JP2011089125A - ヒドロキシアルキルデンプン誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
カー化合物の1級または2級アミノ基と反応させる方法により得ることができるヒドロキ
シアルキルデンプン誘導体に関する。特に好ましい実施形態によれば、本発明はヒドロキ
シアルキルデンプンをリンカー化合物の1級または2級アミノ基と反応させ、得られた反
応生成物をリンカー化合物の少なくとも1つの別の反応基を介してポリペプチド、好まし
くは糖タンパク質と、そして特に好ましくはエリスロポエチンと反応させることによる方
法により得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。特に好ましいヒ
ドロキシアルキルデンプンはヒドロキシエチルデンプンである。本発明に従って、ヒドロ
キシアルキルデンプン、そして好ましくはヒドロキシエチルデンプンを反応の前には酸化
されていないその還元末端でリンカー化合物と反応させる。
でアルファアミラーゼにより分解される。HESは炭水化物ポリマーアミロペクチンの置
換誘導体であり、これは95重量%までの濃度でコーンスターチに存在する。HESは有
利な生物学的特性を呈し、臨床で血液希釈治療において血漿増量剤として使用されている(非特許文献1および非特許文献2)。
ド結合が存在し、分岐部位にはアルファ−1,6−グリコシド結合が見出される。この分
子の物理化学的特性は主にグリコシド結合の型により決定される。割り込んだ(nicked)
アルファ−1,4−グリコシド結合のために、らせん1回転あたり約6個のグルコースモ
ノマーを有するらせん構造が生み出される。ポリマーの物理化学的特性および生化学的特
性を、置換により改変することができる。アルカリ性ヒドロキシエチル化によりヒドロキ
シエチル基の導入を達成することができる。ヒドロキシエチル化に関して、反応条件を適
合させることにより、置換されていないグルコースモノマーの各々のヒドロキシ基の異な
る反応性を利用することが可能である。この事実により、当業者は置換パターンを限定的
に操ることができる。
る。
環系に適用されるポリペプチドの安定化である。これらのポリペプチドの1つの具体例は
エリスロポエチンであり、これは循環中の赤血球レベルを制御するのに必須であるおよそ
34,000kDaの酸性糖タンパク質である。
足できない安定性を呈するということである。特にエリスロポエチンは相対的に血漿半減
期が短い(特許文献3および特許文献4)。これは、治療用血漿レベルが急速に喪失され、静脈内投与を繰り返し行わなければならないということを意味している。さらに特定に環境では、ペプチドに対する免疫応答が観察される。
でき、ポリペプチドに対する免疫応答が低減されることは一般に認められている。特許文献2は、ポリエチレングリコール(PEG)で修飾された生理学的に活性なポリペプチドは免疫原性および抗原性の低減を呈し、そしてコンジュゲーションされていないタンパク質よりもかなり長く血流中で循環する、すなわちクリアランス率が延長されることを開示している。しかしながら、PEG薬物コンジュゲートはいくつかの不利益を呈し、例えばインビボ分解経路の構成要素により認識され得る天然構造を呈さない。従ってPEGコンジュゲートは別として、その他のコンジュゲートおよびタンパク質重合化物質が生成されている。種々のタンパク質および高分子、例えばポリメラーゼの架橋のための多くの方法が文献に記載されている(例えば非特許文献5を参照)。
ンジュゲーションされないという不利益を被る。結果的に、接合によりコンジュゲーショ
ン工程の間に3次元構造の崩壊のために不活性化し得る多くの成分を有する非常に異種性
の生成物が生じる。従って、安定性および/または生物活性が改善されている、さらに改
善されたHESポリペプチドコンジュゲートに関する必要性が存在する。
するHESの酸化形態を用い、ここで得られた生成物をポリペプチドと反応させるか、ま
たはさらに修飾して、続いてポリペプチドと反応させる。第1工程で天然のHESが概し
てその還元末端で、末端アルデヒド基および/またはヘミアセタール基のラクトンへの酸
化により選択的に酸化されなければならず、従って方法全体がさらに困難で、経費がかか
るものになっているのがこの方法の主要な不利な点である。
ないその還元末端で適当な化合物と反応させることを可能にするヒドロキシアルキルデン
プン誘導体を生成する方法を提供することである。
ないその還元末端で適当な化合物と反応させることを可能にするヒドロキシアルキルデン
プン誘導体を生成する方法を提供することであり、前記方法は、ヒドロキシアルキルデン
プンをその還元末端で適当な化合物との反応の反応生成物をさらに少なくとも1つの別の
化合物と反応させることを特徴とする。
好ましくはタンパク質、さらに好ましくはエリスロポエチンである前記方法を提供するこ
とである。
いないその還元末端で適当な化合物と反応させることを含む前記方法により得られるヒド
ロキシアルキルデンプン誘導体を提供することである。
ドロキシアルキル基で置換されているデンプン誘導体を意味する。従って、本発明で用い
るヒドロキシアルキルデンプンなる用語は、末端炭水化物部分が簡略にするために式(I
)で表されるようなヒドロキシアルキル基R1、R2および/またはR3を含む化合物に限
定されないだけではなく、末端炭水化物部分か、および/またはデンプン分子HAS’の
残りの部分のいずれかのどこかに存在する、少なくとも1つのヒドロキシ基がヒドロキシ
アルキル基R1、R2またはR3により置換されている化合物をも意味する。
基でよい。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は1から10個の炭素原子、さらに好まし
くは1から6個の炭素原子、さらに好ましくは1から4個の炭素原子、そしてなおさらに
好ましくは2から4個の炭素原子を含有する。従って、「ヒドロキシアルキルデンプン」
は好ましくはヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシ
ブチルデンプンを含み、ここでヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデン
プンが特に好ましい。
もまた可能である。
ドロキシ基を含有できる。好ましい実施形態によれば、HASに含まれる少なくとも1つ
のヒドロキシアルキル基は1つのヒドロキシ基を含有する。
換されている誘導体をも含む。この文脈では、アルキル基はHASが水溶性のままであれ
ば、ハロゲン、特にフッ素で、またはアリール基で置換されているのが好ましい。さらに
ヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化されていてよい
。
いることもできる。
に加えて、その他のデンプン誘導体を本発明の文脈で使用することもできる。例えば、エ
ステル化ヒドロキシ基を含む誘導体が有用である。これらの誘導体は、例えば2から12
個の炭素原子を有する非置換モノまたはジカルボン酸の誘導体かまたはその置換誘導体で
よい。2から6個の炭素原子を有する非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体
が特に有用である。この文脈では、アセチルデンプン、ブチルデンプンおよびプロピルデ
ンプンが好ましい。
いるのが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体もまた本発
明の文脈で適している。
ル残基に関して前記したものと同一でよい。
al.,Comprehensive Cellulose Chemistry Vo
l.2,1998,Whiley−VCH,Weinheim,New York,es
pecially chapter4.4,Esterification of Ce
llulose(ISBN 3−527−29489−9)参照)。
。
前記した方法にも関する。
2つの可能性がある。
1.全てのグルコース部分(DS)に関して、置換グルコースモノマーの部分に相対的
に置換の程度を記載することができる。
2.「モル置換度」(MS)として置換の程度を記載することができ、その場合グルコ
ース部分あたりのヒドロキシエチル基の数を記載する。
ーンに関して互いに異なっている多分散系組成物として存在する。従って、HESは、分
子量の異なる化合物の混合物である。結果的に、特定のHES溶液は統計学的手段の助け
を借りて、平均分子量により決定される。この文脈で、Mnは分子の数に依存して算術平
均として計算される。また別に、重量平均、MwはHESの質量に依存する単位を表す。
kDaでよく、5〜100kDaの平均分子量が好ましい。ヒドロキシエチルデンプンは
さらに0.1〜0.8のモル置換度、およびヒドロキシエチル基に関して2〜20の範囲
のC2:C6置換間の比率を呈する。
よる化合物と依然反応できれば特別な制限は与えられていない。好ましい実施形態によれ
ば、R1、R2およびR3は独立して、水素または1から10個の炭素原子を有するヒドロ
キシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基またはヒドロキシアル
カリール基である。水素および1から6個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基が好
ましい。アルキル、アリール、アラルキルおよび/またはアルカリール基は直鎖状または
分岐し、適当に置換されてよい。
原子を有する直鎖状もしくは分岐したヒドロキシアルキル基である、前記した方法にも関
する。
ブチル、ヒドロキシプロピル、例えば1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル
、3−ヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシイソプロピル、2−ヒドロキシイソプロピル
、ヒドロキシエチル、例えば1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、またはヒド
ロキシメチルでよい。水素およびヒドロキシエチル基が好ましく、水素および2−ヒドロ
キシエチル基が特に好ましい。
ル基である前記した方法にも関する。
で化合物(II)を、化合物(I)との反応の前に別の化合物と反応させてヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体を得ることができる。化合物(II)に関して、化合物(II)を
酸化されていないその還元末端でR’およびR”を架橋するNH基を介して化合物(I)
と反応させてヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得ることができる場合、特別な制限は
ない。
ル、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリールまたはシクロアルキルアリール
残基であり、ここでシクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、
アルカリールまたはシクロアルキルアリール残基は化合物(II)のR’およびR”を架
橋するNH基に直接連結されているか、または別の実施形態によれば、化合物(II)の
R’およびR”を架橋するNH基への酸素橋により連結されていてよい。アルキル、アリ
ール、アラルキルまたはアルカリール残基は適当に置換されていてよい。好ましい置換基
として、ハロゲン、例えばF、ClまたはBrに言及することができる。特に好ましい残
基R’は水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、そしてさらに好ましいのは水素およ
び非置換アルキルおよびアルコキシ基である。
コキシ基である前記した方法にも関する。
る基が好ましい。さらに好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキ
シ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、
エチル、メトキシ、エトキシであり、そして特に好ましいのはメチルまたはメトキシであ
る。
にも関する。
の少なくとも1つのさらなる官能基Wは概してR”のどこにあってもよい。好ましくは、
Wは、R’が連結されるNH基に直接連結される。
して特別な制限はない。好ましい実施形態では、官能基Wは構造単位−NH−および/ま
たは構造単位−(C=G)−(式中、GはOまたはSである)および/または構造単位−
SO2−を含む。さらに好ましい実施形態によれば、官能基Wは;
(式中、Gが2つ存在する場合、それは独立して、OまたはSである)
からなる群から選択される。
り、特別の制限は存在しない。概して、少なくとも1つの別の化合物との反応を可能にす
る全ての官能基が可能である。
の化合物との全ての種類の相互作用が可能である。特に、共有結合、イオン結合および/
またはファンデルワース結合を形成するに至る少なくとも1つの官能基Xと別の化合物と
の反応が可能であり、共有結合が特に好ましい。
・C−C二重結合またはC−C三重結合または芳香族C−C結合;
・チオ基またはヒドロキシ基;
・アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド;
・1,2−ジオール;
・1,2−アミノアルコール;
・アミノ基−NH2または構造単位−NH−を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノア
ルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基;
・ヒドロキシルアミノ基−O−NH2、または構造単位−O−NH−を含むヒドロキシ
ルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミ
ノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキサルアルカリールアミノ基;
・各々構造単位−NH−O−を含むアルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、ア
ラルキルオキシアミノ基、またはアルカリールオキシアミノ基;
・カルボニル基、−Q−C(=G)−Mを有する残基であって、ここで、GはOまたは
Sであり、Mは例えば、
・−OHまたは−SH;
・アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリールオ
キシ基;
・アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリールチオ
基;
・アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボ
ニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基;
・活性化エステル、例えばイミド構造、例えばN−ヒドロキシスクシンイミドを有
するか、もしくはNがヘテロアリール化合物の一部である構造単位O−Nを有するヒドロ
キシルアミンのエステル、またはG=OおよびQは不在である、例えば置換アリール残基
、例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトロクロロフェニルを有す
るアリールオキシ化合物;
であり、
ここで、Qは不在であるかまたはNHもしくはヘテロ原子、例えばSもしくはOである
;
・−NH−NH2、または−NH−NH−;
・−NO2;
・ニトリル基;
・カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基;
・カルボキシ基;
・−N=C=O基または−N=C=S基;
・ハロゲン化ビニル基、例えばヨウ化ビニルもしくは臭化ビニル基またはビニルトリフ
ラート;
・−C≡C−H;
・−(C=NH2Cl)−Oアルキル;
・−(C=O)−CH2−Halの基であって、ここでHalはCl、Br、またはI
である;
・−CH=CH−SO2−;
・−S−S−構造を含むジスルフィド基;
NH−O−アルキル、−(C=G)−NH−NH2、−G−(C=G)−NH−NH2、−
NH−(C=G)−NH−NH2、および−SO2−NH−NH2からなる群(式中、Gは
OまたはSであり、Gが2つ存在する場合、これは独立して、OまたはSである)から選
択される、前記した方法にも関する。
キシアミノ基が特に好ましく、特にメトキシアミノ基−NH−O−CH3が好ましい。
物と直接反応できないが、所望の方法で反応できるように化学的に修飾することができる
基でよい。化合物(II)に含まれる官能基Xのこの修飾を化合物(II)と化合物(I
)との反応の前か、または化合物(II)と化合物(I)との反応の後のいずれかに実施
することができる。化合物(II)が少なくとも2つの、任意選択的に化学的に異なる官
能基Xを含む場合、化合物(II)と化合物(I)との反応の前に少なくとも1つの官能
基Xを、および化合物(II)と化合物(I)との反応の後に少なくとも1つの官能基X
を修飾することが可能である。
れてアルデヒド基またはケト基を形成する1,2−アミノアルコールまたは1,2−ジオ
ールが挙げられる。
できる。従って、本発明の1つの実施形態によれば、官能基XはR”と同等である。Xが
R’およびR”を架橋するNH基に直接連結されている化合物の具体例は、特に、
またはアリールまたはアラルキルまたはアリールシクロアルキルまたはアルカリールまた
はシクロアルキルアリール基(式中、これらの基は少なくとも1つのヘテロ原子、例えば
N、O、Sを含むことができ、そしてこれらの基は適当に置換されていてよい)により、
R’およびR”を架橋するNH基を少なくとも1つの官能基Xから隔離することができる
。R’およびR”を架橋するNHを隔離する基、および少なくとも1つの官能基Xの大き
さは特定の必要性に適合させることができる。一般に、隔離基は概して1から60個、好
ましくは1から40個、さらに好ましくは1から20個、さらに好ましくは1から10個
、さらに好ましくは1から6個、そして特に好ましくは1から4個の炭素原子を有する。
ヘテロ原子が存在する場合、隔離基は概して1から20個、好ましくは1から8個、およ
び特に好ましくは1から4個のヘテロ原子を含む。本発明の特に好ましい実施形態によれ
ば、隔離基は1から4個の酸素原子を含む。隔離基は、例えば5から7個の炭素原子を有
する、任意に分岐していてもよいアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基を
含むことができるか、またはアルキル部分が直鎖状および/または環状アルキル基でよい
アラルキル基、アルカリール基でよい。なおさらに好ましい実施形態によれば、隔離基は
1から20個、好ましくは1から8個、さらに好ましくは1から6個、さらに好ましくは
1から4個、そして特に好ましくは2から4個の炭素原子のアルキル鎖である。ヘテロ原
子が存在する場合、1から4個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
当に置換されていてよい。好ましい置換基は、例えばF、Cl、BrまたはIなどのハロ
ゲン化物である。
予め決定された部位で得られた化合物が容易に切断されることを可能にする1つまたはそ
れ以上の切断部位、例えば、
エチル]ヒドロキシルアミンまたはカルボヒドラジドである、前記した方法にも関する。
ラル中心に関してR立体配座で、またはS立体配座で、またはラセミ化合物として存在す
ることができる。
の反応の前に少なくとも1つの別の化合物と反応した化合物(II)と反応することがで
きる。
とができる。各々の溶媒または2つまたはそれ以上の溶媒の混合物を化合物(I)および
(II)の反応条件および化学的特性の特定の必要性に適合させることができる。本発明
の特に好ましい実施形態によれば、溶媒として水を単独、または少なくとも1つのその他
の溶媒との組み合わせのいずれかで用いる。少なくとも1つのその他の溶媒として、DM
SO、DMF、メタノールおよびエタノールが挙げられる。水以外の好ましい溶媒はDM
SO、DMF、メタノールおよびエタノールである。
した方法にも関する。
基づいて、少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも50重量%、さらに好ましくは
少なくとも80重量%、なおさらに好ましくは少なくとも90重量%から、または100
重量%までの範囲で水を含む溶媒、または水を含む溶媒の混合物を意味する。好ましい反
応溶媒は水である。
体に至るのであれば、特定の制限は存在しない。
はヒドラジドである場合、温度は好ましくは5から45℃の範囲、さらに好ましくは10
から30℃の範囲、そして特に好ましくは15から25℃の範囲である。
度は好ましくは100℃までの範囲、さらに好ましくは20から95℃の範囲、さらに好
ましくは25から90℃の範囲、さらに好ましくは70から90℃の範囲、そして特に好
ましくは75から85℃の範囲である。
、化合物(I)および化合物(II)の反応が5から45℃の温度で行われる前記した方
法にも関する。
(II)の反応が25から90℃の温度で行われる前記した方法にも関する。
れてよい。
でき、概して1時間から7日間の範囲である。
くは1時間から3日間、そしてさらに好ましくは2時間から48時間の範囲である。
ましくは2時間から7日間の範囲である。
学的特性に適合させることができる。
は4.5から6.5の範囲である。
しくは8から12の範囲である。
、化合物(I)および化合物(II)の反応が4.5から6.5のpHで行われる前記し
た方法にも関する。
(II)の反応が8から12のpHで行われる前記した方法にも関する。
25℃、およびpH約5.5であり、また化合物(I)および化合物(II)の反応が還
元的アミノ化である場合、反応温度約80℃、およびpH約11である。
することができる。好ましい緩衝液の中で、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸塩またはホウ
酸塩緩衝液が挙げられる。
れた反応生成物を少なくとも1つの官能基Xを介して少なくとも1つの別の化合物と反応
させる。
Xを少なくとも1つの適当な保護基で保護することができる。この点に関して、保護され
た化合物(II)が少なくとも1つの官能基Xを介して化合物(I)と反応することを防
ぐ全ての考え得る保護基が可能である。従って、保護基を、保護される官能基Xの化学的
特性に依存して、例えば反応を行う溶媒または反応混合物のpHに依存して選択すること
ができる。好ましい保護基は、特にベンジルオキシカルボニル基、tert−ブトキシカ
ルボニル基、メトキシフェニル基、2,4−ジメトキシフェニル基、トリアリールメチル
基、トリチル、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメチルトリチル基
、ジメチルトリチル基、トリフルオロアセチル基、フタルイミン化合物、2−(トリアル
キルシリル)エトキシカルボニル化合物、Fmoc、tert−ブチル基、またはトリア
ルキルシリル基である。
つの基を保護することができるが、一方少なくとも1つの別の基を保護せずにおくことが
できる。
残すか、または適当な方法、例えば当業者に公知の慣用される方法により除去することが
できる。2つの異なる官能基Xを適当な保護基で保護する場合、少なくとも1つの官能基
Xを少なくとも1つの別の化合物との別の反応に利用できるようにするために、少なくと
も1つの保護基を除去し、そして化合物(I)と化合物(II)との反応生成物が別の化
合物と反応するまで、少なくとも1つの別の官能基を保護されたままにすることができる
。その後、依然保護されている官能基の保護基を除去して、残りの官能基Xをさらに別の
化合物との反応に利用可能にすることができる。
た化合物(II)、すなわち多HAS置換化合物(II)からなるヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体に至るのを防御するのに重要である。しかしながら、化合物(I)を過剰の
化合物(II)と反応させることにより同一の結果を達成することができる。過剰量の化
合物(II)を本発明の方法で用いる場合、化合物(II)の化合物(I)に対するモル
比は、2から100の範囲であるのが好ましい。
とも1つの適当な方法により反応混合物からそれを単離することができる。必要に応じて
、少なくとも1つの適当な方法による単離の前に、反応生成物を沈殿させることができる
。
存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも1つの溶媒または溶媒混合物と接触させ
ることが可能である。溶媒として水を用いる本発明の特に好ましい態様によれば、反応混
合物をエタノールおよびアセトンの混合物、好ましくは1:1混合物(これは好ましくは
−20から+50℃の範囲、そして特に好ましくは0から25℃の範囲の温度で前記化合
物が等量であることを示している)と接触させる。
うことができる。本発明の好ましい態様によれば、適当な方法、例えば遠心または濾過に
より、反応生成物を最初に反応混合物または反応物混合物と例えばエタノール・アセトン
混合物との混合物から分離する。第2の工程では、分離した反応生成物を別の処理、例え
ば透析、遠心濾過または加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、MPLC
、ゲル濾過および/または凍結乾燥のような後処理に供することができる。なおさらに好
ましい態様に従って、分離した反応生成物を最初に好ましくは水に対して透析し、次に、
生成物の所望の規格に従って、反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで凍結乾燥する
。20から35℃、好ましくは25から30℃の温度で凍結乾燥を行うことができる。
成物に含まれる少なくとも1つの官能基Xを介してさらに少なくとも1つの別の化合物と
反応させることができる。
化合物を用いることができる。この反応に関して、1つまたはそれ以上の適当な溶媒を用
いることができ、全ての反応パラメーター、例えば反応中の温度、反応時間、反応物質の
比率または反応混合物のpH値を特定の必要性に適合させることができる。
ことができる少なくとも1つの化合物はポリペプチドまたは少なくとも2つの異なるポリ
ペプチドの混合物である。
I)に含まれる官能基Xを介してポリペプチドと反応させる前記した方法にも関する。
することができる少なくとも1つの別の化合物は、化合物(I)および化合物(II)の
反応生成物と少なくとも1つの官能基Xとの第1の化学結合、および第2の別の化合物と
の第2の化学結合を形成できる架橋化合物である。
なくとも2つの異なるポリペプチドの混合物である。
第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を架橋化合物と反応させて第2のヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体を得ることが可能である。この第2のヒドロキシアルキルデンプン
誘導体を続いて第2の別の化合物、好ましくはポリペプチドと反応させて第3のヒドロキ
シアルキルデンプン誘導体を得ることができる。
ルキルデンプン誘導体を、架橋化合物と第2の別の化合物、好ましくはポリペプチドとの
反応生成物と反応させることも可能である。
物(II)の反応生成物に含まれる官能基Xの反応を介して、化合物(I)および化合物
(II)の反応生成物を、架橋化合物である別の化合物と反応させる前記した方法にも関
する。
I)の反応生成物に含まれる官能基Xの反応を介して、化合物(I)および(II)の反
応生成物を、架橋化合物である別の化合物と反応させ、前記架橋化合物は化合物(I)お
よび(II)の反応生成物との反応の前に第2の別の化合物と反応させている、前記した
方法にも関する。
ンであり、これを架橋化合物に含まれる官能基Xの反応を介して架橋化合物と反応させる
前記した方法にも関する。
反応させて第1の反応生成物が得られ、前記第1の反応生成物を第2の別の化合物と反応
させて第2の反応生成物が得られ、そして前記第2の反応生成物を化合物(I)と反応さ
せる前記した方法にも関する。
、好ましくはポリペプチドと反応させて第1の反応生成物が得られ、前記第1の反応生成
物を化合物(II)と反応させて第2の反応生成物が得られ、前記第2の反応生成物を化
合物(I)と反応させてヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる前記した方法にも
関する。
合物(I)および(II)の反応生成物と、第2の別の化合物との間の化学的架橋を形成
し、ここで架橋化合物と反応する第2の別の化合物の官能基が−SH基またはアルデヒド
基またはケト基であり、架橋化合物と反応する化合物(II)または化合物(I)および
化合物(II)の反応生成物の官能基は構造NH−、特に好ましくは−NH2を含む基で
ある。
び(II)の反応生成物と、少なくとも1つの所与の第2の別の化合物との間で結合を形
成できる化学的化合物に関する。第2の別の化合物の化学的特性に依存して、架橋化合物
は化合物(II)または化合物(I)および(II)の反応生成物に含まれる官能基Xと
反応することができる少なくとも1つの官能基V、並びに第2の別の化合物と化学的結合
を形成することができる少なくとも1つの別の官能基を含む。架橋化合物に含まれるこの
少なくとも1つの別の官能基は官能基Xに関して前記で論じた型の官能基でよい。
の全体的な化学的架橋の長さを延長させ、および/または第2の別の化合物を用いて、ま
たは用いずに得られた反応生成物の化学的特性に影響を及ぼし、および/またはいくつか
の第2の別の化合物と化合物(I)、(II)および架橋化合物の反応生成物との間の結
合を形成できる可能性を提供することができ、および/または化合物(I)および(II
)の反応生成物に含まれる官能基Xを化学的に修飾して所与の別の化合物と反応できる前
記反応生成物を提供することができる。
能性を提供するために、前記で論じ、そして−NH2基である官能基Xと、別の化合物、
例えば、
の架橋化合物との反応の具体例である。
よい。
官能基Vまたは官能基Xは好ましくは
ら選択される。
エステル、または任意に活性化エステルに変換され得るカルボキシ基からなる群から選択
される。この特定の場合では、官能基Vまたは官能基Xは各々化学構造−NH−を含む。
る。2つの官能基の場合、架橋化合物はホモ二官能性かまたはヘテロ二官能性でよい。ホ
モ二官能性架橋化合物は、例えば化合物(I)と(II)との反応生成物と第2の別の化
合物との間で架橋を形成する可能性を提供し、反応生成物および別の化合物は同一の型の
官能基を有している。ヘテロ二官能性架橋化合物は、例えば化合物(I)と(II)との
反応生成物と第2の別の化合物との間で架橋を形成する可能性を提供し、反応生成物およ
び別の化合物は互いに反応できない官能基を有している。
は分岐したアルキルまたはシクロアルキルまたはアリールまたはアラルキルまたはアリー
ルシクロアルキルまたはアルカリールまたはシクロアルキルアリール基により隔離されて
いてよく、これらの基は少なくとも1つのヘテロ原子、例えばN、O、Sを含み、そして
これらの基は適当に置換されていてよい。架橋化合物の少なくとも2つの官能基を隔離す
る基の長さを特定の必要性に適合させることができる。一般に、隔離基は1から60個、
好ましくは1から40個、さらに好ましくは1から20個、さらに好ましくは1から10
個、さらに好ましくは5から10個の炭素原子を有している。ヘテロ原子が存在する場合
、隔離基は概して1から20個、好ましくは1から8個、そして特に好ましくは1から4
個のヘテロ原子を含む。なおさらに好ましい実施形態によれば、隔離基は炭素原子1から
20個のアルキルまたはアラルキル鎖である。さらに、架橋化合物は化合物(II)に関
して前記で論じた少なくとも1つの切断部位を含むことができる。
できる。
含む場合、少なくとも1つの別の化合物は各々のキラル中心に関してR立体配座で、また
はS立体配座で、またはラセミ化合物として存在し得る。
O)−NH−構造を伴う結合を介して連結される少なくとも2つのアミノ酸を含む化合物
を意味する。ポリペプチドは天然発生化合物または天然に発生しないポリペプチドでよく
、後者は天然発生アミノ酸および/または少なくとも1つの天然に発生しないアミノ酸を
含む。ポリペプチドの骨格、ポリペプチド鎖は少なくとも1つの適当な置換基でさらに置
換されてよく、従って少なくとも1つの側鎖を有してよい。少なくとも1つの官能基Yは
ポリペプチド骨格の、または骨格の少なくとも1つの置換基の一部でよく、ここで態様は
ポリペプチド骨格の一部である少なくとも1つの官能基およびポリペプチド骨格の少なく
とも1つの置換基の一部である少なくとも1つの官能基を含むことが可能である。
、制限は存在しない。前記官能基Yはポリペプチド骨格に直接連結されてもよく、または
骨格の側鎖の一部でよい。側鎖もしくは官能基Yのいずれか、または双方は、天然発生ポ
リペプチドの一部であるかまたは、官能基Xとの反応の前に、天然発生ポリペプチド、ま
たは少なくとも部分的に天然発生でないポリペプチドに導入されてよい。
好ましい実施形態では、ポリペプチドはヒト供給源のものである。
AT III、インターロイキン、特にインターロイキン−2、IFN−ベータ、IFN
−アルファ、G−CSF、CSF、インターロイキン−6および治療用抗体でよい。
IIIでよい(Levy JH,Weisinger A,Ziomek CA,Ech
elard Y,Recombinant Antithrombin:Product
ion and Role in Cardiovascular Disorder,
Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27
,4(2001)405−416;Edmunds T,Van Patten SM,
Pollock J,Hanson E,Bernasconi R,Higgins
E,Manavalan P,Ziomek C,Meade H,McPherson
J,Cole ES,Transgenically Produced Human
Antithrombin:Structural and Functional
Comparison to Human Plasma−Derived Antit
hrombin,Blood 91,12(1998)4661−4671;Minne
ma MC,Chang ACK,Jansen PM,Lubbers YTP,Pr
att BM,Whittaker BG,Taylor FB,Hack CE,Fr
iedman B,Recombinant human antithrombin
III improves survival and attenuates inf
lammatory responses in baboons lethally
challenged with Escherichia coli,Blood 9
5,4(2000)1117−1123;Van Patten SM,Hanson
EH,Bernasconi R,Zhang K,Manavaln P,Cole
ES,McPherson JM,Edmunds T,Oxidation of M
ethionine Residues in Antithrombin,J.Bio
l.Chemistry 274,15(1999)10268−10276))。
1a(Avonex(登録商標)、REBIF(登録商標)参照)およびIFNベータ1
b(BETASERON(登録商標)参照)である。
えば、Nagata et al.,The chromosomal gene st
ructure and two mRNAs for human granuloc
yte colony−stimulating factor,EMBO J.5:5
75−581,1986;Souza et al.,Recombinant hum
an granulocyte colony−stimulating factor
:effects on normal and leukemic myeloid
cells,Science 232(1986)61−65;and Herman
et al.,Characterization,formulation,and
stability of Neupogen(登録商標)(Filgrastim),
a recombinant human granulocyte−colony s
timulating factor,in:Formulalion,charact
erization,and stability of protein drugs
,Rodney Pearlman and Y.John Wang,eds.,Pl
enum Press,New York,1996,303−328。
プチドは例えば分子量、アミノ酸の数および/または配列、種々の程度のグリコシル化、
置換基の数および/または化学的特性または適当な化学結合、例えばジスルフィド架橋に
より連結されたポリペプチド鎖の数で異なっていてよい。
合物(I)および化合物(II)の反応生成物を、好ましくは少なくとも1つの前記した
方法に従って単離し、次に任意にさらに架橋化合物と反応させてもよい化合物(I)およ
び化合物(II)の反応生成物の少なくとも1つの官能基Xと反応できる少なくとも1つ
の官能基Yを有するポリペプチドと反応させて、少なくとも1つの化学的結合を形成させ
る。ポリペプチド、例えばタンパク質の官能基Yは、例えば、
化物部分である。
キシケトン、およびその化学的修飾を意味する(Rompp Chemielexiko
n,Thieme Verlag Stuttgart,Germany,9th ed
dition 1990,Volume 9、pages 2281−2285、および
そこで引用された文献)。さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸等
の天然発生炭水化物部分の誘導体をも意味する。用語はまた化学的酸化された天然発生炭
水化物部分をも含む。酸化された炭水化物部分の構造は環状または直鎖状でよい。
炭水化物側鎖の一部である。さらに好ましくは、炭水化物部分は炭水化物側鎖の末端部分
である。
好ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、本明
細書に後述するように末端シアル酸の除去、続く酸化による化合物(I)および化合物(
II)の反応生成物との反応に利用することができる。
鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端シアル酸残基に連結させる。
素酸での処理を含む(Chamow et al.,J.Biol.Chem.,267
:15916−15922(1992))。
部分も酸化することが可能である。しかしながら、穏やかな条件(厳しい条件である10
mMの過ヨウ素酸塩、室温で1時間とは対照的に、1mMの過ヨウ素酸塩、0℃)を選択
することにより、好ましくは炭水化物側鎖の末端シアル酸を酸化することができる。
のための酵素は当分野で公知であり、例えばガラクトースの場合、酵素はガラクトースオ
キシダーゼである。末端ガラクトース部分の酸化を意図する場合、シアル酸を炭水化物鎖
に付着させることができる細胞、例えば哺乳動物細胞において、または遺伝的に修飾され
ていて、シアル酸を炭水化物鎖に付着させることができる細胞においてポリペプチドが生
成された場合、末端シアル酸を(部分的または完全に)除去することが実際に必要である
。シアル酸を除去するための化学的または酵素的方法は当分野で公知である(Chapl
inおよびKennedy(eds.),1996,Carbohydrate Ana
lysis:a practical approach,especially Ch
apter 5 Montreuill,Glycoproteins,pages 1
75−177;IRL Press Practical approach seri
es(ISBN 0−947946−44−3))。
に含まれる酸化された炭水化物部分を介してポリペプチドと反応させる前記した方法にも
関する。
て、化合物(I)および(II)の反応生成物を、S原子をポリペプチドに含まれるいず
れかのチオ基から誘導できるチオエーテル基を介してポリペプチドに連結することができ
る。
ポリペプチドに導入することが可能である。特に化学的方法に言及することができる。ジ
スルフィド架橋がポリペプチドに存在する場合、−S−S−構造を還元してチオ基を得る
ことが可能である。アミノ基を介するポリペプチドと、その一方はアミノ基と反応するこ
とができ、他方はSH基かまたはSH基の前駆体である少なくとも2つの官能基を有する
化合物との反応により、ポリペプチドに存在するアミノ基をSH基に転換することも可能
である。アミノ基のこの修飾を、タンパク質が、少なくとも2つの異なる官能基を有し、
その一方はアミノ基と反応することができ、他方はSH基である化合物(L)と最初に反
応する一例と見なすことができ、得られた反応生成物を次いで例えば、HASおよび化合
物(D)を含み、SH基と反応することができる官能基を含むHAS誘導体と反応させる
。ポリペプチドの変異により、例えばシステインまたは適当なSH官能性アミノ酸をポリ
ペプチドに導入するか、または例えばポリペプチドからシステインを除去してポリペプチ
ドの別のシステインを無効にしてジスルフィド架橋を形成することによりSH基を導入す
ることも可能である。
応の結果である反応生成物とポリペプチドとを反応させるのが特に好ましい。
反応させ、得られた反応生成物をさらに、ポリペプチドに含まれる酸化された炭水化物部
分および/またはチオ基を介してポリペプチドと反応させる前記した方法にも関する。
。
4,An improved method for the purificatio
n of human erythropoietin with high in v
ivo activity from the urine of anemic pa
tients,Biol.Pharm.Bull.17(2),180−4;Miyak
e,Kung,Goldwasser,1977,Purification of h
uman erythropoietin.,J.Biol.Chem.,252(15
),5558−64参照)または別の哺乳動物供給源のものでよく、ヒト腎臓、胚性ヒト
腎臓、胚性ヒト肝臓または動物、好ましくはサル腎臓のような天然発生供給源からの精製
により得ることができる。さらに、「エリスロポエチン」または「EPO」なる表現はま
た、1つまたはそれ以上のアミノ酸(例えば1から25個、好ましくは1から10個、さ
らに好ましくは1から5個、最も好ましくは1または2個)が別のアミノ酸と交換されて
おり、エリスロポエチン活性を呈する(例えば欧州特許第640 619 B1号参照)
EPO変種をも包含する。エリスロポエチン活性の測定は当分野で報告されている(イン
ビトロ活性の測定に関して、例えばFibi et al.,1991,Blood,7
7:1203 ff;Kitamura et al.,1989,J.Cell Ph
ys.,140:323−334参照;EPOインビボ活性の測定に関して、Ph.Eu
r.2001,911−917;Ph.Eur.2000,1316 Erythrop
oietini solution concentrata,780−785;欧州薬
局方(1996/2000);欧州薬局方、1996,Erythropoetin c
oncentrated solution,Pharmaeuropa.,8,371
−377;Fibi,Hermentin,Pauly,Lauffer,Zettlm
eissl.,1995,N− and O−glycosylation mutei
ns of recombinant human erythropoietin s
ecreted from BHK−21 cells,Blood,85(5),12
29−36;(EPOおよび修飾されたEPO形態を雌NMRIマウスに1、2および3
日目に注射し(等量のタンパク質50ng/マウス)、4日目に血液サンプルを採取し、
網状赤血球を測定した))。EPOの活性の測定に関して試験する別の文献は、Barb
one,Aparicio,Anderson,Natarajan,Ritchie,
1994,Reticulocytes measurements as a bio
assay for erythropoietin,J.Pharm.Biomed.
Anal.,12(4),515−22;Bowen,Culligan,Beguin
,Kendall,Villis,1994,Estimation of effec
tive and total erythropoiesis in myelody
splasia using serum transferrin receptor
and erythropoietin concentrations,with
automated reticulocyte parameters,Leukem
i,8(1),151−5;Delorme,Lorenzini,Giffin,Ma
rtin,Jacobsen,Boone,Elliott,1992,Role of
glycosylation on the secretion and biol
ogical activity of erythropoietin,Bioche
mistry,31(41),9871−6;Higuchi,Oheda,Kubon
iwa,Tomonoh,Shimonaka,Ochi,1992;Role of
sugar chains in the expression of the bi
ological activity of human erythropoieti
n,J.Biol.Chem.,267(11),7703−9;Yamaguchi,
Akai,Kawanishi,Ueda,Masuda,Sasaki,1991,e
ffects of site−directed removal of N−gly
cosylation sites in human erythropoietin
on its production and biological proper
ties,J.Biol.Chem.,266(30),20434−9;Takeuc
hi,Inoue,Strickland,Kubota,Wada,Shimizu,
Hoshi,Kozutsumi,Takasaki,Kobata,1989,Rel
ationship between sugar chain structure
and biological activity of recombinant h
uman erythropoietin produced in Chinese
hamster ovary cells,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,85(20),7819−22;Kurtz,Eckardt,1989,Ass
ay methods for erythropoietin,Nephron.,5
1(1),11−4(German);Zucali,Sulkowski,1985,
Purification of human urinary erythropoi
etin on controlled−pore glass and silici
c acid,Exp.Hematol.,13(3),833−7;Krystal,
1983,Physical and biological characteriz
ation of erythroblast enhancing factor(E
EF),a late acting erythropoietic stimula
tor in serum distinct from erythropoieti
n,Exp.Hematol.,11(1),18−31に記載されている。
くは哺乳動物、昆虫、酵母、細菌細胞での、またはEPOの組換え生成に好都合であるい
ずれかその他の細胞型での生成が含まれる。さらに、EPOをトランスジェニック動物(
例えば乳、血液等のような体液において)において、トランスジェニック鳥、特に家禽、
好ましくはニワトリにおいて、またはトランスジェニック植物において発現することがで
きる。
ーでの宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの生成を可能にする条件下での宿
主細胞の培養、および宿主細胞からのポリペプチドの精製が含まれる。詳細な情報に関し
ては、例えば、Krystal,Pankratz,Farber,Smart,198
6,Purification of human erythropoietin t
o homogeneity by a rapid five−step proce
dure,Blood,67(1),71−9;Quelle,Caslake,Bur
kert,Wojchowski,1989,High−level expressi
on and purification of a recombinant hum
an erythropoietin produced using a bacul
ovirus vector,Blood,74(2),652−7;欧州特許第640
619 B1号、および欧州特許第668 351 B1号を参照のこと。
148 605 B2号参照)。
ている、すなわちEPOがグリコシル化されている1つまたはそれ以上の炭水化物側鎖、
好ましくは1から12個、さらに好ましくは1から9個、なおさらに好ましくは1から6
個、そして特に1から4個、特に好ましくは4個の炭水化物側鎖を含むことができる。通
常、EPOが真核細胞において生成される場合、ポリペプチドは翻訳後グリコシル化され
る。結果的に、炭水化物側鎖は哺乳動物、特にヒト、昆虫または酵母細胞における生合成
の間、EPOに付着していてよい。グリコシル化されたEPOの構造および特性は当分野
で広く研究されている(欧州特許第428 267 B1号;欧州特許第640 619
B1号;Rush,Derby,Smith,Merry,Rogers,Rohde
,Katta,1995,Microheterogeneity of erythr
opoietin carbohydrate structure,Anal Che
m.,67(8),1442−52;Takeuchi,Kobata,1991,St
ructures and functional roles of the sug
ar chains of human erythropoietins,Glyco
biology,1(4),337−46(Review)。
も1つ、好ましくは1から12個、さらに好ましくは1から9個、なおさらに好ましくは
1から6個、そして特に好ましくは1から4個のHAS分子を含むことができる。生成物
の加水分解および得られた単糖類の誘導体化の後、GC−MSを用いる炭水化物組成物の
定量的分析によりEPO分子あたりのHAS分子の数を決定することができる(Chap
lin and Kennedy(eds.),1986,Carbohydrate
Analysis:a practical approach,IRL Press
Practical approach series(ISBN 0−947946−
44−3),especially Chapter 1,Monosaccharid
es,page 1−36;Chapter 2,Oligosaccharides,
page 37−53,Chapter 3,Neutral Polysacchar
ides,page 55−96参照)。
側鎖の一部である。さらに好ましくは、炭水化物部分は炭水化物側鎖の末端部分である。
さらに好ましい実施形態によれば、炭水化物部分は炭水化物側鎖のガラクトース残基、好
ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。本明細書に後述するように、末端
シアル酸の除去、続く酸化により、このガラクトース残基を化合物(I)および化合物(
II)の反応生成物との反応で利用可能にすることができる。さらに好ましい実施形態で
は、化合物(I)および(II)の反応生成物を炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましく
は炭水化物側鎖の末端シアル酸残基に連結させる。本明細書に記載するようにシアル酸を
酸化する。
(I)および(II)の反応生成物、または官能基Xを介する化合物(I)および(II
)の反応生成物と架橋化合物との反応の反応生成物との反応で利用可能になる。
II)の反応生成物をEPOに含まれるチオ基と反応させることができる。
物を、その各々が少なくとも1つの別の化合物、好ましくはポリペプチド、さらに好まし
くはエリスロポエチンに含まれるチオ基および炭水化物部分と反応させることも可能であ
る。
ノオキシ)エチルメルカプタンを用いることにより(Bauer L.et al.,J
.Org.Chem.,30:949(1965))、またはヒドラジド誘導体、例えば
チオグリコール酸ヒドラジドを用いることにより(Whitesides et al.
,J.Org.Chem.,42:332(1977))このSH基を、好ましくは酸化
された炭水化物部分に連結させることができる。
、さらに好ましくはEPOの炭水化物側鎖の一部である酸化された炭水化物部分に導入す
る。
する。さらに好ましくは、EPOはヒトEPOのアミノ酸配列を有し、天然発生システイ
ンはシステイン29および/または33である。さらに好ましい実施形態では、任意に架
橋化合物と反応させてもよい、化合物(I)および化合物(II)の反応生成物をシステ
イン29と反応させるが、一方システイン33を別のアミノ酸と置換する。また別に、任
意に架橋化合物と反応させてもよい、化合物(I)および化合物(II)の反応生成物を
システイン33と反応させるが、一方システイン29を別のアミノ酸と置換する。
Oが野生型ポリペプチドには存在しないシステイン残基を含むことを示す。
た付加的なアミノ酸でよい。
発生アミノ酸を置換することにより付加することができる。好ましくは、本発明のこの態
様の文脈では、EPOはヒトEPOであり、置換されたアミノ酸残基はセリン126であ
る。
物と少なくとも1つの別の化合物との反応の反応条件を、例えば少なくとも1つの別の化
合物がポリペプチドである場合、または少なくとも1つの別の化合物が架橋化合物である
場合、または少なくとも1つの別の化合物が架橋化合物およびポリペプチドの反応生成物
である場合、各々の反応の特定の必要性に適合させることができる。前記した化合物の少
なくとも1つを緩衝液化合物として使用できることが好ましい。前記した溶媒の少なくと
も1つを溶媒または溶媒の混合物として使用できることが好ましい。単離および/または
後処理を実施することができ、その好ましい方法は前記で論じた方法から選択される。
チド、好ましくはEPOとさらに反応させる場合、反応のための溶媒として水を用いるの
が好ましい。水に加えて、少なくとも1つの別の溶媒が存在し得る。好ましい可能な別の
溶媒として、DMSO、DMF、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
、好ましくはEPOとの反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
てポリペプチドと反応した化合物(I)および(II)の反応生成物を含む所望のヒドロ
キシアルキルデンプン誘導体に至るのであれば、特別な制限は存在しない。反応の温度は
好ましくは4から37℃の範囲、さらに好ましくは10から30℃の範囲、特に好ましく
は15から25℃の範囲である。
との反応を4から37℃の温度で実施する前記した方法にも関する。
を保ってよい。
特定の必要性に適合させることができ、一般に0.5から48時間の範囲、好ましくは2
から24時間の範囲、そして特に好ましくは10から20時間の範囲である。
定の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。
H2である官能基Xと、ポリペプチドに含まれる少なくとも1つのアルデヒド基との反応
を介して別の化合物と反応させる場合、pH値は好ましくは約4.5から6の範囲、さら
に好ましくは約5.5である。
物、好ましくはEPOとさらに反応させる場合、反応のための溶媒として水を用いるのが
好ましい。水に加えて、少なくとも1つの別の溶媒が存在し得る。好ましい可能な別の溶
媒として、DMSO、DMF、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
の反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
て架橋化合物と反応した化合物(I)および(II)の反応生成物を含む所望のヒドロキ
シアルキルデンプン誘導体に至るのであれば、特別な制限は存在しない。反応の温度は好
ましくは4から37℃の範囲、さらに好ましくは10から30℃の範囲、特に好ましくは
15から25℃の範囲である。
の反応を4から37℃の温度で実施する前記した方法にも関する。
を保ってよい。
定の必要性に適合させることができ、そして一般に10分から10時間の範囲、好ましく
は20分から5時間の範囲、そしてさらに好ましくは30分から2時間の範囲である。
の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。
応生成物に含まれ、そしてアミノ基NH2である官能基Xを介して架橋化合物である架橋
化合物と反応させる場合、pH値は好ましくは約7から8.5の範囲、さらに好ましくは
約7.2である。
ばポリペプチド、好ましくはEPOとさらに反応させる場合、反応のための溶媒として水
を用いるのが好ましい。水に加えて、少なくとも1つの別の溶媒が存在し得る。好ましい
可能な別の溶媒として、DMSO、DMF、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
)の反応生成物とポリペプチドとの反応を水系で実施する前記した方法にも関する。
に含まれる少なくとも1つの官能基Xを介してポリペプチドとさらに反応した、化合物(
I)および(II)の反応生成物を含む所望のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生ず
るのであれば、特別な制限は存在しない。反応の温度は好ましくは4から37℃の範囲、
さらに好ましくは10から30℃の範囲、特に好ましくは15から25℃の範囲である。
)の反応生成物とポリペプチドとの反応を、4から37℃の温度で実施する前記した方法
にも関する。
を保ってよい。
プチドとの反応の反応時間を特定の必要性に適合させることができ、一般に0.5から4
8時間の範囲、好ましくは2から24時間の範囲、そして特に好ましくは10から20時
間の範囲である。
ペプチドとの反応のpH値を特定の必要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させるこ
とができる。
架橋化合物に含まれ、そしてアミノ基NH2である官能基Xを介してポリペプチドと反応
させる場合、pH値は好ましくは約7から8.5の範囲、さらに好ましくは約7.2であ
る。
り調整することができる。好ましい緩衝液の中で、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリ
ウム緩衝液またはホウ酸緩衝液が挙げられる。
ある少なくとも1つの別の化合物との反応から得られた反応生成物、並びに化合物(I)
、化合物(II)、架橋化合物およびポリペプチドの反応から得られた化合物を含む反応
生成物を、少なくとも1つの適当な方法により反応混合物から単離し、少なくとも1つの
別の処理、例えば少なくとも1つの後処理、例えば透析および/または凍結乾燥に供する
ことができる。
応混合物から単離することができる。
ことができる。
しくは遠心により、反応生成物を最初に反応物混合物または反応混合物の混合物から分離
する。第2の工程では、分離した反応生成物を別の処理、例えば透析および/または凍結
乾燥のような後処理に供することができる。なおさらに好ましい実施形態によれば、分離
された反応生成物を最初に好ましくは水に対して透析し、次に生成物の所望の規格に従っ
て、反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで凍結乾燥する。
するように反応生成物を単離するのが好ましい。
化合物と反応させる。すなわち化合物(I)との反応の前に、前記するような少なくとも
1つの官能基Xを介して化合物(II)と少なくとも1つの官能基Yを含む少なくとも1
つの別の化合物との反応により化合物(II)の誘導体を生成する。
Oと反応する場合、反応のための溶媒として水を用いるのが好ましい。水に加えて、少な
くとも1つの別の溶媒が存在し得る。好ましい可能な別の溶媒として、DMSO、DMF
、メタノールまたはエタノールが挙げられる。
しくはポリペプチド、なおさらに好ましくはEPOとの反応を水系で実施する前記した方
法にも関する。
る少なくとも1つの別の化合物、好ましくはポリペプチド、さらに好ましくはEPOと反
応した化合物(II)の反応生成物を含む所望の化合物(II)の誘導体に至るのであれ
ば、特別な制限は存在しない。反応の温度は好ましくは4から37℃の範囲、さらに好ま
しくは10から30℃の範囲、特に好ましくは15から25℃の範囲である。
37℃の温度で実施する前記した方法にも関する。
を保ってよい。
要性、例えば反応物質の化学的特性に適合させることができる。反応混合物の適当なpH
値を少なくとも1つの適当な緩衝液の添加により調整することができる。好ましい緩衝液
の中で、酢酸塩、リン酸塩またはホウ酸塩緩衝液、例えば酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸
ナトリウム緩衝液またはホウ酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。
反応から得られた反応生成物を反応混合物から単離し、少なくとも1つの別の処理、例え
ば少なくとも1つの後処理、例えば透析および/または凍結乾燥に供することができる。
と、少なくとも1つの適当な方法によりこれを反応混合物から単離することができる。
物の単離を実施することができる。
化合物との反応の前に化合物(II)のR’およびR”を架橋するNH基を適当な保護基
で保護することができる。保護基として前記した保護基の1つを用いることができる。化
合物(II)および少なくとも1つの別の化合物、例えばポリペプチド、好ましくはEP
Oの反応生成物と化合物(I)との反応の前に、少なくとも1つの適当な方法により保護
基を除去する。
と反応させる場合、全ての反応条件をこれらの反応の特定の必要性に対して調整すること
ができる。特に前記した緩衝液系および/または溶媒を用いることができる。
化合物(I)と反応させる。
とができる。特に、前記した緩衝液系および/または溶媒を用いることができる。
物のの反応生成物と化合物(I)との反応から得られた反応生成物を各々の反応混合物か
ら単離し、少なくとも1つの別の処理、例えば少なくとも1つの後処理、例えば透析およ
び/または凍結乾燥に供することができる。この文脈で、前記した各々の適当な方法を用
いることができる。
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、RP−HPLC、ヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは少なくとも2つの
その方法の組み合わせを用いることにより、架橋化合物を伴うかまたは伴わないいずれか
のHASポリペプチドコンジュゲートの単離を行うことができる。
組成分析により確認することができる。
ィング分析での予測された高移動度へのシフト観察により、ポリペプチドのN連結された
オリゴ糖でのHAS修飾を実証することができる。
よびMALDI/TOF−MSで対応するタンパク質溶解性Cysペプチドを検出できな
いことにより、システイン残基でのポリペプチドのHAS修飾を実証することができる(
Zhou et al.,1998,Application of capillar
y electrophoresis,liquid chromatography,
electrospray−mass spectrometry and matri
x−assisted laserdesorption/ionization −
time of flight − mass spectrometry to th
e characterization of recombinant human
erythropoietin,Electrophoresis,19(13),23
48−55)。Cys修飾されたポリペプチドのタンパク質溶解性消化の後のHAS含有
分画の単離により、慣用されるアミノ酸組成物分析による対応するペプチドのこの分画の
確認が可能になる。
で開示した全ての実施形態を、HASポリペプチドコンジュゲートの生成に関する本発明
の方法にも適用する。さらに、HAS−EPOまたは一般にペプチドもしくはHASに関
係するその調製に関して前記で開示したすべての実施形態を、HASポリペプチドコンジ
ュゲートの生成に関する本発明の方法にも適用する。
記したホモおよびヘテロ二官能性化合物から選択される化合物(II)と反応させ、得ら
れた反応生成物を糖タンパク質、好ましくはエリスロポエチンと、好ましくはEPO炭水
化物側鎖の酸化された末端炭水化物部分と反応させる。
は前記したホモおよびヘテロ二官能性化合物から選択される化合物(II)と反応させ、
第1のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。この第1のヒドロキシエチルデンプ
ン誘導体を続いて架橋化合物と反応させて、第2のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得
られる。この第2のヒドロキシエチルデンプン誘導体を、続いて糖タンパク質、好ましく
はエリスロポエチンと、好ましくは糖タンパク質に含まれる−SH基と反応させて、第3
のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。好ましくは、架橋化合物はヘテロ二官能
性化合物である。さらに好ましくは、架橋化合物を第1のヒドロキシエチルデンプン誘導
体に含まれる−NH−構造を含む官能基と反応させる。さらに好ましくは、この官能基は
−NH2である。
る反応工程で毒性学的に限界の溶媒を使用する必要がなく、従って、生成物の溶媒との夾
雑を避けるために、生成過程の後にこれらの溶媒を除去する必要がないという点である。
さらに残留する毒性学的に限界の溶媒に関して付加的な品質管理を実施する必要がない。
好ましくは水に加えて、有機溶媒を用いる場合、毒性学的に限界でない溶媒、例えばエタ
ノールおよび/またはプロピレングリコールを使用するのが好ましい。
誘起される非可逆的または可逆的な構造変化が避けられるという点である。結果的に本発
明の方法に従って得られたポリペプチド誘導体は、有機溶媒、例えばDMSO中で調製さ
れたものとは異なる。
ュゲーションにより副反応が最小化されるかまたは回避される。結果的に本発明の方法の
この実施形態により純度の高い改善されたヒドロキシアルキルデンプン生成物に至る。
式(I):
R’−NH−R”
(式中、R1、R2およびR3は独立して、水素または直鎖状もしくは分岐したヒドロキシ
アルキル基であり、R’もしくはR”またはR’およびR”のいずれかは、(I)および
(II)の反応の前または後で少なくとも1つの別の化合物と反応することができる少な
くとも1つの官能基Xを含む)の化合物と反応させることを含む方法により得ることがで
きるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]ヒドロキシルアミンを用い、好ましいヒドロ
キシアルキルデンプンとしてヒドロキシエチルデンプンを用いる。
2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]ヒドロキシルアミンと反応させる方法により得
られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
はR”に依存して、前記した方法または複数の方法により得られるヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体は以下の構造(IIIa):
デンプン誘導体にも関する。
シアルキルデンプン誘導体は以下の構造(IIIa)または(IIIb)を有することが
でき、ここで(IIIa)および(IIIb)が特定の平衡分布を有する反応混合物に双
方共に存在し得るということも可能である。
デンプン誘導体にも関する。
る前記したヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
IIa)による化合物は、双方の形態の混合物もまた特定の平衡分布を有して存在し得る
エクアトリアル位またはアキシアル位のN原子を伴って存在し得る。
IIb)による化合物は、双方の形態の混合物もまた特定の平衡分布を有して存在し得る
E立体配座またはZ立体配座でC−N二重結合を伴って存在し得る。
IIIa)による化合物が水系で生成され、および/または用いられる場合である。安定
化方法としては、特にR’が水素である場合、式(IIIa)による化合物のアシル化が
特に好ましい。アシル化試薬として、式(IVa):
ができる。
である。アシル化試薬として、無水カルボン酸、ハロゲン化カルボン酸、およびカルボン
酸活性エステルを用いるのが好ましい。
ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
0℃の範囲の温度でアシル化を実施する。
式(IIIb)による化合物が水系で生成され、および/または用いられる場合である。
安定化方法としては、特にR’が水素である場合、式(IIIb)による化合物の還元が
特に好ましい。還元試薬として、式(IVb):
ができる。
ばNaCNBH3またはNaBH4を用いることができる。
ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
から80℃の範囲の温度で還元を実施する。
、(IIIa)および(IVa)、(IIIa)および(IVb)、(IIIb)および
(IVa)、(IIIb)および(IVb)、(IIIa)および(IIIb)および(
IVa)、(IIIa)および(IIIb)および(IVb)、(IVa)および(IV
b)および(IIIa)、並びに(IVa)および(IVb)および(IIIb)の混合
物に関し、ここで(IIIa)および/または(IVa)は独立して、N原子がエクアト
リアル位またはアキシアル位である立体配座で存在でき、および/または(IIIb)は
E立体配座またはZ立体配座でC−N二重結合を伴って存在できる。
生成物が得られる。前記第1の反応生成物を、次いで、少なくとも1つの前記の方法によ
り任意選択的に安定化してもよい。第1の、任意選択的に安定化されている反応生成物を
、次いで、第1の反応生成物のR”に含まれる少なくとも1つの官能基Xと、少なくとも
1つの別の化合物に含まれる少なくとも1つの官能基Yとの反応を介して、少なくとも1
つの別の化合物と反応させて、第2の反応生成物を得る。前記第2の反応生成物を次いで
、任意選択的に少なくとも1つの前記の方法により安定化してもよい。
は架橋化合物、または架橋化合物とポリペプチドとの反応生成物である。少なくとも1つ
の別の化合物がポリペプチドである場合、官能基Yはポリペプチドに含まれる。少なくと
も1つの別の化合物が架橋化合物である場合、官能基Yは架橋化合物に含まれ、任意選択
的にポリペプチドにも含まれてもよい。少なくとも1つの別の化合物が架橋化合物とポリ
ペプチドとの反応生成物である場合、官能基Yは架橋化合物に含まれる。
くとも1つの官能基Xとの、少なくとも1つの別の化合物に含まれる官能基Yとの反応を
介して、少なくとも1つの別の化合物と反応させて、第1の反応生成物を得る。少なくと
も1つの別の化合物は、前記で論じたようにポリペプチド、または架橋化合物、または架
橋化合物とポリペプチドとの反応生成物であることが好ましい。次いで、前記第1の反応
生成物を、化合物(I)の還元末端と化合物(II)の天然の残基R’およびR”を架橋
する第1の反応生成物のNH基との反応を介して化合物(I)と反応させて、第2の反応
生成物が得られる。次いで前記第2の反応生成物を任意に前記の方法の少なくとも1つに
従って安定化してもよい。
ンを用い、化合物(II)としてO−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]
ヒドロキシルアミンを用い、別の化合物として炭水化物側鎖の酸化された末端炭水化物部
分を有するEPOを用いる。さらに好ましくは、ヒドロキシエチルデンプンをO−[2−
(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]ヒドロキシルアミンと反応させて、第1のヒ
ドロキシエチルデンプン誘導体が得られ、その第1の誘導体をさらに炭水化物側鎖の酸化
された末端炭水化物部分を有するEPOと反応させて、第2のヒドロキシエチルデンプン
誘導体が得られる。この例では、安定化反応を行う必要は全くない。
(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]ヒドロキシルアミンと反応させ、反応生成物
をエリスロポエチンの炭水化物側鎖の酸化された末端炭水化物部分を介してエリスロポエ
チンと反応させる方法により得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関する。
チルデンプンを用い、化合物(II)としてO−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)
−エチル]ヒドロキシルアミンを用い、マレイミド基およびN−ヒドロキシスクシンイミ
ド活性エステル基を有するヘテロ二官能性架橋化合物を用い、少なくとも1つの−SH基
を有するEPO(チオEPOと称する)をポリペプチドとして用いる。さらに好ましくは
、ヒドロキシエチルデンプンを、O−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]
ヒドロキシルアミンと反応させて、第1のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られ、そ
の第1の誘導体をさらに架橋化合物のN−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基と反
応させて、第2の誘導体が得られ、その第2の誘導体を、マレイミド基を介してチオEP
Oと反応させて、第3のヒドロキシエチルデンプン誘導体が得られる。
場合によっては架橋化合物およびエリスロポエチンの反応により形成されるヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体は、コンジュゲーション前のエリスロポエチンと比較した場合、改
善された生物学的安定性を呈するという利点を有する。これは主にこのヒドロキシアルキ
ルデンプン誘導体が、肝臓および腎臓の除去系によりあまり認識されないか、または全く
認識されず、従ってより長時間循環系で維持されるという事実による。さらに、HASは
部位特異的に付着するので、HASのEPOへのコンジュゲーションによりEPOのイン
ビボ生物学的活性を破壊する危険性が最小化される。
、本発明のHAS−EPOコンジュゲートは組換えの天然のEPOと本質的に同一のイン
ビトロ生物学的活性を呈し得る。インビトロ生物学的活性を決定するための方法は当分野
で公知である。
コンジュゲートされていないEPO)よりも大きなインビボ活性を呈する。インビボ生物
学的活性を決定するための方法は当分野で公知である。
EPOコンジュゲートは110%から300%、好ましくは110%から200%、さら
に好ましくは110%から180%または110%から150%、最も好ましくは110
%から140%のインビボ活性を呈し得る。
と比較して、高度にシアル化されたEPOのインビボ活性を100%と設定すると、HA
S−EPOは、高度にシアル化されたEPOのインビボ活性の好ましくは少なくとも50
%、さらに好ましくは少なくとも70%、なおさらに好ましくは少なくとも85%もしく
は少なくとも95%、少なくとも150%、少なくとも200%、または少なくとも30
0%の活性を呈する。最も好ましくは、高度にシアル化されたEPOのインビボ活性の少
なくとも95%の活性を呈する。
によりあまり認識されないため、および高分子量のために腎クリアランスが低下するため
に、HAS−EPOコンジュゲートが、コンジュゲートされていないEPOよりも循環中
に長く留まるという事実に主に起因する。循環中のEPOのインビボ半減期を決定する方
法は当分野で公知である(Sytkowski,Lunn,Davis,Feldman
,Siekman,1998,Human erythropoietin dimer
s with markedly enhanced in vivo activit
y,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(3),1184−8)。
コンジュゲートが提供されることが本発明の大きな利点である。標準的なEPO調製物は
少なくとも3日毎に投与しなければならないが、本発明のHAS−EPOコンジュゲート
は好ましくは週2回、さらに好ましくは週1回投与される。
まないので、有効なEPO誘導体を低コストで生成することができる。すなわち、インビ
ボ生物学的活性が低いかまたは全く呈さないことが解っているシアル化が不十分な形態の
EPOを精製して除去する必要がないという利点を有している。
−EPOコンジュゲート、さらに好ましくは本発明のHES−EPOコンジュゲートを含
む医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、医薬組成物はさらにエリスロポエチン治
療において有用な少なくとも1つの医薬的に許容される希釈剤、補助剤および/または担
体を含む。
まれる少なくとも1つの官能基Xを介して少なくとも1つの別の化合物と反応させるか、
または化合物(I)との反応の前に化合物(II)を少なくとも1つの官能基Xを介して
少なくとも1つの別の化合物と反応させ、少なくとも1つの別の化合物がポリペプチドで
ある治療上有効量の前記したヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む医薬組成物にも関
する。
ポリペプチドのチオ基もしくは酸化された炭水化物部分を介して化合物(II)と、また
は化合物(I)および化合物(II)の反応生成物と反応させる。
エチンをポリペプチドに含まれる酸化された炭水化物部分を介して化合物(II)と、ま
たは化合物(I)および化合物(II)の反応生成物と反応させる。
介して化合物(II)と、または化合物(I)および化合物(II)の反応生成物と反応
させる前記した医薬組成物に関する。
タまたはエリスロポエチンであり、さらに好ましくはエリスロポエチンである。
する。
エチンを酸化する。
化し、続いて過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。
Oに基づいて生成されたヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む医薬組成物は除外され
る。
応生成物を化合物(II)に含まれる少なくとも1つの官能基Xを介して少なくとも1つ
の別の化合物と反応させるか、または化合物(I)との反応の前に化合物(II)を少な
くとも1つの官能基Xを介して少なくとも1つの別の化合物と反応させ、そして少なくと
も1つの別の化合物が架橋化合物であり、化合物(I)および化合物(II)の反応生成
物の架橋化合物との反応生成物をポリペプチドと反応させる治療上有効量の前記したヒド
ロキシアルキルデンプン誘導体を含む医薬組成物にも関する。
る前記した医薬組成物に関する。
患の処置に適している。
果を提供する量を意味する。エリスロポエチンイソ型の投与は非経口経路によるのが好ま
しい。選択される具体的な経路は、処置される症状に依存する。エリスロポエチンイソ型
の投与は、適当な担体、例えばヒト血清アルブミン、適当な希釈剤、例えば緩衝生理食塩
水、および/または適当な補助剤を含有する処方の一部として行うのが好ましい。必要と
される投与量は患者のヘマトクリットを上昇させるのに十分な量であり、処置される症状
の重篤度、用いられる投与方法等に依存して変化する。
ミリモル/l以上に上昇させることである。このために、ヘモグロビン値を週あたり0.
6ミリモル/l〜1.6ミリモル/l上昇させるように医薬組成物を投与することができ
る。ヘモグロビン値が8.7ミリモル/lを超える場合、好ましくはヘモグロビン値が8
.1ミリモル/l未満になるまで治療を中断すべきである。
好ましい。このために、適当な賦形剤および担体は、例えば二水素リン酸ナトリウム、リ
ン酸水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート80、HSAおよび注射用水
である。組成物を週3回、好ましくは週2回、さらに好ましくは週1回、そして最も好ま
しくは隔週で投与することができる。
から5μg/kg、0.1から1μg/kg、または0.2〜0.9μg/kg、最も好
ましくは0.3〜0.7μg/kg、そして最も好ましくは0.4〜0.6μg/kgの
医薬組成物を投与する。
00μgの間を投与する。
ASポリペプチドに関する。
ための医薬品の調製のための本発明のHAS−EPOコンジュゲートの使用に関する。
することを意図するものでは決してない。
[実施例1.1]
ヒドロキシエチルデンプンと1,3−ジアミノ−2−ヒドロキシプロパン:
a)ヒドロキシエチルデンプン(HES18/0.4(MW=18,000D、DS=
0.4))200mgの水(5ml)溶液に、1,3−ジアミノ−2−ヒドロキシプロパ
ン0.83ミリモルおよびシアノボロハイドラートナトリウム(NaCNBH3)50m
gを加えた。得られた混合物を80℃で17時間インキュベートした。アセトンおよびエ
タノール1:1(容量/容量)冷混合物160mlに反応混合物を加えた。遠心により沈
殿物を収集し、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析用チューブ、3.5K
Dカットオフ、Perbio Science Deutschland GmbH,B
onn,D)、凍結乾燥した。
シアノボロハイドラートナトリウム(NaCNBH3)をヒドロキシエチルデンプン20
0mgの溶液へ添加することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であ
り、25℃で3日間行った。
ヒドロキシエチルデンプンと1,2−ジヒドロキシ−3−アミノプロパン:
a)ヒドロキシエチルデンプン(HES18/0.4(MW=18,000D、DS=
0.4))200mgの水(5ml)溶液に、0.83ミリモルの1,2−ジヒドロキシ
−3−アミノプロパンおよび50mgのシアノボロハイドラートナトリウム(NaCNB
H3)を加えた。得られた混合物を80℃で17時間インキュベートした。アセトンおよ
びエタノール1:1(容量/容量)冷混合物160mlに反応混合物を加えた。遠心によ
り沈殿物を収集し、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析用チューブ、3.
5KDカットオフ、Perbio Science Deutschland GmbH
,Bonn,D)、凍結乾燥した。
シアノボロハイドラートナトリウム(NaCNBH3)をヒドロキシエチルデンプン20
0mgの溶液へ添加することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であ
り、25℃で3日間行った。
に記載されるように、過ヨウ素酸による反応生成物中の1,2−ジオールの酸化的切断に
起因するホルムアルデヒドの定量により1,2−ジヒドロキシ−3−アミノプロパンとH
ESとの反応を間接的に確認した。
ヒドロキシエチルデンプンと1,4−ジアミノブタン:
a)ヒドロキシエチルデンプン(HES18/0.4(MW=18,000D、DS=
0.4))200mgの水(5ml)溶液に、0.83ミリモルの1,4−ジアミノブタ
ンおよび50mgのシアノボロハイドラートナトリウム(NaCNBH3)を加えた。得
られた混合物を80℃で17時間インキュベートした。アセトンおよびエタノール1:1
(容量/容量)冷混合物160mlに反応混合物を加えた。遠心により沈殿物を収集し、
水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析用チューブ、3.5KDカットオフ、
Perbio Science Deutschland GmbH,Bonn,D)、
凍結乾燥した。
ートナトリウム(NaCNBH3)をヒドロキシエチルデンプン200mgの溶液へ添加
することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であり、25℃で3日間
行った。
ヒドロキシエチルデンプンと1−メルカプト−2−アミノエタン:
a)ヒドロキシエチルデンプン(HES18/0.4(MW=18,000D、DS=
0.4))200mgの水(5ml)溶液に、0.83ミリモルの1−メルカプト−2−
アミノエタンおよび50mgのシアノボロハイドラートナトリウム(NaCNBH3)を
加えた。得られた混合物を80℃で17時間インキュベートした。アセトンおよびエタノ
ール1:1(容量/容量)冷混合物160mlに反応混合物を加えた。遠心により沈殿物
を収集し、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析用チューブ、3.5KDカ
ットオフ、Perbio Science Deutschland GmbH,Bon
n,D)、凍結乾燥した。
ロハイドラートナトリウム(NaCNBH3)をヒドロキシエチルデンプン200mgの
溶液へ添加することにより得られた混合物のインキュベーションもまた可能であり、25
℃で3日間行った。
[実施例2.1]
ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジド:
0.96gのHES18/0.4(MW=18,000D、DS=0.4)を0.1M
の酢酸ナトリウム緩衝液水溶液(pH5.2)8mlに溶解し、8ミリモルのカルボヒド
ラジド(Sigma Aldrich,Taufkirchen,D)を加えた。25℃
で18時間攪拌した後、アセトンおよびエタノール1:1(容量/容量)冷混合物160
mlに反応混合物を加えた。遠心により沈殿した生成物を収集し、水40mlに再溶解し
、水に対して3日間透析し(SnakeSkin透析用チューブ、3.5KDカットオフ
、Perbio Science Deutschland GmbH,Bonn,D)
、凍結乾燥した。
ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジド:
0.96gのHES18/0.4(MW=18,000D、DS=0.4)を0.1M
の酢酸ナトリウム緩衝液水溶液(pH5.2)8mlに溶解し、8ミリモルのアジピン酸
ジヒドラジド(Lancaster Synthesis,Frankfurt/Mai
n,D)を加えた。25℃で18時間攪拌した後、アセトンおよびエタノール1:1(容
量/容量)冷混合物160mlに反応混合物を加えた。遠心により沈殿した生成物を収集
し、水40mlに再溶解し、水に対して3日間透析し(SnakeSkin透析用チュー
ブ、3.5KDカットオフ、Perbio Science Deutschland
GmbH,Bonn,D)、凍結乾燥した。
ヒドロキシエチルデンプンと1,4−フェニレン−ビス−3−チオセミカルバジド
0.96gのHES18/0.4(MW=18,000D、DS=0.4)を0.1M
の酢酸ナトリウム緩衝液水溶液(pH5.2)8mlに溶解し、8ミリモルの1,4−フ
ェニレン−ビス−3−チオセミカルバジド(Lancaster Synthesis,
Frankfurt/Main,D)を加えた。25℃で18時間攪拌した後、8mlの
水を反応混合物に加え、懸濁液を4,500rpmで15分間遠心した。透明な上澄をデ
カントし、続いてアセトンおよびエタノール1:1(容量/容量)冷混合物160mlに
加えた。遠心により沈殿した生成物を収集し、水40mlに再溶解し、4,500rpm
で15分間遠心した。透明な上澄を水に対して3日間透析し(SnakeSkin透析用
チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Science Deutschla
nd GmbH,Bonn,D)、凍結乾燥した。
ヒドロキシエチルデンプンとO−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]ヒ
ドロキシルアミン:
Boturyn et al.,Tetrahedron 53:5485−5492
(1997)に記載されるように市販により入手可能な材料から、2工程でO−[2−(
2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]ヒドロキシルアミンを合成した。
の酢酸ナトリウム緩衝液水溶液(pH5.2)8mlに溶解し、8ミリモルのO−[2−
(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]ヒドロキシルアミンを加えた。25℃で18
時間攪拌した後、アセトンおよびエタノール1:1(容量/容量)冷混合物160mlに
反応混合物を加えた。遠心により沈殿した生成物を収集し、水40mlに再溶解し、水に
対して3日間透析し(SnakeSkin透析用チューブ、3.5KDカットオフ、Pe
rbio Science Deutschland GmbH,Bonn,D)、凍結
乾燥した。
実施例7に記載するように酸化エリスロポエチンを生成した。酸化されたエリスロポエ
チンとして実施例7.11(c)に記載したEPO−GT−1−Aを用いた(酸加水分解
を行わず、穏やかな過ヨウ素酸酸化で処理したEPO−GT−1)。
ュゲーション
[実施例4.1]
酸化されたエリスロポエチンと実施例2.1の反応生成物との反応
20mMのPBS緩衝液中で、酸化されたEPO(1.055μg/μl)を5Mの酢
酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。実施例2.1に従って生成
された18μlのHES誘導体の溶液(MW 18kD;0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
(pH5.2)中18.7μg/μl)を19μlのEPO溶液に加え、混合物を25℃
で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invitrogenにより提供された指
示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis−Trisゲル/MOPS緩衝液
(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を用いて、粗生成物をSD
S−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマシー染色試薬(Roth,Kar
lsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布およびタン
パク質に連結されたHES誘導体の数による。
酸化エリスロポエチンと実施例2.3の反応生成物との反応
20mMのPBS緩衝液中で、酸化されたEPO(1.055μg/μl)を5Mの酢
酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。実施例2.3に従って生成
された18μlのHES誘導体の溶液(MW 18kD;0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
(pH5.2)中18.7μg/μl)を19μlのEPO溶液に加え、混合物を25℃
で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invitrogenにより提供された指
示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis−Trisゲル/MOPS緩衝液
(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を用いて、粗生成物をSD
S−PAGEにより分析した。
酸化されたエリスロポエチンと実施例2.4の反応生成物との反応
20mMのPBS緩衝液中で、酸化されたEPO(1.055μg/μl)を5Mの酢
酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。実施例2.4に従って生成
された18μlのHES誘導体の溶液(MW 18kD;0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
(pH5.2)中18.7μg/μl)を19μlのEPO溶液に加え、混合物を25℃
で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invitrogenにより提供された指
示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis−Trisゲル/MOPS緩衝液
(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を用いて、粗生成物をSD
S−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマシー染色試薬(Roth,Kar
lsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示されている。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布および
タンパク質に連結されたHES誘導体の数による。
241.5μgのエリスロポエチン(EPO−GT−1、実施例7参照)を、0.1M
のホウ酸ナトリウム緩衝液、5mMのEDTA、10mMのDTT(Lancaster
,Morcambe,UK)(pH8.3)の500μl中で、37℃で1時間インキュ
ベートした。VIVASPIN 0.5mlの濃縮器、10KD MWCO(VIVAS
CIENCE,Hannover,D)を用いて13,000rpmで遠心濾過によりD
TTを除去し、続いてホウ酸塩緩衝液で3回、リン酸塩緩衝液(0.1M,9.15M
NaCl,50mM EDTA,pH7.2).で2回洗浄した。
ジュゲーション
以下の実施例の各々で、N−(アルファ−マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエス
テル(AMAS)
酸化されたエリスロポエチンと実施例2.1の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例2.1に従って生成され、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M,9.
15M NaCl,50mM EDTA,pH7.2)200μlに溶解した50ナノモ
ルのHES誘導体に、10μlの2.5マイクロモルのAMAS(Sigma Aldr
ich,Taufkirchen,D)のDMSO溶液を加えた。透明な溶液を25℃で
80分、および40℃で20分インキュベートした。VIVASPIN製の0.5ml濃
縮器、5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D)を用いて1
3,000rpmで遠心濾過により残りのAMASを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用い
て30分、4回洗浄した。
/μl)を加え、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invi
trogenにより提供された指示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis
−Trisゲル/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,U
SA)を用いて、粗生成物をSDS−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布およびタン
パク質に連結されたHES誘導体の数による。
酸化されたエリスロポエチンと実施例2.2の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例2.2に従って生成され、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M,9.
15M NaCl,50mM EDTA,pH7.2)200μlに溶解した50ナノモ
ルのHES誘導体に、10μlの2.5マイクロモルのAMAS(Sigma Aldr
ich,Taufkirchen,D)DMSO溶液を加えた。透明な溶液を25℃で8
0分、および40℃で20分インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮器
、5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D)を用いて13,
000rpmで遠心濾過により残りのAMASを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて3
0分、4回洗浄した。
/μl)を加え、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invi
trogenにより提供された指示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis
−Trisゲル/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,米
国)を用いて、粗生成物をSDS−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマシ
ー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布およびタン
パク質に連結されたHES誘導体の数による。
酸化されたエリスロポエチンと実施例2.3の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例2.3に従って生成され、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M,9.1
5M NaCl,50mM EDTA,pH7.2)200μlに溶解した50ナノモル
のHES誘導体に、10μlの2.5マイクロモルのAMAS(Sigma Aldri
ch,Taufkirchen,D)のDMSO溶液を加えた。透明な溶液を25℃で8
0分、および40℃で20分インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮器
、5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D)を用いて13,
000rpmで遠心濾過により残りのAMASを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて3
0分、4回洗浄した。
/μl)を加え、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invi
trogenにより提供された指示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis
−Trisゲル/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,U
SA)を用いて、粗生成物をSDS−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布およびタン
パク質に連結されたHES誘導体の数による。
酸化エリスロポエチンと実施例2.4の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例2.4に従って生成され、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M,9.1
5M NaCl,50mM EDTA,pH7.2)200μlに溶解した50ナノモル
のHES誘導体に、10μlの2.5マイクロモルのAMAS(Sigma Aldri
ch,Taufkirchen,D)のDMSO溶液を加えた。透明な溶液を25℃で8
0分、および40℃で20分インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮器
、5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D)を用いて13,
000rpmで遠心濾過により残りのAMASを除去し、各々リン酸塩緩衝液を用いて3
0分、4回洗浄した。
/μl)を加え、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invi
trogenにより提供された指示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis
−Trisゲル/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,U
SA)を用いて、粗生成物をSDS−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布およびタン
パク質に連結されたHES誘導体の数による。
酸化されたエリスロポエチンと実施例1.1の反応生成物および架橋化合物との反応
80℃で17時間(実施例1.1a)および25℃で3日(実施例1.1b)のインキ
ュベーション条件で実施例1.1に従って生成され、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(
0.1M,9.15M NaCl,50mM EDTA,pH7.2)200μlに溶解
した50ナノモルのHES誘導体に、10μlの2.5マイクロモルのAMAS(Sig
ma Aldrich,Taufkirchen,D)のDMSO溶液を加えた。透明な
溶液を25℃で80分、および40℃で20分インキュベートした。VIVASPIN
0.5ml濃縮器、5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D
)を用いて13,000rpmで遠心濾過により残りのAMASを除去し、各々リン酸塩
緩衝液を用いて30分、4回洗浄した。
/μl)を加え、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invi
trogenにより提供された指示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis
−Trisゲル/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,U
SA)を用いて、粗生成物をSDS−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布およびタン
パク質に連結されたHES誘導体の数による。
酸化されたエリスロポエチンと実施例1.3の反応生成物および架橋化合物との反応
80℃で17時間(実施例1.3a)および25℃で3日(実施例1.3b)のインキ
ュベーション条件で実施例1.1に従って生成され、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(
0.1M,9.15M NaCl,50mM EDTA,pH7.2)200μlに溶解
した50ナノモルのHES誘導体に、10μlの2.5マイクロモルのAMAS(Sig
ma Aldrich,Taufkirchen,D)のDMSO溶液を加えた。透明な
溶液を25℃で80分、および40℃で20分インキュベートした。VIVASPIN
0.5ml濃縮器、5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D
)を用いて13,000rpmで遠心濾過により残りのAMASを除去し、各々リン酸塩
緩衝液を用いて30分、4回洗浄した。
/μl)を加え、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、Invi
trogenにより提供された指示書に記載されるように、NuPAGE 10%Bis
−Trisゲル/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,U
SA)を用いて、粗生成物をSDS−PAGEにより分析した。Roti−ブルークーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)を用いてゲルを一晩染色する。
ンの成功が示される。増加したバンド幅は、用いたHES誘導体の分子量分布およびタン
パク質に連結されたHES誘導体の数による。
要旨
HES誘導体(平均分子量18,000ダルトン;ヒドロキシエチル置換度0.4)の
組換えヒトEPOのオリゴ糖鎖の部分的に酸化された(穏やかな過ヨウ素酸)シアル酸残
基へのカップリングによりHAS−EPOコンジュゲートを合成した。炭水化物構造分析
に基づいて、穏やかな酸処理されたHES修飾グリカンのMALDI/TOF−MSは未
修飾EPO生成物で観察されたものと区別できない無傷の中性のN−アセチルラクトース
アミン型鎖を示したので、導入された修飾はコアオリゴ糖鎖の構造完全性に影響しなかっ
た。得られた結果により、先に部分的シアル酸除去を行わずに修飾したEPO調製物の場
合、EPO分子あたり少なくとも3つの修飾されたHES残基が付着することが示される
。元のタンパク質の約50%のシアル酸残基を欠如するEPO変種は、SDS−PAGE
で類似の見かけの高分子量移動度を示した(BRP EPO標準に関して60〜110k
Da対40kDa)。HES修飾されたEPOは標準的なイオン交換クロマトグラフィー
条件下、室温、pH3〜10で安定である。
れたEPOはこのアッセイで、欧州薬局方およびBRP EPO標準調製物に対して修正
されたRP−HPLC EPOタンパク質測定方法のUV吸収値を用いるタンパク質測定
に基づく国際BRP EPO基準値と比較して2.5〜3.0倍高い特異活性(IU/m
g)を有することが示される。
材料および方法
(a)N−グリコシダーゼでの消化によるN−連結オリゴ糖の分離
サンプルを25単位(製造者の規格による、Roche Diagnostics,G
ermany)の組換えPNGアーゼFと共に37℃で一晩インキュベートした。SDS
−PAGEにおけるタンパク質の特定の移動度シフトにより完全な消化をモニター観察し
た。3容量の冷100%エタノールの添加、および−20℃で少なくとも2時間のインキ
ュベーションにより放出されたN−グリカンをポリペプチドから分離した(Schroe
ter S et al.(1999))。4℃、13000rpmで10分間の遠心に
より沈殿したタンパク質を除去した。次いでペレットを、氷冷75%エタノール500μ
lを用いてさらに2回洗浄した。プールした上澄中のオリゴ糖を真空遠心で乾燥した(S
peed Vac concentrator,Savant Instruments
Inc.,USA)。使用前に以下のようにHypercarbカートリッジ(Hyp
erCarb25mgまたは100mg)を用いてグリカンサンプルを脱塩した。カラム
を0.1%のTFA中の80%アセトニトリル(容量/容量)3×500μlで洗浄し、
続いて水3×500μlで洗浄した。サンプルを水で最終容量300μlから600μl
に希釈した後、次いで水で厳密に洗浄したカートリッジに加えた。0.1%のトリフルオ
ロ酢酸(容量/容量)を含有する水中、25%のアセトニトリル1.2ml(25mgカ
ートリッジ;100mgカートリッジの場合1.8ml)でオリゴ糖を溶出した。溶出し
たオリゴ糖を2MのNH4OHで中和し、Speed Vac濃縮器で乾燥した。N−グ
リコシダーゼ放出されたオリゴ糖の脱塩を、全(糖)タンパク質<100μgのサンプル
からの消化混合物を100mg Hypercarbカートリッジに吸収させることによ
り実施した場合もあった。
F/TOF−MS)によるオリゴ糖の分析
Bruker ULTRAFLEX飛行時間(TOF/TOF)装置を使用した。双方
の場合でリフレクトロンを用いる陽イオンおよび陰イオン様式で、UV吸収材料として2
,5−ジヒドロキシ安息香酸を用いて、天然の脱シアル化オリゴ糖を分析した。MS−M
S分析のために、選択した親イオンをレーザー誘起解離(LID)に供し、得られたフラ
グメントイオンを装置の第2のTOF段階(LIFT)により分離した。およそ1〜10
ピコモル・μl-1の濃度のサンプル溶液1μlを等量の各マトリックスと混合した。この
混合物をステレススチール標的にスポットし、分析前に室温で乾燥した。
組換えヒトEPO(EPO−GT−1)の調製およびキャラクタリゼーション
Mueller PP et al.(1999)、Dorner AJ et al
.(1984)に記載されるように、組換えCHO細胞からEPOを発現させ、そして欧
州薬局方に記載される方法(Ph.Eur.4,Monography 01/2002
:1316:エリスロポエチン濃縮溶液)に従って調製物をキャラクタリゼーションした
。最終生成物のシアル酸含量はタンパク質ナノモルあたり12ナノモル(+/−1.5ナ
ノモル)であった。Nimtz et al.(1999)、Grabenhorst(
1999)に記載されるように、N連結されたオリゴ糖の構造をHPAEC−PADおよ
びMALDI/TOF−MSにより決定した。得られたEPO調製物は、二、三および四
シアル化オリゴ糖を含有した(各々2〜12%、15〜28%、60〜80%、硫酸化さ
れ、五シアルされた鎖が少量存在した)。EPO調製物の全体的なグリコシル化の特徴は
、国際BRP EPO標準調製物の特徴に類似した。
O標準調製物のパターンに匹敵した。EPOタンパク質の25%はポリペプチド鎖のSe
r126で、O−グリコシル化されていなかった。
部分的に脱シアル化されたEPO形態の調製
EPO GT−1タンパク質(2.84mg/ml)を20mMのリン酸Na緩衝液(
pH7.0)中80℃まで加熱し、次にEPO溶液1mlあたり1NのH2SO4100μ
lを加えた。インキュベーションを各々5分、10分および60分続け、シアル化の程度
が異なるEPO調製物を生じた。ポリペプチドN−グリコシダーゼを用いてオリゴ糖を放
出させた後に、0〜4個のシアル酸を伴うオリゴ糖の定量を実施し、Hypercarb
カートリッジ(25mg HyperSep Hypercarb;ThermoHyp
ersil−Keystone,UK)を用いる脱塩によりN連結された鎖の単離を行っ
た。1NのNaOHの添加によりEPO調製物を中和し、液体N2中で凍結し、さらに用
いる時まで−20℃で保存した。
シアル化されたEPO形態の過ヨウ素酸酸化
20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)3.5mlに溶解した、未処理また
は穏やかな酸処理を行ったEPO10mgに0.1Mの酢酸Na緩衝液(pH5.5)1
.5mlを加え、混合物を氷浴中0℃まで冷却し、10mMの過ヨウ素酸Na500μl
を加え、反応混合物を、暗中0℃で60分間維持した。次いで、10μlのグリセロール
を加え、暗中でさらに10分間インキュベーションを続けた。VIVASPIN濃縮器(
10,000 MWCO,PES Vivascience AG,Hannover,
Germany)を用いる脱塩により、製造者の推奨に従って、固定角ローターを装着し
た実験用遠心器中3000rpmで部分的に酸化されたEPO形態を試薬から分離した。
液体窒素中で凍結した後、EPO調製物を最終容量4mlで、−20℃で保存した。
し、記載されるようにHypercarbカートリッジを用いてオリゴ糖を単離した。穏
やかな酸処理によりオリゴ糖を脱シアル化し、HPAEC−PADにより分析し、その保
持時間を記載される(Nimtz et al.(1990)および(1993))真正
の標準オリゴ糖の保持時間と比較した。
ジチオエリスレイトール(dithioerythreitol)によるEPOジスルフィドの還元
EPO−GT−1を30mM ジチオエリスレイトール(DTT)の存在下、0.1M
のTris/HCl緩衝液(pH8.1)5ml中でインキュベートし、Vivaspi
n濃縮器を用いて4℃、4サイクルの緩衝液交換でDTTの除去を達成した。最終還元E
PO調製物を液体窒素中で凍結し、50mMの酢酸Na緩衝液(pH5.5)中、−20
℃で保存した。
EPOタンパク質測定
欧州薬局方(European Pharmacopeia 4,Monograph
y 01/2002:1316:エリスロポエチン濃縮溶液)に従って、1cmの路長の
キュベットで280nmのUV吸収を測定することによりEPOタンパク質の定量測定を
実施した。加えて、RP−C4カラム(Vydac Protein C4、カタログ番
号 214TP5410,Grace Vydac,Ca,US)を用いるRP−HPL
C方法を適用することによりEPOを定量した。エリスロポエチンBRP1基準品を用い
てHPLC法を修正した(European Pharmacopeia,Consei
l de l’Europe B.P.907−F67029,Strasbourg
Cedex 1)。
ガラクトースオキシダーゼによる脱シアル化EPOの酸化
完全に脱シアル化したEPO4.485mgをカタラーゼ(6214単位/200ml
)16μlおよびガラクトースオキシダーゼ(Dactylium dendroide
s由来、2250単位/ml(Sigma−Aldrich,Steinheim,Ge
rmany))80μlの存在下、20mMのリン酸Na緩衝液(pH6.8)中でイン
キュベートした。37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションの開始後、4時
間および8時間にガラクトースオキシダーゼ20μlを2回加えた。
バイオアッセイのためのEPOサンプルの調製
過ヨウ素酸酸化またはガラクトースオキシダーゼ酸化したEPOタンパク質調製物と活
性化HESとのインキュベーションからのEPOの精製
室温でEPOサンプルの精製(未反応HES誘導体の除去)を実施した。EPOインキ
ュベーション混合物(EPOタンパク質およそ5mg)を緩衝液A(H2O bides
t中の、20mMのN−モルホリンプロパンスルホン酸[MOPS/NaOH]、pH8
.0)で1:10に希釈し、10カラム容量(CV)の緩衝液Aを流速0.5ml/分で
用いることにより平衡にした3mlのQ−セファロースHP(Pharmacia コー
ド番号 17−1014−03、ロット番号 220211)を含有するカラムに適用し
た。カラムを緩衝液A 6〜8CV(流速=0.8ml/分)で洗浄し、緩衝液B(H2
O bidest中の、20mMのモルホリンエタンスルホン酸[MES/NaOH]、
0.5MのNaCl、pH6.5)を流速0.5ml/分で用いて溶出を行った。280
nmでのUV吸収によりEPOを検出し、約6mlで溶出した。緩衝液C(H2O中の、
20mMのMES,1.5M NaCl、pH6.5に調整)3CVを用いることにより
カラムを再生し、緩衝液Aの10CV(流速=0.7ml/分)を用いて再度平衡にした
。
たり各々3回の遠心サイクルでQ−セファロース工程から得られたEPO溶出物の緩衝液
交換を行い、PBSでサンプルを2mlに調整し、−20℃で保存した。
ったHES誘導体と一緒に流出液中に見出されたので、Q−セファロース溶出物からはH
ES修飾に供した、部分的に脱シアル化され、続いて穏やかに過ヨウ素酸酸化されたEP
O形態が、<25%しか得られなかった。
パルスドアンペトメトリー検出器を備えた高pHアニオン交換クロマトグラフィー(Hi
gh-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection:HPAE
C−PAD)
パルスドアンペトメトリー検出器(PAD)と組み合わせたCarboPac PA1
カラム(0.4×25cm)を装着したDionex BioLCシステム(Dione
x,米国)を用いる高pHアニオン交換(HPAE)クロマトグラフィーにより精製され
た天然のオリゴ糖、および脱シアル化されたオリゴ糖を分析した(Schroter e
t al.(1999);Nimtz et al.,(1999))。検出器ポテンシ
ャル(E)およびパルス幅(T)は:E1:+50mV,T1:480分;E2:+50
0mV,T2:120分;E3:−500mV,T3:60分であり、出力範囲は500
〜1500nAであった。次いでオリゴ糖を100%の溶媒Aで平衡にしたCarboP
ac PA1カラムに注入した。脱シアル化されたオリゴ糖に関して、溶媒Bの直線グラ
ジエント(0〜20%)を40分間、続いて20〜100%溶媒Bの直線的増加を5分間
適用することにより溶出(流速:1ml/分-1)を行った。溶媒Aは蒸留H2O中0.2
M NaOHであり、溶媒Bは溶媒A中、0.6MのNaOAcからなるものであった。
天然のオリゴ糖に関しては、カラムを100%溶媒C(蒸留H2O中0.1M NaOH
)で平衡にし、溶媒Dの直線グラジエント(0〜35%)を48分間、続いて35〜10
0%溶媒Dの直線的増加を10分間適用することにより溶出(流速:1ml/分-1)を行
った。溶媒Dは溶媒C中0.6M NaAcから成った。
GC−MSによるN−グリカン、HES修飾したN−グリカンおよびEPOタンパク質
の単糖類組成分析
メタノール分解、N−再アセチル化および三メチルシリル化の後の対応するメチルグリ
コシドとして、GC/MSにより単糖類を分析した[Chaplin,M.F.(198
2)A rapid and sensitive method for the a
nalysis of carbohydrate.Anal.Biochem.123
,336−341」Anal.Biochem.123:336−341(1982)]
。30m DB5キャピラリーカラムを装着した陽イオンEI様式で作動させるFinn
igan GCQイオントラップ質量分析器(Finnigan MAT corp.,
San Jose,CA)で分析を実施した。温度プログラム:80℃で2分間等温、次
いで10℃/分で300℃まで。
未修正結果を定量に用いた。アノマー性および/またはフラノイド形態およびピラノイド
形態の存在により複数のピークを生じた単糖類を、全ての主要なピークを加算することに
より定量した。内部標準化合物として、ミオイノシトール0.5μgを用いた。
結果
[実施例7.11(a)]
穏やかに酸処理した(部分的に脱シアル化された)EPO−GT−1のN−グリカンの
キャラクタリゼーション
図5に示すように、N−グリコシダーゼとのインキュベーションによるN連結されたオ
リゴ糖の放出の前および後に、5、10または60分間の穏やかに酸処理に供したEPO
−GT−1調製物をSDS−PAGEにより分析した。N連結されたオリゴ糖をHPAE
C−PADオリゴ糖マッピングに供した(図6)。未処理EPO−GT−1は3個または
4個のシアル酸残基を有するN連結されたオリゴ糖>90%を含有したが、穏やかな酸の
存在下での5分間のインキュベーションの後、3個または4個のシアル酸残基を有する炭
水化物鎖は<40%であった。脱シアル化N−グリカンのHPAEC−PADにより未処
理EPO−GT−1に関して検出され、5、10または60分間の酸処理に供した調製物
において安定なままであった中性オリゴ糖の比率が示された。脱シアル化されたグリカン
のMALDI/TOF−MSにより、タンパク質の穏やかな酸処理の後<90%の近位フ
コースが存在したことが示された。
過ヨウ素酸処理したEPO−GT−1のキャラクタリゼーション
予め5分間および10分間、酸との処理に供したか、または処理しなかった、穏やかな
過ヨウ素酸処理したEPO形態のSDS−PAGE移動度を図8で比較した。シアル酸の
過ヨウ素酸酸化に用いた条件はEPO調製物のSDS−PAGEパターンを変化させなか
った(図5と比較)。シアル酸の酸化により、HPAEC−PAD分析でオリゴ糖の溶出
時間が早まるシフトに至った(図6および図9と比較)。
HES修飾されたEPO誘導体のキャラクタリゼーション
(aa)実施例2.4に従って生成されたEPO−GT−1−Aのヒドロキシルアミン
修飾HES誘導体XでのHES修飾の時間経過
400μgのヒドロキシルアミン修飾HES誘導体Xを、0.5MのNaOAc緩衝液
(pH5.5)20μl中の、20μgのEPO−GT−1−A(穏やかな過ヨウ素酸酸
化されたEPO、穏やかな過ヨウ素酸酸化の前に酸加水分解していない)に加え、30分
、2、4および17時間後に各々液体窒素中でサンプルを凍結させることにより反応を停
止させた。続いてサンプルをさらなる分析まで−20℃で保存した。
供した。図10に示すように、インキュベーション時間を長くすると高分子量のタンパク
質向きにシフトが増す結果に至った。ヒドロキシルアミン修飾HES誘導体Xの存在下、
17時間のインキュベーションの後、分子量標準の位置に基づいて、60kDaと11k
Daの間の領域で移動する拡散したクーマシー染色タンパク質バンドが検出された(図1
0の左部分)。N−グリコシダーゼで処理したとき、たいていのタンパク質は脱N−グリ
コシル化EPOの位置に向かってシフトした(図10参照、右のゲル;矢印AはN−グリ
コシダーゼの移動位置を示し、矢印Bは脱N−グリコシル化EPOの移動位置を示す。2
8kDaと36kDa分子量標準との間の領域に見える拡散したタンパク質バンドは恐ら
くHESおよび分子のO−グリコシル化部位により修飾されたEPO形態を表す)。N−
グリコシダーゼの特異性に鑑みて、この結果から実際にHES修飾がEPOタンパク質の
グリカンの過ヨウ素酸酸化されたシアル酸残基で起こると結論付けた。
前記したようにHES−EPOコンジュゲートI(穏やかな過ヨウ素酸酸化後のEPO
−GT−1、すなわちEPO−GT−1−Aに由来する)、II(5分間の酸加水分解お
よび穏やかな過ヨウ素酸酸化に供したEPO−GT−1から得られた)、III(10分
間の酸加水分解および穏やかな過ヨウ素酸酸化に供したEPO−GT−1から得られた)
を合成した。同一緩衝液条件下で、等量の未修飾HESを加えた未修飾EPO−GT−1
を含有する対照インキュベーション(K)を含めた。続くHES−EPO誘導体の生化学
的分析のために、インキュベーション混合物をさらなる精製に供した。
ために、「材料および方法」(実施例7.8)に記載するように、インキュベーションH
ES−EPOコンジュゲートI、IIおよびIII並びに対照インキュベーションKをQ
−セファロース工程に供した。予め酸処理したサンプルIIおよびIIIに含まれる高量
の塩基性EPO形態のために、流出液中にかなりの量のこれらのインキュベーションに由
来する修飾されたEPO生成物が存在すると予測された。図11に示すように、サンプル
Iに由来するほぼ全てのEPO材料がQ−セファロースカラムに保持されたが、高い塩濃
度で溶出される分画ではサンプルIIIおよびIIはおよそ20〜30%しか回収されな
かった。HES誘導体Xを含むインキュベーションに由来する全てのタンパク質材料は、
流出液中、および高塩で溶出される分画中の双方で、SDS−PAGEでは対照EPOと
比較してより高い見かけの分子量を有した。
およびK(図11参照)を過ヨウ素酸酸化された形態EPO−GT−1−Aと比較した。
サンプルをN−グリコシダーゼ処理に供し、図12aおよび12bに示すように、N−グ
リカンの放出の結果、標準EPO調製物のO−グリコシル化および非グリコシル化EPO
形態の位置で2つの低分子量バンドに至った。サンプルAの場合、28kDa分子量標準
の位置で移動する別のバンドが検出され、これはこのEPO変種のO−グリカンでのHE
S修飾を示唆している(実施例7.11(c)(aa)参照)。このバンド(およびN−
グリコシル化EPOの多くHES修飾された高分子量形態もまた、図12aおよび図12
b参照)はサンプルを穏やかな加水分解に供した後に消失し、これはHES修飾がエリス
ロポエチンの過ヨウ素酸酸化されたシアル酸残基で達成されたとする見解に合致する。
な除去を可能にする条件を用いて、N−グリコシダーゼインキュベーション混合物のアリ
コートを加水分解し、中和後、次いでその脱塩のために混合物を小型のHypercar
bカラムに吸収させた。カラムを水で厳密に洗浄し、続いて0.1%のトリフルオロ酢酸
を含有するH2O中の40%のアセトニトリルを用いて、結合した中性のオリゴ糖を溶出
した。得られたオリゴ糖をMALDI/TOF−MSに供した。サンプルA、EPO−G
T−1−AおよびサンプルKに由来する脱シアル化されたオリゴ糖分画のスペクトルはm
/z=1810Da(2本鎖(diantennary))、2175=3本鎖(triantennary)、
2540=4本鎖(tetraantennary)、2906=4本鎖+1 N−アセチルラクトース
アミン反復、および3271=4本鎖+2 N−アセチルラクトースアミン反復で複合型
オリゴ糖と同一の質量を示した。フコース(−146)およびガラクトース(マイナス1
62)の欠如に相当する小型のシグナルが検出され、これはシアル酸除去のために適用さ
れた酸加水分解条件に起因する(MALDI−図15、16および17参照)。
吸収させ、予めオリゴ糖を酸加水分解しない)、そして0.1%のTFAを含有する水中
5%のアセトニトリルで溶出を行った。これらの条件下でEPOタンパク質は完全にRP
材料に保持され、0.1%のTFAを含有するH2O中、5%のアセトニトリルでカラム
からオリゴ糖を洗い流した。脱N−グリコシル化EPOタンパク質を、0.1%のTFA
を含有するH2O中、70%のアセトニトリルで溶出した。N−グリコシダーゼ処理した
サンプルA、EPO−GT−1−AおよびサンプルKのRP−C18工程に由来するオリ
ゴ糖分画を中和し、前記したようにHypercarbカートリッジを用いる脱塩に供し
た。グリカンからのシアル酸の定量的除去を可能にする条件下で穏やかな酸処理の前(図
13参照)および後で単離したオリゴ糖をHPAEC−PADマッピングに供した(図1
4参照)。
ファイルはオリゴ糖に関して無視できるシグナルのみを示したが、EPO−GT−1−A
由来のオリゴ糖は図9に示したものと同一のグリカンプロファイルを呈した(穏やかな過
ヨウ素酸処理の後EPO−GT−1と命名されたサンプル)。対照EPOサンプル(K)
から得られたオリゴ糖の溶出プロファイルは予測されたパターンを生じた(図6のプロフ
ァイルと比較)。比較するために、国際BRP EPO標準の天然のオリゴ糖プロファイ
ルを比較用に、および基準品として含める。
かな酸加水分解の後、全てのオリゴ糖調製物は2本鎖、3本鎖および4本鎖複合型炭水化
物鎖の予測される定量的および定性的組成を有する中性のオリゴ糖構造(図14参照)と
同一の溶出プロファイルを示した。この結果は、EPOサンプルのHES修飾は、炭水化
物を脱シアル化することが解っている穏やかな酸処理条件を用いてN−グリカンから除去
されるので、N−グリコシダーゼによりEPOタンパク質から除去され、そして酸に不安
定であるHES誘導体の共有結合に至ることを実証している(実施例12a+b参照)。
類組成分析
さらに分子のN−グリカンでのEPOのHES修飾を確認するために、EPOサンプル
をN−グリコシダーゼで消化し、EPOタンパク質をRP−C18カートリッジに吸収さ
せたが、オリゴ糖材料は前記したように洗い流した。表2に示すように、グルコースおよ
びヒドロキシエチル化グルコース誘導体はシステイン残基でHES修飾に供したEPOタ
ンパク質およびEPOサンプルA2のオリゴ糖分画においてのみ検出された。
HES修飾されたEPOの生物学的活性のインビボアッセイ
欧州薬局方に記載される手順に従って、normocythaemicマウス系のEP
Oバイオアッセイを実施した。EPOアッセイを実施した研究室は、国際BRP EPO
標準調製物を使用していた。HES修飾されたEPO A2調製物に関して、EPOタン
パク質1mgあたり294,600単位の特異活性に関する平均値を測定し、これは活性
アッセイを行うサンプルに含められた国際BRP EPO標準調製物に比較した場合、お
よそ3倍高い特異活性を示した。
〔請求項1〕
式(I):
:
R’−NH−R”
(式中、R1、R2およびR 3は独立して、水素または直鎖状もしくは分岐したヒドロキ
シアルキル基であり、R’もしくはR”、またはR’およびR”は、(I)と(II)と
の反応の前または後に、少なくとも1つの別の化合物と反応することができる少なくとも
1つの官能基Xを含む)の化合物と反応させる工程を含むヒドロキシアルキルデンプン誘
導体を生成する方法。
〔請求項2〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである請求項1に記載の
方法。
〔請求項3〕
R1、R2およびR3が独立して、水素または2−ヒドロキシエチル基である請求項1ま
たは2に記載の方法。
〔請求項4〕
R’が水素または直鎖状もしくは分岐したアルキル基またはアルコキシ基である請求項
1から3のいずれかに記載の方法。
〔請求項5〕
R’が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である請求項4に記載の方法。
〔請求項6〕
官能基Xとは別に、R”が、R’とR”とを架橋するNH基に直接連結される少なくと
も1つのさらなる官能基Wを含み、前記官能基Wは;
からなる群から選択される請求項1から5のいずれかに記載の方法。
〔請求項7〕
R’がHである場合、R’並びにR’とR”とを架橋するNH基はWと一緒に以下の基
:
〔請求項8〕
前記少なくとも1つの官能基Xが、−SH、−NH2、−O−NH2、−NH−O−アル
キル、−(C=G)−NH−NH2、−G−(C=G)−NH−NH2、−NH−(C=G
)−NH−NH2、および−SO2−NH−NH2からなる群(式中、GはOまたはSであ
り、Gが2つ存在する場合、これは独立して、OまたはSである)から選択される請求項
1から7のいずれかに記載の方法。
〔請求項9〕
式(II)による化合物が、O−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)エチル]ヒド
ロキシルアミンまたはカルボヒドラジドである請求項1から6または8のいずれかに記載
の方法。
〔請求項10〕
化合物(I)との反応の前に別の化合物と反応させていない化合物(II)を、化合物
(I)と反応させる請求項1から9のいずれかに記載の方法。
〔請求項11〕
化合物(I)と化合物(II)との反応を、水性溶媒中5〜45℃の温度で、4.5〜
6.5の範囲のpHで行う請求項10に記載の方法であって、化合物(II)がヒドロキ
シルアミンまたはヒドラジドである方法。
〔請求項12〕
化合物(I)と化合物(II)との反応を、水性溶媒中、25〜90℃の温度で、8〜
12の範囲のpHで行う請求項10に記載の方法であって、該反応が還元性アミノ化であ
る方法。
〔請求項13〕
化合物(I)と化合物(II)との反応生成物を、前記少なくとも1つの官能基Xを介
して別の化合物と反応させる請求項10から12のいずれかに記載の方法。
〔請求項14〕
前記少なくとも1つの別の化合物を、該少なくとも1つの別の化合物に含まれるチオ基
または酸化された炭水化物部分を介して反応させる請求項13に記載の方法。
〔請求項15〕
前記少なくとも1つの別の化合物がポリペプチドである請求項14に記載の方法。
〔請求項16〕
前記ポリペプチドがエリスロポエチンである請求項15に記載の方法。
〔請求項17〕
前記反応を4〜37℃の範囲の温度で実施する請求項13から16のいずれかに記載の
方法。
〔請求項18〕
前記反応を水性溶媒中で実施する請求項13から17のいずれかに記載の方法。
〔請求項19〕
前記別の化合物が架橋化合物である請求項13に記載の方法。
〔請求項20〕
化合物(I)と(II)との反応生成物と、架橋化合物との反応生成物を第2の別の化
合物と反応させる請求項19に記載の方法。
〔請求項21〕
前記第2の別の化合物がポリペプチドである請求項20に記載の方法。
〔請求項22〕
前記第2の別の化合物を、前記少なくとも1つの別の化合物に含まれるチオ基または酸
化された炭水化物部分を介して反応させる請求項20または21に記載の方法。
〔請求項23〕
前記別の化合物が、架橋化合物と第2の別の化合物との反応生成物である請求項13に
記載の方法。
〔請求項24〕
前記第2の別の化合物がポリペプチドである請求項23に記載の方法。
〔請求項25〕
化合物(I)との反応の前に化合物(II)を別の化合物と反応させる請求項1から3
のいずれかに記載の方法。
〔請求項26〕
前記少なくとも1つの別の化合物を、前記少なくとも1つの別の化合物に含まれるチオ
基または酸化された炭水化物部分を介して反応させる請求項25に記載の方法。
〔請求項27〕
前記少なくとも1つの別の化合物がポリペプチドである請求項25または26に記載の
方法。
〔請求項28〕
前記ポリペプチドがエリスロポエチンである請求項27に記載の方法。
〔請求項29〕
前記反応を4〜37℃の範囲の温度で実施する請求項25から28のいずれかに記載の
方法。
〔請求項30〕
前記反応を水性溶媒中で実施する請求項25から29のいずれかに記載の方法。
〔請求項31〕
前記別の化合物が架橋化合物である請求項25に記載の方法。
〔請求項32〕
化合物(II)との反応の前に前記架橋化合物を第2の別の化合物と反応させる請求項
31に記載の方法。
〔請求項33〕
前記別の化合物が、架橋化合物と第2の別の化合物との反応生成物である請求項25に
記載の方法。
〔請求項34〕
前記第2の別の化合物がポリペプチドである請求項33に記載の方法。
〔請求項35〕
式(I):
:
R’−NH−R”
(式中、R1、R2およびR3は独立して、水素または2−ヒドロキシエチル基であり、式
中R’は水素またはメチル基もしくはメトキシ基であり、R”は(I)と(II)との反
応の前または後に少なくとも1つの別の化合物と反応することができる、少なくとも1つ
の官能基Xを含み、該官能基Xは−SH、−NH2、−O−NH2、−NH−O−アルキル
、−(C=G)−NH−NH2、−G−(C=G)−NH−NH2、−NH−(C=G)−
NH−NH2、および−SO2−NH−NH2からなる群(式中、GはOまたはSであり、
Gが2つ存在する場合、これは独立して、GまたはSである)から選択される)の化合物
と水性溶媒中で反応させる工程を含むヒドロキシエチルデンプン誘導体を生成する方法。
〔請求項36〕
式(II)による化合物が、O−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)エチル]ヒド
ロキシルアミンまたはカルボヒドラジドである請求項35に記載の方法。
〔請求項37〕
前記化合物(I)と化合物(II)との反応生成物を、化合物(II)に含まれる少な
くとも1つの官能基Xおよびポリペプチドに含まれるチオ基または酸化された炭水化物部
分を介してポリペプチドと水性溶媒中で反応させる請求項35または36に記載の方法。
〔請求項38〕
前記ポリペプチドがエリスロポエチンである請求項37に記載の方法。
〔請求項39〕
化合物(II)を、化合物(II)に含まれる少なくとも1つの官能基Xおよびポリペ
プチドに含まれるチオ基または酸化された炭水化物部分を介してポリペプチドと水性溶媒
中で反応させ、得られた反応生成物を化合物(I)と反応させる請求項35に記載の方法
。
〔請求項40〕
前記ポリペプチドがエリスロポエチンである請求項39に記載の方法。
〔請求項41〕
式(I):
ヒドロキシエチルデンプンを、反応の前には酸化されていないその還元末端でO−[2−
(2−アミノオキシ−エトキシ)エチル]ヒドロキシルアミンと水性溶媒中で反応させる
工程と、反応生成物をエリスロポエチンと、該エリスロポエチンに含まれる酸化された炭
水化物部分を介して水性溶媒中で反応させる工程とを含むヒドロキシエチルデンプン誘導
体を生成する方法。
〔請求項42〕
式(I):
式(II):
R’−NH−R”
(式中、R1、R2およびR3は独立して、水素または直鎖状もしくは分岐したヒドロキシ
アルキル基であり、R’もしくはR”、またはR’およびR”のいずれかは、(I)と(
II)との反応の前または後で少なくとも1つの別の化合物と反応することができる少な
くとも1つの官能基Xを含む)の化合物と反応させる工程を含む方法により得ることがで
きるヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項43〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである請求項42に記載
のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項44〕
R1、R2およびR3が独立して、水素または2−ヒドロキシエチル基である請求項42
または43に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項45〕
R’が水素または直鎖状もしくは分岐したアルキル基またはアルコキシ基である請求項
42から44のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項46〕
R’が水素またはメチル基もしくはメトキシ基である請求項45に記載のヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体。
〔請求項47〕
前記官能基Xとは別に、R”がR’とR”とを架橋するNH基に直接連結される少なく
とも1つのさらなる官能基Wを含み、前記官能基Wは;
からなる群から選択される請求項42から46のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項48〕
R’がHである場合、R’と、R’とR”とを架橋するNH基とはWと一緒に以下の基
:
〔請求項49〕
前記少なくとも1つの官能基Xが、−SH、−NH2、−O−NH2、−NH−O−アル
キル、−(C=G)−NH−NH2、−G−(C=G)−NH−NH2、−NH−(C=G
)−NH−NH2、および−SO2−NH−NH2からなる群(式中、GはOまたはSであ
り、Gが2つ存在する場合、これは独立して、GまたはSである)から選択される請求項
42から48のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項50〕
式(II)による化合物が、O−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)エチル]ヒド
ロキシルアミンまたはカルボヒドラジドである請求項42に記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項51〕
前記誘導体が式(IIIa):
〔請求項52〕
R’が水素であり、前記誘導体が式(IIIa)の化合物
載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項53〕
化合物(I)と化合物(II)との反応生成物を化合物(II)に含まれる少なくとも
1つの官能基Xを介して少なくとも1つの別の化合物と反応させるか、または化合物(I
)との反応の前に化合物(II)を少なくとも1つの官能基Xを介して少なくとも1つの
別の化合物と反応させる請求項42に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項54〕
前記少なくとも1つの別の化合物を、該少なくとも1つの別の化合物に含まれるチオ基
または酸化された炭水化物部分を介して、前記化合物(II)、または前記化合物(I)
と化合物(II)との反応生成物と反応させる請求項53に記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項55〕
前記少なくとも1つの別の化合物がポリペプチドである請求項54に記載のヒドロキシ
アルキルデンプン誘導体。
〔請求項56〕
前記ポリペプチドがエリスロポエチンである請求項55に記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項57〕
前記別の化合物が架橋化合物である請求項53に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘
導体。
〔請求項58〕
前記化合物(I)と(II)との反応生成物と、前記架橋化合物との反応生成物を、第
2の別の化合物と反応させる請求項57に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項59〕
前記第2の別の化合物がポリペプチドである請求項57に記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項60〕
前記第2の別の化合物を、前記少なくとも1つの別の化合物に含まれるチオ基または酸
化された炭水化物部分を介して反応させる請求項58に記載のヒドロキシアルキルデンプ
ン誘導体。
〔請求項61〕
前記別の化合物が、架橋化合物と第2の別の化合物との反応生成物である請求項53に
記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項62〕
前記第2の別の化合物がポリペプチドである請求項61に記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項63〕
前記化合物(I)と化合物(II)との反応生成物を、化合物(II)に含まれる前記
少なくとも1つの官能基Xを介して少なくとも1つの別の化合物と反応させるか、または
化合物(I)との反応の前に化合物(II)を前記少なくとも1つの官能基Xを介して少
なくとも1つの別の化合物と反応させてなり、該少なくとも1つの別の化合物がポリペプ
チドである請求項42に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、治療上有効量で含
む医薬組成物。
〔請求項64〕
前記ポリペプチドに含まれる酸化された炭水化物部分を介して、該ポリペプチドを化合
物(II)と、または前記化合物(I)と化合物(II)との反応生成物と反応させる請
求項63に記載の医薬組成物。
〔請求項65〕
前記ポリペプチドがエリスロポエチンである請求項64に記載の医薬組成物。
〔請求項66〕
ヒドロキシエチルデンプンを以下の式:
項65に記載の医薬組成物。
〔請求項67〕
前記エリスロポエチンを、前記反応の前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する請求項66
に記載の医薬組成物。
〔請求項68〕
前記エリスロポエチンが部分的に脱シアル化され、続いて前記反応の前に過ヨウ素酸ナ
トリウムで酸化される請求項66に記載の医薬組成物。
〔請求項69〕
前記化合物(I)と化合物(II)との反応生成物を、化合物(II)に含まれる前記
少なくとも1つの官能基Xを介して少なくとも1つの別の化合物と反応させるか、または
化合物(I)との反応の前に化合物(II)を前記少なくとも1つの官能基Xを介して少
なくとも1つの別の化合物と反応させてなり、該少なくとも1つの別の化合物が架橋化合
物であり、化合物(I)と(II)との反応生成物と、架橋化合物との反応生成物をポリ
ペプチドと反応させた請求項42に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、治療上
有効量で含む医薬組成物。
〔請求項70〕
前記ポリペプチドがエリスロポエチンである請求項69に記載の医薬組成物。
Claims (1)
- 式(I)
のヒドロキシアルキルデンプンを、反応の前には酸化されていないその還元末端で式(II)
R'−NH−R" (II)
(式中、R'は水素または直鎖状もしくは分岐したアルキル基またはアルコキシ基であり、
R"は、(I)と(II)との反応の前または後に、少なくとも1つの別の化合物と反応することができる少なくとも1つの官能基Xを含むか、またはR"は、該官能基Xとは別に少なくとも1つのさらなる官能基Wを含み、
化合物(II)が、R'およびR"を架橋するNH基を介して酸化されていない式(I)の還元末端と反応し、
前記官能基Wが存在する場合には、該官能基Wが、
からなる群から選ばれ、
前記少なくとも1つの官能基Xが、−SH、−NH2、−O−NH2、−NH−O−アルキル、−(C=G)−NH−NH2、−G−(C=G)−NH−NH2、−NH−(C=G)−NH−NH2、および−SO2−NH−NH2(式中、Gは、OまたはSであり、2つ存在する場合は、Gは独立して、OまたはSである。)からなる群から選択される。)
の化合物と反応させる工程を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する方法。
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