ES2213507T3 - Derivados de almidon hidroxialquilado. - Google Patents

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Abstract

Un método de producir un derivado de hidroxialquil-almidón, que comprende hacer reaccionar un hidroxialquil-almidón de la fórmula (I) (Ver fórmula) en su extremo reductor que no está oxidado antes de dicha reacción, con un compuesto de la fórmula (II) (Ver fórmula) en donde R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado, y en donde bien R'' o R" o bien R'' y R" comprenden al menos un grupo funcional X capaz de ser hecho reaccionar con al menos otro compuesto antes o después de la reacción de (I) y (II).

Description

Derivados de almidón hidroxialquilado.
La presente invención se refiere a derivados de almidón hidroxietilado, particularmente derivados de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento en el que el almidón hidroxietilado se hace reaccionar con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de engarce. De acuerdo con una realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a derivados de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con el cual el almidón hidroxietilado se hace reaccionar con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de engarce y el producto de reacción resultante se hace reaccionar con un polipéptido, preferiblemente con una glicoproteína y especialmente preferiblemente con eritropoyetina, mediante al menos otro grupo reactivo del compuesto de engarce. Un almidón hidroxietilado que es especialmente preferido es almidón hidroxietilado. De acuerdo con la presente invención, el almidón hidroxietilado y preferiblemente el almidón hidroxietilado se hace reaccionar con el compuesto de engarce en su extremo reductor que no está oxidado antes de dicha reacción.
Almidón hidroxietilado (HES) es un derivado de la amilopectina de origen natural y se degrada por la alfa-amilasa en el cuerpo. HES es un derivado sustituido de la carbohidrato polímero amilopectina, que está presente en el almidón de maíz a una concentración de hasta 95% en peso. HES muestra propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reemplazo de volumen de sangre y en la terapia de hemodilución en los centros sanitarios (Sommermeyer et al, 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; y Weidler et al, 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498).
La amilopectina consta de restos de glucosa, en la que en los enlaces de la cadena principal de alfa-1,4-glicosídicos están presentes y se han encontrado los lugares de ramificación de los enlaces alfa-1,6-glicosídicos. Las propiedades físico químicas de esta molécula se determinan principalmente mediante el tipo de enlaces glicosídicos. Debido a que el enlace alfa-1,4-glicosídico está roto, se producen las estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por giro. Las propiedades fisicoquímicas así como las bioquímicas del polímero se pueden modificar mediante substitución. La introducción de un grupo hidroxietilo se puede lograr mediante hidroxietilación alcalina. Mediante la adaptación de las condiciones de reacción es posible explotar la reactividad diferente del grupo hidroxi respectivo en el monómero de glucosa no sustituido con respecto a una hidroxietilación. Debido a este hecho, los expertos en la técnica son capaces de influenciar el patrón de sustitución hasta un grado limitado.
Algunas formas de producir un derivado de almidón hidroxietilado se describen en la técnica.
El documento DE 26 16 086 describe la conjugación de hemoglobina con almidón hidroxietilado en la que, en una primera etapa, un agente de reticulación, por ejemplo bromociano, se une a almidón hidroxietilado y posteriormente la hemoglobina se une al producto intermedio.
Un campo importante en el que se usa HES es en la estabilización de polipéptidos que se aplican, por ejemplo, al sistema circulatorio con el fin de obtener un efecto fisiológico particular. Un ejemplo específico de estos polipéptidos es la eritropoyetina, una glicoproteína ácida de aproximadamente 34.000 kD que es esencial en la regulación del nivel de glóbulos rojos en la circulación.
Un problema bien conocido con la aplicación de polipéptidos y enzimas es que estas proteínas muestran a menudo una estabilidad no satisfactoria. Especialmente eritropoyetina tiene una semivida en plasma relativamente corta (Spivak and Hogans, 1989, Blood 73, 90; McMahon et al, 1990, Blood 76, 1718). Esto significa que los niveles en plasma terapéuticos se pierden rápidamente y se debe llevar a cabo la administración intravenosa repetida. Además, en ciertas circunstancias, se observa una respuesta inmune contra los péptidos.
En general se acepta que la estabilidad de los polipéptidos se puede mejorar y la respuesta inmune frente a estos polipéptidos se reduce cuando los polipéptidos están acoplados a moléculas poliméricas. El documento WO 94/28024 describe que los polipéptidos fisiológicamente activos modificados con polietilenglicol (PEG) muestran una inmunogenicidad y antigenicidad reducida y circulan en el torrente sanguíneo considerablemente más tiempo que las proteínas no acopladas, Es decir, tienen una velocidad de eliminación más larga Sin embargo, los conjugados PEG-fármaco muestras varias desventajas, por ejemplo, no muestran una estructura natural que se puede reconocer por los elementos de las rutas de degradación in vivo. Por lo tanto, aparte de los conjugados de PEG, se han producido otros conjugados y polímeros de proteínas. Se han descrito una pluralidad de procedimientos para la reticulación de diferentes proteínas y macromoléculas tales como polimerasa en la bibliografía (véase por ejemplo, Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, 1993, CRCS, Inc.
Los conjugados de HES-fármaco descritos en la técnica padecen la desventaja que HES no está conjugado de manera específica al fármaco. Por consiguiente, la conjugación da como resultado cualquier producto heterogéneo que tiene muchos componentes que pueden ser inactivos debido a la destrucción de la estructura de 3 dimensiones durante la etapa de conjugación. Por lo tanto, existe una necesidad de conjugados de HES-polipéptidos adicionales mejorados con estabilidad y/o bioactividad mejorada.
Un procedimiento de producción de estos conjugados usa, como material de partida, una forma oxidada de HES que se hace reaccionar con un compuesto de reticulación en el que el producto resultante se hace reaccionar con un polipéptido o modificado adicionalmente y posteriormente se hace reaccionar con un polipéptido. Una desventaja principal de este procedimiento es que en una primera etapa, el HES original se tiene que oxidar de manera selectiva, en general en su extremo reductor, mediante oxidación del grupo aldehído terminal y/o grupo hemiacetal a una lactona, de este modo haciendo el procedimiento global más difícil y caro.
El documento WO 02/080979 A2 describe compuestos que comprenden un conjugado de un agente activo y un almidón hidroxietilado en los que el agente activo y almidón hidroxietilado están o bien unidos directamente o mediante un compuesto de engarce. Con referencia al enlace directo, la reacción del agente activo y el almidón hidroxialquilado se lleva a cabo en un medio acuoso que comprende al menos 10% en peso de agua. No se proporcionan ejemplos que se refieran a un derivado de almidón hidroxietilado que se produce mediante reacción de almidón hidroxietilado en su extremo reductor con un compuesto reticulado que comprende la unidad de estructura -NH- en un medio acuoso. Todos los ejemplos se refieren a almidón hidroxietilado que se oxida antes de de una reacción adicional, la enseñanza específica del documento WO 02/080979 A2 que tienen las desventajas anteriormente mencionadas.
Thomas et al., Crit Care Med 2000, vol. 28, No. 3, describen la reacción de almidón hidroxietilado con diclorhidrato de putrescina para reducir la base de Schiff formada de esta manera mediante un complejo borano/piridina y para reaccionar el almidón hidroxietilado aminado así obtenido con isocianato fluorescente para obtener un almidón hidroxietilado fluorescente. Thomas et al. no describen el uso de un polipéptido en esta reacción, es decir, la reacción de almidón hidroxietilado con un compuesto de engarce y la reacción del producto obtenido con un polipéptido no se describe en el documento.
Thomas et al. Documento WO 03/074087 describe el acoplamiento de proteínas a un polisacárido modificado. Para las funciones de unión de SH y CHO, BMPH, EMCA, KMUH, M2C2H, MPBH y PDPH se describen como moléculas de engarce específicas. El uso de las moléculas de engarce, en particular el uso de las moléculas de engarce mencionadas anteriormente, no se describe en ninguno de los ejemplos del documento WO 03/074087.
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción de un derivado de almidón hidroxietilado que permite reaccionar el almidón hidroxietilado en su extremo reductor con un compuesto adecuado en el que el extremo reductor del almidón no está oxidado antes de la reacción.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento de producción de un derivado de almidón hidroxietilado que permite reaccionar el almidón hidroxietilado en su extremo reductor con un compuesto adecuado en el que el extremo reductor del almidón no está oxidado antes de la reacción, estando dicho procedimiento caracterizado porque el producto de la reacción del almidón hidroxietilado en su extremo reductor con un compuesto adecuado se hace reaccionar adicionalmente con al menos un compuesto adicional.
Es todavía un objeto adicional la presente invención proporcionar un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el al menos un compuesto adicional es un polipéptido, preferiblemente una proteína, mas preferiblemente eritropoyetina.
Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un derivado de almidón hidroxietilado que se puede obtener mediante un procedimiento como se ha descrito anteriormente que comprende hacer reaccionar almidón hidroxietilado en su extremo reductor con un compuesto adecuado en el que el extremo reductor del almidón no está oxidado antes de la reacción.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un derivado de almidón hidroxietilado que comprende hacer reaccionar un almidón hidroxietilado (HAS) de fórmula (I)
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en su extremo reductor que no está oxidado antes de la reacción, con un compuesto de fórmula (II)
(II)R'-NH-R''
en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado, y en la que o bien R' o R'' o R' y R'' comprenden al menos un grupo funcional X capaz de hacerse reaccionar con al menos otro compuesto antes o después de la reacción de (I) y (II), y en la que el compuesto (II) se hace reaccionar mediante el grupo NH que une mediante puentes R' y R'' con el compuesto (I) en su extremo reductor que no está oxidado; y
- en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un polipéptido; o
- en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un compuesto de reticulación y el producto de reacción con el compuesto de reticulación se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un segundo compuesto adicional y el segundo compuesto adicional es un polipéptido;
con la condición de que si el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un polipéptido, el compuesto de fórmula (II) no es BMPH (N-(ácido beta-maleimidopropiónico) hidrazida TFA); EMCA (N-(ácido epsilon-maleimidocaproico) hidrazida), KMUH (N-(ácido kappa-maleimidoundecanoico) hidrazida), M_{2}C_{2}H (4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil-hidrazida HCl), MPBH (4-(ácido 4-N-maleimidofenil)butírico hidrazida HCl), PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida).
En el contexto de la presente invención, el término "almidón hidroxietilado" (HAS) se refiere a un derivado de almidón que se ha sustituido por al menos un grupo hidroxialquilo. Por lo tanto, el término almidón hidroxietilado como se usa en la presente invención no se limita a compuestos donde el resto carbohidrato terminal comprende grupos hidroxialquilo R_{1}, R_{2}, y/o R_{3} como se ha mostrado, por motivo de brevedad, en la fórmula (I), sino que también se refiere a un compuestos que presenten al menos un grupo hidroxi presente en cualquier parte, o bien en el resto carbohidrato terminal y/o en la parte remanente de la molécula de almidón, HAS', está sustituido por un grupo hidroxialquilo R_{1}, R_{2}, o R_{3}.
En este contexto, el grupo alquilo puede ser un grupo alquilo lineal o ramificado que puede estar adecuadamente sustituido. Preferiblemente, el grupo hidroxialquilo contiene 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente entre 1 y 6 átomos de carbono, más preferiblemente entre y 4 átomos de carbono, e incluso más preferiblemente 2-4 átomos de carbono. "Almidón hidroxietilado" por lo tanto preferiblemente comprende almidón hidroxietilado, almidón hidroxipropilado y almidón hidroxibutilado, en el que el almidón hidroxietilado y almidón hidroxipropilado se prefieren particularmente.
Almidón hidroxietilado que comprende dos o más grupos hidroxialquilo diferentes son también posibles.
El al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS puede contener dos o más grupos hidroxi. De acuerdo con una realización preferida, el al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS contiene un grupo hidroxi.
La expresión "almidón hidroxietilado" también incluye derivados en los que el grupo alquilo está mono- o polisustituido. En este contenido, se prefiere que el grupo alquilo está sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo, siempre que el HAS permanezca soluble en agua. Además, el grupo hidroxi terminal de un grupo hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado.
Además, en lugar de alquilo, también se pueden usar grupos alqueno lineales o ramificados sustituidos o no sustituidos.
Almidón hidroxietilado es un derivado de éter de almidón. Además de dichos derivados de éter, también se pueden usar otros derivados de almidón en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, los derivados que son útiles comprenden grupos hidroxiesterificados. Estos derivados pueden ser por ejemplo, derivados de ácidos mono- o dicarboxílicos no sustituidos con 2-12 átomos de carbono o de derivados sustituidos de los mismos. Son especialmente útiles derivados de ácidos monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente derivados de ácido acético. En este contexto, almidón acetilado, almidón butilado y almidón propilado son preferidos.
Además, se prefieren derivados de ácidos dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono.
En el caso de derivados de ácidos dicarboxílicos, es útil que el segundo grupo carboxi del ácido dicarboxílico está también esterificado. Además, los derivados de monoalquil ésteres de ácidos dicarboxílicos son también adecuados en el contexto de la presente invención.
Para los ácidos mono o dicarboxílicos sustituidos, los grupos sustitutos pueden ser preferiblemente los mismos como se han mencionado anteriormente para los restos alquilo sustituidos.
Las técnicas para la esterificación de almidón se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especialmente el capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).
Almidón hidroxietilado (HES) es el más preferido para todas las realizaciones de la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el almidón hidroxietilado es almidón hidroxietilado.
HES se caracteriza principalmente por la distribución de peso molecular y el grado de substitución. Existen dos posibilidades de descripción del grado de substitución:
1. El grado de substitución se puede describir con relación a la parte de monómeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los restos de glucosa (DS).
2. El grado de substitución se puede describir como la " substitución molar" (MS), en la que se describen el número de grupos hidroxietilo por resto de glucosa.
Las soluciones de HES están presentes como composiciones polidispersas, en las que cada molécula se diferencia de la otra con respecto al grado de polimerización, el número y patrón de sitios de ramificación, y el patrón de substitución. HES es por lo tanto una mezcla de compuestos con diferente peso molecular. Por consiguiente, una solución particular de HES se determina mediante el peso molecular medio con la ayuda de medios estadísticos. En este contexto, Mn se calcula como la media aritmética dependiendo del número de moléculas. Como alternativa, M_{w}, la media de peso, representa una unidad que depende de la masa del HES.
En el contexto de la presente invención, almidón hidroxietilado puede tener un peso molecular medio (media de peso) de entre 1 y 300 kDa, en el que un peso molecular medio entre 5 y 100 kDa es más preferido. Almidón hidroxietilado puede además mostrar un grado molar de sustitución de entre 0,1 y 0,8 y una relación entre la sustitución C2 : C6 en el intervalo de entre 2 y 20 con respecto a los grupos hidroxietilo.
En la medida posible los restos R_{1}, R_{2} y R_{3} de acuerdo con la fórmula (I) se refiere a que no existen limitaciones específicas dadas para que el compuesto (I) sea capaz de hacerse reaccionar con un compuesto de acuerdo con la fórmula (II). De acuerdo con una realización preferida, R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono. Se prefieren hidrógeno y grupos hidroxialquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono. El grupo alquilo, arilo, aralquilo y/o alcarilo pueden ser lineales o ramificados y estar sustituidos de manera adecuada.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado con entre 1 y 6 átomos de carbono.
De este modo, R_{1}, R_{2} y R_{3} puede ser un grupo hidroxihexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo tales como 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 1-hidroxiisopropilo, 2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo tales como1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, o hidroximetilo. Se prefieren hidrógeno y grupos hidroxietilo, siendo especialmente preferido hidrógeno y el grupo 2-hidroxietilo.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo.
De acuerdo con la presente invención, almidón hidroxietilado se hace reaccionar con un compuesto de fórmula (II) en la que el compuesto (II) se puede hacer reaccionar con otro compuesto antes de la reacción con el compuesto (I), para proporcionar un derivado de almidón hidroxietilado. Como el compuesto (II), no existen limitaciones específicas si el compuesto (II) es capaz de hacerse reaccionar mediante el grupo NH que une por puentes R' y R'' con el compuesto (I) en su extremo reductor que no está oxidado, para proporcionar un derivado de almidón hidroxietilado.
Los restos preferidos de R' del compuesto (II) son hidrógeno y restos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo en los que los restos cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar unidos directamente a un grupo NH que une por puentes R' y R'' del compuesto (II) o, de acuerdo con otra realización, puede estar unido mediante un puente de oxígeno al grupo NH que une por puentes R' y R'' del compuesto (II). Los restos alquilo, arilo, aralquilo o alcarilo pueden estar sustituidos de manera adecuada. Como sustituyentes preferidos, se pueden mencionar, halógenos tales como F, Cl o Br. Los restos especialmente preferidos de R' son hidrógeno, grupos alquilo y alcoxi, e incluso son más preferidos hidrógeno y los grupos son alquilo y alcoxi no sustituidos.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que R' es hidrógeno o un grupo alquilo o alcoxilintal o ramificado.
Entre los grupos alquilo y alcoxi, se prefieren los grupos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 átomos de carbono. Más preferidos son los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi, e isopropoxi. Especialmente preferidos son metilo, etilo, metoxi, etoxi, una preferencia particular se proporciona para metilo o metoxi.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que R' es hidrógeno o un grupo metilo o metoxi.
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Aparte del grupo funcional X, R'' puede comprender al menos un grupo funcional adicional W. Éste al menos un, grupo funcional adicional, W en general puede estar en cualquier sitio en R''. Preferiblemente, W está unido directamente al grupo NH R' está también unido.
En general, no existen limitaciones específicas con relación al grupo funcional W dado, para que el compuesto (I) es capaz de reaccionar con el compuesto (II). En las realizaciones preferidas, el grupo funcional W comprende la unidad de estructura -NH y/o la unidad de estructura -(C=G)- donde G es O o S, y/o la unidad de estructura -SO_{2}-, De acuerdo con realizaciones más preferidas, el grupo funcional W se selecciona entre el grupo constituido por
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y
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donde, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.
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De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención cuando R' es H y W está unido directamente al grupo NH que une por puentes R' y R'', R' y el grupo NH que une por puentes R' y R'' forman, conjuntamente con W, uno de los siguientes grupos:
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Siempre que el al menos un grupo funcional X que está comprendido en R' y/o R'', preferiblemente en R'', no existen limitaciones específicas. En general, son posibles todos los grupos funcionales que permiten que la reacción con al menos un compuesto adicional.
Siempre que esta reacción se refiera a un compuesto adicional se, todos los tipos de interacciones de al menos un grupo funcional con el al menos un compuesto adicional son posibles, Entre otras, las reacciones de el al menos un grupo funcional X con un compuesto adicional son posibles que conducen a un enlace covalente, un enlace iónico y/o un enlace de van-der-Waals, siendo el enlace covalente especialmente preferido.
Entre otros, los siguientes grupos funcionales X se tienen que mencionar:
- Dobles enlace C-C-o triples enlace C-C o enlaces aromáticos C-C-;
- el grupo tio o los grupos hidroxi;
- ácido alquil sulfónico hidrazida, ácido aril sulfónico hidrazida;
- 1,2-dioles;
- 1,2-aminoalcoholes;
- el grupo amino -NH_{2} o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad de estructura -NH- tales como los grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarliamino;
- el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad de estructura -O-NH-, tales como los grupos hidroxilalquilamino, hidroxilarilamino, hidroxilaralquilamino, o grupos hidroxalalcarilamino;
- grupos alcoxiamino, ariloxiamino, aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad de estructura -NH-O-;
- restos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en los que G es O o S, y M es, por ejemplo,
-OH o -SH;
- un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aralaquiloxi, o un grupo alcariloxi; un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquilltio, o un grupo alcariltio;
- un grupo alquilcarboniloxi, un grupo arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi, un grupo alcarilcarboniloxi; ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen una una estructura imid tal como N-hidroxisuccinimida o una unidad de estructura O-N donde N es parte de un compuesto heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tales como compuesto de ariloxi con un resto de arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o troclorofenilo;
en los que Q no está o NH o un heteroátomo tal como S u O;
-NH-NH2, o -NH-NH-;
-NO2;
- el grupo nitrilo;
- grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;
- el grupo carboxi;
- grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
- grupos haluro de vinilo tales como yoduro de vinilo o el grupo bromuro de vinilo o viniltriflato;
-C\equivC-H;
-(C=NH_{2}Cl)-OAlquilo
- grupos -(C=O)-CH_{2}-Hal en el que Hal es Cl, Sr, o I;
-CH=CH-SO2-;
- un grupo disulfuro que comprende ka estructura -S-S-;
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- el grupo
5
- el grupo
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Entre estos grupos, el grupo tio, el grupo amino, el grupo hidroxilamino, los grupos alcoxiamino y los siguientes grupos son especialmente preferidos:
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Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el al menos un grupo funcional X se selecciona entre el grupo constituido por -SH, -NH_{2}, -O-NH_{2}, -NH-O-alquilo, -(C=G)-NH-NH_{2}, -G-(C=G)-NH-NH_{2}, -NH-(C=G)-NH-NH_{2}, y -SO_{2}-NH-NH_{2} donde G es O o S y, si G está presente dos veces, es independientemente O o S.
En lo que se refiere a los grupos alcoxiamino, se proporciona una preferencia particular al grupo de etoxiamino y al grupo metoxiamino, siendo el grupo metoxiamino -NH-O-CH_{3} especialmente preferido.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, el al menos un grupo funcional X puede ser un grupo que no es capaz de reaccionar directamente con un compuesto dado adicional pero que se puede modificar químicamente con el fin de que sean capaces de reaccionar de la forma deseada. Esta modificación del grupo funcional X comprendida en el compuesto (II) se puede llevar a cabo o bien antes de la reacción del compuesto (II) con el compuesto (I) o después de la reacción del compuesto (II) con el compuesto (I). Si en el compuesto (II) comprende al menos dos, opcionalmente químicamente diferentes, grupos funcionales X, es posible para modificar al menos un grupo funcional X antes de la reacción del compuesto (II) con el compuesto (I) y al menos un grupo funcional X después de la reacción del compuesto (II) con el compuesto (I).
Como un ejemplo de un grupo funcional X a modificar antes de la reacción con un compuesto adicional, un 1,2-amino alcohol o un 1,2-diol se puede mencionar que está modificado, por ejemplo, mediante oxidación para formar un grupo aldehído o una ceto.
Otro ejemplo para un grupo funcional X a modificar antes de la reacción con un compuesto adicional es un grupo -NH_{2} que está modificado por la reacción con, por ejemplo, un compuesto de acuerdo con la siguiente fórmula
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para proporcionar una estructura de la fórmula
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que es, por ejemplo, reactive hacia un grupo tio.
Otro ejemplo para un grupo funcional X a modificar antes de la reacción con un compuesto adicional es un grupo -NH_{2} que se modifica mediante la reacción con, por ejemplo, un compuesto de acuerdo con la siguiente fórmula
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para proporcionar una estructura de la siguiente fórmula
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que es, por ejemplo, reactivo hacia un grupo tio.
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El al menos un grupo funcional X puede estar unido directamente al grupo NH que une por puentes R' y R''. De este modo, de acuerdo con una realización de la presente invención, el grupo funcional X es equivalente a R''. Los ejemplos específicos de los compuestos donde X está unido directamente al grupo NH que une por puentes R' y R'' son, entre otros,
H_{2}N-NH_{2}
o
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Otro ejemplo específico de tal compuesto que también está comprendido en la presente invención es NH3.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, el grupo NH que une por puentes R' y R'' puede estar separado del al menos un grupo funcional X mediante un grupo lineal o ramificado alquilo o cicloalquilo o arilo o aralquilo o arilcicloalquilo o alcarilo o cicloalquilarilo, en la que estos grupos pueden comprender al menos un heteroátomo tal como N, O, S, y en la que estos grupos pueden estar sustituidos de manera adecuada. El tamaño del grupo que separa NH, que une por puentes R' y R'', y en al menos un grupo funcional X. se puede adaptar a necesidades específicas. En general, el grupo de separación tiene en general entre 1 y 60, más preferiblemente entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 10, más preferiblemente entre 1 y 6 y especialmente preferiblemente entre 1 y 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo de separación comprende en general entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 8 y especialmente preferiblemente entre 1 y 4 heteroátomos. De acuerdo con realizaciones particularmente preferidas de la presente invención, el grupo de separación comprende entre 1 y 4 átomos de oxígeno. El grupo de separación puede comprender una cadena alquilo ramificada opcionalmente o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte alquilo puede ser un grupo linear y/o cíclico alquilo. De acuerdo con una realización incluso más preferida, el grupo de separación es una cadena alquilo de entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 8, más preferiblemente entre 1 y 6, más preferiblemente entre 1 y 4 y especialmente preferiblemente entre 2 y 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, una cadena que comprende entre 1 y 4 átomos de oxígeno es particularmente preferida.
Los ejemplos específicos de los compuestos (II) donde X está separado del grupo NH que une por puentes R' y R'' son, entre otros,
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El grupo NH, de separación, que une por puentes R' y R'', y el al menos un grupo funcional X puede estar sustituido de manera adecuada.
Los sustituyentes preferidos son, por ejemplo, haluros tales como F, Cl, Br o Y.
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El grupo NH de separación, que une por puentes R' y R'', y el al menos un grupo funcional X puede comprender uno o más sitios de escisión tal como
-S-S-
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que permite una fácil escisión de un compuesto resultante en un sitio predeterminado.
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De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, el compuesto (II) es 0-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etill]-hidroxil amina
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o carbohidrazida
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Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el compuesto (II) es O-[2-(2aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina o carbohidrazida.
En el caso del compuesto (II) comprende uno o más centros quirales, el compuesto (II) puede estar presente en la conformación R o en la conformación S o como un compuesto racémico con respecto a cada centro quiral
La reacción del compuesto (I) con el compuesto (II) como tal se puede llevar a cabo en al menos un disolvente adecuado. El disolvente respectivo o una mezcla de dos o más disolventes se puede adaptar a las necesidades específicas de las condiciones de reacción y la naturaleza química de de los compuestos (I) y (II). De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, se usa agua como disolvente, o bien solo o en combinación con al menos otro disolvente. Se pueden mencionar al menos otros disolventes, DMSO, DMF, metanol y etanol. Los disolventes preferidos distintos de agua son DMSO, DMF, metanol y etanol.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del compuesto (I) con el compuesto (II) se lleva a cabo en un sistema acuoso.
El término "sistema acuoso" como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un disolvente o o una mezcla de disolventes que comprende agua en el intervalo de entre al menos 10% en peso, preferiblemente al menos 50% en peso, más preferiblemente al menos 80% en peso, incluso más preferiblemente al menos 90% en peso o hasta 100% en peso, basado en el peso de los disolventes implicados. El medio de reacción preferido es agua.
Siempre que las temperaturas que se aplican durante la reacción sean consecuentes, no existen limitaciones específicas cuando la reacción da como resultado el derivado de almidón hidroxietilado deseado.
En el caso que el compuesto (I) se hace reaccionar con compuesto (II), siendo el compuesto (II) una hidroxilamina o una hidrazida, la temperatura está preferiblemente en el intervalo de entre 5 y 45ºC, más preferiblemente en el intervalo de entre 10 y 30ºC y especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 15 y 25ºC.
En el caso que el compuesto (I) se haga reaccionar con el compuesto, (II), siendo dicha reacción una aminación reductora, la temperatura está preferiblemente en el intervalo de hasta 100ºC, más preferiblemente en el intervalo de entre 20 a 95ºC, más preferiblemente en el intervalo de entre 25 a 90ºC, más preferiblemente en el intervalo de entre 70 a 90ºC y especialmente preferiblemente en el intervalo de 75 a 85ºC.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo el compuesto (II) una hidroxilamina o una hidrazida, se lleva a cabo a una temperatura de entre 5 y 45ºC.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo dicha reacción una aminación reductora, se lleva a cabo a una temperatura de entre 25 y 90ºC.
Durante el curso de la reacción la temperatura se puede variar, preferiblemente en los intervalos proporcionados anteriormente, o se mantienen esencialmente constante.
El tiempo de reacción para la reacción del compuesto (I) con (II) se puede adaptar a las necesidades específicas y está en general en el intervalo de entre 1 h y 7 d.
En el caso que el compuesto (II) sea una hidroxilamina o una hidrazida, el tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de entre 1 h y 3 d y más preferiblemente de entre 2 h y 48 h.
En el caso que la reacción del compuesto (I) y compuesto (II) sea una aminación reductora, el tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de entre 2 h a 7 d.
El valor de pH para la reacción del compuesto (I) con (II) se puede adaptar a las necesidades específicas tal como la naturaleza química de los reactivos.
En el caso que el compuesto (II) sea una hidroxilamina o una hidrazida, el valor de pH está preferiblemente en el intervalo de entre 4,5 y 6,5.
En el caso que la reacción del compuesto (I) y compuesto (II) sea una aminación reductora, el valor de NH está preferiblemente en el intervalo de entre 8 y 12.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo el compuesto (II) una hidroxilamina o una hidrazida, se lleva a cabo a un pH de entre 4,5 y 6,5.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo dicha reacción una aminación reductora, se lleva a cabo a un pH de entre 8 y 12.
Los ejemplos específicos de las condiciones de reacción descritas anteriormente son, por ejemplo, una temperatura de reacción de aproximadamente 25ºC y un pH de aproximadamente 5,5 en caso que el compuesto sea una hidroxilamina, y una temperatura de reacción de aproximadamente 80ºC y un pH de aproximadamente 11 en caso que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) sea una aminación reductora.
El valor adecuado de pH de la mezcla de reacción se puede ajustar añadiendo al menos un tampón adecuado. Entre los tampones preferidos, se pueden mencionar tampón acetato de sodio, tampones fosfato o borato.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el producto de reacción que se produce a partir de la reacción del compuesto (I) con el compuesto (II) se hace reaccionar con al menos un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X.
Si es necesario, el al menos un grupo funcional X se puede proteger con al menos un grupo protector adecuado antes de la reacción del compuesto (I) con el compuesto (II). A este respecto, son posibles todos los grupos de protección concebibles que evitan que el compuesto (II) protegido reaccione con el compuesto (I) mediante el al menos un grupo funcional X. Por lo tanto, el grupo de protección se puede elegir dependiendo de la naturaleza química del grupo funcional X a proteger, de, por ejemplo, el disolvente la reacción se lleva a cabo en o el pH de la mezcla de reacción. Los grupos de protección preferidos son, entre otros, el grupo benciloxicarbonil, el grupo terc-butoxicarbonilo, el grupo metoxifenilo, el grupo 2,4-dimetoxifenilo, grupos triaril metilo, tritilo, el grupo monometoxitritilo, el grupo dimetoxitritilo, el grupo monometiltritilo, el grupo dimetiltritilo, el grupo trifluoracetilo, compuestos de ftalimin, compuestos de 2-(trialquilsilil)etoxicarbonilo, Fmoc, el grupo terc-butilo, o grupos trialquil sililo.
Si están presentes dos o más grupos funcionales X en el compuesto (II), al menos un grupo puede estar protegido mientras al menos otro grupo puede quedarse sin proteger.
Después de la reacción del compuesto (I) con el compuesto (II), el al menos un grupo de protección puede quedarse en el producto de reacción o eliminarse mediante procedimientos adecuados tales como los procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Si dos grupos funcionales diferentes X están protegidos mediante grupos de protección, es posible eliminar al menos un grupo de protección con el fin de preparar al menos un grupo funcional X disponible para la reacción adicional con al menos un compuesto adicional, y dejar al menos otro grupo funcional protegido hasta que el producto de reacción del compuesto (I) con el compuesto (II) se haga reaccionar con el compuesto adicional. Después, el grupo de protección del grupo funcional todavía protegido se puede eliminar para preparar el grupo funcional X remanente disponible pata la reacción con incluso un compuesto adicional.
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El uso de al menos un grupo de protección puede ser importante para evitar que la reacción dé como resultado un derivado de almidón hidroxietilado que consta de un compuesto (II) que se ha hecho reaccionar con dos o más compuestos (I), es decir, un compuesto (II) múltiple sustituido de HAS. Sin embargo, se puede lograr el mismo resultado haciendo reaccionar el compuesto (I) con un exceso del compuesto (II). Si se usa una cantidad en exceso del compuesto (II) en el procedimiento de la presente invención, la relación molar del compuesto (II) al compuesto (I) está preferiblemente en el intervalo de entre 2 y 100.
Una vez que se forma el producto de reacción de la reacción del compuesto (I) con el compuesto (II), se puede aislar a partir de la mezcla de reacción mediante al menos un procedimiento adecuado. Si es necesario, el producto de reacción se puede precipitar antes del aislamiento mediante al menos una vez por procedimientos adecuados.
Si el producto de reacción se precipita primero, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes distinto del disolvente o mezcla de disolventes presentes en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención si se usa agua como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con una mezcla de etanol y acetona, preferiblemente una mezcla 1:1, indicando volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el intervalo de entre -20 y +50ºC y especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 0 y 25ºC.
El aislamiento del producto de reacción se puede llevar a cabo mediante un procedimiento adecuado que puede comprender una o más etapas. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el producto de reacción se separa primero de la mezcla de reacción para la mezcla de mezcla de reacción con, por ejemplo, la mezcla etanol-acetona mediante un procedimiento adecuado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el producto de reacción separado se puede someter a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior como diálisis, filtración centrífuga o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o liofilización De acuerdo con una realización incluso más preferida, el producto de reacción separado se dializa primero, preferiblemente contra agua, y después se liofiliza hasta que el contenido en disolvente del producto de reacción es suficientemente baja de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto. La liofilización se puede llevar a cabo a temperatura de entre 20 y 35ºC, preferiblemente de entre 25 y 30ºC.
El producto de reacción así aislado del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar adicionalmente con al menos otro compuesto mediante al menos un grupo funcional X comprendido en dicho producto de reacción.
Para esta reacción, se pueden usar uno o más disolventes adecuados, y todos los parámetros de reacción tal como la temperatura durante la reacción, el tiempo de reacción, las relaciones de los reactivos o el valor de pH de la mezcla de reacción se pueden adaptar a las necesidades específicas.
De acuerdo con la primera realización de la presente invención, el al menos un compuesto capaz de formar un enlace químico con el al menos un grupo funcional X es un polipéptido o una mezcla de al menos dos polipéptidos diferentes.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un polipéptido mediante el grupo funcional X comprendido en el compuesto (II).
De acuerdo con la segunda realización de la presente invención, el al menos un compuesto adicional capaz de formar un enlace químico con el al menos un grupo funcional X es un compuesto de reticulación que es capaz de formar un primer enlace químico con el al menos un grupo funcional X del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), y un segundo enlace químico con un segundo compuesto adicional, que es un polipéptido o una mezcla de al menos dos polipéptidos diferentes.
En el contexto de esta realización de la presente invención, el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), el primer derivado de almidón hidroxietilado, se hace reaccionar con el compuesto de reticulación para proporcionar un segundo derivado de almidón hidroxietilado. Este segundo derivado de almidón hidroxietilado se hace reaccionar posteriormente con los segundos compuestos adicionales, el polipéptido, para proporcionar un tercer derivado de almidón hidroxietilado.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el producto de reacción de los compuestos (I) y (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional, siendo dicho compuesto adicional un compuesto de reticulación, mediante la reacción de un grupo funcional V comprendido en el compuesto de reticulación y un grupo funcional X comprendido en el producto de reacción de los compuestos (I) y (II).
De acuerdo con realizaciones especialmente preferidos de la presente invención, los compuestos de reticulación se usan para formar un puente químico entre el producto de reacción de los compuestos (I) y (II), y un segundo compuesto adicional en el que el grupo funcional del segundo compuesto adicional que reacciona con el compuesto de reticulación es un grupo -SH o un grupo aldehído o un grupo ceto, y el grupo funcional del producto de reacción de los compuestos (I) y (II) que reacciona con el compuesto de reticulación es un grupo que comprende la estructura -NH-, particularmente preferiblemente -NH_{2}.
En el contexto de la presente invención, el término "compuesto de reticulación" se refiere a compuestos químicos que son capaces de formar un enlace entre el producto de reacción de los compuestos (I) y (II), y al menos un segundo compuesto adicional dado. Dependiendo de la naturaleza química del segundo compuesto adicional, el compuesto de reticulación comprende al menos un grupo funcional V capaz de hacerse reaccionar con el grupo funcional X comprendido en el producto de reacción de los compuestos (I) y (II), y al menos un grupo funcional adicional que es capaz de formar un enlace químico con el segundo compuesto adicional. Este al menos un grupo funcional adicional comprendido en el compuesto de reticulación puede ser un grupo funcional del tipo descrito anteriormente con relación al grupo funcional X.
El compuesto de reticulación se puede usar para ampliar la longitud del puente químico global entre el compuesto (I) y el segundo compuesto adicional, un polipéptido, y/o para influir en la naturaleza química del producto de reacción resultante, o bien con o sin el segundo compuesto adicional, y/o proporcionar la posibilidad de formar un enlace entre varios segundos compuestos adicionales y el producto de reacción del compuesto (I), (II) y el compuesto de reticulación, y/o para modificar químicamente el grupo funcional X comprendido en el producto de reacción del compuesto (I) y (II) con el fin de hacer que dicho producto de reacción sea capaz de hacer reaccionar con compuesto adicional dado.
De este modo, las realizaciones de la presente invención que se describen anteriormente y que se refieren a la modificación química del grupo funcional X que es un grupo -NH_{2}, con un compuesto adicional, por ejemplo,
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con el fin de proporcionar la posibilidad para la reacción con un grupo -SH comprendido en un segundo compuesto adicional, un polipéptido, son ejemplos específicos de hacer reaccionar el producto de reacción de los compuestos (I) y (II) con un compuesto de reticulación.
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De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el grupo funcional V puede ser un grupo funcional del tipo descrito anteriormente como grupo X.
De acuerdo con otra realización preferida, o bien el grupo funcional X o el grupo funcional V es un grupo tio y el grupo funcional V o grupo funcional X se selecciona preferiblemente entre el grupo constituido por
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en la que Hal es Cl, Br, o Y, preferiblemente Br o I.
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De acuerdo con todavía otra realización preferida, o bien el grupo funcional X o el grupo funcional V se selecciona preferiblemente entre el grupo constituido por un éster activado como se ha descrito anteriormente o un grupo carboxi que está opcionalmente transformado en un éster activado. En este caso particular, el grupo funcional V o el grupo funcional X, respectivamente, comprende la estructura química -NH-.
Por lo tanto, el compuesto de reticulación es un compuesto que tiene al menos dos grupos funcionales que son iguales o diferentes. En el caso de dos grupos funcionales, el compuesto de reticulación puede ser homobifuncional o heterobifuncional. Un compuesto de reticulación homobifuncional, por ejemplo, proporciona la posibilidad de formar un puente entre el producto de reacción del compuesto (I) con (II) y un segundo compuesto adicional, el producto de reacción y teniendo el compuesto adicional el mismo tipo de grupos funcionales. Un compuesto de reticulación heterobifuncional, por ejemplo, proporciona la posibilidad de formar un puente entre el producto de reacción de compuestos (I) con (II) y un segundo compuesto adicional, teniendo el producto de reacción y el compuesto adicional los grupos funcionales que no son capaces de reaccionar entre sí.
Los al menos dos grupos funcionales del compuesto de reticulación pueden estar ligados directamente conjuntamente o pueden estar separados por un grupo lineal o ramificado alquilo o cicloalquilo o aril o aralquilo o arilcicloalquilo o alcarilo o cicloalquilarilo, donde estos grupos pueden comprender al menos un heteroátomo tal como N, O, S, y donde estos grupos pueden estar sustituidos de manera adecuada. La longitud del grupo que separa los al menos dos grupos funcionales del compuesto de reticulación se puede adaptar a las necesidades específicas. En general, el grupo de separación tiene entre 1 y 60, preferiblemente entre 1 y 40, más preferiblemente entre 1 y 20, más preferiblemente entre 1 y 10, más preferiblemente entre 5 y 10 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo de separación comprende en general entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 8 y especialmente preferiblemente entre 1 y 4 heteroátomos. De acuerdo con una realización preferida incluso más preferida, el grupo de separación es una cadena alquilo o aralquilo de entre 1 y 20 átomos de carbono. Además, el compuesto de reticulación puede comprender además al menos un sitio de escisión como se ha descrito anteriormente con relación al compuesto (II).
Otros ejemplos de los compuestos de reticulación que se han de mencionar en el contexto de la presente invención se pueden catalogar, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente lista:
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En la Tabla 1 al final de la presente descripción, se enumeran algunos ejemplos preferidos de los compuestos de reticulación.
En el caso que el al menos un compuesto adicional, por ejemplo, el compuesto de reticulación, comprenda uno o más centros quirales, el al menos un compuesto adicional puede estar presente en conformación R o en conformación S o como compuesto racémico con respecto a cada centro quiral.
El término "polipéptido" como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un compuesto que comprende al menos al menos 2 aminoácidos que están ligados mediante un enlace peptídico, Es decir, un enlace con estructura -(C=O)-NH-. El polipéptido puede ser un compuesto de origen natural o un polipéptido que no se produce de manera natural, comprendiendo el último aminoácidos de origen natural y/o al menos un aminoácido que no se produce de manera natural. La estructura central del polipéptido, la cadena de polipéptido, puede además estar sustituida con al menos un sustituyente adecuado teniendo de este modo al menos una cadena lateral. El al menos un grupo funcional Y puede ser parte de la estructura central del polipéptido o de al menos un sustituyente de la estructura central en la que son posibles realizaciones que comprenden al menos un grupo funcional que es parte de la estructura central del polipéptido y al menos un grupo funcional que es parte de al menos un sustituyente de la estructura central del polipéptido.
En lo que se refiere al polipéptido, no existen restricciones, siempre que el polipéptido comprenda al menos un grupo funcional Y. Dicho grupo funcional Y puede estar unido directamente a la estructura central del polipéptido o ser parte de una cadena lateral de la estructura central. O bien la cadena lateral o grupo funcional Y o ambos pueden ser parte de un polipéptido de origen natural o se puede introducir en un polipéptido de origen natural o en un polipéptido que, al menos parcialmente, no se produce de origen natural, antes de la reacción con el grupo funcional X.
Además, el polipéptido puede ser, al menos parcialmente, de cualquier origen humano o animal. En una realización preferida, el polipéptido es de origen humano.
El polipéptido puede ser una citoquina, especialmente eritropoyetina, una antitrombina (AT) tal como AT III, una interleuquina, especialmente interleuquina-2, IFN-beta, IFN-alfa, G-CSF, CSF, interleuquina-6 y anticuerpos terapéuticos.
De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido es una antitrombina (AT), preferiblemente AT III (Levy JH, Weisinger,A, Ziomek CA, Echelard Y, Recombinant Antithrombin: Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4 (2001) 405-416; Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, Hanson E, Bernasconi R, Higgins E, Manavalan P, Ziomek C, Meade H, McFerson J, Cole ES, Transgenically, Produced Human Antithrombin: Structural and Funcional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671; Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM, Lubbers YTP, Pratt BM, Whittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons letally challenged with Escherichia coli, Blood 95, 4 (2000) 1117-1123; Van Patten SM, Hanson EH, Bernasconi R, Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McFerson JM, Edmunds T, Oxidación de Metionine Residues in Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274,15 (1999) 10268-10276).
De acuerdo con otra realización preferida, es polipéptido es IFN-beta de tipo humano, en particular IFN-beta 1a (cf. AvoneX®, REBIF®) y IFN-beta 1b (cf. BETASERON®).
Un polipéptido preferido adicional es G-CSF de tipo humano (factor de estimulación de la colonia de granulocitos). Véase, por ejemplo, Nagata et al., The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor, EMBO J. 5: 575-581,1986; Souza et al., Recombinant human, granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 232 (1986) 61-65; and Herman et al., Characterization, formulation, and stability of Neupogen® (Filgrastim), a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor, in: Formulation, characterization, and stability of protein drugs; Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Press, New York, 1996,303-328.
Si se usa una mezcla de al menos dos polipéptidos diferentes, los al menos dos polipéptidos pueden ser diferentes, por ejemplo, en la masa molecular, el número y/o secuencia de aminoácidos, grados diferentes de glicosilación, el número y/o naturaleza química de los sustituyentes o el número de cadenas de polipéptido unidas mediante enlaces químicos adecuados tales como puentes disulfuro.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), opcionalmente además, se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, se aísla, preferiblemente de acuerdo con al menos uno de los procedimientos anteriormente mencionados, y después se hace reaccionar con un polipéptido que tiene al menos un grupo funcional Y capaz de hacerse reaccionar con el al menos un grupo funcional X del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), opcionalmente además se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, para formar al menos un enlace químico. Los grupos funcionales Y de polipéptidos tales como proteínas son, por ejemplo,
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-SH -OH
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o un resto carbohidrato que puede estar unido al polipéptido mediante N-glicosilación u O-glicosilación.
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En el contexto de la presente invención, el término "resto carbohidrato" se refiere a hidroxialdehídos o hidroxicetonas así como a sus modificaciones químicas (véase Römpp Chemielexikon, Tieme Verlag Stuttgart, Alemania, 9ª edición 1990, Volumen 9, páginas 2281-2285 y la bibliografía citada en el documento). Además, también se refiere a derivados de restos carbohidrato de origen natural como glucosa, galactosa, manosa, ácido siálico y similares. El término también incluye restos carbohidrato oxidados químicamente, de origen natural. La estructura del resto carbohidrato oxidado puede ser cíclico o lineal.
El resto carbohidrato puede estar ligado directamente a la estructura central del polipéptido. Preferiblemente, el resto carbohidrato es parte de una cadena lateral de carbohidrato. Más preferiblemente, el resto carbohidrato es el resto terminal de la cadena lateral de carbohidrato.
En incluso una realización más preferida, el resto carbohidrato es un resto de galactosa de la cadena lateral del carbohidrato, preferiblemente el resto de galactosa terminal de la cadena lateral del carbohidrato. Este resto de galactosa se puede preparar disponible para la reacción con el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) mediante la eliminación de los ácidos siálicos terminales, seguido de oxidación, como se describe en el presente documento más adelante.
En todavía una realización preferida adicional, el producto de reacción del compuesto (I) y (II) está ligado a un resto de ácido siálico de la cadena lateral del carbohidratos, preferiblemente el resto de ácido siálico terminal de la cadena lateral del carbohidrato.
La oxidación de los restos carbohidrato terminales se pueden realizar o bien de manera química o de manera enzimática.
Los procedimientos para la oxidación química de los restos carbohidrato, de los polipéptidos se conocen en la técnica e incluyen el tratamiento con peryodato (Chamow et al., 1992 J. Biol. Chem., 267, 15916-15922).
Mediante la oxidación química, es en principio posible oxidar cualquier resto carbohidrato, que está posicionado de manera terminal o no. Sin embargo, mediante la elección de condiciones suaves (peryodato 1 mM, 0ºC en contraste a condiciones fuertes: peryodato 10 mM 1 h a temperatura ambiente), es posible oxidar preferiblemente el ácido siálico terminal de una cadena lateral del carbohidrato.
Como alternativa, el resto carbohidrato se puede oxidar de manera enzimática. Las enzimas para la oxidación de los restos carbohidrato individuales se conocen en la técnica, por ejemplo, en el caso de galactosa la enzima es galactosa oxidasa. Se pretende oxidar restos de galactosa terminales, será eventualmente necesario eliminar los ácidos siálicos terminales (parcialmente o completamente) si el polipéptido se ha producido en las células capaces de unir ácidos siálicos a cadenas carbohidrato, por ejemplo, en células de mamífero o en células que se han modificado de manera genética para que sean capaces de unir ácidos siálicos a cadenas de carbohidrato. Los procedimientos químicos o enzimáticos para la eliminación de los ácidos siálicos se conocen en la técnica (Chaplin and Kennedy (eds.), 1996, Carbohidrato Analysis: a practical approach, especialmente el Capítulo 5 Montreuill, Glicoproteins, páginas 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)).
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con el polipéptido mediante un resto carbohidrato oxidado, comprendido en el polipéptido.
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De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el grupo funcional del polipéptido es el grupo tio. Por lo tanto, el producto de reacción del compuesto (I) y (II) puede estar unido al polipéptido mediante un grupo tioéter en el que el átomo S se puede derivar de cualquier grupo tio comprendido en el polipéptido.
El grupo tio puede estar presente en el polipéptido como tal, además, es posible introducir un grupo tio en el polipéptido de acuerdo con un procedimiento adecuado. Entre otros, se pueden mencionar procedimientos químicos. Si está presente un puente disulfuro en el polipéptido, es posible reducir la estructura -S-S- para conseguir un grupo tio. Es también posible transformar un grupo amino presente en el polipéptido en un grupo SH mediante la reacción del polipéptido mediante el grupo amino con un compuesto que tiene al menos dos grupos funcionales diferentes, uno de los cuales es capaz de hacerse reaccionar con el grupo amino y el otro es un grupo SH o un precursor de un grupo SH. Esta modificación de un grupo amino puede estar en referencia con el ejemplo en el que la proteína se hace primero reaccionar con un compuesto (L) que tiene al menos dos, grupos funcionales diferentes, uno de los cuales es capaz de hacerse reaccionar con el grupo amino y el otro es un grupo SH, y el producto de reacción resultante después se hace reaccionar con, por ejemplo, un derivado de HAS que comprende HAS y un compuesto (D), comprendiendo dicho derivado un grupo funcional que es capaz de reaccionar con el grupo SH. es también posible introducir un grupo SH mediante mutación del polipéptido tal como mediante la introducción de una cisteína o un aminoácido SH funcional adecuado en el o tal como la eliminación de una cisteína del polipéptido con el fin de inactivar otra cisteína en el polipéptido para formar un puente disulfuro.
En el contexto de estas realizaciones, se prefiere particularmente hacer reaccionar el polipéptido con un producto reacción que se produce a partir de la reacción del producto de reacción de los compuestos (I) y (II) con un compuesto de reticulación.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el producto de reacción del compuesto (I) y compuesto (II) se hace reaccionar con un compuesto de reticulación y el producto de reacción resultante además se hace reaccionar con el polipéptido mediante un resto carbohidrato oxidado y/o un grupo tio comprendido en el polipéptido.
Como un polipéptido especialmente preferido, se usa eritropoyetina (EPO).
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que el polipéptido es eritropoyetina.
La EPO puede ser de cualquier ser humano (véase por ejemplo, Inoue, Wada, Takeuchi. 1994, An improved method for the purification of human eritropoyetina with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol. Pharm. Bull. 17(2), 180-4; Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythopoietin., J. Biol. Chem., 252 (15), 5558-64) u otro origen de mamífero y se puede obtener mediante purificación a partir de fuentes de origen natural como riñón humano, hígado humano o animal embrionario, preferiblemente riñón de mono. Además, la expresión "eritropoyetina" o "EPO" abarca también una variante de EPO en la que uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1 a 25, preferiblemente 1 a 10, más preferido 1 a 5, lo más preferido 1 ó 2) se han intercambiado por otro aminoácido y que muestra actividad eritropoyética (véase por ejemplo, el documento EP 640619 B1). La medición de la actividad eritropoyética se describe en la técnica (para la medición de la actividad in vitro véase por ejemplo, Fibi et al., 1991, Blood, 77,1203 ff; Kitamura et al, 1989, J. Cell Phys., 140,323-334; para la medición de la actividad de EPO in vivo véase Ph. Eur. 2001,911-917; Ph. Eur. 2000, 1316 Eritropoyetinai solutio concentrata, 780-785; European Pharmacopoeia (1996/2000); European Pharmacopoeia, 1996, Erythopoietin concentrated solution, Pharmaeuropa., 8, 371-377; Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl., 1995, N- and O-glicosilación muteins of recombinant human erythopoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85(5), 1229-36; (formas de EPO y EPO modificadas se inyectaron en ratones hembra NMRI (iguales cantidades de proteína 50 ng/ratón) el día 1, 2 y 3 se tomaron muestras de sangre el día 4 y los reticulocitos también se determinaron)). Publicaciones adicionales donde los ensayos para la medición de la actividad de EPO se describen en Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythopoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4),515-22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythopoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(I), 151-5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role of glicosilation on the secretion and biological activity of erythopoietin, Biochemistry, 31 (41), 9871-6; Higuchi, Oheda, Kuboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992; Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythopoietin, J. Biol. Chem., 267(II), 7703-9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, effects of site-directed removal of N-glicosilación sites in human eritropoyetina on its production and biological properties, J. Biol. 50 Chem.; 266 (30), 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythopoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (20), 7819-22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythopoietin, Nephron., 51 (I), 11-4 (German); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinary erythopoietin on controlled-pore glass and silicic acid, Exp. Hematol., 13(3), 833-7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoietic simulator in serum distinct from eritropoyetina, Exp. Hematol., 11 (I), 18-31.
Preferiblemente, la EPO se produce de manera recombinante. Esto incluye la producción en células eucarióticas o procarióticas, preferiblemente células de mamífero, de insecto, de levaduras, de bacterias o en cualquier otro tipo de célula que es conveniente para la producción recombinante de EPO. Además, la EPO se puede expresar en animales transgénicos (por ejemplo, en fluidos corporales como la leche, sangre, etc.), en huevos de pájaros transgénicos, especialmente aves de corral, pollitos preferidos, o en plantas transgénicas.
La producción recombinante de un polipéptido se conoce en la técnica En general, esto incluye la transfección de células huésped con un vector de expresión adecuado, el cultivo de las células huésped en condiciones que permiten la producción del polipéptido y la purificación del polipéptido a partir de las células huésped. Para la información detallada véase por ejemplo, Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67 (I), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74 (2), 652-7; documentos EP 640 619 B1 y EP 668351 B1.
En una realización preferida, la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana (véase el documento EP 148605 B2).
La EPO puede comprender una o más cadenas laterales del carbohidrato, preferiblemente 1 a 12, más preferiblemente 1 a 9, incluso más preferiblemente 1 a 6 y particularmente 1 a 4, especialmente preferiblemente 4 cadenas laterales del carbohidrato, unidas a la EPO mediante N- y/o glicosilación unida a O, es decir, la EPO está glicosilada. Usualmente, cuando la EPO se produce en células eucarióticas, el polipéptido se glicosila después de la traducción. Por consiguiente, la cadena lateral del carbohidratos pueden estar unidos a la EPO durante la biosíntesis en mamíferos, especialmente células de seres humanos, insectos o levaduras. La estructura y propiedades de la EPO glicosilada se han estudiado de manera extensiva en la técnica (véanse los documentos EP 428 267 B1; EP 640 619 B1; Rush, Derby, Smith, Merry, Rogers, Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure, Anal Chem., 67(8), 1442-52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and funtional roles of the sugar chains of human erythropoietin, Glicobiology, 1 (4), 337-46 (Revisión).
Por lo tanto, el derivado de almidón hidroxietilado de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos uno, preferiblemente 1 a 12, más preferiblemente 1 a 9, incluso más preferiblemente 1 a 6 y particularmente preferiblemente 1 a 4 moléculas de HAS por molécula de EPO. El número de moléculas de HAS por molécula de EPO se puede determinar mediante un análisis cuantitativo de composición de carbohidrato usando GC-MS después de la hidrólisis del producto y derivatización de los monosacáridos resultantes (véase Chaplin y Kennedy (eds.), 1986, Carbohydrate Analysis: a practical approach, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3), especialmente el Capítulo 1, Monosaccharides, página 1-36; Capítulo 2, Oligosacáridos, página 37-53, Capítulo 3, Neutral Polisaccharides, página 55-96).
De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, el resto carbohidrato unido a EPO, es parte de una cadena lateral del carbohidrato. Más preferiblemente, el resto carbohidrato es el resto terminal de la cadena lateral del carbohidrato. En incluso una realización más preferida, el resto carbohidrato es un resto de galactosa de la cadena lateral del carbohidrato, preferiblemente el resto de galactosa terminal de la cadena lateral del carbohidrato. Este resto de galactosa se puede hacer disponible para la reacción con el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) mediante la eliminación de los ácidos siálicos terminales, seguido de oxidación, como se describe en el presente documento más adelante. En una realización preferida adicional, el producto de reacción del compuesto (I) y (II) está unido a un resto de ácido siálico de la cadena lateral del carbohidratos, preferiblemente el ácido siálico terminal de la cadena lateral del carbohidrato. El ácido siálico se oxida como se describe en el presente documento.
Particularmente preferiblemente este resto de galactosa se hace disponible para la reacción con el producto de reacción de los compuestos (I) y (II) o con el producto de reacción de la reacción del producto de reacción de los compuestos (I) y (II) y un compuesto de reticulación mediante un grupo funcional X mediante la eliminación del ácido siálico terminal seguido de la oxidación.
Como se ha mencionado anteriormente, el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), que opcionalmente ha reaccionado con un compuesto de reticulación, se puede hacer reaccionar con un grupo tio comprendido en EPO.
Es también posible hacer reaccionar el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), que opcionalmente ha reaccionado con un compuesto de reticulación, con un grupo tio así como con un resto carbohidrato, cada uno de ellos comprendido en el polipéptido, más preferiblemente eritropoyetina.
De acuerdo con a realización preferida, este grupo SH puede estar unido preferiblemente a un resto carbohidrato oxidado, por ejemplo, mediante el uso de un derivado de hidroxilamina, por ejemplo, 2-(aminooxi)etilmercaptan clorhidrato (Bauer L. et al., 1965, J. Org., Chem., 30, 949) o mediante el uso de un derivado de hidrazida, por ejemplo, hidrazida del ácido tioglicólico (Whitesides et al., 1977, J. Org. Chem., 42, 332.).
De acuerdo con una realización preferida adicional, el grupo tio se introduce preferiblemente en un resto carbohidrato oxidado de EPO, más preferiblemente un resto carbohidrato oxidado que es parte de una cadena lateral del carbohidrato de EPO.
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Preferiblemente, el grupo tio se deriva de una cisteína de origen natural o a partir e una cisteína añadida. Más preferiblemente, la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de EPO humana y las cisteínas de origen natural son cisteína 29 y/o 33. En una realización más preferida, el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), que opcionalmente ha reaccionado con un compuesto de reticulación, se hace reaccionar con cisteína 29 mientras la cisteína 33 se reemplaza por otro aminoácido. Como alternativa, el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), que opcionalmente ha reaccionado con un compuesto de reticulación, se hace reaccionar con cisteína 33 mientras la cisteína 29 se reemplaza por otro aminoácido.
En el contexto de la presente invención, el término "cisternas añadidas" indica que los polipéptidos, preferiblemente EPO, comprenden un resto de cisteínas que no está presente en el polipéptido de tipo salvaje.
En el contexto de este aspecto de la invención, la cisteína puede ser un aminoácido adicional añadido al extremo N- o C-terminal de EPO.
Además, la cisteína añadida puede haber sido añadida mediante el reemplazo de un aminoácido de origen natural por cisteína o una cisteína sustituida de manera adecuada. Preferiblemente, en el contexto de este aspecto de la invención, la EPO es EPO humana y el resto de aminoácido reemplazado es serina 126.
Las condiciones de reacción de la reacción del producto de reacción de los compuestos (I) y (II), que opcionalmente reaccionan con un compuesto de reticulación, con el polipéptido se pueden adaptar a las condiciones específicas de la reacción específica. Como compuestos tampón, al menos uno de los compuestos anteriormente mencionados se puede usar preferiblemente. Como disolvente o mezcla de disolventes, al menos uno de los disolventes anteriormente mencionados se puede usar preferiblemente. El aislamiento y/o después del tratamiento se puede llevar a cabo, donde los procedimientos preferidos se seleccionan entre procedimientos descritos anteriormente.
Si el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), por ejemplo, se hace reaccionar adicionalmente con un polipéptido como compuesto adicional, preferiblemente EPO, se usa agua preferiblemente as disolvente para la reacción. De manera adicional al agua, al menos un disolvente adicional puede estar presente. Como disolvente adicional preferido, se pueden mencionar DMSO, DMF, metanol o etanol.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con un polipéptido, preferiblemente EPO, se lleva a cabo en un sistema acuoso. En lo que se refiere a las temperaturas que se aplican durante esta reacción, no existen limitaciones específicas para que la reacción dé como resultado el derivado de almidón hidroxietilado deseado que comprende el producto de reacción de los compuestos (I) y (II) que reaccionan con el polipéptido mediante el al menos un grupo funcional X. La temperatura de la reacción está preferiblemente en el intervalo de entre 4 y 37º, más preferiblemente en el intervalo de entre 10 y 30ºC especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 15 y 25ºC.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con el polipéptido se lleva a cabo a una temperatura de entre 4 y 37ºC.
Durante el curso de la reacción la temperatura se puede variar, preferiblemente en los intervalos proporcionados anteriormente, o mantenerse esencialmente constantes.
El tiempo de reacción para la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con el polipéptido se puede adaptar a las necesidades específicas y está en general en el intervalo de entre 0,5 y 48 h, preferiblemente en el intervalo de entre 2 y 24 h y especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 10 y
20 h.
El valor de pH para la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con el polipéptido se puede adaptar a las necesidades específicas tal como la naturaleza química de los reactivos.
Si, por ejemplo, el producto de reacción del compuesto (I) y (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional mediante la reacción de un grupo funcional X que es un grupo hidroxil amino -O-NH_{2} con al menos un grupo aldehído que está comprendido en el polipéptido, el pH está preferiblemente en el intervalo de entre 4,5 y 6, más preferiblemente a aproximadamente 5,5.
Si el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) por ejemplo, se hace reaccionar adicionalmente con un compuesto de reticulación como compuesto adicional, se usa agua preferiblemente como disolvente para la reacción. De manera adicional al agua, al menos un disolvente adicional puede estar presente. Como un disolvente adicional preferido posible, se pueden mencionar DMSO DMF, metanol o etanol.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del producto de reacción, del compuesto (I) y el compuesto (II) con un compuesto de reticulación se lleva a cabo en un sistema acuoso.
En lo que se refiere a las temperaturas que se aplican durante esta reacción, no existen limitaciones específicas para que la reacción dé como resultado el derivado de almidón hidroxietilado deseado que comprende el producto de reacción de los compuestos (I) y (II) que han reaccionado con el compuesto de reticulación mediante el al menos un grupo funcional X. La temperatura de la reacción está preferiblemente en el intervalo de entre 4 y 37ºC, más preferiblemente en el intervalo de entre 10 y 30ºC especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 15
y 25ºC.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con el compuesto de reticulación se lleva a cabo a una temperatura de entre 4 y 37ºC.
Durante el curso de la reacción se puede variar la temperatura, preferiblemente en los intervalos proporcionados anteriormente, o o mantenerse esencialmente constantes.
El tiempo de reacción, para la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con el compuesto de reticulación se puede adaptar a las necesidades específicas y está en general en el intervalo de entre 10 min y 10 h, preferiblemente de entre 20 min y 5 h y más preferiblemente de entre 30 min y 2 h.
El valor de pH para la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con el compuesto de reticulación se puede adaptar a las necesidades específicas tal como la naturaleza química de los reactivos.
Si por ejemplo, el producto de reacción del compuesto (I) y (II) se hace reaccionar con un compuesto de reticulación mediante el grupo funcional X que está comprendido en el producto de reacción del compuesto (I) y (II) y es un grupo amino -NH_{2}, el pH está preferiblemente en el intervalo de entre 7 y 8,5, más preferiblemente a aproximada-
mente 7,2.
Si el producto de reacción de la reacción del producto de reacción de compuestos (I) y (II), y un compuesto de reticulación, por ejemplo, se hace reaccionar con un polipéptido, preferiblemente EPO, se usa agua preferiblemente como disolvente para la reacción. Además del agua, al menos un disolvente adicional puede estar presente. Como disolvente adicional posible preferido, se pueden mencionar DMSO, DMF, metanol o etanol.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere, a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) que además se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, con un polipéptido se lleva a cabo en un sistema acuoso.
En lo que se refiere a las temperaturas que se aplican durante esta reacción, no existen limitaciones específicas para que la reacción dé como resultado el derivado de almidón hidroxietilado deseado que comprende el producto de reacción de los compuestos (I) y (II), que ha reaccionado con un compuesto de reticulación además ha reaccionado con un polipéptido mediante el al menos un grupo funcional X comprendido en el compuesto de reticulación. La temperatura de la reacción está preferiblemente en el intervalo de entre 4 y 37ºC, más preferiblemente en el intervalo de entre 10 y 30ºC especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 15 y 25ºC.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) que además se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, con el polipéptido se lleva a cabo a una temperatura de entre 4 y 37ºC.
Durante el curso de la reacción se puede variar la temperatura, preferiblemente en los intervalos proporcionados anteriormente, o mantenerse esencialmente constante.
El tiempo de reacción para la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (is) que además se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, con el polipéptido se puede adaptar a las necesidades específicas y está en general de entre 0,5 y 48 h, preferiblemente en el intervalo de entre 2 y 24 h y especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 10 y 20 h.
El valor de pH para la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) que además se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, con el polipéptido se puede adaptar a las necesidades específicas tal como la naturaleza química de los reactivos.
Si, por ejemplo, el producto de reacción del compuesto (I) y (II) que además se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, se hace reaccionar con un polipéptido mediante el grupo funcional X que está comprendido en el compuesto de reticulación y es un grupo amino -NH_{2}, el pH está preferiblemente en el intervalo de entre 7 y 8,5, más preferiblemente a aproximadamente 7,2.
El valor de pH adecuado de la mezcla de reacción se puede ajustar en cada caso mediante la adición de al menos un tampón adecuado. Entre los tampones preferidos se pueden mencionar tampón fosfato de sodio, o tampones
borato.
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El producto de reacción que se produce a partir de la reacción del producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) con el al menos un compuesto adicional, siendo el al menos un compuesto adicional o bien un polipéptido o un compuesto de reticulación, y comprendiendo el producto de reacción además los compuestos que se producen a partir de la reacciones del compuesto (I), compuesto (II), a compuesto de reticulación and a polipéptido, se pueden aislar a partir de la mezcla de reacción mediante al menos un procedimiento adecuado y sometido a al menos un tratamiento adicional tal como al menos un tratamiento posterior tal como diálisis y/o liofilización.
Una vez que se ha formado el producto de reacción anteriormente mencionado, se puede aislar a partir de la mezcla de reacción mediante al menos un procedimiento adecuado.
El aislamiento del producto de reacción se puede llevar a cabo mediante un procedimiento adecuado que puede comprender una o más etapas.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, cuando el producto de reacción no comprende un polipéptido, el producto de reacción se separa después de la mezcla de reacción o la mezcla de la mezcla de reacción preferiblemente mediante filtración centrífuga. En una segunda etapa, el producto de reacción separado se puede someter a un tratamiento adicional tal como un tratamiento posterior como diálisis y/o liofilización. De acuerdo con una realización incluso más preferida, el producto de reacción separado se dializa primero, preferiblemente contra agua, y después se liofiliza hasta que el contenido en disolvente del producto de reacción es suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto.
De acuerdo con otra realización de la presente invención cuando el producto de reacción comprende el polipéptido, el producto de reacción se aísla preferiblemente como se ha descrito en el Ejemplo 7.8.
En general, el aislamiento del conjugado HAS-polipéptido, o bien con o sin compuesto de reticulación, se puede realizar mediante el uso de procedimientos conocidos para la purificación de polipéptidos naturales y recombinantes tales como cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, RP-HPLC, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba o combinaciones de al menos dos procedimientos de los mismos.
La unión covalente de HAS al polipéptido se puede verificar mediante análisis de composición de carbohidrato después de la hidrólisis de la proteína modificada.
La demostración de la modificación de HAS en los oligosacáridos ligados a N del polipéptido se puede llevar a cabo mediante la eliminación de los N-glicanos modificados por HAS y observación del desplazamiento predicho para una movilidad mayor en SDS-PAGE +/- análisis de transferencia de Western.
La modificación de HAS del polipéptido en restos de cisteína se puede demostrar mediante el fallo para detectar el correspondiente péptido de Cys proteolítico en RP-HPLC y MALDI/TOF-MS en los fragmentos proteolíticos del producto modificado por HAS (Zhou et al., 1998, Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospray-mass spectrometry and matrix-assisted laserdesorption/ionization-time off flight-mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin, Electrophoresis, 19 (13), 2348-55). El aislamiento de la fracción que contiene HAS después de la digestión proteolítica del polipéptido modificado por Cys- permite la verificación en esta fracción del péptido correspondiente mediante análisis de la composición convencional de aminoácidos.
Todas las realizaciones descritas anteriormente con relación al HAS-polipéptido de la invención que se refiere a las propiedades del polipéptido o HAS se aplican también al procedimiento de la invención para la producción de un conjugado HAS-polipéptido. Además, todas las realizaciones descritas anteriormente con respecto a HAS-EPO o la preparación del mismo que se refiere a péptidos en general o a HAS se aplican también al procedimiento de la invención para la producción de un conjugado HAS-polipéptido.
De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención almidón hidroxietilado se hace reaccionar con un compuesto (II), preferiblemente seleccionado entre los compuestos homo- y heterobifuncionales descritos anteriormente, y el producto de reacción resultante se hace reaccionar con una glicoproteína, preferiblemente eritropoyetina, preferiblemente con el resto carbohidrato terminal oxidado de una cadena lateral del carbohidrato de EPO.
De acuerdo con otra realización especialmente preferida de la presente invención almidón hidroxietilado se hace reaccionar con un compuesto (II), preferiblemente seleccionado entre los compuestos homo- y heterobifuncionales descritos anteriormente, para proporcionar un primer derivado de almidón hidroxietilado. Este primer derivado de almidón hidroxietilado se hace reaccionar posteriormente con un compuesto de gesticulación para proporcionar un segundo derivado de almidón hidroxietilado. Este segundo derivado de almidón hidroxietilado se hace reaccionar posteriormente con una glicoproteína, preferiblemente eritropoyetina, preferiblemente con un grupo -SH comprendido en la glicoproteína, para proporcionar el tercer derivado de almidón hidroxietilado. Preferiblemente, el compuesto de reticulación es un compuesto heterobifuncional. Más preferiblemente, los compuestos de reticulación se hacen reaccionar con un grupo funcional que comprende la estructura -NH- que está comprendida en el primer derivado de almidón hidroxietilado. Más preferiblemente, este grupo funcional es -NH2.
Una ventaja de la presente invención es que no es necesario usar disolventes toxicológicamente críticos en al menos una etapa de reacción, preferiblemente todas las etapas de reacción, la etapa de reacción implicada y de este modo, no es necesario eliminar estos disolventes después del procedimiento de producción con el fin de evitar la contaminación de los productos con el disolvente. Además, no es necesario realizar controles de calidad adicionales con respecto a los disolventes toxicológicamente críticos. Si se usan disolventes orgánicos, preferiblemente además de agua, es preferible usar disolventes toxicológicamente no críticos tales como etanol y/o propilenglicol.
Otra ventaja de la presente invención es que se evitan cargas estructurales irreversibles o reversibles en las etapas en las que se usa un sistema acuoso como disolvente que de otra manera están inducidas por disolventes orgánicos. Por consiguiente, los derivados de polipéptido obtenidos de acuerdo con el procedimiento de la invención son diferentes de los preparados en disolventes orgánicos tal como DMSO.
Además, se ha observado sorprendentemente que la conjugación de HAS a polipéptidos tal como EPO en solución acuosa minimiza o evita reacciones secundarias. Por consiguiente, esta realización del procedimiento de la invención conduce a productos de almidón hidroxietilado mejorados con gran pureza.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se refiere al derivado de hidroxi alquilo almidón, que se puede obtener mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar el almidón hidroxietilado (HAS) de fórmula (I)
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en su extremo reductor que no está oxidado antes de la reacción, con un compuesto de fórmula (II) en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado y en la que o bien R' o R'' o R' y R'' comprenden al menos al menos un grupo funcional X capaz de hacerse reaccionar con al menos otro compuesto antes o después de la reacción de (I) y (II), y en la que el compuesto (II) se hace reaccionar mediante el grupo NH que une por puentes R' y R'' con el compuesto (I) en su extremo reductor que no está oxidado; y
-
en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un polipéptido; o
-
en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un compuesto de reticulación y el producto de reacción con el compuesto de reticulación se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un segundo compuesto adicional y el segundo compuesto adicional es un polipéptido;
siempre que si el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se haga reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X and el al menos un compuesto adicional es un polipéptido, el compuesto de fórmula (II) no es BM PH (N-(ácido beta-maleimidopropiónico) hidrazida TFA); EMCA (N-(ácido epsilon-maleimidocaproico) hidrazida), KMUH (N-( ácido kappa-maleimidoundecanoico) hidrazida), M2C2H (4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilhidrazida HCl), MPBH (4-(ácido 4-N-maleimidofenil)butírico hidrazida HCl), PDPH (3-(2-piridilditio)-propionilhidrazida), y siempre que el producto de reacción del compuesto de fórmula (II) y el compuesto adicional que tiene un grupo funcional Y y que es un polipéptido que no es insulina.
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Como ya se ha descrito anteriormente en el contexto de los procedimientos de la presente invención, O-2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina se usa como un compuesto (II) preferido y el almidón hidroxietilado se usa como un almidón hidroxietilado preferido.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de almidón hidroxietilado que se puede obtener mediante un procedimiento en el que el almidón hidroxietilado se hace reaccionar mediante su extremo reductor con 2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina.
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Dependiendo de las condiciones de reacción respectivas, el disolvente o mezcla de disolventes usado y/o los restos R' y/o R'' es posible que el derivado de almidón hidroxietilado que se puede obtener mediante el procedimiento o procedimientos, descritos anteriormente tienen las siguientes constituciones (IIIa):
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Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de almidón hidroxietilado como se ha descrito anteriormente que tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (IIIa).
También es posible que, por ejemplo, en el caso en el que R' sea hidrógeno ese derivado de almidón hidroxietilado que se puede obtener mediante el procedimiento para los procedimientos descritos anteriormente pueden tener las siguientes constituciones (IIIa) o (IIIa) donde (IIIa) y (IIIb) pueden estar ambas presentes en la mezcla de reacción que tiene una cierta distribución de equilibrio:
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Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de almidón hidroxietilado como se ha descrito anteriormente que tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (IIIb).
Además, la presente invención también se refiere a un derivado de almidón hidroxietilado como se ha descrito anteriormente que está presente en una mezcla de constituciones de acuerdo con las fórmulas (IIIa) y (IIIb).
Dependiendo de las condiciones de reacción y/o la naturaleza química del compuesto (II) usado para la reacción, los compuestos de acuerdo con la fórmula (IIIa) se pueden presentar con el átomo N en posición ecuatorial o axial donde también una mezcla de ambas formas puede estar presente para que tengan una cierta distribución de equilibrio.
Dependiendo de las condiciones de reacción y/o la naturaleza química del compuesto (II) usado para la reacción, los compuestos de acuerdo con la fórmula (IIIb) puede estar presente con el doble enlace C-N en conformación E o Z donde también una mezcla de ambas formas puede estar presente para que tengan una cierta distribución de equilibrio.
En algunos casos puede ser necesario estabilizar el compuesto de acuerdo con la fórmula (IIIa). Esto es especialmente el caso en el que el compuesto de acuerdo con la fórmula (IIIa) se produce y/o se usa en una solución acuosa. Como un procedimiento de estabilización la acilación del compuesto de acuerdo con la fórmula (IIIa) es particularmente preferida, especialmente en el caso en el que R' sea hidrógeno. Como reactivo de acilación, se pueden usar todos los reactivos adecuados que dan como resultado el derivado de almidón hidroxietilado deseado de acuerdo con la fórmula (IVa)
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De acuerdo con realizaciones especialmente preferidas de la presente invención, el resto Ra que es parte del reactivo de acilación es metilo. Como reactivos de acilación, se usan preferiblemente anhídridos de ácido carboxílico, haluros de de ácido carboxílico, y ésteres activos de ácido carboxílico.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que dicho derivado tiene una constitución, de acuerdo con la fórmula (IVa).
La acilación se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de entre 0 y 30ºC, preferiblemente en el intervalo de entre 2 y 20ºC and especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 4 y 10ºC.
En otros casos puede ser deseable estabilizar el compuesto de acuerdo con la fórmula (IIIb). Esto es especialmente el caso en el que el compuesto de acuerdo con la fórmula (IIIb) se produce y/o se usa en solución acuosa. Como se establece en el procedimiento, la reducción del compuesto de acuerdo con la fórmula (IIIb) se prefiere particularmente, especialmente en el caso en el que R' sea hidrógeno. Como agente reductor se pueden usar todos los agentes adecuados que dan como resultado del derivado de almidón hidroxietilado deseado de acuerdo con la fórmula (IVb)
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De acuerdo con realizaciones especialmente preferidas de la presente invención, se usan como agentes de reducción boro hidruros tales como NaCNBH_{3} o NaBH_{4}.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de almidón hidroxietilado que se puede obtener mediante un procedimiento como se ha descrito anteriormente en el que dicho derivado tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (IVb).
La reducción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de entre 4 y 100ºC, preferiblemente en el intervalo de entre 10 y 90ºC y especialmente preferiblemente en el intervalo de entre 25 y 80ºC.
La presente invención además se refiere a mezclas de los compuestos (IIIa) y (IIIb), (IVa) y (IVb), (IIIa) y (IVa), (IIIa) y (IVb), (IIIb) y (IVa), (IIIb) y (IVb), (IIIa) y (IIIb) y (IVa), (IIIa) y (IIIb) y (IVb), (IVa) y (IVb) y (IIIa), y (IVa) y (IVb) y (IIIb) en el que (IIIa) y/o (IVa) puede estar independientemente presentes en una conformación donde el átomo de N en la posición ecuatorial o axial y/o en el que (IIIb) puede estar presente con el doble enlace C-N en conformación E o Z.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el compuesto (I) se hace reaccionar con compuesto (II) para proporcionar un primer producto de reacción. Dicho primer producto de reacción se estabiliza después opcionalmente de acuerdo con al menos uno de los procedimientos descritos anteriormente. El primer, opcionalmente producto de reacción estabilizado después se hace reaccionar con al menos un compuesto adicional mediante la reacción de al menos un grupo funcional X comprendido en R'' del primer producto de reacción con al menos un grupo funcional Y comprendido en el al menos un compuesto adicional, para proporcionar un segundo producto de reacción Dicho segundo producto de reacción después se estabiliza opcionalmente de acuerdo con al menos uno de los procedimientos descritos anteriormente.
De acuerdo con la presente invención, el al menos un compuesto adicional es un polipéptido o a compuesto de reticulación. En el caso que el al menos un compuesto adicional sea un polipéptido, el grupo funcional Y está comprendido en el polipéptido. En el caso que el al menos un compuesto adicional sea un compuesto de reticulación, el grupo funcional Y está comprendido en el compuesto de reticulación y opcionalmente también en el polipéptido.
De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, almidón hidroxietilado se usa como compuesto (I), O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina se usa como compuesto (II), y EPO que tiene un resto carbohidrato oxidado terminal de una cadena lateral del carbohidrato se usa como compuestos adicionales. Más preferiblemente, hidroxietilo almidón se hace reaccionar con O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilo amina para proporcionar un derivado de almidón hidroxietilado, y el primer derivado se hace reaccionar adicionalmente con EPO que un resto carbohidrato terminal oxidado de una cadena lateral carbohidrato para proporcionar un segundo derivado de almidón hidroxietilado. En este caso específico, no se tiene que llevar a cabo ninguna reacción estabilizante.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento en el que el almidón hidroxietilado se hace reaccionar mediante su extremo reductor con O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina y el producto de reacción se hace reaccionar con eritropoyetina mediante el resto carbohidrato terminal oxidado de una cadena lateral del carbohidrato de la eritropoyetina.
De acuerdo con otra realización especialmente preferida de la presente invención, almidón hidroxietilado se usa como compuesto (I), O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina se usa como el compuesto (II), se usa un compuesto heterobifuncional de reticulación que tiene un grupo maleimida y un grupo éster activo de N-hidroxi succinimida, y EPO que tiene al menos un grupo -SH (mencionado como TioEPO) se usa como polipéptido. Más preferiblemente, almidón hidroxietilado se hace reaccionar con O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina para proporcionar un primer derivado de almidón hidroxietilado, ese primer derivado se hace reaccionar además con el grupo éster activo de N-hidroxi succinimida del compuesto de reticulación para proporcionar un segundo derivado, y ese segundo derivado se hace reaccionar mediante el grupo de maleimida con el TioEPO para proporcionar un tercer derivado de almidón hidroxietilado.
El derivado de almidón hidroxietilado que a continuación se menciona se menciona como un conjugado de HAS-EPO y se ha formado mediante la reacción del compuesto (I) con el compuestos (II) y posiblemente un compuesto de reticulación y eritropotetina, tiene la ventaja que muestra una estabilidad biológica mejorada cuando se compara con la eritropotetina antes de la conjugación. Esto se debe principalmente al hecho de que este derivado de almidón hidroxietilado está menos o incluso menos reconocido por los sistemas del hígado y riñón y por lo tanto persiste en el sistema circulatorio durante un largo período de tiempo. Además, ya que HAS está unido específicamente al sitio, el riesgo de destruir la actividad biológica in-vivo def EPO por la conjugación de HAS a EPO está minimizado.
El conjugado HAS-EPO de la invención puede mostrar esencialmente la misma actividad biológica in-vitro que la EPO nativa recombinante, ya que la actividad biológica in-vitro solamente mide la afinidad de unión al receptor de la EPO. Procedimientos para determinar la actividad biológica in-vitro se conocen en la técnica.
Además, el HAS-EPO muestra una mayor la actividad in-vivo que la EPO usada como unarting material de partida para la conjugación (EPO no conjugada). Procedimientos para determinar la actividad biológica in vivo se conocen en la técnica.
El conjugado HAS-EPO puede mostrar una actividad in vivo de entre 110% y 300%, preferiblemente entre 110% y 200%, más preferiblemente entre 110% y 180% o entre 110 y 150%, lo más preferiblemente entre 110% y 140%, si la actividad in-vivo de la EPO no conjugada se establece como 100%.
Comparado con la EPO altamente sializada de Amgen (véase el documento EP 428 267 B1), el HAS-EPO muestra preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 85% o al menos 95%, al menos 150%, al menos 200% o al menos 300% de la actividad in vivo de la EPO altamente sializada si la actividad in-vivo de la EPO altamente sializada se establece como 100%. Lo más preferiblemente, muestra al menos 95% de la actividad in vivo de la EPO altamente sializada.
La alta actividad biológica in-vivo del conjugado HAS-EPO de la invención principalmente se produce a partir del hecho que el conjugado HAS-EPO permanece más tiempo en la circulación que la EPO no conjugado debido a que es menos reconocido por los sistemas de eliminación del hígado y debido a que la eliminación renal está reducida debido al mayor peso molecular. Procedimientos para la determinación del tiempo de semivida in-vivo de la EPO en la circulación se conocen en la técnica (Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 95(3), 1184-8).
Por consiguiente, una gran ventaja de la presente invención es que se proporciona un conjugado HAS-EPO que se puede administrar menos frecuentemente que las preparaciones de EPO comercialmente disponibles actualmente. Mientras las preparaciones de EPO convencionales se han de administrar al menos cada 3 días, el conjugado HAS-EPO de la invención se administra preferiblemente dos veces a la semana, más preferiblemente una vez a la semana.
Además, el procedimiento de la invención tiene la ventaja que se puede producir un derivado de EPO eficaz a costes reducidos ya que el procedimiento no comprende etapas de purificación extensas y de larga duración que dan como resultado una un rendimiento final bajo, por ejemplo, no es necesario purificar en formas de EPO sializada que se conoce que muestra baja o ninguna actividad biológica in vivo.
Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz, el conjugado HAS-polipéptido, preferiblemente el conjugado HAS-EPO, más preferiblemente, el conjugado HES-EPO de la presente invención. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende además al menos un diluyente, adjuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable útil en la terapia con eritropoyetina.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz, un derivado de almidón hidroxietilado como se ha descrito anteriormente en el que el producto de reacción del compuesto (I) con el compuesto (II) se hace reaccionar mediante el al menos un grupo funcional X comprendido en compuesto (II) con al menos un compuesto adicional en el que el al menos un compuesto adicional es un polipéptido.
De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención, el polipéptido, preferiblemente eritropoyetina se hace reaccionar con el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) mediante a grupo tio o resto carbohidrato oxidado comprendido en el polipéptido.
De acuerdo con realizaciones preferidas incluso más preferidas de la presente invención, el polipéptido, preferiblemente eritropoyetina se hace reaccionar con el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) mediante un resto carbohidrato oxidado comprendido en el polipéptido.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente el que el polipéptido se hace reaccionar con el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) mediante un resto carbohidrato oxidado comprendido en el polipéptido.
De acuerdo con realizaciones preferidas, el polipéptido es GCS-F, AT III, IFN-beta o eritropoyetina, más preferiblemente eritropoyetina.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente en el que el polipéptido es eritropoyetina.
De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente se produce mediante reacción de almidón hidroxietilado en un medio acuoso con un compuesto de acuerdo con la siguiente fórmula
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y mediante reacción del producto de reacción con eritropoyetina.
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De acuerdo con una realización particularmente preferida, la eritropoyetina se oxida con peryodato de sodio antes de la reacción anteriormente mencionada.
De acuerdo con otra realización particularmente preferida, la eritropoyetina está parcialmente desializada y posteriormente se oxida con peryodato de sodio antes de la reacción.
De acuerdo con una realización preferida adicional de la presente invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden un derivado de almidón hidroxietilado que se producen en base a un Tio-EPO completamente reducido de acuerdo con el Ejemplo 5 están excluidas.
De acuerdo con otra realización preferida, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz un derivado de almidón hidroxietilado como se ha descrito anteriormente en el que el producto de reacción del compuesto (I) con el compuesto (II) se hace reaccionar mediante el al menos un grupo funcional X comprendido en el compuesto (II) con al menos un compuesto adicional y en el que el al menos un compuesto adicional es un compuesto de reticulación y el producto de reacción del producto de reacción de los compuestos (I) y (II) con el compuesto de reticulación se hace reaccionar con un polipéptido.
De acuerdo con todavía una realización preferida adicional, la presente invención se refiere a la composición farmacéutica anteriormente mencionada en la que el polipéptido es eritropoyetina.
La composición farmacéutica anteriormente mencionada es especialmente adecuada para el tratamiento de trastornos anémicos o trastornos de disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas con ellos.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección dada y régimen de administración. La administración de isoformas de eritropoyetina es preferiblemente mediante vías parenterales. La vía específica elegida dependerá de la afección que se está tratando. La administración de isoformas de eritropoyetina se hace preferiblemente como parte de una formulación que contiene un vehículo adecuado, tal como albúmina sérica un diluyente adecuado tal como solución salina tamponada, y/o un adyuvante adecuado. La dosificación requerida estará en las cantidades suficientes para alcanzar el hematocrito de los pacientes y variará dependiendo de la gravedad de la afección que se está tratando, el procedimiento de administración usado y similares.
El objeto del tratamiento con la composición farmacéutica de la invención es preferiblemente un incremento del valor de hemoglobina de más de 6,8 mmol/l en la sangre. Para esto, la composición farmacéutica se puede administrar de forma que el valor de hemoglobina se incrementa entre 0,6 mmol/l y 1,6 mmol/l por semana. Si el valor de hemoglobina supera 8,7 mmol/l, la terapia se debe interrumpir preferiblemente hasta que el valor de hemoglobina esté por debajo de 8,1 mmol/l.
La composición de la invención se usa preferiblemente en una formulación adecuada para inyección subcutánea o intravenosa o parenteral. Para esto, los excipientes y vehículos adecuados son por ejemplo, fosfato diácido de sodio, fosfato ácido disódico, clorato de sodio, polisorbato 80, HSA y agua para inyección. La composición se puede administrar tres veces a la semana, preferiblemente dos veces a la semana, más preferiblemente una vez a la semana, y lo más preferiblemente cada dos semanas.
Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra en una cantidad de 0,01-10 \mug/kg de peso corporal del paciente, más preferiblemente 0,1 a 5 \mug/kg, 0,1 a 1 \mug/kg, o 0,2-0,9 \mug/kg, lo más preferiblemente 0,3-0,7 \mug/kg, y lo más preferido 0,4-0,6 \mug/kg de peso corporal.
En general, preferiblemente se administran por dosis entre 10 \mug y 200 \mug, preferiblemente entre 15 \mug y 100 \mug.
La invención además se refiere a un HAS-polipéptido de acuerdo con la presente invención para uso en el procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal.
La invención además se refiere a uso de un conjugado HAS-EPO de la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos anémicos o trastornos de disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas.
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, tablas, y figuras que no se intenta de ninguna manera que limiten el ámbito de la presente invención.
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Breve descripción de las figuras
Figura 1
La Figura 1 muestra un análisis SDS PAGE del conjugado HES-EPO, producido de acuerdo con el ejemplo 4.1.
Calle A: Marcador de Proteína Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); pesos moleculares (en kD) del marcador de proteína desde la parte superior a la inferior: 245, 123, 77,42, 30, 25,4, y 17.
Calle B: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 4.1.
Calle C: Material de partida de la EPO
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Figura 2
La Figura 2 muestra un análisis SDS PAGE del conjugado HES-EPO, producido de acuerdo con el ejemplo 4.3.
Calle A: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 4.3.
Calle B: Material de partida de la EPO
Calle C: Marcador de Proteína Roti@-Mark PRESTAINEO (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); pesos moleculares (en KD) del marcador de proteína desde la parte superior a la inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4, y 17.
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Figura 3
La Figura 3 muestra un análisis SDS PAGE de los conjugados HES-EPO, producidos de acuerdo con los ejemplos 6.1 y 6.4.
Calle A: Marcador de proteína Roti®-Mark PRESTAINEO (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); pesos moleculares (en KD) del marcador de proteína desde la parte superior a la inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4, y 17.
Calle B: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.4.
Calle C: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.1.
Calle D: Material de partida de la EPO.
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Figura 4
La Figura 4 muestra un análisis SDS PAGE de los conjugados HES-EPO, producidos de acuerdo con ejemplos 6.2, 6.3, 6.5, y 6.6.
Calle A: Marcador de proteína Roti®-Mark PRESTAINEO (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, O); pesos moleculares (en KD) del marcador de proteína desde la parte superior a la inferior: 245, 1.23, 77, 42, 30, 25,4, y 17.
Calle B: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.6, basado en el Ejemplo 1.3 b).
Calle C: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.5, basado en el Ejemplo 1.1 b).
Calle D: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.6, basado en el Ejemplo 1.3 a).
Calle E: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.5, basado en el Ejemplo 1.1 a).
Calle F: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.2.
Calle G: Producto bruto después de la conjugación de acuerdo con el ejemplo 6.3.
Calle K: Material de partida de la EPO.
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Figura 5
Análisis de SDS-PAGE de EPO-GT-1 sometido a tratamiento ácido suave durante 5 min = calle 2; 10 min = calle 3; 60 min = calle 4 y EPO sin tratar = calle 1; el desplazamiento de movilidad de la EPO después de la eliminación de N-glicanos se muestra (+PNGASE).
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Figure 6
Patrón de HPAEC-PAO de los oligosacáridos aislados a partir de EPO y a partir de EPO incubados durante 5 min., 10 min y 60 min en condiciones de hidrólisis de ácido suave. Los números romanos IV indican la posición de elución de I = estructura diantenaria desializada, II = estructuras triantenarias trisializadas (dos isómeros), III = estructura tetraantenaria tetrasializada +2 N-acetil lactosamina repeticiones, IV = estructura tetraantenaria tetrasializada +1 repetición N-acetil lactosamina; V = estructura tetraantenaria tetrasializada + sin repetición de N-acetil lactosamina. El área de elución de las estructuras de los oligosacáridos, con 1-4 ácido siálico se indica entre paréntesis.
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Figura 7
Se muestra HPAEC-PAO de oligosacáridos ligados a N después de la desialilación; la posición de elución del ácido N-acetilneuráminico; los números 1-9 indican la posición de elución de los oligosacáridos convencionales: 1 = diantenario; 2 = triantenario (2-4 isómeros), 3 = triantenario (2-6 isómeros); 4 = tetraantenario; 5 = triantenario más 1 repetición; 6 = tetraantenario más 1 repetición; 7 = triantenario más 2 repeticiones; 8 = tetraantenario más 2 repeticiones y 9 = tetraantenario más 3 repeticiones.
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Figura 8
Análisis SDS-PAGE de la EPO tratada suave y no tratada que se sometieron a oxidación por peryodato de los restos de ácido siálico. 1 = oxidado con peryodato sin tratamiento de ácido; 2 = oxidado con peryodato 5 min de tratamiento de ácido; 3 = oxidado con peryodato y de tratamiento de ácido 10 min.; 4 = oxidado con peryodato sin tratamiento de ácido; 5 = BRP EPO estándar sin peryodato y sin tratamiento de ácido.
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Figura 9
Patrón de HPAEC-PAO de oligosacáridos natives aislados a partir de EPO no tratada y de EPO incubada durante 5 min y 10 min en condiciones de hidrólisis de ácido suave y posterior tratamiento de peryodato. El área de elución de las estructuras de oligosacáridos sin y con 1-4 ácido siálico se indica entre paréntesis 1-5.
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Figura 10
Análisis SDS-PAGE del tiempo de curso de la modificación por HES de EPO-GT-1-A: alícuotas de 20 \mug de EPO-GT-1-A- se hicieron reaccionar con derivado X de HES modificado por hidroxilamina durante 30 min, 2, 4 y 17 horas. Calle 1 = 30 min de tiempo de reacción; Calle 2 = 2 horas de tiempo de reacción; Calle 3 = 4 horas de tiempo de reacción; calle 4 = 17 horas de tiempo de reacción; Calle 5 = EPO-GT-1-A sin modificación por HES. La figura de la izquierda muestra el desplazamiento en movilidad de EPO-GT-1-A con un tiempo de incubación creciente en la presencia del derivado de HES modificado por hidroxilamina (caudal: 1 ml-min-1) X: calle 1 = 30 min de tiempo de reacción; calle 2 = 2 horas de tiempo de reacción; calle 3 = 4 horas de tiempo de reacción, calle 4 = 17 horas de tiempo de reacción; calle 5 = EPOGT-1-A con modificación por HES. La figura en el análisis de la muestra derecha de las mismas muestras después de su tratamiento con N-glicosidasa.
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Figura 11
Análisis SDS-PAGE de fracciones de Q-Sefarosa de los conjugados HES-EPO. Cada 1% del flujo continuo 1% de la fracción que eluye a latas concentraciones de sal se concentraron en un concentrador Speed Vac y se cargaron en los geles en tampón de muestra. La proteína EPO se tiñó mediante azul Coomassie. A = muestra I; B muestra II; C = muestra III; K =control EPO-GT-1; A1, B1, C1 y K1 indicaron la fracción de flujo continuo; A2, B2, C2 y K2 indica la fracción eluída con alta concentración de sal.
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Figura 12a
Análisis SDS-PAGE de muestra A2 de EPO modificada por HES (véase Fig. 7), muestra A2 de EPO de control EPO y preparación de EPO-GT-1-A EPO se digirieron en la presencia de N-glicosidasa con el fin de eliminar los oligosacáridos ligados a N. Todas las muestras de EPO.
Mostraron desplazamiento de movilidad hacia las formas de bajo peso molecular que carecen o contienen O-glicano. Una baja relación de la banda de proteína O-glicosilada y no glicosilada se observó para la muestra A2 de EPO modificada por HES después de la des glicosilación y una banda de proteína difusa se detectó alrededor de 30 KDa, representando presumiblemente la modificación por HES en el ácido siálico del resto O-glicano (véase la flecha marcada por un asterisco).
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Figura 12b
Análisis SDS-PAGE después de hidrólisis suave de la muestra A2 de EPO modificada por HES (véase Fig. 11), muestra K2 de EPO de control y EPO-GT-1A que estaban sin tratar o digeridas en la presencia de N-glicosidasa con el fin de eliminar los oligosacáridos ligados a N (véase la figura 12a). Tanto la forma de alto peso molecular de A2 antes como A después del tratamiento de N.glicosidasa (véanse los paréntesis con y sin flecha) desparecieron tras el tratamiento de ácido de las muestras. La BRP EPO estándar que se ensayó para comparación U no se sometió a tratamiento de ácido suave.
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Figura 13
Análisis HPAEC-PAD de material de oligosacárido ligado a N liberado de la Muestra A modificada por HES, de EPO-GT-1-A y de una muestra de EPO de control incubada con HES no modificada (K). Los números romanos I-V indican la posición de elución de I = estructura diantenaria disializada, II = estructuras triantenarias trisializadas (dos isómeros), III = estructura tetraantenaria tetrasializada + 2 repeticiones N-acetillactosamina, IV = estructura tetraantenaria tetrasializada + 1 repetición N-acetillactosamina, V = estructura tetraantenaria tetrasializada + sin repetición de N-acetillactosamina; los paréntesis indican el área de elución de N-glicanos di-, tri- y tetrasializados como se indica en las leyendas de las Figs. 6 y 9.
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Figura 14
Análisis HPAEC-PAD de material de oligosacárido ligado a N liberado de la muestra A modificada por HES, de EPO-GT1A y de una muestra de EPO de control (K) incubada con HES no modificada. Los tiempos de retención de una muestra de oligosacáridos convencionales se muestra: los números 1-9 indican la posición de elución de oligosacáridos convencionales: 1 = diantenario; 2 = triantenario (2-4 isómeros); 3 = triantenario (2-6 isómeros); 4 = tetraantenario; 5 = triantenario más 1 repetición; 6 = tetraantenario más 1 repetición; 7 = triantenario más 2 repeticiones; 8 = tetraantenario más 2 repeticiones y 9 tetraantenario más 3 repeticiones.
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Figuras 15 a 21
Las figuras 15 a 21 representan los espectros de masas MALDI/TOF de los N-glicanos liberados enzimáticamente y desislizados químicamente de la EPO modificada por HES y preparaciones de EPO de control. Las señales principales en m/z 1809,7, 2174,8, 2539,9, 2905,0 y 3270,1 ([M+Na]^{+}) corresponden a estructuras de N-glicano de tipo complejo di- a tetraantenarias con ninguna, una o dos repeticiones de N-acetil lactosamina acompañadas de señales débiles debido a la pérdida de fucosa o galactosa que se deben a las condiciones de hidrólisis de ácido empleadas para la desialización de las muestras para el análisis de MS.
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Figura 15
Espectro de MALDI/TOF: oligosacáridos desializados de EPO modificada por HES A2.
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Figura 16
Espectro de MALDI/TOF: oligosacáridos desializados de EPO GT-1-A.
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Figura 17
Espectro de MALDI/TOF: oligosacáridos desializados de EPO K2.
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Figura 18
Espectro de MALDI/TOF: oligosacáridos desializados de EPO-GT-1.
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Figura 19
Espectro de MALDI/TOF: oligosacáridos desializados de EPO-GT-1 sometidos a hidrólisis de ácido durante
5 min.
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Figura 20
Espectro de MALDI/TOF: oligosacáridos desializados de EPO-GT-1 sometidos a hidrólisis de ácido durante
10 min.
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Figura 21
Espectro de MALDI/TOF: oligosacáridos desializados de EPO-GT-1 sometidos a hidrólisis de ácido durante
60 min.
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Ejemplos Ejemplo 1 Formación de derivados de almidón hidroxietilado mediante aminación reductora
Ejemplo 1.1
Reacción de almidón hidroxietilado con 1,3-diamino-2-hidroxi propano
30
a) A una solución de 200 mg de almidón hidroxietilado (HES18/0,4 (PM = 18.000 D, DS = 0,4)) en 5 ml de agua, 0,83 mmol de 1,3-diamino-2-hidroxi propano y se añadieron 50 mg de cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3}. La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 h. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se dializó durante 4 d contra agua (tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
b) Incubación de la mezcla resultante de añadir 0,83 mmol. 1,3-diamino-2-hidroxi propano y 50 mg de cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3} a la solución de 200 mg de almidón hidroxietilado fue también posible y se llevó a cabo a 25ºC durante 3 d.
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Ejemplo 1.2
Reacción de almidón hidroxietilado con 1,2-dihidroxi-3-amino propano
31
a) A una solución de 200 mg de almidón hidroxietilado (HES 18/0,4 (PM = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml de agua, 0,83 mmol de 1,2-dihidroxi-3-amino propano y se añadieron 50 mg de cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3}. La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 h. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se dializó durante 4 d contra agua (Tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
b) Incubación de la mezcla resultante de la adición de 0,83 mmol de 1,2-dihidroxi-3-amino propano y 50 mg de cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3} a la solución de 200 mg de almidón hidroxietilado fue también posible y se llevó a cabo a 25ºC durante 3.
La reacción de 1,2-dihidroxi-3-amino propano con HES se confirmó indirectamente mediante cuantificación de formaldehído, que se produce a partir de la escisión oxidante del 1,2-diol en el producto de reacción mediante peryodato como se describe por G. Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983) 449-504.
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Ejemplo 1.3
Reacción de almidón hidroxietilado con 1,4-diamino butano
32
a) A una solución de 200 mg de almidón hidroxietilado (HES 18/0,4 (PM = 18.000 D, DS = 0,4)) en 5 ml de agua, 0,83 mmol de 1,4-diamino butano y se añadieron 50 mg de cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3}. La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 h. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v). El precipitado se recogió mediante centrifugación y se dializó durante 4 d contra agua (Tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
b) Incubación de la mezcla resultante de la adición de 0,83 mmol de 1,4-diamino, butano y 50 mg de cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3} a la solución de 200 mg de almidón hidroxietilado fue también posible y se llevó a cabo a 25ºC durante 3 d.
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Ejemplo 1.4
Reacción de almidón hidroxietilado con 1-mercapto-2-amino etano
33
a) A una solución de 200 mg de almidón hidroxietilado (HES 18/0,4 (PM = 18.000 D, DS = 0.4)) en 5 ml de agua, 0,83 mmol de 1-mercapto-2-amino etano y se añadieron 50 mg cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3}. La mezcla resultante se incubó a 80ºC durante 17 h. La mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v). Se recogió el precipitado mediante centrifugación y se dializó durante 4 d contra agua (tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
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b) Incubación de la mezcla resultante de la adición de 0,83 mmol de 1-mercapto-2-amino etano y 50 mg de cianoborohidruro de sodio NaCNBH_{3} a la solución de 200 mg de almidón hidroxietilado fue también posible y se llevó a cabo a 25ºC durante 3.
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Ejemplo 2 Formación de derivado de almidón hidroxietilado mediante conjugación
Ejemplo 2.1
Reacción de almidón hidroxietilado con carbohidrazida
34
0,96 g de HES 18/0,4 (PM = 18.000 D, DS = 0.4) se disolvieron en 8 ml de tampón acetato de sodio acuoso 0,1 M, pH 5,2, y se añadieron 8 mmol de carbohidrazida (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D). Después de agitación durante 18 h a 25ºC, la mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v). El producto precipitado se recogió mediante centrifugación, se volvió a disolver en 40 ml de agua, y se dializó durante 3 d contra agua (Tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Oeutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
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Ejemplo 2.2
Reacción de almidón hidroxietilado con dihidrazida adípica
35
0,96 g de HES 18/0, 4 (PM = 18.000 D, DS = 0.4) se disolvieron en 8 ml de tampón acetato de sodio acuoso 0,1 M, pH 5,2, y se añadieron 8 mmol de dihidrazida adípica (Lancaster Synthesis, FrankfurtlMain, D). Después de agitación durante 18 h a 25ºC, la mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v). El producto precipitado se recogió mediante centrifugación, se volvió a disolver en 40 ml de agua, y se dializó durante 3 d contra agua (tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Oeutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
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Ejemplo 2.3
Reacción de almidón hidroxietilado con 1,4-fenilen-bis-3-tiosemicarbazida
36
0,96 g de HES 18/0, 4 (PM = 18.000 D, DS = 0,4) se disolvieron en 8 ml de tampón acetato de sodio acuoso 0,1 M, pH 5,2, y se añadieron 8 mmol de 1,4-fenilen-bis-3-tiosemicarbazida (Lancaster Synthesis, FrankfurtlMain, D). Después de agitar durante 18 h a 25ºC, se añadieron 8 ml de agua a la mezcla de reacción, y la suspensión se centrifugó durante 15 min a 4.500 rpm. El sobrenadante transparente se decantó y posteriormente se añadió a 160 ml de una mezcla fría 1:1 de acetona y etanol (v/v). El producto precipitado se recogió mediante centrifugación, se volvió a disolver en 40 ml de agua, y se centrifugó durante 15 min a 4.500 rpm. El sobrenadante transparente se dializó durante 3 d contra agua (tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Oeutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
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Ejemplo 2.4
Reacción de almidón hidroxietilado con O-[2-(2-aminooxietoxi)-etil]-hidroxil amina
37
O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina se sintetizó como se ha descrito en Boturyn et al. Tetrahedron 53 (1997) p. 5485-5492 en 2 etapas a partir de materiales comercialmente disponibles.
0,96 g de HES 18/0, 4 (PM = 18.000 D, DS = 0,4) se disolvieron en 8 ml de tampón acetato de sodio acuoso 0,1 M, pH 5,2, y se añadieron 8 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxil amina. Después de agitación durante 18 h a 25ºC, la mezcla de reacción se añadió a 160 ml de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v). El producto precipitado se recogió mediante centrifugación, se volvió a disolver en 40 ml de agua, y se dializó durante 3 d contra agua (Tubería de diálisis SnakeSkin, 3,5 KD de corte, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), y se liofilizó.
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Ejemplo 3 Oxidación de eritropoyetina
Se produjo eritropoyetina oxidada como se ha descrito en el Ejemplo 7. Como eritropoyetina oxidada, EPO-GT-1-A como se ha descrito en el Ejemplo 7.11 (c) como se usó (EPO-GT-1 sin dihidrólisis de ácido, se trató con oxidación suave por peryodato).
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Ejemplo 4 Conjugación de derivado de almidón hidroxietilado con con eritropoyetina oxidada del ejemplo 3
Ejemplo 4.1
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 2.1
EPO oxidada (1,055 \mug/I\mul) en 20 mM de tampón PBS se ajustó hasta pH 5,3 con 5 M de tampón acetato de sodio, pH 5,2. A 19 \muI de la Solución de EPO, se añadieron 18 \muI de una solución del Derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 2,1 (PM 18 kD; 18,7 \mug/\muI en 0,1 M de tampón acetato de sodio, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones proporcionadas por Invitrogen. El gel se tiñe con Reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante toda una noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig. 1. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más altos. El aumento de la amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 4.2
Reacción de eritropoyetina oxidada with el producto de reacción del ejemplo 2.3
EPO oxidada (1,055 \mug/\muI) en 20 mM de Tampón PBS se ajustó hasta pH 5,3 con 5 M de tampón acetato de sodio, pH 5,2. A 19 \muI de la solución de EPO, se añadieron 18 \muI de una solución del derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 2,3 (PM 18 kD; 18,7 \mug/\muI en 0,1 M de tampón acetato de sodio, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen.
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Ejemplo 4.3
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 2.4
EPO oxidada (1,055 \mug/\muI) en 20 mM de Tampón PBS se ajustó hasta pH 5,3 con 5 M de tampón acetato de sodio, pH 5,2. A 19 \muI de la solución de EPO, se añadieron 18 \muI de una solución del derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 2,4 (PM 45 18 kD; 18,7 \mug/\muI en 0,1 M de tampón acetato de sodio, pH 5,2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñe con reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante toda una noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig. 2. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más altos. El aumento de la amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de Derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 5 Formación de Tio-EPO mediante reducción de eritropoyetina
241,5 \mug de eritropoyetina (EPO-GT-1, véase Ejemplo. 7) en 500 \muI de 0,1 M de un tampón borato de sodio, 5 mM de EDTA, 10 mM de DTT (Lancaster, Morcambe, Reino Unido), pH 8,3, se incubaron durante 1 h a 37ºC. El DTT se eliminó mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0,5 ml VIVASPIN, 10 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, posterior lavado 3 veces con el tampón borato y dos veces con un tampón fosfato (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2).
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Ejemplo 6 Conjugación de derivados de almidón hidroxietilado con tioeritropoyetina usando un compuesto de reticulación
En cada uno de los siguientes ejemplos, N-(alfa-maleimidoacetoxi) succinimida éster (AMAS)
38
se usó como compuesto de reticulación.
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Ejemplo 6.1
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 2.1 y el compuesto de reticulación
A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 2.1 y disuelto en 200 \muI de 0,1 M de un tampón fosfato de sodio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), se añadieron 10 \muI de una solución de 2.5 \mumol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución transparente se incubó durante 80 min a 25ºC y 20 min a 40ºC. Se retiró el AMAS remanente mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD
MWCO (VIVAS-25 CIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 veces y 30 min cada una con el tampón fosfato.
A la solución residual, se añadieron 15 \mug de TioEPO producido de acuerdo con el ejemplo 5 (1 \mug/\muI en tampón fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñe con reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante toda una noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig. 3. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más altos. El aumento de la amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de Derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 6.2
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 2.2 y el compuesto de reticulación
A 50 nmol den derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 2.2 y disuelto en 200 \muI de 0,1 M de un tampón de fosfato de sodio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), se añadieron 10 \muI de una solución de 2,5 \mumol de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución transparente se incubó durante 80 min a 25ºC y 20 min a 40ºC. Se retiró el AMAS remanente mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCI ENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 veces y 30 min cada una con el tampón fosfato.
A la solución residual, se añadieron 15 \mug de TioEPO producido de acuerdo con el ejemplo 5 (1 \mug/\muI en tampón fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/Tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñe con reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante toda una noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig 4. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más altos. El aumento de amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 6.3
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 2.3 y el compuesto de reticulación
A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 2.3 y disuelto en 200 \muI de 0,1 M de un tampón fosfato de sodio (0,1 M, 9,15 M de NaCl, 50 mM de EDTA, pH 7,2), se añadieron 10 \muI de una solución de 2.5 \mumol de AMAS (Sigma Aldrich, 55 Taufkirchen, D) en DMSO. La solución transparente se incubó durante 80 min a 25ºC y 20 min a 40ºC. Se retiró el AMAS remanente mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 veces y 30 min cada una con el tampón fosfato.
A la solución residual, se añadieron 15 \mug de TioEPO producido de acuerdo con el ejemplo 5 (1 \mug/\muI en tampón fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/Tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñe con Reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) con vigilancia.
El resultado experimental se muestra en la Fig. 4. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más altos. El aumento de la amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de Derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 6.4
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 2.4 y el compuesto de reticulación
A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 2.4 y disuelto en 200 \mul de 0,1 M de un tampón fosfato de sodio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), se añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol de MAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen,D) en DMSO. La solución transparente se incubó durante 80 min a 25ºC y 20 min a 40ºC. Se retiró el AMAS remanente mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 veces y 30 min cada una con el tampón fosfato.
A la solución residual, se añadieron 15 \mug de TioEPO producido de acuerdo con el ejemplo 5 (1 \mug/\mul en tampón fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/Tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñe con Reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante toda una noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig 3. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a mayor peso molecular El aumento de la amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de Derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 6.5
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 1.1 y el compuesto de reticulación
A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 1.1, en condiciones de incubación de 80ºC y 17 h (Ejemplo 1.1 a)) así como de 25ºC y 3 d (Ejemplo 1.1 b)), y disuelto en 200 \mul de 0,1 M tampón fosfato de sodio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), se añadieron 10 \mul de una solución de 2.5 \mumol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución transparente se incubó durante 80 min a 25ºC y 20 min a 40ºC. Se retiró el AMAS remanente mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 veces y 30 min cada una con el tampón fosfato.
A la solución residual, se añadieron 15 \mug de TioEPO producido de acuerdo con el ejemplo 5 (1 \mug/ \mul en tampón fosfato), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/Tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñe con Reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) con vigilancia.
El resultado experimental se muestra en la Fig. 4. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más altos. El aumento de la amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados de HES usados y el número de Derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 6.6
Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del ejemplo 1.3 y el compuesto de reticulación
A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 1.3, en condiciones de incubación de 80ºC y 17 h (Ejemplo 1.3 a)) así como de 25ºC y 3 d (Ejemplo 1.3 b), y disuelto en 200 \mul de 0,1 M de un tampón fosfato de sodio (0,1 M, 9,15 M de NaCl, 50 mM de EDTA, pH 7,2), se añadieron 10 \mul de una solución de 2,5 \mumol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución transparente se incubó durante 80 min a 25ºC y 20 min a 40ºC. Se retiró el AMAS remanente mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 veces y 30 min cada una con el tampón fosfato.
A la solución residual, 15 \mug de TioEPO producido de acuerdo con el ejemplo 5 (1 \mug/\mul en tampón fosfato) se añadieron, y la mezcla se incubó durante 16 h a 25ºC. Después de la liofilización, el producto bruto se analizó mediante SDS-Page con Geles NuPAGE de Bis-Tris al 10%/Tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se ha descrito en las instrucciones dadas por Invitrogen. El gel se tiñe con Reactivo de tinción Roti-Azul Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante toda una noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig 4. Una conjugación exitosa se indica por la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más altos. El aumento de la amplitud de banda se debe a la distribución de peso molecular de los Derivados de HES usados y el número de Derivados de HES ligados a la proteína.
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Ejemplo 7 Producción preparativa de los conjugados HES-EPO Sumario
Los conjugados HES-EPO se sintetizaron mediante acoplamiento de los derivados de HES (peso molecular promedio de 18.000 Dalton; grado de sustitución de hidroxietilo de 0,4) a los restos de ácido siálico (peryodato suave) parcialmente oxidados sobre las cadenas de oligosacárido de la EPO humana recombinante. Basándose en el análisis estructural de carbohidrato las modificaciones introducidas no afectaron la integridad estructural de las cadenas de oligosacárido estructural ya que MALDl/TOF-MS de los glicanos modificados por HES tratados con ácido suave revelaron cadenas de tipo N-acetil lactosamina neutras intactas que eran indistinguibles de de éstos observados en el producto EPO no modificado. Los resultados obtenidos indican que al menos 3 restos de HES modificados están unidos por molécula de EPO en el caso de la preparación de EPO que se sometió a modificación sin la anterior eliminación de ácido siálico parcial. Una variante de EPO que carece de aproximadamente 50% de los restos de ácido siálico de la proteína anterior mostraron una movilidad de alto peso molecular aparente similar en SDS-PAGE (60-110 KDa frente a 40 KDa para el estándar de BRP EPO). La EPO modificada por HES es estable en condiciones de cromatografía de intercambio iónico convencionales a temperatura ambiente a pH 3-10.
El bioensayo de EPO en el sistema de ratón normocitémico indica que la EPO modificada por HES tiene una actividad 2,5-3,0 veces mayor (IU/mg) en este ensayo cuando se compara cuando se compara con es estándar de referencia BRP EPO basándose en la determinación de proteína usando el valor de absorción de UV de la Farmacopea Europea y un procedimiento de determinación de proteína de EPO RP-HPLC calibrado contra la preparación estándar de BRP EPO.
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Ejemplo 7.1
Materiales y procedimientos (a) Liberación de oligosacáridos unidos a N mediante digestión con N-glicosidasa
Las muestras se incubaron con 25 unidades (de acuerdo con la especificación de los fabricantes, Roche Diagnostics, Alemania) de PNGasa F recombinante durante una noche a 37ºC. La digestión completa se controló mediante el desplazamiento de movilidad específica de la proteína en SDS-PAGE. Los N-glicanos liberados se separaron del polipéptido mediante la adición de 3 volúmenes de etanol al 100% frío y la incubación a -20ºC durante al menos 2 horas (Schroeter S et al, 1999).La proteína purificada se eliminó mediante centrifugación durante 10 minutos a 4ºC a 13000 rpm. El sedimento después se sometió a dos lavados adicionales con 500 \muI de etanol al 75% enfriado con hielo. Los oligosacáridos en los sobrenadantes combinados se secaron en una centrífuga de vacío (concentrador Speed Vac, Savant Instruments Inc., Estados Unidos). Las muestras de glicano se desalaron usando Cartuchos Hypercarb (25 mg o 100 mg de HyperCarb) como sigue antes de uso: las columnas se lavaron con 3 x 500 \muI de 80% de acetonitrilo (v/v) en 0,1% de TFA seguido de lavados con 3 x 500 \mul de agua. Las muestras se diluyeron con agua hasta un volumen final de 300 \muI-600 \muI antes de cargar en el cartucho que después se lavó vigorosamente con agua. Los oligosacáridos se eluyeron con 1,2 ml (cartuchos de 25 mg; 1,8 ml en el caso de cartuchos de 100 mg) 25% de acetonitrilo en agua que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético (v/v). Los oligosacáridos eluidos se neutralizaron con 2 M de NH_{4}0H ay se secaron en un concentrador Speed Vac. En algunos casos la desalinización de los oligosacáridos liberados por la N-glicosidasa se realizó mediante la adsorción de la mezcla de digestión de las muestras < 100 \mug de (glico)proteína total en Cartuchos Hypercarb de 100 mg.
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(b) Análisis de oligosacáridos mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización de láser asistida por matriz (MALDI/TOF/TOF-MS)
Se usó un instrumento de tiempo de vuelo Bruker ULTRAFLEX (TOF/TOF): se analizaron oligosacáridos desializados nativos usando ácido 2,5-dihidroxibenzoico como material adsorbente de UV en el modo de ion positivo así como en el negativo usando el reflectron en ambos casos. Para los análisis de MS-MS, se sometieron iones precursores seleccionados a disociación inducida por láser (LID) y iones de los fragmentos resultantes separados mediante la segunda fase TOF (LIFT) del instrumento. Soluciones de muestra de 1 \muI y una concentración aproximada de 1-10 pmol.\mu1^{-1} se mezclaron con cantidades iguales de la matriz respectiva. Esta mezcla se manchó sobre una diana de acero inoxidable y se secaron a temperatura ambiente antes de análisis.
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Ejemplo 7.2
Preparación y caracterización de EPO recombinante humana (EPO-GT-1)
EPO se expresó a partir de células CHO recombinantes como se ha descrito (Mueller PP et al, 1999, Dorner AJ et al, 1984) y las preparaciones se caracterizaron de acuerdo con procedimientos descritos en Eur. Phar. (Ph. Eur. 4, Monography 01/2002: 1316: Erythropoietin concentrated solution). El producto final tenía un contenido en ácido siálico de12 nMol (+/-1,5 nMol) por nMol de proteína. Las estructuras de oligosacáridos ligados a N se determinaron mediante HPAEC-PAD y mediante MALDlfTOF-MS como se ha descrito (Nimtz et al, 1999, Grabenhorst, 1999). Las preparaciones de EPO que se obtuvieron contenían oligosacáridos di-, tri y tetrasializados (2-12%, 15-28% y 60-80%, respectivamente, cadenas sulfatadas y pentasializadas estaban presentes en pequeña cantidad). Las características de glicosilación globales de las Preparaciones de EPO eran similares a la de la preparación estándar de BRP EPO internacional.
El patrón de localización isoeléctrico de la EPO recombinante era comparable a la de la preparación estándar de BRP de referencia EPO internacional que muestra las isoformas correspondientes. 25% de la proteína EPO carecía de O-glicosilación en la Ser126 de la cadena del polipéptido.
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Ejemplo 7.3
Preparación de formas de EPO parcialmente desializadas
La proteína EPO GT-1 (2,84 mg/ml) se calentó hasta 80ºC en 20 mM de tampón fosfato de Na pH 7,0 y después 100 \muI de 1 N H_{2}SO_{4} se añadió por 1 ml de la solución de EPO; se continuó la incubación durante 5 min, 10 min y 60 min, respectivamente, produciendo las preparaciones de EPO de diferente grado de sialilación. La cuantificación de los oligosacáridos con 0-4 ácidos siálicos se realizó después de la liberación de oligosacáridos con el polipéptido. N-glicosidasa y aislamiento de las cadenas ligadas a N se realizó mediante la desalinización Cartuchos Hypercarb (25 mg HyperSep Hypercarb; ThermoHypersil-Keystone, Reino Unido). Las preparaciones de EPO se neutralizaron mediante la adición de 1 N de NaOH y, se congelaron en N_{2} líquido y se almacenaron a -20ºC hasta el uso posterior.
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Ejemplo 7.4
Oxidación por Peryodato de formas de EPO sializadas
A 10 mg de EPO no tratada o tratada con ácido suave tratada disuelta en 3,5 ml de 20 mM de tampón fosfato de Na pH 7,0 se añadieron 1,5 ml de 0,1 M de tampón acetato de Na pH 5,5 y la mezcla se enfrió hasta 0ºC en un baño de hielo; se añadieron 500 \muI de 10 mM de peryodato de Na y la mezcla de reacción se mantuvo en la oscuridad durante 60 min a 0ºC. Después se añadieron 10 \muI de glicerol y se continuó la incubación durante 10 min en la oscuridad. Las formas de EPO parcialmente oxidadas se separaron de los reactivos mediante desalinización usando concentradores VIVASPIN (10.000 MWCO, PES Vivascience AG, Hannover, Alemania) de acuerdo con la recomendación del fabricante a 3000 rpm en una centrífuga de laboratorio equipada con un rotor de ángulo fijo. Después de la
congelación en nitrógeno líquido las preparaciones de EPO se almacenaron en un volumen final de 4 ml a -20ºC.
Alícuotas de 100 \mug de la preparación de EPO parcialmente oxidada se sometieron a tratamiento con N-glicosidasa y los oligosacáridos se aislaron usando Cartuchos Hypercarb como se ha descrito. Los oligosacáridos se desializaron mediante tratamiento de ácido suave y se analizaron mediante HPAEC-PAD y sus tiempos de retención se compararon con los oligosacáridos convencionales auténticos como se ha descrito (Nimtz et al., 1990 y 1993).
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Ejemplo 7.5
Reducción de disulfuros de EPO con ditioeritreitol
5 mg de EPO-GT1 se incubaron en 5 ml de 0,1 de tampón MTris/HCl pH 8,1 en la presencia de 30 mM de ditioeritreitol (DTI) a 37ºC durante 60 minutos; la retirada de DTI se logró mediante el uso de un concentrador Vivaspin at 4ºC, 4 ciclos de cambio de tampón. La preparación de EPO reducida final se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -20ºC en 50 mM de tampón acetato de Na pH 5,5.
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Ejemplo 7.6
Determinación de la proteína de EPO
La determinación cuantitativa de Proteína de EPO se realizó mediante la medición de la absorpción de UV a 280 nm de acuerdo con la Eur. Phar. (Farmacopea Europea 4, Monography 01/2002: 1316: erythropoietin concentrated solution) en una cubeta con una longitud de trayecto de 1 cm. Además, EPO se cuantificó mediante la aplicación de un procedimiento RP-HPLC usando una columna RP-C4 (Vydac Proteína C4, nº de Cat. 214TP5410, Grace Vydac, Ca, US); el procedimiento HPLC se calibró usando el estándar de referencia BRP 1 de eritropoyetina (Farmacopea Europea, Conseil de l'Europe B.P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1).
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Ejemplo 7.7
Oxidación de EPO desializada con la galactosa oxidasa
4,485 mg de EPO completamente desializada se incubó en 20 mM de tampón fosfato de Na pH 6,8 en la presencia de 16 \muI de catalasa (6214 unidades/200 ml) y 80 \muI de galactosa oxidasa (2250 unidades/ml de Dactylium dendroides (SigmaAldrich, Steinheim, Alemania); incubación a 37ºC durante toda una noche; 2 veces 20 \muI de galactosa oxidasa se añadió después de 4 horas y después de 8 horas después del comienzo de la incubación.
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Ejemplo 7.8
Preparación de Muestras de EPO para bioensayos Purificación de EPO a partir de incubaciones de preparaciones de proteínas de EPO oxidada por peryodato - o la galactosa-oxidasa-EPO con HES activado
Purificación de muestras de EPO (eliminación de derivados de HES sin reaccionar) se llevó a cabo a temperatura ambiente. Las mezclas de incubación de EPO (aproximadamente 5 mg de Proteína de EPO) se diluyeron 1:10 con tampón A (20 mM de N-morfolina propano ácido sulfónico [MOPS/NaOH] en H_{2}O bidestilada, pH 8,0) y se aplicaron a una columna que contenía 3 ml de Q-Sefarosa HP (Pharmacia nº de código. 17-1014 -03, nº de lote 220211) equilibrada con 10 volúmenes de columna (CV) o tampón A mediante el uso de un caudal de 0,5 ml/min. La columna se lavó con 6-8 CV de tampón A (caudal = 0,8 ml/min) y se realizó la elución mediante el uso del tampón B (20 mM de morfolina etano ácido sulfónico [MES/NaOH], 0,5 M de NaCl en H_{2}O bidestilada, pH 6,5) a un caudal de 0,5 ml/min. EPO se detectó mediante absorción de UV a 280 nm y se eluyó en aproximadamente 6 ml. La columna se regeneró mediante el uso de 3 CV de tampón C (20 mM MES, 1,5 M NaCl en H_{2}O ajustada hasta pH 6,5) y se volvió a equilibrar mediante el uso de 10 CV de tampón A (caudal = 0,7 ml/min).
El cambio de tampón de los eluatos de EPO obtenidos de la etapa de Q-Sefarosa se realizó usando concentradores Vivaspin y solución salina tamponado con fosfato (PBS) con cada 3 ciclos de centrifugación por muestra; las muestras se ajustaron hasta 2 ml con PBS y se almacenaron a -20ºC.
Solamente < 25% de las formas de EPO parcialmente desializadas y posteriormente oxidadas con peryodato que se sometieron a la modificación de HES se obtuvieron a partir del eluato de Q-Sefarosa ya que en las condiciones empleadas las formas de EPO básicas no se unieron a Q-Sefarosa y se encontraron en el flujo continuo conjuntamente con derivados de HES no reactivos.
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Ejemplo 7.9
Cromatografía de intercambio aniónico de alto pH con detección amperiométrica por pulsos (HPAEC-PAD)
Se analizaron oligosacáridos nativos purificados y desializados mediante cromatografía de intercambio aniiónico de alto pH (HPAE) usando un sistema Dionex BioLC (Dionex, Estados Unidos) equipado con una columna CarboPac PA1 (0,4 x 25 cm) en combinación con un detector de amperios por pulsos (PAD) (Schroter et al., 1999; Nimtz et al., 1999). Los potenciales de detector (E) y duraciones del pulso (T) eran: E1: +50 mV, T1: 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms; E3: -500 mV, T3: 60 ms, y el intervalo de salida era 500-1500 nA. Los oligosacáridos después se inyectaron en la columna CarboPac PA1 que se equilibró con 100% de disolvente A. Para la elución de oligosacáridos desializados (caudal: 1 ml-min^{-1}) se realizó mediante la aplicación de un gradiente lineal (0-20%) de disolvente B durante un período de 40 min seguido de un incremento lineal entre 20-100% de disolvente B durante 5 min. El disolvente A era 0,2 M de NaOH en H_{2}O bidestilada, disolvente B constaba de 0,6 M de NaOAc en disolvente A. para los oligosacáridos nativos la columna se equilibró con 100% de disolvente C (0,1 M de NaOH en H_{2}O bidestilada) y la elución (caudal: 1 ml-min^{-1}) se realizó mediante la aplicación de un gradiente lineal (0-35%) de disolvente D durante un período de 48 min seguido de un incremento lineal de 35-100% de disolvente D durante 10 min. El disolvente D constaba de 0,6 M de NaAc en disolvente C.
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Ejemplo 7.10
El análisis de la composición de monosacáridos de N-glicanos, N-glicanos modificados por HES y Proteína de EPO mediante GC-MS
Los monosacáridos se analizaron como los metil glicósidos correspondientes después de la metanolisis, N-reacetilación y trimetilsililación mediante GC/MS [Chaplin, M. F. (1982) A rapid and sensitive method for the analysis of carbohidrate Anal. Biochem. 123, 336-341 J. Los análisis se realizaron sobre un espectrómetro de masas de trampa de iones Finnigan GCQ (Finnigan MAT corp., San José, CA) desarrollando en el modo EL del ion positivo equipado con una columna capilar 30 m DB5. Programa de temperatura: 2 min de isotermia a 80ºC, después 300 grados min^{-1} hasta 30ºC.
Los monosacáridos se identificaron mediante su tiempo de retención y patrón de caracterización característico. Los resultados sin corregir de la integración de máximos electrónicos se usaron para cuantificación. Los monosacáridos que producen más de un máximo debido a la anomericidad y/o la presencia de formas furanoides y piranoides se purificaron mediante la adición de todos los máximos principales. 0,5 \mug de mio-inositol se usaron como un compuesto estándar interno.
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Ejemplo 7.11
Resultados
Ejemplo 7.11(a)
Caracterización de N-glicanos de EPO-GT-1 tratados con ácido suave (parcialmente desializados)
Las preparaciones EPO-GT-1 sometidas a tratamiento de ácido suave durante 5, 10 ó 60 min. se analizaron mediante SDS-PAGE antes y después de la liberación de oligosacáridos ligados a N mediante incubación con la N-glicosidasa como se muestra en la figura 5, Los oligosacáridos ligados a N se sometieron a mapeo de oligosacárido de HPAEC-PAD (Figura 6). La EPO-GT-1 no tratada contenía > 90% de los oligosacáridos ligados a N con 3 ó 4 restos de ácido siálico mientras que después de 5 min. de incubación en la presencia de ácido suave < 40% de cadenas de carbohidrato tenían 3 o 4 restos de ácido siálico. HPAEC-PAD de los N-glicanos desializados revelaron que la relación de oligosacáridos neutros que se detectaron para la EPO-GT-1 sin tratar y permanecían estable en las preparaciones sometidas al tratamiento de ácido durante 5, 10 ó 60 min. MALDIITOF-MS de los glicanos desializados revelaron que < 90% de la fucosa proximal estaba presente después de tratamiento de ácido suave de la proteína.
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Ejemplo 7.11(b)
Caracterización de EPO-GT-1 tratada con peryodato
La movilidad SDS-PAGE de formas de EPO tratada con peryodato suave que se habían sometido previamente a tratamiento de 5 y 10 minutos con ácido o no se trataron se compara en la figura 8. Las condiciones usadas para la oxidación por peryodato de ácidos siálicos no cambiaron el patrón de SDS-PAGE de las preparaciones de EPO (se comparan en la Fig. 5). Oxidación de ácidos siálicos dio como resultado un desplazamiento de oligosacáridos en análisis de HPAEC-PAO hasta tiempo de elución más tempranos (se comparan en las figuras 6 y 9).
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Ejemplo 7.11(c)
Caracterización de derivados de EPO modificada por HES (aa) Curso del tiempo de la modificación por HES de la EPO-GT-1-A con un derivado X de HES modificado por hidroxilamina, producida de acuerdo con el Ejemplo 2.4
400 \mug de derivado X de HES modificado por hidroxilamina se añadieron a 20 \mug de EPO-GT-1-A (EPO oxidada por peryodato suave, no hidrolizada por ácido antes de la oxidación por peryodato suave) en 20 \mul 0,5 M de tampón NaOAc pH 5,5 y la reacción se detuvo después de 30 min, 2, 4, y 17 horas, respectivamente, mediante las muestras de congelación en nitrógeno líquido. Posteriormente las muestras se almacenaron a -20ºC hasta análisis posterior.
Se añadió tampón de muestra SDS PAGE y las muestras se calentaron hasta 90ºC y se aplicaron sobre geles SDS. Como se muestra en la figura 10, los incrementos de los tiempos de incubación dan como resultado un incremento del desplazamiento hacia peso molecular más alto de la proteína. Después de 17 horas de incubación en la presencia del derivado X de HES modificado por hidroxilamina se detectó una banda de proteína difusa teñida por Coomassie que migra en el área entre 60 y 11 KDa, basándose en la posición de patrones de peso molecular (véase la parte izquierda de la Fig. 10). Tras el tratamiento con N-glicosidasa la mayoría de la proteína se desplazó hacia la posición de la EPO des N-glicosilada (véase la Fig. 10, gel de la derecha; la flecha A indica la posición de migración de la N-glicosidasa, la flecha B indica la posición de migración de la EPO des N-glicosilada; la banda de proteína difusa visible en la región entre los patrones de peso molecular de 28 KDa y 36 KDa presumiblemente representa las formas de EPO que están modificadas por HES y el sitio de O-glicosilación de la molécula. En vista de la especificidad de la N-glicosidasa los inventores concluyen a partir de este resultado que de hecho la modificación de HES se produce en los restos de ácido siálico oxidados con peryodato de glicanos de la Proteína de EPO.
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(bb) Caracterización de los conjugados HES-EPO
Los conjugados HES-EPO I(que se originan a partir de EPO-GT-1 después de la oxidación por peryodato suave, es decir, a partir de EPO-GT-1-A), III (que se produce a partir de EPO-GT-1 sometida a 5 min de hidrólisis de ácido y oxidación por peryodato suave), II (que se produce a partir de EPO-GT-1 sometida a 10 min de hidrólisis de ácido y oxidación por peryodato suave) se sintetizaron como se ha descrito antes. Una incubación de control (K) que incluyó que contenía EPO-GT-1 no modificada en las mismas condiciones de tampón a la que se añadió una cantidad equivalente de HES modificado. Las mezclas de incubación se sometieron a una purificación adicional para el análisis posterior adicional de los derivados de HES-EPO.
Las incubaciones de los conjugados HES-EPO I, II y III así como la incubación K se control se sometieron a una etapa de purificación por Q-Sefarosa como se describe más adelante "Material y Procedimientos" (Ejemplo 7.8) con el fin de eliminar el exceso de reactivo de HES que no ha reaccionado que se esperó en el flujo continuo de la columna de intercambio iónico. Debido a las altas cantidades de de las formas de EPO básicas contenidas en las muestras tratadas con ácido previamente II y III los investigadores esperan considerables cantidades de producto EPO modificado a partir de estas incubaciones en el flujo continuo. Como se muestra en la Figura 11, casi todo el material de EPO material de las muestras I se retuvo mediante la columna de Q-Sefarosa mientras que solamente aproximadamente 20-30% de las muestras III y II se recuperó en la fracción que eluye con alta concentración de sal. Todo el material de la proteína de las incubaciones con derivado X de HES, tanto en el flujo continuo como en las fracciones que eluyen con alto
contenido en sal, tenían aparentes altos pesos moleculares en SDS-PAGE cuando se compara con la EPO de control.
Con el fin de caracterizar en más detalle la muestra A y K de EPO modificada por HES (véase la figura 11) se compararon con la EPO-GT-1-A de la forma oxidada con peryodato. Las muestras se sometieron a tratamiento con N-glicosidasa y como se muestra en las Figuras 12a y 12b la liberación de los N-glicanos dio como resultado las dos bandas de bajo peso molecular en la posición de las formas de EPO O-glicosilada y no glicosilada de la preparación de EPO estándar. En el caso de la muestra A una banda adicional que migra en la posición del patrón de 28 KDa de PM se detectó sugiriendo la modificación de HES en el O-glicano de esta variante de EPO (cf. Ejemplo 7.11 (c) (aa)). Esta banda (y también la forma de alto peso molecular altamente modificada por de la EPO N-glicosilada, véanse las Figs. 12a y 12b) desaparecieron después de someter las muestras a hidrólisis suave que está de acuerdo con la opinión que la modificación de HES se logró en los restos de ácido siálico oxidados por peryodato de eritropoyetina.
Las alícuotas de las mezclas de incubación de la N-glicosidasa se hidrolizaron usando condiciones que permiten la completa eliminación de los ácidos siálicos (y también el derivado de HES unido a ácido siálico) a partir de oligosacáridos; después de la neutralización, las mezclas se absorbieron después sobre pequeñas columnas de Hypercarb para su desalinización. Las columnas se lavaron de manera rigurosa con agua seguido de la elución de oligosacáridos unidos neutros con 40% de acetonitrilo en H_{2}O que contenía 0,1% de ácido trifluoroacético. Los oligosacáridos resultantes se sometieron a MALOlfTOF-MS. Los espectros de las fracciones de oligosacáridos desializados de la muestra A, EPO-GT-1-A y la muestra K mostraron masas idénticas para el complejo los oligosacáridos de tipo complejo a miz =1810 Da (diantenario), 2175 = triantenario, 2540 = tetraantenario, 2906 = tetraantenario más 1 repetición de N- acetillactosamina y 3271 = tetraantenario más 2 repeticiones de N-acetillactosamina; las señales pequeñas corresponden a la acrencia de fucosa (-146) y galactosa (menos 162) se detectaron que eran atribuibles a las condiciones de hidrólisis de ácido aplicadas para la eliminación del ácido siálico (véase MALDI -Figuras 15, 16 y 17).
En un experimento paralelo la mezcla de digestión por N-glicosidasa se absorbió sobre 1 ml de cartucho RP-C18 (sin hidrólisis de ácido anterior de los oligosacáridos) y la elución se realizó con 5% de acetonitrilo en agua que contenía 0,1% de TFA; en estas condiciones la proteína de EPO se retuvo completamente sobre el material de RP y los oligosacáridos se retiraron por lavado de la columna con 5% de acetonitrilo en H_{2}O que contenía 0,1% TFA. la Proteína de EPO des-N-glicosilada se eluyó con 70% de acetonitrilo en H_{2}O que contenía 0,1% de TFA. Las fracciones de oligosacárido de la etapa RP-C18 de la muestra A tratada con N-glicosidasa, EPO GT-1-A y la muestra K se neutralizaron y se sometieron a desalinización usando Cartuchos Hypercarb como se ha descrito antes. Los oligosacáridos aislados se sometieron a mapeo de HPAEC-PAD antes (véanse las figuras 13) y después de de tratamiento de ácido suave
en condiciones que permitían la eliminación cuantitativa de ácidos siálicos de los glicanos (véanse las Figuras 14).
El perfil de HPAEC-PAD del material nativo obtenido a partir de las muestras A modificadas por HES mostraron solamente señales no detectables para los oligosacáridos mientras que los oligosacáridos derivados de EPO GT-1-A mostraron el mismo perfil de glicano que el mostrado en la Fig. 9 (muestra denominada EPO-GT-1 después del tratamiento suave con peryodato). El perfil de elución de los oligosacáridos obtenidos a partir de la muestra de EPO de control (K) produjeron el patrón esperado (comparar el perfil en la figura 6). Para la comparación, el perfil de oligosacárido
nativo de los patrones de BRP-EPO internacionales se incluye como estándar de comparación y como referencia.
Después de la hidrólisis de ácido suave, todas las preparaciones de oligosacárido, mostraron un perfil de elución idénticos de las estructuras de oligosacáridos neutros (véanse las figuras 14) con la composición cualitativa y cuantitativa esperada de cadenas de carbohidrato de tipo complejo di-, tri- y tetraantenarias como se ha descrito en la sección de procedimientos para la preparación de EPO que se usó como un material de partida en el estudio presente. Este resultado demuestra que la modificación de HES -de la muestra de EPO da como resultado en un enlace covalente de los derivados de HES, que se desprende de la proteína de EPO mediante la N-glicosidasa y es lábil al ácido ya que se elimina de los N-glicanos usando las condiciones de tratamiento de ácido suave conocidas para desialilar los carbohidratos (véanse las figuras 12a+b).
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(cc) Análisis de la composición de monosacáridos de HES-EPO y N-glicanos de HES-EPO por GC-MS
Con el fin de además confirmar la modificación de HES -de EPO en los N-glicanos de la molécula, se digirieron las muestras de EPO con N-glicosidasa y la proteína de EPO se absorbió sobre cartuchos RP-C18 mientras que el material de oligosacárido se retiró por lavado como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Tabla 2, derivados de glucosa y glucosa hidroxietilada se detectaron solamente en la proteína de EPO que se sometió a modificación de HES en los restos de cisteína y en las fracciones de oligosacárido de la muestra A2 de EPO.
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Ejemplo 7.11(d)
Ensayo in-vivo de la actividad biológica de la EPO modificada por HES
El bioensayo de EPO en el sistema de ratón normocitémico indica que se realizó de acuerdo con los procedimientos descritos en la Farmacopea Europea; el laboratorio que llevó a cabo el ensayo de EPO estaba usando la preparación convencional de referencia de BRP EPO Internacional. Para la EPO modificada por HES. La preparación A2 un valor medio para la actividad específica de 294.600 unidades por mg de EPO de proteína se determinó que reivindicaban una actividad específica aproximadamente 3 veces mayor cuando se compara con la preparación convencional de referencia de BRP EPO Internacional que estaba incluida en las muestras enviadas para ensayos de actividad.
Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 3.
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TABLA 2
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TABLA 3
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Claims (22)

1. Un procedimiento de producción de un derivado de almidón hidroxietilado que comprende hacer reaccionar almidón hidroxietilado de fórmula (I)
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en su extremo reductor que no está oxidado antes de la reacción, con un compuesto de fórmula (II)
(II)R'-NH-R''
en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado, y en la que o bien R' o R'' o R' y R'' comprenden al menos un grupo funcional X capaz de hacerse reaccionar con al menos otro compuesto antes o después de la reacción de (I) y (II), y en la que el compuesto (II) se hace reaccionar mediante el grupo NH que une mediante puentes R' y R'' con el compuesto (I) en su extremo reductor que no está oxidado; y
- en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un polipéptido; o
- en la que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un compuesto de reticulación y el producto de reacción con el compuesto de reticulación se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un segundo compuesto adicional y el segundo compuesto adicional es un polipéptido;
con la condición de que si el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X y el al menos un compuesto adicional es un polipéptido, el compuesto de fórmula (II) no es BMPH (N-(ácido beta-maleimidopropiónico) hidrazida TFA); EMCA (N-(ácido epsilon-maleimidocaproico) hidrazida), KMUH (N-(ácido kappa-maleimidoundecanoico) hidrazida), M_{2}C_{2}H (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxil-hidrazida HCl), MPBH (4-(ácido 4-N-maleimidofenil)butírico hidrazida HCl), PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida).
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2. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que el grupo funcional Y es
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o un resto carbohidrato que puede estar ligado al polipéptido mediante N-glicosilación u O- glicosilación.
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3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 en el que el almidón hidroxietilado es almidón hidroxietilado.
4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo.
5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que R' es hidrógeno o un grupo lineal o ramificado alquilo o alcoxi, preferiblemente hidrógeno o un grupo metilo o un grupo metoxi.
6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que aparte del grupo funcional X, R'' comprende al menos un grupo funcional adicional W que está directamente unido al grupo NH que une por puentes R' y R'', seleccionándose dicho grupo funcional W entre el grupo constituido por
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y
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donde G es O o S y, si está presente dos veces, G es independientemente O o S.
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7. Un procedimiento según la reivindicación 6 en el que, si R' es H, R' y el grupo NH que une por puentes R' y R'' forman, conjuntamente con W, uno de los siguientes grupos
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8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el al menos un grupo funcional X se selecciona entre el grupo constituido por -SH, -NH_{2}, -O-NH_{2}, -NH-O-alquilo, -(C=G)-NH-NH_{2}, -G-(C=G)-NH-NH_{2}, -NH-(C=G)-NH-NH_{2}, y -SO_{2}-NH-NH_{2} donde G es O o S y, si G está dos veces, es independientemente O o S.
9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 en el que el compuesto de acuerdo con la fórmula (II) es O-[2-(2-aminooxietoxi)-etil]-hidroxil amina o carbohidrazida.
10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo el compuesto (II) una hidroxilamina o una hidrazida, se lleva a cabo a una temperatura de entre 5 y 45ºC y a un pH en el intervalo de entre 4,5 y 6,5 en un medio acuoso.
11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que la reacción del compuesto (I) y el compuesto (II), siendo dicha reacción una aminación reductora, se lleva a cabo a una temperatura de entre 25 y 90ºC and a un pH en el intervalo de entre 8 y 12 en un medio acuoso.
12. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11 en el que el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) se hace reaccionar con un compuesto adicional mediante el al menos un grupo funcional X, siendo el compuesto adicional un polipéptido, preferiblemente eritropoyetina, y en el que el al menos un compuesto adicional se hace reaccionar mediante un grupo tio o un resto carbohidrato oxidado comprendido en el al menos un compuesto adicional.
13. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 9 en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de entre 4 y 37ºC y/o en un medio acuoso.
14. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que el segundo compuesto adicional se hace reaccionar mediante un grupo tio o un resto carbohidrato oxidado comprendido en el al menos un compuesto adicional.
15. Un derivado de almidón hidroxietilado que se pueden obtener mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 con la condición de que el producto de reacción del compuesto de fórmula (II) y el compuesto adicional que tiene un grupo funcional Y y que es un polipéptido no sea insulina.
16. Un derivado de almidón hidroxietilado según la reivindicación 15 en el que dicho derivado tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (IIIa)
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17. Un derivado de almidón hidroxietilado según la reivindicación 15 en el que R' es hidrógeno y en el que el derivado es o bien un compuesto de fórmula (IIIa) o un compuesto de fórmula (IIIb) o una mezcla de compuestos de fórmulas (IIIa) y (IIIb)
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18. Una composición farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz, un derivado de almidón hidroxietilado según la reivindicación 15.
19. Una composición farmacéutica según la reivindicación 18 en la que el polipéptido, preferiblemente eritropoyetina, se hace reaccionar con el producto de reacción del compuesto (I) y el compuesto (II) mediante un resto carbohidrato oxidado comprendido en el polipéptido.
20. Una composición farmacéutica según la reivindicación 19 en la que almidón hidroxietilado se hace reaccionar en un medio acuoso con un compuesto de acuerdo con la siguiente fórmula
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y el producto de reacción se hace reaccionar con eritropoyetina.
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21. Una composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la que la eritropoyetina se oxida con peryodato de sodio antes de la reacción.
22. Una composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la que la eritropoyetina está parcialmente desializada y posteriormente oxidada con peryodato de sodio antes de la reacción.
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