JP2009190993A - シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法、及び、前記方法により得られた蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質 - Google Patents

Abstract

【課題】各種クロマトグラフィーや質量分析等、様々な分析手段によるシアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の高感度分析を可能とする、効率的なシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法、及び、前記方法により得られる蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質を提供すること。
【解決手段】シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に、下記一般式（１）で表される化合物を結合させることを特徴とするシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法、及び、前記方法により得られた蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質である。
【化４】

ただし、前記一般式（１）中、ｎは２〜４の整数を示す。
【選択図】なし

Description

本発明は、シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法、及び、前記方法により得られた蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質に関する。

近年、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質研究の分野においても、分析技術の向上によりこれまで知られていなかった新規の微量成分が検出されるようになってきた。このような成分の生理機能を解析していくために、分析、分離精製、構造解析等を行うためには、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質を、非破壊的に高感度化できる修飾技術が必須である。中でも、実験室で行う高感度化技術としては、蛍光標識化法が適している。

代表的な糖鎖の蛍光標識化技術としては、糖鎖の還元末端に２−アミノピリジンを導入する、ピリジルアミノ化（ＰＡ化）が１９７０年代の終わりに開発された（非特許文献１参照）。ＰＡ化糖鎖は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離され、質量分析（ＬＣ−ＭＳ）や二種類のカラム（Ｃ１８及びアミドシリカ）での分離パターンを基に作成された糖鎖マッピングにより構造解析が簡易化され、現在も糖鎖の解析には欠かせない技術の一つとして広く採用されている。
しかし、ＰＡ化法では糖鎖の還元末端を修飾するために、複合糖質全体としての分析は行えない。またＬＣ−ＭＳでは調べる事のできる分子量の上限が２０００程度である、といった問題点もあった。

一方、高分子成分の分析のためにＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳが利用されるようになってきた。しかし、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の場合、糖鎖に含まれるシアル酸のカルボキシル基が負のチャージを持つために、飛行しにくい、飛行中に分解するといった分析上の問題点があった。

なお、近年、新たな脱水縮合剤として、ＤＭＴ−ＭＭが開発された（非特許文献２参照）。ＤＭＴ−ＭＭを用いたカルボキシアミド合成反応は、カルボキシル基、アミン、縮合剤の混合モル比が１：１．１：１．１で、室温でワンステップで進行し、反応後の精製操作も容易であることが報告されている。シアル酸含有糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析のため、ＰＡ化糖鎖のシアル酸カルボキシル基を、このＤＭＴ−ＭＭを用い、塩化アンモニウムでアミド化する方法も試みられている（非特許文献３参照）が、この方法はＰＡ化とアミド化の二段階の反応を必須とするため効率的でなく、また、この反応系を構成する成分のモル比は、ＰＡ化糖鎖：炭酸水素アンモニウム：塩化アンモニウム：ＤＭＴ−ＭＭ（１：１０^３：１０^６：６ｘ１０^５）であり、反応条件として良好なものではなかった。

Ｈａｓｅ，Ｓ．，Ｉｋｅｎａｋａ，Ｔ．，Ｍａｔｕｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７８）８５，２５７−２６３ Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９９，４０，５３２７−５３３０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２００１，５７，１５５１−１５５８ Ｔａｎａｋａら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，７７，４９６２−４９６８

本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、各種クロマトグラフィーや質量分析等、様々な分析手段によるシアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の高感度分析を可能とする、効率的なシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法、及び、前記方法により得られる蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質におけるシアル酸のカルボキシル基に、２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミン等の蛍光物質を導入することにより、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質を非破壊的に蛍光標識化することができ、これにより、各種クロマトグラフィーや質量分析等、様々な分析手段によるシアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の高感度分析が可能となるという知見である。

前記したように、従来の蛍光標識化技術（ピリジルアミノ化（ＰＡ化））では、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の還元末端を標識化するため、例えば、ガングリオシド等のシアル酸含有複合糖質を標識化する場合には、糖鎖のみを切り出して用いる必要があり、そのため、シアル酸含有複合糖質全体を分析することは不可能であった。また、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質は、シアル酸が有するカルボキシル基が負のチャージを持つために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析において飛行しにくい、飛行中に分解するといった問題から、質量分析への応用が困難であるとされていた。
一方、本発明では、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質における、シアル酸のカルボキシル基を標識化することから、例えば、ガングリオシド等のシアル酸含有複合糖質を標識化する場合であっても、その構造を破壊する必要がなく、そのため、シアル酸含有複合糖質全体としての分析を可能とすることができる。また、本発明では、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質における、シアル酸のカルボキシル基を標識化するために、カルボキシル基の負のチャージを失くすことができ、そのため、前記したような、高分子量成分の分析に有利なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおいて、飛行しにくい、飛行中に分解するといった問題点を克服し、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の質量分析への応用を可能とすることができる。
また、本発明では、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質に導入する蛍光物質として、小さな蛍光発色団を有し、かつ、導入に関与する側鎖として炭素数２〜４のアルキルアミンを有する蛍光物質（２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミン等）を使用するため、導入に際して蛍光発色団がシアル酸と隣接する糖との結合で生じる立体障害に影響を受ける懸念がなく、安定に導入を行うことができ、そのため、シアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の蛍光標識化を効率的に行うことが可能となる。

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に、下記一般式（１）で表される化合物を結合させることを特徴とするシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
ただし、前記一般式（１）中、ｎは２〜４の整数を示す。
＜２＞ シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかと、一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかと、脱水縮合剤とを、溶媒中で混合する工程を含む前記＜１＞に記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜３＞ シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかが、シアル酸含有オリゴ糖である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜４＞ シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかが、ガングリオシドである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜５＞ 一般式（１）で表される化合物が、２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミンである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜６＞ 脱水縮合剤が、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−ｙｌ）−４−メチルモルホリニウム塩化物である前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜７＞ シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかがシアル酸含有オリゴ糖であり、かつ、溶媒が水、並びに水及びアルコールの混合溶媒の少なくともいずれかである前記＜２＞から＜６＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜８＞ シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかがガングリオシドであり、かつ、溶媒がアルコール、並びに水及びアルコールの混合溶媒の少なくともいずれかである前記＜２＞から＜６＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜９＞ 一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかを、中性に調整して混合に使用する前記＜２＞から＜８＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜１０＞ 弱酸性条件下で混合を行う前記＜２＞から＜９＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法である。
＜１１＞ 前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法により得られたことを特徴とする蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質である。

本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、各種クロマトグラフィーや質量分析等、様々な分析手段によるシアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質の高感度分析を可能とする、効率的なシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法、及び、前記方法により得られる蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質を提供することができる。

（シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法／蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質）
本発明のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法は、シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に、後述する一般式（１）で表される化合物を結合させることを特徴とする。
前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基への、前記一般式（１）で表される化合物の結合方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択した方法により行うことができるが、中でも、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかと、前記一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかと、脱水縮合剤とを、溶媒中で混合する工程を含む方法により、好適に行うことが可能である。以下に前記方法の詳細を示す。

＜シアル酸、シアル酸含有糖質、シアル酸含有複合糖質＞
前記シアル酸、シアル酸含有糖質、シアル酸含有複合糖質は、前記蛍光標識化方法における蛍光標識化の対象物質であり、これらはいずれか１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
ここで、前記シアル酸とは、ノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸などが挙げられる。なお、前記シアル酸は、通常糖鎖の非還元末端に存在するが、単糖の状態で前記蛍光標識化の対象物質に使用されてもよい。また、前記シアル酸含有糖質とは、前記シアル酸を含有する糖質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シアル酸含有オリゴ糖、シアル酸含有多糖などが挙げられる。また、前記シアル酸含有複合糖質とは、前記シアル酸を含有する複合糖質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガングリオシド等のシアル酸含有糖脂質、シアル酸含有糖タンパク質、シアル酸含有プロテオグリカン、シアル酸含有ペプチドグリカン、シアル酸含有リポ多糖などが挙げられる。
なお、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、シアル酸含有複合糖質は、天然由来のものを使用してもよいし、合成により得られたものを使用してもよい。

前記シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法では、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に、後述する一般式（１）で表される化合物（蛍光物質）を結合させる。そのため、前記蛍光標識化の対象物質がガングリオシド等のシアル酸含有複合糖質である場合であっても、従来のように蛍光標識化のためにその複合体部分（ガングリオシドの場合はセラミド部分）を切り離す必要がなく、そのため、前記シアル酸含有複合糖質を、全体として分析に供することができる点で、有利である。
また、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に、後述する一般式（１）で表される化合物（蛍光物質）を結合させることにより、カルボキシル基の負のチャージを失くすことができ、そのため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析において飛行しにくい、飛行中に分解するといった従来における質量分析上の問題点を克服し、シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の質量分析への応用を可能とすることができる点で、有利である。

＜一般式（１）で表される化合物＞
前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に結合させる蛍光物質としては、下記一般式（１）で表される化合物が使用される。
ただし、前記一般式（１）中、ｎは２〜４の整数を示す。中でも、ｎ＝２が好ましい。

前記一般式（１）で表される化合物の具体例としては、２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミン、２−（２−ピリジルアミノ）プロピルアミン、２−（２−ピリジルアミノ）ブチルアミンが挙げられ、これらの中でも、２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミンが好ましい。
また、前記一般式（１）で表される化合物は、塩の状態で使用してもよい。前記塩としては、例えば、塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩などが挙げられる。
これらの中でも、前記一般式（１）で表される化合物としては、２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミン・２塩酸（ＰＡＥＡ）が特に好ましい。

前記シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法では、前記一般式（１）で表される化合物のような、小さな蛍光発色団を有し、かつ、結合に関与する側鎖として炭素数２〜４のアルキルアミンを有する蛍光物質を使用するため、結合に際して蛍光発色団が、シアル酸と隣接する糖との結合で生じる立体障害の影響を受ける懸念がなく、安定に結合を行うことができ、そのため、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化を効率的に行うことができる点で、有利である。また、前記一般式（１）で表される化合物は、アミド結合によりカルボキシル基に結合されるため、エステル結合等より強固に結合できる点でも、有利である。
一般に、蛍光物質として使用されている試薬は、蛍光発色団がピレン型、アントラセン型、ナフタレン型といった多環式化合物が主であるが、これらの蛍光物質では、結合の際に蛍光発色団がシアル酸と隣接する糖との間に生じる立体障害の影響を受けてしまい、蛍光標識化反応の進行が著しく妨げられる等の問題がある。また、一般に、結合にかかるアミノ基を持つ側鎖は、炭素数が環を形成できる数になるにつれ、炭素鎖の折れ曲がりが生じ、直線性が損なわれるために、側鎖のアルキルアミンの炭素数が５以上となると、かえって反応性が乏しくなってしまう等の問題がある。

＜脱水縮合剤＞
前記脱水縮合剤は、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基と、前記一般式（１）で表される化合物との結合反応（蛍光標識化反応）を促進させる目的で使用される。前記結合反応は、前記脱水縮合剤を使用せずに進行させることも可能であるが、より反応を促進させることができる点で、前記脱水縮合剤を使用することが好ましい。

前記脱水縮合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−ｙｌ）−４−メチルモルホリニウム塩化物（ＤＭＴ−ＭＭ；Ｋｕｎｉｓｈｉｍａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９９，４０，５３２７−５３３０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２００１，５７，１５５１−１５５８参照）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等が挙げられるが、中でも、ＤＭＴ−ＭＭが好ましい。前記脱水縮合剤がＤＭＴ−ＭＭであると、前記結合反応を促進する効果に優れる点で、有利である。

＜混合量比＞
前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかと、前記一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかと、前記脱水縮合剤との混合量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、モル比で、シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれか：一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれか：脱水縮合剤＝１：１：１〜１：２：２が好ましく、１：１．０５：１．０５〜１：１．５：１．５がより好ましく、１：１．１：１．１が特に好ましい。

＜溶媒＞
前記溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、アルコール、水及びアルコールの混合溶媒などが挙げられる。前記水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、超純水等が挙げられる。前記アルコールとしても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノール等が挙げられる。

前記溶媒の種類は、前記蛍光標識化の対象物質（シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれか）の種類に応じて、適宜選択することが好ましい。前記対象物質の種類に応じて適切な溶媒を選択することにより、蛍光標識化反応効率をより向上させることができる。
例えば、前記蛍光標識化の対象物質として、疎水性部を有さないシアル酸含有糖質（シアル酸含有オリゴ糖等）を使用する場合には、前記溶媒としては、水、並びに水及びアルコールの混合溶媒の少なくともいずれかを使用することが好ましい。なお、前記混合溶媒における、水とアルコールとの混合量比としては、体積比で、１：０〜１：１が好ましく、１：０〜１：０．５がより好ましい。
一方、前記蛍光標識化の対象物質として、疎水性部を有するシアル酸含有複合糖質（疎水性部としてセラミドを有するガングリオシド等）を使用する場合には、前記溶媒としては、アルコール、並びに水及びアルコールの混合溶媒の少なくともいずれかを使用することが好ましい。なお、前記混合溶媒における、水とアルコールとの混合量比としては、体積比で、０：１〜１：１が好ましく、０：１〜０．５：１がより好ましい。

＜混合＞
前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかと、前記一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかと、前記脱水縮合剤とを、前記溶媒中で混合する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピッペット等の装置を用いて混合を行うことができる。また、前記各成分の添加順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記混合は、弱酸性（ｐＨ４〜５）条件下で行うことが好ましい。前記一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかの好ましい一態様である２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミン・２塩酸（ＰＡＥＡ）は、塩酸塩であるために強い酸性を示すが、これを水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤により中性（ｐＨ６．５〜７）に調整して使用し、全体としては弱酸性条件下で前記混合を行うことにより、前記蛍光標識化反応効率を著しく向上させることができる。前記ＰＡＥＡを中和して使用することにより、前記一般式（１）で表される化合物や、前記脱水縮合剤を多量に使用することなしに、効果的に反応効率を向上させることができる。

また、前記混合を行う温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、２０〜３５℃が好ましく、室温（２５〜３０℃）がより好ましい。
また、前記混合を行う時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、０．３〜２４時間が好ましく、０．５〜４時間がより好ましい。

前記混合により、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基と、前記一般式（１）で表される化合物との結合反応（蛍光標識化反応）を効率的に進行させることができ、その結果、蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質を得ることができる。
前記混合によれば、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に、前記一般式（１）で表される化合物を結合させるのみの、一段階の反応で前記シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化を行うことができ、したがって、反応効率に優れる点で、有利である。

前記蛍光標識化反応終了後は、通常の精製操作により、前記反応後溶液から前記蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質を分離精製することができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法等により、分離精製を行うことができる。
また、得られた蛍光標識化シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質は、例えば、^１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲ等の手法によりその構造を確認することができる。前記蛍光標識化シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質は、シアル酸のカルボキシル基に、前記一般式（１）で表される化合物（蛍光物質）がアミド結合により結合した新規な構造を有するものであり、したがって、前記蛍光標識化シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質も、それぞれ本発明の範囲内に含まれるものである。

＜用途＞
前記のようにして得られた蛍光標識化シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質は、各種クロマトグラフィーや質量分析等、様々な分析手段に適用が可能である。このような蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質を用いることにより、より高感度なシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の分析が可能となる。
また、前記蛍光標識化シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質は、シアル酸のカルボキシル基を蛍光物質で標識しただけで、その構造を破壊していないため、前記シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の全体をそのまま分析することができる点で、有利である。
また、前記蛍光標識化シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質は、シアル酸のカルボキシル基を蛍光物質で標識しているために、カルボキシル基の負のチャージが失われている。したがって、カルボキシル基の負のチャージが原因となっていた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析において飛行しにくい、飛行中に分解するといった質量分析上の問題点を克服することができ、従来は困難であったシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の質量分析を可能とすることができる点で、有利である。

以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例及び参考例に何ら限定されるものではない。

（参考例１：シアル酸含有糖質／シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法の予備検討）
本発明者らは、まず、以下のようにして、シアル酸含有スフィンゴ糖脂質（ガングリオシド）におけるシアル酸のカルボキシル基を蛍光標識化する方法を予備検討した。

まず初めに、蛍光物質として、脂肪酸分析用蛍光試薬９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ（ＡＤＡＭ，“アダム”、フナコシ社）を用いて検討した。使用説明書に従いラウリン酸を用いて試験したところ、問題なく反応が進行することが確認された。しかし、ガングリオシドでは、様々な反応条件下（ガングリオシド：ＧＭ４、ＧＭ３、ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂなど、ガングリオシドとＡＤＡＭのモル比：１：１〜１：２０、溶媒：水、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、時間：５分〜４８時間、温度：２０℃〜８０℃）で検討したが、標識化反応はほとんど進行しなかった（反応率１％未満）。反応が進行しにくい一番の要因は、シアル酸と結合する隣接糖との間に生じる立体障害により、アントラセンを基本骨格として有するアダム試薬がカルボキシル基に接近できないためであると考えられた。
そこで、本発明者らは、蛍光発色団が小さく、かつ、反応に預かる側鎖としてエチルアミンを持つ蛍光物質、２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミン・２塩酸（ＰＡＥＡ）を選択した。ＰＡＥＡでは、ＡＤＡＭの場合と異なり、反応後に目的とする反応物が形成されていることが確認できた（反応率１％程度）。

ただし、前記条件ではガングリオシドのＰＡＥＡ化反応率は１％程度であり、より高い反応率が望まれた。そこで、本発明者らは更に、水やアルコールといった極性溶媒中でも使用できる脱水縮合剤、Ｎ，Ｎ’−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ）、及び、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−ｙｌ）−４−メチルモルホリニウム塩化物（ＤＭＴ−ＭＭ）を用いて、反応の促進化を検討した（ガングリオシドとＤＣＣ又はＤＭＴ−ＭＭのモル比：１：１〜１：２０、溶媒：水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、時間：５分〜４８時間、温度：２０℃〜５０℃）。
水、メタノール、エタノール、２−プロパノール中で反応を行った結果、ＤＣＣでは顕著な反応の促進はみられなかったが、ＤＭＴ−ＭＭではエタノール、２−プロパノールで反応率は１０％に上がった。

更に、ＰＡＥＡ溶液の液性をＮａＯＨ溶液で中性に調整（ｐＨ６．５〜７）してから使用することで、反応率は更に倍（２０％）になった（この際の反応液のｐＨは４．５前後）。
反応溶液は、ロータリーエバポレーターで濃縮後、少量の水で溶解し、陽イオン交換カラム（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）に負荷し、素通り画分を集め、更に陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）に負荷し、素通り画分を集め凍結乾燥した。その後、シリカゲルカラム（イヤトロビーズ ６ＳＲ ８０６０、ダイアヤトロン社）を用い、凍結乾燥物から反応成生物を、通常のガングリオシドの精製法に従い、溶離溶媒系のクロロホルムとメタノールの混合体積比を９：１から１：２まで順次変化させることで単離する事ができた。

一方、ガングリオシドのような疎水性部（セラミド）を持たないシアル酸含有オリゴ糖では、様々な反応条件下（シアル酸含有オリゴ糖とＤＭＴ−ＭＭのモル比：１：１〜１：２０、溶媒：水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、時間：５分〜４８時間、温度：２０℃〜８０℃）で検討したところ、反応溶液として水：エタノール（１：９、体積比）を用いた時に一番良い反応率が得られた（２４％）。

（実施例１：３’−シアリルラクトース（シアル酸含有糖質）のＰＡＥＡ化反応）
図１に示す反応スキームに従い、３’−シアリルラクトースのＰＡＥＡ化反応を行った。具体的には、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）（シグマ社）１５ｍｇ（２４μｍｏｌ）とＰＡＥＡ（和光純薬工業）５．５ｍｇ（２６μｍｏｌ）に、６００μＬのＥｔＯＨ／０．３２Ｍ ＮａＯＨ（９：１体積比）を加え、更にＤＭＴ−ＭＭ（国産化学社）（１２．９０％ 水分）８．３ｍｇ（２６μｍｏｌ）を加えた後、室温で３時間放置することにより、３’−ＳＬ誘導体（ＰＡＥＡ−３’ＳＬ）を得た。

ＰＡＥＡ−３’ＳＬの精製は、反応溶液を濃縮乾固後、３ｍｌの水を加え、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）カラム（１．２ｘ５ｃｍ）に負荷し、水で溶出した。溶出画分を凍結乾燥した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）カラム（１．５ｘ７５ｃｍ）を用いて分画した。溶出には水を用いて、５ｍｌずつ集められたフラクションを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてモニタリングした。ＵＶランプで蛍光を発し、かつレゾルシノール試薬に陽性であったスポットを含む画分を集め、凍結乾燥した。その画分をＴＳＫ ＧＥＬ ＡＭＩＤＥ−８０（４μｍ，４．６ｘ２５０ｍｍ）カラム（ＴＯＳＯＨ社）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で最終精製を行い、精製ＰＡＥＡ−３’ＳＬ画分を得た。ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
溶離液Ａ：５０％アセトニトリル−１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）
溶離液Ｂ：７５％アセトニトリル−１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）
溶離液Ｂ：１００％→０％のリニアーグラジエント溶出
検出条件：蛍光検出器（Ｅｘ：３００ｎｍ，Ｅｍ：３６０ｎｍ）
溶離液に含まれる塩の除去には、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）カラム（１．５ｘ６０ｃｍ）を用いた。

ＰＡＥＡ−３’−ＳＬの反応収率は２７％であった。反応生成物の構造は、^１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲを用いて確認した（図２）。
ＰＡＥＡ−３’−ＳＬのＨＰＬＣ蛍光検出結果を図３に示す。サンプル量は１０ｎｇ（１３ｐｍｏｌ）とした。ＨＰＬＣでは、感度はＵＶ検出（１９５ｎｍ）の数百倍となり、ｐｍｏｌレベルでの分析が可能であることがわかった。反応生成物の蛍光特性は、励起波長Ｅｘ：３００ｎｍ，蛍光極大波長Ｅｍ：３６０ｎｍであった。
また、ＰＡＥＡ−３’−ＳＬのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を図４に示す。偽イオンピークの質量数は計算上の理論値と良く一致していた。未修飾成分のマススペクトル（図４中、（ａ））と比較すると、シアル酸のカルボキシル基の修飾により、飛行しにくい、飛行中に分解しやすい、といった欠点が改善されたことが良くわかる（図４中、（ｂ））。

（実施例２：６’−シアリルラクトース（シアル酸含有糖質）のＰＡＥＡ化反応）
図５に示す反応スキームに従い、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）のＰＡＥＡ化反応を行った。具体的には、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）（ウシ初乳由来）１５ｍｇ（２４μｍｏｌ）とＰＡＥＡ（和光純薬工業）５．５ｍｇ（２６μｍｏｌ）に、６００μＬのＥｔＯＨ／０．３２Ｍ ＮａＯＨ（９：１体積比）を加え、更にＤＭＴ−ＭＭ（国産化学社）（１２．９０％ 水分）８．３ｍｇ（２６μｍｏｌ）を加えた後、室温で３時間放置することにより、６’−ＳＬ誘導体（ＰＡＥＡ−６’ＳＬ）を得た。

ＰＡＥＡ−６’−ＳＬの反応収率は４０％であった。反応生成物の構造は、^１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲを用いて確認した（図６）。

なお、前記実施例１〜２と同様にして得られた各ＰＡＥＡ化シアル酸含有オリゴ糖を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析した様子を図７に示す（レーン１：３’−ＳＬ、レーン２：６’−ＳＬＮ（６’−シアリルラクトサミン）、レーン３：６’−ＳＬ、レーン４：ＤＳＬ（ジシアリルラクトース）、レーン５：ネガティブコントロール）。なお、図７中、溶媒系１、３、４、５の組成は以下の通りである。
溶媒系１：テトラヒドロフラン/アセトニトリル/１−プロパノール/０．６Ｍ酢酸アンモニウム水溶液/２８％アンモニア水（５：１０：５０：３５：０．３、体積比）
溶媒系３：アセトン/２−プロパノール/ピリジン/水/酢酸（６０：６０：１０：３０：３、体積比）
溶媒系４：テトラヒドロフラン/アセトン/１−ブタノール/２−プロパノール/ピリジン/水/酢酸（１０：３０：２０：６０：１０：３０：３、体積比）
溶媒系５：エタノール/１−ブタノール/ピリジン/水/酢酸（１００：１０：１０：３０：３、体積比）
ＴＬＣ上では、蛍光ランプでの検出と、通常のレソルシノール反応による検出が可能であり、各ＰＡＥＡ化反応物は出発の成分（親成分）より移動度が大きかった（低極性化）（図７）。また、ＴＬＣプレートからＰＶＤＦ膜に転写しても、蛍光は失われることがなかった（図８）。

（実施例３：ガングリオシドＧＭ４（シアル酸含有複合糖質）のＰＡＥＡ化反応）
図９に示す反応スキームに従い、ガングリオシドＧＭ４のＰＡＥＡ化反応を行った。具体的には、ガングリオシドＧＭ４（ミンククジラ脳由来）１０ｍｇ（９μｍｏｌ）とＰＡＥＡ（和光純薬工業社）２．３ｍｇ（１１μｍｏｌ）に、１ｍＬのＰｒＯＨ／８０ｍＭ ＮａＯＨ（９：１体積比）を加え、更にＤＭＴ−ＭＭ（国産化学社）７．０ｍｇ（２２μｍｏｌ）を加えた後、室温で３時間放置することにより、ＧＭ４誘導体（ＰＡＥＡ−ＧＭ４）を得た。

ＰＡＥＡ−ＧＭ４の精製は、反応溶液を濃縮乾固後、４ｍｌのＭｅＯＨを加え、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）カラム（１．２ｘ５ｃｍ）に負荷し、ＭｅＯＨで溶出した。カラム未吸着画分を集め、濃縮後Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）カラム（１．５ｘ７５ｃｍ）で分画を行った。溶出はＭｅＯＨで行い、３ｍｌずつ分画された各画分をＴＬＣでモニターした。ＵＶランプで蛍光を発し、かつレゾルシノール試薬に反応したスポットを集め、ロータリーエバポレーターで濃縮した。その画分にＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（５０：５０体積比）を少量加え、そこでアルカリ処理を行った。その後、再度濃縮乾固した後、その画分にＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ ９：１を加え、シリカゲル（イヤトロビーズ ６ＳＲ ８０６０、ダイアヤトロン社）カラム（１．２ｘ８ｃｍ）に負荷した。そのカラムはＣＨＣｌ_３／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ ４２．５：４２．５：１５，２：２：１，０：２：１，０：１：１，０：１：２（体積比）と、順にそれぞれ３０ｍｌで溶出し、ＰＡＥＡ−ＧＭ４を単離した。

ＰＡＥＡ−ＧＭ４の反応収率は１５％であった。反応生成物の構造は、^１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＨ−ＣＯＳＹ ＮＭＲを用いて確認した（図１０）。
また、ＰＡＥＡ−ＧＭ４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を図１１に示す。偽イオンピークの質量数は計算上の理論値と良く一致していた。未修飾成分のマススペクトル（図１１中、（ａ））と比較すると、シアル酸のカルボキシル基の修飾により、飛行しにくい、飛行中に分解しやすい、といった欠点が改善されたことが良くわかる（図１１中、（ｂ））。
図１１のＰＡＥＡ−ＧＭ４のＭＳスペクトルは、シアル酸含有複合糖質のシアル酸カルボキシル基を蛍光物質で標識しただけで分解せず、全体そのままを調べた世界で初めての成功例である。そのためＭ／Ｚ１２６０のシグナルの前後に観察される分子イオンピークは、セラミドの構成脂肪酸分子種（図１２）を良く反映している。

本発明のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法は、各種クロマトグラフィーや質量分析等、様々な分析手段によりシアル酸含有糖質やシアル酸含有複合糖質を分析、分離精製、構造解析等するための、シアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の非破壊的な高感度化技術として、幅広く応用可能である。

図１は、３’−シアリルラクトースのＰＡＥＡ化反応スキームを示した図である。 図２は、ＰＡＥＡ化３’−シアリルラクトースの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。 図３は、ＰＡＥＡ化３’−シアリルラクトースのＨＰＬＣ蛍光検出結果を示した図である。 図４は、ＰＡＥＡ化３’−シアリルラクトースのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示した図である。（ａ）未修飾３’−シアリルラクトース、（ｂ）ＰＡＥＡ化３’−シアリルラクトース。 図５は、６’−シアリルラクトースのＰＡＥＡ化反応スキームを示した図である。 図６は、ＰＡＥＡ化６’−シアリルラクトースの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。 図７は、各ＰＡＥＡ化シアル酸含有オリゴ糖の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析像である。レーン１：３’−ＳＬ、レーン２：６’−ＳＬＮ、レーン３：６’−ＳＬ、レーン４：ＤＳＬ、レーン５：ネガティブコントロール。 図８は、ＰＡＥＡ化３’−シアリルラクトースの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析像及びＴＬＣ−ブロッティング像である。 図９は、ガングリオシドＧＭ４のＰＡＥＡ化反応スキームを示した図である。 図１０は、ＰＡＥＡ化ガングリオシドＧＭ４の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。 図１１は、ＰＡＥＡ化ガングリオシドＧＭ４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示した図である。（ａ）未修飾ＧＭ４、（ｂ）ＰＡＥＡ化ＧＭ４。 図１２は、図１１に示したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルから予測されるセラミドの構成脂肪酸分子種を示した図である。

Claims (11)

1. シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかにおけるシアル酸のカルボキシル基に、下記一般式（１）で表される化合物を結合させることを特徴とするシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
   ただし、前記一般式（１）中、ｎは２〜４の整数を示す。
2. シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかと、一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかと、脱水縮合剤とを、溶媒中で混合する工程を含む請求項１に記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
3. シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかが、シアル酸含有オリゴ糖である請求項１から２のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
4. シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかが、ガングリオシドである請求項１から２のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
5. 一般式（１）で表される化合物が、２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミンである請求項１から４のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
6. 脱水縮合剤が、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−ｙｌ）−４−メチルモルホリニウム塩化物である請求項２から５のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
7. シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかがシアル酸含有オリゴ糖であり、かつ、溶媒が水、並びに水及びアルコールの混合溶媒の少なくともいずれかである請求項２から６のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
8. シアル酸、シアル酸含有糖質、及びシアル酸含有複合糖質の少なくともいずれかがガングリオシドであり、かつ、溶媒がアルコール、並びに水及びアルコールの混合溶媒の少なくともいずれかである請求項２から６のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
9. 一般式（１）で表される化合物及びその塩の少なくともいずれかを、中性に調整して混合に使用する請求項２から８のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
10. 弱酸性条件下で混合を行う請求項２から９のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法。
11. 請求項１から１０のいずれかに記載のシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質の蛍光標識化方法により得られたことを特徴とする蛍光標識化されたシアル酸、シアル酸含有糖質、乃至シアル酸含有複合糖質。