CN1681846A - 生产羟烷基淀粉衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产羟烷基淀粉衍生物的一种方法，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构，该方法包括：通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端，或者，可通过通式(I)的羟烷基淀粉在其任选地氧化的还原性末端与一种化合物(D)反应获得的羟烷基淀粉衍生物，与一种化合物(L)反应，该化合物(D)含有：能够与任选氧化的羟烷基淀粉的还原性末端反应的至少一个官能团Z1，和至少一个官能团W，化合物(L)含有：至少一个能够与该羟烷基淀粉反应的官能团Z1，或者至少一个能够与该羟烷基淀粉衍生物中所含的官能团W反应的官能团Z2，和至少一个能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应的官能团X，其中该官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基。本发明还涉及这样的羟烷基淀粉衍生物，以及含有这种羟烷基淀粉衍生物的药物组合物。

Description

生产羟烷基淀粉衍生物的方法
本发明涉及羟烷基淀粉衍生物，特别是可以通过以下方法获得的羟烷基淀粉衍生物：羟烷基淀粉与一种交联化合物的伯氨基或仲氨基反应或者与两种交联化合物反应，生成的羟烷基淀粉衍生物含有至少一个官能团X，X能够与另外一种化合物的官能团Y反应，其中Y是醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基。根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及可以通过以下方法获得的羟烷基淀粉衍生物：羟烷基淀粉与交联化合物的伯氨基或仲氨基反应，生成的反应产物任选地与第二种交联化合物进一步反应，生成的羟烷基淀粉衍生物含有至少一个官能团X，X能够与另外一种化合物的官能团Y反应，其中Y是醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基，所得反应产物与含有至少一个这些官能团Y的多肽反应，优选地与如ATIII、IFN-β或促红细胞生成素等多肽反应，特别优选地与促红细胞生成素反应。特别优选的羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。根据本发明，羟烷基淀粉(优选羟乙基淀粉)在其还原性末端与接头化合物反应，该还原性末端在反应前任选地被氧化。
羟乙基淀粉(HES)是天然存在的支链淀粉的衍生物，可被体内的α-淀粉酶降解。HES是碳水化合物聚合物支链淀粉的一种取代衍生物，在玉米淀粉中以浓度高达95％重量存在。HES显示有利的生物学性质，可以用作血容量替代剂，在临床血液稀释治疗中使用(Sommermeyer等人，1987，Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278；Weidler等人，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498)。
支链淀粉由葡萄糖部分(moiety)组成，其中主链中存在α-1，4-糖苷键，在分支位点处可见α-1，6-糖苷键。该分子的物理化学性质主要取决于糖苷键的类型。由于α-1，4-糖苷键具有切口，产生每圈大约有6个葡萄糖单体的螺旋结构。该聚合物的物理化学以及生物化学性质能够通过取代而改变。通过碱性羟乙基化作用可以引入羟乙基。通过改变反应条件，能够利用非取代葡萄糖单体中各羟基相对于羟乙基化的不同反应性。由于这一事实，技术人员能够有限程度地影响取代模式。
本领域中描述了一些生产羟乙基淀粉衍生物的方法。
DE 26 16 086公开了血红蛋白与羟乙基淀粉的偶联，其中第一步中交联剂例如溴化氰(bromocyane)，与羟乙基淀粉结合，随后血红蛋白与中间产物连接。
HES应用的一个重要领域是用于稳定为获得特定生理效应而向例如循环系统施用的多肽。这类多肽的一个具体例子是促红细胞生成素，它是约为34,000kDa的酸性糖蛋白，为调节循环中红细胞水平所必需。
多肽和酶应用的一个众所周知的问题是这些蛋白质通常不能显示令人满意的稳定性。具体而言，促红细胞生成素的血浆半衰期相对较短(Spivak and Hogans，1989，Blood 73，90；McMahon等人，1990，Blood 76，1718)。这意味着治疗性血浆水平快速降低，必须重复静脉内施用。此外，在某些情况下，还观察到针对这些肽的免疫应答。
通常认为，当多肽与聚合物分子偶联时，多肽的稳定性能够提高，且针对这些多肽的免疫应答降低。WO 94/28024公开了被聚乙二醇(PEG)修饰的生理活性多肽显示免疫原性和抗原性降低，在血流中的循环远长于未偶联的蛋白质，即清除所需时间更长。然而，PEG-药物偶联物也有几个缺点，例如，它们不具有能够被体内降解途径组件识别的天然结构。因此，除了PEG-偶联物之外，还生产了其它偶联物和蛋白质聚合物。交联不同蛋白质和大分子(如聚合酶)的多种方法在文献中已有描述(参见，例如，Wong，Chemistry of protein conjugationand cross-linking，1993，CRCS，Inc.)。
总之，仍然需要进一步改进的稳定性和/或生物活性提高的多肽。对于促红细胞生成素尤其如此，含有高水平唾液酸因此具有高活性的同种型必须从唾液酸含量低的同种型中纯化(见EP 428 267 B1)。因此，如果可以采用能够产生高活性多肽而不需要复杂纯化的生产方法，将是非常有利的。遗憾的是，在细菌或昆虫细胞中生产多肽通常较困难，因为通常产生的多肽不具有正确折叠的天然构象并且缺乏适当的糖基化。
WO 02/08079 A2公开了含有活性剂与羟烷基淀粉之偶联物的化合物，其中活性剂和羟烷基淀粉直接连接或者通过接头化合物连接。对于所述的直接连接，活性剂与羟烷基淀粉的反应在至少含有10％重量水的水性介质中进行。对于与活性试剂中所含的羰基连接、或与醛基或酮基或与缩醛或半缩醛基连接的羟烷基淀粉衍生物，没有给出实例。
因此，本发明的一个目的是提供能够与另外一种化合物(例如多肽)形成化学键的羟烷基淀粉衍生物，所述另一种化合物含有巯基或醛基、酮基、半缩醛基或缩醛基作为官能团。优选地，所述醛基、酮基、半缩醛基或缩醛基位于该另外一种化合物的碳水化合物部分。
因此，本发明涉及生产一种羟烷基淀粉衍生物的方法，所述羟烷基淀粉具有根据通式(I)的结构：
该方法包括：
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端，或者
-可通过通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端与化合物(D)反应获得的羟烷基淀粉衍生物，化合物(D)含有：
-至少一个能够与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应的官能团Z1，和
-至少一个官能团W，
与化合物(L)反应，化合物(L)含有：
-至少一个能够与所述羟烷基淀粉反应的官能团Z1，或者至少一个能够与所述羟烷基淀粉衍生物中所含官能团W反应的官能团Z2，和
-至少一个能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应的官能团X，
其中所述官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基。
在本发明中，术语“羟烷基淀粉”(HAS)指被至少一个羟烷基取代的淀粉衍生物。因此，在本发明中使用的术语羟烷基淀粉不只限于末端碳水化合物部分含有羟烷基R1、R2和/或R3(在通式(I)中为了简短起见)的化合物，也指如下化合物：至少一个羟基(位于末端碳水化合物部分和/或淀粉分子其余部分HAS’的任何位置)被羟烷基R1、R2或R3取代。
其中，烷基可以是直链或支链的烷基，它可以被适当取代。优选地，羟烷基含有1-10个碳原子，更优选1-6个碳原子，更优选1-4个碳原子，更优选2-4个碳原子。因此，“羟烷基淀粉”优选地包括羟乙基淀粉、羟丙基淀粉和羟丁基淀粉，其中羟乙基淀粉和羟丙基淀粉是特别优选的。
本发明也包括含有两个或多个不同羟烷基的羟烷基淀粉。
HAS中所含的所述至少一个羟烷基可以含有两个或多个羟基。根据一个优选实施方案，HAS中所含的所述至少一个羟烷基含有一个羟基。
表述“羟烷基淀粉”也包括烷基是单取代或多取代烷基的衍生物。对此，只要HAS保持水溶性，优选烷基被卤素特别是氟、或者芳基取代。此外，羟烷基的末端羟基也可以酯化或者醚化。
此外，也可以使用直链或支链的取代或未取代的链烯基代替烷基。
羟烷基淀粉是淀粉的一种醚衍生物。除了所述醚衍生物以外，在本发明中也能够使用其它淀粉衍生物。例如，可以使用含有酯化羟基的衍生物。这些衍生物可以是，例如，具有2-12个碳原子的未取代单羧酸或二羧酸的衍生物，或者是其取代衍生物的衍生物。特别有用的是具有2-6个碳原子的未取代单羧酸的衍生物，特别是乙酸的衍生物。对此，乙酰基淀粉、丁基淀粉或丙基淀粉是优选的。
此外，具有2-6个碳原子的未取代二羧酸的衍生物也是优选的。
对于二羧酸的衍生物，二羧酸的第二个羧基也被酯化是有利的。此外，二羧酸的单烷基酯衍生物在本发明中也适用。
对于取代的单羧酸或二羧酸，取代基优选可以与以上述用于取代烷基残基的取代基相同。
淀粉的酯化技术在本领域公知(参见，例如Klemm D.等人，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol.2，1998，Whiley-VCH，Weinheim，New York，具体见chapter 4.4，Esterification ofCellulose(ISBN 3-527-29489-9)。
对于本发明的所有实施方案，羟乙基淀粉(HES)是最优选的。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
HES的特征主要在于分子量分布和取代程度。有两种方式可以描述取代程度：
1.以取代葡萄糖单体相对于所有葡萄糖部分的比例描述取代程度(DS)。
2.以描述每葡萄糖部分之羟乙基数的“摩尔取代”(MS)来描述取代程度。
HES溶液作为多分散组合物存在，每个分子在聚合程度、分支位点数量和型式以及取代型式方面彼此不同。因此HES是不同分子量化合物的混合物。因此，利用统计学方法，根据平均分子量确定具体的HES溶液。在本文中，Mn被计算为取决于分子数的算术平均值。此外，重量平均值Mw代表取决于HES质量的单位。
在本发明中，羟乙基淀粉的平均分子量(重量平均值)可以是1-300kDa，其中5-100kDa的平均分子量是更优选的。对于羟乙基，羟乙基淀粉可以进一步显示0.1-0.8的摩尔取代程度，和2-20的C2∶C6取代比。
对于通式(I)中的残基R1、R2和R3没有具体限制，只要化合物(I)仍然能够与化合物(D)或化合物(L)反应。根据一个优选实施方案，R1、R2和R3独立地是氢或者是含有1-10个碳原子的羟烷基、羟芳基、羟芳烷基或羟烷芳基。氢和含有1-6个碳原子的羟烷基是优选的。烷基、芳基、芳烷基和/或烷芳基可以是直链或直链的，并且被适当取代。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R1、R2和R3独立地是氢或者是含有1-6个碳原子的直链或支链羟烷基。
R1、R2和R3可以是羟己基、羟戊基、羟丁基、羟丙基(如1-羟丙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-羟异丙基、2-羟异丙基)、羟乙基(如1-羟乙基、2-羟乙基)或羟甲基。氢和羟乙基是优选的，氢和2-羟乙基是特别优选的。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基。
根据本发明，化合物(D)或化合物(L)通过所含官能团Z1与羟烷基淀粉的还原性末端反应。
根据本发明的第一个优选实施方案，化合物(D)或化合物(L)与羟烷基淀粉的还原性末端反应，其中该还原性末端在反应之前被氧化。
该还原性末端的氧化产生如下羟烷基淀粉：其中末端碳水化合物基团含有内酯基，或者根据化学反应条件和/或氧化剂不同，末端碳水化合物基团具有含羧基的非环状结构。
根据本发明的一个实施方案，还原性末端被氧化的羟烷基淀粉作为含有内酯基的化合物和含有羧基的化合物的混合物存在。在该混合物中，各种化合物可能以可以想到的任意比例存在。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前被氧化，所述羟烷基淀粉具有通式(IIa)
和/或通式(IIb)的结构。
Figure A0382146500232
羟烷基淀粉还原性末端的氧化可以按照产生具有上述结构(IIa)和/或(IIb)的化合物的各种方法或方法组合进行。
尽管可以按照使羟烷基淀粉之还原性末端氧化的所有合适方法进行氧化，但是优选使用如196 28705 A1所述的碱性碘溶液进行。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中还原性末端用碱性碘溶液氧化。
根据本发明的第二个优选实施方案，化合物(D)或化合物(L)与羟烷基淀粉的还原性末端反应，并且该还原性末端在反应之前不被氧化。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前不被氧化，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构。
Figure A0382146500233
化合物(L)与羟烷基淀粉或者化合物(D)与羟烷基淀粉之间化学键的形成通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选氧化的还原性末端反应而实现。
可以使用能够与羟烷基淀粉任选氧化的还原性末端形成化学键的各种官能团作为官能团Z1。
根据本发明的一个优选实施方案，官能团Z1包含化学结构-NH-。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中官能团Z1包含结构-NH-。
根据本发明的一个优选实施方案，官能团Z1是具有结构R′-NH-的一种基团，其中R′是氢，或者是烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以与NH基直接连接，或者根据另外一个实施方案，可以通过氧桥与NH基连接。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以被适当取代。卤素，如F、Cl或Br，是优选的取代基。特别优选残基R′是氢、烷基和烷氧基，更优选氢和非取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，含有1、2、3、4、5或6个C原子的基团是优选的。更优选甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，尤其优选甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R′是氢或甲基或甲氧基。
根据本发明另外一个优选实施方案，官能团Z1具有结构R′-NH-R″-，其中R″优选含有结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自：
和
其中，如果G存在两个，则独立地是O或S。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中官能团Z1选自：H2N-
Figure A0382146500251
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
本发明的一个目的是提供含有官能团X的羟烷基淀粉衍生物，X能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应，所得反应产物是一种羟烷基淀粉衍生物，其含有该羟烷基淀粉、化合物(L)、任选地化合物(D)和另外一种化合物。
关于官能团X没有具体限制，只要能够与化合物(M)所含的官能团Y形成化学键。
如果官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，则官能团X优选地含有化学结构-NH-。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，官能团X含有结构-NH-。
根据本发明的一个优选实施方案，官能团X是具有结构R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以与NH基直接连接，或者根据另外一个实施方案，可以通过一个氧桥与NH基连接。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以被适当取代。卤素，如F、Cl或Br，是优选的取代基。特别优选残基R′是氢、烷基和烷氧基，更优选氢和未取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，含有1、2、3、4、5或6个C原子的基团是优选的。更优选甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，尤其优选甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中R′是氢或甲基或甲氧基。
根据本发明的另外一个优选实施方案，官能团X具有结构R′-NH-R″-，其中R″优选地含有结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，
其中G是O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自：
Figure A0382146500261
和
其中，如果G存在两个，则独立地是O或S。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中官能团X选自：H2N-
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
如果官能团Y是巯基，则官能团X优选地选自：
Figure A0382146500265
其中Hal是Cl、Br或I，优选Br或I。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中官能团Y是-SH，官能团X选自：
其中Hal是Cl、Br或I。
根据本发明的一个实施方案，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，获得的反应产物进一步与化合物(L)反应，其中化合物(L)与反应产物之间的化学键通过化合物(L)所含的官能团Z2与作为反应产物一部分的化合物(D)中所含官能团W反应形成。
对于官能团Z2和W通常没有限制，只要能够形成希望的化学键。
可能的官能团W或Z2包括下列官能团：
-C-C-双键或C-C-三键或芳族C-C-键；
-巯基或羟基；
-烷基磺酸酰肼，芳基磺酸酰肼；
-1，2-二醇；
-1，2-氨基醇；
-氨基-NH2或含有结构单元-NH-的氨基衍生物，如氨基烷基、氨基芳基、氨基芳烷基或烷芳基氨基；
-羟氨基-O-NH2，或者含有结构单元-O-NH-的羟氨基衍生物，如羟烷基氨基、羟芳基氨基、羟芳烷基氨基或羟烷芳基氨基；
-烷氧基氨基、芳氧基氨基、芳烷氧基氨基或烷芳氧基氨基，它们均含有结构单元-NH-O-；
-含有羰基的残基，-Q-C(＝G)-M，其中G是O或S，M是，例如：
--OH或-SH；
-烷氧基，芳氧基、芳烷氧基或烷芳氧基；
-烷硫基，芳硫基，芳烷硫基或烷芳硫基；
-烷基羰基氧基，芳基羰基氧基，芳烷基羰基氧基，烷芳基羰基氧基；
-活化酯，如含有酰亚胺结构的羟胺的酯，如N-羟基琥珀酰亚胺，或者含有结构单元O-N，其中N是杂芳基化合物的一部分，或者G＝O而没有Q时，如含有取代的芳基残基的芳氧基化合物，如五氟苯基、对硝基苯基或三氯苯基；
其中不含Q或者Q是NH或杂原子，如S或O；
-   -NH-NH2或-NH-NH-；
-   -NO2；
-    腈基；
-    羰基，如醛基或酮基；
-    羧基；
-   -N＝C＝O基或-N＝C＝S基；
-    乙烯基卤基团，如乙烯基碘或乙烯基溴基团或三氟甲磺酸酯(triflate)；
-   -C≡C-H；
-    -(C＝NH2Cl)-O烷基
-   -(C＝O)-CH2-Hal，其中Hal是Cl、Br或I；
-   -CH＝CH-SO2-；
-    含有结构-S-S-的二硫醚基团；
-    基团
Figure A0382146500281
-    基团
Figure A0382146500282
其中Z2和W分别是能够与上述基团之一形成化学键的基团。根据本发明的优选实施方案，W和Z2都是选自上述基团的基团。根据本发明的第一个特别优选的实施方案，Z2或W是巯基。在这种情况下，官能团W优选地选自：
Figure A0382146500291
其中Hal是Cl、Br或I，优选Br或I。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A0382146500292
其中Hal是Cl、Br或I。
根据本发明的第二个特别优选的实施方案，Z2或W选自如上所述的活化酯，或能够任选地转化为活化酯的羧基。在这种情况下，官能团W或Z2分别含有化学结构-NH-。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中Z2或W选自如上所述的活化酯，或能够任选地转化为活化酯的羧基，官能团W或Z2分别含有化学结构-NH-。
根据本发明的一个优选实施方案，含有结构-NH-的官能团W或Z2是含有结构R′-NH-的基团，其中R′是氢或烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基，其中环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以与NH基直接连接，或者根据另外一个实施方案，可以通过氧桥与NH基连接。烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷芳基残基可以被适当取代。卤素，如F、Cl或Br，是优选的取代基。特别优选残基R′是氢、烷基和烷氧基，更优选氢和非取代的烷基和烷氧基。
在烷基和烷氧基中，含有1、2、3、4、5或6个C原子的基团是优选的。最优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。特别优选的是甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，尤其优选甲基或甲氧基。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中W或Z2选自如上所述的活化酯，或能够任选地转化为活化酯的羧基，官能团W或Z2分别是R′-NH-，其中R’是氢或甲基或甲氧基。
根据本发明的另外一个优选实施方案，官能团W或Z2含有结构R’-NH-R″-，其中R″优选地含有结构单元-NH-和/或结构单元-(C＝G)-，其中G是O或S，和/或结构单元-SO2-。根据更优选的实施方案，官能团R″选自：
Figure A0382146500301
和
其中，如果G存在两个，则独立地是O或S。因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中官能团W或Z2选自：
H2N-
Figure A0382146500303
Figure A0382146500304
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
根据本发明的另外一方面，至少一个官能团X、Z2和/或W可以是这样一个基团：它不能与给定的另外一种化合物反应，但是可以被化学修饰以便能够以希望的方式反应。
在与另外一种化合物反应之前修饰的官能团的一个例子是1，2-氨基醇或1，2-二醇，它例如通过氧化修饰形成醛或酮基。
在与另外一种化合物反应之前修饰的官能团的另外一个例子是
-NH2基，它通过与例如下式的化合物反应而被修饰
Figure A0382146500311
产生下式的结构
Figure A0382146500312
它对例如巯基具有反应性。
在与另外一种化合物反应之前修饰的官能团的另外一个例子是-NH2基，它通过与例如下式的化合物反应而被修饰
产生下式的结构
Figure A0382146500314
它对例如巯基具有反应性。
在与另外一种化合物反应之前修饰的官能团的另外一个例子是，氨基与溴乙酸酐或碘乙酸N-琥珀酰亚氨基酯反应。
根据本发明的一个优选实施方案，化合物(L)具有结构Z1-L′-X或Z2-L′-X，L′是分隔官能团的有机残基，可以任选地不存在，该结构取决于化合物(D)是否与羟烷基淀粉反应。
根据第一个优选实施方案，不涉及化合物(D)，Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基。
在这种情况下，下列化合物优选作为含有结构Z1-L′-X的化合物(L)，其中L′不存在：
H2N-NH2或
Figure A0382146500321
或
在这种具体情况中，如果含有L′，L′可以是直链或支链的烷基或环烷基或芳基或芳烷基或芳基环烷基或烷芳基或环烷基芳基，其中L′可以含有至少一个杂原子，如N、O、S，其中L′可以被适当取代。基团L′的大小可以按照具体需要调整。分隔基团L’通常含有1-60个、优选1-40个、更优选1-20个、更优选1-10个、更优选地1-6个、特别优选地1-4个碳原子。如果含有杂原子，分隔基团通常含有1-20个、优选1-8个、特别优选1-4个杂原子。根据本发明特别优选的实施方案，分隔基团含有1-4个氧原子。分隔基团L′可含有例如含5-7个碳原子的任选分支的烷基链或芳基或者环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是线性和/或环状烷基。根据一个更优选的实施方案，分隔基团是烷基链，它含有1-20个、优选1-8个、更优选1-6个、更优选1-4个、特别优选2-4个碳原子。如果含有杂原子，则含有1-4个氧原子的链是特别优选的。
对于Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基的这种具体情况，下列化合物优选作为具有结构Z1-L’-X的化合物(L)，其中L′未缺失：
Figure A0382146500323
Figure A0382146500331
根据第二个优选实施方案，涉及化合物(D)。
根据本发明的另外一个优选实施方案，化合物(D)含有结构Z1-D′-W，D′是分隔官能团的有机残基，任选地不存在。
在这种具体情况中，下列化合物优选作为含有结构Z1-D′-W的化合物(D)，其中D′不存在：
H2N-NH2或
Figure A0382146500332
或
D′缺失的化合物D的一个具体实例是NH3。
在这种具体情况下，如果含有D′，则D′可以是直链或支链的烷基或环烷基或芳基或芳烷基或芳基环烷基或烷芳基或环烷基芳基，其中D′可以含有至少一个杂原子如N、O、S，其中D′可以被适当取代。D′基的大小可以按照具体的需要调整。分隔基团D’通常含有1-60个、优选1-40个、更优选1-20个、更优选1-10个、更优选1-6个、特别优选1-4个碳原子。如果含有杂原子，分隔基团通常含有1-20个、优选1-8个、特别优选1-4个杂原子。根据本发明特别优选的实施方案，分隔基团D’含有1-4个氧原子。分隔基团D′可含有例如含5-7个碳原子的任选地分支的烷基链或芳基或者环烷基，或者是芳烷基、烷芳基，其中烷基部分可以是线性和/或环状烷基。根据一个更优选的实施方案，分隔基团是烷基链，它含有1-20个、优选1-8个、更优选1-6个、更优选1-4个、特别优选2-4个碳原子。如果含杂原子，则含有1-4个氧原子的链是特别优选的。
对于这种具体情况，具有结构Z1-D′-W、其中D′不缺失的优选化合物(D)是：
根据化合物(D)中所含官能团W和官能团Y的化学性质，可以根据具体需要使用具体的化合物(L)。
例如，如果如上所详述，官能团Y是巯基，且官能团W含有结构-NH-，则下列类型的化合物(L)是优选的：
化合物(L)的类型 官能团X 官能团Z2
C 碘烷基 N-琥珀酰亚胺酯
D 溴烷基 N-琥珀酰亚胺酯
E 马来酰亚氨基 N-琥珀酰亚胺酯
F 吡啶基二硫基 N-琥珀酰亚胺酯
G 乙烯基砜 N-琥珀酰亚胺酯
例如，如果官能团选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，且官能团W是巯基，则下列类型的化合物(L)是优选的：
化合物(L)的类型 官能团X 官能团Z2
A 酰肼 马来酰亚氨基
B 酰肼 吡啶基二硫基
在本说明书结尾处的表1中列出了上述类型化合物(L)的一些优选实例。
分隔基团L’和/或D’可以被适当取代。优选的取代基例如是卤素如F、Cl、Br或I。
分隔基团L′和/或D′可以含有一个或多个切割位点，如
-S-S-
Figure A0382146500361
该位点允许在预定位点容易地切割所得化合物。
如果所得羟烷基淀粉衍生物含有能够与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应的官能团X，并且官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基，那么可以与羟烷基淀粉连接的化合物(L)的特别优选实例包括：
和
化合物(L)
Figure A0382146500374
和
是特别优选的。
如果所得羟烷基淀粉衍生物含有能够与化合物(L)中所含的官能团Z2反应的官能团W，并且所得含有羟烷基淀粉、化合物(D)和化合物(L)的羟烷基淀粉衍生物能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应，并且官能团Y是巯基，那么可以与羟烷基淀粉连接的化合物(D)的特别优选实例包括：
Figure A0382146500376
Figure A0382146500377
和
Figure A0382146500378
化合物(D)
和
Figure A03821465003710
是特别优选的。
与上述优选的化合物(D)一起，下列化合物(L)
和
Figure A03821465003712
是优选的，化合物(L)
Figure A0382146500381
是特别优选的。
根据本发明的第一优选实施方案，化合物(D)或化合物(L)与羟烷基淀粉未氧化的还原性末端反应。
根据反应条件，如使用的溶剂或溶剂混合物，反应混合物的温度、压力或pH，化合物(D)或化合物(L)的反应产物与羟烷基淀粉未氧化的还原性末端反应，反应产物可能具有不同的结构。
根据本发明的一个优选实施方案，该反应在一种水性体系中进行。
本发明上下文中所用的术语“水性体系”指含水的溶剂或溶剂混合物，根据使用溶剂的重量，其中含有至少10％重量的水，优选至少50％重量，更优选至少80％重量，甚至更优选至少90％重量，或者可达100％重量的水。所谓其它溶剂包括如DMSO、DMF、乙醇或甲醇等溶剂。
如果反应在水性体系中进行，且官能团Z1是如上所述的基团R′-NH-，羟烷基淀粉衍生物可以具有通式(IIIa)的结构
如果反应在水性体系中进行，且官能团Z1是如上所述的基团R′-NH-，R′＝H，羟烷基淀粉衍生物可以具有通式(IIIa)或通式(IIIb)的结构，或者是通式(IIIa)和(IIIb)化合物的混合物
Figure A0382146500391
根据反应条件和/或反应使用的化合物(L)或化合物(D)的化学性质，通式(IIIa)的化合物可能在平伏位置或直立位置含有N原子，也可能存在具有一定平衡分布的这两种型式的混合物。
根据反应条件和/或反应使用的化合物(L)或(D)的化学性质，通式(IIIb)的化合物可能含有E或Z构象的C-N双键，也可能存在具有一定平衡分布的两种型式的混合物。
因此，本发明也涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，它具有通式(IIIa)或者通式(IIIb)或者通式(IIIa)和(IIIb)的结构。
在有些情况下，可能希望稳定通式(IIIa)的化合物。特别是在水溶液中生产并且/或者使用通式(IIIa)的化合物时。作为稳定方法，特别优选酰化通式(IIIa)的化合物，特别当R′是氢时。可以使用产生希望的通式(IVa)羟烷基淀粉衍生物的所有适当试剂作为酰化剂。
根据本发明的特别优选的实施方案，作为酰化剂一部分的残基Ra是甲基。优选使用羧酸酐、羧酸酰卤和羧酸活化酯作为酰化剂。
酰化在0-30℃下进行，优选地在2-20℃下进行，特别优选地在4-10℃下进行。
因此，本发明也涉及可以通过上述方法获得的具有通式(IVa)结构的羟烷基淀粉衍生物。
在其它一些情况下，可能希望稳定通式(IIIb)的化合物。特别是当在水溶液中生产并且/或使用通式(IIIb)的化合物时。作为稳定方法，特别优选还原通式(IIIb)的化合物，特别当R′是氢时。可以使用产生希望的通式(IVb)的羟烷基淀粉衍生物的所有适当试剂作为还原剂。
根据本发明特别优选的实施方案，使用硼氢化物如NaCNBH3或NaBH4，作为还原剂。
还原在4-100℃下进行，优选地在10-90℃下进行，特别优选地在25-80℃下进行。
因此，本发明也涉及可以通过上述方法获得的具有通式(IVb)结构的羟烷基淀粉衍生物。
本发明还涉及具有通式(IIIa)和(IIIb)、(IVa)和(IVb)、(IIIa)和(IVa)、(IIIa)和(IVb)、(IIIb)和(IVa)、(IIIb)和(IVb)、(IIIa)和(IIIb)和(IVa)、(IIIa)和(IIIb)和(IVb)、(IVa)和(IVb)和(IIIa)以及(IVa)和(IVb)和(IIIb)结构的化合物的混合物，其中(IIIa)和/或(IVa)可以独立地以在平伏或直立位置含有N原子的构象存在，和/或(IIIb)可能以具有E或Z构象的C-N双键的形式存在。
根据本发明的第二个优选实施方案，化合物(D)或化合物(L)与羟烷基淀粉氧化的还原性末端反应。
在这种情况中，优选地使用极性非质子溶剂，该溶剂也可以含有一定量的水，如可达10％重量。优选的非质子溶剂是DMSO或DMF。优选的反应温度范围的实例是从室温20℃-65℃，反应时间通常是1分钟到数小时，可达数天，这取决于与羟烷基淀粉氧化的还原性末端反应的官能团之化学性质和其它反应条件。
在这种情况下，如果如上所述官能团Z1是基团R′-NH-，则羟烷基淀粉衍生物可能具有通式(Va)的结构。
Figure A0382146500411
因此，本发明也涉及可以通过上述方法获得的具有通式(Va)结构的羟烷基淀粉衍生物。
对于羟烷基淀粉与化合物(D)和/或化合物(L)以及化合物(M)的反应，本发明包括所有可能的顺序。
本发明的一个优选实施方案涉及如上所述的一种方法，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，所得反应产物与化合物(M)反应。
本发明的另外一个实施方案涉及如上所述的一种方法，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，而在与羟烷基淀粉反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
本发明的另外一个实施方案涉及如上所述的一种方法，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(L)中所含的官能团Z2与化合物(D)中所含的官能团W反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，产生第二种羟烷基淀粉衍生物。
本发明的另外一个实施方案涉及后一种方法，其中通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，第二种羟烷基淀粉衍生物与化合物(M)反应。
本发明的另外一个实施方案涉及如上所述的一种方法，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(D)中所含的官能团W与化合物(L)中所含的官能团Z2反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，其中在与第一种羟烷基淀粉衍生物反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
对于上述每个反应步骤的反应条件，所有参数，如温度、压力、pH或溶剂或溶剂混合物都可以根据具体需要和将要反应的化合物的化学性质而改变。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，单独的水或者水与至少另外一种溶剂组合用作溶剂。所谓的至少另外一种溶剂可以是DMSO、DMF、甲醇和乙醇。除水之外其它优选溶剂有DMSO、DMF、甲醇和乙醇。在该实施方案中，羟烷基淀粉优选地通过未氧化的还原性末端反应。
如果羟烷基淀粉在水性介质中与化合物(D)或化合物(L)反应，并且化合物(D)或化合物(L)是羟胺或酰肼，则反应温度优选为5-45℃，更优选10-30℃，特别优选15-25℃。
如果羟烷基淀粉在水性介质中与化合物(D)或化合物(L)反应，并且该反应是还原胺化反应，则反应温度优选地可达100℃，更优选70-90℃，特别优选70-85℃。
在反应过程中，温度可以变化，优选在上述范围内变化，或者基本保持恒定。
羟烷基淀粉与化合物(D)或化合物(L)的反应时间可以根据具体需要改变，通常是1小时到7天。
如果化合物(D)或化合物(L)是羟胺或酰肼，则反应时间优选为1小时-3天，更优选2小时-48小时。
如果羟烷基淀粉与化合物(D)或化合物(L)的反应是还原胺化，则反应时间优选是2小时-7天。
羟烷基淀粉与化合物(D)或化合物(L)反应的pH值可以根据具体需要(如还原剂的化学性质)而改变。
如果化合物(D)或化合物(L)是羟胺或酰肼，则pH值优选为4.5-6.5。
如果羟烷基淀粉与化合物(D)或化合物(L)的反应是还原胺化，则pH值优选为8-12。
对于每一个反应步骤，可以通过添加至少一种适当的缓冲液调节反应混合物的适当pH值。优选的缓冲液包括乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液。
必要时，在羟烷基淀粉与化合物(L)反应之前，或者在化合物(D)与化合物(L)反应之前，或者在化合物(L)与羟烷基淀粉和化合物(D)的反应产物反应之前，至少一个官能团X可以用至少一个适当的保护基保护。在这个方面，可以使用所有可能的保护基，防止受保护的化合物(L)通过至少一个官能团X反应。因此，可以根据要保护的官能团X的化学性质，例如根据进行反应的溶剂或者反应混合物的pH，选择保护基。优选的保护基包括苄氧羰基、叔丁氧羰基、甲氧基苯基、2，4-二甲氧基苯基、三芳基甲基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、单甲基三苯甲基、二甲基三苯甲基、三氟乙酰基、邻苯二酰亚胺(phthalimin)化合物、2-(三烷基甲硅烷基)乙氧基羰基化合物、Fmoc、叔丁基或三烷基甲硅烷基。
如果化合物(L)中存在两个或多个不同的官能团X，则至少一个基团可以受到保护，而至少另外一个基团可以不被保护。
在化合物(L)反应后，至少一个保护基可以在反应产物中存在，或者可以通过适当的方法除去，如通过本领域技术人员公知的常规方法除去。如果两个不同的官能团X用适当的保护基保护，则可以除去至少一个保护基，以使至少一个官能团X可以与至少另外一种化合物(M)进一步反应，并且使至少另外一个官能团受到保护，直到含有化合物(L)的反应产物与另外一种化合物(M)反应。然后可以除去仍然受到保护的官能团的保护基，使其余的官能团X可以与另外一种化合物(M)反应。
为了防止反应产生如下的羟烷基淀粉衍生物，使用至少一个保护基可能至关重要：该羟烷基淀粉衍生物含有已经与两个或多个羟烷基淀粉分子反应的化合物(L)或化合物(D)，即多HAS取代的化合物(L)或(D)。羟烷基淀粉与过量的化合物(L)或(D)反应可以获得相同的结果。如果在本发明方法中使用过量的化合物(L)或(D)，化合物(L)或(D)与羟烷基淀粉的摩尔比优选为2-100。
一旦如上所述各个反应步骤形成反应产物，即可利用至少一种适当的方法从反应混合物中将其分离。必要时，在分离之前可以利用至少一种适当的方法沉淀反应产物。
如果首先沉淀反应产物，例如，可以在适当温度下使反应混合物接触至少一种与反应混合物中所含溶剂或溶剂混合物不同的溶剂或溶剂混合物。根据使用水性体系作为溶剂的本发明一个特别优选的实施方案，在一定温度下，优选在-20-+50℃，特别优选在0-25℃下，反应混合物接触乙醇与丙酮的混合物(优选是1∶1混合物，表示这些化合物等体积)。
反应产物的分离可以用适当的方法进行，该方法可以包括一个或多个步骤。根据本发明的一个优选实施方案，首先利用一种适当的方法，如离心或过滤，将反应产物与反应混合物或反应混合物与例如乙醇-丙酮混合物的混合物分离。第二步，可以进一步处理分离的反应产物，如后处理的透析、离心过滤或正压式过滤、离子交换层析、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。根据一个更优选的实施方案，分离的反应产物首先优选用水透析，然后冻干，直到根据产物希望的特性反应产物的溶剂含量足够低。冻干可以在20-35℃下进行，优选在25-30℃下进行。
根据本发明的优选实施方案，含有羟烷基淀粉和化合物(L)或者含有羟烷基淀粉、化合物(D)和化合物(L)的羟烷基淀粉衍生物进一步与含有至少一个官能团Y的另外一种化合物(M)反应。
对化合物(M)通常没有限制。优选地，在本发明中使用多肽作为化合物(M)。然而，也可以使用其它化合物(M)，可以是聚合物或寡聚物或单分子化合物或其中两种或多种的混合物。
本发明中使用的术语“多肽”指含有至少两个通过肽键(即具有结构-(C＝O)-NH-的键)连接之氨基酸的化合物。多肽可以是天然存在的化合物，或者是非天然存在的多肽，后者含有天然存在的氨基酸和/或至少一种非天然存在的氨基酸。多肽的骨架即多肽链，可以进一步用至少一个适当的取代基取代，从而含有至少一个侧链。所谓的至少一个官能团Y可以是多肽骨架的一部分，或者是至少一个骨架取代基的一部分，其中以下实施方案是可能的：其含有至少一个作为多肽骨架一部分的官能团，和至少一个作为多肽骨架至少一个取代基之一部分的官能团。
对于所述多肽没有限制，只要该多肽含有至少一个官能团Y。该官能团Y可以与多肽骨架直接连接，或者是该骨架侧链的一部分。侧链或官能团Y或者这两者可以是天然存多肽的一部分，或者可以在与官能团X反应之前被引入天然多肽内，或至少部分非天然多肽内。
而且，该多肽可以是，至少部分是，任何人或动物来源的。在一个优选实施例中，该多肽是人源的。
该多肽可以是细胞因子特别是促红细胞生成素，抗凝血酶(AT)如AT III，白介素特别是白介素-2、IFN-β、IFN-α、G-CSF、CSF、白介素-6和治疗性抗体。
根据一个优选实施方案，该多肽是抗凝血酶(AT)，优选AT III(Levy JH，Weisinger A，Ziomek CA，Echelard Y，RecombinantAntithrombin：Production and Role in Cardiovascular Disorder.Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27，4(2001)405-416；Edmunds T，Van Patten SM，Pollock J，Hanson E，Bernasconi R，Higgins E，Manavalan P，Ziomek C，Meade H，McPherson J，ColeES，Transgenically Produced Human Antithrombin：Structural andFunctional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin，Blood 91，12(1998)4661-4671；Minnema MC，Chang ACK，JansenPM，Lubbers YTP，Pratt BM，Whittaker BG，Taylor FB，Hack CE，Friedman B，Recombinant human antithrombin III improves survivaland attenuates inflammatory responses in baboons lethallychallenged with Escherichia coli，Blood 95，4(2000)1117-1123；Van Patten SM，Hanson EH，Bernasconi R，Zhang K，Manavaln P，Cole ES，McPherson JM，Edmunds T，Oxidation of MethionineResidues in Antithrombin，J.Biol.Chemistry 274，15(1999)10268-10276)。
根据另外一个优选实施方案，该多肽是人IFN-β，特别是IFN-β1a(参见Avonex，REBIF)和IFN-β1b(参见BETASERON)。
另外一种优选的多肽是人G-CSF(粒细胞集落刺激因子)。参见，例如，Nagata等人，The chromosomal gene structure and two mRNAsfor human granulocyte colony-stimulating factor，EMBO J.5：575-581，1986；Souza等人，Recombinant human granulocytecolony-stimulating factor：effects on normal and leukemicmyeloid cells，Science 232(1986)61-65；Herman等人，Characterization，formulation，and stability of Neupogeng(Filgrastim)，a recombinant human granulocyte-colonystimulating factor，in：Formulalion，characterization，andstability of proteindrugs，Rodney Pearlman and Y.John Wang，eds.，Plenum Press，New York，1996，303-328。
如果使用至少两种不同多肽的混合物，则这两种多肽在例如分子量、氨基酸数量和/或序列、取代基的数量和/或化学性质或通过适当化学键(如二硫键)连接之多肽链的数量方面可能不同。
根据本发明的一个优选实施方案，优选地至少按照上述方法之一，分离羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物，或者羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物(其进一步与化合物(L)反应)，然后与含有至少一个官能团Y的一种多肽反应。根据本发明的一个优选实施方案，多肽的碳水化合物部分含有官能团Y。
在本发明上下文中，术语“碳水化合物部分”指羟基醛或羟基酮，以及它们的化学修饰(见Rmpp Chemielexikon，Thieme VerlagStuttgart，Germany，9th edition 1990，Volume 9，pages 2281-2285，和此处引用的文献)。此外也指天然存在的碳水化合物部分(如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等)的衍生物。该术语也包括化学氧化的天然存在的碳水化合物部分。氧化的碳水化合物部分的结构可以是环状或线性的。
碳水化合物部分可以与多肽骨架直接连接。优选地，碳水化合物部分是碳水化合物侧链的一部分。更优选地，碳水化合物部分是碳水化合物侧链的末端部分。
在一个更优选的实施方案中，碳水化合物部分是碳水化合物侧链的半乳糖残基，优选是碳水化合物侧链的末端半乳糖残基。如下文所述，通过除去末端唾液酸随后氧化，该半乳糖残基可以用来与官能团X(位于羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物或羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物中，后者进一步与化合物(L)反应)反应。
在另外一个优选实施方案中，羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物，或者进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物，与碳水化合物侧链的唾液酸残基连接，优选地与碳水化合物侧链的末端唾液酸残基连接。
末端碳水化合物部分的氧化可以以化学或酶学方法进行。
化学氧化多肽之碳水化合物部分的方法在本领域公知，包括高碘酸盐处理(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
通过化学氧化，原则上能够氧化位于末端或者不位于末端的任何碳水化合物部分。然而，通过选择温和条件(1mM高碘酸盐，0℃，不同于严格条件：10mM高碘酸盐，室温1小时)，优选地可以氧化碳水化合物侧链的末端唾液酸。
此外，碳水化合物部分也可以用酶氧化。氧化各种碳水化合物部分的酶在本领域公知，例如，对于半乳糖的酶是半乳糖氧化酶。如果准备氧化末端半乳糖部分，如果在能够连接唾液酸与碳水化合物链的细胞例如哺乳动物细胞中，或者在遗传修饰后能够连接唾液酸与碳水化合物链的细胞中生产多肽，最终必须(部分或完全)除去末端唾液酸。去除唾液酸的化学或酶法在本领域中公知(Chaplin and Kennedy(eds.)，1996，Carbohydrate Analysis：a prac-tical approach，具体见Chapter 5 Montreuill，Glycoproteins，pages 175-177；IRLPress Practical approach series(ISBN 0-947946-44-3))。
根据本发明的另外一个优选实施方案，多肽的官能团是巯基。因此，羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物，或者进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物，可以通过一个硫醚基团与该多肽连接，该硫醚基团中的S原子可能来源于该多肽所含的任何巯基。
在本发明中，特别优选地使多肽与进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物反应。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物通过多肽中所含的巯基与该多肽反应。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物通过多肽中所含氧化的碳水化合物部分和巯基与该多肽反应。
多肽中可能存在巯基本身。而且，可以用适当的方法向多肽中引入巯基。其中包括化学方法。如果多肽中含有二硫桥，则可以还原-S-S-结构产生巯基。多肽经氨基与含有至少两个不同官能团的化合物反应(其中一个能够与氨基反应，另外一个是SH基或SH基的前体)，也能够将多肽中存在的氨基转化为SH基。氨基的这种修饰可以以如下实例进行：蛋白质首先与含有至少两个不同官能团的化合物(L)反应(其中一个官能团能够与氨基反应，另外一个是SH基)，产生的反应产物然后与例如含有HAS和化合物(D)的HAS衍生物反应(该衍生物含有一个能够与SH基反应的官能团)。也可以通过多肽的突变引入SH基，例如通过向多肽内引入半胱氨酸或适当的SH功能性氨基酸，或者例如从多肽上除去一个半胱氨酸，从而使多肽中的另外一个半胱氨酸不能形成二硫键。
使用促红细胞生成素(EPO)作为一种特别优选的多肽。
因此，本发明也涉及如上所述的一种方法，其中该多肽是促红细胞生成素。
EPO可以是任何人来源的(参见，例如，Inoue，Wada，Takeuchi，1994，An improved method for the purification of humanerythropoietin with high in vivo activity from the urine ofanemic patients，Biol.Pharm.Bull.17(2)，180-4；Miyake，Kung，Goldwasser，1977，Purification of human erythropoietin.，J.Biol.Chem.，252(15)，5558-64)或者另外一种哺乳动物来源的，通过从天然存在的来源(如人肾脏、人胚胎肝脏，或动物，优选地猴肾)中纯化获得。此外，表述“促红细胞生成素”或“EPO”也包括一种EPO变体，其中一个或多个氨基酸(例如1-25个，优选1-10个，更优选1-5个，最优选1个或2个)已经被置换为另外的氨基酸，并显示红细胞生成活性(参见，例如EP 640 619 B1)。红细胞生成活性的测定在本领域中有描述(关于体外活性的测定，参见，例如Fibi等人，1991，Blood，77，1203 ff；Kitamura等人，1989，J.Cell Phys.，140，323-3341991，Blood，77，1203 ff；关于EPO体内活性的测定，参见Ph.Eur.2001，911-9171；Ph.Eur.2000，1316 Erythropoietinisolutio concentrata，780-785；European Pharmacopoeia(1996/2000)；European Pharmacopoeia，1996，Erythropoietinconcentrated solution，Pharmaeuropa.，8，371-377；Fibi，Hermentin，Pauly，Lauffer，Zettlmeissl.，1995，N-andO-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietinsecreted from BHK-21 cells，Blood，85(5)，1229-36；(在第1、2、3天向雌性NMRI小鼠注射EPO和修饰的EPO型(等量50ng蛋白质/小鼠)，在第4天采集血样，测定网织红细胞))。关于EPO活性测定的其它出版物包括Barbone，Aparicio，Anderson，Natarajan，Ritchie，1994，Reticulocytes measurements as a bioassay forerythropoietin，J.Pharm.Biomed.Anal.，12(4)，515-22；Bowen，Culligan，Beguin，Kendall，Villis，1994，Estimation ofeffective and totalerythropoiesis in myelodysplasia usingserum transferrin receptor and erythropoietin concentrations，with automated reticulocyte parameters，Leukemi，8(1)，151-5；Delorme，Lorenzini，Giffin，Martin，Jacobsen，Boone，Elliott，1992，Role of glycosylation on the secretion and biologicalactivity of erythropoietin，Biochemistry，31(41)，9871-6；Higuchi，Oh-eda，Kuboniwa，Tomonoh，Shimonaka，Ochi，1992；Role of sugar chains in the expression of the biologicalactivity of human erythropoietin，J.Biol.Chem.，267(11)，7703-9；Yamaguchi，Akai，Kawanishi，Ueda，Masuda，Sasaki，1991，Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites inhuman erythropoietin on its production and biologicalproperties，J.Biol.Chem.，266(30)，20434-9；Takeuchi，Inoue，Strickland，Kubota，Wada，Shimizu，Hoshi，Kozutsumi，Takasaki，Kobata，1989，Relationship between sugar chain structure andbiological activity of recombinant human erythropoietinproduced in Chinese hamster ovary cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(20)，7819-22；Kurtz，Eckardt，1989，Assay methods forerythropoietin，Nephron.，51(1)，11-4(German)；Zucali，Sulkowski，1985，Purification of human urinary erythropoietinon controlled-pore glass and silicicacid，Exp.Hematol.，13(3)，833-7；Krystal，1983，Physical and biological characterizationof erythroblast enhancing factor(EEF)，a lateactingerythropoietic stimulator in serum distinct fromerythropoietin，Exp.Hematol.，11(1)，18-31。
优选地重组生产EPO。包括在真核或原核细胞中生产，优选地在哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞中或者在适于重组生产EPO的其它任何细胞型中生产。此外，EPO也可以在转基因动物中(例如在体液中，如奶、血液等)、在转基因鸟特别是在家禽优选地在鸡的蛋中，或者在转基因植物中表达。
多肽的重组生产在本领域中公知。通常包括用一种适当的表达载体转染宿主细胞，在能够生产多肽的条件下培养宿主细胞，以及从宿主细胞中纯化多肽。关于详细信息，参见例如Krystal，Pankratz，Farber，Smart，1986，Purification of human erythropoietin tohomogeneity by a rapid five-step procedure，Blood，67(1)，71-9；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-levelexpression and purification of a recombinant humanerythropoietin produced using abaculovilms vector，Blood，74(2)，652-7；EP 640 619 B1和EP 668 351 B1。
在一个优选实施方案中，EPO具有人EPO的氨基酸序列(见EP 148605 B2)。
EPO可以含有通过N-和/或O-连接的糖基化作用与EPO连接的一个或多个碳水化合物侧链，优选1-12个、更优选1-9个、更优选1-6个、特别是1-4个、特别优选4个碳水化合物侧链，即EPO被糖基化。当在真核细胞中生产EPO时，多肽通常在翻译后被糖基化。因此，在哺乳动物特别是在人、昆虫或酵母细胞内的生物合成过程中，碳水化合物侧链可以与EPO连接。糖基化EPO的结构和性质在本领域中已经广泛研究(参见EP 428 267 B1；EP 640 619 B1；Rush，Derby，Smith，Merry，Rogers，Rohde，Katta，1995，Microheterogeneity oferythropoietin carbohydrate structure，Anal Chem.，67(8)，1442-52；Iakeuchi，Kobata，1991，Structures and functionalroles of the sugar chains of humanerythropoietins，Glycobiology，1(4)，337-46(Review)。
因此，本发明羟烷基淀粉衍生物的每个EPO分子可以含有至少1个、优选1-12个、更优选1-9个、更优选1-6个、特别优选1-4个HAS分子。每个EPO分子的HAS分子数可以在产物水解及获得的单糖衍生化后，利用GC-MS，通过定量碳水化合物组成分析测定(见Chaplinand Kennedy(eds.)，1986，Carbohydrate Analysis：a practicala pproach，IRL Press Practical a pproach series(ISBN0-947946-44-3)，具体见Chapter 1，Monosaccharides，page 1-36；Chapter 2，Oligosaccharides，page 37-53，Chapter 3，NeutralPolysaccharides，page 55-96)。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，与EPO连接的碳水化合物部分是碳水化合物侧链的一部分。更优选地，该碳水化合物部分是碳水化合物侧链的末端部分。在一个更优选的实施方案中，该碳水化合物部分是碳水化合物侧链的一个半乳糖残基，优选地是碳水化合物侧链的末端半乳糖残基。如下文所述，通过除去末端唾液酸，随后氧化，该半乳糖残基能够与化合物(I)和化合物(II)的反应产物反应。在另外一个优选实施方案中，化合物(I)和化合物(II)的反应产物与碳水化合物侧链的唾液酸残基连接，优选地与碳水化合物侧链的末端唾液酸残基连接。该唾液酸如下文所述被氧化。
特别优选地，通过除去末端唾液酸，随后氧化，使得该半乳糖残基可以通过官能团X与羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物或进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物反应。
更优选地，通过氧化(其中末端唾液酸未被去除)，使得该半乳糖残基可以通过官能团X与羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物或进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物反应。
如上所述，羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物或进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物与EPO中所含的巯基反应。
羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物或进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物也可以与巯基以及与碳水化合物部分反应，它们均含于至少另外一种化合物中，优选含于多肽、更优选促红细胞生成素中。
根据一个优选实施方案，该SH基可以与一个优选氧化的碳水化合物部分连接，例如通过使用羟胺衍生物，例如2-(氨氧基)乙硫醇盐酸盐(Bauer L.等人，1965，J.Org.Chem.，30，949)，或者通过使用酰肼衍生物，例如巯基乙酸酰肼连接(Whitesides等人，1977，J.Org.Chem.，42，332)。
根据另外一个优选实施方案，优选地将巯基引入EPO的氧化的碳水化合物部分中，更优选地引入作为EPO碳水化合物侧链一部分的氧化的碳水化合物部分中。
优选地，该巯基来源于天然存在的半胱氨酸或者来源于添加的半胱氨酸。更优选地，EPO具有人EPO的氨基酸序列，天然存在的半胱氨酸是半胱氨酸29和/或33。在一个更优选的实施方案中，羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物或进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物与半胱氨酸29偶联，半胱氨酸33被置换为另外一种氨基酸。此外，羟烷基淀粉与化合物(L)的反应产物或进一步与化合物(L)反应的羟烷基淀粉与化合物(D)的反应产物也可以与半胱氨酸33偶联，而半胱氨酸29被置换为另外一种氨基酸。
在本发明中，术语“添加的半胱氨酸”指多肽(优选EPO)含有在野生型多肽中不存在的半胱氨酸残基。
在本发明该方面中，半胱氨酸可以是在EPO的N端或C端添加的额外氨基酸。
此外，也可以通过将天然存在的氨基酸置换为半胱氨酸或适当取代的半胱氨酸来添加半胱氨酸。优选地，在本发明该方面中，EPO是人EPO，被置换的氨基酸残基是丝氨酸126。
对于羟烷基淀粉与化合物(L)(以及任选地与化合物(D))的反应产物与另外一种化合物(M)的反应条件没有具体限制，可以根据具体需要调整反应条件。根据本发明的一个特别优选的实施方案，单独使用水或者水与至少另外一种溶剂联合使用作为溶剂。至少另外一种溶剂可以是DMSO、DMF、甲醇和乙醇。除了水之外，优选的溶剂是甲醇和乙醇。根据其它优选实施方案，使用DMSO或DMF或甲醇或乙醇或其中两种或多种的混合物作为溶剂。
例如，如果羟烷基淀粉在水性体系中与化合物(L)反应，在这种情况下，例如，当羟乙基淀粉通过淀粉未氧化的还原性末端与一种羟胺如O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺反应，并且反应产物通过醛基、酮基、缩醛基或半缩醛基进一步与多肽(优选促红细胞生成素)反应时，反应温度优选为4-37℃，更优选10-30℃，特别优选15-25℃。
含有另外一种化合物(M)(优选多肽，特别优选促红细胞生成素)的反应产物的分离，可以用已知的纯化天然和重组EPO的方法进行(例如分子排阻层析、离子交换层析、RP-HPLC、羟基磷灰石层析、疏水相互作用层析或其组合)。反应产物的分离可以利用一种适当的方法进行，该方法可能包括一个或多个步骤。根据本发明的一个优选实施方案，首先利用适当的方法如离心或过滤，将反应产物与反应混合物或反应混合物与例如乙醇-丙酮混合物的混合物分离。第二步，可以进一步处理分离的反应产物，如后处理的透析、离心过滤或正压式过滤、离子交换层析(例如利用含有Q-sepha rose的柱)、HPLC、MPLC、凝胶过滤和/或冻干。根据一个优选实施方案，分离的反应产物首先优选用水透析，然后冻干，直到根据产物希望的特性，反应产物的溶剂含量足够低。冻干可以在20-35℃下进行，优选地在25-30℃下进行。根据另外一个优选实施方案，将含有反应产物的反应混合物上样到含有Q-Sepharose的柱上，得到洗脱物，通过例如离心过滤浓缩。
本发明的另外一个目的是提供通过上述一种或多种方法产生的羟烷基淀粉衍生物。
因此，本发明涉及可以通过生产羟烷基淀粉衍生物之方法获得的羟烷基淀粉衍生物，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构
该方法包括：
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端，或者
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端与化合物(D)反应获得的羟烷基淀粉衍生物，化合物(D)含有：
-至少一个能够与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应的能团Z1，和
-至少一个官能团W，
与一种化合物(L)反应，化合物(L)含有：
-至少一个能够与所述羟烷基淀粉反应的官能团Z1，或者至少一个能够与所述羟烷基淀粉衍生物中所含的官能团W反应的官能团Z2，和
-至少一个能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应的官能团X，
其中所述官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基。
根据一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R1、R2和R3独立地是氢或直链或支链羟烷基。
根据一个更优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团Z1含有结构-NH-。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中Z1选自：
H2N-
Figure A0382146500562
其中，G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，官能团X含有结构-NH-。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中X选自：
H2N-
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R是甲基。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团Y是-SH，官能团X选自：
其中Hal是Cl、Br或I。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A0382146500571
其中Hal是Cl、Br或I。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团W或官能团Z2选自如上所述的活化酯或能够任选地转化为活化酯的羧基，官能团Z2或官能团W选自：
H2N-
Figure A0382146500572
Figure A0382146500573
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R是甲基。
根据一个特别优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前未氧化，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构
根据另外一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前被氧化，该羟烷基淀粉因此具有通式(IIa)
和/或通式(IIb)的结构。
Figure A0382146500582
根据另外一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中还原性末端用碱性碘溶液氧化。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，所得反应产物与化合物(M)反应。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，而在与羟烷基淀粉反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(L)中所含的官能团Z2与化合物(D)中所含的官能团W反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，产生第二种羟烷基淀粉衍生物。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，第二种羟烷基淀粉衍生物与化合物(M)反应。
根据另外一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(D)中所含的官能团W与化合物(L)中所含的官能团Z2反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，其中在与第一种羟烷基淀粉衍生物反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中所述至少另外一种化合物(M)是一种多肽。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物，其中多肽是促红细胞生成素。
羟烷基淀粉衍生物在下文中被称为HAS-EPO偶联物，是通过羟烷基淀粉与化合物(L)和任选地化合物(D)和促红细胞生成素反应形成的，它具有以下优点：与偶联前的促红细胞生成素相比，生物稳定性提高。此外，它也显示比标准BRP EPO更高的生物活性。这主要是基于以下事实：HAS-EPO很少甚至不被肝脏和肾脏的清除系统识别，因此在循环系统中长时间存在。此外，由于HAS以位点特异性的方式连接，因此因HAS与EPO偶联而破坏EPO体内生物活性的危险被最小化。
本发明的HAS-EPO偶联物可以具有与重组天然EPO基本相同的体外生物活性，因为体外生物活性只决定与EPO受体的结合亲和力。测定体外生物活性的方法在本领域公知。
此外，HAS-EPO也显示比用作偶联初始材料的EPO(未偶联的EPO)更高的体内活性。测定体内生物活性的方法在本领域公知。
如果将未偶联的EPO的体内活性设为100％，则HAS-EPO偶联物可能显示110-500％、优选300-400％、或者110％-300％、优选110％-200％、更优选110％-180％、或者110-150％、最优选110％-140％的体内活性。
与Amgen的高度唾液酸化的EPO相比(见EP 428 267 B1)，如果将高度唾液酸化EPO的体内活性设为100％，则HAS-EPO显示优选至少50％、更优选至少70％、更优选至少85％、或者至少95％、至少150％、至少200％或者至少300％的高度唾液酸化EPO的体内活性。最优选地，它显示至少95％的高度唾液酸化EPO的体内活性。
本发明HAS-EPO偶联物的高体内生物活性主要是基于以下事实：该HAS-EPO偶联物在循环中保持的时间比未偶联的EPO更长，因为它较少被肝脏的清除系统识别，并且由于分子量较高，肾清除减少。测定EPO在循环中的体内半衰期的方法在本领域公知(Sytkowski，Lunn，Davis，Feldman，Siekman，1998，Human erythropoietindimers withmarkedly enhanced in vivo activity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(3)，1184-8)。
因此，本发明的一个大的优点是：提供一种HAS-EPO，它可以比目前作为商品获得的EPO制品以更低频率施用。标准EPO制品必须至少施用3天，而本发明HAS-EPO偶联物优选每周施用两次，更优选每周一次。
此外，本发明的方法还具有能够以低成本生产有效EPO衍生物的优点，因为该方法不包括导致低终产率的复杂且耗时的纯化步骤，例如，不需要纯化掉已知显示低体内生物活性或者无体内生物活性的低唾液酸化的EPO形式。具体而言，实施例8.11(d)证明，用极少修饰步骤生产的一种HES-EPO显示3倍于标准BRP-EPO的活性。
本发明的另外一个目的是提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明HAS-EPO偶联物。
此外，本发明还涉及一种药物组合物，其含有治疗有效的量的本发明HAS-多肽偶联物，优选HAS-EPO偶联物，更优选HES-EPO偶联物。在一个优选实施方案中，该药物组合物还含有至少一种用于促红细胞生成素治疗的药学可接受的稀释剂、佐剂和/或载体。
因此，本发明也涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的羟烷基淀粉衍生物，该羟烷基淀粉衍生物可以通过一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法获得，所述羟烷基淀粉具有根据通式(I)的结构
该方法包括：
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端，或者
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端与化合物(D)反应获得的羟烷基淀粉衍生物，该化合物(D)含有：
-至少一个能够与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应的官能团Z1，和
-至少一个官能团W，
与化合物(L)反应，化合物(L)含有：
-至少一个能够与所述羟烷基淀粉反应的官能团Z1，或者至少一个能够与所述羟烷基淀粉衍生物中所含的官能团W反应的官能团Z2，和
-至少一个能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应的官能团X，
其中所述官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基，所述生产羟烷基淀粉衍生物的方法还包括使含有羟烷基淀粉、化合物(L)和任选地化合物(D)的反应产物与另外一种化合物(M)反应，其中所述至少另外一种化合物是一种多肽。
而且，本发明也涉及如上所述的羟烷基淀粉衍生物在制备治疗贫血性疾病或造血功能障碍性疾病或与之有关的疾病的药物中的用途。
根据一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中多肽是抗凝血酶(AT)，优选是AT III(Levy JH，Weisinger A，ZiomekCA，Echelard Y，Recombinant Antithrombin：Production and Rolein Cardiovascular Disorder，Seminars in Thrombosis andHemostasis 27，4(2001)405-416；Edmunds T，Van Patten SM，Pollock J，Hanson E，Bernasconi R，Higgins E，Manavalan P，Ziomek C，Meade H，Mc Pherson J，Cole ES，Transgenically ProducedHuman Antithrombin：Structural and Functional Comparison toHuman Plasma-Derived Antithrombin，Blood 91，12(1998)4661-4671；Minnema MC，Chang ACK，Jansen PM，Lubbers YTP，Pratt BM，Whittaker BG，Taylor FB，Hack CE，Friedman B，Recombinant human antithrombin III improves survival andattenuates inflammatory responses in baboons lethallychallenged with Escherichiacoli，Blood 95，4(2000)1117-1123；Van Patten SM，Hanson EH，Bernasconi R，Zhang K，Manavaln P，Cole ES，McPherson JM，Edmunds T，Oxidation of MethionineResidues in Antithrombin，J.Biol.Chemistry 274，15(1999)10268-10276)。
根据其它一些优选实施方案，本发明涉及多肽是G-CSF或IFN-β的药物组合物。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中多肽是促红细胞生成素。
根据另外一个实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中官能团Y是-SH，化合物(L)是通式Z1-L′-X的化合物，其中官能团
Z1选自：
H2N-
Figure A0382146500621
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，其中官能团X选自：
其中Hal是Cl、Br或I，L’是桥接Z1与X的有机链，或者L’不存在。
根据一个优选实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，化合物(L)是通式Z1-L′-X的化合物，其中官能团Z1选自：
Figure A0382146500632
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，其中官能团X选自：
H2N-
Figure A0382146500633
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，L’是桥接Z1与X的一个有机链，或者L’不存在。
根据另外一个实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中官能团Y是-SH，化合物(D)是通式Z1-D′-W的化合物，化合物(L)是通式Z2-L′-X的化合物，其中官能团Z1选自：
H2N-
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，官能团X选自：
H2N-
Figure A0382146500642
Figure A0382146500643
其中Hal是Cl、Br或I，官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
其中Hal是Cl、Br或I，或者官能团W或官能团Z2选自如上所述的活化酯、能够任选地转化为活化酯的羧基，官能团Z2或官能团W分别选自：
H2N-
Figure A0382146500646
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，D’是桥接Z1与W的有机链，或者D’不存在，L’是桥接Z2与X的有机链，或者L’不存在。
根据另外一个实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，化合物(D)是通式Z1-D′-W的化合物，化合物(L)是通式Z2-L′-X的化合物，其中官能团Z1选自：
H2N-
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，其中官能团X选自：
H2N-
Figure A0382146500653
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A0382146500655
其中Hal是Cl、Br或I，官能团W或官能团Z2选自如上所述的活化酯、或能够任选地转化为活化酯的羧基，官能团Z2或官能团W分别选自：
H2N-
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，D’是桥接Z1与W的有机链，或者D’不存在，L’是桥接Z2与X的有机链，或者L’不存在。
根据一个特别优选的实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中羟烷基淀粉在水性介质中与下式化合物反应，
Figure A0382146500663
反应产物与促红细胞生成素反应。
根据一个更优选的实施方案，本发明涉及上述药物组合物，其中促红细胞生成素在反应之前用高碘酸钠氧化。
根据一个进一步优选的实施方案，本发明涉及如上所述的药物组合物，其中促红细胞生成素在反应之前部分去唾液酸化，随后用高碘酸钠氧化。
根据本发明的一个进一步优选的实施方案，不包括根据实施例6以完全还原的巯基-EPO为基础产生的含有羟烷基淀粉衍生物的药物组合物。
上述药物组合物特别适合治疗贫血性疾病或造血功能障碍性疾病或与之有关的疾病。
如此处所用的“治疗有效量”指对于指定病征和施用方案提供治疗效果的量。促红细胞生成素同种型优选地通过肠胃外途径施用。选择的具体途径取决于治疗的疾病。促红细胞生成素同种型优选作为制剂的一部分施用，该制剂还含有适当的载体如人血清白蛋白、适当的稀释剂如缓冲液、和/或适当的佐剂。需要的剂量是足以提高患者血细胞比容的量，因所治疗疾病的严重程度、使用的施用方法等而异。
优选地，本发明药物组合物治疗的目的是提高血液中血红蛋白值至6.8mmol/l以上。为此，可以施用药物组合物，使得血红蛋白值每周提高0.6mmol/l-1.6mmol/l。如果血红蛋白值超过8.7mmol/l，优选地应当中断治疗，直到血红蛋白值低于8.1mmol/l。
本发明组合物优选地在适于皮下或静脉内或肠胃外注射的制剂中使用。为此，适当的赋形剂和载体是，例如：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯酸钠、聚山梨醇酯80(polysorbate 80)、HAS和注射用水。该组合物可以每周施用三次，优选每周两次，更优选每周一次，最优选每两周一次。
优选地，该药物组合物以0.01-10μg/kg患者体重的量施用，更优选0.1-5μg/kg、0.1-1μg/kg或0.2-0.9μg/kg、最优选0.3-0.7μg/kg、最优选地0.4-0.6μg/kg体重。
优选地，每次剂量通常施用10μg-200μg，优选15μg-100μg。
本发明还涉及本发明HAS-多肽在治疗人或动物体的方法中的用途。
本发明还涉及本发明HAS-EPO偶联物在制备治疗贫血性疾病或造血功能障碍性疾病或与之有关疾病的药物中的应用。
如果根据本发明使用的化合物(L)含有一个或多个手性中心，则化合物(II)可以是R构象或者S构象，或者是相对于每一个手性中心的外消旋化合物。
如果本发明中任选地使用的化合物(D)含有一个或多个手性中心，则化合物(D)可以是R构象或S构象，或者是相对于每一个手性中心的外消旋化合物。
本发明通过下列实施例、表和附图进一步说明，它们绝非意在限制本发明的范围。
附图简述
图1
图1显示根据实施例5.1产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例5.1偶联后的粗制品。
C道：EPO初始材料
图2
图2显示根据实施例5.3产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：根据实施例5.3偶联后的粗制品。
B道：EPO初始材料
C道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
图3
图3显示根据实施例5.4和5.5产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例5.4偶联后的粗制品。
C道：根据实施例5.5偶联后的粗制品。
D道：EPO初始材料
图4
图4显示根据实施例7.1和7.4产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例7.4偶联后的粗制品。
C道：根据实施例7.1偶联后的粗制品。
D道：EPO初始材料
图5
图5显示根据实施例7.2、7.3、7.5和7.6产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例7.6偶联后的粗制品，基于实施例1.3b)。
C道：根据实施例7.5偶联后的粗制品，基于实施例1.1b)。
D道：根据实施例7.6偶联后的粗制品，基于实施例1.3a)。
E道：根据实施例7.5偶联后的粗制品，基于实施例1.1a)。
F道：根据实施例7.2偶联后的粗制品。
G道：根据实施例7.3偶联后的粗制品。
K道：EPO初始材料。
图6
图6显示根据实施例7.7、7.8、7.9、7.10、7.11和7.12产生的HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析。
A道：蛋白质分子量标准Roti-Mark PRESTAINED(Carl RothGmbH+Co，Karlsruhe，D)；蛋白质标准的分子量(kD)从上到下依次为：245，123，77，42，30，25.4和17。
B道：根据实施例7.11偶联后的粗制品。
C道：根据实施例7.10偶联后的粗制品。
D道：根据实施例7.7偶联后的粗制品。
E道：根据实施例7.8偶联后的粗制品。
F道：根据实施例7.12偶联后的粗制品。
G道：EPO初始材料
K道：根据实施例7.9偶联后的粗制品。
图7
EPO-GT-1的SDS-PAGE分析，其中弱酸处理5分钟＝2道；10分钟＝3道；60分钟＝4道；未处理的EPO＝1道；显示除去N-聚糖后EPO的迁移率变化(+PNGASE)。
图8
从未处理的EPO中以及从在弱酸水解条件下温育5分钟、10分钟、60分钟的EPO中分离的寡糖的HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法)图案。罗马数字I-V表示洗脱位置，I＝二唾液酸化的二分支(antennary)结构，II＝三唾液酸化的三分支结构(两种异构体)，III＝四唾液酸化的四分支结构+2个N-乙酰基乳糖胺重复，IV＝四唾液酸化的四分支结构+1个N-乙酰基乳糖胺重复；V＝四唾液酸化的四分支结构+不含N-乙酰基乳糖胺重复。不含及含有1-4个唾液酸的寡糖结构的洗脱区用括号表示。
图9
去唾液酸化后N-连接寡糖的HPAEC-PAD；显示了N-乙酰神经氨酸的洗脱位置；数字1-9表示标准寡糖的洗脱位置；1＝二分支；2＝三分支(2-4种异构体)，3＝三分支(2-6种异构体)，4＝四分支；5＝三分支+1个重复；6＝四分支+1个重复；7＝三分支+2个重复；8＝四分支+2个重复；9＝四分支+3个重复。
图10
温和处理的和未处理的EPO在唾液酸残基经受高碘酸盐氧化后的SDS-PAGE分析。1＝高碘酸盐氧化，未酸处理；2＝高碘酸盐氧化5分钟，酸处理；3＝高碘酸盐氧化，酸处理10分钟；4＝高碘酸盐氧化，未酸处理；5＝未高碘酸盐氧化且未酸处理的BRP EPO标准。
图11
从未处理的EPO中以及从在弱酸水解条件下温育5分钟和10分钟随后高碘酸盐处理的EPO中分离的天然寡糖的HPAEC-PAD图。不含及含有1-4个唾液酸的寡糖结构的洗脱区用括号1-5表示。
图12
EPO-GT-1-A的HES修饰时间过程的SDS-PAGE分析：20μg等份的EPO-GT-1-A与羟胺修饰的HES衍生物X反应30分钟、2、4、17小时。1道＝30分钟反应时间；2道＝2小时反应时间；3道＝4小时反应时间；4道＝17小时反应时间；5道＝没有HES修饰的EPO-GT-1-A。左图显示在羟胺修饰的HES衍生物(流速：1ml·min-1)X存在下，随着温育时间延长，EPO-GT-1-A的迁移率改变：1道＝30分钟反应时间；2道＝2小时反应时间；3道＝4小时反应时间；4道＝17小时反应时间；5道＝HES修饰的EPO-GT-1-A。右图显示相同样品用N-糖苷酶处理后的分析。
图13
HES-EPO偶联物的Q-Sepharose级分的SDS-PAGE分析。1％的穿流液(flow-through)以及在高盐浓度下洗脱的1％级分用Speed Vac浓缩器浓缩，在样品缓冲液中加样到凝胶上。EPO蛋白用考马斯蓝染色。A＝样品I；B＝样品II；C＝样品III；K＝对照EPO-GT-1；A1、B1、C1和K1表示穿流液部分；A2、B2、C2和K2表示用高盐浓度洗脱的级分。
图14a
HES修饰的EPO样品A2(见图13)、对照EPO样品K2和EPO-GT-1-A的SDS-PAGE分析。为了除去N-连接的寡糖，在N-糖苷酶存在下消化EPO制品。所有EPO样品都显示迁移率向缺乏或含有O-聚糖的低分子量型转变。对于HES-修饰的EPO样品A2，在去-N-糖基化后观察到O-糖基化与非糖基化蛋白带的比值较低，在30KDa左右检测到一条弥散的蛋白带，这推定代表O-聚糖残基的唾液酸处的HES-修饰(见星号标记的箭头)。
图14b
未处理的或者在N-糖苷酶存在下消化除去N-连接寡糖(见图14a)的HES-修饰的EPO样品A2(见图13)、对照EPO样品K2和EPO-GT-1A在温和水解后的SDS-PAGE分析。在N-糖苷酶处理之前的高分子量型A2和处理之后的高分子量型A(见有箭头及无箭头的括号)在样品酸处理后都消失。用于比较的BRP EPO标准不进行弱酸处理。
图15
从HES修饰的样品A、EPO-GT-1-A以及与未修饰的HES温育的对照EPO样品(K)中释放的N-连接寡糖物质的HPAEC-PAD分析。罗马数字I-V表示洗脱位置，I＝二唾液酸化的二分支结构，II＝三唾液酸化的三分支结构(两种异构体)，III＝四唾液酸化的四分支结构+2个N-乙酰基乳糖胺重复，IV＝四唾液酸化的四分支结构+1个N-乙酰基乳糖胺重复；V＝四唾液酸化的四分支结构+不含N-乙酰基乳糖胺重复；括号表示二、三、四唾液酸化的N-聚糖的洗脱区，如图8和图11的图例所述。
图16
从HES修饰的样品A、EPO-GT-1-A以及与未修饰的HES温育的对照EPO样品(K)中释放的N-连接寡糖物质的HPAEC-PAD分析。显示了标准寡糖混合物的保留时间：数字1-9表示标准寡糖的洗脱位置：1＝二分支；2＝三分支(2-4种异构体)，3＝三分支(2-6种异构体)，4＝四分支；5＝三分支+1个重复；6＝四分支+1个重复；7＝三分支+2个重复；8＝四分支+2个重复；9＝四分支+3个重复。
图17-23
图17-23表示从HES修饰的EPO和对照EPO制品中分离的酶释放的和化学去唾液酸化的N-聚糖的MALDI/TOF质谱。在m/z 1809.7、2174.8、2539.9、2905.0和3270.1处的主要信号([M+Na]+)对应于二到四分支的不含、含有一个或两个N-乙酰基乳糖胺重复的复杂型N-聚糖结构，并且伴有弱信号，这是由于为了对MS分析的样品去唾液酸化所使用的酸水解条件引起岩藻糖或半乳糖损失所致。
图17
MALDI/TOF谱：HES-修饰的EPO A2的去唾液酸化寡糖。
图18
MALDI/TOF谱：EPO GT-1-A的去唾液酸化寡糖。
图19
MALDI/TOF谱：EPO K2的去唾液酸化寡糖。
图20
MALDI/TOF谱：EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
图21
MALDI/TOF谱：酸水解5分钟的EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
图22
MALDI/TOF谱：酸水解10分钟的EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
图23
MALDI/TOF谱：酸水解60分钟的EPO-GT-1的去唾液酸化寡糖。
图24
图24显示两种HES-EPO偶联物的SDS-PAGE分析
mw：分子量标准
1道：根据实施例方案8产生的HES-EPO：EPO与酰肼-HES12KDL偶联
2道：根据实施例方案9产生的HES-EPO：EPO与羟氨基HES12KDK偶联
C：对照(未偶联的EPO)；上面的一条带代表EPO二聚体
图25
图25通过显示多肽N-糖苷酶对HAS修饰的EPO型的消化，证明HES与碳水化合物侧链的碳水化合物部分偶联
1道：根据实施例方案8产生的HES-EPO，N-糖苷酶消化
2道：根据实施例方案9产生的HES-EPO，N-糖苷酶消化
3道：BRP EPO标准
4道：BRP EPO标准，N-糖苷酶消化
mw：分子量标准(Bio-Rad SDS-PAGE Standards Low range，目录号161-0305，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)
实施例
实施例1
通过未氧化的还原性末端的还原胺化形成羟乙基淀粉衍生物实施例1.1羟乙基淀粉与1，3-二氨基-2-羟基丙烷的反应
Figure A0382146500741
a)向200mg羟乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，3-二氨基-2-羟基丙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下温育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，3-二氨基-2-羟基丙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物，也可以在25℃下温育3天。
实施例1.2羟乙基淀粉与1，2-二羟基-3-氨基丙烷的反应
a)向200mg羟乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，2-二羟基-3-氨基丙烷(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下温育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschl and GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，2-二羟基-3-氨基丙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物，也可以在25℃下温育3天。
如G.Avigad，Anal.Biochem.134(1983)449-504所述，用高碘酸盐氧化切割反应产物中的1，2-二醇产生醛，通过对醛定量间接证实1，2-二羟基-3-氨基丙烷与HES的反应。
实施例1.3羟乙基淀粉与1，4-二氨基丁烷的反应
Figure A0382146500752
a)向200mg羟乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1，4-二氨基丁烷(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下温育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1，4-二氨基丁烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物也，可以在25℃下温育3天。
实施例1.4羟乙基淀粉与1-巯基-2-氨基乙烷的反应
a)向200mg羟乙基淀粉(HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4))在5ml水中的溶液中加入0.83mmol 1-巯基-2-氨基乙烷(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3。获得的混合物在80℃下温育17小时。将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
b)向200mg羟乙基淀粉的溶液中加入0.83mmol 1-巯基-2-氨基乙烷和50mg氰基硼氢化钠NaCNBH3产生的混合物，也可以在25℃下温育3天。
实施例2：通过与未氧化的还原性末端偶联形成羟乙基淀粉衍生物
实施例2.1：羟乙基淀粉与碳酰肼的反应
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸钠水性缓冲液pH5.2中，加入8mmol碳酰肼(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)。在25℃下搅拌18小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例2.2：羟乙基淀粉与己二酸二酰肼的反应
Figure A0382146500771
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸钠水性缓冲液pH5.2中，加入8mmol己二酸二酰肼(LancasterSynthesis，Frankfurt/Main，D)。在25℃下搅拌18小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例2.3：羟乙基淀粉与1，4-亚苯基-二-3-氨基硫脲的反应
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中，加入8mmol 1，4-亚苯基-二-3-氨基硫脲(Lancaster Synthesis，Frankfurt/Main，D)。在25℃下搅拌18小时后，向反应混合物中加入8ml水，悬液以4,500rpm离心15分钟。将澄清的上清液移至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，以4,500rpm离心15分钟。澄清的上清液用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例2.4：羟乙基淀粉与O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺的反应
Figure A0382146500781
O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺如Boturyn等人Tetrahedron 53(1997)5485-5492所述用可购得的材料通过两步合成。
将0.96g HES18/0.4(MW＝18,000D，DS＝0.4)溶解于8ml 0.1M乙酸钠水性缓冲液pH5.2中，加入8mmol O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺。在25℃下搅拌18小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40ml水中，用水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例3通过与氧化的还原性末端反应，形成羟乙基淀粉衍生物
实施例3.1羟乙基淀粉与碳酰肼的反应
Figure A0382146500782
将0.12mmol氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根据DE196 28 705 A1制备)溶解于3ml无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至15mmol碳酰肼(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在15mlDMSO中的混合物中。在65℃下搅拌88小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例3.2羟乙基淀粉与1，4-亚苯基-二-3-氨基硫脲的反应
将0.12mmol氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根据DE196 28 705 A1制备)溶解于3ml无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至15mmol 1，4-亚苯基-二-3-氨基硫脲(Lancaster Synthesis，Frankfurt/Main，D)在15ml DMSO中的混合物中。在65℃下搅拌88小时后，将反应混合物加至160mL丙酮与乙醇的1∶1(v/v)冷混合物中。离心收集沉淀，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，冻干。
实施例3.3羟乙基淀粉与肼的反应
H2N-NH2
将1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根据DE 196 28 705 A1制备)溶解于3ml无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至0.47ml(15mmol)肼在15ml DMSO中的混合物中。在40℃下搅拌19小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1(v/v)混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40mL水中，对0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。
实施例3.4羟乙基淀粉与羟胺的反应
Figure A0382146500791
O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺如Boturyn等人所述用可购得的材料通过两步合成(Boturyn，Boudali，Constant，Defrancq，Lhomme，1997，Tetrahedron，53，5485)。
将1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根据DE 196 28 705 A1制备)溶解于3ml无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至2.04g(15mmol)O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺在15ml DMSO中的混合物中。在65℃下搅拌48小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1(v/v)混合物中。离心收集沉淀产物，再溶解于40mL水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。
实施例3.5羟乙基淀粉与己二酸二酰肼的反应
在65℃下将1.74g(15mmol)己二酸二酰肼溶解于20ml无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加入溶解于3ml无水二甲亚砜中的1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根据DE 196 28 705 A1制备)。在60℃下搅拌68小时后，将反应混合物加至200mL水中。含有反应产物的溶液用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。
实施例3.6羟乙基淀粉与1，4-二氨基丁烷的反应
Figure A0382146500802
将1.44g(0.12mmol)氧代-HES 10/0.4(MW＝10,000D，DS＝0.4，根据DE 196 28 705 A1制备)溶解于3ml无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至1.51ml(15mmol)1，4-二氨基丁烷(SigmaAldrich，Tauflcirchen，D)在15ml DMSO中的混合物中。在40℃下搅拌19小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1(v/v)混合物中。离心收集沉淀氨基-HES10KD/0.4，再溶解于40ml水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，PerbioScienceDeutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。
实施例4促红细胞生成素的氧化
氧化的促红细胞生成素如实施例8所述生产。使用实施例8.11(c)所述的EPO-GT-1-A(未进行酸水解，用温和的高碘酸盐氧化处理的EPO-GT-1)作为氧化的促红细胞生成素。
实施例5：羟乙基淀粉衍生物与实施例4的氧化的促红细胞生成素的偶联
实施例5.1氧化的促红细胞生成素与实施例2.1的反应产物的反应
用5M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例2.1产生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图1中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例5.2氧化的促红细胞生成素与实施例2.3的反应产物的反应
用5M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例2.3产生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。
实施例5.3氧化的促红细胞生成素与实施例2.4的反应产物的反应
用5M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例2.4产生的18μl HES衍生物溶液(MW 18kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图2中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例5.4氧化的促红细胞生成素与实施例3.1的反应产物的反应
用5M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例3.1产生的18μl HES衍生物溶液(MW 10kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图3中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例5.5氧化的促红细胞生成素与实施例3.2的反应产物的反应
用5M乙酸钠缓冲液pH5.2将含氧化EPO(1.055μg/μl)的20mMPBS缓冲液)调节为pH5.3。向19μl EPO溶液中加入根据实施例3.1产生的18μl HES衍生物溶液(MW 10kD；18.7μg/μl，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图3中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例6通过还原促红细胞生成素形成巯基-EPO
241.5μg促红细胞生成素(EPO-GT-1，见实施例8)在500μl 0.1M硼酸钠缓冲液，5mM EDTA，10mM DTT(Lancaster，Morcambe，UK)，pH8.3中37℃温育1小时。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，10KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤除去DTT，随后用硼酸盐缓冲液洗涤3次，用磷酸盐缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)洗涤2次。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实施例7：用交联化合物偶联羟乙基淀粉衍生物与巯基促红细胞生成素
在下列所有实施例中都使用N-(α-马来酰亚氨基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯(AMAS)作为交联化合物。
Figure A0382146500831
实施例7.1巯基促红细胞生成素与实施例2.1的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.1产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图4中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.2巯基促红细胞生成素与实施例2.2的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.2产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图5中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.3巯基促红细胞生成素与实施例2.3的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.3产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图5中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.4巯基促红细胞生成素与实施例2.4的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例2.4产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图4中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.5巯基促红细胞生成素与实施例1.1的反应产物和交联化合物的反应
向在80℃温育17小时以及25℃温育3天根据实施例1.1产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAs。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图5中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.6巯基促红细胞生成素与实施例1.3的反应产物和交联化合物的反应
向在80℃温育17小时以及25℃温育3天根据实施例1.3产生并且溶解于200μl 0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HEs衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(SigmaAldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去剩余的AMAs。
向剩余的溶液中加入15μg根据实施例5产生的巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图5中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.7巯基促红细胞生成素与实施例3.1的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例3.1产生并且溶解于200μl磷酸钠缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液，将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德国)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图6中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.8巯基促红细胞生成素与实施例3.2的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例3.2产生并且溶解于200μl磷酸盐缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，D)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图6中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.9巯基促红细胞生成素与实施例3.3的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例3.3产生并且溶解于200μl磷酸盐缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德国)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图6中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.10巯基促红细胞生成素与实施例3.4的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例3.4产生并且溶解于200μl磷酸盐缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。将澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德国)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图6中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.11巯基促红细胞生成素与实施例3.5的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例3.5产生并且溶解于200μl磷酸盐缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德国)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图6中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例7.12巯基促红细胞生成素与实施例3.6的反应产物和交联化合物的反应
向根据实施例3.6产生并且溶解于200μl磷酸盐缓冲液(0.1M，9.15M NaCl，50mM EDTA，pH7.2)中的50nmol HES衍生物中加入10μl 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)在DMSO中的溶液。澄清溶液在25℃下温育80分钟，在40℃下温育20分钟。使用VIVASPIN 0.5ml浓缩器，5KD MWCO(VIVASCIENCE，Hannover，德国)，以13,000rpm离心过滤，并用磷酸盐缓冲液洗涤4次各30分钟，除去AMAS。
向剩余的溶液中加入15μg巯基EPO(1μg/μl，在磷酸盐缓冲液中)，混合物在25℃下温育16小时。冻干后，使用NuPAGE 10％Bis-Tris Gels/MOPS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，如Invitrogen说明书所述，通过SDS-PAGE分析粗制品。凝胶用Roti-考马斯蓝染色试剂(Roth，Karlsruhe，D)染色过夜。
实验结果在图6中显示。蛋白带向较高分子量的迁移表明偶联成功。带宽增加是由于所用HES衍生物的分子量分布和与该蛋白质连接的HES衍生物的数量。
实施例8 HES-EPO偶联物的制备性生产
概述
HES-EPO偶联物如下合成：将HES衍生物(平均分子量为18,000道尔顿；羟乙基取代程度为0.4)与重组人EPO的寡糖链上部分氧化(温和的高碘酸盐)的唾液酸残基偶联。根据碳水化合物结构分析，引入的修饰不影响核心寡糖链的结构完整性，因为经弱酸处理的HES-修饰聚糖的MALDI/TOF-MS显示完整的中性N-乙酰基乳糖胺型链，它与未修饰的EPO产物中所见的链无法区分。获得的结果表明，对于预先没有部分去除唾液酸而进行修饰的EPO制品，每个EPO分子至少连接3个修饰的HES残基。缺少前述蛋白质中约50％唾液酸残基的EPO变体在SDS-PAGE中显示类似的高表观分子量迁移率(60-110 KDa比BRP EPO标准的40KDa)。在室温和pH3-10下的标准离子交换层析条件下，HES修饰的EPO稳定。
在红细胞正常的小鼠系中进行EPO生物检测，根据欧洲药典用紫外线吸收值测定蛋白质，RP-HPLC测定EPO蛋白质并经BRP EPO标准制品校准，在该检测中，HES修饰的EPO具有比国际BRP EPO参照标准高2.5-3.0倍的比活性(IU/mg)。
实施例8.1材料与方法
(a)通过N-糖苷酶消化释放N-连接的寡糖
样品与25单位(根据德国Roche Diagnostics的厂商说明书)重组PNGase F在37℃下温育过夜。根据SDS-PAGE中的蛋白质比迁移率的位移来监测完全消化。通过加入3倍体积的冷100％乙醇，并在-20℃下放置至少2小时，从多肽中分离释放的N-聚糖(Schroeter S等人，1999)。通过在4℃下以13000rpm离心10分钟除去沉淀的蛋白质。然后用500μl冰冷的75％乙醇再洗涤沉淀两次。合并上清液中的寡糖在真空离心机(Speed Vac浓缩器，Savant Instruments Inc.，USA)中干燥。聚糖样品在使用前用Hypercarb柱(25mg或100mg HyperCarb)如下脱盐：柱用500μl溶于0.1％TFA中的80％乙腈(v/v)洗涤3次，随后用500μl水洗涤3次。样品用水稀释至终体积为300μl-600μl，之后上柱，然后用水充分洗涤。寡糖用1.2ml(25mg柱；对于100mg柱为1.8ml)含有0.1％三氟乙酸(v/v)的25％乙腈水溶液洗脱。洗脱的寡糖用2M NH4OH中和，在Speed Vac浓缩器中干燥。在某些情况下，通过将总(糖)蛋白样品＜100μg的消化混合物吸附到100mgHypercarb柱上，对N-糖苷酶释放的寡糖进行脱盐。
(b)通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI/TOF/TOF-MS)对寡糖的分析
使用Bruker ULTRAFLEX飞行时间(TOF/TOF)仪器：在阳离子及阴离子模式中使用2，5-二羟基苯甲酸作为紫外线吸收材料，在两种模式中均使用反射器(reflectron)，分析天然去唾液酸化的寡糖。对于MS-MS分析，选择母离子进行激光诱导的解离(LID)，获得的碎片离子用仪器的第二TOF阶段(LIFT)分离。浓度约为1-10pmol.μl-1的1μl样品溶液与等量的各自的基质混合。将该混合物点样到不锈钢靶上，分析前在室温下干燥。
实施例8.2重组人EPO(EPO-GT-1)的制备和鉴定
如(Mueller PP等人，1999，Dorner AJ等人，1984)所述由重组CHO细胞表达EPO，根据欧洲药典所述的方法鉴定这些制品(Ph.Eur.4，Monography 01/2002：1316：Erythropoietin concentratedsolution)。终产物的唾液酸含量为每nMol蛋白质12nMol(+/-1.5nMol)。N-连接寡糖的结构如(Nimtz等人，1999，Grabenhorst，1999)所述通过HPAEC-PAD和MALDI/TOF-MS测定。获得的EPO制品含有二、三、四唾液酸化的寡糖(分别为2-12％、15-28％和60-80％，少量存在硫酸化和五唾液酸化链)。EPO制品的总糖基化特征类似于国际BRPEPO标准制品。
重组EPO的等电聚焦图案与国际BRP参照EPO标准制品相当，表明是相应的同种型。25％的EPO蛋白在多肽链的Ser126处缺乏O-糖基化。
实施例8.3部分去唾液酸化的EPO型的制备
EPO GT-1蛋白(2.84mg/ml)在20mM磷酸钠缓冲液pH7.0中加热到80℃，然后每1ml EPO溶液加入100μl 1N H2SO4；分别继续温育5分钟、10分钟、60分钟，产生不同唾液酸化程度的EPO制品。用多肽N-糖苷酶释放寡糖后对含有0-4个唾液酸的寡糖进行定量，通过用Hypercarb柱(25mg HyperSep Hypercarb；Thermo-Hypersil-Keystone，UK)脱盐进行N-连接链的分离。加入1N NaOH中和EPO制品，在液氮中冷冻，贮存于-20℃，直到下一步使用。
实施例8.4唾液酸化EPO型的高碘酸盐氧化
向溶解于3.5ml 20mM磷酸钠缓冲液pH7.0中的10mg未处理或弱酸处理的EPO中加入1.5ml 0.1M乙酸钠缓冲液pH5.5，混合物在冰浴中冷却到0℃；加入500μl 10mM高碘酸钠，反应混合物在0℃下在暗处保持60分钟。加入10μl甘油，在暗处继续温育10分钟。使用VIVASPIN浓缩器(10,000MWCO，PES Vivascience AG，Hannover，德国)，根据厂商推荐，在配备固定角转子的实验室离心机中以3000rpm脱盐，从试剂中分离部分氧化的EPO型。在液氮中冷冻后，EPO制品以4ml的终体积贮存于-20℃。
对100μg等份的部分氧化的EPO制品进行N-糖苷酶处理，寡糖如上所述用Hypercarb柱分离。寡糖通过弱酸处理去唾液酸化，用HPAEC-PAD分析，它们的保留时间与如(Nimtz等人，1990和1993)所述的可信标准寡糖相当。
实施例8.5用二硫赤藓糖醇还原EPO二硫醚
在30mM二硫赤藓糖醇(DTT)存在下，5mg EPO-GT-1在5ml 0.1M Tris/HCl缓冲液pH8.1中温育，37℃温育60分钟；使用Vivaspin浓缩器在4℃下除去DTT，更换缓冲液4个循环。最终的还原EPO制品冷冻于液氮中，在50mM乙酸钠缓冲液pH5.5中贮存于-20℃。
实施例8.6EPO蛋白测定
EPO蛋白的定量测定如下进行：根据欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia 4，Monography 01/2002：1316：Erythropoietinconcentrated solution)，在1cm径长的比色杯中测定280nm处的紫外线吸光度。另外，也可以使用RP-C4柱(Vydac Protein C4，目录号214TP5410，Grace Vydac，Ca，US)，通过RP-HPLC方法定量EPO；HPLC方法用促红细胞生成素BRP 1参照标准校准(EuropeanPharmacopoeia，Conseil de l′Europe B.P.907-F67029，StrasbourgCedex 1)。
实施例8.7用半乳糖氧化酶氧化去唾液酸化的EPO
在16μl过氧化氢酶(6214单位/200ml)和80μl半乳糖氧化酶(2250单位/ml，来自Dactylium dendroides(Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)存在下，4.485mg完全去唾液酸化的EPO在20mM磷酸钠缓冲液pH6.8中温育，37℃过夜；在温育开始4小时和8小时后分两次加入20μl半乳糖氧化酶。
实施例8.8用于生物检测的EPO样品的制备
通过高碘酸盐或半乳糖氧化酶氧化的EPO蛋白制品与活化的HES温育，纯化EPO
EPO样品的纯化(除去未反应的HES衍生物)在室温下进行。EPO温育混合物(约5mg EPO蛋白)用缓冲液A(20mM N-吗啉丙烷磺酸[MOPS/NaOH]，在双蒸水中，pH8.0)1∶10稀释，以0.5ml/min的流速上样到用10倍柱体积(CV)缓冲液A平衡的含有3ml Q-SepharoseHP(Pharmacia编号17-1014-03，批号220211)的柱上。用6-8倍柱体积的缓冲液A洗柱(流速＝0.8ml/min)，使用缓冲液B(20mM吗啉乙磺酸[MES/NaOH]，0.5M NaCl，在双蒸水中，pH6.5)以0.5ml/min的流速进行洗脱。根据280nm的紫外线吸光度检测EPO，洗脱到约6ml中。柱用3倍柱体积的缓冲液C(20mM MES，1.5M NaCl，在H2O中，调节为pH6.5)再生，用10倍柱体积的缓冲液A再平衡(流速＝0.7ml/min)。
用Vivaspin浓缩器和磷酸盐缓冲盐水(PBS)对Q-Sepharose步骤获得的EPO洗脱物进行缓冲液更换，每个样品进行3个离心循环；样品用PBS调节为2ml，贮存于-20℃。
从Q-Sepharose洗脱物中只获得＜25％的部分唾液酸化、随后温和高碘酸盐氧化的HES修饰的EPO型，因为在采用的条件下，基础EPO型不结合Q-Sepharose并发现与未反应的HES衍生物一起出现在穿流液中。
实施例8.9采用脉冲安培检测的高pH阴离子交换层析(HPAEC-PAD)
使用配备CarboPac PA1柱(0.4×25cm)的Dionex BioLC系统(Dionex，USA)，通过高pH阴离子交换(HPAE)层析以及脉冲安培检测器(PAD)，分析纯化的天然及去唾液酸化的寡糖(Schroter等人，1999；Nimtz等人，1999)。检测器电势(E)和脉冲持续时间(T)为：E1：+50mV，T1：480ms；E2：+500mV，T2：120ms；E3：-500mV，T3：60ms，输出范围为500-1500nA。然后将寡糖注射到用100％溶剂A平衡的CarboPac PA1柱上。对于去唾液酸化的寡糖，在40分钟内使用溶剂B的线性梯度(0-20％)，随后在5分钟内将溶剂B从20％线性提高到100％，进行洗脱(流速：1ml·min-1)。溶剂A是溶于双蒸水的0.2MNaOH，溶剂B由溶于溶剂A的0.6M NaOAc组成。对于天然寡糖，柱子用100％溶剂C(0.1M NaOH，溶于双蒸水)平衡，在48分钟内使用线性梯度(0-35％)的溶剂D，随后在10分钟内将溶剂D从35％线性提高到100％，进行洗脱(流速：1ml·min-1)。溶剂D由溶于溶剂C的0.6MNaAc组成。
实施例8.10通过GC-MS对N-聚糖、HES-修饰的N-聚糖和EPO蛋白进行单糖组成分析
在甲醇分解、N-再乙酰化和三甲基硅烷化后，通过GC/MS[Chaplin，M.F.(1982)一种快速、灵敏的碳水化合物分析方法.Anal.Biochem.123，336-341]以相应甲基糖苷的形式分析单糖。这些分析用Finnigan GCQ离子阱质谱仪(Finnigan MAT corp.，San Jose，CA)进行，其配备一个30m DB5毛细管柱，以阳离子E I模式运行。温度程序：80℃恒温2min，然后每分钟升高10度，至300℃。
根据保留时间和特有的断裂模式鉴定单糖。未校正的电子峰积分的结果用于定量。由于正位异构性和/或存在呋喃型和吡喃型而产生一个以上峰的单糖通过加和所有主峰来定量。0.5μg肌醇用作内部标准化合物。
实施例8.11结果
实施例8.11(a)弱酸处理的(部分去唾液酸化的)EPO-GT-1的N-聚糖的鉴定
如图7所示，在与N-糖苷酶温育释放N-连接寡糖之前及之后，通过SDS-PAGE分析弱酸处理5、10或60分钟的EPO-GT-1制品。对N-连接寡糖进行HPAEC-PAD寡糖作图(图8)。未处理的EPO-GT-1含有＞90％的具有3或4个唾液酸残基的N-连接寡糖，而在弱酸存在下温育5分钟后，＜40％的碳水化合物链含有3或4个唾液酸残基。去唾液酸化N-聚糖的HPAEC-PAD显示，检测的未处理EPO-GT-1的中性寡糖比例在酸处理5、10或60分钟的制品中保持稳定。去唾液酸化聚糖的MALDI/TOF-MS显示，在弱酸处理蛋白质后存在＜90％的近端岩藻糖。
实施例8.11(b)高碘酸盐处理的EPO-GT-1的鉴定
对于预先酸处理5分钟和10分钟或者不予处理的温和高碘酸盐处理的EPO型，在图10中比较它们的SDS-PAGE迁移率。高碘酸盐氧化唾液酸所采用的条件不改变EPO制品的SDS-PAGE图案(比较图7)。唾液酸的氧化在HPAEC-PAD分析中导致寡糖向较早的洗脱时间迁移(比较图8和11)。
实施例8.11(c)HES-修饰的EPO衍生物的鉴定
(aa)用根据实施例2.4产生的羟胺修饰的HES衍生物X对EPO-GT-1-A进行HES修饰的时程(time course)
将400μg羟胺修饰的HES衍生物X加入溶于20μL 0.5M NaOAc缓冲液pH5.5中的20μg EPO-GT-1-A(温和高碘酸盐氧化的EPO，在温和高碘酸盐氧化之前未经酸水解)中，分别在30分钟、2、4、17小时后，通过将样品冷冻于液氮中，终止反应。随后将样品贮存于-20℃，直到进一步分析。
加入SDS-PAGE样品缓冲液，将样品加热到90℃，加样到SDS-凝胶上。如图12所示，温育时间延长导致向较高分子量蛋白质的迁移增加。在羟胺修饰的HES衍生物X存在下温育17小时后，检测到一条弥散的考马斯蓝染色的蛋白带，根据分子量标准的位置，它在60-11KDa之间的区域迁移(见图12的左部分)。用N-糖苷酶处理后，大多数蛋白质向去-N-糖基化EPO的位置迁移(见图12，右侧凝胶；箭头A表示N-糖苷酶的迁移位置；箭头B表示去-N-糖基化EPO的位置；推定在28KDa与36KDa分子量标准之间区域内所见的弥散蛋白带代表在分子的O-糖基化位点被HES修饰的EPO型。关于N-糖苷酶的特异性，我们由该结果得出结论，实际上HES-修饰发生在EPO蛋白的聚糖之高碘酸盐氧化的唾液酸残基处。
(bb)HES-EPO偶联物的鉴定
HES-EPO偶联物I(来源于温和高碘酸盐氧化后的EPO-GT-1，即来源于EPO-GT-1-A)、II(来源于酸水解5分钟且温和高碘酸盐氧化的EPO-GT-1)、III(来源于酸水解10分钟且温和高碘酸盐氧化的EPO-GT-1)如前所述合成。包括在相同缓冲液条件下的对照温育(K)，其中包括未修饰的EPO-GT-1，并加入等量的未修饰的HES。为了随后进行HES-EPO衍生物的生物化学分析，进一步纯化这些温育混合物。
HES-EPO偶联物I、II和III以及对照温育K的温育物如“材料与方法”(实施例8.8)所述进行Q-Sepharose纯化步骤，以除去过量的未反应HES试剂，后者预计出现在离子交换柱的穿流液中。由于在预先酸处理的样品II和III中含有大量的基础EPO型，我们预计在穿流液中含有来自这些温育物的相当量的修饰的EPO产物。如图13所示，几乎所有来源于样品I的EPO都被Q-Sepharose柱保留，而样品III和II中只有约20-30％被回收到用高盐浓度洗脱的级分中。在SDS-PAGE中，与对照EPO相比，在穿流液和用高盐洗脱的级分中，与HES衍生物X温育产生的所有蛋白质物质都具有更高的表观分子量。
为了更详细地鉴定HES-修饰的EPO，将样品A和K(见图11)，与高碘酸盐氧化形式EPO-GT-1-A进行比较。对样品进行N-糖苷酶处理，如图14a和14b所示，N-聚糖的释放在标准EPO制品的O-糖基化和非糖基化EPO型的位置处产生两条低分子量带。对于样品A，检测到另一条在28KDa分子量标准位置处迁移的带，提示在该EPO变体的O-聚糖处发生HES-修饰(参见实施例8.11(c)(aa))。在样品温和水解后，这条带(以及高度HES-修饰的高分子量形式的N-糖基化EPO，见图14a和14b)消失，这与在促红细胞生成素的高碘酸盐氧化的唾液酸残基处发生HES修饰的看法一致。
使用能够从寡糖上完全除去唾液酸残基(以及唾液酸连接的HES衍生物)的条件，水解N-糖苷酶温育混合物等份；中和后，将混合物吸附到小Hypercarb柱上进行脱盐。用水充分洗涤该柱，随后用含有0.1％三氟乙酸的40％乙腈水溶液洗脱结合的中性寡糖。对产生的寡糖进行MALDI/TOF-MS。来自样品A、EPO-GT-1-A和样品K的去唾液酸化寡糖级分的波谱显示复杂型寡糖的相同质量数：m/z＝1810Da(二分支)、2175＝三分支、2540＝四分支、2906＝四分支+1个N-乙酰基乳糖胺重复、3271＝四分支+2个N-乙酰基乳糖胺重复；检测到对应于缺乏岩藻糖(-146)和半乳糖(-162)的弱信号，这可归因于去除唾液酸所使用的酸水解条件(见MALDI-图17、18、19)。
在一个平行实验中，将N-糖苷酶消化混合物吸附到1ml RP-C18柱上(寡糖没有预先用酸水解)，用含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液进行洗脱；在这些条件下，EPO蛋白完全保留在RP-材料上，用含有0.1％TFA的5％乙腈水溶液从柱上洗下寡糖。用含有0.1％TFA的70％乙腈水溶液洗脱去-N-糖基化的EPO蛋白。中和N-糖苷酶处理的样品A、EPOGT-1-A和样品K经过RP-C18步骤后获得的寡糖级分，如前所述用Hypercarb柱脱盐。在能够从聚糖上定量除去唾液酸的条件下进行弱酸处理之前(见图15)及之后(见图16)，对分离的寡糖进行HPAEC-PAD作图。
从HES修饰的样品A中所得天然物质的HPAEC-PAD图只显示可以忽略的寡糖信号，而EPOGT-1-A-衍生的寡糖显示与图11所示样品(称为温和高碘酸盐处理后的EPO-GT-1样品)相同的聚糖谱。由对照EPO样品(K)获得的寡糖的洗脱图产生预期的图案(比较图8的图)。为了比较，包括了用于比较和作为参照标准的国际BRP-EPO标准的天然寡糖谱。
在弱酸水解后，所有寡糖制品都显示相同的中性寡糖结构的洗脱图(见图16)，该结构具有二、三、四分支复杂型碳水化合物链的定性和定量组成，如作为本研究初始材料的EPO制品的方法部分所述。该结果证实，EPO样品的HES-修饰导致HES衍生物的共价连接，该衍生物可以用N-糖苷酶从EPO-蛋白质上分离下来，使用去唾液酸化碳水化合物的弱酸处理条件可以将其从N-聚糖上去除(见图14a+b)，因此该衍生物是酸不稳定的。
(cc)通过GC-MS对HES-EPO和HES-EPO N-聚糖进行的单糖组成分析
为了进一步证实EPO在分子N-聚糖处的HES-修饰，用N-糖苷酶消化EPO样品，EPO蛋白被吸附到RP-C18柱上，而寡糖物质如上所述洗掉。如表2所示，只在半胱氨酸残基处HES修饰的EPO蛋白中和EPO样品A2的寡糖级分中检测到葡萄糖和羟乙基化葡萄糖衍生物。
实施例8.11(d)HES-修饰的EPO的体内生物活性检测
按照欧洲药典所述方法在红细胞正常的小鼠系中进行EPO生物检测；进行EPO检测的实验室使用国际BRP EPO参照标准制品。对于HES-修饰的EPO A2制品，测得比活性平均值为每mg EPO蛋白294600单位，表明与同样进行活性测定的包括国际BRP EPO参照标准制品的样品相比，比活性约高3倍。
研究结果总结于表3中。
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Anal Biochem.1992 Jun；203(2)：281-9
Schroter S，DerrP，Conradt HS，Nimtz M，Hale G，KirchhoffC.
Male specific modification of human CD52.
J Biol Chem.1999 Oct.15；274(42)：29862-73
实施例9
重组EPO的生产
A)在哺乳动物细胞中的生产
重组EPO如下在CHO细胞中生产：
将携带人EPO cDNA的质粒克隆到真核表达载体中(pCR3，在下文中称为pCREPO)。如述利用标准方法进行定点诱变(Grabenhorst，Nimtz，Costa等人，1998，In vivo specificity of human alpha1，3/4-fucosyltransferases III-VII in the biosynthesis of Lewis(x)and sialyl Lewis(x)motifs on complex-type N-glycans-Coexpression studies from BHK-21 cells together with humanbeta-trace protein，J.Biol.Chem.，273(47)，30985-30994)。
稳定表达人EPO或其氨基酸变体(例如Cys-29→Ser/Ala，或Cys-33→Ser/Ala，Ser-126→Ala等)的CHO细胞用磷酸钙沉淀法产生，如(Grabenhorst等人)所述用硫酸G418筛选。转染三天后，将细胞1∶5传代培养，在含有10％FBS和1.5g/l硫酸G418的DMEM中筛选。
采用这种筛选操作，通常有100-500个克隆存活，在选择培养基中再繁殖2-3周。然后通过Westernblot和IEF/Western Blot分析汇合生长成单层的细胞培养上清液的EPO表达水平。
EPO由稳定的亚克隆在旋转培养瓶中或者在21灌注反应器(perfusion reactors)中产生。按照发表的方案，含有不同数量NeuAc(例如2-8、4-10、8-12个NeuAc残基)的EPO的不同糖型(glycoform)使用如下所述的多种层析法的组合分离。
文献：
Grabenhorst，Conradt，1999，Thecytoplasmic，transmembrane，and stem regions of glycosyltransferases specify their in vivofunctional sublocalization and stability in-the Golgi.，J BiolChem.，274(51)，36107-16；Grabenhorst，Schlenke，Pohl，Nimtz，Conradt，1999，Genetic engineering of recombinantglycoproteins and theglycosylation pathway in mammalian hostcells，Glycoconj J.，16(2)，81-97；Mueller，Schlenke，Nimtz，Conradt，Hauser，1999，Recombinant glycoprotein productquality in proliferation-controlled BHK-21 cells，Biotechnology and bioengineering，65(5)，529-536；Schlenke，Grabenhorst，Nimtz，Conradt，1999，Construction andcharacterization of stably transfected BHK-21 cells withhuman-type sialylation characteristic，Cytotechnology，30(1-3)，17-25。
B)在昆虫细胞中的生产
如文献所述，用含有处于多角体蛋白启动子控制下的人EPO cDNA的重组杆状病毒载体转染细胞后，由昆虫细胞系SF9和SF 21产生重组人EPO。
在无血清培养基中生长的细胞以2×106或2×107个细胞/mL的细胞密度转染，每天测定细胞培养上清液中的EPO滴度。EPO通过Bluesepharose层析、Q-Sepharose上的离子交换层析，最后通过C4相上的RP-HPLC纯化。
产物的纯度通过SDS-PAGE和N末端测序证实。详细的碳水化合物结构分析(N-和O-糖基化)按照发表的操作进行。
文献：
Grabenhorst，Hofer，Nimtz，Jager，Conradt，1993，Biosynthesis and secretion of human interleukin 2glycoproteinvariants from baculovirus-infected S21 cells.Characterizationof polypeptides and posttranslational modifications，Eur JBiochem.，215(1)，189-97；Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-level expression and purification of a recombinanthuman erythropoietin produced using a baculovirus vector，Blood，74(2)，652-7
实施例10
反应性HES衍生物的形成
1.SH-反应性HES
1.1EMCH与氧代-HES12KD反应，形成SH-反应性HES12KD B
将0.144g(0.012mmol)氧代-HES12KD(Fresenius GermanPatent DE 196 28 705 A1)溶解于0.3mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至34mg(0.15mmol)EMCH(Perbio Science，Deutschland GmbH，Bonn，德国)在1.5mL DMSO中的混合物中。在60℃下搅拌19小时后，将反应混合物加至16mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀，再溶解于3mL DMSO中，如上所述再次沉淀。通过离心及真空干燥获得SH-反应性HES12KD B。与巯基-EPO的偶联反应在实施例11的2.2中描述。
备选方案：
在该反应中可以使用具有被间隔区隔开的酰肼和马来酰亚氨基官能团的所有交联剂。表1列出了可从Perbio Science，DeutschlandGmbH，Bonn，德国获得的这类分子的另外一些实施例；用“A”标记。此外，也可以使用具有活化的二硫基代替马来酰亚氨基的另外一类交联剂。
1.2HES糖基胺的卤代乙酰胺衍生物
a)糖基胺的形成1
将1mg HES12KD样品溶解于3mL饱和碳酸氢铵中。然后另外加入固体碳酸氢铵，以使溶液在30℃ 120小时的温育过程中保持饱和。通过直接冻干反应混合物对氨基-HES12KD C脱盐。
b)用氯乙酸酐酰化糖基胺C
将1mg氨基-HES12KD C样品溶解于1mL 1M碳酸氢钠中，在冰上冷却。加入固体氯乙酸酐晶体(～5mg)，使反应混合物升温至室温。监测pH，如果pH下降到7.0以下则另外加入碱。在室温下2小时后，加入第二份碱和酸酐。6小时后产物氯乙酰胺-HES D1(X＝Cl)通过混合床Amberlite MB-3(H)(OH)离子交换树脂脱盐。
c)用溴乙酸酐酰化糖基胺2
溴乙酸酐如Thomas所述制备3。将1mg氨基-HES12KD C样品溶解于0.1mL无水DMF中，在冰上冷却，加入5mg溴乙酸酐。使反应混合物缓慢升温至室温，搅拌溶液3小时。在-20℃下将反应混合物加至1mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀，再溶解于0.1mL DMF中，如上所述再次沉淀。通过离心及真空干燥获得溴乙酰胺-HES D2(X＝Br)。与巯基-EPO的偶联反应在实施例11的1.2中描述。
1Manger，Wong，Rademacher，Dwek，1992，Biochemistry，31，10733-10740；Manger，Rademacher，Dwek，1992，Biochemistry，31，10724-10732
2Black，Kiss，Tull，Withers，1993，Carbohydr.Res.，250，195
3Thomas，1977，Methodes Enymol.，46，362
d)相应的碘衍生物D3(X＝I)按合成D2的所述方法合成。使用碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯代替溴乙酸酐，所有步骤都避光进行。
Figure A0382146501051
备选方案：
对于氨基的酰化，可以使用卤素和酸的其它活化形式，例如
--酰溴或-酰氯
-酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，与取代酚的酯(对硝基酚、五氟酚、三氯酚等)
此外，也可以使用含有被间隔区隔开的反应性氨基和卤代乙酰基的所有交联剂。一个例子是SBAP。该分子及其它一些分子可获自Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国。它们在表1中用“D”标记。关于不需要分离卤代乙酰胺-HES衍生物就可以连接氨基-HES与巯基-EPO的交联剂，见实施例11中1.2的描述。
1.3氨基-HES E的卤代乙酰胺衍生物1
a)1，4-二氨基丁烷与氧代-HES12KD反应，产生氨基-HES12KD E4
将1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至1.51mL(15mmol)1，4-二氨基丁烷在15mL DMSO中的混合物中。在40℃下搅拌19小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀氨基-HES12KDE，再溶解于40mL水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。
Figure A0382146501061
b)氯乙酰胺-HES12KD F1按以上1.3中氯乙酰胺-HES12KD D1所述方法制备。
c)溴乙酰胺-HES12KD F2(X＝Br)按上述1.3中制备溴乙酰胺-HES12KD D2的所述方法制备。与巯基-EPO的偶联反应在实施例11的1.2中描述。
d)相应的碘衍生物F3(X＝I)在与巯基-EPO反应之前不分离。实验在实施例11的1.1中描述。
备选方案：
参见上文1.2。
4S.Frie，Diplomarbeit，Fachhochschule Hamburg，1998
2.CHO-反应性HES
2.1酰肼-HES
Figure A0382146501062
a)酰肼与氧代-HES12KD的反应
将1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至0.47mL(15mmol)酰肼在15mL DMSO中的混合物中。在40℃下搅拌19小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀产物J，再溶解于40mL水中，用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。与氧化的Glyco-EPO的偶联反应在实施例12的2.2中描述。
b)己二酸二酰肼与氧代-HES12KD的反应
在65℃下将1.74g(15mmol)己二酸二酰肼溶解于20mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加入溶解于3mL无水DMSO中的1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD。在60℃下搅拌68小时后，将反应混合物加至200mL水中。含有L的溶液用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。与氧化的Glyco-EPO的偶联反应在实施例12的2.2中描述。
备选方案：
此外，也可以使用2个酰肼基被任何间隔区分隔的衍生物。
3.另外的氨基-HES12KD衍生物I和H1
D或F的氨解如下分开进行：将各1mg卤代乙酰胺样品溶解于0.1mL饱和碳酸铵中。然后加入另外的固体碳酸铵，以使溶液在30℃120小时的温育过程中保持饱和。在-20℃下将反应混合物加至1mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀物，再溶解于0.05mL水中，如上所述再次沉淀。通过离心及真空干燥获得产物氨基HES H或I。与氧化的Glyco-EPO的偶联反应在实施例12的4.1中描述。
4.羟胺修饰的HES12KD K
O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺如Boturyn等人所述用可购得的材料通过两步合成5。将1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至2.04g(15mmol)O-[2-(2-氨氧基-乙氧基)-乙基]-羟胺在15mL DMSO中的混合物中。在65℃下搅拌48小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀产物K，再溶解于40mL水中，用水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。与氧化的Glyco-EPO的偶联反应在实施例12的3.1中描述。
备选方案：
此外，也可以使用两个羟胺基团被任何间隔区隔开的衍生物。
5Boturyn，Boudali，Constant，Defrancq，Lhomme，1997，Tetrahedron，53，5485
5.巯基-HES12KD
5.1向氧代-HES12KD中添加
将1.44g(0.12mmol)氧代-HES12KD溶解于3mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至1.16g(15mmol)巯乙胺在15mL DMSO中的混合物中。在40℃下搅拌24小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀产物M，再溶解于40mL水中，用0.5％(v/v)三乙胺水溶液透析2天，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。与氧化的Glyco-EPO的偶联反应在实施例12的2.1中描述。
备选方案：
也可以使用氨基和巯基被任何分隔区隔开的衍生物。此外，衍生物中的氨基也能够被置换为肼、酰肼或羟胺。巯基可以用例如二硫醚或三苯甲基衍生物的形式受到保护。但在这种情况下，在偶联之前必须进行额外的脱保护步骤，该步骤将释放一种类似于M的成分。
5.2氨基HES12KD E、H或I的修饰
a)用SATA/SATP修饰
将1.44g(0.12mmol)氨基-HES12KD E、H或I溶解于3mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至139mg(0.6mmol)SATA在5mL DMSO中的混合物中。在室温下搅拌24小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀产物N，再溶解于40mL水中，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。
脱保护在含有25mM EDTA和0.5M羟胺的50mM磷酸钠缓冲液pH7.5中进行，室温下2小时，通过用含有1mM EDTA的0.1M乙酸钠缓冲液pH5.5透析来纯化产物O。在脱保护反应之后立即进行实施例12的2.1中描述的偶联反应。
b)用SPDP修饰
将1.44g(0.12mmol)氨基-HES12KD E、H或I溶解于3mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在氮气下逐滴加至187mg(0.6mmol)SPDP在5mL DMSO中的混合物中。在室温下搅拌24小时后，将反应混合物加至160mL乙醇与丙酮的1∶1混合物中。离心收集沉淀产物P，再溶解于40mL水中，用水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5KD截留分子量，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国)，冻干。
脱保护在每0.5mL含有12mg二硫苏糖醇(DTT)的100mM乙酸钠缓冲液(含100mM氯化钠)pH4.5中进行，室温下30分钟，通过用含有1mM EDTA的0.1M乙酸钠缓冲液pH5.5透析来纯化产物Q。在脱保护反应之后立即进行实施例12的2.1中描述的偶联反应。
备选方案：
对于氨基向游离形式或受保护的硫醇基的转化，可以使用几种试剂。在修饰后，可以分离产物。此外，关于交联剂的使用，它们可以直接用于偶联反应，优选在纯化步骤之后使用。合成受保护形式的巯基-HES衍生物可以用于分离和贮存巯基-HES衍生物。为此，可以使用类似于SATA的所有衍生物，它们含有被任何间隔区隔开的活性酯官能团和硫酯官能团。表1中的SATP(用“H”标记)是该类的另外一个成员。与SPDP类似的衍生物可能含有被任何间隔区隔开的活性酯官能团和二硫官能团。表2中可见这些类的其它一些成员，用“F”标记。其它类似的衍生物可能含有被任何间隔区隔开的活性酯官能团和作为三苯甲基衍生物而受到保护的硫醇官能团。
实施例11
与巯基-EPO的偶联反应
1.巯基-EPO与卤代乙酰胺修饰的SH-反应性HES的反应
1.1实施例方案1
使用含有NHS-活性酯和碘乙酰胺基团的交联剂例如SIA，偶联巯基-EPO与氨基-HES12KD(E、H或I)6
材料
A.硼酸盐缓冲液。组成为50mM硼酸钠，pH8.3，5mM EDTA。
B.PBS，磷酸盐缓冲盐水：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4。
C.氨基-HES12KD E、H或I。在硼酸盐缓冲液中以1mg/mL制备。
D.交联剂贮存液：14mg SIA溶解于1mL DMSO中。
E.D-SaltTM葡聚糖脱盐柱，2×5mL柱床体积(Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德国)
F.Coomassie蛋白质检测试剂(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德国)
G.巯基EPO溶液：5mg/mL巯基EPO 1，在硼酸盐缓冲液中
H.微量浓缩器：Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德国)
6Cumber，Forrester，Foxwell，Ross，Thorpe，1985，MethodsEnrymol.，112，207
方法
将100μL SIA溶液加至400μL氨基HES12KD E溶液中，在室温下搅拌使之反应0.5小时。用微量浓缩器以14000×g离心样品60分钟除去过量的交联剂。离心后，用硼酸盐缓冲液使样品达到其初始体积，该步骤重复两次以上。将剩余溶液加至1mL巯基EPO溶液中，反应混合物在室温下温育16小时。在温育结束时，通过加入半胱氨酸至终浓度为10mM来终止过量碘乙酰胺的反应性。将反应混合物上样到用PBS缓冲液平衡的脱盐柱上，用Coomassie蛋白质检测试剂监测级分的蛋白质含量。合并含有蛋白质偶联物的所有级分，在用水透析过夜后通过冻干获得偶联物。
备选方案：
在该反应中，可以使用含有被间隔区隔开的琥珀酰亚胺或硫代琥珀酰亚胺官能团和碘乙酰胺官能团的所有交联剂。表1中可见其它一些实例。它们用“C”标记，可获自Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，德国。
1.2实施例方案2
巯基EPO1与SH反应性HES12KD溴乙酰胺D2、F2或碘乙酰胺D3的偶联7
材料
A.磷酸盐缓冲液：组成为100mM磷酸钠，pH6.1，5mM EDTA。
B.PBS，磷酸盐缓冲盐水：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4。
C.SH反应性HES12KD溴乙酰胺D2。在磷酸盐缓冲液中以10mg/mL制备。
D.D-SaltTM葡聚糖脱盐柱，2×5mL柱床体积(Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德国)
E.Coomassie蛋白质检测试剂(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德国)
F.巯基EPO溶液：5mg/mL巯基EPO1，在磷酸盐缓冲液中
7de Valasco，Merkus，Anderton，Verheul，Lizzio，Vander Zee，van Eden，Hoffmann，Verhoef，Method Snippe，1995，Infect.Immun.，63，961
方法
1mL SH反应性HES12KD溴乙酰胺D2溶液与1mL巯基-EPO溶液混合，反应混合物在室温下温育48小时。在温育结束时，通过加入半胱氨酸至终浓度为10mM来破坏过量溴乙酰胺的反应性。将反应混合物上样到用PBS缓冲液平衡的脱盐柱上。用Coomassie蛋白质检测试剂监测级分的蛋白质含量，合并含有蛋白质偶联物的所有级分，在用水透析过夜后通过冻干获得偶联物。
备选方案：
代替SH反应性HES12KD-溴乙酰胺D2的分离，氨基HES12KD(E，H，I)能够通过琥珀酰亚胺和溴乙酰胺官能团与交联剂连接(见上文1.1)。SBAP是这类交联剂的一个成员，在表1中可见，用“D”标记。
2.巯基-EPO与马来酰亚胺修饰的SH反应性HES的反应
2.1实施例方案4
巯基EPO与马来酰亚氨基-HES12KD B的偶联
材料
A.马来酰亚氨基-HES12KD B：10mg/mL，在0.1M乙酸钠缓冲液pH5.5中
B.巯基EPO溶液：5mg/mL巯基EPO，在磷酸盐/NaCl缓冲液中
C.磷酸盐/NaCl：0.1M磷酸钠，50mM NaCl，pH7.0
D.凝胶过滤柱：例如，SephadexG-200(1.5×45cm)
E.Coomassie蛋白质检测试剂(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德国)
F.PBS，磷酸盐缓冲盐溶液：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4。
方法
1mL SH反应性HES12KD B溶液与1mL巯基EPO1溶液混合，在室温下温育2小时。在温育结束时，通过加入半胱氨酸至终浓度为10mM破坏过量马来酰亚胺的反应性。将反应混合物上样到用PBS缓冲液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL为单位收集级分。用Coomassie蛋白质检测试剂监测级分的蛋白质含量。合并含有蛋白质偶联物的所有级分，在用水透析过夜后通过冻干获得偶联物。
2.2实施例方案12
使用含有NHS-活性酯和马来酰亚胺官能团的交联剂例如SMCC，偶联巯基EPO与氨基HES12KD(E，H，I)
材料
A.微量浓缩器：Microcon YM-10(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德国)
B.PBS，磷酸盐缓冲盐水：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4
C.氨基HES12KD E、H或I。在PBS缓冲液中以10mg/mL制备。
D.SMCC溶液：1mg SMCC溶解于50μL DMSO中
E.D-SaltTM葡聚糖脱盐柱，2×5mL柱床体积(Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德国)
F.Coomassie蛋白质检测试剂(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德国)
G.巯基EPO 1溶液：5mg/mL巯基EPO 1，在PBS缓冲液中
方法
向50μL SMCC溶液中加入400μL氨基HES12KD E溶液，使反应混合物在搅拌下室温反应80分钟，在46℃下反应10分钟。通过使用微量浓缩器以14000×g离心样品60分钟除去过量的交联剂。用PBS缓冲液使体积达到450μL，该步骤重复两次以上。最后一次离心后，用PBS使剩余的溶液达到450μL，加至1mL巯基EPO溶液中，反应混合物在室温下温育16小时。在温育结束时，通过加入半胱氨酸至终浓度为10mM破坏过量马来酰亚胺的反应性。将反应混合物上样到用PBS缓冲液平衡的脱盐柱上。用Coomassie蛋白质检测试剂监测级分的蛋白质含量，合并含有蛋白质偶联物的所有级分，在用水透析过夜后通过冻干获得偶联物。
备选方案：
在该反应中，可以使用含有被间隔区隔开的琥珀酰亚胺或硫代琥珀酰亚胺官能团和马来酰亚胺官能团的所有交联剂。表1中可见这类分子的其它一些例子，用“E”标记，可以获自Perbio ScienceDeutschland GmbH，Bonn，德国。还有另外一类交联剂，它们含有活化的二硫官能团代替马来酰亚胺官能团。这些交联剂也可以用于偶联。而该偶联物的二硫键在还原条件下可以被切割。这一类的成员在表1中用“F”标记。第三类交联剂利用乙烯基砜官能团代替马来酰亚胺官能团作为SH反应性基团。这一类的一个成员是“SVSB”，在表1中用“G”标记。
实施例12
与氢化的EPO的偶联反应
1.Glyco-EPO的氧化
1.1用偏高碘酸钠氧化Glyco-EPO：实施例方案5
材料
A.Glyco-EPO溶液：10mg/mL Glyco-EPO，在乙酸缓冲液中
B.偏高碘酸钠溶液：10mM或100mM高碘酸钠，在乙酸缓冲液中新鲜制备。暗处保存。使用这些溶液时，氧化混合物中高碘酸钠的终浓度分别为1mM或10mM。
C.乙酸盐缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.5
D.甘油
E.微量浓缩器：Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德国)
方法
所有步骤都避光进行。
向1mL冷Glyco-EPO溶液中加入0.1mL冷偏高碘酸钠溶液，氧化反应避光进行1小时。如果将被氧化的Glyco-EPO含有唾液酸残基，则氧化条件是1mM高碘酸钠，0℃。否则，使用室温下10mM高碘酸钠的条件。为了终止氧化，加入甘油至终浓度为15mM，并在0℃下温育5分钟。用微量浓缩器以14000×g离心产物60分钟，除去过量的试剂和副产物。离心后，用下一修饰步骤所用的缓冲液例如乙酸盐缓冲液，使样品达到其初始体积。该步骤重复两次以上。
1.2Glyco-EPO的酶氧化：实施例方案6
EPO的酶氧化在别处有描述(Chamow等人，1992，J.Biol.Chem.，267，15916-15922)。
2.与肼/酰肼衍生物的偶联
2.1实施例方案7
用含有酰肼和马来酰亚胺官能团的交联剂例如M2C2H(PerbioScience，Deutschland GmbH，Bonn，德国)，偶联氧化的Glyco-EPO与巯基-HES12KD M、O或Q
材料
A.M2C2H贮存液：10mg/mL M2C2H，在DMSO中新鲜制备
B.6.1.1中的氧化的Glyco-EPO溶液：5mg/mL Glyco-EPO，在乙酸盐缓冲液中
C.巯基-HES12KD M、O或Q：10mg/mL，在磷酸盐/NaCl缓冲液中
D.乙酸盐缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.5
E.磷酸盐/NaCl：0.1M磷酸钠，50mM NaCl，pH7.0
F.微量浓缩器：Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH，Eschborn，德国)
G.凝胶过滤柱：例如，SephadexG-200(1.5×45cm)
H.Coomassie蛋白质检测试剂(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德国)
I.PBS，磷酸盐缓冲盐水：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4
方法
向1mL氧化的Glyco-EPO中加入M2C2H贮存液至终浓度为1mM，使之在室温搅拌下反应2小时。通过使用微量浓缩器以14000×g离心样品60分钟，除去过量的交联剂。离心后，用磷酸盐/NaCl缓冲液使样品达到其初始体积，该步骤重复两次以上。向M2C2H修饰的Glyco-EPO中加入1mL巯基-HES12KD M、O或Q溶液，反应混合物在室温下温育16小时。在温育结束时，通过加入半胱氨酸破坏过量马来酰亚胺的反应性。将反应混合物上样到用PBS缓冲液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL为单位收集级分。用Coomassie蛋白质检测试剂监测级分的蛋白质含量，合并含有蛋白质偶联物的所有级分，在用水透析过夜后通过冻干获得偶联物。
操作注意事项
腙加合物在极端pH下略不稳定。对于可能涉及低pH下处理的应用，我们用PBS缓冲液中的30mM氰基硼氢化钠处理，将腙还原为肼。对于大多数应用，这一额外的步骤是不必要的。
2.2实施例方案8
氧化的Glyco-EPO与酰肼-HES12KD L的直接偶联
材料
A.6.1.1中氧化的Glyco-EPO溶液：5mg/mL Glyco-EPO，在乙酸盐缓冲液中
B.酰肼-HES12KD L或J：10mg/mL，在乙酸盐缓冲液中
C.乙酸盐缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.5
D.凝胶过滤柱：例如，SephadexG-200(1.5×45cm)
E.Coomassie蛋白质检测试剂(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德国)
F.PBS，磷酸盐缓冲盐水：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4
方法
1mL酰肼-HES12KD L或J溶液与1mL氧化的Glyco-EPO溶液混合，反应混合物在搅拌下室温温育16小时。将反应混合物上样到用PBS缓冲液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL为单位收集级分。用Coomassie蛋白质检测试剂监测级分的蛋白质含量，合并含有蛋白质偶联物的所有级分，在用水透析过夜后通过冻干获得偶联物。偶联结果在图24中显示。观察到的分子位移证明偶联是成功的。拖尾(smear)是由于HES的不均一性引起的。图25证明HES与碳水化合物侧链的碳水化合物部分偶联。
操作注意事项
腙加合物在极端pH下略不稳定。对于可能涉及低pH下处理的应用，我们通过用PBS缓冲液中的30mM氰基硼氢化钠处理，将腙还原为肼。对于大多数应用，这一额外的步骤是不必要的。
3.与羟胺衍生物的偶联8
3.1实施例方案9
氧化的Glyco-EPO与羟氨基-HES12KD K的偶联
材料
A.来自6.1.1的氧化的Glyco-EPO溶液：5mg/mL Glyco-EPO，在乙酸盐缓冲液中
B.羟氨基-HES12KD K：10mg/mL，在乙酸盐缓冲液中
C.乙酸盐缓冲液：0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.5
D.凝胶过滤柱：例如，SephadexG-200(1.5×45cm)
E.Coomassie蛋白质检测试剂(Perbio Science DeutschlandGmbH，Bonn，德国)
F.PBS，磷酸盐缓冲盐水：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.4
方法
1mL羟氨基-HES12KDK溶液与1mL氧化的Glyco-EPO溶液混合，反应混合物在搅拌下室温温育16小时。将反应混合物上样到用PBS缓冲液平衡的SephadexG-200(1.5×45cm)上，以1mL为单位收集级分。用Coomassie蛋白质检测试剂监测级分的蛋白质含量，合并含有蛋白质偶联物的所有级分，在用水透析过夜后通过冻干获得偶联物。偶联结果在图24中显示。在2道观察到的分子位移证明偶联是成功的。拖尾(smear)是由于HES的不均一性引起的。图25证明HES与碳水化合物侧链的碳水化合物部分偶联。
8Rose，1994，Am.Chem.Soc.，116，30
实施例13
半乳糖氧化酶处理的EPO N-聚糖的鉴定
在过氧化氢酶存在下，在0.05M磷酸钠缓冲液pH7.0中，重组EPO或部分去唾液酸化的EPO型(有限弱酸水解产生的)与半乳糖氧化酶37℃温育30分钟-4小时。通过取出50μg等份EPO，随后用多肽N-聚糖酶处理蛋白质，监测反应的进展。
在除去唾液酸之前及之后，如(Grabenhorst等人，1999，Nimtz等人，1993/1994；Schlenke等人，1999)所述，对释放的N-连接寡糖(通过SDS-PAGE检测去-N-糖基化多肽进行监测)进行HPAEC-PAD作图。根据HPAEC-PAD中观察到的典型位移，定量各EPO寡糖中氧化的半乳糖残基，也通过寡糖混合物的MALDI/TOF MS证实。
实施例14
HAS修饰的EPO的鉴定
使用例如Ultrogel AcA 44/54或类似的凝胶过滤介质，通过凝胶过滤实现HAS修饰的EPO型与未反应的EPO和HAS前体分子的分离。此外也可以如下除去未反应的HAS：在含有与Affigel(BioRad)偶联的单克隆抗体的4mL柱上免疫亲和分离EPO，随后通过凝胶过滤分离未修饰的EPO(例如使用能够分离相对分子量为20kDa-200kDa的球蛋白的介质)。
通过SDS-PAGE分析(使用12.5％或10％丙稀酰胺凝胶)，通过考马斯亮蓝染色凝胶后检测高于未修饰EPO的分子量，鉴定HAS修饰的EPO。使用抗重组人EPO的多克隆抗体对样品进行Western Blot分析，也能鉴定HAS修饰的EPO多肽的较高分子量。
EPO型的N-聚糖修饰通过用多肽N-聚糖酶(重组N-糖苷酶，来自德国Roche，使用25单位/mg EPO蛋白，37℃16小时)从EPO蛋白上成功去除来证明；SDS-PAGE分析可见EPO蛋白向N-糖苷酶处理的未修饰EPO的迁移位置一般移动约20KDa。
通过SDS-PAGE检测与未反应的去-N-糖基化EPO相比去-N-糖基化产物的迁移位置，证实单去唾液酸化和半乳糖氧化酶处理的EPO 0-聚糖在Ser 126处的修饰。必要时，在SDS-PAGE分析之前通过在C8-相上的RP-HPLC分级分离修饰的EPO。也可以通过O-聚糖的β-去除以及使用抗重组人EPO多克隆抗体的Western blot检测EPO的去-O-糖基化形式，分析EPO的HAS O-聚糖修饰。
实施例15
EPO和修饰EPO型的定量
根据如欧洲药典(2000，Erythropoietini solutio concentrata，1316，780-785)所述的UV测量对EPO定量，并且与国际BRP参照EPO标准比较。此外，也可以使用RP-C4-柱通过RP-HPLC测定，并且使用20、40、80、120μg BRP标准EPO参照制品进行校准，根据254nm的吸光度，测定EPO浓度。
实施例16
HES修饰的重组人EPO的体外生物活性
使用如Krystal[Krystal，1984，Exp.Heamatol.，11，649-660]描述的促红细胞生成素生物活性分析来检测纯化的HES修饰的EPO的活性。
如[Fibi等人，1991，Blood，77，1203 ff.]所述，通过用盐酸苯肼处理在NMR I小鼠中诱导贫血，收集并使用脾细胞。EPO的稀释液在9 6孔微量滴定板中与3×105细胞/孔温育。在潮湿空气(5％CO2)下37℃温育24小时后，细胞用每孔1μCi 3H-胸苷标记4小时。通过液体闪烁计数测量掺入的放射性。国际参照EPO标准(BRP-标准)用于比较。
此外，也可以使用EPO敏感细胞系TF-1(Kitamura等人，[J.cellPhys.，140.323-334])，通过体外检测来测定EPO的生物活性。洗去指数生长的细胞中的生长因子，在连续稀释的EPO存在下再温育48小时。使用Mosmann[Mosman，1983，J.Immunol.Methods，65，55-63]所述的MTT还原检测来估计细胞的增殖。
实施例17
EPO和HAS-修饰的EPO型的体内活性测定
体内活性测定在红细胞正常的小鼠中进行，方法是在动物接受预定剂量的EPO或修饰EPO型4天后测量网织红细胞的增加。使用BRPEPO标准进行测定，该标准在红细胞增多小鼠测定中用WHO EPO标准校准。EPO样品用含有1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)的磷酸盐缓冲液稀释。
每只动物皮下注射0.5ml EPO在Dulbecco′s缓冲盐溶液中的检测溶液(相当于100、80、40或20IU/ml BRP标准EPO的EPO蛋白量)。注射4天后采集血样，网织红细胞用吖啶橙染色；在采集血样后5小时内用流式细胞仪计数总共30,000个血细胞中的网织红细胞从而对其定量(参见欧洲药典，2000，Erythropoietini solutioconcentrata，1316，780-785和欧洲药典(1996/2000，附件2002))。
实施例18
体内半衰期测定
兔静脉内注射指定量的未修饰或HAS-修饰的EPO型。在指定时间采集血样，制备血清。血清促红细胞生成素水平通过体外生物测定或者通过EPO-特异的商品化ELISA测定。
实施例19
体内药代动力学
小鼠：每只动物皮下接受300IU EPO/kg。处理7天后测量每只动物的血细胞比容。在用修饰EPO处理的所有动物中有9只观察到血细胞比容显著增加，由于未处理的EPO的半衰期相对较短，这是一个预料之中的结果。修饰EPO处理组中血细胞比容的平均变化与未处理EPO组和对照组显著不同。
兔：兔用相当于200ng/kg或者多达800ng/kg体重的单次剂量的未修饰或HAS-修饰的EPO处理。2、6、16、24、48小时后用测定血浆浓度的商品化EPO-特异性ELISA分析血样。测定平均血浆EPO浓度，如(Zettlmissl等人，1989，J.Biol.Chem.，264，21153-21159)所述，根据ELISA值计算平均初始半衰期(α-相)和终末半衰期(β-相)。
文献：
Sytkowski，Lunn，Risinger和Davis，1999，An ErythropoietinFusion Protein Comprised of Identical Repeating DomainsExhibitis Enhanced Biological Properites，J.Biol.Chem.，274，24773-24778。
实施例20
HES-修饰的重组人IL-2的体外生物活性评估
通过在Ultrogel AcA 54上凝胶过滤回收修饰的IL2。无菌过滤相应级分的等份，使用依赖IL2的鼠CTLL-2细胞系测定IL2的生物活性[Gillis，Ferm，On和Smith，1978，J.Immunol.，120，2027-2032]。活性与国际参照IL2标准制品相关联。
表1
Figure A0382146501231
Figure A0382146501261
Figure A0382146501271
                            表2
来自HES修饰的EPO和对照样品之聚糖的单糖组成分析
**单糖     I.来自A2的聚糖     II.来自EPO-GT-1A的聚糖     III.来自K2的聚糖     III.来自A2的聚糖     IV.来自EPO-GT-1A的聚糖     V.来自K2的聚糖     VI.半胱氨酸修饰的EPO蛋白*
  岩藻糖     1935     3924     2602     2246     4461     2601     2181
  甘露糖     6028     11020     9198     6379     11668     6117     6260
  半乳糖     8886     19935     14427     10570     16911     11555     10386
  葡萄糖     17968     ---     ---     21193     痕量     痕量     33021
  GlcNAc     7839     21310     14440     11360     15953     10503     10498
  GlcHe1     5583     ---     ---     5926     ---     ---     14857
  GlcHe2     1380     ---     ---     1552     ---     ---     3775
  NeuNAc     5461     822     4504     3895     4871     13562     13003
  肌醇     1230     2310     1620     2050     1320     1134     1087
*对等量的Cys-HES-修饰的EPO蛋白进行组成分析；如上所述用Q-Sepharose柱通过层析从HES-温育混合物中分离EPO蛋白，利用Vivaspin 5分离装置离心脱盐。**通过全三甲基甲硅烷基化甲基糖苷的单次GC，进行单糖测定；给出了峰的电子积分值，这些数值未对衍化过程和每种化合物回收过程中的损失进行校正。
                          表3
    样品号     样品描述     EPO样品的计算比活性(根据A280nm和RP-HPLC测定)
    850247     1.HES-修饰的EPO A2     344000U/mg
    850248     2.EPO-GT-1-A     82268U/mg
    850249     3.对照EPO K2     121410U/mg
    850250     4.BRP EPO标准     86702U/mg
    850251     1.用4倍体积的PBS稀释     309129U/mg
    850252     2.用4倍体积的PBS稀释     94500U/mg
    850253     3.用4倍体积的PBS稀释     114100U/mg
    850254     4.用4倍体积的PBS稀释     81200U/mg
    850255     1.用4倍体积的PBS稀释     230720U/mg

Claims (52)

1.一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构
该方法包括：
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端，或者
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端与化合物(D)反应获得的羟烷基淀粉衍生物，化合物(D)含有：
-至少一个能够与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应的官能团Z1，和
-至少一个官能团W，
与化合物(L)反应，化合物(L)含有：
-至少一个能够与所述羟烷基淀粉反应的官能团Z1，或者至少一个能够与所述羟烷基淀粉衍生物中所含的官能团W反应的官能团Z2，和
-至少一个能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应的官能团X，
其中所述官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基和巯基。
2.如权利要求1所述的方法，其中R1、R2和R3独立地是氢或者是直链或支链羟烷基。
3.如权利要求2所述的方法，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中官能团Z1含有结构-NH-。
6.如权利要求5所述的方法，其中Z1选自：
Figure A038214650003C1
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，官能团X含有结构-NH-。
8.如权利要求7所述的方法，其中X选自：
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中官能团Y是-SH，官能团X选自：
Figure A038214650003C3
其中Hal是Cl、Br或I。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
其中Hal是Cl、Br或I。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中官能团W或官能团Z2选自活化酯或者任选地转化为活化酯的羧基，官能团Z2或官能团W选自：
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前不被氧化，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前被氧化，所述羟烷基淀粉具有通式(IIa)
和/或通式(IIb)的结构
14.如权利要求13所述的方法，其中还原性末端用碱性碘溶液氧化。
15.如权利要求1-9和12-14中任一项所述的方法，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，前述反应的反应产物与化合物(M)反应。
1 6.如权利要求1-9和12-14中任一项所述的方法，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，而在与羟烷基淀粉反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
17.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(L)中所含的官能团Z2与化合物(D)中所含的官能团W反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，产生第二种羟烷基淀粉衍生物。
18.如权利要求17所述的方法，其中通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，第二种羟烷基淀粉衍生物与化合物(M)反应。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(D)中所含的官能团W与化合物(L)中所含的官能团Z2反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，在与第一种羟烷基淀粉衍生物反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中至少一种所述另外一种化合物(M)是多肽。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述多肽是促红细胞生成素。
22.一种可通过生产羟烷基淀粉衍生物的方法获得的羟烷基淀粉衍生物，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构
Figure A038214650006C1
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端，或者
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端与化合物(D)反应获得的羟烷基淀粉衍生物，化合物(D)含有：
-至少一个能够与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应的官能团Z1，和
-至少一个官能团W，
与化合物(L)反应，化合物(L)含有：
-至少一个能够与所述羟烷基淀粉反应的官能团Z1，或者至少一个能够与所述羟烷基淀粉衍生物中所含的官能团W反应的官能团Z2，和
-至少一个能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应的官能团X，
其中所述官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基。
23.如权利要求22所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R1、R2和R3独立地是氢或者直链或支链羟烷基。
24.如权利要求23所述的羟烷基淀粉衍生物，其中R1、R2和R3独立地是氢或2-羟乙基。
25.如权利要求22-24中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中羟烷基淀粉是羟乙基淀粉。
26.如权利要求22-25中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团Z1含有结构-NH-。
27.如权利要求26所述的羟烷基淀粉衍生物，其中Z1选自：
其中，G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
28.如权利要求22-27中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，官能团X含有结构-NH-。
29.如权利要求28所述的羟烷基淀粉衍生物，其中X选自：
Figure A038214650007C2
Figure A038214650008C1
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
30.如权利要求22-27中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团Y是-SH，官能团X选自：
Figure A038214650008C2
其中Hal是Cl、Br或I。
31.如权利要求22-30中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A038214650008C3
其中Hal是Cl、Br或I。
32.如权利要求22-30中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中官能团W或官能团Z2选自活化酯或者任选地转化为活化酯的羧基，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A038214650008C4
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基。
33.如权利要求22-32中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中该羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前不被氧化，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构
34.如权利要求22-32中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中羟烷基淀粉的还原性末端在与化合物(D)或化合物(L)反应之前被氧化，所述羟烷基淀粉因此具有通式(IIa)
Figure A038214650009C2
和/或通式(IIb)的结构
35.如权利要求34所述的羟烷基淀粉衍生物，其中还原性末端用碱性碘溶液氧化。
36.如权利要求22-30和33-35中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，前述反应的反应产物与化合物(M)反应。
37.如权利要求22-30和33-35中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(L)反应，而在与羟烷基淀粉反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
38.如权利要求22-35中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(L)中所含的官能团Z2与化合物(D)中所含的官能团W反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，产生第二种羟烷基淀粉衍生物。
39.如权利要求38所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，第二种羟烷基淀粉衍生物与化合物(M)反应。
40.如权利要求22-35中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中通过化合物(D)中所含的官能团Z1与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，羟烷基淀粉与化合物(D)反应，产生第一种羟烷基淀粉衍生物，而通过化合物(D)中所含的官能团W与化合物(L)中所含的官能团Z2反应，第一种羟烷基淀粉衍生物与化合物(L)反应，在与第一种羟烷基淀粉衍生物反应之前，通过化合物(L)中所含的官能团X与另外一种化合物(M)中所含的官能团Y反应，化合物(L)与化合物(M)反应。
41.如权利要求22-40中任一项所述的羟烷基淀粉衍生物，其中至少一种所述另外一种化合物(M)是多肽。
42.如权利要求41所述的羟烷基淀粉衍生物，其中该多肽是促红细胞生成素。
43.一种药物组合物，其含有治疗有效量的羟烷基淀粉衍生物，所述羟烷基淀粉衍生物可通过一种生产羟烷基淀粉衍生物的方法获得，所述羟烷基淀粉具有通式(I)的结构
该方法包括：
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端，或者
-通式(I)的羟烷基淀粉在其任选被氧化的还原性末端与化合物(D)反应获得的羟烷基淀粉衍生物，化合物(D)含有：
-至少一个能够与羟烷基淀粉任选被氧化的还原性末端反应，和
-至少一个官能团W，
与化合物(L)反应，化合物(L)含有：
-至少一个能够与所述羟烷基淀粉反应的官能团Z1，或者至少一个能够与所述羟烷基淀粉衍生物中所含的官能团W反应的官能团Z2，和
-至少一个能够与另外一种化合物(M)的官能团Y反应的官能团X，
其中所述官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基、缩醛基或巯基，所述生产羟烷基淀粉衍生物的方法还包括使含有羟烷基淀粉、化合物(L)和任选的化合物(D)的反应产物与另外一种化合物(M)反应，其中所述至少一种另外的化合物是一种多肽。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述多肽是AT III。
45.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述多肽是促红细胞生成素。
46.如权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其中官能团Y是-SH，化合物(L)是具有通式Z1-L′-X的化合物，其中官能团Z1选自：
Figure A038214650012C1
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，其中官能团X选自：
Figure A038214650012C2
其中Hal是Cl、Br或I，L’是桥接Z1与X的有机链，或者L’不存在。
47.如权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，化合物(L)是具有通式Z1-L′-X的化合物，其中官能团Z1选自：
Figure A038214650012C3
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R是烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳基环烷基、烷芳基或环烷基芳基，其中官能团X选自：
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，L’是桥接Z1与X的有机链，或者L’不存在。
48.如权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其中官能团Y是-SH，化合物(D)是具有通式Z1-D′-W的化合物，化合物(L)是具有通式Z2-L′-X的化合物，其中官能团Z1选自：
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R是甲基，其中官能团X选自：
Figure A038214650013C3
其中Hal是Cl、Br或I，官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A038214650014C1
其中Hal是Cl、Br或I，或者官能团W或官能团Z2选自活化酯或者任选地转化为活化酯的羧基，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A038214650014C2
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，其中D’是桥接Z1与W的有机链，或者D’不存在，L’是桥接Z2与X的有机链，或者L’不存在。
49.如权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其中官能团Y选自醛基、酮基、半缩醛基和缩醛基，化合物(D)是具有通式Z1-D′-W的化合物，化合物(L)是具有通式Z2-L′-X的化合物，其中官能团Z1选自：
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，其中官能团X选自：
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，官能团W或官能团Z2是-SH，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A038214650015C2
其中Hal是Cl、Br或IO，或者官能团W或官能团Z2选自活化酯或者任选地转化为活化酯的羧基，官能团Z2或官能团W选自：
Figure A038214650015C3
其中G是O或S，如果存在两个，则独立地是O或S，R’是甲基，其中D’是桥接Z1与W的有机链，或者D’不存在，L’是桥接Z2与X的有机链，或者L’不存在。
50.如权利要求43所述的药物组合物，其中羟烷基淀粉在水性介质中与下式的化合物反应
反应产物与促红细胞生成素反应。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中促红细胞生成素在反应之前用高碘酸钠氧化。
52.如权利要求50所述的药物组合物，其中在反应之前促红细胞生成素被部分去唾液酸化并随后用高碘酸钠氧化。
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