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Hämoglobin enthaltendes fllutersatzmittel
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Die Erfindung betrifft ein Hämoglobin enthaltendes Blutersatzmittel
der allgemeinen Formel I, M - R1 B B - R2 - Hb (I), bei dem zell freies Hämoglobin
Hbkovalent über reaktive Gruppen R1 und R2 und einen Brückenliganden B mit einem
Polysaccharid M verbunden ist, für den Sauerstofftransport sowie ein Verfahren zu
seiner Herstellung.
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Üblicherweise können Blut- und Plasmaverluste bis zu etwa 1,5 1 durch
Infusion kolloidaler Volumenersatzmittel ausgeglichen werden. Zu derartigen Volumenersatzstoffen
gehören beispielsweise Dextrane, HydroxyäthylstErke und Gelatine. Wenn jedoch dieses
Volumen von ca. 1,5 1 überschritten und nicht sofort ersetzt wird, entsteht beim
menschlichen oder tierischen Organismus der hämorragische Schock, da derartige Blutverluste
nicht ohne Gefahr durch erythrozyten freie Lösungen aufgefüllt werden durfen. In
einem solchen Fall kann nur Vollblut übertragen werden, dem die bekannten Risiken
anhaften. Zu derartigen Risiken gehören eine beschränkte Lagerfähigkeit, die Gruppenspezifität
(Rhesusfaktoren u. dgl.), Immunisierungsprobleme, die durch körperfremde Substanzen
entstehen, mit Krankheitstragern (beispielsweise
Hepatitsviren)
infizierte Vollblutkonserven, Aggregatbildung von Blutplättchen und BlutkOrperchen
u. dgl.
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Diese und weitere Risiken faktoren sind beispielsweise in der Monographie
von U.F. Gruber Blutersatz, Springerverlag, 1968, beschrieben.
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Zur Lösung des Problems wurden u.a. Emulsionen von fluorierten Kohlenwasserstoffen
und der zellfreie Einsatz von HämoglobinlOsungen vorgeschlagen. Diese Versuche scheiterten
jedoch, da einerseits bei den fluorierten Kohlenwasserstoffen keine ausreichende
Emulsionsstabilität und quantitative Ausscheidung gegeben sind, andererseits auch
nach der vollständigen Beseitigung von Zell fragmenten, die zu nierentoxischen Rffekten
führten, das stromafreie, gelöste Hämoglobin weder die erforderliche Sauerstoffaufnahme-
oder -abgabekapazität aufweist noch ausreichend lange im Körper verbleibt, da es
bereits nach relativ kurzer Zeit durch die Niere ausgeschieden wird. Um die Halbwertszeit
der Ausscheidung zu erhöhens wurden deshalb gem. DE-OS 26 46 854 Substanzen zur
Verwendung als Blutersatz oder Blutstrecker erzeugt, bei denen Hämoglobin über eine
kovalente Bindung an ein makromolekulares Produkt gebunden ist. Während als Makromoleküle
Dextran oder Hydroxyäthylstärke, die jeweils ein Molekulargewicht von 5000 bis 2000000
besitzen, in Frage kommen können, wird die kovalente Bindung dadurch hergestellt,
daß Hydroxygruppen der Polysaccharide aktiviert und diese aktivierten funktionellen
Gruppen, ggf. über einen Brückenllganden, mit dem Hämoglobin gekuppelt werden. Aktivierte
Zwischenprodukte der Makromoleküle lassen sich durch Reaktionen mit Bromcyan, einem
t-Halogenalkylamin oder Perjodat herstellen. Anschließend erfolgt entweder eine
direkte Kupplung mit Hämoglobin oder eine Ankupplung über einen kurzkettigen Spacer.
Obwohl durch die Ankupplung die Ausscheidungen von Hämoglobin durch die Niere verlangsamt
werden, wodurch die Wirkungsdauer des Hämoglobin erheblich erhöht wird, ist andererseits
die Sauerstoffbindungs- und-abgabeeigenschaft des Endprodukts gem. DE-OS 26 46 85L
nicht ausreichend, da bei weitem nicht die sigmoide
Sauerstoffaufnahme
-abgabekurve des reinen Hämoglobins erreicht wird. Diese sigmoide Funktion ist jedoch
eine wichtige Voraussetzung für die Sauerstoffaufnahme in der Lunge und Sauerstoffabgabe
in den peripheren Muskelgeweben. Sofern diese Eigenschaft nicht in einem genügenden
Maß erreicht wird, besteht weiterhin die Gefahr eines hämorragischen Schocks.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Blutersatzmittel
auf der Basis eines an eine makromolekulare Verbindung gekoppelten Hämoglobins zu
schaffen, das einerseits eine hohe Verweildauer im Kerner aufweist, andererseits
der Sauerstoffaufnahme- oder Abgabeeigenschaft des natürlichen Hxmoglobins weitgehend
angenähert ist.
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Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs
1 gelöst.
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Das erfindungsgem!Be Blutersatzmittel läßt sich bei Mensch und Tier
gleichermaßen einsetzen, wobei die vorstehend genannten Nachteile, die durch Ubertagung
von konserviertem Blut entstehen, nicht auftreten. Weiterhin läßt sich dieses Mittel
über lange Zeit lagern und kann im Bedarfsfall durch einfaches Mischen mit Wasser
und Auflösen darin sofort eingesetzt werden.
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Dabei hat sich herausgestellt, daß die Volumenverweilzeit in Abhängigkeit
von der Kettenlange und der Modifizierung des Brtekengliedes variierbar ist und
bis zu Oh betragen kann, d.h., daß nach 10 Stunden noch 50% des infundierten Volumens
im Kreislauf nachzuweisen sind. Außerdem sind die erfindungsgemaßen Produkte biologisch
akzeptabel und erzeugen u.a. keine allergischen Reaktionen.
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Die erfindungsgemaßen Produkte bestehen im wesentlichen aus Polysaccharid
als makromolekulare Verbindungen, die als Matrix M bezeichnet werden, einer chemischen
Brücke B ("Spacer") und einem Liganden Hb,wobei die Brücke B jeweils über reaktive
Gruppen R1 und R2 mit der Matrix M bzw. dem Liganden Hb,
der das
Hämoglobin darstellt, verbunden ist.
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Als Matrix kommen makromolekulare Polyhydroxy-Verbindungen, wie Polysaccharide,
in Frage, wobei Dextrane und Hydroxyathystärke mit einem Molekulargewicht von 5000
bis 1000000 bevorzugt sind.Besonders bevorzugt sind*Dextrane 40 und 70 ki ische
sowie SHydroxySthylsturke die einen Anteil von mindestens 90 % Amylopectin-Hydrolysat,
eine Eigenviskositat von 0,05-0,3 dl/g bei 250 C, einen Athersubstitutionsgrad bis
0,9 HydroxyAthylgruppen/Glucoseeinheit, ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht
Mw bis 700000, und ein teilchengemitteltes Molekulargewicht Mn bis 100000 aufweist.
Die Dextrane sowie die Hydroxyathylstärke sind als solche im Handel und deshalb
leicht erhältlich. * die klinischen Als Hämoglobin wird vorteilhaft zellfreies (stromafreies)
Hämoglobin eingesetzt, das aus Prischem Humanblut frei von Antigenen, Zellbestandteilen
und Pyrogenen lyophilisiert hergestellt wurde. Hierzu bedient man sich beispielsweise
eines Druckfiltrationsgerates mit einem Membranfilter der PorengrOBe tm, um das
Humanblut zell frei zu filtrieren.
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Als chemische Brücke B kommen gerad- oder verzweigtkettige aliphatische
Gruppen mit 3 - 14 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 4 - 10, insbesondere 4 - 8 Kohlenstoffatomen
infrage.
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Spezielle Beispiele für gerad- oder verzweigtkettige Alkylgruppen
sind die Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Oktyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-,
Dodecyl- und die Myristylgruppe wie deren isomere Formen. Vorstehend genannten Alkylgruppen
können auch eine oder mehrere ungesättigte Bindungen enthalten. Beispiele für Alkenylgruppen
sind die Allyl-, 1-Methylallyl-,2-Methylallyl-(Methallyl-), 2-Butenyl-(Crotyl-),
3-Butenyl-,1,2-Dimethylallylfl -Dimethylallyl-s2-Athylallyl-,1-Methyl-2"butenyl-,2-Methyl-2-butenyl-,3-Methyl-2-butenyl73-peienyl-w23-Dimethyl-2-butenyl-
2-Trimethylallyl-1,3-Dimethyl-2-butenyl-,1-Äthyl-2-butenyl-,4-Methyl-2-pentenyl-,
2-Äthyl-2-pentenyl-S4S4-Dimethyl-2-pentenyl-,2-Heptenyl-,2-Oktenyl-, 5-Oktenyl-,
2-Nonenyl-, 2-Decenyl -, 2-Dodencenyl- und dgl.
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Vorstehenden Alkylgruppen können auch in der Seitenkette Alkoxygruppen
aufweisen, wobei beispielsweise die 2-Methoxypropyl-, 3-Methoxypropyl-, 3-Propoxypropyl-,
2-Methoxybutyl-, 3-AthOxybutyl-,4-Butoxybutyl-,2-Äthoxyhexyl-,3-Methoxy~3-methylpentyl-,4-Methoxyoktylgruppe
in-Frage kommen können.
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Die vorstehenden Alkylgruppen, die ggf. ein oder mehrere ungesättigte
Bindungen oder Alkoxygruppen aufweisen, können mit zunehmender Kettenlänge wasserunlöslich
werden, was sowohl bei der Synthese als auch beim Endprodukt von Nachteil sein kann.
Diese Eigenschaft läßt sich dadurch verbessern oder aufheben, daß ein oder mehrere
Hydroxygruppen eingeführt werden. Spezielle Beispiele für derartige Gruppen sind
Abkömmlinge von Di-, Tri- und Tetraglycerin.
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Die vorstehenden C3-C14 haltigen Gruppen können auch als Cycloalkylgruppen
vorliegen, wobei die Cyclohexyl-,4-tert-Butylcyclohexyl-, 3-Isopropylcyclohexyl-,
2, 2-Dimethylcyclohexyl-, Cycloheptyl-und die Cylooktylgruppe in Frage kommen können.
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Die reaktiven Gruppen R1 und R2 sind bei den zyklischen Gruppierungen
vorzugsweise in 1,4 Stellung ankondensiert.
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Zu C3-C14 haltigen Gruppen gehören weiterhin Arylgruppen, wie die
Phenyl-,Biphenyl-,1-Naphtyl- und die 2-Naphtylgruppe, die ggf. mit den vorstehend
genannten Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxyalkyl-, oder Cycloalkylgruppen substituiert sein
können.
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Beispiele für Alkarylgruppen sind die o-Tolyl-, m- Tolyl-, p-Tolyl-
und die p-tert-Butylphenylgruppe, die isomere; Form der Xylyl-Gruppen, dieisomeren
Formen der Trimethylphenylgruppen und die 4-Athyl-1-naphtylgruppe.
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Beispiele für Aralkylgruppen sind die Benzyl-PhenylAthyl-1-Phenyläthyl-,2-Phenylpropyl-,4-Phenylbutyl-,6-Phenylhexyl-,
5-Phenyl-2-methylphenyl- und 1-Naphtyl-methylgruppe.
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Beispiele für Alkarylgrupperl sind die o-Tolylmethyl-,m-Tolylmethyllp-Tolylmethylgruppe
und dgl.
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Beispiele für Alkoxyaralkylgruppen sind die o-Methoxyphenyl-, m-MethOxyphenyl-,p-Methoxyphenyl-,2-(m-Methoxyphenyl)-athyl-,
4-Methoxy-1 -naphtylmethylgruppe und dgl.
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Als reaktive Gruppen R1 und R2, die jeweils die Verbindung zwischen
der Brücke B und der Matrix M bzw. dem Hämoglobin Hb darstellen und die gleiche
oder verschiedene Bedeutung besitzen können, kommen üblicherweise folgende Gruppierungen
in Frage: -O-,-NH-,=N-,-S-,- S(CH2)-, =N-(CH2)m-NH-,-NH-(CH2)m-NH-, =N-(CH2)m-N=,-NH-(CH2)m-N=,
wobei m entweder 0 (also mit dem Ausgangsprodukt Hydrazin) oder eine ganze Zahl
von 1-14 bedeutet,
Bevorzugte reaktive Gruppen R1 und R2 sind die Gruppierungen der Formel -O-,-NH-,-N-,-NH-NH-,=N-NH-,=N-N=,
Precursoren für die vorstehend genannten Gruppierungen R1 und R2 sind Halogenatome,
Amino-0mid-,Carboxyl-,Carbonyl-, Saurehalogenid-, Säureacid, SulPhydryl-, Imidazo-
und Thiomethylgruppen.
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Bevorzugte Ausgangsverbindungen sind « Diamine der allgemeinen Formel
II H2N-B-NH2 (11) und-Aminocarbonsäuren der allgemeinen Formel III H2N-B-COOH. (III)
Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel II und III sind diejenigen,
bei denen B aliphatische Gruppen mit 3-14 Kohlenstoffatomen darstellt.
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Zur Herstellung des erfindungsgemaßen Blutersatzmittels wird üblicherweise
zuerst die Backe B an die Matrix M über die reaktive Gruppe R1 angekuppelt und anschließend
wird das erhaltene Produkt über die zweite reaktive Gruppe R2 mit dem zell freien
H§mo;lobin verbunden. Die Reihenfolge der Kuppelung ist jedoch nicht erfindungswesentlich
und kann deshalb umgekehrt werden.
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Um eine Brücke 13 mit der Matrix M zu koppeln, muß einer der beiden
Reaktionsteilnehmer mindestens eine reaktonsfreudige Gruppe aufweisen. Da als Matrix
M gewöhnlich Polysaccharide, also VerbindungEn mit OH-Funktionen eingesetzt werden,
müssen entweder diese Hydroxy-Gruppen der Polysaccharide in eine reaktive Form überf;Qhrt
werden oder aber die Brücke B muß besonders reaktionsfreudige Gruppen aufweisen,
beispielsweise Halogenatome oder Doppelbindungen, die mit der Hydroxygruppe reagieren
konnten.
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Unter den Halogenatomen ist das Bromatom bevorzugt, das nach folgender
Gleichung 1
in der M-(Hdie Matrix mit einer beliebig ausgewählten OH-Gruppe bedeutet und die
BrUcke B die vorstehende Bedeutung besitzt, mit der Matrix unter Abspaltung des
entsprechenden Bromwasserstoffs reagieren kann.
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Das nach der Gleichung 1 erhaltene Produkt kann wiederum über eine
entsprechende reaktive Gruppe R2 mit dem Hämoglobin umgesetzt werden.
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Andererseits kann die Matrix M auch mit einer reaktiven DoDelbindunR.
beispielsweise mit P-Benochinon nach Gleicung 2
umgesetzt werden.Das erhaltene Produkt kann mit einer Aminogruppe des Hamoglobins
nach Gleichung 3 reagieren.
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Diese Reaktion ist stark vom pH-Wert abhangig. Bei einem
pH-Wert
von 9 treten beispielsweise starke Vernetzungen und Farbbildung auf, wahrend die
Reaktion bei einem pll-Wert von 7 offensichtlch zu einem eringeren Vernetzungsgrad
führt.
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Durch Steuerwlg des pH-Wertes lassen sich also beliebige Vernetzungsgrlde
erzeugen, so daß unterschiedlich hohe Molekulargewichte die aus mehreren Matrix-
und Hämoglobineinheiten herrühren, erhalten werden können.
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Wenn die Brücke B endstandige funktionelle Gruppen aufweist, die nicht
mit einer Hydroxygruppe der Matrix reagieren können, muß diese Hydroxygruppe der
Matrix aktiviert werden, wobei häufig eine milde Oxidation mit Natriumperjodat nach
folgender Gleichung 4 bevorzugt ist
Es können jedoch auch andere reaktive Stoffe, beispielsweise Acylhalogenide, Alkylhalogenide,
Isocyanate oder Bromcyan eingesetzt werden.
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Das nach Gleichung 4 erhaltene Produk- kann beispielsweise mit der
Aminogruppe als endstandige Gruppe der Brücke B nach Gleichung 5
unter Bildung einer Schiff'schen Base umgesetzt-werden. Da derartige Schiff-Basen
häufig nicht besonders stabil sind und zur Bildung von Folgeprodukten neigen, werden
sie vorzugsweise mit Natrium- oder Lithiumborhydrid, je nach dem eingesetzten Lösungsmittel,
hydriert.
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Wenn die endstandige reaktive Gruppe cer Brücke B eine Aldehyd-Gruppe
ist, soerfolgtdie Kupplung mit der gemaß Gleichung 5 aktivierten Matrix mit Hilfe
einer Verbindung mit zwei endstandigen Aminogruppen der allgemeinen Formel H2N-(CH2)
rn-NH2 (IV) in der m die Bedeutung von 0 (Hydrazin) besitzt oder eine ganze Zahl
von 1-14 darstellt.
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Die Verbindung mit der allgemeinen Formel IV reagiert nach folgender
Gleichung 6 M-CHO fH2N-(C;t ) -NH. +OCH-B- -- M-CHPN(CH,) -N=CH-B- (6) mit den beiden
Aldehydgruppen der Matrix und der Brücke unter Bildung einer doppelten Schiff'schBase.Bevorzugt
ist bei dieser Jmsetzung die Verwendung von Hydrazin. Weiterhin ist bevorzugt, daß
die nach Gleichung 6 erzeugten Schiff' schen Basen hydriert werden.
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Setzt man gemaß Gleichung 6 eine Brücke mit zwei endständigen Aldehydgrup})en,
also einen Dialdehyd ein, wie Malondialdehyd, Succindialdehyd, Glutardialdehyd und
dgl., dann ist der Reaktionsmechanismus dieser Dialdehyde häufig nicht gesichert,
da sowohl die Aldehydgruppen unter Bildung von Schiff'schen Basen als auch die durch
Keto-Enol-Tautomerie gebildeten Doppelbindungen gemäß der Michael-Addition (Reaktion
mit aktiven Methylengruppen oder Stickstoffatome enthaltenden Funktionen) m:it der
endstandigen Aminogruppe reagieren können. Der Gluardialdehyd der Formel IV OHC-
(CH2)4 - OHO (1v) legt häufig trimerisiert in seiner crotonisierten Form der allgemeinen
Formel V vor
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Reaktion des trimerisierten Glutardialdehyds
mit dem Reaktionsprodukt aus Hydrazin und der aktivierten Matrix gemaß Gleichung
4 einerseits und dem zell freien Hämoglobin andererseits. Nach der Wahl des pH-Werts
können entweder die freien Carbonylfunktionen des trimerisierten Glutardialdehyds
oder aber die Doppelbindungen mit aktiven Wasserstoffatomen, beispielsweise der
Amino-oder Thiogruppe reagieren. Da die Brücke B lediglich als spacer, also zur
Erzeugung eines bestimmten Abstandes zwischen Matrix und Hamoglobin dienen soll,
können beide Reaktionsarten gleichermaßen zur Brücken
bildung eingesetzt
werden.
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Diese Reaktionen sind in der nachfolgenden Gleichung 7 a und 7 b gezeigt,
in der der trimerisiesrte Glutardialdehyd verkürzt dargestellt ist, wobei die Gruppen
X und Y die nicht in die Reaktion eingreifende Reste der Glutardialdehyd der allgemeinen
Formel V darstellen.
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Die nach Gleichung 1, 5, 6 und 7 erhaltenen Produkte aus der Umsetzung
der Matrix M mit einer BrUck B werden nach der Gleichung 8
in der Z eine funktionelle Gruppe darstellt, mit Hämoglobin zum erfindungsgemßen
Endprodukt der aLlgemeinen Formel I umgesetzt. Als Gruppe Z kommen ciie Carboxyl-,
Amid-, Carbonyl-, Amino-, Thio-, oder Thiomethylgruppe in Frage. Die Gruppen mit
der Bedeutung Z kennen mit einer oder mit mehreren reaktiven Gruppen des Hämoglobinmoleküls
wie Amino-, Thio-, Carboxyl- oder Thiomethylgruppen reagieren. Weiterhin kann die
Gruppe Z auch eine Doppelbirdung, i)eispielsweise die Doppelbindung des trimerisierter
Glutaldialdehyds bedeuten, die mit aktivierten Wasserstoffen, beispielsweise der
Aminogruppe oder der Thiogruppe reagieren kann.
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Die nach Gleichung 4 erhaltene aktivierte Matrix kann auch mit einem
Hydrazid oder Dihydrazid einer « -Dicarbonsaure oder einer # -Aminocarbonsäure umgesetzt
werden, wobei eine mit einer Brücke versehene Matrix der allgemeinen Formel VI M-CHN-NH-CO-B
(VI)
erhalten wird. In der Formel VI ist wie in den vorstehenden
Formeln und Gleichungen die Bedeutung der endstandigen Gruppe offengehalten und
kann beispielsweise eine Gruppe der Bedeutung Z,eine Såurehydrazidgruppe und dgl.
sein.
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Die Kupplung dieser Gruppen mit aktiven Gruppen des HEmoglobinmoleküls
erfolgt entweder aufgrund ihrer eigenen Reaktivitat oder aber über aktivierte Zwischenzustande,
beispielsweise übzr N-Hydroxysuccinimide und dgl., wie sie beispielsweise aus der
Peptid -Synthese bekannt sind.
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Doppelbindungen lassen sich, wie bereits vorstehend festgestellt,
durch Hydrierung mit Alkalisazen von Borhydriden hydrieren. Übrig gebliebene Carbonylfunktionen
werden blokkiert, beispielsweise durch TES, das nachstehend beschrieben ist. Die
Zwischen- und Endprodukte werden üblicherweise gegen destilliertes Wasser dialysiert
und dadurch gereinigt.
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Die Umsetzung eines Brückenmoleküls mit der Matrix beträgt üblicherweise
5:1, vorzugsweise 1:1. Das dadurch erzeugte Zwischenprodukt: aus Brückenglied und
Matrix kann bis zu 5 HEmoglobinmoleS:Ule entnehmen und nimmt vorzugsweise ein HEmoglobinmoleS:tl
auf. Ein besonders bevorzugtes Endprodukt der allgemeinen Formel I besteht aus jeweils
einem Molekül Matrix, Brücke und Hämoglobin.
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Nachstehend werden die allgemeinen Reaktionsbedingungen beschrieben,
die zu den vorstehend beschriebenen Zwischen-und Endprodukten führen.
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Die Aktivierung von Polysacchariden durch Oxydation mit Perjodat gemaß
Gleichung 4 wird nach der Methode von Fleming et al, Acta biol med germ. Bd. 30
(1973) S. 177 durchgeführt, wobei man in Wasser oder alkoholischen Wassergemischen
arbeitet. Die Reaktionvtemperatur liegt normalerweise zwischen 0 und 50, vorzusrsweise
zwischen 5° C und der Raumtemperatur. Die Reaktionszeit hängt vom Substitutionsgrad
der Reaktionsteilnehmer, also beispielsweise der Hydroxyathylstarke HES ab und steigt
mit steigen-
dem Substitionsgrad an. Diu Abtrennung und Reinigung
des erhaltenen Produkts erfolgt durch Dialyse gegen aqua dest.
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Das mit Perjodat oxidierte Produkt wird bei einem pH-Wert von 3-7,
vorztgsweise 4,5-5,5 nit einem «,-Diamin oder einer t-Aminocarbonsaure gemäß Gleichlang
5 umgesetzt, wobei der pH-Wert unter Kontrolle gehalten wird. Es wird mit hohem
Überschuß an Diamin oder Aminocarbonsäure gearbeitet, um möglichst sämtliche CarbonyLgruppen
umzusetzen. Die Umsetzung erfolgt üblicherweise bei Raurntemperatur innerhalb einer
Zeit von 4-10 Stunden.
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Um restliche Carbonylfunktionen zu blockieren, wird beispielsweise
TES (N-Tris(Hydroxrmethyl-methyl-2-aminoethansulfonsaure)zugesetzt. Anschließend
erfolgt die Reinigung des Produkts wiederum durch Dialyse gegen aqua dest.
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Sofern ein Diamin mit der aktivierten Polysaccharidverbindung umgesetzt
worden ist, kann die endständige Aminofunktion mit Glutardialdehyd nach Gleichung
7 verlc:ngert werden, wobei vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7-E', insbesondere
bei 7,5 (Phosphatpuffer mit einer Phosphatkon entration von etwa 0,5 Mol.) gearbeitet
wird. Die in wässriger Lösung ablaufende Umsetzung erfolgt üblicherweise bei Temyteraturen
oberhalb der Raumtemperatur, vorzugsweise zwischen 30 und 500, insbesondere bei
370 C über einen Zeitraum von mehreren Tagen, vorzugsweise 15-25 Stunden. Die Reinigung
des Endproduktes erfolgt wiederum durch Dialyse gegen aqa dest.
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Falls das oxidierte Polysaccharidprodtkt mit einer endständigen Aminofunktion
gekuppelt wird, entsteht eine Schiff'sche Base gemäß Gleichung 5, deren Doppelbindung
ggf. durch Reduktion mit Natriumborhydrid in wässriger Lösung bei alkalischen Bedingungen
(pH ca. 9) beseitigt werden kann. Nach der Zugabe von NACH4 arbeitet man unterhalb
der Raumtemperatur zwischen 8 und 24 Stunden, vorzugsweise 12 Stunden weiter.
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Da bei Einsatz von NaBH4 neben der Reduzierung der Doppelbindungen
auch die übrig gebliebenen Carbonylgruppen zu
Hydroxygruppen reduziert
wurden, erübrigt sich die Zugabe von TES. Die übrigen Reaktionsteilnehmer werden
vom Reaktionsprodukt wiederum durch Dialyse gegen aqua dest. entfernt.
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Die Umsetzung mit Benzochinon gemäß Gleichung 2 erfolgt üblicherweise
unter Verwendung von Polysaccharid und p-Benzochinon, wobei das Benzochinon in einem
organischen LUsungsmittel, vorzugsweise Ethanol, gelöst wird. Um eine zu starke
Kopplung zu vermeiden wird bei einem pH-Wert von 6-8, vorzugsweise 7 gearbeitet,
wobei zweckmaßiger'weise wiederum Phosphatpuffer verwendet wird.
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Die vorstehend erhaltenen Zwischenprodukte, die ein Makromolekül als
Matrix und eine chemische Brücke aufweisen, werden mit dem freien Ende der chemischen
Brücke an zell freies Hämoglobin angekoppelt, wobei üblicherweise bei pH-Werten
von 8-11, vorzugsweise 9,5 (Bicarbonatpuffer) und Temperaturen von etwa 0-30, vorzugsweise
5-10 C gearbeitet wird.
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Hochmolekulare {ernetzungsprodukte werden anschließend durch Filtration,
beispielsweise durch Druckfiltration gereinigt.
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Das klare Filtrat läßt sich weiter in einer Ultrafiltrationsanlage,
beispieLsweise von der Firma AMICON, über eine Membran, bispielsweise die mit PM
10 bezeichnete Membran fraktionieren, sofern der pH-Wert auf 7,4 eingestellt wird.
Das erhaltene Produkt wird durch Gefriertrocknen in eine stabile Form überführt
und kann über lange Zeit aufbewahrt werden.
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Wenn andererseiHs als Brückenglied eine o-Aminocarbonsaure gemaß Gleichung
5 eingesetzt wird, kann das erhaltene Produkt durch Umsetzung seiner endstandigen
Carboxylgruppe mit aktivierenden Substanzen, beispielsweise N-Hydroxysuccinimide
oder EDAC (1 -Ätiyl-3-( 3-dimethylaminopropyl)-c'arbodiimid hydrochloridl umgesetzt
werden, wobei bei dem ersten Diimid wasserfrei und l)ei RDAC in Wasser gearbeitet
wird. Diese Umsetzung mit Dicylohexylcarbodiimid (DCC) ruht durch Reaktion mit N-Hydroxysuccinimicl
zu einem aktiven Ester, der mit einer Aminofunktion Unter Thiofunktion des Hamoglobins
zungewünschten
Endprodukt reagieren kann. Diese Reaktion von DCC
wird oblicherweise in wasserfreien organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Dioxan
durchgeführt, wobei ctie Umsetzungszeit zwischen einer und vier Stunden variieren
kann.
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Sofern jedoch ein wasserlösliches Carbodiimid, beispielsweise BDAC,
zum Einsatz kommt, kann dcs aus der Kopplung mit Polysaccharid und6;Aminocarbonsäure
erhaltene Produkt direkt in Wasser mit Hb, umgesetzt werden, wcbei wiederum die
Carboxylgruppe mit einer NH2 - oder SH-Gruppe des HG koppelt.
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Der pH-Wert ist zwischen 3 und 7, vorzugsweise bei pH 5 zu halten.
Die Umsetzungszeit liegt üblicherweise bei 3-15, vorzugsweise bei 6-8 Stunden.
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Der Reinheitsgrad der erhaltenen Komplexe kann durch schnelle GPC
überprüft und deren Molekulargewicht abgeschätzt werden.
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Weiter lassen sich folgende Parameter kontrollieren: Viskositat, Hämoglobin-Anteil,
Polysaccharid-Anteil, Methämoglobin-Gehalt, Osmolarität und pH-Wert.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 a) Oxidation 8,5 g Dextran bzw. HydroxyEthylstårke (HES)
(0,05 Mol) werden in 100 ml Wasser gelöst. Unter Rühren wird dann eine Lösung aus
1,2 g Natriumperjodat in 10 ml Wasser zugegeben. Die Mischung bleibt aber Nacht
bei +50 C stehen. Das Oxidationsprodukt wird dann gegen aqua dest.
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dialysiert.
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Die Reaktionsdauer wird mit wachsen(lem Substitutionsgrad bei HES
entsprechend verlangert.
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b) Umsetzung mitt Diamin Das dialysierte Oxidationsprodukt wird bei
einem pH-Wert von etwa 5 mit 20 ml einer 2- molaren Lösung von
Äthylendiamin
tropfenweise versetzt. Dabei muß der pH-Wert kontrolliert und evtl. nachjustiert
werden. Anschließend wird bei Raumtemperatur 6-10 Stunden vorsichtig gerührt.
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Die Lösung wird danach mit dem gleichen Volumen 0,1 M TES versetzt,
um üb-rschüssige Aldehydfunktionen zu blockieren.
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Zum Schluß wird wiederum gegen aqua dest. dialysiert.
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c) Umsetzung mit Glutardialdehyd wird Die Reaktionslösung/durch Zugabe
von festem KH 2PO4 und Na2HP04 auf pH 1,5 eingestellt, wobei eine Phosphatkonzentration
von 0,5 Mol erreicht werden soll. Diese gepufferte Lösung wird in 50 ml einer 25%-igen
wässrigen Glutardialdehydlösung eingerührt, wobei der pH-Wert kontrolliert und ggf.
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nachjustiert wird. Die Umsetzung erfolgt bei 370 C in Wasser, wobei
18 S1:unden vorsichtig gerührt wird. Zur Entfernung überschüssien Glutardialdehyds
wird gegen aqua dest.
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dialysiert.
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d) Kupplung mit Human-Hamoglobin 8 g Humanhamoglobin werden in 200
ml 0,2 M Bicarbonatpuffer pH 9,5 gelöst, Cann in einem Druckfiltrationsgerat (Sartorius)
über 3,nn Membrenfilter filtriert und in die aus Stufe c erhaltene Lösung eingerührt,
wobei diese Reaktion bei + 50 C durchgeführt wird.
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Nach Ablauf der Kupplungsreaktion, die durch analytische Gelchromatographie
verfolgt wird, wird wieder mit einem Filter der Porengröße 3 µm filtriert, um hochmolekulare
Vernetzungsprodukte abzutrennen. Das klare Filtrat wird zur weiteren Reinigung in
einer Ultrafriltrationsanlage (AMICON) über eine Membran PM 10 fraktioniert und
auf pH 7,4 umgepuffert. Die wassrige Lösung des HEmoglobin-Polysaccharid-Komplexes
wird anschließend gefriergetrocknet.
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Der Reinheitsgrad der Komplexe kann durch schnelle GPq überprüft und
deren Molekulargewicht abgeschätzt werden (Pitz, LeltIM, Chromatographia, Bd. 12,
(1979) S. 155). Weitere
Parameter bei der Qualitätskontrolle sind
Viskositat, HEmoglobin-Anteil, Polysaccharid-Anteil, moglobingehalt, Osmolaritat
und pH-Wert.
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Beispiel 2 Die Stufen a und b gemaß Beispiel 1 werden wiederholt,
wobei Jedoch anstelle von Athylendiamin Hydrazin eingesetzt wird.
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Das erhaltene Produkt, namlich eine Schiff'sche Base wird mit Natriumborhydrid
reduziert.
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Nach Abschluß der Reaktion mit Hydrazin bei pH 5 wird der pH-Wert
durch Zugabe von festem Na2OO3 auf 9,0 eingestellt.
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Danach werden 10 ml einer frisch bereiteten 5 M wässrigen NaBH4-LOsung
unter Rühren in kleinen Arteilen zugegeben. Es 0 wird 12 Stunden bei + 5 C weitergerührt,
wobei zu starkes Schäumen vermieden werden soll. Die Zugabe von TSS erübrigt sich,
da auch überschüssige Aldehydgruppen durch Natriumborhydrid reduziert werden. Zur
Entfernung von nicht umgesetztem Hydrazin sowie NACH, wird die Lösung gegen aqua
dest.
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dialysiert.
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di Die weitere Umsetzung mit Glutan/a@dehyd und Kupplung mit Hämoglobin
erfolgt entsprechend Beispiel 1.
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Beispiel 3 Die Stufe a gemaß Beispiel 1, also Oxidation mit Natriumperjodat
wird wiederholt. Anschließend erfolgt die Umsetzung mit #-Aminocarbonsäure.
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Zu einer Lösung aus 8 g oxidiertes Dextran (bzw. HES) werden bei einem
pH-Wert von 5 insgesamt 20 ml einer 2M Lösung von 6-Aminocapronsaure in Xthanol/Wasser
zugetropft. Dabei muß der pH-Wert kontrolliert und ggf. korregiert werden. Anschließend
wird bei Raumtemperatur 6-10 Stunden vorsichtig gerührt. Zur Blockierung überschüssiger
Aldehyd-Funktionen wird die Lösung mit dem gleichen Volumen 0,1 M TES versetzt und
noch weitere 3 Stunden gerührt. Anschließend wird gegen
aqua dest.
dia].ysiert. Die weitere Umsetzung mit Glutardialdehyd und Kupplung mit Hämoglobin
erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
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Beispiel 4 Das Polysaccharid wird wie in Beispiel 3 oxydiert und dann
mit einer wWAminocarbonsaure umgesetzt. Das erhaltene Produkt wird mit Carbodiimid
aktiviert und anschließend mit Hämoglobin gekuppelt.
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Das Reaktionsprodukt aus Polysaccharid und der-Aminocarbonsaure wird
unter Führen mit 8 g HumanhEmoglobinlösung in 100 ml Wasser versetzt. Der pH-Wert
wird dann mit verdünnter Salzsäure auf 4,7 - 5,0 eingestellt. Unter Rühren wird
20 mg EDAC hinzugefügt. Der pH-Wert wird anschließend sofort wieder auf 5,0 eingestellt.
Nach einer Reaktionszeit von etwa 6 Stundei wird das Carbodiimid durch Dialyse vollstandig
entfernt.
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Beispiel 5 8,5 g Dextran 70 bzw. HES 200/0,5 werden in 100 ml Phosphatpuffer
pH 7 aufeltSst und anschließend wird eine Lösung aus 5,4 g p-Benzochinon in 20 ml
Äthanol eingerührt. Zum Schluß der Reaktion wird nicht umgesetztes Benzochinon durch
Dialyse entfernt. Zur Kupplung werden 8,0 g Human-Hamoglobin in 200 ml Phosphat.-Pufter
pH 7 gelöst und mit der vorgelegten Dextran- (bzw. tES)-Benzochinon-Verbindung umgesetzt.
Die Umsetzung erfolgt bei + 50 C. Der erhaltene Hämoglobin-Polysaccharid-Komplex
wird - wie in Beispiel 1 beschrieben -gereinigt und analytisch untersucht.
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In den Fig. 1 und 2 sind Elutionsdiagramme und in den Fig.
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3 und 4 Absorptionsspektren der Umsetzungsprodukte dargestellt.
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Beispiel 3 einerseits und von Hämoglobin Kb andererseits/ Die Elutionsdiagramme
von Humanhämoglobin Hb, Dextran-70-Hämoglobin D 70--Hb sowie Dextran-250-HEmoglobin
D 250-Hb wurden auf Spheron P1000 durch schnelle GPC erhalten. Als chemische BrückE'
wurde 6-Aminocapronsäure eingesetzt. Sowohl aus den Elutionsdiagrammen als auch
den Absorptions-
spektren kann entnommen wenigen, daß die durch
die einzelnen Reaktionsteilnehmer erzeugten Endprodtkte eine Veranderung im Elutionsverhalten
als auch spektroskophische Veranderungen erzeugen, so daß sicher gestellt wird,
daß tatsächlich makromolekulare Kupplungsprodukte entstanden sind.