飽和していることが示され、上記測定方法で用いた濃度は十分に過剰量であることが確認された（図４）。なお培養細胞は氷冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４）で二回洗浄した後、組織に準じてサンプル調整を行った。
【００３５】
（５）　反応時間の検証
上記測定法の至適反応時間を調べるために、Ｈｕｈ７培養細胞を用いて上記測定法において反応時間を０、３０分、１時間、２時間、３．５時間、４．５時間としたときのフコシルＰＡＢＡの生成を調べたところ、反応時間１時間以上でほぼ横ばいとなった。従って上記測定法での反応時間２時間は適当であることが判明した。（図５）
【００３６】
実施例２　　肝臓組織中のＧＤＰ−Ｌ−フコースの測定
上記検証により、前述のＧＤＰ−Ｌ−フコースの測定法が定量法として利用できることが判明した。そこで当該方法を用いて健常（非癌）人の肝組織、肝細胞癌及び周辺正常組織のＧＰＤ−Ｌ−フコース値を測定し、比較した。１ｍｇのミクロソームたんぱく質量あたりのＧＤＰ−Ｌ−フコース量は、健常人組織と周辺正常組織ではすべて２００μＭ以下であった（中心値１６３μＭ）のに対し、肝細胞癌組織では７症例中４例で高値であることが示された（中心値２０９μＭ）（図６）。
【００３７】
実施例３　　血清サンプルでのＧＤＰ−Ｌ−フコースの測定
血清サンプルを用いてＧＤＰ−Ｌ−フコース量を測定した（ただし蛋白質量あたりの量とはしていない）。正常人７サンプルではすべて低値であったが、膵癌患者の５症例のサンプルのうち３サンプルで顕著に上昇が見られた（図７）。一方、症例が限られているため詳細は不明であるが肝癌と胃癌患者血清ではＧＤＰ−Ｌ−フコースは検出されず、特定種類の癌で上昇することが示唆された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、癌の診断に有用な新規な腫瘍マーカーを利用した、新規な癌の診断方法が提供された。本発明の方法は、とりわけ、肝臓癌や膵臓癌の検出に有用であり、特に膵臓癌では血清を試料として利用できる利点がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例において採用した、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの定量方法における反応式を示す図である。
【図２】実施例において得られた、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す図である。
【図３】実施例において作成された、ＧＤＰ−Ｌ−フコースと蛍光強度との関係を示す検量線を示す図である。
【図４】実施例において測定された、α１−６ＦｕｃＴの添加量と蛍光強度との関係を示す図である。
【図５】実施例において測定された、反応時間と蛍光強度との関係を示す図である。
【図６】実施例において測定された、肝臓癌患者の肝臓組織及び周辺正常組織並びに健常者の肝臓組織のミクロソーム画分中のＧＤＰ−Ｌ−フコース濃度を示す図である。
【図７】実施例において測定された、膵臓癌患者と健常人の血清中のＧＤＰ−Ｌ−フコース濃度を示す図である。

Claims

生体から分離した試料中のＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量することを含む癌の診断方法。
前記試料が肝臓組織であり、前記癌が肝臓癌である請求項１記載の方法。
前記試料が血清又は血漿であり、前記癌が膵臓癌である請求項１記載の方法。
前記定量は、ＧＤＰ−Ｌ−フコシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドα１−６フコシルトランスフェラーゼの存在下で前記試料を標識オリゴサッカライドと反応させてＬ−フコシル基を該標識オリゴサッカライドに結合させ、次いで、生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分析することにより行う請求項１又は２記載の方法。
組織を構成する細胞のミクロソーム画分中のＧＤＰ−Ｌ−フコースを定量する請求項４記載の方法。
前記定量は、ＧＤＰ−Ｌ−フコシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドα１−６フコシルトランスフェラーゼの存在下で前記試料を標識オリゴサッカライドと反応させてＬ−フコシル基を該標識オリゴサッカライドに結合させ、次いで、生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分析することにより行う請求項３記載の方法。