KR20050061466A - 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은
- 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 또는 - 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 이러한 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1과 하나 이상의 작용성 그룹 W를 포함하는 화합물 (D)와 반응시킴으로써 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를
- 상기 하이드록시알킬 전분과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1, 또는 상기 하이드록시알킬 전분 유도체 내에 포함된 작용성 그룹 W와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z2와, 추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X(상기 작용성 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 및 티오 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)
를 포함하는 화합물(L)과 반응시키는 단계를 포함하는, 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 하이드록시알킬 전분이 다음 화학식 I에 따르는 구조를 갖는다:
화학식 I
본 발명은 추가로, 하이드록시알킬 전분 유도체 그 자체, 및 이러한 하이드록시알킬 전분 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법{Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives}
본 발명은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이고, 특히 하이드록시알킬 전분을 가교결합성 화합물의 1급 또는 2급 아미노 그룹과 반응시키거나 또는 2개의 가교결합성 화합물과 반응시키고, 이로써 생성된 하이드록시알킬 전분 유도체가, 추가 화합물의 작용성 그룹 Y와 반응할 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X를 갖도록 하는(여기서, 상기 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 또는 티오 그룹이다) 공정에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분을 가교결합성 화합물의 1급 또는 2급 아미노 그룹과 반응시키고, 이로써 생성된 반응 생성물을 제2의 가교결합성 화합물과 임의로 추가 반응시켜, 이로써 생성된 하이드록시알킬 전분 유도체가 추가 화합물의 작용성 그룹 Y와 반응할 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X를 갖도록 하며(여기서, 상기 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 또는 티오 그룹이다), 이와 같이 하여 생성된 반응 생성물을, 상기 작용성 그룹 Y 중의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 AT III, IFN-베타 또는 에리트로포이에틴(erythropoietin: 적혈구생성 인자) 등의 폴리펩티드, 특히 바람직하게는 에리트로포이에틴과 반응시키는 공정에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다. 특히 바람직한 하이드록시알킬 전분은 하이드록시에틸 전분이다. 본 발명에 따르면, 하이드록시알킬 전분, 바람직하게는 하이드록시에틸 전분을, 반응에 앞서 임의로 산화시킨 이의 환원성 말단에서 링커 화합물과 반응시킨다.
하이드록시에틸 전분(HES)은 천연 아밀로펙틴의 유도체이고 체내에서 알파-아밀라제에 의해 분해된다. HES는 옥수수 전분에 95중량% 이하의 농도로 존재하는, 탄수화물 중합체 아밀로펙틴의 치환된 유도체이다. HES는 유리한 생물학적 특성을 나타내므로, 혈액량 대체제(blood volume replacement agent)로서 사용되고 혈액희석 임상 요법에 사용된다[참조: Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; and Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498].
아밀로펙틴은 글루코스 잔기로 이루어지는데, 주쇄에는 알파-1,4-글리코시드 결합이 존재하고, 분지 부위에는 알파-1,6-글리코시드 결합이 발견된다. 이러한 분자의 물리-화학적 특성은 글리코시드 결합의 유형에 의해 주로 결정된다. 눈금간(nicked) 알파-1,4-글리코시드 결합으로 인해, 1선회(turn)당 대략 6개의 글루코스-단량체를 갖는 나선형 구조물이 생성된다. 상기 중합체의 물리-화학적 특성 뿐만 아니라 생화학적 특성은 치환을 통하여 변형시킬 수 있다. 하이드록시에틸 그룹의 도입은 알칼리성 하이드록시에틸화를 통하여 이루어질 수 있다. 이에 맞도록 반응 조건을 적응시킴으로써, 하이드록시에틸화 반응 측면에서, 치환되지 않은 글루코스 단량체 내의 각각의 하이드록시 그룹의 상이한 반응성을 활용하는 것이 가능하다. 이러한 사실 때문에, 당업자는 치환 패턴에 제한된 정도의 영향을 미칠 수 있다.
하이드록시에틸 전분 유도체를 제조하는 몇 가지 방식이 당해 분야에 보고되었다.
DE 26 16 086에는 제1 단계에서, 가교 결합제, 예를 들면, 브로모시안을 하이드록시에틸 전분에 결합시킨 다음, 연속해서 헤모글로빈을 이러한 중간 생성물에 연결시키는 것을 포함하는, 하이드록시에틸 전분에 헤모글로빈을 접합시키는 방법이 기재되어 있다.
HES를 사용하는 한 가지 중요한 분야는 특정한 생리학적 효과를 획득하기 위해 예를 들어, 순환계에 적용되는 폴리펩티드를 안정화시키기 위한 분야이다. 이러한 폴리펩티드들 중의 한 가지 구체적인 예가 에리트로포이에틴인데, 이는 순환시 적혈구 수준을 조절하는데 있어 필수적인 대략 34,000 kD의 산 당단백질이다.
폴리펩티드와 효소를 적용하는데 있어 야기되는 문제점으로 널리 공지된 것은 이들 단백질이 종종 불만족스러운 안정성을 나타낸다는 것이다. 특히 에리트로포이에틴은 혈장 반감기가 비교적 짧다[참조: Spivak and Hogans, 1989, Blood 73, 90; McMahon et al., 1990, Blood 76, 1718]. 이는 치료학적 혈장 수준이 신속하게 상실되어 정맥내 투여를 반복해서 수행해야만 한다는 것을 의미한다. 더우기, 특정 상황 하에서는 이들 펩티드에 대항한 면역 반응이 관찰된다.
이들 폴리펩티드를 중합체성 분자와 커플링시킨 경우에 폴리펩티드의 안정성이 개선될 수 있고 이들 폴리펩티드에 대항한 면역 반응이 저하된다는 사실이 일반적으로 용인되고 있다. WO 94/28024에는 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 변형시킨 생리학적 활성의 폴리펩티드가 저하된 면역원성 및 항원성을 나타내고, 접합되지 않은 단백질 보다 상당히 더 오랫동안 혈류 내를 순환한다고, 즉 제거되기 까지의 시간(clearance rate)이 보다 길다고 기재되어 있다. 그러나, PEG-약물 접합체는 몇 가지 단점을 나타내는데, 예를 들면, 이들은 생체내 분해 경로 요소들에 의해 인식될 수 있는 천연 구조를 나타내지 않는다. 따라서, PEG-접합체와는 별도로, 기타 접합체 및 단백질 중합물(polymerate)이 제조되었다. 상이한 단백질과 거대 분자, 예를 들면, 폴리머라제(중합효소)를 가교 결합시키는 다수의 방법이 당해 분야 문헌에 보고되었다[참조: 예를 들면, Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, 1993, CRCS, Inc.].
요약하면, 안정성 및/또는 생활성(bioactivity)이 개선된 추가의 개선된 폴리펩티드가 지속적으로 요망된다. 이는 시알산을 고도로 함유함으로써 활성이 높은 이소형(isoform)을 시알산 수준이 낮은 이소형으로부터 정제시켜야 하는 에리트로포이에틴에 특히 해당된다[참조: EP 0 428 267 B1]. 따라서, 광범위한 정제를 필요로 하지 않으면서도 높은 활성의 폴리펩티드를 제공해주는 생성 방법을 이용할 있다면, 이는 매우 유리할 것이다. 불행하게도, 세균이나 곤충 세포에서 폴리펩티드를 생성시키는 것은 종종 곤란한데, 이는 폴리펩티드가 적절하게 폴딩된 본래의 입체 구조로는 생성되지 않고 적당한 수준의 당화(glycosylation)도가 결여되었기 때문이다.
WO 02/08079 A2에는 활성제와 하이드록시알킬 전분을 직접적으로 연결시키거나 또는 링커 화합물을 통하여 연결시킨, 활성제와 하이드록시알킬 전분의 접합체를 포함하는 화합물이 기재되어 있다. 직접적인 결합에 관한 한은, 활성제와 하이드록시알킬 전분의 반응을, 10중량% 이상의 물을 포함하는 수성 매질에서 수행한다. 활성 시약 내에 포함된 카보닐 그룹 뿐만 아니라 알데히드 또는 케토 그룹, 또는 아세탈 또는 헤미아세탈 그룹에 연결되는 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 어떠한 예도 제시되어 있지 않다.
도 1
도 1은 실시예 5.1에 따라서 제조된, HES-EPO 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
레인 A: 단백질 마커 Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); 상단에서 부터 하단까지의 상기 단백질 마커의 분자량(kD): 245, 123, 77, 42, 30, 25.4, 및 17.
레인 B: 실시예 5.1에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 C: EPO 출발 물질.
도 2
도 2는 실시예 5.3에 따라서 제조된, HES-EPO 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
레인 A: 실시예 5.3에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 B: EPO 출발 물질.
레인 C: 단백질 마커 Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); 상단에서 부터 하단까지의 상기 단백질 마커의 분자량(kD): 245, 123, 77, 42, 30, 25.4, 및 17.
도 3
도 3은 실시예 5.4 및 5.5에 따라서 제조된, HES-EPO 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
레인 A: 단백질 마커 Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); 상단에서 부터 하단까지의 상기 단백질 마커의 분자량(kD): 245, 123, 77, 42, 30, 25.4, 및 17.
레인 B: 실시예 5.4에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 C: 실시예 5.5에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 D: EPO 출발 물질.
도 4
도 4는 실시예 7.1 및 7.4에 따라서 제조된, HES-EPO 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
레인 A: 단백질 마커 Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); 상단에서 부터 하단까지의 상기 단백질 마커의 분자량(kD): 245, 123, 77, 42, 30, 25.4, 및 17.
레인 B: 실시예 7.4에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 C: 실시예 7.1에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 D: EPO 출발 물질.
도 5
도 5는 실시예 7.2, 7.3, 7.5 및 7.6에 따라서 제조된, HES-EPO 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
레인 A: 단백질 마커 Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); 상단에서 부터 하단까지의 상기 단백질 마커의 분자량(kD): 245, 123, 77, 42, 30, 25.4, 및 17.
레인 B: 실시예 1.3 b)를 근거로 하여, 실시예 7.6에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 C: 실시예 1.1 b)를 근거로 하여, 실시예 7.5에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 D: 실시예 1.3 a)를 근거로 하여, 실시예 7.6에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 E: 실시예 1.1 a)를 근거로 하여, 실시예 7.5에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 F: 실시예 7.2에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 G: 실시예 7.3에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 K: EPO 출발 물질.
도 6
도 6은 실시예 7.7, 7.8, 7.9, 7.10, 7.11 및 7.12에 따라서 제조된, HES-EPO 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
레인 A: 단백질 마커 Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); 상단에서 부터 하단까지의 상기 단백질 마커의 분자량(kD): 245, 123, 77, 42, 30, 25.4, 및 17.
레인 B: 실시예 7.11에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 C: 실시예 7.10에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 D: 실시예 7.7에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 E: 실시예 7.8에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 F: 실시예 7.12에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
레인 G: EPO 출발 물질.
레인 K: 실시예 7.9에 따라서 접합시킨 후의 조 생성물.
도 7
5분(=레인 2); 10분(=레인 3); 60분(=레인 4) 동안 순한 산으로 처리시킨 EPO-GT-1의 SDS-PAGE 분석 결과; 및 처리되지 않은 EPO의 SDS-PAGE 분석 결과(=레인 1): N-글리칸 제거 후의 EPO의 이동도 변위가 도시되어 있다(+PNGASE).
도 8
처리되지 않은 EPO로부터 분리된 올리고당류와, 순한 산 가수분해 조건 하에서 5분, 10분 및 60분 동안 항온 배양시킨 EPO로부터 분리된 올리고당류의 HPAEC-PAD 패턴. 로마 숫자 I 내지 V는 I(=탈시알릴화 2-촉각 구조), II(=트리시알릴화 3-촉각 구조)(2개 이성체), III(=테트라시알릴화 4-촉각 구조 + 2개 N-아세틸락토사민 반복체), IV(=테트라시알릴화 4-촉각 구조 + 1개 N-아세틸락토사민 반복체), V(=테트라시알릴화 4-촉각 구조 + N-아세틸락토사민 반복체 없음)의 용출 위치를 지시해준다. 시알산을 전혀 갖지 않은 올리고당류 구조물과, 1 내지 4개의 시알산을 갖는 올리고당류 구조물의 용출 영역이 모난 괄호([])로써 지시된다.
도 9
탈시알릴화 후의 N-연결된 올리고당류의 HPAEC-PAD; N-아세틸뉴라민산의 용출 위치가 도시되어 있다; 숫자 1 내지 9는 표준 올리고당류의 용출 위치를 지시한다: 1 = 2-촉각; 2 = 3-촉각(2-4 이성체); 3 = 3-촉각(2-6 이성체); 4 = 4-촉각; 5 = 3-촉각 + 1개 반복체; 6 = 4-촉각 + 1개 반복체; 7 = 3-촉각 + 2개 반복체; 8 = 4-촉각 + 2개 반복체; 및 9 = 4-촉각 + 3개 반복체.
도 10
시알산 잔사를 퍼요오데이트 산화시킨, 순한 산 처리된 EPO와 처리되지 않은 EPO의 SDS-PAGE 분석 결과. 1 = 산 처리시키지 않으면서 퍼요오데이트 산화시킴; 2 = 5분 동안 산 처리시키고, 퍼요오데이트 산화시킴; 3 = 10분 동안 산 처리시키고, 퍼요오데이트 산화시킴; 4 = 산 처리시키지 않으면서 퍼요오데이트 산화시킴; 5 = 퍼요오데이트 산화시키지 않고 산 처리시키지 않은 BRP EPO 표준물.
도 11
처리되지 않은 EPO로부터 분리된 본래의 올리고당류와, 순한 산 가수분해 조건 하에서 5분 및 10분 동안 항온 배양시키고 후속 퍼요오데이트 처리시킨 EPO로부터 분리된 본래의 올리고당류의 HPAEC-PAD 패턴. 시알산을 전혀 갖지 않은 올리고당류 구조물과, 1 내지 4개의 시알산을 갖는 올리고당류 구조물의 용출 영역이 모난 괄호([]) 1 내지 5로써 지시된다.
도 12
시간 경과에 따른, EPO-GT-1-A의 HES-변형에 관한 SDS-PAGE 분석 결과: 20㎍ 분취량의 EPO-GT-1-A를 30분, 2, 4 및 17시간 동안 하이드록실아민-변형된 HES 유도체 X와 반응시킨다. 레인 1 = 30분 반응 시간; 레인 2 = 2시간 반응 시간; 레인 3 = 4시간 반응 시간; 레인 4 = 17시간 반응 시간; 레인 5 = HES-변형을 수반하지 않는 EPO-GT-1-A. 좌측 도면은 하이드록실아민-변형된 HES 유도체(유속: 1ml/min) X의 존재 하에서 항온 배양 시간 증가에 따른 EPO-GT-1-A의 이동도 변위를 도시한 것이다: 레인 1 = 30분 반응 시간; 레인 2 = 2시간 반응 시간; 레인 3 = 4시간 반응 시간; 레인 4 = 17시간 반응 시간; 레인 5 = HES-변형을 수반하지 않는 EPO-GT-1-A. 우측 도면은 동일한 샘플을 N-글리코시다제로 처리시킨 후의 분석 결과를 도시한 것이다.
도 13
HES-EPO 접합체의 Q-세파로스 분획에 대한 SDS-PAGE 분석 결과. 높은 염 농도에서 용출되는 분획 1%와 병류 분획 1% 각각을 스피드 백(Speed Vac) 농축기에서 농축시키고, 샘플 완충액 중의 겔 상으로 부하한다. EPO 단백질을 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색시킨다. A = 샘플 I; B = 샘플 II; C = 샘플 III; K = 대조군 EPO-GT-1; A1, B1, C1 및 K1은 병류 분획을 지시하고; A2, B2, C2 및 K2는 높은 염 농도에서 용출된 분획을 지시한다.
도 14a
N-연결된 올리고당류를 제거하기 위해 N-글리코시다제의 존재 하에 분해시킨, HES-변형된 EPO 샘플 A2(도 13 참조), 대조군 EPO 샘플 K2 및 EPO-GT-1-A EPO 제제의 SDS-PAGE 분석 결과. 모든 EPO 샘플은 O-글리칸을 함유하거나 결여된 저분자량 형태를 향하여 이동도 변위를 나타내었다. 탈-N-당화 후 HES-변형된 EPO 샘플 A2에 대해서는, O-당화된 단백질과 비-당화된 단백질의 비율이 보다 낮은 것으로 관찰되었고, 확산 단백질 밴드는 30 KDa 주변에서 탐지되었는데, 이는 O-글리칸 잔사의 시알산에서 HES-변형이 있다는 것을 나타내는 것으로 추정된다(별표가 표시된 화살표 참조).
도 14b
N-연결된 올리고당류를 제거하기 위해 N-글리코시다제의 존재 하에 분해시키거나 처리시키지 않은, HES-변형된 EPO 샘플 A2(도 13 참조), 대조군 EPO 샘플 K2 및 EPO-GT-1-A EPO 제제의 순한 산 가수분해 후의 SDS-PAGE 분석 결과(도 14a 참조). N-글리코시다제로 처리시키기 전의 고분자량 형태 A2와 N-글리코시다제 처리시킨 후의 고분자량 형태 A 둘 다(화살표가 있거나 없는 모난 괄호 참조)는 해당 샘플의 산 처리시 소멸되었다. 비교를 위해 수행된 BRP EPO 표준물은 순한 산 처리시키지 않았다.
도 15
HES-변형된 샘플 A, EPO-GT-1-A, 및 변형되지 않은 HES와 함께 항온 배양된 대조군 EPO 샘플(K)로부터 방출된 N-연결된 올리고당류 물질의 HPAEC-PAD 분석 결과. 로마 숫자 I 내지 V는 I(=디시알릴화 2-촉각 구조), II(=트리시알릴화 3-촉각 구조)(2개 이성체), III(=테트라시알릴화 4-촉각 구조 + 2개 N-아세틸락토사민 반복체), IV(=테트라시알릴화 4-촉각 구조 + 1개 N-아세틸락토사민 반복체), V(=테트라시알릴화 4-촉각 구조 + N-아세틸락토사민 반복체 없음)의 용출 위치를 지시해주며; 모난 괄호([])는 도 8 및 도 11의 주석에 보고된 바와 같이 디-, 트리- 및 테트라-시알릴화 N-글리칸의 용출 영역을 지시해준다.
도 16
HES-변형된 샘플 A, EPO-GT-1-A, 및 변형되지 않은 HES와 함께 항온 배양된 대조군 EPO 샘플(K)로부터 방출된 N-연결된 올리고당류 물질의 HPAEC-PAD 분석 결과. 표준 올리고당류의 혼합물의 잔류 시간이 제시되어 있다: 숫자 1 내지 9는 표준 올리고당류의 용출 위치를 지시한다: 1 = 2-촉각; 2 = 3-촉각(2-4 이성체); 3 = 3-촉각(2-6 이성체); 4 = 4-촉각; 5 = 3-촉각 + 1개 반복체; 6 = 4-촉각 + 1개 반복체; 7 = 3-촉각 + 2개 반복체; 8 = 4-촉각 + 2개 반복체; 및 9 = 4-촉각 + 3개 반복체.
도 17 내지 23
도 17 내지 23은 HES-변형된 EPO 및 대조군 EPO 제제로부터 분리된, 효소적으로 방출되고 화학적으로 탈시알릴화된 N-글리칸의 MALDI/TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다. m/z 1809.7, 2174.8, 2539.9, 2905.0 및 3270.1에서의 주요 시그널([M+Na]+)은 MS 분석용 샘플을 탈시알릴화하기 위해 이용된 산 가수분해 조건에 기인한 푸코스 또는 갈락토스 상실로 인해 약한 시그널을 수반하는 N-아세틸락토사민 반복체를 전혀 갖지 않거나 이러한 반복체를 1개 또는 2개 갖는 2- 내지 4-촉각 복합체-유형 N-글리칸 구조물에 상응한다.
도 17
MALDI/TOF 스펙트럼: HES-변형된 EPO A2의 탈시알릴화 올리고당류.
도 18
MALDI/TOF 스펙트럼: EPO GT-1-A의 탈시알릴화 올리고당류.
도 19
MALDI/TOF 스펙트럼: EPO K2의 탈시알릴화 올리고당류.
도 20
MALDI/TOF 스펙트럼: EPO GT-1의 탈시알릴화 올리고당류.
도 21
MALDI/TOF 스펙트럼: 5분 동안 산 가수분해시킨 EPO GT-1의 탈시알릴화 올리고당류.
도 22
MALDI/TOF 스펙트럼: 10분 동안 산 가수분해시킨 EPO GT-1의 탈시알릴화 올리고당류.
도 23
MALDI/TOF 스펙트럼: 60분 동안 산 가수분해시킨 EPO GT-1의 탈시알릴화 올리고당류.
도 24
도 24는 2개의 HES-EPO 접합체의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.
mw: 마커
레인 1: 실시예 프로토콜 8에 따라서 제조된 HES-EPO: EPO를 하이드라지도-HES 12KD L에 접합시킨다.
레인 2: 실시예 프로토콜 9에 따라서 제조된 HES-EPO: EPO를 하이드록실아미노 HES 12KD K에 접합시킨다.
C: 대조군(접합되지 않은 EPO); 상부 밴드는 EPO 이량체를 나타낸다.
도 25
도 25는 HAS 변형된 EPO 형태를 폴리펩티드 N-글리코시다제로 분해시키는 것을 보여줌으로써, HES가 탄수화물 측쇄의 탄수화물 잔기에 접합된다는 것을 입증해준다.
레인 1: N-글리코시다제로 분해시킨 후 실시예 프로토콜 8에 따라서 제조된 HES-EPO.
레인 2: N-글리코시다제로 분해시킨 후 실시예 프로토콜 9에 따라서 제조된 HES-EPO.
레인 3: BRP EPO 표준물.
레인 4: N-글리코시다제로 분해시킨 후의 BRP EPO 표준물.
mw: 마커 (Bio-Rad SDS-PAGE Standards Low range Catalog No 161-0305, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
결과적으로, 본 발명의 목적은 작용성 그룹으로서, 티오 그룹 또는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 또는 아세탈 그룹을 포함하는 추가의 화합물(예: 폴리펩티드)와 화학적 결합을 형성할 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세틸 그룹 또는 아세탈 그룹이 상기 추가 화합물의 탄수화물 잔기 내에 포함된다.
따라서, 본 발명은
- 다음 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 또는
- 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 이러한 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1과 하나 이상의 작용성 그룹 W를 포함하는 화합물 (D)와 반응시킴으로써 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를
- 상기 하이드록시알킬 전분과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1, 또는 상기 하이드록시알킬 전분 유도체 내에 포함된 작용성 그룹 W와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z2와,
추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X(상기 작용성 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 또는 티오 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)
를 포함하는 화합물(L)과 반응시키는 단계를 포함하는, 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 관한 것인데, 이러한 하이드록시알킬 전분은 다음 화학식 I에 따르는 구조를 갖는다:
본 발명의 맥락에서, 용어 "하이드록시알킬 전분"(HAS)은 하나 이상의 하이드록시알킬 그룹에 의해 치환된 전분 유도체를 지칭한다. 따라서, 본 발명에 사용된 바와 같은 용어 하이드록시알킬 전분은, 말단 탄수화물 잔기가 화학식 I 중에 간결하게 묘사된 바와 같은 하이드록시알킬 그룹 R1, R2 및/또는 R3을 포함하는 화합물로 제한되는 것이 아니라, 전분 분자 HAS의 말단 탄수화물 잔기 및/또는 이의 나머지 부분 어디에서든 존재하는 하나 이상의 하이드록시 그룹이 하이드록시알킬 그룹 R1, R2 및/또는 R3에 의해 치환되는 화합물을 지칭하기도 한다.
이러한 맥락에서, 알킬 그룹은 적합하게 치환될 수 있는 선형 또는 분지된 알킬 그룹일 수 있다. 바람직하게는, 하이드록시알킬 그룹이 1 내지 10개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자, 보다 더 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유한다. 따라서, "하이드록시알킬 전분"에는 바람직하게 하이드록시에틸 전분, 하이드록시프로필 전분 및 하이드록시부틸 전분이 포함되고, 하이드록시에틸 전분 및 하이드록시프로필 전분이 특히 바람직하다.
2개 이상의 상이한 하이드록시알킬 그룹을 포함하는 하이드록시알킬 전분이 또한 본 발명에 포함된다.
HAS 내에 포함된 1개 이상의 하이드록시알킬 그룹은 2개 이상의 하이드록시 그룹을 함유할 수 있다. 바람직한 양태에 따르면, HAS 내에 포함된 1개 이상의 하이드록시알킬 그룹은 1개의 하이드록시 그룹을 함유한다.
"하이드록시알킬 전분"이란 표현에는 알킬 그룹이 일치환 또는 다치환되는 유도체가 또한 포함된다. 이러한 맥락에서, 알킬 그룹이 할로겐, 특히 불소에 의해 치환되거나 또는 아릴 그룹에 의해 치환되는 것이 바람직한데, 단 HAS는 수용성을 유지해야만 한다. 더우기, 하이드록시알킬 그룹의 말단 하이드록시 그룹을 에스테르화 또는 에테르화할 수도 있다.
더우기, 알킬 대신, 치환되거나 치환되지 않은 선형 또는 분지된 알켄 그룹을 사용할 수도 있다.
하이드록시알킬 전분은 전분의 에테르 유도체이다. 상기 에테르 유도체 이외에도, 본 발명의 맥락에서 기타 전분 유도체를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 에스테르화 하이드록시 그룹을 포함하는 유도체가 유용하다. 이들 유도체는, 예를 들어, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 모노- 또는 디카복실산의 유도체, 또는 이의 치환된 유도체일 수 있다. 특히 유용한 것은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 모노카복실산의 유도체, 특히 아세트산의 유도체이다. 이러한 맥락에서, 아세틸 전분, 부틸 전분 및 프로필 전분이 바람직하다.
더우기, 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 디카복실산의 유도체가 바람직하다.
디카복실산의 유도체의 경우에는, 이러한 디카복실산의 제2의 카복시 그룹을 에스테르화시키는 것도 유용하다. 추가로, 디카복실산의 모노알킬 에스테르의 유도체가 본 발명의 맥락에서 적합하기도 하다.
치환된 모노- 또는 디카복실산의 경우, 치환체 그룹은 치환된 알킬 잔사에 대해 상기 언급된 바와 동일한 것이 바람직할 수 있다.
전분을 에스테르화시키는 기술이 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especially chapter 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9)].
하이드록시에틸 전분(HES)이 본 발명의 모든 양태에 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명은 하이드록시알킬 전분이 하이드록시에틸 전분인 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
HES는 분자량 분포도와 치환도에 의해 주로 특징지워진다. 치환도를 서술하는데 있어 다음 2가지 가능성이 있다:
1. 치환도는 모든 글루코스 잔기를 기준으로 하여 치환된 글루코스 단량체 부분을 상대적으로 서술할 수 있다(DS).
2. 치환도는 글루코스 잔기당 하이드록시에틸 그룹 수를 서술한 "몰 치환도"(MS)로서 서술될 수 있다.
HES 용액은 다분산(polydisperse) 조성물로서 존재하는데, 각 분자는 중합도, 분지 부위의 수와 패턴, 및 치환 패턴 측면에서 서로 상이하다. 따라서, HES는 분자량이 상이한 화합물들의 혼합물이다. 결과적으로, 특정한 HES 용액은 통계 수단의 도움 하에 평균 분자량으로써 결정된다. 이러한 맥락에서, Mn은 분자 수에 따른 산술 평균으로서 계산된다. 또 다른 한편, 중량 평균인 Mw은 HES의 질량에 좌우되는 단위를 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 하이드록시에틸 전분은 평균 분자량(중량 평균)이 1 내지 300 kDa이고, 5 내지 100 kDa의 평균 분자량이 보다 바람직하다. 하이드록시에틸 전분은 추가로, 하이드록시에틸 그룹에 기준한 몰 치환도가 0.1 내지 0.8이고 C2:C6 치환비가 2 내지 20 범위 내일 수 있다.
화학식 I에 따르는 잔사 R1, R2 및 R3에 관한 한은, 화합물(I)이 여전히 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응될 수 있다는 것에 관한 구체적인 어떠한 제한 사항도 제시되어 있지 않다. 바람직한 양태에 따르면, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소, 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는, 하이드록시알킬 그룹, 하이드록시아릴 그룹, 하이드록시아르알킬 그룹 또는 하이드록시알카릴 그룹이다. 수소, 및 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬 그룹이 바람직하다. 알킬, 아릴, 아르알킬 및/또는 알카릴 그룹은 선형 또는 분지되고 적합하게 치환될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지된 하이드록시알킬 그룹인 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
따라서, R1, R2 및 R3은 하이드록시헥실, 하이드록시펜틸, 하이드록시부틸, 하이드록시프로필, 예를 들면, 1-하이드록시프로필, 2-하이드록시프로필, 3-하이드록시프로필, 1-하이드록시이소프로필, 2-하이드록시이소프로필, 하이드록시에틸, 예를 들면, 1-하이드록시에틸, 2-하이드록시에틸, 또는 하이드록시메틸이다. 수소 및 하이드록시에틸 그룹이 바람직하고, 수소 및 2-하이드록시에틸 그룹이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 2-하이드록시에틸 그룹인 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 화합물(D) 또는 화합물(L)을 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단과 반응시키는데, 이는 작용성 그룹 Z1과 상기 환원성 말단과의 반응을 통해서 이루어진다(그룹 Z1은 화합물(D) 또는 화합물(L) 내에 포함되어 있다).
본 발명의 제1 바람직한 양태에 따르면, 화합물(D) 또는 화합물(L)을 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단과 반응시키는데, 이러한 환원성 말단은 상기 반응에 앞서 산화시킨다.
이러한 환원성 말단의 산화 반응으로 인해, 말단 탄수화물 그룹이 락톤 그룹을 포함하는 하이드록시알킬 전분이 생성되거나, 또는 말단 탄수화물 그룹이 화학 반응 조건 및/또는 산화제에 따라서 카복시 그룹을 포함하는 비-사이클릭 구조를 갖는 하이드록시알킬 전분이 생성된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 이의 환원성 말단에서 산화시킨 하이드록시알킬 전분은 락톤 그룹을 포함하는 화합물과 카복시 그룹을 포함하는 화합물의 혼합물로서 존재한다. 이러한 혼합물에서는 각각의 화합물이 어떠한 비율로도 존재할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시킴으로써, 하이드록시알킬 전분이 다음 화학식 IIa에 따르는 구조 및/또는 다음 화학식 IIb에 따르는 구조를 갖는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
하이드록시알킬 전분의 환원성 말단의 산화 반응은 상기 언급된 구조 (IIb) 및/또는 (IIb)를 갖는 화합물을 생성시키는 각 방법 또는 방법 조합에 따라서 수행할 수 있다.
상기 산화 반응을, 하이드록시알킬 전분의 산화된 환원성 말단을 생성시키는데 적합한 모든 방법(들)에 따라서 수행할 수 있긴 하지만, 예를 들어, 196 28 705 A1에 기재된 바와 같은 알칼리성 요오드 용액을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, 상기 환원성 말단을 알칼리성 요오드 용액에 의해 산화시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2 바람직한 양태에 따르면, 화합물(D) 또는 화합물(L)을 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단과 반응시키는데, 이러한 환원성 말단은 상기 반응에 앞서 산화시키지 않는다.
따라서, 본 발명은 또한, 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시키지 않음으로써, 하이드록시알킬 전분이 화학식 I에 따르는 구조를 갖는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
화학식 I
화합물(L)과 하이드록시알킬 전분 간의 화학적 결합, 또는 화합물(D)와 하이드록시알킬 전분 간의 화학적 결합의 형성은 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응에 의해 달성된다.
작용성 그룹 Z1로서, 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 화학적 결합을 형성할 수 있는 각 작용성 그룹을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 Z1은 화학 구조 -NH-를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한, 작용성 그룹 Z1이 구조 -NH-를 포함하는 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 Z1은 구조 R'-NH-를 갖는 그룹인데, 여기서 R'는 수소, 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사이고, 이러한 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사는 NH 그룹에 직접 연결될 수 있거나, 또는 또 다른 양태에 따르면, 산소 브릿지에 의해 NH 그룹에 연결될 수 있다. 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사는 적합하에 치환될 수 있다. 바람직한 치환체로서, 할로겐, 예를 들면, F, Cl 또는 Br을 언급할 수 있다. 특히 바람직한 잔사 R'는 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 보다 더 바람직한 것은 수소, 및 치환되지 않은 알킬 및 알콕시 그룹이다.
알킬 및 알콕시 그룹 중에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 C 원자를 갖는 그룹이 바람직하다. 보다 바람직한 것은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로폭시 그룹이다. 특히 바람직한 것은 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시이고, 메틸 또는 메톡시가 보다 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, R'가 수소, 또는 메틸 또는 메톡시 그룹인 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 Z1은 구조 R'-NH-R"-를 갖는데, 여기서 R"는 바람직하게는, 구조 단위 -NH- 및/또는 구조 단위 -(C=G)-(여기서, G는 O 또는 S이다), 및/또는 구조 단위 -SO2-를 포함한다. 보다 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 R"는 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다:
및
상기 그룹에서, G가 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한, 작용성 그룹 Z1이 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
상기 그룹에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
본 발명의 목적은, 반응 생성물로서 하이드록시알킬 전분, 화합물(L), 임의 화합물(D) 및 추가 화합물(M)을 포함하는 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하기 위해, 추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응할 수 있는 작용성 그룹 X를 포함하는 하이드록시알킬 전분 유도체를 제공하는 것이다.
작용성 그룹 X에 관해 언급하면, 추가 화합물(M) 내에 포함되는 작용성 그룹 Y와 화학적 결합을 형성할 수 있다는 것을 제외하고는, 특별한 어떠한 제한 사항도 없다.
작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 경우에는, 작용성 그룹 X가 화학 구조 -NH-를 포함하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 X가 구조 -NH-를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 X는 구조 R'-NH-를 갖는 그룹인데, 여기서 R'는 수소, 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사이고, 이러한 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사는 NH 그룹에 직접 연결될 수 있거나, 또는 또 다른 양태에 따르면, 산소 브릿지에 의해 NH 그룹에 연결될 수 있다. 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사는 적합하에 치환될 수 있다. 바람직한 치환체로서, 할로겐, 예를 들면, F, Cl 또는 Br을 언급할 수 있다. 특히 바람직한 잔사 R'는 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 보다 더 바람직한 것은 수소, 및 치환되지 않은 알킬 및 알콕시 그룹이다.
알킬 및 알콕시 그룹 중에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 C 원자를 갖는 그룹이 바람직하다. 보다 바람직한 것은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로폭시 그룹이다. 특히 바람직한 것은 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시이고, 메틸 또는 메톡시가 보다 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, R'가 수소, 또는 메틸 또는 메톡시 그룹인 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 X가 구조 R'-NH-R"-를 갖는데, 여기서 R"는 바람직하게는, 구조 단위 -NH- 및/또는 구조 단위 -(C=G)-(여기서, G는 O 또는 S이다), 및/또는 구조 단위 -SO2-를 포함한다. 보다 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 R"는 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다:
및
상기 그룹에서, G가 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한, 작용성 그룹 X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
상기 그룹에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
작용성 그룹 Y가 티오 그룹인 경우, 작용성 그룹 X는 바람직하게는, 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다:
상기 그룹에서, Hal은 Cl, Br 또는 I, 바람직하게는 Br 또는 I이다.
따라서, 본 발명은 또한, 작용성 그룹 Y가 -SH이고 작용성 그룹 X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
상기 그룹에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
본 발명의 한 가지 양태에 따르면, 하이드록시알킬 전분을 화합물(D)와 반응시키고, 이로써 생성된 반응 생성물을 화합물(L)과 추가로 반응시키는데, 이러한 화합물(L)과 반응 생성물 간의 화학적 결합은, 반응 생성물의 일부인 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와의 반응에 의해 형성된다.
작용성 그룹 Z2와 W에 관해 언급하면, 목적하는 화학적 결합이 형성되기만 한다면 일반적으로 어떠한 제한도 없다.
가능한 작용성 그룹 W 또는 Z2로서, 특히 다음 작용성 그룹을 언급할 수 있다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티오 그룹 또는 하이드록시 그룹;
- 알킬 설폰산 하이드라지드, 아릴 설폰산 하이드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노알코올;
- 아미노 그룹 -NH2-, 또는 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노 그룹의 유도체, 예를 들면, 아미노알킬 그룹, 아미노아릴 그룹, 아미노아르알킬 그룹 또는 알카릴아미노 그룹;
- 하이드록실아미노 그룹 -O-NH2-, 또는 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 하이드록실아미노 그룹의 유도체, 예를 들면, 하이드록실알킬아미노 그룹, 하이드록실아릴아미노 그룹, 하이드록시아르알킬아미노 그룹 또는 하이드록실알카릴아미노 그룹;
- 각각 구조 단위 -NH-O-를 포함하는, 알콕시아미노 그룹, 아릴옥시아미노 그룹, 아르알킬옥시아미노 그룹 또는 알카릴옥시아미노 그룹;
- 카보닐 그룹을 갖는 잔사 -Q-C(=G)-M[여기서, G는 O 또는 S이고, M은, 예를 들어,
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 그룹, 아릴옥시 그룹, 아르알킬옥시 그룹 또는 알카릴옥시 그룹;
-- 알킬티오 그룹, 아릴티오 그룹, 아르알킬티오 그룹 또는 알카릴티오 그룹;
-- 알킬카보닐옥시 그룹, 아릴카보닐옥시 그룹, 아르알킬카보닐옥시 그룹 또는 알카릴카보닐옥시 그룹;
-- 활성화 에스테르, 예를 들면, 이미드 구조를 갖는 하이드록실아민의 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시석신이미드, 또는 구조 단위 O-N(여기서, N은 헤테로아릴 화합물의 일부이다)를 갖는 하이드록실아민의 에스테르, 또는 G가 O이고 Q가 부재하는 경우, 예를 들어, 치환된 아릴 잔사를 갖는 아릴옥시 화합물, 예를 들면, 펜타플루오로페닐, 파라니트로페닐 또는 트리클로로페닐이며;
Q는 부재하거나, 또는 NH 또는 헤테로 원자, 예를 들면, S 또는 O이다];
- -NH-NH2 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 그룹;
- 카보닐 그룹, 예를 들면, 알데히드 그룹 또는 케토 그룹;
- 카복시 그룹;
- -N=C=O 그룹 또는 -N=C=S 그룹;
- 비닐 할라이드 그룹, 예를 들면, 비닐 요오다이드 또는 비닐 브로마이드 그룹, 또는 트리플레이트;
- -C≡C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
- 그룹 -(C=O)-CH2-Hal(여기서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다);
- -CH=CH-SO2-;
- 구조 -S-S-를 포함하는 디설파이드 그룹;
- 그룹 ;
- 그룹 .
상기에서, Z2 및 W는 각각, 상기 언급된 그룹들 중의 하나와 화학적 결합을 형성할 수 있는 그룹이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, W와 Z2 둘 다가 상기 제시된 그룹 목록으로부터의 그룹이다.
본 발명의 특히 바람직한 제1 양태에 따르면, Z2 또는 W가 티오 그룹이다. 이러한 특정한 경우, 작용성 그룹 W는 바람직하게는 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다:
상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I, 바람직하게는 Br 또는 I이다.
따라서, 본 발명은 또한, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
본 발명의 특히 바람직한 제2 양태에 따르면, Z2 또는 W가 상기 언급된 바와 같은 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이러한 특정한 경우, 작용성 그룹 W 또는 Z2는 각각, 화학 구조 -NH-를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한, Z2 또는 W가 상기 언급된 바와 같은 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 W 또는 Z2가 각각, 화학 구조 -NH-를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 구조 -NH-를 포함하는 작용성 그룹 W 또는 Z2는 구조 R'-NH-를 갖는 그룹인데, 여기서 R'는 수소, 또는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사이고, 이러한 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사는 NH 그룹에 직접 연결될 수 있거나, 또는 또 다른 양태에 따르면, 산소 브릿지에 의해 NH 그룹에 연결될 수 있다. 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 잔사는 적합하에 치환될 수 있다. 바람직한 치환체로서, 할로겐, 예를 들면, F, Cl 또는 Br을 언급할 수 있다. 특히 바람직한 잔사 R'는 수소, 알킬 및 알콕시 그룹이고, 보다 더 바람직한 것은 수소, 및 치환되지 않은 알킬 및 알콕시 그룹이다.
알킬 및 알콕시 그룹 중에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 C 원자를 갖는 그룹이 바람직하다. 보다 바람직한 것은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 및 이소프로폭시 그룹이다. 특히 바람직한 것은 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시이고, 메틸 또는 메톡시가 보다 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, W 또는 Z2가 상기 언급된 바와 같은 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 W 또는 Z2가 각각 R'-NH-(여기서, R'는 수소, 또는 메틸 또는 메톡시 그룹이다)인, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 W 또는 Z2가 구조 R'-NH-R"-를 갖는데, 여기서 R"는 바람직하게는, 구조 단위 -NH- 및/또는 구조 단위 -(C=G)-(여기서, G는 O 또는 S이다), 및/또는 구조 단위 -SO2-를 포함한다. 보다 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 R"는 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다:
및
상기에서, G가 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이다.
따라서, 본 발명은 또한, 작용성 그룹 W 또는 Z2가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
본 발명의 또 다른 국면에 따르면, 작용성 그룹 X, Z2 및/또는 W 중의 하나 이상은 소정의 추가 화합물과 직접적으로 반응할 수는 없지만, 목적하는 방식으로 반응할 수 있도록 하기 위해 화학적으로 변형시킬 수 있는 그룹일 수 있다.
추가 화합물과의 반응에 앞서 변형시키고자 하는 작용성 그룹의 예로서, 예를 들어, 알데히드 또는 케토 그룹을 형성하기 위해 산화시킴으로써 변형되는 1,2-아미노 알코올 또는 1,2-디올이 언급될 수 있다.
추가 화합물과의 반응에 앞서 변형시키고자 하는 작용성 그룹에 대한 또 다른 예는, 예를 들어, 다음 식 에 따르는 화합물과 반응시킴으로써 변형되어, 예를 들어 티오 그룹에 대해 반응성인 다음 식 의 구조를 제공해주는 -NH2 그룹이다.
추가 화합물과의 반응에 앞서 변형시키고자 하는 작용성 그룹에 대한 또 다른 예는, 예를 들어, 다음 식 에 따르는 화합물과 반응시킴으로써 변형되어, 예를 들어 티오 그룹에 대해 반응성인 다음 식 의 구조를 제공해주는 -NH2 그룹이다.
추가 화합물과의 반응에 앞서 변형시키고자 하는 작용성 그룹에 대한 또 다른 예는 브로모아세트산 무수물 또는 N-석신이미딜 요오도 아세테이트와 반응되는 아미노 그룹이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 화합물(L)은 구조 Z1-L'-X 또는 Z2-L'-X[여기서, L'는 작용성 그룹들을 격리시키는 유기 잔사이고, 임의로 부재한다]를 갖는데, 이러한 구조는 화합물(D)가 하이드록시알킬 전분과 반응하는지의 여부에 따라서 좌우된다.
제1 바람직한 양태에 따르면, 화합물(D)가 관여하지 않으며 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
이러한 특정한 경우, 구조 Z1-L'-X(여기서, L'은 부재한다)를 갖는 화합물(L)로서, 특히 다음 화합물이 바람직하다:
이러한 특정한 경우에 L'이 부재하지 않는다면(즉, 존재한다면), L'은 선형 또는 분지된 알킬 또는 사이클로알킬 또는 아릴 또는 아르알킬 또는 아릴사이클로알킬 또는 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 그룹일 수 있는데, L'은 1개 이상의 헤테로 원자, 예를 들면, N, O 또는 S를 포함할 수 있으며, L'은 적합하게 치환될 수 있다. 그룹 L'의 크기는 구체적인 요구에 맞도록 적응시킬 수 있다. 일반적으로, 격리성 그룹 L'은 일반적으로 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 헤테로 원자가 존재하는 경우, 이러한 격리성 그룹은 일반적으로 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 격리성 그룹 L'은 1 내지 4개의 산소 원자를 포함한다. 격리성 그룹 L'은 예를 들어, 5 내지 7개의 탄소 원자를 갖는, 임의의 분지된 알킬 쇄 또는 아릴 그룹 또는 사이클로알킬 그룹을 포함할 수 있거나, 또는 아르알킬 그룹 또는 알카릴 그룹(여기서, 알킬 부분은 선형이고/이거나 사이클릭 알킬 그룹일 수 있다)일 수 있다. 보다 더 바람직한 양태에 따르면, 격리성 그룹은 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개 탄소 원자의 알킬 쇄이다. 헤테로 원자가 존재하는 경우, 1 내지 4개의 산소 원자를 포함하는 쇄가 특히 바람직하다.
Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 특정한 경우에 대해서는, 구조 Z1-L'-X(여기서, L'은 부재하지 않는다)를 갖는 화합물(L)로서, 특히 다음 화합물이 바람직하다:
제2의 바람직한 양태에 따르면, 화합물(D)가 관여한다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에 따르면, 화합물(D)가 구조 Z1-D'-W[여기서, D'는 작용성 그룹들을 격리시키는 유기 잔사이고 임의로 부재한다]를 갖는다.
이러한 특정한 경우, 구조 Z1-D'-W[여기서, D'는 부재한다]를 갖는 화합물(D)로서, 특히 다음 화합물이 바람직하다:
D'가 부재하는 화합물 D의 구체적인 예가 NH3이다.
이러한 특정한 경우에 D'이 부재하지 않는다면(즉, 존재한다면), D'은 선형 또는 분지된 알킬 또는 사이클로알킬 또는 아릴 또는 아르알킬 또는 아릴사이클로알킬 또는 알카릴 또는 사이클로알킬아릴 그룹일 수 있는데, D'은 1개 이상의 헤테로 원자, 예를 들면, N, O 또는 S 를 포함할 수 있으며, D'은 적합하게 치환될 수 있다. 그룹 D'의 크기는 구체적인 요구에 맞도록 적응시킬 수 있다. 일반적으로, 격리성 그룹 D'은 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 헤테로 원자가 존재하는 경우, 이러한 격리성 그룹은 일반적으로 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 격리성 그룹 D'은 1 내지 4개의 산소 원자를 포함한다. 격리성 그룹 D'은 예를 들어, 5 내지 7개의 탄소 원자를 갖는, 임의의 분지된 알킬 쇄 또는 아릴 그룹 또는 사이클로알킬 그룹을 포함할 수 있거나, 또는 아르알킬 그룹 또는 알카릴 그룹(여기서, 알킬 부분은 선형이고/이거나 사이클릭 알킬 그룹일 수 있다)일 수 있다. 보다 더 바람직한 양태에 따르면, 격리성 그룹은 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 2 내지 4개 탄소 원자의 알킬 쇄이다. 헤테로 원자가 존재하는 경우, 1 내지 4개의 산소 원자를 포함하는 쇄가 특히 바람직하다.
이러한 특정한 경우에 관해서, 구조 Z1-D'-W[여기서, D'는 부재하지 않는다]를 갖는 바람직한 화합물(D)은 다음과 같다:
화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와, 작용성 그룹 Y의 화학적 성질에 따라서, 특정의 화합물(L)이 특정의 요구에 따라 사용될 수 있다.
예를 들어, 앞서 상세히 언급된 바와 같이, 작용성 그룹 Y가 티오 그룹이고 작용성 그룹 W가 구조 -NH-를 포함하는 경우에는, 다음 유형의 화합물(L)이 특히 바람직하다:
화합물(L)의 유형 작용성 그룹 X 작용성 그룹 Z 2
C 요오도알킬 N-석신이미드 에스테르
D 브로모알킬 N-석신이미드 에스테르
E 말레이미도 N-석신이미드 에스테르
F 피리딜디티오 N-석신이미드 에스테르
G 비닐설폰 N-석신이미드 에스테르
예를 들어, 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 W가 티오 그룹인 경우에는, 다음 유형의 화합물(L)이 특히 바람직하다:
화합물(L)의 유형 작용성 그룹 X 작용성 그룹 Z 2
A 하이드라지드 말레이미도
B 하이드라지드 피리딜디티오
본원 명세서 마지막에 제시된 표 1에는, 상기 제시된 유형에 따르는 화합물(L)의 몇 가지 바람직한 예가 열거되어 있다.
격리성 그룹 L' 및/또는 D'는 적합하게 치환될 수 있다. 바람직한 치환체는, 예를 들어, 할라이드, 예를 들면, F, Cl, Br 또는 I이다.
격리성 그룹 L' 및/또는 D'는 생성되는 화합물을 예정된 부위에서 용이하게 절단시켜 줄 수 있는 하나 이상의 절단 부위, 예를 들면, 다음을 포함할 수 있다:
하이드록시알킬 전분에 연결될 수 있어, 이로써 생성된 하이드록시알킬 전분 유도체가, 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와 반응할 수 있는 작용성 그룹 X를 포함하고, 이러한 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 화합물(L)의 특히 바람직한 예는 다음과 같다:
다음 화합물(L)이 특히 바람직하다:
하이드록시알킬 전분에 연결될 수 있어, 이로써 생성된 하이드록시알킬 전분 유도체가, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와 반응할 수 있는 작용성 그룹 W를 포함하고, 하이드록시알킬 전분, 화합물(D) 및 화합물(L)을 포함하는 상기 생성된 하이드록시알킬 전분 유도체가 추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응할 수 있으며, 이러한 작용성 그룹 Y가 티오 그룹인, 화합물(D)의 특히 바람직한 예는 다음과 같다:
다음 화합물(D)이 특히 바람직하다:
상기 언급된 바람직한 화합물(D)와 함께, 다음 화합물(L)이 바람직하다:
다음 화합물(L)이 특히 바람직하다:
본 발명의 제1 바람직한 양태에 따르면, 화합물(D) 또는 화합물(L)을, 산화시키지 않은 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단과 반응시킨다.
반응 조건, 예를 들면, 사용된 용매 또는 용매 혼합물, 반응 혼합물의 온도, 압력 또는 pH에 따라서, 산화시키지 않은 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단과 반응하는 화합물(D) 또는 화합물(L)의 반응 생성물은 상이한 구성분을 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 반응을 수성 시스템에서 수행한다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "수성 시스템"은 이용된 용매의 중량을 기준으로 하여, 10중량% 이상, 바람직하게는 50중량% 이상, 보다 바람직하게는 80중량% 이상, 보다 더 바람직하게는 90중량% 이상, 또는 100중량% 이하 범위의 물을 포함하는 용매 또는 용매 혼합물을 지칭한다. 부가의 용매로서, DMSO, DMF, 에탄올 또는 메탄올 등의 용매를 언급할 수 있다.
상기 반응을 상기 언급된 바와 같이, 수성 시스템에서 수행하고 작용성 그룹 Z1이 그룹 R'-NH-인 경우에는, 본 발명의 하이드록시알킬 전분 유도체가 다음 화학식 IIIa에 따르는 구성분을 가질 수 있다:
상기 반응을 상기 언급된 바와 같이, 수성 시스템에서 수행하고 작용성 그룹 Z1이 그룹 R'-NH-(여기서, R'는 H이다)인 경우에는, 본 발명의 하이드록시알킬 전분유도체가 다음 화학식 IIIa 또는 화학식 IIIb에 따르는 구성분을 가질 수 있거나, 또는 화학식 IIIa에 따르는 화합물과 화학식 IIIb에 따르는 화합물의 혼합물일 수 있다:
화학식 IIIa
반응 조건 및/또는 해당 반응에 사용된 화합물(L) 또는 화합물(D)의 화학적 성질에 따라서, 화학식 IIIa에 따르는 화합물은, N 원자가 적도 또는 축방향 위치에 있는 형태로 존재할 수 있으며, 특정의 평형 분포를 지닌 양 형태의 혼합물로 존재할 수도 있다.
반응 조건 및/또는 해당 반응에 사용된 화합물(L) 또는 화합물(D)의 화학적 성질에 따라서, 화학식 IIIb에 따르는 화합물은, E 또는 Z 입체 구조의 C-N 이중 결합을 수반하여 존재할 수 있으며, 특정의 평형 분포를 지닌 양 형태의 혼합물로 존재할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 화학식 IIIa에 따르는 구성분 또는 화학식 IIIb에 따르는 구성분을 갖거나, 또는 화학식 IIIa에 따르는 화합물과 화학식 IIIb에 따르는 화합물의 혼합물인, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
몇 가지 경우에는, 화학식 IIIa에 따르는 화합물을 안정화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 화학식 IIIa에 따르는 화합물을 수용액 중에서 제조 및/또는 사용하는 경우에 특히 해당된다. 안정화 방법으로서, 특히 R'가 수소인 경우에는 화학식 IIIa에 따르는 화합물을 아실화시키는 방법이 특히 바람직하다. 아실화제로서, 다음 화학식 IVa에 따르는 목적하는 하이드록시알킬 전분 유도체를 생성시키는데 적합한 모든 시약을 사용할 수 있다:
본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 아실화 시약의 일부인 잔사 Ra가 메틸이다. 아실화 시약으로서, 카복실산 무수물, 카복실산 할라이드 및 카복실산 활성 에스테르가 바람직하게 사용된다.
아실화 반응은 0 내지 30℃, 바람직하게는 2 내지 20℃, 특히 바람직하게는 4 내지 10℃의 범위 내에서 수행한다.
따라서, 본 발명은 또한, 화학식 IVa에 따르는 구성분을 갖는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
기타 경우에 있어, 화학식 IIIb에 따르는 화합물을 안정화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 화학식 IIIb에 따르는 화합물을 수용액 중에서 제조 및/또는 사용하는 경우에 특히 해당된다. 안정화 방법으로서, 특히 R'가 수소인 경우에는 화학식 IIIb에 따르는 화합물을 환원시키는 방법이 특히 바람직하다. 환원 시약으로서, 다음 화학식 IVb에 따르는 목적하는 하이드록시알킬 전분 유도체를 생성시키는데 적합한 모든 시약을 사용할 수 있다:
본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 환원 시약으로서 보로하이드라이드, 예를 들면, NaCNBH3 또는 NaBH4를 사용한다.
환원 반응은 4 내지 100℃, 바람직하게는 10 내지 90℃, 특히 바람직하게는 25 내지 80℃의 범위 내에서 수행한다.
따라서, 본 발명은 또한, 화학식 IVb에 따르는 구성분을 갖는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 화학식 IIIa와 IIIb, 화학식 IVa와 IVb, 화학식 IIIa와 IVa, 화학식 IIIa와 IVb, 화학식 IIIb와 IVa, 화학식 IIIb와 IVb, 화학식 IIIa와 IIIb와 IVa, 화학식 IIIa와 IIIb와 IVb, 화학식 IVa와 IVb와 IIIa, 및 화학식 IVa와 IVb와 IIIb에 따르는 구성분을 갖는 화합물의 혼합물에 관한 것인데, 화학식 IIIa 및/또는 IVa는 독립적으로, N 원자가 적도 또는 축방향 위치에 있는 형태로 존재할 수 있고/있거나 화학식 IIIb는 E 또는 Z 입체 구조의 C-N 이중 결합을 수반하여 존재할 수 있다.
본 발명의 제2 바람직한 양태에 따르면, 화합물(D) 또는 화합물(L)을, 산화시킨 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단과 반응시킨다.
이러한 경우에는, 특정 량의 물, 예를 들면, 10중량% 이하의 물을 함유할 수도 있는 극성 비양성자성 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 비양성자성 용매는 특히 DMSO 또는 DMF이다. 바람직한 반응 온도 범위의 예는 실온 20 내지 65℃이고, 반응 시간은 일반적으로, 하이드록시알킬 전분의 산화된 환원성 말단과 반응되는 작용성 그룹의 화학적 성질과 기타 반응 조건에 따라서 1분 내지 수 시간 및 수 일이다.
이러한 경우, 작용성 그룹 Z1이 상기 언급된 바와 같은 그룹 R'-NH-이면, 본 발명의 하이드록시알킬 전분 유도체는 다음 화학식 Va에 따르는 구성분을 가질 수 있다:
따라서, 본 발명은 또한, 화학식 Va에 따르는 구성분을 갖는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
하이드록시알킬 전분과 화합물(D) 및/또는 화합물(L) 뿐만 아니라 화합물(M)과의 반응에 관한 한은, 가능한 모든 순서가 본 발명에 포괄된다.
본 발명의 바람직한 양태는 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키고; 이로써 생성된 반응 생성물을, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 하이드록시알킬 전분과 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시켜 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태는 상기 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는 상기 후자 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태는 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체와 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
상기 언급된 반응 단계 각각의 반응 조건에 관한 한은, 온도, 압력, pH, 또는 용매 또는 용매 혼합물과 같은 모든 파라미터를 구체적인 요구와, 반응시키고자 하는 화합물의 화학적 성질에 맞도록 적응시킬 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 물을 용매로서 사용하는데, 이는 단독으로 사용되거나 또는 하나 이상의 기타 용매와 조합하여 사용된다. 하나 이상의 기타 용매로서, DMSO, DMF, 메탄올 및 에탄올을 언급할 수 있다. 물 이외의 바람직한 용매는 DMSO, DMF, 메탄올 및 에탄올이다. 이러한 양태에서는, 하이드록시알킬 전분을 비-산화된 환원성 말단을 통하여 반응시키는 것이 바람직하다.
하이드록시알킬 전분을 수성 매질 중에서 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키고 화합물(D) 또는 화합물(L)이 하이드록실아민 또는 하이드라지드인 경우에는, 반응 온도가 바람직하게는 5 내지 45℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30℃, 특히 바람직하게는 15 내지 25℃의 범위이다.
하이드록시알킬 전분을 수성 매질 중에서 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키고 이러한 반응이 환원적 아민화 반응인 경우에는, 반응 온도가 바람직하게는 100℃ 이하, 보다 바람직하게는 70 내지 90℃, 특히 바람직하게는 75 내지 85℃의 범위이다.
상기 반응 과정 동안, 온도는 바람직하게는 상기 언급된 범위 내에서 다양할 수 있거나 또는 거의 일정하게 유지시킬 수 있다.
하이드록시알킬 전분과 화합물(D) 또는 화합물(L)과의 반응에 소용되는 반응 시간은 구체적인 요구에 맞도록 적응시킬 수 있으며, 이는 일반적으로 1시간 내지 7일 범위 내이다.
화합물(D) 또는 화합물(L)이 하이드록실아민 또는 하이드라지드인 경우에는, 반응 시간이 바람직하게는 1시간 내지 3일, 보다 바람직하게는 2시간 내지 48시간 범위 내이다.
하이드록시알킬 전분과 화합물(D) 또는 화합물(L)과의 반응이 환원적 아민화 반응인 경우에는, 반응 시간이 바람직하게는 2시간 내지 7일 범위 내이다.
하이드록시알킬 전분과 화합물(D) 또는 화합물(L)과의 반응에 대한 pH 값은 구체적인 요구, 예를 들면, 해당 반응물의 화학적 성질에 맞도록 적응시킬 수 있다.
화합물(D) 또는 화합물(L)이 하이드록실아민 또는 하이드라지드인 경우에는, pH 값이 바람직하게는 4.5 내지 6.5 범위 내이다.
하이드록시알킬 전분과 화합물(D) 또는 화합물(L)과의 반응이 환원적 아민화 반응인 경우에는, pH 값이 바람직하게는 8 내지 12 범위 내이다.
반응 혼합물의 적합한 pH 값은 하나 이상의 적합한 완충제를 부가함으로써, 각 반응 단계에 맞도록 조정할 수 있다. 바람직한 완충제로서, 나트륨 아세테이트 완충제, 인산염 또는 붕산염 완충제를 언급할 수 있다.
필요한 경우, 하이드록시알킬 전분을 화합물(D)와 반응시키기에 앞서, 화합물(D)를 화합물(L)과 반응시키기에 앞서, 또는 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 화합물(L)과 반응시키기에 앞서, 하나 이상의 작용성 그룹 X를 하나 이상의 적합한 보호 그룹으로 보호시킬 수 있다. 이와 관련하여, 보호된 화합물(L)이 하나 이상의 작용성 그룹 X를 통하여 반응되지 못하게 해주는 모든 보호 그룹이 가능하다. 따라서, 보호 그룹은 보호시키고자 하는 작용성 그룹 X의 화학적 성질, 해당 반응이 수행되는 용매, 또는 반응 혼합물의 pH에 따라서 선택될 수 있다. 바람직한 보호 그룹은 특히, 벤질옥시카보닐 그룹, 3급-부톡시카보닐 그룹, 메톡시페닐 그룹, 2,4-디메톡시페닐 그룹, 트리아릴 메틸 그룹, 트리틸, 모노메톡시트리틸 그룹, 디메톡시트리틸 그룹, 모노메틸트리틸 그룹, 디메틸트리틸 그룹, 트리플루오르아세틸 그룹, 프탈리민 화합물, 2-(트리알킬실릴)에톡시 카보닐 화합물, Fmoc, 3급-부틸 그룹 또는 트리알킬 실릴 그룹이다.
2개 이상의 상이한 작용성 그룹 X가 화합물(L)에 존재하는 경우, 적어도 1개 그룹은 보호시킬 수 있는 반면, 적어도 1개의 다른 그룹은 보호되지 않은 채로 둘 수 있다.
화합물(L)의 반응 후, 1개 이상의 보호 그룹을 반응 생성물 내에 잔존시킬 수 있거나 또는 당업자에게 공지된 통상적인 방법과 같은 적합한 방법에 의해 제거할 수 있다. 2개의 상이한 작용성 그룹 X가 적합한 보호 그룹에 의해 보호되는 경우에는, 하나 이상의 추가 화합물(M)과의 추가 반응에 이용될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X를 만들기 위해 적어도 1개의 보호 그룹은 제거시키고; 화합물(L)을 포함하는 반응 생성물이 추가 화합물(M)과 반응할 때까지 적어도 1개의 다른 작용성 그룹은 보호된 채로 둔다. 그 후, 여전히 보호된 채로 있는 작용성 그룹의 보호 그룹을 제거하여, 나머지 작용성 그룹 X가 추가 화합물(M)과의 반응에 또한 이용될 수 있도록 한다.
2개 이상의 하이드록시알킬 전분 분자와 반응된 화합물(L) 또는 화합물 (D), 즉 다중 HAS 치환된 화합물(L) 또는 (D)를 포함하는 하이드록시알킬 전분 유도체를 생성시키지 못하도록 하기 위해서는, 1개 이상의 보호 그룹을 사용하는 것이 중요할 수 있다. 그러나, 하이드록시알킬 전분을 과량의 화합물(L) 또는 (D)와 반응시킴으로써 동일한 결과를 달성할 수 있다. 과량의 화합물(L) 또는 (D)이 본 발명의 방법에 사용된 경우에는, 하이드록시알킬 전분에 대한 화합물(L) 또는 (D)의 몰비가 바람직하게는 2 내지 100 범위 내이다.
상기 언급된 바와 같은 각각의 반응 단계의 반응 생성물이 일단 형성되면, 이를 적합한 한 가지 이상의 방법에 의해 반응 혼합물로부터 분리시킬 수 있다. 필요한 경우, 분리에 앞서, 적합한 한 가지 방법에 의해 상기 반응 생성물을 침전시킬 수도 있다.
반응 생성물을 먼저 침전시키는 경우에는, 예를 들어, 반응 혼합물을, 이러한 반응 혼합물에 존재하는 용매 또는 용매 혼합물 이외의 한 가지 이상 용매 또는 용매 혼합물과 적합한 온도 하에 접촉시키는 것이 가능하다. 수성 시스템이 용매로서 사용되는 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 반응 혼합물을 바람직하게는 -20 내지 +50℃, 특히 바람직하게는 0 내지 25℃ 범위 내에서, 에탄올과 아세톤의 혼합물, 바람직하게는 1:1 혼합물(이는 상기 화합물의 등 용적을 지시해준다)과 접촉시킨다.
반응 생성물의 분리는 한 가지 이상의 단계를 포함할 수 있는 적합한 공정에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 반응 생성물을 먼저, 적합한 방법, 예를 들면, 원심분리 또는 여과에 의해 반응 혼합물로부터 분리시키거나 또는 반응 혼합물과 예를 들어, 에탄올-아세톤 혼합물과의 혼합물로부터 분리시킨다. 제2 단계에서는, 상기와 같이 분리된 반응 생성물을 대상으로 하여, 후처리형 투석, 원심분리성 여과 또는 압력 여과, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조와 같은 추가 처리를 수행할 수 있다. 보다 더 바람직한 양태에 따르면, 분리시킨 반응 생성물을 먼저, 바람직하게는 물에 대해 투석시킨 다음, 반응 생성물의 용매 함량이 목적하는 생성물 명세에 따라 충분히 낮아질 때까지 동결건조시킨다. 동결건조는 20 내지 35℃, 바람직하게는 25 내지 30℃에서 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)을 포함하거나 또는 하이드록시알킬 전분, 화합물(D) 및 화합물(L)을 포함하는 하이드록시알킬 전분 유도체를, 하나 이상의 작용성 그룹 Y를 포함하는 추가 화합물(M)과 추가로 반응시킨다.
일반적으로, 화합물(M)에 관한 제한 사항은 없다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 폴리펩티드가 화합물(M)로서 사용된다. 그러나, 중합체, 올리고머 또는 모노분자 화합물, 또는 이들 둘 이상의 혼합물 등의 기타 화합물(M)도 가능하다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합, 즉 구조 -(C=O)-NH-를 갖는 결합을 통하여 연결되는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭한다. 폴리펩티드는 천연 화합물이거나 또는 천연이 아닌 폴리펩티드일 수 있는데, 후자는 천연 아미노산 및/또는 천연이 아닌 1개 이상의 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드 주쇄는 1개 이상의 적합한 치환체에 의해 추가로 치환될 수 있으므로, 1개 이상의 측쇄를 지닐 수 있다. 하나 이상의 작용성 그룹 Y는 폴리펩티드 주쇄의 일부이거나 또는 이러한 주쇄의 1개 이상의 치환체의 일부일 수 있는데, 하나 이상의 작용성 그룹이 폴리펩티드 주쇄의 일부이고 하나 이상의 작용성 그룹이 폴리펩티드 주쇄의 1개 이상의 치환체의 일부인 양태가 가능하다.
폴리펩티드에 관한 한은, 어떠한 제한도 존재하지 않는데, 단 이러한 폴리펩티드는 하나 이상의 작용성 그룹 Y를 포함해야 한다. 이러한 작용성 그룹 Y는 폴리펩티드 주쇄에 직접적으로 연결되거나 또는 이러한 주쇄의 측쇄 일부일 수 있다. 측쇄 또는 작용성 그룹 Y, 또는 이들 둘 다는 천연 폴리펩티드의 일부일 수 있거나 또는 작용성 그룹 X와의 반응에 앞서, 천연 폴리펩티드 내로 도입되거나 또는 적어도 부분적으로는 천연이 아닌 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다.
더우기, 폴리펩티드는 적어도 부분적으로는, 모든 사람 또는 동물 기원일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 폴리펩티드가 사람 기원의 것이다.
폴리펩티드는 사이토킨, 특히 에리트로포이에틴, 항트롬빈(AT), 예를 들면, AT III, 인터루킨, 특히 인터루킨-2, IFN-베타, IFN-알파, G-CSF, CSF, 인터루킨-6 및 치료학적 항체일 수 있다.
바람직한 양태에 따르면, 폴리펩티드가 항트롬빈(AT), 바람직하게는 AT III이다[참조: Levy JH, Weisinger A, Ziomek CA, Echelard Y, Recombinant Anti-thrombin: Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4(2001) 405-416; Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, Hanson E, Bernasconi R, Higgins E, Manavalan P, Ziomek C, Meade H, McPherson J, Cole ES, Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671; Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM, Lubbers YTP, Pratt BM, Whittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons lethally challenged with Escherichia coli, Blood 95, 4(2000) 1117-1123; Van Patten SM, Hanson EH, Bernasconi R, Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McPherson JM, Edmunds T, Oxidation of Methionin Residues in Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274, 15(1999) 10268-10276].
또 다른 바람직한 양태에 따르면, 폴리펩티드가 사람 IFN-베타, 특히 IFN-베타 1a[참조: Avonex®, REBIF®] 및 IFN-베타 1b[참조: BETASERON®]이다.
추가의 바람직한 폴리펩티드는 사람 G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자)이다[참조: 예를 들면, Nagata et al., The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor, EMBO J. 5:575-581, 1986; Souza et al., Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 232 (1986) 61-65; and Herman et al., Characterization, formulation, and stability of Neupogen® (Filgrastim), a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor, in: Formulation, characterization, and stability of protein drugs, Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Press, New York, 1996, 303-328].
2가지 이상의 상이한 폴리펩티드의 혼합물이 사용된 경우에는, 이러한 2가지 이상의 폴리펩티드는 예를 들어, 분자량, 아미노산의 수 및/또는 서열, 치환체의 수 및/또는 화학적 성질, 또는 적합한 화학적 결합(예: 디설파이드 브릿지)에 의해 연결된 폴리펩티드 쇄의 수에 있어 상이할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을, 바람직하게는 상기 언급된 공정들 중의 한 가지 이상의 공정에 따라서 분리시킨 다음, 하나 이상의 작용성 그룹 Y를 갖는 폴리펩티드와 반응시킨다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 작용성 그룹 Y는 해당 폴리펩티드의 탄수화물 잔기 내에 포함된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "탄수화물 잔기"는 하이드록시알데히드 또는 하이드록시케톤 뿐만 아니라 이들의 화학적 변형물을 지칭한다[참조: Rompp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Germany, 9th edition 1990, Volume 9, pages 2281-2285 및 이에 인용된 문헌]. 추가로, 이는 또한, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 시알산 등의 천연 탄수화물 잔기의 유도체를 지칭한다. 상기 용어에는 화학적으로 산화된 천연 탄수화물 잔기도 포함된다. 이러한 산화된 탄수화물 잔기의 구조는 사이클릭 또는 선형일 수 있다.
탄수화물 잔기는 폴리펩티드 주쇄에 직접적으로 연결될 수 있다. 바람직하게는, 탄수화물 잔기가 탄수화물 측쇄의 일부이다. 보다 바람직하게는, 탄수화물 잔기가 탄수화물 측쇄의 말단 잔기이다.
보다 더 바람직한 양태에서는, 탄수화물 잔기가 탄수화물 측쇄의 갈락토스 잔사, 바람직하게는 탄수화물 측쇄의 말단 갈락토스 잔사이다. 이러한 갈락토스 잔사는 후술되는 바와 같이 말단 시알산을 제거한 다음 산화시킴으로써, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물 내에 포함되거나, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물 내에 포함된 작용성 그룹 X와의 반응에 이용 가능해질 수 있다.
추가의 바람직한 양태에서는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 탄수화물 측쇄의 시알산 잔사, 바람직하게는 탄수화물 측쇄의 말단 시알산 잔사에 연결시킨다.
말단 탄수화물 잔기의 산화는 화학적 또는 효소적으로 수행할 수 있다.
폴리펩티드의 탄수화물 잔기의 화학적 산화 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이에는 퍼요오데이트(periodate)로 처리하는 방법이 포함된다[참조: Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922].
화학적으로 산화시킴으로써, 말단 위치되거나 그렇치 않은 모든 탄수화물 잔기를 산화시키는 것이 원칙적으로 가능하다. 그러나, 순한 조건(10mM 퍼요오데이트, 실온 하 1시간의 엄격한 조건에 비해 1mM 퍼요오데이트, 0℃이다)을 선택함으로써, 탄수화물 측쇄의 말단 시알산을 바람직하게 산화시키는 것이 가능하다.
또 다른 한편, 탄수화물 잔기를 효소적으로 산화시킬 수 있다. 개개의 탄수화물 잔기를 산화시키기 위한 효소는 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어, 갈락토스의 경우에는 해당 효소가 갈락토스 옥시다제이다. 말단 갈락토스 잔기를 산화시키고자 하는 경우, 해당 폴리펩티드가 시알산을 탄수화물 쇄에 부착시킬 수 있는 세포(예: 포유류 세포) 또는 시알산을 탄수화물 쇄에 부착시킬 수 있도록 유전적으로 변형시킨 세포에서 생성되었다면, 말단 시알산을 (부분적으로 또는 완전히) 제거하는 것이 궁극적으로 필요할 것이다. 시알산을 제거하기 위한 화학적 또는 효소적 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Chaplin and Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, especially Chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, pages 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)].
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 폴리펩티드의 작용성 그룹은 티오 그룹이다. 따라서, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 티오에테르 그룹을 통하여 폴리펩티드에 연결시킬 수 있는데, S 원자는 이러한 폴리펩티드 내에 포함된 모든 티오 그룹으로부터 유도될 수 있다.
이러한 양태의 맥락에서, 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 폴리펩티드와 반응시키는 것이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을, 폴리펩티드 내에 포함된 티오 그룹을 통하여 폴리펩티드와 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한, 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을, 폴리펩티드 내에 포함된 티오 그룹 및 산화된 탄수화물 잔기를 통하여 폴리펩티드와 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
티오 그룹은 폴리펩티드 내에 그 자체로서 존재할 수 있다. 더우기, 티오 그룹을 적합한 방법에 따라서 폴리펩티드 내로 도입하는 것이 가능하다. 특히, 화학적 방법을 언급할 수 있다. 디설파이드 브릿지가 폴리펩티드 내에 존재하는 경우에는, -S-S- 구조를 환원시켜 티오 그룹을 수득할 수 있다. 폴리펩티드를 이의 아미노 그룹을 통하여, 2가지 이상의 상이한 작용성 그룹(이들 중의 하나는 아미노 그룹과 반응할 수 있는 것이고, 다른 하나는 SH 그룹 또는 SH 그룹의 전구체이다)을 갖는 화합물과 반응시킴으로써, 폴리펩티드 내에 존재하는 아미노 그룹을 SH 그룹으로 변환시키는 것이 또한 가능하다. 이러한 아미노 그룹의 변형 공정은, 단백질을 먼저, 2가지 이상의 상이한 작용성 그룹(이들 중의 하나는 아미노 그룹과 반응할 수 있는 것이고 다른 하나는 SH 그룹이다)을 갖는 화합물(L)과 반응시킨 다음, 이로써 생성된 반응 생성물을 예를 들어, HAS와 화합물(D)를 포함하는 HAS 유도체(이러한 유도체는 SH 그룹과 반응할 수 있는 작용성 그룹을 포함한다)와 반응시키는 방법의 한 예로서 간주될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 또는 적합한 SH 작용성 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하거나 또는 폴리펩티드 내의 또 다른 시스테인이 디설파이드 브릿지를 형성할 수 없도록 하기 위해 시스테인을 폴리펩티드로부터 제거함으로써 폴리펩티드를 돌연변이시켜 SH 그룹을 도입하는 것이 또한 가능한다.
특히 바람직한 폴리펩티드로서, 에리트로포이에틴(EPO)이 사용된다.
따라서, 본 발명은 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
EPO는 사람 기원[참조: 예를 들면, Inoue, Wada, Takeuchi, 1994, An improved method for the purification of human erythropoietin with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol. Pharm. Bull. 17 (2), 180-4; Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythropoietin., J. Biol. Chem., 252(15), 5558-64] 또는 또 다른 포유류 기원일 수 있고, 사람 신장, 배아 사람 간 또는 동물, 바람직하게는 원숭이 신장과 같은 천연 공급원으로부터 정제함으로써 수득할 수 있다. 더우기, "에리트로포이에틴" 또는 "EPO"란 표현은 1개 이상의 아미노산(예를 들면, 1 내지 25개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산)을 또 다른 아미노산으로 교환시킨, 적혈구생성 활성을 나타내는 EPO-변이체를 포괄하기도 한다[참조: EP 640 619 B1]. 적혈구생성 활성의 측정 방법이 당해 분야에 보고되었다[시험관내 활성 측정에 관해서는 문헌(Fibi et al., 1991, Blood, 77, 1203 ff; Kitamura et al, 1989, J. Cell Phys., 140, 323-334)을 참조할 수 있고; 생체내 EPO 활성의 측정에 관해서는 문헌(Ph. Eur. 2001, 911-917; Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata, 780-785; European Pharmacopoeia (1996/2000); European Pharmacopoeia, 1996, Erythropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa., 8, 371-377; Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl., 1995, N- and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85 (5), 1229-36)을 참조할 수 있으며; EPO 및 변형된 EPO-형태는 1, 2 및 3일째에 NMRI 암컷 마우스에게 주사하고(마우스당 등량의 단백질 50ng), 4일째에 혈액 샘플을 채취하고, 망상 적혈구(reticulocyte)를 결정하였다]. EPO 활성 측정용 시험에 관한 추가의 공개 문헌은 다음과 같다[참조: Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4), 515-22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythropoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(1), 151-5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin, Biochemistry, 31(41), 9871-6; Higuchi, Oheda, Kuboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992; Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol. Chem., 267(11), 7703-9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties, J. Biol. Chem., 266(30), 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(20), 7819-22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythropoietin, Nephron., 51(1), 11-4 (German); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinary erythropoietin on controlled-pore glass and silicic acid, Exp. Hematol, 13(3), 833-7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoietic stimulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol., 11(1), 18-31].
바람직하게는, EPO를 재조합적으로 생성시킨다. 이에는 진핵성 또는 원핵성 세포, 바람직하게는 포유류, 곤충, 효모, 세균성 세포, 또는 EPO를 재조합 생성시키기에 편리한 기타 모든 세포 유형에서의 생성이 포함된다. 추가로, EPO를 형질전환성 동물(예를 들면, 유즙, 혈액 등의 체액), 형질전환성 조류, 특히 가금류의 알, 바람직하게는 계란, 또는 형질전환성 식물에서 발현시킬 수 있다.
폴리펩티드의 재조합 생성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 숙주 세포를 적당한 발현 벡터로 형질감염시키고, 이러한 숙주 세포를, 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 조건 하에 배양한 다음, 폴리펩티드를 숙주 세포로부터 정제하는 것을 포함한다. 상세한 정보는 다음 문헌을 참조할 수 있다[Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 Bl and EP 668 351 B1].
바람직한 양태에서는, EPO가 사람 EPO의 아미노산 서열을 갖는다[참조: EP 148 605 B2].
EPO는 N- 및/또는 C-연결된 당화(glycosylation)를 통하여 EPO에 부착된(즉, EPO가 당화된다) 1개 이상의 탄수화물 측쇄, 바람직하게는 1 내지 12개, 보다 바람직하게는 1 내지 9개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 6개, 특히 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 4개의 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다. 통상적으로, EPO가 진핵성 세포에서 생성되는 경우에는, 이러한 폴리펩티드를 해독후 당화시킨다. 결과적으로, 탄수화물 측쇄는 포유류, 특히 사람, 곤충 또는 효모 세포에서의 생합성 동안에 EPO에 부착될 수 있었을 것이다. 당화 EPO의 구조와 특성이 당해 분야에 광범위하게 보고되어 있다[참조: EP 428 267 B1; EP 640 619 B1; Rush, Derby, Smith, Merry, Rogers, Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure, Anal Chem., 67(8), 1442-52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins, Glycobiology, 1(4), 337-46 (Review)].
따라서, 본 발명에 따르는 하이드록시알킬 전분 유도체는 EPO 분자당 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 12개, 보다 바람직하게는 1 내지 9개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 6개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개의 HAS 분자를 포함할 수 있다. EPO 분자당 HAS-분자의 수는, 생성물을 가수분해시킨 다음, 이로써 생성된 단당류를 유도체화시킨 후에 GC-MS를 사용하여 정량적 탄수화물 조성 분석함으로써 결정할 수 있다[참조: Chaplin and Kennedy (eds.), 1986, Carbohydrate Analysis: a practical approach, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3), especially Chapter 1, Monosaccharides, page 1-36; Chapter 2, Oligosaccharides, page 37-53, Chapter 3, Neutral Polysaccharides, page 55-96].
본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, EPO에 연결된 탄수화물 잔기는 탄수화물 측쇄의 일부이다. 보다 바람직하게는, 이러한 탄수화물 잔기가 탄수화물 측쇄의 말단 잔기이다. 보다 더 바람직한 양태에서는, 상기 탄수화물 잔기가 탄수화물 측쇄의 갈락토스 잔사, 바람직하게는 탄수화물 측쇄의 말단 갈락토스 잔사이다. 이러한 갈락토스 잔사는 후술되는 바와 같이 말단 시알산을 제거한 다음 산화시킴으로써, 화합물(I)과 화합물(II)의 반응 생성물과의 반응에 이용 가능해질 수 있다. 추가의 바람직한 양태에서는, 화합물(I)과 화합물(II)의 반응 생성물을 탄수화물 측쇄의 시알산 잔사, 바람직하게는 탄수화물 측쇄의 말단 시알산 잔사에 연결시킨다. 시알산을 후술되는 바와 같이 산화시킨다.
특히 바람직하게는, 상기 갈락토스 잔사가, 말단 시알산을 제거한 다음 산화시킴으로써, 작용성 그룹 X를 통한 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물과의 반응, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물과의 반응에 이용 가능해진다.
보다 바람직하게는, 상기 갈락토스 잔사가, 말단 시알산을 제거하지 않고 산화시킴으로써, 작용성 그룹 X를 통한 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물과의 반응, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물과의 반응에 이용 가능해진다.
상기 언급된 바와 같이, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 EPO 내에 포함된 티오 그룹과 반응시킨다.
하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 티오 그룹 뿐만 아니라 탄수화물 잔기(이들 각각은 하나 이상의 추가 화합물, 바람직하게는 폴리펩티드, 보다 바람직하게는 에리트로포이에틴 내에 포함되어 있다)와 반응시키는 것이 또한 가능하다.
바람직한 양태에 따르면, 상기 SH 그룹을 예를 들어, 하이드록실아민 유도체, 예를 들면, 2-(아미노옥시)에틸머캅탄 하이드로클로라이드[참조: Bauer L. et al., 1965, J. Org. Chem., 30, 949] 또는 하이드라지드 유도체, 예를 들면, 티오글리콜산 하이드라지드[참조: Whitesides et al., 1977, J. Org. Chem., 42, 332]를 사용함으로써, 바람직하게는 산화된 탄수화물 잔기에 연결시킬 수 있다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 티오 그룹을 바람직하게는 EPO의 산화된 탄수화물 잔기, 보다 바람직하게는 EPO의 탄수화물 측쇄의 일부인 산화된 탄수화물 잔기에 도입한다.
바람직하게는, 티오 그룹이 천연 시스테인 또는 부가된 시스테인으로부터 유도된 것이다. 보다 바람직하게는, EPO가 사람 EPO의 아미노산 서열을 갖고 천연 시스테인이 시스테인 29 및/또는 33이다. 보다 바람직한 양태에서는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 시스테인 29와 반응시키는 반면, 시스테인 33은 또 다른 아미노산으로 대체시킨다. 또 다른 한편으론, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물, 또는 화합물(L)과 추가로 반응되는, 하이드록시알킬 전분과 화합물(D)의 반응 생성물을 시스테인 33과 반응시키는 반면, 시스테인 29는 또 다른 아미노산으로 대체시킨다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "부가된 시스테인"은 폴리펩티드, 바람직하게는 EPO가, 야생형 폴리펩티드에는 존재하지 않는 시스테인 잔사를 포함한다는 것을 지시한다.
이러한 본 발명의 국면의 맥락에서, 시스테인은 EPO의 N- 또는 C-말단에 부가된 부가의 아미노산일 수 있다.
더우기, 상기 부가된 시스테인은 천연 아미노산을 시스테인 또는 적합하게 치환된 시스테인으로 대체시킴으로써 부가될 수 있었을 것이다. 바람직하게는, 이러한 본 발명의 국면 맥락에서, EPO는 사람 EPO이고 대체된 아미노산 잔사는 세린 126이다.
하이드록시알킬 전분과 화합물(L)의 반응 생성물과 임의의 화합물(D)와의 반응 또는 추가 화합물(M)과의 반응에 관한 반응 조건에 관해서는, 특정한 어떠한 제한 사항도 존재하지 않으며, 이러한 반응 조건은 구체적인 요구 사항에 따라서 조정될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 물을 용매로서 사용하는데, 이는 단독으로 사용되거나 또는 하나 이상의 기타 용매와 조합하여 사용된다. 하나 이상의 기타 용매로서, DMSO, DMF, 메탄올 및 에탄올을 언급할 수 있다. 물 이외의 바람직한 용매는 메탄올 및 에탄올이다. 기타 바람직한 양태에 따르면, DMSO, DMF, 메탄올, 에탄올, 또는 이들 둘 이상의 혼합물을 용매로서 사용한다.
예를 들어, 하이드록시알킬 전분을 이러한 전분의 비-산화된 환원성 말단의 반응을 통하여 하이드록실아민, 예를 들면, O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록시 아민과 반응시키고, 이러한 반응 생성물을 알데히드, 케토, 아세탈 또는 헤미아세탈 그룹을 통하여, 폴리펩티드, 바람직하게는 에리트로포이에틴과 추가로 반응시키는 경우와 같이, 하이드록시알킬 전분을 수성 시스템 중에서 화합물(L)과 반응시키는 경우에는, 반응 온도가 바람직하게는 4 내지 37℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30℃, 특히 바람직하게는 15 내지 25℃ 범위 내이다.
추가 화합물(M), 바람직하게는 폴리펩티드, 특히 바람직하게는 에리트로포이에틴을 포함하는 반응 생성물의 분리는 천연 및 재조합 EPO를 정제시키는 것으로 공지된 과정(예를 들면, 크기별 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, RP-HPLC, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 이들의 조합 방법)을 사용함으로써 수행할 수 있다. 상기 반응 생성물의 분리는 한 가지 이상의 단계를 포함할 수 있는 적합한 공정에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 반응 생성물을 먼저, 적합한 방법, 예를 들면, 원심분리 또는 여과에 의해 반응 혼합물로부터 분리시키거나 또는 반응 혼합물과 예를 들어, 에탄올-아세톤 혼합물과의 혼합물로부터 분리시킨다. 제2 단계에서는, 상기와 같이 분리된 반응 생성물을 대상으로 하여, 후처리형 투석, 원심분리성 여과 또는 압력 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면, Q-세파로스를 함유하는 칼럼 크로마토그래피, HPLC, MPLC, 겔 여과 및/또는 동결건조와 같은 추가 처리를 수행할 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 분리시킨 반응 생성물을 먼저, 바람직하게는 물에 대해 투석시킨 다음, 반응 생성물의 용매 함량이 목적하는 생성물 명세에 따라 충분히 낮아질 때까지 동결건조시킨다. 동결건조는 20 내지 35℃, 바람직하게는 25 내지 30℃에서 수행할 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 상기 반응 생성물을 포함하는 반응 혼합물을 Q-세파로스 함유 칼럼에 적용하여 용출액을 수득하고, 이를 예를 들어, 원심분리성 여과시킴으로써 농축시킨다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술된 방법들 중의 한 가지 이상의 방법에 의해 제조되는 하이드록시알킬 전분 유도체를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은
- 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 또는
- 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 이러한 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1과 하나 이상의 작용성 그룹 W를 포함하는 화합물 (D)와 반응시킴으로써 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를
- 상기 하이드록시알킬 전분과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1, 또는 상기 하이드록시알킬 전분 유도체 내에 포함된 작용성 그룹 W와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z2와,
추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X(상기 작용성 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 또는 티오 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)
를 포함하는 화합물(L)과 반응시키는 단계를 포함하는 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것인데, 상기 하이드록시알킬 전분은 다음 화학식 I에 따르는 구조를 갖는다:
화학식 I
바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 선형 또는 분지된 하이드록시알킬 그룹인 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
보다 더 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 2-하이드록시에틸 그룹인 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분이 하이드록시에틸 전분인 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 Z1이 구조 -NH-를 포함하는 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 Z1이 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 X가 구조 -NH-를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 Y가 -SH이고 작용성 그룹 X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 상기 언급된 바와 같은 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을, 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시키지 않음으로써, 이러한 하이드록시알킬 전분이 화학식 I에 따르는 구조를 갖는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
화학식 I
또 다른 특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을, 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시킴으로써, 이러한 하이드록시알킬 전분이 화학식 IIa 및/또는 화학식 IIb에 따르는 구조를 갖는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
화학식 IIa
화학식 IIb
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 환원성 말단을 알칼리성 요오드 용액에 의해 산화시킨, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키고; 이로써 생성된 반응 생성물을, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 하이드록시알킬 전분과 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시켜 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하는, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시킨, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체와 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시킨, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하나 이상의 추가 화합물(M)이 폴리펩티드인, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다.
다음에 HAS-EPO 접합체로서 지칭되고, 하이드록시알킬 전분과 화합물(L), 임의 화합물(D) 및 에리트로포이에틴과의 반응에 의해 형성되는 하이드록시알킬 전분 유도체는 접합시키기 전의 에리트로포이에틴과 비교해서 개선된 생물학적 안정성을 나타낸다는 이점을 지니고 있다. 더우기, 이는 표준 BRP EPO 보다 높은 생물학적 활성을 나타낸다. 이는 이러한 하이드록시알킬 전분 유도체가 간 및 신장의 제거 시스템에 의해 덜 인식되거나 심지어 전혀 인식되지 않기 때문에, 순환계 내에서 보다 장시간 지속된다는 사실에 주로 기인된 것이다. 더우기, HAS는 부위 특이적으로 부착되기 때문에, HAS를 EPO에 접합시킴으로써 EPO의 생체내 생물학적 활성을 파괴시킬 위험은 최소화된다.
본 발명의 HAS-EPO 접합체는 재조합 본래의 EPO와 본질적으로 동일한 시험관내 생물학적 활성을 나타낼 수 있는데, 이는 시험관내 생물학적 활성은 EPO 수용체에 대한 결합 친화성 만을 측정하기 때문이다. 시험관내 생물학적 활성을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
더우기, HAS-EPO는 접합을 위한 출발 물질로서 사용된 EPO(접합되지 않은 EPO) 보다 높은 생체내 활성을 나타낸다. 생체내 생물학적 활성을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
접합되지 않은 EPO의 생체내 활성을 100%로 설정할 경우, HAS-EPO 접합체의 생체내 활성은 110 내지 500%, 바람직하게는 300 내지 400%, 또는 바람직하게는 110 내지 300%, 보다 바람직하게는 110 내지 200%, 보다 더 바람직하게는 110 내지 180%, 또는 110 내지 150%, 가장 바람직하게는 110 내지 140%을 나타낼 수 있다.
고도로 시알릴화된 EPO(Amgen; EP 428 267 B1 참조)와 비교하면, 고도로 시알릴화된 EPO의 생체내 활성을 100%로 설정한 경우, HAS-EPO는 고도로 시알릴화된 EPO의 생체내 활성의 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 85% 이상 또는 95% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 또는 300% 이상을 나타낼 수 있다. 가장 바람직하게는, 고도로 시알릴화된 EPO의 생체내 활성의 95% 이상을 나타낸다.
본 발명의 HAS-EPO 접합체의 높은 생체내 생물학적 활성은, 이러한 HAS-EPO 접합체가 간의 제거 시스템에 의해 덜 인식되고 보다 큰 분자량으로 인해 신장 청소율이 감소되기 때문에, 접합되지 않은 EPO 보다 순환계 내에 보다 장기간 유지된다는 사실에 주로 기인된 것이다. 순환시 EPO의 생체내 반감기를 결정하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(3), 1184-8].
결론적으로, 현재 시판중인 EPO 제제 보다 덜 자주 투여될 수 있는 HAS-EPO 접합체를 제공하는 것이 본 발명의 커다란 이점이다. 표준 EPO 제제는 최소한 3일마다 투여해야만 하지만, 본 발명의 HAS-EPO 접합체는 바람직하게는 1주 2회, 보다 바람직하게는 1주 1회 투여한다.
더우기, 본 발명의 방법은 최종 수율을 떨어뜨리는 시간 소모적이고 광범위한 정제 단계를 포함하지 않기 때문에, 예를 들면, 낮은 생체내 생물학적 활성을 나타내거나 생체내 생물학적 활성을 전혀 나타내지 않는 것으로 공지된 수준 이하로 시알릴화된 EPO 형태를 정제 제거할 필요가 없기 때문에, 유효한 EPO 유도체를 저렴한 비용으로 제조할 수 있다는 이점을 지니고 있다. 특히 실시예 8.11(d)는 변형 단계를 거의 수반하지 않고 제조된 HES-EPO가 표준 BRP EPO에 비해 3배 높은 활성을 나타낸다는 사실을 입증해준다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 HAS-EPO 접합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
더우기, 본 발명은 본 발명의 HAS-폴리펩티드 접합체, 바람직하게는 HAS-EPO 접합체, 보다 바람직하게는 HES-EPO 접합체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서는, 본 발명의 약제학적 조성물이 에리트로포이에틴 치료법에 유용한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 아쥬반트(adjuvant) 및/또는 담체를 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한,
- 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 또는
- 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 이러한 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1과 하나 이상의 작용성 그룹 W를 포함하는 화합물 (D)와 반응시킴으로써 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를
- 상기 하이드록시알킬 전분과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1, 또는 상기 하이드록시알킬 전분 유도체 내에 포함된 작용성 그룹 W와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z2와,
추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X(상기 작용성 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 또는 티오 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)
를 포함하는 화합물(L)과 반응시키는 단계를 포함하고, 하이드록시알킬 전분, 화합물(L) 및 임의 화합물(D)를 포함하는 반응 생성물을 추가 화합물(M)[여기서, 하나 이상의 추가 화합물은 폴리펩티드이다]과 반응시키는 단계를 추가로 포함하는, 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것인데, 상기 하이드록시알킬 전분은 다음 화학식 I에 따르는 구조를 갖는다:
화학식 I
더우기, 본 발명은 빈혈 장애 또는 조혈성 기능 장애, 또는 이와 관련된 질환 치료용 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 하이드록시알킬 전분 유도체의 용도에 관한 것이다.
바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 폴리펩티드가 항트롬빈(AT), 바람직하게는 AT III인, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다[참조: Levy JH, Weisinger A, Ziomek CA, Echelard Y, Recombinant Antithrombin: Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4(2001) 405-416; Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, Hanson E, Bernasconi R, Higgins E, Manavalan P, Ziomek C, Meade H, McPherson J, Cole ES, Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12(1998) 4661-4671; Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM, Lubbers YTP, Pratt BM, Whittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons lethally challenged with Escherichia coli, Blood 95, 4(2000) 1117-1123; Van Patten SM, Hanson EH, Bernasconi R, Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McPherson JM, Edmunds T, Oxidation of Methionin Residues in Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274, 15(1999) 10268-10276].
기타 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 폴리펩티드가 G-CSF 또는 IFN-베타인 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 Y가 -SH이고, 화합물(L)이 구조식 Z1-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
[상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, L'가 Z1과 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 화합물(L)이 구조식 Z1-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, L'가 Z1과 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 Y가 -SH이고, 화합물(D)가 구조식 Z1-D'-W의 화합물이며 화합물(L)이 구조식 Z2-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
[상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
[상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나, 또는 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 상기 언급된 바와 같은 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, D'가 Z1과 W를 브릿징하는 유기 쇄이거나 D'가 부재하고, L'가 Z2와 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 화합물(D)가 구조식 Z1-D'-W의 화합물이며 화합물(L)이 구조식 Z2-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
_
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
[상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나, 또는 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 상기 언급된 바와 같은 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
[상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, D'가 Z1과 W를 브릿징하는 유기 쇄이거나 D'가 부재하고, L'가 Z2와 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 하이드록시알킬 전분을 수성 매질 중에서 다음 식에 따르는 화합물과 반응시키고, 이러한 반응 생성물을 에리트로포이에틴과 반응시키는, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다:
보다 더 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 에리트로포이에틴을 반응에 앞서 과요오드화나트륨으로 산화시키는, 전술된 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 에리트로포이에틴을 부분 탈시알릴화시키고, 반응에 앞서 과요오드화나트륨으로 후속 산화시키는, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에 따르면, 실시예 6에 따르는 완전히 환원된 티오-EPO를 근거로 하여 제조되는 하이드록시알킬 전분 유도체를 포함하는 약제학적 조성물은 제외된다.
상기 언급된 약제학적 조성물은 빈혈 장애 또는 조혈 기능 장애, 또는 이와 관련된 질환을 치료하는데 특히 적합하다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료학적 유효량"은 소정의 질환 및 투여 섭생에 대해 치료학적 효과를 제공해주는 양이다. 에리트로포이에틴 이소형을 비경구 경로로 투여하는 것이 바람직하다. 선택된 구체적인 투여 경로는 치료하고자 하는 질환에 좌우될 것이다. 에리트로포이에틴 이소형의 투여는 적합한 담체, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 적합한 희석제, 예를 들면, 완충 식염수, 및/또는 적합한 아쥬반트를 함유하는 제형의 일부로서 수행하는 것이 바람직하다. 요구되는 투여량은 환자의 적혈구 용적율(hematocrit)을 상승시키기에 충분한 양일 것이며, 치료하고자 하는 질환의 중증도, 사용된 투여 방법 등에 따라서 다양할 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 치료의 목적은 바람직하게는, 혈중 헤모글로빈 수치를 6.8mmol/l 이상으로 증가시키는 것이다. 이를 위해, 헤모글로빈 수치를 매주 0.6mmol/l 내지 1.6mmol/l으로 증가시키는 방식으로 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다. 헤모글로빈 수치가 8.7mmol/l를 초과하게 되면, 헤모글로빈 수치가 8.1mmol/l 아래로 떨어질 때까지 치료법을 중단하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 피하, 정맥내 또는 비경구 주사용으로 적합한 제형에 사용되는 것이 바람직하다. 이를 위해 적합한 부형제 및 담체는, 예를 들어, 인산이수소 나트륨, 인산수소 이나트륨, 나트륨 클로레이트, 폴리솔베이트 80, HSA 및 주사용 수이다. 본 발명의 조성물은 1주 3회, 바람직하게는 1주 2회, 보다 바람직하게는 1주 1회, 가장 바람직하게는 2주마다 투여할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물을 환자 체중 kg당 0.01 내지 10㎍, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5㎍, 0.1 내지 1㎍, 또는 0.2 내지 0.9㎍, 보다 바람직하게는 0.3 내지 0.7㎍, 가장 바람직하게는 0.4 내지 0.6㎍의 양으로 투여한다.
일반적으로, 1회 투약당 바람직하게는 10 내지 200㎍, 바람직하게는 15 내지 100㎍을 투여한다.
본 발명은 추가로, 사람 또는 동물체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따르는 HAS-폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 빈혈 장애 또는 조혈 기능 장애, 또는 이와 관련된 질환 치료용 약물을 제조하기 위한, 본 발명에 따르는 HAS-EPO 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라서 사용된 화합물(L)이 1개 이상의 키랄 중심을 포함하는 경우, 화합물(L)는 각 키랄 중심에 대해 R 입체 구조 또는 S 입체 구조, 또는 라세미 화합물로서 존재할 수 있다.
본 발명에 임의로 사용된 화합물(D)가 1개 이상의 키랄 중심을 포함하는 경우, 화합물(D)는 각 키랄 중심에 대해 R 입체 구조 또는 S 입체 구조, 또는 라세미 화합물로서 존재할 수 있다.
본 발명은 다음 실시예, 표 및 도면에 의해 추가로 예시되지만, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
실시예 1: 비-산화된 환원성 말단의 환원적 아민화 반응에 의한 하이드록시에틸 전분 유도체의 형성
실시예 1.1: 하이드록시에틸 전분과 1,3-디아미노-2-하이드록시 프로판과의 반응
a) 5ml 물 중의 200mg 하이드록시에틸 전분(HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4))의 용액에, 0.83mmol 1,3-디아미노-2-하이드록시 프로판(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 가한다. 이로써 생성된 혼합물을 80℃에서 17시간 동안 항온 배양한다. 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
b) 0.83mmol 1,3-디아미노-2-하이드록시 프로판 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 200mg 하이드록시에틸 전분의 용액에 부가함으로써 생성된 혼합물을 항온 배양하는 것이 또한 가능한데, 이는 25℃에서 3일 동안 수행한다.
실시예 1.2: 하이드록시에틸 전분과 1,2-디하이드록시-3-아미노 프로판과의 반응
a) 5ml 물 중의 200mg 하이드록시에틸 전분(HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4))의 용액에, 0.83mmol 1,2-디하이드록시-3-아미노 프로판(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 가한다. 이로써 생성된 혼합물을 80℃에서 17시간 동안 항온 배양한다. 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
b) 0.83mmol 1,2-디하이드록시-3-아미노 프로판 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 200mg 하이드록시에틸 전분의 용액에 부가함으로써 생성된 혼합물을 항온 배양하는 것이 또한 가능한데, 이는 25℃에서 3일 동안 수행한다.
1,2-디하이드록시-3-아미노 프로판과 HES와의 반응은 문헌[참조: G. Avigad, Anal. Biochem. 134(1983) 449-504]에 기재된 바와 같이, 반응 생성물 중의 1,2-디올을 퍼요오데이트에 의해 산화적 절단시킴으로써 생성된 포름알데히드를 정량화함으로서 간접적으로 확인하였다.
실시예 1.3: 하이드록시에틸 전분과 1,4-디아미노 부탄과의 반응
a) 5ml 물 중의 200mg 하이드록시에틸 전분(HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4))의 용액에, 0.83mmol 1,4-디아미노 부탄(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 가한다. 이로써 생성된 혼합물을 80℃에서 17시간 동안 항온 배양한다. 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
b) 0.83mmol 1,4-디아미노 부탄 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 200mg 하이드록시에틸 전분의 용액에 부가함으로써 생성된 혼합물을 항온 배양하는 것이 또한 가능한데, 이는 25℃에서 3일 동안 수행한다.
실시예 1.4: 하이드록시에틸 전분과 1-머캅토-2-아미노 에탄과의 반응
a) 5ml 물 중의 200mg 하이드록시에틸 전분(HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4))의 용액에, 0.83mmol 1-머캅토-2-아미노 에탄(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 가한다. 이로써 생성된 혼합물을 80℃에서 17시간 동안 항온 배양한다. 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
b) 0.83mmol 1-머캅토-2-아미노 에탄 및 50mg 나트륨 시아노보로하이드레이트 NaCNBH3를 200mg 하이드록시에틸 전분의 용액에 부가함으로써 생성된 혼합물을 항온 배양하는 것이 또한 가능한데, 이는 25℃에서 3일 동안 수행한다.
실시예 2: 비-산화된 환원성 말단과의 접합에 의한 하이드록시에틸 전분 유도체의 형성
실시예 2.1: 하이드록시에틸 전분과 카보하이드라지드와의 반응
0.96g의 HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4)를 8ml 수성 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)에 용해시키고, 8mmol 카보하이드라지드(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D)를 가한다. 25℃에서 18시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 3일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
실시예 2.2: 하이드록시에틸 전분과 아데프산 디하이드라지드와의 반응
0.96g의 HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4)를 8ml 수성 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)에 용해시키고, 8mmol 아데프산 디하이드라지드(Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D)를 가한다. 25℃에서 18시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전된 생성물을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 3일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
실시예 2.3: 하이드록시에틸 전분과 1,4-페닐렌-비스-3-티오세미카바지드와의 반응
0.96g의 HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4)를 8ml 수성 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)에 용해시키고, 8mmol 1,4-페닐렌-비스-3-티오세미카바지드(Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D)를 가한다. 25℃에서 18시간 동안 교반시킨 후, 8ml 물을 상기 반응 혼합물에 가하고, 현탁액을 4,500rpm으로 15분 동안 원심분리시킨다. 청정한 상등액을 경사 제거한 후, 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전된 생성물을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 4,500rpm으로 15분 동안 원심분리시킨다. 청정한 상등액을 물에 대해 3일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
실시예 2.4: 하이드록시에틸 전분과 O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민과의 반응
O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민을 문헌[참조: Boturyn et al. Tetrahedron 53 (1997) p. 5485-5492]에 기재된 바와 같이, 시판용 물질로부터 2 단계로 합성하였다.
0.96g의 HES 18/0.4(MW = 18,000 D, DS=0.4)를 8ml 수성 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)에 용해시키고, 8mmol O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실 아민를 가한다. 25℃에서 18시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전된 생성물을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 3일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
실시예 3: 산화된 환원성 말단과의 반응에 의한 하이드록시에틸 전분 유도체의 형성
실시예 3.1: 하이드록시에틸 전분과 카보하이드라지드와의 반응
0.12mmol 옥소-HES 10/0.4(MW = 10,000 D, DS=0.4; DE 196 28 705 A1에 따라서 제조됨)를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 15mmol 카보하이드라지드(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D)의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 65℃에서 88시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
실시예 3.2: 하이드록시에틸 전분과 1,4-페닐렌-비스-3-티오세미카바지드와의 반응
0.12mmol 옥소-HES 10/0.4(MW = 10,000 D, DS=0.4; DE 196 28 705 A1에 따라서 제조됨)를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 15mmol 1,4-페닐렌-비스-3-티오세미카바지드(Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D)의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 65℃에서 88시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 찬 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), 동결건조시킨다.
실시예 3.3: 하이드록시에틸 전분과 하이드라진과의 반응
1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES 10/0.4(MW = 10,000 D, DS=0.4; DE 196 28 705 A1에 따라서 제조됨)를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 0.47ml(15mmol) 하이드라진의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 40℃에서 19시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전된 생성물을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 수용액 중의 0.5%(v/v) 트리에틸아민에 대해 2일 동안 투석시키고, 물에 대해 2일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다.
실시예 3.4: 하이드록시에틸 전분과 하이드록실아민과의 반응
O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실아민을 문헌[참조: Boturyn, Boudali, Constant, Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485]에 기재된 바와 같이, 시판용 물질로부터 2 단계로 합성하였다.
1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES 10/0.4(MW = 10,000 D, DS=0.4; DE 196 28 705 A1에 따라서 제조됨)를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 2.04g(15mmol) O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실아민의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 65℃에서 48시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전된 생성물을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다.
실시예 3.5: 하이드록시에틸 전분과 아데프산 디하이드라지드와의 반응
1.74g(15mmol) 아데프산 디하이드라지드(Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D)을 65℃에서 20ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 3ml 무수 DMSO에 용해시킨 1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES 10/0.4(MW = 10,000 D, DS=0.4; DE 196 28 705 A1에 따라서 제조됨)를 질소 하에 적가한다. 60℃에서 68시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 물 200ml에 가한다. 반응 생성물을 함유하는 용액을 수용액 중의 0.5%(v/v) 트리에틸아민에 대해 2일 동안 투석시키고, 물에 대해 2일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다.
실시예 3.6: 하이드록시에틸 전분과 1,4-디아미노 부탄과의 반응
1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES 10/0.4(MW = 10,000 D, DS=0.4; DE 196 28 705 A1에 따라서 제조됨)를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 1.51ml(15mmol) 1,4-디아미노부탄(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D)의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 40℃에서 19시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물(v/v) 160ml에 가한다. 침전물 아미노-HES 10KD/0.4를 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다.
실시예 4: 에리트로포이에틴의 산화
산화된 에리트로포이에틴은 실시예 8에 기재된 바와 같이 제조한다. 산화된 에리트로포이에틴으로서, 실시예 8.11(c)에 기재된 바와 같은 EPO-GT-1-A(산 가수분해시키지 않고, 순한 퍼요오데이트 산화 처리시킨 EPO-GT-1)를 사용하였다.
실시예 5: 하이드록시에틸 전분 유도체와 실시예 4의 산화된 에리트로포이에틴과의 접합
실시예 5.1: 산화된 에리트로포이에틴과 실시예 2.1의 반응 생성물과의 반응
20mM PBS 완충액 중의 산화된 EPO(1.055㎍/㎕)를, 5M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)을 사용하여 pH 5.3이 되도록 조종한다. 19㎕의 상기 EPO 용액에, 실시예 2.1에 따라서 제조된 바와 같은 HES 유도체 용액 18㎕(MW 18 kD; 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 중의 18.7㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 1에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 5.2: 산화된 에리트로포이에틴과 실시예 2.3의 반응 생성물과의 반응
20mM PBS 완충액 중의 산화된 EPO(1.055㎍/㎕)를, 5M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)을 사용하여 pH 5.3이 되도록 조종한다. 19㎕의 상기 EPO 용액에, 실시예 2.3에 따라서 제조된 바와 같은 HES 유도체 용액 18㎕(MW 18 kD; 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 중의 18.7㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다.
실시예 5.3: 산화된 에리트로포이에틴과 실시예 2.4의 반응 생성물과의 반응
20mM PBS 완충액 중의 산화된 EPO(1.055㎍/㎕)를, 5M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)을 사용하여 pH 5.3이 되도록 조종한다. 19㎕의 상기 EPO 용액에, 실시예 2.4에 따라서 제조된 바와 같은 HES 유도체 용액 18㎕(MW 18 kD; 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 중의 18.7㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 2에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 5.4: 산화된 에리트로포이에틴과 실시예 3.1의 반응 생성물과의 반응
20mM PBS 완충액 중의 산화된 EPO(1.055㎍/㎕)를, 5M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)을 사용하여 pH 5.3이 되도록 조종한다. 19㎕의 상기 EPO 용액에, 실시예 3.1에 따라서 제조된 바와 같은 HES 유도체 용액 18㎕(MW 10 kD; 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 중의 18.7㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 3에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 결합된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 5.5: 산화된 에리트로포이에틴과 실시예 3.2의 반응 생성물과의 반응
20mM PBS 완충액 중의 산화된 EPO(1.055㎍/㎕)를, 5M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2)을 사용하여 pH 5.3이 되도록 조종한다. 19㎕의 상기 EPO 용액에, 실시예 3.2에 따라서 제조된 바와 같은 HES 유도체 용액 18㎕(MW 10 kD; 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.2) 중의 18.7㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 3에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 6: 에리트로포이에틴의 환원에 의한 티오-EPO의 형성
500㎕의 0.1M 붕산나트륨 완충액, 5mM EDTA, 10mM DTT(Lancaster, Morcambe, UK), pH 8.3 중의 241.5㎍ 에리트로포이에틴(EPO-GT-1; 실시예 8 참조)을 37℃에서 1시간 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 10 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 상기 붕산염 완충액으로 3회 세척한 다음 인산염 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)으로 2회 세척함으로써, DTT를 제거하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
실시예 7: 가교 결합성 화합물을 사용한 티오-에리트로포이에틴과 하이드록시에틸 전분 유도체와의 접합
각각의 다음 실시예에서, N-(알파-말레이미도아세톡시) 석신이미드 에스테르(AMAS)를 가교 결합성 화합물로서 사용하였다:
실시예 7.1: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 2.1과 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 2.1에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 0.1M 인산나트륨 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가한다. 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, 잔여 AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 실시예 5에 따라서 제조된 바와 같은 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 4에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.2: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 2.2와 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 2.2에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 0.1M 인산나트륨 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가한다. 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, 잔여 AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 실시예 5에 따라서 제조된 바와 같은 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 5에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.3: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 2.3과 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 2.3에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 0.1M 인산나트륨 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가한다. 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, 잔여 AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 실시예 5에 따라서 제조된 바와 같은 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 5에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.4: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 2.4와 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 2.4에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 0.1M 인산나트륨 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가한다. 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, 잔여 AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 실시예 5에 따라서 제조된 바와 같은 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 4에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.5: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 1.1과 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
80℃에서 17시간 동안의 항온 배양 조건 뿐만 아니라 25℃에서 3일 동안의 항온 배양 조건 하에, 실시예 1.1에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 0.1M 인산나트륨 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가한다. 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, 잔여 AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 실시예 5에 따라서 제조된 바와 같은 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 5에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.6: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 1.3과 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
80℃에서 17시간 동안의 항온 배양 조건 뿐만 아니라 25℃에서 3일 동안의 항온 배양 조건 하에, 실시예 1.3에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 0.1M 인산나트륨 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가한다. 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, 잔여 AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 실시예 5에 따라서 제조된 바와 같은 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 5에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.7: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 3.1과 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 3.1에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 인산염 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가하고, 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 6에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.8: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 3.2와 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 3.2에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 인산염 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가하며, 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, D)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 6에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.9: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 3.3과 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 3.3에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 인산염 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가하고, 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, Germany)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 6에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.10: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 3.4와 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 3.4에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 인산염 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가하고, 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, Germany)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 6에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.11: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 3.5와 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 3.5에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 인산염 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가하고, 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, Germany)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 6에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 7.12: 티오-에리트로포이에틴과, 실시예 3.6과 가교 결합성 화합물의 반응 생성물과의 반응
실시예 3.6에 따라서 제조된 바와 같고 200㎕의 인산염 완충액(0.1M, 9.15M NaCl, 50mM EDTA, pH 7.2)에 용해시킨 50nmol HES 유도체에, DMSO 중의 2.5μmol AMAS(Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) 용액 10㎕를 가하고, 청정한 용액을 25℃에서 80분 동안 및 40℃에서 20분 동안 항온 배양한다. VIVASPIN 0.5ml 농축기, 5 KD MWCO(VIVASCIENCE, Hannover, Germany)를 사용하여 13,000rpm으로 원심분리성 여과시키고, 이어서 인산염 완충액으로 30분 동안 4회 세척함으로써, AMAS를 제거하였다.
잔류성 용액에, 티오-EPO 15㎍(인산염 완충액 중의 1㎍/㎕)을 가하고, 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 항온 배양한다. 동결건조시킨 후, Invitrogen에 의해 제공된 지시서에 기재된 바와 같이, NuPAGE 10% Bis-Tris 겔/MOPS 완충제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 상기 조 생성물을 SDS-PAGE 분석하였다. 상기 겔을 Roti-Blue 쿠마시 염색용 시약(Roth, Karlsruhe, D)을 사용하여 밤새 염색하였다.
이러한 실험 결과가 도 6에 도시되어 있다. 성공적인 접합은 단백질 밴드가 보다 고분자량 쪽으로 이동함으로써 지시된다. 밴드 폭 증가는 사용된 HES 유도체의 분자량 분포도와 단백질에 연결된 HES 유도체의 수에 기인한 것이다.
실시예 8: HES-EPO 접합체의 제조
요약
HES 유도체(평균 mw 18,000 달톤; 하이드록시에틸 치환도 0.4)를, 재조합 사람 EPO의 올리고당류 쇄 상의 부분적으로(순한 퍼요오데이트) 산화된 시알산 잔사에 커플링시킴으로써, HES-EPO 접합체를 합성한다. 탄수화물 구조 분석을 근거로 하면, 이와 같이 도입된 변형물은 코어 올리고당류 쇄의 구조적 원형 보전에 전혀 영향을 미치지 않았는데, 이는 순한 산 처리된 HES-변형된 글리칸을 MALDI/TOF-MS 분석한 결과, 이는 변형되지 않은 EPO 생성물에서 관찰된 것과 구별할 수 없을 정도로 본래 중성의 N-아세틸락토사민-유형 쇄인 것으로 밝혀졌기 때문이다. 이와 같이 수득된 결과는, 미리 부분 시알산 제거시키지 않으면서 변형시킨 EPO 제제의 경우에는 EPO 분자당 3개 이상의 변형된 HES-잔사가 부착된다는 사실을 지시해준다. 이전 단백질의 시알산 잔사의 약 50%가 결여된 EPO 변이체는 SDS-PAGE에서 유사한 외견상(겉보기) 고분자량 이동도를 나타내었다(BRP EPO 표준물에 대한 40 KDa 대 60-110 KDa). HES 변형된 EPO는 pH 3 내지 10의 실온에서 표준 이온-교환 크로마토그래피 조건 하에 안정적이다.
정상적혈구증(normocythaemic) 마우스 시스템에서의 EPO-생물학적 검정 결과는 HES-변형된 EPO가, 유럽 약전(European Pharmacopeia)으로부터의 UV 흡광치를 이용한 단백질 결정법과 BRP EPO 표준 제제에 대해 보정된 RP-HPLC EPO 단백질 결정법을 기준으로 하여 국제 BRP EPO 기준 표준물과 비교할 경우에, 본 검정에서 2.5 내지 3.0배 정도 더 높은 특이 활성(IU/mg)을 지니고 있다는 사실을 지시해준다.
실시예 8.1: 물질 및 방법
(a) N-글리코시다제로의 분해에 의한 N-연결된 올리고당류의 방출
샘플을 37℃에서 밤새 25 단위(제조업자의 명세서에 따름, Roche Diagnostics, Germany)의 재조합 PNGase F와 함께 항온 배양한다. SDS-PAGE에서 해당 단백질의 특이 이동도 변위에 의해 완전한 분해를 모니터한다. 찬 100% 에탄올 3 용적을 부가하고 -20℃에서 2시간 이상 동안 항온 배양함으로써, 방출된 N-글리칸을 폴리펩티드로부터 격리시킨다[참조: Schroeter S et al., 1999]. 침전된 단백질을 4℃에서 10분 동안 13,000rpm으로 원심분리시킴으로써 제거한다. 이어서, 펠릿을 500㎕의 빙냉 75% 에탄올로 2회 부가 세척시킨다. 모아진 상등액 중의 올리고당류를 진공 원심분리기(Speed Vac 농축기, Savant Instruments Inc., USA)에서 건조시킨다. 하이퍼카브(Hypercarb) 카트릿지(25mg 또는 100mg의 하이퍼카브)를 사용하여, 글리칸 샘플을 사용하기에 앞서 다음과 같이 탈염시킨다: 칼럼을 0.1% TFA 중의 3 x 500㎕의 80% 아세토니트릴(v/v)로 세척한 다음, 3 x 500㎕ 물로 세척한다. 물을 사용하여 상기 샘플을 희석시켜, 최종 용적 300 내지 600㎕가 되도록 한 후, 카트릿지 상에 부하한 다음 물로 철저하게 세척한다. 올리고당류를, 0.1% 트리플루오로아세트산(v/v)을 함유하는 수중 1.2ml(25mg 카트릿지; 100mg 카트릿지의 경우에는 1.8ml) 25% 아세토니트릴로 용출시킨다. 이와 같이 용출된 올리고당류를 2M NH4OH로 중화시키고, Speed Vac 농축기에서 건조시킨다. 몇몇 경우에는, 총 (당)단백질 <100㎍ 샘플로부터의 분해 혼합물을 100mg 하이퍼카브 카트릿지 상으로 흡착시킴으로써, N-글리코시다제 방출된 올리고당류의 탈염 과정을 수행한다.
(b) 매트릭스-촉진된 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광법(MALDI/TOF/TOF-MS)에 의한 올리고당류의 분석
브루커(Bruker) ULTRAFLEX 비행 시간(TOF/TOF) 기기를 사용하였다: 양이온 모드 뿐만 아니라 음이온 모드(양 경우에 있어 반사를 이용한다)에서 UV-흡수 물질로서 2,5-디하이드록시벤조산을 사용하여, 본래의 탈시알릴화 올리고당류를 분석하였다. MS-MS 분석을 위해, 선별된 모 이온을 대상으로 레이저 유도된 해리를 수행하는데, 이로써 생성된 단편 이온들은 상기 기기의 제2 TOF 단(LIFT)에 의해 분리되었다. 농도가 대략 1 내지 10pmol/㎕인 1㎕ 샘플 용액을 등량의 각각의 매트릭스와 혼합한다. 이 혼합물을 스테인레스 강(stainless steel) 표적물 상으로 스폿팅하고, 분석에 앞서 실온에서 건조시킨다.
실시예 8.2: 재조합 사람 EPO(EPO-GT-1)의 제조 및 성상 확인
EPO를 문헌[참조: Mueller PP et al., 1999, Dorner AJ et al., 1984]에 기재된 바와 같이 재조합 CHO 세포로부터 발현시키고, 해당 제제를 문헌[참조: Eur. Phar. (Ph. Eur. 4, Monography 01/2002:1316:Erythropoietin concentrated solution)]에 기재된 방법에 따라서 성상 확인하였다. 최종 생성물은 단백질 1nMol당 12nMol(±1.5nMol)의 시알산 함량을 지니고 있다. N-연결된 올리고당류의 구조는 문헌[참조: Nimtz et al., 1999, Grabenhorst, 1999]에 기재된 바와 같은 MALDI/TOF-MS 및 HPAEC-PAD에 의해 결정하였다. 수득된 EPO 제제는 디-, 트리- 및 테트라시알릴화 올리고당류를 함유하였다(각각 2 내지 12%, 15 내지 28% 및 60 내지 80%; 황화된 쇄와 펜타시알릴화된 쇄가 소량으로 존재한다). EPO 제제의 전반적인 당화 특징은 국제 BRP EPO 표준 제제의 당화 특징과 유사하였다.
재조합 EPO의 등전 집중 패턴은 국제 BRP 기준 EPO 표준 제제의 것에 필적하는데, 이는 이것이 상응하는 이소형이라는 것을 보여준다. EPO 단백질의 25%에서, 폴리펩티드 쇄의 Ser126에서의 O-당화가 결여되었다.
실시예 8.3: 부분적으로 탈시알릴화된 EPO 형태의 제조
EPO GT-1 단백질(2.84mg/ml)을 20mM Na-인산염 완충액(pH 7.0) 중에서 80℃로 가열한 다음, EPO 용액 1ml당 100㎕의 1N H2SO4를 가하고; 항온 배양을 각각 5분, 10분 및 60분 동안 지속시키면, 시알릴화도가 상이한 EPO 제제가 산출된다. 폴리펩티드 N-글리코시다제를 사용하여 올리고당류를 방출시킨 후에, 0 내지 4개의 시알산을 갖는 올리고당류의 정량화를 수행하고, 하이퍼카브 카트릿지(25mg HyperSep Hypercarb; ThermoHypersil-Keystone, UK)를 사용하여 탈염시킴으로써 N-연결된 쇄의 분리를 수행하였다. 1N NaOH를 부가함으로써 EPO 제제를 중화시키고, 액상 N2 에서 동결시킨 다음, 추가로 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
실시예 8.4: 시알릴화 EPO 형태의 퍼요오데이트 산화
3.5ml의 20mM Na-인산염 완충액(pH 7.0)에 용해된, 처리되지 않았거나 순한 산 처리된 EPO 10mg에, 1.5ml의 0.1M Na-아세테이트 완충액(pH 5.5)을 가하고, 혼합물을 빙욕 속에서 0℃로 냉각시키며; 500㎕의 10mM Na-퍼요오데이트를 가하고 반응 혼합물을 0℃ 하에 60분 동안 암실에서 유지시킨다. 이어서, 10㎕의 글리세롤을 가하고 항온 배양을 암실에서 10분 더 지속시킨다. 고정 각 회전자가 장착된 실험실용 원심분리기에서 제조업자의 권고 사항에 따라서 3000rpm으로 VIVASPIN 농축기(10,000 MWCO, PES Vivascience AG, Hannover, Germany)를 사용하여 탈염시킴으로써, 부분적으로 산화된 EPO 형태를 시약으로부터 분리시킨다. 액상 질소에서 동결시킨 후, EPO 제제를 -20℃에서 최종 용적 4ml으로 저장하였다.
100㎍ 분취량의 부분적으로 산화된 EPO 제제를 N-글리코시다제로 처리하고, 전술된 바와 같은 하이퍼카브 카트릿지를 사용하여 올리고당류를 분리시킨다. 올리고당류를 순한 산 처리시킴으로써 탈시알릴화시키고, HPAEC-PAD에 의해 분석한 다음, 이들의 잔류 시간을 문헌[참조: Nimtz et al., 1990 and 1993]에 기재된 바와 같이 본래의 표준 올리고당류의 것과 비교하였다.
실시예 8.5: 디티오에리트레이톨을 이용한 EPO 디설파이드의 환원
5mg의 EPO-GT-1을 30mM 디티오에리트레이톨(DTT)의 존재 하에 37℃에서 60분 동안 5ml의 0.1M Tris/HCl 완충액(pH 8.1)에서 항온 배양하고; 완충액을 4회 교환하면서 4℃에서 Vivaspin 농축기를 사용함으로써 DTT를 제거하였다. 최종적으로 환원된 EPO 제제를 액상 질소에서 동결시키고, -20℃ 하에 50mM Na-아세테이트 완충액(pH 5.5)에서 저장하였다.
실시예 8.6: EPO 단백질 결정
문헌[참조: Eur. Phar. (European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002:1316:erythropoietin concentrated solution)]에 따라서 280nm 하의 UV 흡광도를, 경로 길이가 1cm인 큐벳에서 측정함으로써, EPO 단백질의 정량적 결정을 수행하였다. 또한, RP-C4 칼럼(Vydac Protein C4, Cat.# 214TP5410, Grace Vydac, Ca, US)을 사용하여 RP-HPLC 방법을 적용함으로써, EPO를 정량화하였는데; 이러한 HPLC 방법은 에리트로포이에틴 BRP 1 기준 표준물(European Pharmacopeia, Conseil de 1'Europe B. P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1)을 사용하여 보정하였다.
실시예 8.7: 갈락토스 옥시다제를 이용한 탈시알릴화 EPO의 산화
4.485mg의 완전하게 탈시알릴화된 EPO를 16㎕ 카탈라제(6214 단위/200ml) 및 80㎕ 갈락토스 옥시다제(Dactylium dendroides (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)로부터의 2250 단위/ml)의 존재 하에 20mM Na-인산염 완충액(pH 6.8)에서 항온 배양하고; 37℃에서의 항온 배양을 밤새 수행하며; 항온 배양을 개시한지 4시간 및 8시간 후에 20㎕의 갈락토스 옥시다제를 2회 부가하였다.
실시예 8.8: 생물학적 검정용 EPO 샘플의 제조
퍼요오데이트- 또는 갈락토스-옥시다제-산화된 EPO 단백질 제제와 활성화 HES의 항온 배양물로부터의 EPO의 정제
EPO 샘플의 정제(반응되지 않은 HES 유도체의 제거)는 실온에서 수행한다. EPO 항온 배양 혼합물(대략 5mg의 EPO 단백질)을, 완충액 A(H2O 중의 20mM N-모르폴린 프로판 설폰산[MOPS/NaOH], pH 8.0)를 사용하여 1:10으로 희석시키고, 유속 0.5ml/mim을 사용함으로써 10 칼럼 용적(CV)의 완충액 A로 평형시킨 3ml Q-세파로스 HP(Pharmacia Code no. 17-1014-03, Lot no. 220211)를 함유하는 칼럼에 적용하였다. 상기 칼럼을 6 내지 8 CV의 완충액 A로 희석시키고(유속=0.8ml/min), 유속 0.5ml/min으로 완충액 B(H2O 중의 20mM 모르폴린 에탄 설폰산[MES/NaOH], 0.5M NaCl, pH 6.5)를 사용함으로써 용출을 수행하였다. 280nm에서 UV 흡수시킴으로써 EPO를 탐지하고 약 6ml에서 용출시킨다. 3 CV의 완충액 C(H2O 중의 20mM MES, 1.5M NaCl, pH 6.5)를 사용함으로써 상기 칼럼을 재생시키고, 10 CV의 완충액 A(유속=0.7ml/min)를 사용함으로써 재평형시킨다.
샘플당 각각 3회의 원심분리 주기를 이용하는 Vivaspin 농축기 및 인삼염 완충 식염수(PBS)를 사용하여, 상기 Q-세파로스 단계로부터 수득된 EPO 용출물의 완충액 교환을 수행하며; PBS를 사용하여 샘플이 2ml가 되도록 조정하며 이를 -20℃에서 저장하였다.
HES-변형시킨, 부분적으로 탈시알릴화되고 순한 퍼요오데이트로 후속 산화시킨 EPO 형태의 <25% 만이 상기 Q-세파로스 용출물로부터 수득되었는데, 이는 이용된 조건 하에서는 염기성 EPO 형태가 Q-세파로스와 결합되지 않았고, 반응되지 않은 HES 유도체와 함께 병류물에서 발견되었기 때문이다.
실시예 8.9: 펄스된 전류 탐지를 수반한 높은-pH 음이온-교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)
펄스된 전류 탐지기(PAD)와 조합하여 CarboPac PA1 칼럼(0.4 x 25cm)이 장착된 Dionex BioLC 시스템(Dionex, USA)을 사용하여 높은-pH 음이온-교환(HPAE) 크로마토그래피함으로써, 정제된 본래의 올리고당류와 탈시알릴화 올리고당류를 분석하였다[참조: Schroter et al., 1999; Nimtz et al., 1999]. 탐지기 전위(E)와 펄스 기간(T)은 다음과 같다: El: +50 mV, T1: 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms ; E3: -500 mV, T3: 60 ms. 출력 범위는 500 내지 1500 nA이다. 이어서, 올리고당류를, 100% 용매 A로 평형시킨 CarboPac PA1 칼럼 상으로 주사하였다. 탈시알릴화 올리고당류의 경우에는, 용매 B의 선형 구배(0 내지 20%)를 40분에 걸쳐 적용한 다음, 5분에 걸쳐 20 내지 100% 용매 B로 선형 증가시킴으로써, 용출(유속 1ml/min)을 수행하였다. 용매 A는 이증류수 중의 0.2M NaOH이고, 용매 B는 용매 A 중의 0.6M NaOAc로 이루어진다. 본래의 올리고당류의 경우에는, 칼럼을 100% 용매 C(이증류수 중의 0.1M NaOH)로 평형시키고, 용매 D의 선형 구배(0 내지 35%)를 48분에 걸쳐 적용한 다음, 10분에 걸쳐 35 내지 100% 용매 D로 선형 증가시킴으로써, 용출(유속 1ml/min)을 수행하였다. 용매 D는 용매 C 중의 0.6M NaAc로 이루어진다.
실시예 8.10: GC-MS에 의한 N-글리칸, HES-변형된 N-글리칸 및 EPO 단백질의 단당류 조성 분석
메탄올 분해, N-재아세틸화 및 트리메틸실릴화 후 상응하는 메틸 글리코시드로서의 단당류를 GC/MS에 의해 분석하였다[참조: Chaplin, M. F. (1982) A rapid and sensitive method for the analysis of carbohydrate. AnaL Biochem. 123, 336-341]. 30m DB5 모세관 칼럼이 장착된 양이온 EI 모드에서 수행하는 피니간(Finnigan) GCQ 이온 트랩 질량 분광계(Finnigan MAT corp., San Jose, CA) 상에서 분석을 수행하였다. 온도 프로그램: 80℃에서 2분간 등온시킨 다음, 300℃까지 분당 10도씩 상승시킴.
단당류는 이들의 잔류 시간과 특징적 단편화 패턴으로써 동정하였다. 전자 피크 통합의 교정되지 않은 결과가 정량화에 사용되었다. 아노머성(anomericity) 및/또는 푸라노이드 및 피라노이드 형태의 존재로 인해 1 피크 이상 산출시키는 단당류는 모든 주요 피크를 부가함으로써 정량화하였다. 0.5㎍의 미오-이노시톨을 내부 표준 화합물로서 사용하였다.
실시예 8.11: 결과
실시예 8.11(a): 순한 산 처리된(부분적으로 탈시알릴화된) EPO-GT-1의 N-글리칸의 성상 확인
5, 10 또는 60분 동안 순한 산 처리시킨 EPO-GT-1 제제를, 도 7에 도시된 바와 같이 N-글리코시다제와 함께 항온 배양함으로써 N-연결된 올리고당류를 방출시키기 전 및 후에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. N-연결된 올리고당류를 대상으로 하여, HPAEC-PAD 올리고당류 지도화를 수행하였다(도 8). 처리되지 않은 EPO-GT-1은 3 또는 4개의 시알산 잔사를 갖는 N-연결된 올리고당류를 >90% 함유하는 반면, 순한 산의 존재 하에 5분 동안 항온 배양한 후에는, 탄수화물 쇄의 <40%이 3 또는 4개의 시알산 잔사를 갖는다. 탈시알릴화 N-글리칸을 HPAEC-PAD 분석한 결과, 처리되지 않은 EPO-GT-1에 대해 탐지된 중성 올리고당류와, 5, 10 또는 60분 동안 산 처리시킨 제제에서 안정적인 중성 올리고당류의 비율이 밝혀졌다. 탈시알릴화 글리칸의 MALDI/TOF-MS 결과, 근위 푸코스의 <90%가 해당 단백질의 순한 산 처리 후에도 존재한 것으로 나타났다.
실시예 8.11(b): 퍼요오데이트 처리된 EPO-GT-1의 성상 확인
5 및 10분 동안 미리 산 처리시켰거나 또는 처리시키지 않은, 순한 퍼요오데이트 처리된 EPO 형태의 SDS-PAGE 이동도를 도 10에서 비교하였다. 시알산의 퍼요오데이트 산화에 사용된 조건은 EPO 제제의 SDS-PAGE 패턴을 변화시키지 못하였다(도 7 비교). 시알산을 산화시키면, 올리고당류가 보다 빠른 용출 시간으로 이동되는 HPAEC-PAD 분석 결과가 나타났다(도 8 및 11 비교).
실시예 8.11(c): HES-변형된 EPO 유도체의 성상 확인
(aa) 실시예 2.4에 따라서 제조된 하이드록실아민-변형된 HES 유도체 X를 이용한, 시간 경과에 따른 EPO-GT-1-A의 HES 변형
400㎍의 하이드록실아민-변형된 HES 유도체 X를 20㎕의 0.5M NaOAc 완충액(pH 5.5) 중의 20㎍의 EPO-GT-1-A(순한 퍼요오데이트 산화된 EPO; 순한 퍼요오데이트 산화에 앞서 산 가수분해되지 않음)에 가하고, 샘플을 액상 질소에서 동결시킴으로써, 상기 반응을 각각 30분, 2, 4 및 17시간 후에 중지시킨다. 연속해서, 추가로 분석할 때까지 샘플을 -20℃에서 저장하였다.
SDS-PAGE 샘플 완충액을 가하고, 샘플을 90℃로 가열한 다음, SDS-겔 상에 적용하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 항온 배양 시간이 증가하면, 보다 고 분자량 단백질로의 이동이 증가하게 된다. 하이드록실아민-변형된 HES 유도체 X의 존재 하에 항온 배양한지 17시간 후, 분자량 표준물의 위치를 기준으로 하여 60 내지 110 KDa 사이 영역으로 유주하는 확산 쿠마시 염색된 단백질 밴드가 탐지되었다(도 12의 좌측 부 참조). N-글리코시다제로의 처리시, 대부분의 단백질은 탈-N-당화된 EPO의 위치를 향해 이동하였고(도 12, 우측 겔); 화살표 A는 N-글리코시다제의 유주 위치를 지시하고, 화살표 B는 탈-N-당화된 EPO의 유주 위치를 지시하며; 28 KDa 내지 36 KDa 분자량 표준물 사이 영역에서 가시적인 확산 단백질 밴드는 HES에 의해 변형된 EPO-형태 및 해당 분자의 O-당화 부위를 나타내는 것으로 추정된다. N-글리코시다제의 특이성 측면에서, 본 발명자들은 상기 결과로부터, HES-변형이 사실상 EPO 단백질의 글리칸의 퍼요오데이트 산화된 시알산 잔사에서 일어난다고 결론지었다.
(bb) HES-EPO 접합체의 성상 확인
HES-EPO 접합체 I(순한 퍼요오데이트 산화 후의 EPO-GT-1로부터 유래됨, 즉 EPO-GT-1-A로부터 유래됨), II(5분 동안 산 가수분해시키고 순한 퍼요오데이트 산화시킨 EPO-GT-1로부터 비롯됨), III(10분 동안 산 가수분해시키고 순한 퍼요오데이트 산화시킨 EPO-GT-1로부터 비롯됨)을 전술된 바와 같이 합성하였다. 등량의 변형되지 않은 HES가 부가된 동일한 완충액 조건 하에 변형되지 않은 EPO-GT-1을 함유하는 대조군 항온 배양물(K)이 포함되었다. 이들 항온 배양 혼합물을 대상으로 하여, HES-EPO 유도체의 후속 생화학 분석을 위해 추가로 정제시킨다.
항온 배양물 HES-EPO 접합체 I, II 및 III 뿐만 아니라 대조군 항온 배양물 K를 대상으로 하여, 이온-교환 칼럼의 병류물에 존재하는 것으로 예상되는 과량의 반응되지 않은 HES-시약을 제거하기 위해 "물질 및 방법"(실시예 8.8) 하에 기재된 바와 같은 Q-세파로스 정제 단계를 수행하였다. 미리 산 처리시킨 샘플 II 및 III에 함유된 다량의 염기성 EPO 형태로 인해, 본 발명자들은 이들 항온 배양물로부터의 상당 량의 변형된 EPO 생성물이 상기 병류물에 존재하는 것으로 예상하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 샘플 I로부터의 거의 모든 EPO 물질이 Q-세파로스 칼럼에 의해 보존되는 반면, 샘플 III 및 II의 대략 20 내지 30% 만이, 높은 염 농도로 용출되는 분획에서 회수되었다. HES 유도체 X를 수반한 항온 배양물로부터의 단백질 물질, 병류물에서의 양 물질 및 높은 염으로 용출되는 분획물 모두는 대조군 EPO와 비교해 볼때, SDS-PAGE에서 보다 높은 외견상 분자량을 지니고 있다.
보다 상세히 성상 확인하기 위해, HES-변형된 EPO 샘플 A 및 K(도 11 참조)를 퍼요오데이트 산화된 형태 EPO-GT-1-A와 비교하였다. 상기 샘플을 N-글리코시다제 처리시키고, 도 14a 및 14b에 도시된 바와 같이, N-글리칸을 방출시키면, 표준 EPO 제제의 O-당화된 EPO 형태와 비-당화된 EPO 형태의 해당 위치에 2개의 저분자량 밴드가 생성되었다. 샘플 A의 경우에는, 28 KDa mw 표준물 위치에서 유주하는 추가의 밴드가 탐지되었는데, 이는 이러한 EPO 변이체의 0-글리칸에서 HES-변형이 이루어졌다는 것을 제시해준다(실시예 8.11(c)(aa) 참조). 이러한 밴드(및 또한, HES-변형된 고분자량 형태의 N-당화된 EPO의 굵은 밴드; 도 14a 및 14b 참조)는, 상기 샘플을 순한 산 가수분해처리시킨 후에 소멸되었는데, 이는 HES 변형이 에리트로포이에틴의 퍼요오데이트 산화된 시알산 잔사에서 이루어졌다는 관점과 일치한다.
올리고당류로부터 시알산 잔사(및 또한, 시알산 연결된 HES 유도체)를 완전히 제거할 수 있게 해주는 조건을 사용하여, 분취량의 N-글리코시다제 항온 배양 혼합물을 가수분해시키고; 중화시킨 후, 이러한 혼합물을 탈염시키기 위해 작은 하이퍼카브 칼럼 상으로 흡수시킨다. 이 칼럼을 물로 철저하게 세척한 다음, 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 H2O 중의 40% 아세토니트릴을 사용하여, 결합된 중성 올리고당류를 용출시킨다. 이로써 생성된 올리고당류를 대상으로 MALDI/TOF-MS를 수행하였다. 샘플 A, EPO-GT-1-A 및 샘플 K로부터의 탈시알릴화 올리고당류 분획의 스펙트럼은 m/z = 1810 Da(2-촉각), 2175 (= 3-촉각), 2540 (= 4-촉각), 2906 (= 4-촉각 + 1개 N-아세틸락토사민 반복체) 및 3271 (= 4-촉각 + 2개 N-아세틸락토사민 반복체)에서 복합체 유형 올리고당류에 대해 동일한 질량을 나타내었으며; 푸코스(-146) 및 갈락토스(-162) 결여에 상응하는 작은 시그널이 탐지되었는데, 이는 시알산 제거에 적용된 산 가수분해 조건에 기인된 것이다(MALDI-도 17, 18 및 19 참조).
병행된 실험에서는, N-글리코시다제 분해 혼합물을 1ml RP-C18 카트릿지(올리고당류를 미리 산 가수분해시키지 않음) 상으로 흡수시키고, 0.1% TFA를 함유하는 수중 5% 아세토니트릴을 이용하여 용출시키는데; 이들 조건 하에서는, EPO 단백질이 RP-물질 상에 완전히 보존되었으며, 0.1% TFA를 함유하는 H2O 중의 5% 아세토니트릴을 사용하여, 올리고당류를 상기 칼럼으로부터 세척 제거하였다. 탈-N-당화된 EPO 단백질을 0.1% TFA를 함유하는 H2O 중의 70% 아세토니트릴을 사용하여 용출시킨다. N-글리코시다제 처리된 샘플 A, EPO-GT-1-A 및 샘플 K의 RP-C18 단계로부터의 올리고당류 분획을 중화시키고, 전술된 바와 같은 하이퍼카브 카트릿지를 사용하여 탈염시킨다. 이와 같이 하여 분리된 올리고당류를 대상으로 하여, 글리칸으로부터 시알산을 정량적으로 제거할 수 있는 조건 하에 순한 산 처리시킨 후(도 16 참조) 및 처리시키기 전(도 15 참조)에 HPAEC-PAD 지도화를 수행하였다.
HES-변형된 샘플 A로부터 수득된 본래의 물질에 대한 HPAEC-PAD 프로필은 올리고당류에 대해 무시할 만한 수준의 시그널 만을 나타낸 반면, EPO-GT-1-A-유도된 올리고당류는 도 11에 제시된 것(순한 퍼요오데이트 처리 후의 EPO-GT-1 샘플)과 동일한 글리칸 프로필을 나타내었다. 대조군 EPO 샘플(K)로부터 수득된 올리고당류의 용출 프로필은 예상된 패턴을 나타내었다(도 8에서의 프로필 비교). 비교를 위해, 국제 BRP-EPO 표준물의 본래의 올리고당류 프로필이 비교를 위해 기준 표준물로서 포함된다.
순한 산 가수분해 후, 모든 올리고당류 제제는 본 연구에서 출발 물질로서 사용되는 EPO 제제에 대한 방법 섹션에서 기재된 바와 같은 2-, 3- 및 4-촉각 복합체-유형 탄수화물 쇄의 예상된 정성적 및 정량적 조성을 지닌 중성 올리고당류 구조물과 동일한 용출 프로필(도 16 참조)을 나타내었다. 이러한 결과는, EPO 샘플의 HES-변형으로 인해 HES 유도체의 공유 결합이 생성되고, 이는 N-글리코시다제에 의해 EPO-단백질로부터 떨어져 나가고 산에 불안정하다는 사실을 입증해주는데, 이는 탄수화물을 탈시알릴화시키는 것으로 공지된 순한 산 처리 조건을 사용하여 N-글리칸으로부터 제거되기 때문이다.(도 14a + b 참조).
(cc) GC-MS에 의한 HES-EPO 및 HES-EPO N-글리칸의 단당류 조성 분석
해당 분자의 N-글리칸에서 EPO의 HES-변형이 이루어졌는지를 추가로 확인하기 위해, EPO 샘플을 N-글리코시다제로 분해시키고 EPO 단백질을 RP-C18 카트릿지 상에 흡착시킨 반면, 올리고당류 물질은 전술된 바와 같이 세척하였다. 표 2에 제시된 바와 같이, 글루코스 및 하이드록시에틸화 글루코스 유도체는, 시스테인 잔사에서 HES-변형시킨 EPO 단백질과, EPO 샘플 A2의 올리고당류 분획에서만 탐지되었다.
실시예 8.11(d): HES-변형된 EPO의 생물학적 활성에 관한 생체내 검정
정상적혈구증 마우스 시스템에서의 EPO-생물학적 검정을 유럽 약전에 기재된 과정에 따라서 수행하고; 국제 BRP EPO 기준 표준 제제를 사용하여, 실험실내 EPO 검정을 수행하였다. HES-변형된 EPO A2 제제에 대해서는, 단백질의 특이 활성도에 대한 평균값이 1mg EPO당 294,600 단위인 것으로 결정되었는데, 이는 활성 검정을 위해 송부된 샘플 내에 포함된 국제 BRP EPO 기준 표준 제제와 비교해볼 때 대략 3배 정도 더 높은 특이 활성을 지시해준다.
본 연구 결과가 표 3에 요약되어 있다.
실시예 1 내지 8에 대한 참조 문헌:
Nimtz M, Noll G, Paques EP, Conradt HS.
Carbohydrate structures of a human tissue plasminogen activator expressed in recombinant Chinese hamster ovary cells.
FEBS Lett. 1990 Oct. 1; 271(1-2):14-8
Dorner AJ, Wasley LC, Kaufman RJ.
Increased synthesis of secreted proteins induces expression of glucose-regulated proteins in butyrate-treated Chinese hamster ovary cells.
J Biol Chem. 1989 Dec 5;264(34):20602-7
Mueller PP, Schlenke P, Nimtz M, Conradt HS, Hauser H
Recombinant glycoprotein quality in proliferation-controlled BHK-21 cells.
Biotechnol Bioeng. 1999 Dec 5;65(5):529-36
Nimtz M, Martin W, Wray V, Kloppel KD, Augustin J, Conradt HS.
Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recobminant BHK-21 cells.
Eur J Biochem. 1993. Apr. 1;213(1):39-56
Hermentin P, Witzel R, Vliegenthart JF, Kamerling JP, Nimtz M, Conradt HS.
A strategy for the mapping of N-glycans by high-ph anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection.
Anal Biochem. 1992 Jun; 203(2):281-9
Schroter S, Derr P, Conradt HS, Nimtz M, Hale G, Kirchhoff C.
Male specific modification of human CD52.
J Biol Chem. 1999 Oct. 15;274(42):29862-73.
실시예 9
재조합 EPO의 생성
A) 포유류 세포에서의 생성
재조합 EPO를 CHO 세포에서 다음과 같이 생성시킨다:
사람 EPO cDNA가 정착된 플라스미드를 진핵성 발현 벡터(pCR3; pCREPO로 후술됨) 내로 클로닝시킨다. 문헌[참조; Grabenhorst, Nimtz, Costa et al., 1998, In vivo specificity of human alpha 1,3/4-fucosyltransferases III-VII in the biosynthesis of Lewis(x) and sialyl Lewis(x) motifs on complex-type N-glycans - Coexpression studies from BHK-21 cells together with human beta-trace protein, J. Biol. Chem., 273(47), 30985-30994]에 기재된 바와 같은 표준 과정을 사용하여 부위 지시된 돌연변이 유발을 수행하였다.
인산칼슘 침전법을 사용하여, 사람 EPO 또는 이의 아미노산 변이체(예를 들면, Cys-29→Ser/Ala, 또는 Cys-33→Ser/Ala, Ser-126→Ala 등)를 안정적으로 발현하는 CHO 세포를 생성시키고, 전술된 바와 같이[참조: Grabenhorst et al.] G418-설페이트를 이용하여 선별하였다. 형질감염시킨지 3일 후, 상기 세포를 1:5로 계대배양하고, 10% FBS 및 1.5g/리터 G418 설페이트를 함유하는 DMEM에서 선별하였다.
이러한 선별 과정을 사용하면, 통상 100 내지 500개 클론이 생존하였으며, 선별 매질에서 증식시킨 경우에는 2 내지 3주간 더 생존하였다. 이어서, 밀집 성장하는 단층의 세포 배양 상등액을 대상으로 하여, 웨스턴 블롯 분석 및 IEF/웨스턴 블롯 분석함으로써 EPO 발현 수준에 대해 분석하였다.
EPO는 스피너 플라스크 내에서 또는 21개 관류 반응기 내에서 안정한 아클론으로부터 생성되었다. 상이한 양의 NeuAc(예를 들면, 2-8, 4-10, 8-12 NeuAC 잔사)를 갖는 상이한 글리코형태의 EPO를, 다음에 기재되는 바와 같은 각종 크로마토그래피 과정의 조합 방법을 이용하여 공개된 프로토콜에 따라서 분리하였다.
문헌[참조: Grabenhorst, Conradt, 1999, The cytoplasmic, transmembrane, and stem regions of glycosyltransferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi., J Biol Chem., 274(51), 36107-16 ; Grabenhorst, Schlenke, Pohl, Nimtz, Conradt, 1999, Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells, Glycoconj J., 16(2), 81-97; Mueller, Schlenke, Nimtz, Conradt, Hauser, 1999, Recombinant glycoprotein product quality in proliferation-controlled BHK-21 cells, Biotechnology and bioengineering, 65(5), 529-536; Schlenke, Grabenhorst, Nimtz, Conradt, 1999, Construction and characterization of stably transfected BHK-21 cells with human-type sialylation characteristic, Cytotechnology, 30(1-3), 17-25].
B) 곤충 세포에서의 생성
곤충 세포주 SF9 및 SF 21을, 상기 문헌에 기재된 바와 같이 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 사람 EPO cDNA를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스 벡터로 감염시킨 후, 이러한 곤충 세포주 SF 9 및 SF 21로부터 재조합 사람 EPO를 생성시킨다.
혈청-무함유 배양 배지에서 성장시킨 세포를 2 x 106개 또는 2 x 107개 세포/ml의 세포 밀도로 감염시키고, EPO 역가를 세포 배양 상등액에서 매일 결정하였다. EPO를 블루 세파로스 크로마토그래피, Q-세파로스 상에서의 이온-교환 크로마토그래피, 및 최종적으로 C4-상에서 RP-HPLC함으로써 정제하였다.
SDS-PAGE 및 N-말단 서열 분석함으로써 생성물의 순도를 체크하였다. 공개된 과정에 따라서, 상세한 탄수화물 구조 분석(N- 및 O-당화)을 수행하였다.
문헌[참조: Grabenhorst, Hofer, Nimtz, Jager, Conradt, 1993, Biosynthesis and secretion of human interleukin 2 glycoprotein variants from baculovirus-infected Sf21 cells. Characterization of polypeptides and posttranslational modification, Eur J Biochem., 215(1), 189-97; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7].
실시예 10
반응성 HES 유도체의 형성
1. SH-반응성 HES
1.1 EMCH를 옥소-HES12KD와 반응시켜 SH-반응성 HES12KD B를 형성시킴
0.144g(0.012mmol)의 옥소-HES12KD(Fresenius German Patent DE 196 28 705 Al)을 0.3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 1.5ml DMSO 중의 34mg(0.15mmol) EMCH(Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany)의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 60℃에서 19시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 에탄올과 아세톤의 1:1 혼합물 16ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 3ml DMSO에 재용해시킨 다음, 전술된 바와 같이 재침전시킨다. 원심분리시키고 진공 하에 건조시킴으로써, SH-반응성-HES21KD B를 수득하였다. 티오-EPO와의 접합 반응이 실시예 11, 2.2에 기재되어 있다.
또 다른 방안:
본 반응에서는, 하이드라지드- 및 말레이미드 작용기를 나타내고 이들 작용기가 스페이서에 의해 격리되어 있는 모든 가교 결합제를 사용할 수 있다. 공급원(Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany)으로부터 입수 가능한 분자 그룹에 대한 추가 예가 표 1에 제시되어 있으며; "A"로 표시된다. 더우기, 말레이미드 작용기 대신 활성화 디설파이드 작용기를 나타내는 가교 결합제의 또 다른 예를 사용할 수도 있다.
1.2 HES 글리코실아민의 할로겐아세트아미드-유도체
a) 글리코실아민-형성1
HES12KD의 1mg 샘플을 3ml의 포화 중탄산암모늄에 용해시킨다. 이어서, 부가의 고형 중탄산암모늄을 가하여, 30℃에서 120시간 동안 항온 배양하는 동안 용액의 포화도를 유지시킨다. 반응 혼합물을 직접적으로 동결건조시킴으로써 아미노-HES12KD C를 탈염시킨다.
b) 글리코실아민 C를 클로로아세트산 무수물로 아실화시킴
아미노-HES12KD C의 1mg 샘플을 1ml의 1M 중탄산나트륨에 용해시키고 얼음 상에서 냉각시킨다. 이에, 고형 클로로아세트산 무수물의 결정(약 5g)을 가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온시킨다. pH를 모니터하고, pH가 7.0 아래로 떨어지면 부가의 염기를 가한다. 실온에서 2시간 후, 제2 분취량의 염기와 무수물을 가한다. 6시간 후, 생성물 클로로아세트아미드-HES D1(X=Cl)을 혼합 상 앰버라이트(Amberlite) MB-3(H)(OH) 이온 교환 수지 상으로 통과시킴으로써 탈염시킨다.
c) 글리코실아민을 브로모아세트산 무수물로 아실화시킴2
브로모아세트산 무수물을 문헌3에 기재된 바와 같이 제조한다. 아미노-HES12KD C의 1mg 샘플을 0.1ml의 무수 DMF에 용해시키고 얼음 상에서 냉각시킨 다음, 5mg 브로모아세트산 무수물을 가한다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 만들고, 용액을 3시간 동안 교반시킨다. 반응 혼합물을 -20℃ 하에 에탄올과 아세톤의 1:1 혼합물 1ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 0.1ml DMF에 재용해시킨 다음, 전술된 바와 같이 재침전시킨다. 원심분리시키고 진공 하에 건조시킴으로써, 브로모아세트아미드-HES D2(X=Br)를 수득하였다. 티오-EPO와의 접합 반응이 실시예 11, 1.2에 기재되어 있다.
c) 상응하는 요오도-유도체 D3(X=I)를 D2에 대해 기재된 바와 같이 합성하였다. 브로모아세트산 무수물 대신, N-석신이미딜 요오도아세테이트를 사용하고, 모든 단계를 암실에서 수행하였다:
또 다른 방안:
아미노 그룹을 아실화하기 위해, 할로겐 산성 산의 기타 활성화 형태를 사용할 수 있는데, 예를 들면, 다음과 같다:
- -브로마이드 또는 -클로라이드;
- 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 치환된 페놀(p-니트로페놀, 펜타플루오로페놀, 트리플루로페놀 등)과의 에스테르.
더우기, 스페이서에 의해 격리되어 있는, 아미노 반응성 그룹과 할로겐 아세틸 작용기를 갖는 모든 가교 결합제를 사용할 수 있다. 이의 한 예가 SBAP이다. 이 분자 및 기타 분자는 공급원(Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany)으로부터 입수 가능하다. 이들은 표 1에 "D"로 표시된다. 할로겐아세트아미드-HES 유도체를 분리시키지 않으면서 아미노-HES를 티오-EPO와 연결시키기 위한 가교 결합제로서 사용하기 위해서는, 실시예 11, 1.2에서의 설명을 참조할 수 있다.
1.3 아미노-HES E의 할로겐아세트아미드-유도체 1
a) 1,4-디아미노부탄을 옥소-HES12KD와 반응시켜 아미노-HES12KD E를 형성시킴4
1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES12KD를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 1.51ml(15mmol) 1,4-디아미노부탄의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 40℃에서 19시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물 160ml에 가한다. 침전물 아미노-HES12KD E를 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다.
b) 클로로아세트아미드-HES12KD F1을 상기 1.3에서 클로로아세트아미드-HES12KD D1에 대해 기재된 바와 같이 제조한다.
c) 브로모아세트아미드-HES12KD F2(X=Br)를 상기 1.3에서 브로모아세트아미드-HES12KD D2에 대해 기재된 바와 같이 제조한다. 티오-EPO와의 접합 반응이 실시예 11, 1.2에 기재되어 있다.
d) 상응하는 요오도-유도체 F3(X=I)는 이를 티오-EPO와 반응시키기 전에 분리하지 않았다. 이러한 실험이 실시예 11, 1.1에 기재되어 있다.
또 다른 방안:
상기 1.2 참조.
2. CHO-반응성 HES
2.1 하이드라지드-HES
a) 하이드라진과 옥소-HES12KD와의 반응
1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES12KD를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 0.47ml(15mmol) 하이드라진의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 40℃에서 19시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물 160ml에 가한다. 침전된 생성물 J를 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 수용액 중의 0.5%(v/v) 트리에틸아민에 대해 2일 동안 투석시키고, 물에 대해 2일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다. 산화된 글리코-EPO와의 접합 반응이 실시예 12, 2.2에 기재되어 있다.
b) 아디프산 디하이드라지드와 옥소-HES12KD와의 반응
1.74g(15mmol) 아데프산 디하이드라지드를 65℃에서 20ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 3ml 무수 DMSO에 용해시킨 1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES12KD를 질소 하에 적가한다. 60℃에서 68시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 물 200ml에 가한다. L을 함유하는 용액을 수용액 중의 0.5%(v/v) 트리에틸아민에 대해 2일 동안 투석시키고, 물에 대해 2일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다. 산화된 글리코-EPO와의 접합 반응이 실시예 12, 2.2에 기재되어 있다.
또 다른 방안:
더우기, 2개의 하이드라지드 그룹이 스페이서에 의해 격리되어 있는 유도체를 사용할 수도 있다.
3. 추가의 아미노-HES12KD 유도체 I 및 H 1
각 할로겐아세트아미드 1mg 샘플을 0.1ml의 포화 탄산암모늄에 용해시킴으로써, D 또는 F의 가암모니아 분해 반응을 별개로 수행하였다. 이어서, 부가의 고형 탄산암모늄을 가하여, 30℃에서 120시간의 항온 배양 동안 용액의 포화도를 유지시킨다. 반응 혼합물을 -20℃ 하에 에탄올과 아세톤의 1:1 혼합물 1ml에 가한다. 침전물을 원심분리시켜 수집하고, 0.05ml 물에 재용해시킨 다음, 전술된 바와 같이 재침전시킨다. 원심분리시키고 진공 하에 건조시킴으로써, 생성물 아미노-HES H 또는 I를 수득하였다. 산화된 글리코-EPO와의 접합 반응이 실시예 12, 4.1에 기재되어 있다.
4. 하이드록실아민-변형된 HES12KD K
O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실아민을 문헌(Boturyn et al.)에 기재된 바와 같이 시판용 물질로부터 2 단계로 합성하였다5. 1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES12KD를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 2.04g(15mmol) O-[2-(2-아미노옥시-에톡시)-에틸]-하이드록실아민의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 65℃에서 48시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물 160ml에 가한다. 침전된 생성물 K를 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 4일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다. 산화된 글리코-EPO와의 접합 반응이 실시예 12, 3.1에 기재되어 있다.
또 다른 방안:
더우기, 스페이서에 의해 격리되어 있는 2개의 하이드록실아민 그룹을 갖는 유도체를 사용할 수도 있다.
5. 티오-HES12KD
5.1 옥소-HES12KD에 대한 부가 반응
1.44g(0.12mmol)의 옥소-HES12KD를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 15ml DMSO 중의 1.16g(15mmol) 시스테아민의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 40℃에서 24시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물 160ml에 가한다. 침전된 생성물 M을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 수용액 중의 0.5%(v/v) 트리에틸아민에 대해 2일 동안 투석시키고, 물에 대해 2일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다. 산화된 글리코-EPO와의 접합 반응이 실시예 12, 2.1에 기재되어 있다.
또 다른 방안:
아미노 그룹과 티오-작용기가 스페이서에 의해 격리되어 있는 유도체를 사용할 수 있다. 더우기, 이러한 유도체 중의 아미노 그룹을 하이드라진, 하이드라지드 또는 하이드록실아민으로 대체시킬 수 있다. 티오-작용기를 예를 들어, 디설파이드 또는 트리틸-유도체의 형태로 보호시킬 수 있다. 그러나, 이러한 경우, 접합시키기 전에 추가의 탈보호 단계가 수행되어야만 하는데, 이는 M과 유사한 성분을 방출시킬 것이다.
5.2 아미노-HES12KD E, H 또는 I의 변형
a) SATA/SATP를 이용한 변형
1.44g(0.12mmol)의 아미노-HES12KD E, H 또는 I를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 5ml DMSO 중의 139mg(0.6mmol) SATA의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 실온에서 24시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물 160ml에 가한다. 침전된 생성물 N을 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 2일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다.
25mM EDTA 및 0.5M 하이드록실아민을 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)에서 실온 하에 2시간 동안 탈보호를 수행하고, 1mM EDTA를 함유하는 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 대해 투석함으로써 생성물 O를 정제하였다. 실시예 12, 2.1에 기재되어 있는 접합 반응 직전에 탈보호 반응을 수행한다:
b) SPDP를 이용한 변형
1.44g(0.12mmol)의 아미노-HES12KD E, H 또는 I를 3ml 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 5ml DMSO 중의 187mg(0.6mmol) SPDP의 혼합물에 질소 하에 적가한다. 실온에서 24시간 동안 교반시킨 후, 반응 혼합물을 아세톤과 에탄올의 1:1 혼합물 160ml에 가한다. 침전된 생성물 P를 원심분리시켜 수집하고, 40ml 물에 재용해시키며, 물에 대해 2일 동안 투석시킨 다음(SnakeSkin 투석용 튜빙, 3.5 KD 컷 오프, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany), 동결건조시킨다.
100mM 염화나트륨을 함유하는 0.5ml 100mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.5)당 12mg 디티오트레이톨(DTT) 용액 중에서 실온 하에 30분 동안 탈보호를 수행하고, 1mM EDTA를 함유하는 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.5)에 대해 투석함으로써 생성물 Q를 정제하였다. 실시예 12, 2.1에 기재되어 있는 접합 반응 직전에 탈보호 반응을 수행한다
또 다른 방안:
아미노 그룹을 자유 형태 또는 보호된 형태의 티오 그룹으로 전환시키기 위해서는, 몇 가지 시약이 이용될 수 있다. 이와 같이 변형시킨 후, 생성물을 분리할 수 있다. 또 다른 한편, 가교 결합제의 사용에 대해 허용된 것으로서, 이들을 바람직하게는 정제 단계 후에 접합 반응에 직접 사용할 수 있다. 티오-HES 유도체를 분리 및 저장하기 위해서는, 보호된 형태의 티오-HES 유도체를 합성하는 것이 유용할 수 있다. 이를 위해, 스페이서에 의해 격리되어 있는, 활성 에스테르-작용기와 티오에스테르-작용기를 갖는, SATA와 유사한 모든 유도체를 사용할 수 있다. 이러한 그룹의 추가 구성원인 SATP가 표 1에 "H"로 표시되어 있다. SPDP와 유사한 유도체는 스페이서에 의해 격리되어 있는 활성 에스테르 작용기와 디설파이드 작용기를 가질 수 있다. 이들 그룹의 추가 구성원이 표 1에 "F"로 표시되어 있다. 추가의 유사한 유도체는 스페이서에 의해 격리되어 있고 트리틸 유도체로서 보호시킨, 활성 에스테르 작용기와 티올-작용기를 가질 수 있다.
실시예 11
티오-EPO와의 접합 반응
1. 티오-EPO와 할로겐아세트아미드-변형된 SH-반응성 HES와의 반응
1.1 실시예 프로토콜 1
NHS-활성-에스테르와 요오도아세트아미드 그룹을 함유하는 가교 결합제, 예를 들면, SIA를 이용한, 아미노-HES12KD(E, H 또는 I)에 대한 티오-EPO의 접합6
물질
A. 붕산염 완충액. 조성은 50mM 붕산나트륨, pH 8.3, 5mM EDTA이다.
B. PBS, 인산염 완충 식염수: 10mM 인산나트륨, 150mM NaCI, pH 7.4.
C. 아미노-HES12KD E, H 또는 I. 붕산염 완충액 중에서 1mg/ml로 제조됨.
D. 가교 결합제 스톡 용액: 14mg SIA를 1ml DMSO에 용해시킨다.
E. D-Salt™ 덱스트란 탈염용 칼럼, 2 x 5ml 상 용적(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
F. 쿠마시® 단백질 검정용 시약(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
G. 티오-EPO 용액: 붕산염 완충액 중의 5mg/ml의 티오-EPO 1.
H. 미세농축기: Microcon YM-3(amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Germany).
방법
100㎕ SIA 용액을 400㎕의 아미노-HES12KD E 용액에 가하고, 실온에서 0.5시간 동안 교반시키면서 반응시킨다. 미세농축기를 사용하여 샘플을 14000 x g으로 60분 동안 원심분리시킴으로써, 과량의 가교 결합제를 제거한다. 원심분리 후, 샘플을 붕산염 완충액 중에서 이의 본래의 용적으로 만들고, 이러한 공정을 2회 이상 반복하였다. 잔류성 용액을 1ml 티오-EPO 용액에 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 항온 배양한다. 최종 용적이 10mM이 되도록 시스테인을 부가함으로써 항온 배양 말기에 과량의 요오도아세트아미드의 반응성을 급냉시킨다. 이러한 반응 혼합물을, PBS 완충액으로 평형시킨 탈염용 칼럼에 적용하고, 상기 분획의 단백질 함량을 쿠마시 단백질 검정용 시약으로 모니터하였다. 단백질 접합체를 함유하는 모든 분획을 모으고, 물에 대해 밤새 투석시킨 후에 동결건조시킴으로써 접합체를 수득한다.
또 다른 방안:
본 반응에서는, 스페이서에 의해 격리되어 있는 석신이미드- 또는 설포석신이미드 작용기와 요오도아세트아미드 작용기를 갖는 모든 가교 결합제를 사용할 수 있다. 추가 예가 표 1에 제시되어 있다. 이들은 "C"로 표시되며, 공급원(Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany)으로부터 입수 가능하다.
1.2 실시예 프로토콜 2
SH 반응성-HES12KD 브로모아세트아미드 D2, F2 또는 요오도아세트아미드 D3에 대한 티오-EPO 1의 접합7
물질
A. 인산염 완충액. 조성은 100mM 인산나트륨, pH 6.1, 5mM EDTA이다.
B. PBS, 인산염 완충 식염수: 10mM 인산나트륨, 150mM NaCI, pH 7.4.
C. SH 반응성-HES12KD 브로모아세트아미드 D2. 인산염 완충액 중에서 10mg/ml로 제조됨.
D. D-Salt™ 덱스트란 탈염용 칼럼, 2 x 5ml 상 용적(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
E. 쿠마시® 단백질 검정용 시약(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
F. 티오-EPO 용액: 인산염 완충액 중의 5mg/ml의 티오-EPO 1.
방법
1ml SH 반응성-HES12KD 브로모아세트아미드 D2 용액 및 1ml 티오-EPO 용액을 합하고, 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 항온 배양한다. 최종 용적이 10mM이 되도록 시스테인을 부가함으로써 항온 배양 말기에 과량의 브로모아세트아미드의 반응성을 급냉시킨다. 이러한 반응 혼합물을, PBS 완충액으로 평형시킨 탈염용 칼럼에 적용한다. 상기 분획의 단백질 함량을 쿠마시 단백질 검정용 시약으로 모니터하고, 단백질 접합체를 함유하는 모든 분획을 모으며, 물에 대해 밤새 투석시킨 후에 동결건조시킴으로써 접합체를 수득한다.
또 다른 방안:
SH 반응성 HES12KD-브로모아세트아미드 D2를 분리시키는 것 대신, 아미노-HES12KD(E, H, I)를 석신이미드 작용기와 브로모아세트아미드 작용기를 통하여 가교 결합제와 연결시킬 수 있다(상기 1.1 참조). SBAP는 이러한 가교 결합제 그룹의 한 구성원이고 표 1에 제시되어 있으며, "D"로 표시된다.
2. 티오-EPO와 말레이미드-변형된 SH-반응성 HES와의 반응
2.1 실시예 프로토콜 4
말레이미도-HES12KD B에 대한 티오-EPO의 접합
물질
A. 말레이미도-HES12KD B: 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 5.5) 중에서 10mg/ml로 제조됨.
B. 티오-EPO 용액: 인산염/NaCl-완충액 중의 5mg/ml의 티오-EPO.
C. 인산염/NaCl: 0.1M 인산나트륨, 50mM NaCI, pH 7.0
D. 겔 여과용 칼럼: 예를 들면, 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm).
E. 쿠마시® 단백질 검정용 시약(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
F. PBS, 인산염 완충 식염수: 10mM 인산나트륨, 150mM NaCI, pH 7.4.
방법
1ml SH 반응성-HES12KD B 용액 및 1ml 티오-EPO 1 용액을 합하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 항온 배양한다. 최종 용적이 10mM이 되도록 시스테인을 부가함으로써 항온 배양 말기에 과량의 말레이미드의 반응성을 급냉시킨다. 이러한 반응 혼합물을, PBS 완충액으로 평형시킨 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm)에 적용하고, 1ml 분획을 수집한다. 상기 분획의 단백질 함량을 쿠마시 단백질 검정용 시약으로 모니터한다. 단백질 접합체를 함유하는 모든 분획을 모으며, 물에 대해 밤새 투석시킨 후에 동결건조시킴으로써 접합체를 수득한다.
2.2 실시예 프로토콜 12
NHS-활성-에스테르와 말레이미드 그룹을 함유하는 가교 결합제, 예를 들면, SMCC를 이용한, 아미노-HES12KD(E, H 또는 I)에 대한 티오-EPO의 접합
물질
A. 미세농축기: Microcon YM-10(amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Germany).
B. PBS, 인산염 완충 식염수: 10mM 인산나트륨, 150mM NaCI, pH 7.4.
C. 아미노-HES12KD E, H 또는 I. PBS 완충액 중에서 10mg/ml로 제조됨.
D. SMCC 용액: 1mg SMCC를 50㎕ DMSO에 용해시킨다.
E. D-Salt™ 덱스트란 탈염용 칼럼, 2 x 5ml 상 용적(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
F. 쿠마시® 단백질 검정용 시약(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
G. 티오-EPO 1 용액: PBS 완충액 중의 5mg/ml의 티오-EPO 1.
방법
50㎕ SMCC 용액에 400㎕의 아미노-HES12KD E 용액을 가하고, 실온에서 80분 동안 교반시킨 다음 46℃에서 10분 동안 교반시키면서 반응시킨다. 미세농축기를 통하여 반응 혼합물을 14000 x g으로 60분 동안 원심분리시킴으로써, 과량의 가교 결합제를 제거한다. PBS 완충액을 이용하여 용적을 450㎕ 이하로 만들고, 이러한 공정을 2회 이상 반복하였다. 마지막 원심분리 후, 잔류성 용액을 PBS로 450㎕ 이하로 만들고, 1ml 티오-EPO 용액에 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 항온 배양한다. 최종 용적이 10mM이 되도록 시스테인을 부가함으로써 항온 배양 말기에 과량의 말레이미드의 반응성을 급냉시킨다. 이러한 반응 혼합물을, PBS 완충액으로 평형시킨 탈염용 칼럼에 적용한다. 상기 분획의 단백질 함량을 쿠마시 단백질 검정용 시약으로 모니터하고, 단백질 접합체를 함유하는 모든 분획을 모으며, 물에 대해 밤새 투석시킨 후에 동결건조시킴으로써 접합체를 수득한다.
또 다른 방안:
본 반응에서는, 스페이서에 의해 격리되어 있는 석신이미드- 또는 설포석신이미드 작용기와 말레이미드 작용기를 갖는 모든 가교 결합제를 사용할 수 있다. 이러한 분자 그룹에 대한 추가 예가 공급원(Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany)으로부터 입수 가능하며, 표 1에 제시되어 있고, "E"로 표시된다. 말레이미드 작용기 대신 활성화 디설파이드 작용기를 갖는 추가의 가교 결합제 그룹이 있다. 이들 가교 결합제를 당해 접합에 사용할 수도 있다. 그러나, 본 접합체의 디설파이드 결합은 환원성 조건 하에 절단 가능하다. 이러한 그룹의 구성원이 표 1에 "F"로 표시된다. 제3 가교 결합제 그룹은 말레이미드 작용기 대신, SH-반응성 그룹으로서 비닐설폰 작용기를 사용한다. 이러한 그룹 "SVSB"의 구성원이 표 1에 "G"로 표시된다.
실시예 12
산화된 EPO와의 접합 반응
1. 글리코-EPO의 산화
1.1 나트륨 메타-퍼요오데이트를 이용한 글리코-EPO의 산화: 실시예 프로토콜 5
물질
A. 글리코-EPO 용액: 아세테이트 완충액 중의 글리코-EPO 10mg/ml.
B. 나트륨 메타-퍼요오데이트 용액: 신선하게 제조된, 아세테이트 완충액 중의 10mM 또는 100mM 과요오드화나트륨. 암실에서 유지시킨다. 이들 용액을 사용한, 산화 혼합물 중의 과요오드화나트륨의 최종 농도는 각각 1mM 또는 10mM이다.
C. 아세테이트 완충액: 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5.
D. 글리세롤.
E. 미세농축기: Microcon YM-3(amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Germany).
방법
모든 단계를 암실에서 수행하였다.
1ml의 찬 글리코-EPO 용액에, 0.1ml의 찬 나트륨 메타-퍼요오데이트 용액을 가하고, 암실에서 1시간 동안 산화 반응을 진행시킨다. 산화될 글리코-EPO가 시알산 잔사를 함유하는 경우에는, 산화 조건이 0℃, 1mM 과요오드화나트륨이다. 그 밖에도, 실온 하에서 10mM 과요오드화나트륨을 사용할 수도 있다. 산화 반응을 중지시키기 위해서는, 글리세롤을 가하여 최종 용적이 15mM이 되도록 하고, 0℃에서 5분 동안 항온 배양한다. 미세농축기를 사용하여 생성물을 14000 x g으로 60분 동안 원심분리시킴으로써, 과량의 시약과 부산물을 제거한다. 원심분리 후, 샘플을 다음 변형 단계에 사용된 완충액, 예를 들면, 아세테이트 완충액 중에서 이의 본래의 용적으로 만든다. 이러한 공정을 2회 이상 반복하였다.
1.2 글리코-EPO의 효소적 산화: 실시예 프로토콜 6
EPO의 효소적 산화 반응은 당해 분야의 문헌에 기재되어 있다[참조: Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922].
2. 하이드라진/하이드라지드-유도체와의 접합
2.1 실시예 프로토콜 7
하이드라지드와 말레이미드 작용성 그룹을 함유하는 가교 결합제, 예를 들면, M2C2H(공급원: Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany)를 이용한, 티오-HES12KD M, O 또는 Q에 대한 산화된 글리코-EPO의 접합
물질
A. M2C2H 스톡: 신선하게 제조된, DMSO 중의 10mg/ml M2C2H.
B. 6.1.1로부터의 산화된 글리코-EPO 용액: 아세테이트 완충액 중의 5mg/ml의 글리코-EPO.
C. 티오-HES12KD M, O 또는 Q: 인산염/NaCl 완충액 중의 10mg/ml.
D. 아세테이트 완충액: 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5.
E. 인산염/NaCl: 0.1M 인산나트륨, 50mM NaCl, pH 7.0.
F. 미세농축기: Microcon YM-3(amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Germany).
G. 겔 여과용 칼럼: 예를 들면, 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm).
H. 쿠마시® 단백질 검정용 시약(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
I. PBS, 인산염 완충 식염수: 10mM 인산나트륨, 150mM NaCI, pH 7.4.
방법
M2C2H 스톡 용액을 1ml의 산화된 글리코-EPO 용액에 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 하고, 실온에서 2시간 동안 동안 교반시키면서 반응시킨다. 미세농축기를 사용하여 샘플을 14000 x g으로 60분 동안 원심분리시킴으로써, 과량의 가교 결합제를 제거한다. 원심분리 후, 상기 샘플을 인산염/NaCl 완충액 중에서 이의 본래의 용적으로 만들고, 이러한 공정을 2회 이상 반복하였다. M2C2H-변형된 글리코-EPO에, 1ml의 티오-HES12KD M, O 또는 Q 용액을 가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 항온 배양한다. 시스테인을 부가함으로써 항온 배양 말기에 과량의 말레이미드의 반응성을 급냉시킨다. 이러한 반응 혼합물을, PBS로 평형시킨 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm)에 적용하고, 1ml 분획을 수집한다. 상기 분획의 단백질 함량을 쿠마시 단백질 검정용 시약으로 모니터하고, 단백질 접합체를 함유하는 모든 분획을 모으며, 물에 대해 밤새 투석시킨 후에 동결건조시킴으로써 접합체를 수득한다.
과정 상의 주:
하이드라존 부가물은 pH 극단에서 약간 덜 안정적이다. 낮은 pH에서의 처리를 포함할 수도 있는 적용 분야에 대해서는, 본 발명자들이 PBS 완충액 중의 30mM 나트륨 시아노보로하이드라이드로 처리함으로써 하이드라존을 하이드라진으로 환원시켰다. 대부분의 적용 분야에서는, 이러한 별도의 단계가 필요치 않다.
2.2 실시예 프로토콜 8
산화된 글리코-EPO를 하이드라지도-HES12KD L에 직접적으로 접합시킴.
물질
A. 6.1.1로부터의 산화된 글리코-EPO 용액: 아세테이트 완충액 중의 5mg/ml의 글리코-EPO.
B. 하이드라지도-HES18KD L 또는 J: 아세테이트 완충액 중의 10mg/ml.
C. 아세테이트 완충액: 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5.
D. 겔 여과용 칼럼: 예를 들면, 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm).
E. 쿠마시® 단백질 검정용 시약(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
F. PBS, 인산염 완충 식염수: 10mM 인산나트륨, 150mM NaCI, pH 7.4.
방법
1ml의 하이드라지도-HES12KD L 용액을 1ml의 산화된 글리코-EPO 용액과 합하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시키면서 반응시킨다. 이러한 반응 혼합물을, PBS로 평형시킨 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm)에 적용하고, 1ml 분획을 수집한다. 상기 분획의 단백질 함량을 쿠마시 단백질 검정용 시약으로 모니터하고, 단백질 접합체를 함유하는 모든 분획을 모으며, 물에 대해 밤새 투석시킨 후에 동결건조시킴으로써 접합체를 수득한다. 이러한 접합 결과가 도 24에 도시되어 있다. 관찰된 분자량 이동은 접합이 성공적이라는 사실을 입증해준다. 얼룩진 결과는 HES의 불균질성으로부터 비롯된 것이다. 도 25는 HES가 탄수화물 측쇄의 탄수화물 잔기에 접합된다는 사실을 입증해준다.
과정 상의 주:
하이드라존 부가물은 pH 극단에서 약간 덜 안정적이다. 낮은 pH에서의 처리를 포함할 수도 있는 적용 분야에 대해서는, 본 발명자들이 PBS 완충액 중의 30mM 나트륨 시아노보로하이드라이드로 처리함으로써 하이드라존을 하이드라진으로 환원시켰다. 대부분의 적용 분야에서는, 이러한 별도의 단계가 필요치 않다.
3. 하이드록실아민-유도체와의 접합 8
3.1 실시예 프로토콜 9
산화된 글리코-EPO를 하이드록실아민-HES12KD K에 접합시킴.
물질
A. 6.1.1로부터의 산화된 글리코-EPO 용액: 아세테이트 완충액 중의 5mg/ml의 글리코-EPO.
B. 하이드록실아민-HES12KD K: 아세테이트 완충액 중의 10mg/ml.
C. 아세테이트 완충액: 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5.
D. 겔 여과용 칼럼: 예를 들면, 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm).
E. 쿠마시® 단백질 검정용 시약(Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany).
F. PBS, 인산염 완충 식염수: 10mM 인산나트륨, 150mM NaCI, pH 7.4.
방법
1ml의 하이드록실아민-HES12KD K 용액을 1ml의 산화된 글리코-EPO 용액과 합하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시키면서 반응시킨다. 이러한 반응 혼합물을, PBS로 평형시킨 세파덱스® G-200(1.5 x 45cm)에 적용하고, 1ml 분획을 수집한다. 상기 분획의 단백질 함량을 쿠마시 단백질 검정용 시약으로 모니터하고, 단백질 접합체를 함유하는 모든 분획을 모으며, 물에 대해 밤새 투석시킨 후에 동결건조시킴으로써 접합체를 수득한다. 이러한 접합 결과가 도 24에 도시되어 있다. 레인 2에서 관찰된 분자량 이동은 접합이 성공적이라는 사실을 입증해준다. 얼룩진 결과는 HES의 불균질성으로부터 비롯된 것이다. 도 25는 HES가 탄수화물 측쇄의 탄수화물 잔기에 접합된다는 사실을 입증해준다.
실시예 13
갈락토스 옥시다제 처리된 EPO N-글리칸의 성상 확인
재조합 EPO 또는 부분적으로 탈시알릴화된 EPO 형태(제한된 순한 산 가수분해에 의해 생성됨)를 0.05M Na-인산염 완충액(pH 7.0) 중에서 37℃ 하에 30분 내지 4시간 동안 카탈라제의 존재 하에 갈락토스 옥시다제와 함께 항온 배양한다. 50㎍ 분취량의 EPO를 제거하고 단백질을 폴리펩티드 N-글리카나제로 후속 처리함으로써, 상기 반응의 진행 과정을 모니터하였다.
방출된 N-연결된 올리고당류(탈-N-당화된 폴리펩티드의 SDS-PAGE 탐지에 의해 모니터함)를 대상으로 하여, 시알산 제거 전 및 후에 문헌[참조: Grabenhorst et al., 1999, Nimtz et al., 1993/1994; Schlenke et al., 1999]에 기재된 바와 같이 HPAEC-PAD 지도화를 수행하였다. HPAEC-PAD에서 관찰된 특유의 이동에 의해, 개개의 EPO 올리고당류 중의 산화된 갈락토스 잔사의 정량화를 수행하고, 이는 또한, 올리고당류 혼합물의 MALDI/TOF MS에 의해 확인하였다.
실시예 14
HAS 변형된 EPO의 성상 확인
반응되지 않은 EPO와 HAS-전구체 분자로부터 HAS 변형된 EPO 형태를 격리시키는 것은, 예를 들어, Ultrogel AcA 44/54 또는 유사한 겔 여과용 매질을 사용하여 겔 여과시킴으로써 달성하였다. 또 다른 한편, Affigel(BioRad)와 커플링된 모노클로널 항체를 함유하는 4ml 칼럼 상에 EPO를 면역 친화 분리시키고, 변형되지 않은 EPO를 겔 여과시킴으로써 후속 격리(예를 들면, 상대 분자량이 20 내지 200 kDa인 구상 단백질을 격리시킬 수 있는 매트릭스를 사용함)시킴으로써, 반응되지 않은 HAS를 제거하였다.
HAS 변형된 EPO는, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색시 변형되지 않은 EPO와 비교해서 분자량이 높은 것을 탐지함으로써 SDS-PAGE 분석(12.5 또는 10% 아크릴아미드 겔 사용)에 의해 동정하였다. 분자량이 보다 높은 HAS 변형된 EPO 폴리펩티드는 또한, 재조합 사람 EPO에 대해 생성된 폴리클로널 항체를 사용하여 샘플을 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석함으로써 동정하였다.
EPO 형태의 N-글리칸 변형은, 폴리펩티드 N-글리카나제(Roche, Germany로부터의 재조합 N-글리코시다제, 37℃에서 16시간 동안 25 단위/mg EPO 단백질을 이용함)를 사용하여 EPO 단백질로부터 상기 변형물을 성공적인 제거함으로써 입증되었으며; SDS-PAGE에 의한 분석 결과, 대략 20 KDa의 N-글리코시다제 처리된 변형되지 않은 EPO의 유주 위치로 EPO 단백질 특유의 이동이 이루어졌다.
Ser 126에서 이루어진, 탈시알릴화되고 갈락토스 옥시다제 처리된 단일 EPO O-글리칸의 변형은, 반응되지 않은 탈-N-당화된 EPO와 비교해서 이의 유주 위치를 탐지함으로써 탈-N-당화된 생성물의 SDS-PAGE 유주에 의해 입증되었다. 필요한 경우, 변형된 EPO를 C8-상에서 RP-HPLC에 의해 분획화한 후에, SDS-PAGE 분석하였다. EPO의 HSA O-글리칸 변형은 또한, O-글리칸의 β-제거와, 재조합 사람 EPO에 대해 생성된 폴리클로널 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 탈-O-당화된 형태의 EPO를 탐지함으로써 분석하였다.
실시예 15
EPO와 변형된 EPO 형태의 정량화
EPO 형태를 문헌[참조: Ph. Eur (2000, Erythropoietini solutio concentrata, 1316, 780-785)]에 기재된 바와 같이 UV 측정함으로써 정량화하고, 이를 국제 BRP 기준 EPO 표준물과 비교하였다. 또 다른 한편, 보정을 위한 BRP 표준 EPO 기준 제제 20, 40, 80 및 120㎍을 이용하여 254nm에서의 흡광도와 RP-C4-칼럼을 사용하여 RP-HPLC 검정함으로써, EPO 농도를 결정하였다.
실시예 16
HES-변형된 재조합 사람 EPO의 시험관내 생물학적 활성:
정제된 HES-변형된 EPO를 대상으로 하여, 문헌[참조: Krystal, 1984, Exp. Heamatol., 11, 649-660]에 기재된 바와 같은 에리트로포이에틴 생활성 검정을 이용하여 활성에 대해 시험하였다.
페닐하이드라진 하이드로클로라이드로 처리함으로써 NMRI 마우스에서 빈혈을 유도시키고, 비장 세포를 수집한 다음, 문헌[참조: Fibi et al., 1991, Blood, 77, 1203 ff.]에 기재된 바와 같이 사용하였다. EPO 희석물을 96-웰 미세역가판에서 웰당 3 x 105개 세포와 함께 항온 배양하였다. 흡습 대기(5% CO2) 하 37℃에서 24시간 후, 세포를 웰당 1μCi의 3H-티미딘으로 4시간 동안 표지시킨다. 혼입된 방사능은 액상 신틸레이션 계수함으로써 결정하였다. 국제 기준 EPO 표준물(BRP-표준물)을 비교용으로 사용하였다.
또 다른 한편, EPO-민감성 세포주 TF-1을 사용하여 시험관내 검정함으로써 EPO 생활성을 측정하였다[참조: Kitamura et. al., J. cell Phys., 140. 323-334]. 지수적으로 성장하는 세포로부터 성장 인자가 제거되도록 세척하고, 일련의 EPO 희석물의 존재 하에서 48시간 더 항온 배양하였다. 문헌[참조: Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods, 65, 55-63]에 기재된 바와 같은 MTT 환원 검정을 이용하여 세포 증식을 평가하였다.
실시예 17
EPO와 HAS-변형된 EPO 형태의 생체내 활성 결정:
동물에게 예정 용량의 EPO 또는 변형된 EPO 형태를 투여한지 4일 후에 망상적혈구 증가를 측정함으로써, 정상적혈구증 마우스에서 생체내 활성 결정을 수행하였다. 다혈구증(polycythemic) 마우스 검정에서 WHO EPO 표준물에 대해 보정시킨 BRP EPO 표준물을 사용하여 검정을 수행하였다. EPO 샘플을 1mg/ml의 소 혈청 알부민(Sigma)을 함유하는 인산염 완충 식염수에서 희석시킨다.
둘벡코(Dulbecco) 완충 식염수 중의 EPO 시험용 용액 0.5ml(BRP 표준 EPO 1ml당 100, 80, 40 또는 20IU의 EPO 단백질 당량에 상응함)을 각 동물에게 피하 주사하였다. 주사한지 4일 후에 혈액 샘플을 채취하고 망상적혈구를 아크리딘 오렌지로 염색시키며; 혈액 샘플을 취한지 5시간 이내에 총 30,000개 혈액 세포를 계수함으로써 유동 세포계수법으로 망상 적혈구의 정량화를 수행하였다[참조: Ph. Eur, 2000, Erythropoietini solutio concentrata, 1316, pages 780-785 and European Pharmacopoeia (1996/2000, attachment 2002)].
실시예 18
생체내 반감기 결정
래빗에게 특정 량의 변형되지 않거나 HAS-변형된 EPO 형태를 정맥내 주사하였다. 특정 시간에 혈액 샘플을 수득하고, 혈청을 준비하였다. 시험관내 생물학적 검정 또는 EPO-특이적 시판용 ELISA에 의해 혈청 에리트로포이에틴 수준을 결정하였다.
실시예 19
생체내 약동학
마우스에서: 각 동물에게 300 IU EPO/kg을 피하 투여하였다. 후처리한지 7일 후에, 각 동물의 적혈구 용적을 결정하였다. 변형된 EPO로 처리된 모든 동물 중 9마리에게서 적혈구 용적의 상당한 증가가 관찰되었는데, 이는 처리되지 않은 EPO의 반감기가 비교적 짧다는 것에 비추어 볼때 예상된 결과이다. 변형된 EPO-처리된 그룹의 적혈구 용적 상의 평균적인 변화는 처리되지 않은 EPO와 대조군 그룹의 것과는 상당히 상이한 것이었다.
래빗에서: 200 또는 800ng 이하/체중 kg에 상응하는 단일 용량의 변형되지 않거나 HAS-변형된 EPO를 래빗에게 투여하였다. 2, 6, 16, 24 및 48시간 후, 혈장 농도를 결정하기 위해 시판용 EPO-특이적 ELISA를 사용함으로써 혈액 샘플을 분석하였다. 평균 혈장 EPO 농도를 결정하고, 문헌[참조: Zettlmissl et al., 1989, J. Biol. Chem., 264, 21153-21159]에 기재된 바와 같이 ELISA 값으로부터, 평균 초기 반감기(α-상) 및 말기 반감기(β-상)를 계산하였다.
문헌[참조: Sytkowski, Lunn, Risinger, and Davis, 1999, An Erythropoietin Fusion Protein Comprised of Identical Repeating Domains Exhibitis Enhanced Biological Properites, J. Biol. Chem., 274, 24773-24778].
실시예 20
HES-변형된 재조합 사람 IL-2의 시험관내 생물학적 활성 평가
Ultrogel AcA 54 상에서 겔 여과시킴으로써 변형된 IL-2를 회수하였다. 분취량의 상응하는 분획을 멸균 여과시키고, IL-2 의존적 쥐과 CTLL-2 세포주를 사용함으로써, IL-2 생활성을 결정하였다[참조: Gillis, Ferm, On, and Smith, 1978, J. Immunol., 120, 2027-2032]. 활성은 국제 기준 IL-2 표준 제제를 기준으로 한 것이다.
* 참조문헌에 대한 주석:
1 Manger, Wong, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10733-10740; Manger, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10724-10732.
2 Black, Kiss, Tull, Withers, 1993, Carbohydr. Res., 250, 195.
3 Thomas, 1977, Methodes Enzymol., 46, 362.
4 S. Frie, Diplomarbeit, Fachhochschule Hamburg, 1998.
5 Boturyn, Boudali, Constant, Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485.
6 Cumber, Forrester, Foxwell, Ross, Thorpe, 1985, Methods Enzymol., 112, 207.
7 de Valasco, Merkus, Anderton, Verheul, Lizzio, Van der Zee, van Eden, Hoffmann, Verhoef, Snippe, 1995, Infect. Immun., 63, 961.
8 Rose, 1994, Am. Chem. Soc., 116, 30.
HES-변형된 EPO 및 대조군 샘플로부터의 글리칸의 단당류 조성 분석
**단당류 I.A2로부터의 글리칸 II.EPO-GT-1A로부터의 글리칸 III.K2로부터의 글리칸 III.A2로부터의 글리칸 IV.EPO-GT-1A로부터의 글리칸 V.K2로부터의 글리칸 VI.시스테인 변형된 EPO 단백질*
푸코스 1,935 3,924 2,602 2,246 4,461 2,601 2,181
만노스 6,028 11,020 9,198 6,379 11,668 6,117 6,260
갈락토스 8,886 19,935 14,427 10,570 16,911 11,555 10,386
글루코스 17,968 -- -- 21,193 미량 미량 33,021
GlcNAc 7,839 21,310 14,440 11,360 15,953 10,503 10,498
GlcHel 5,583 -- -- 5,926 -- -- 14,857
GlcHe2 1,380 -- -- 1,552 -- -- 3,775
NeuNAc 5,461 822 4,504 3,895 4,871 13,562 13,003
이노시톨 1,230 2,310 1,620 2,050 1,320 1,134 1,087
* Cys-HES-변형된 EPO 단백질 등가물을 대상으로 하여 조성 분석을 수행하였다; 상기 언급된 바와 같이 Q-세파로스 칼럼 상에서 크로마토그래피함으로써 HES-항온 배양 혼합물로부터 EPO 단백질을 분리하고, Vivaspin 5 분리용 장치를 사용하여 원심분리시킴으로써 탈염시켰다.
** 퍼트리메틸실릴화 메틸글리코시드의 단일 GC 수행으로부터 단당류 결정을 수행하였으며; 유도체화 과정과 각 화합물의 회수 동안 상실에 대한 교정없이 전자 피크 통합값이 제공된다.
샘플 번호 샘플 서술 EPO 샘플의 계산된 특이 활성(A280nm 및 RP-HPLC 결정법에 근거함)
850247 1. HES-변형된 EPO A2 344,000 U/mg
850248 2. EPO-GT-1-A 82,268 U/mg
850249 3. 대조군 EPO K2 121,410 U/mg
850250 4. BRP EPO 표준물 86,702 U/mg
850251 1. 4용적의 PBS로 희석됨 309,129 U/mg
850252 2. 4용적의 PBS로 희석됨 94,500 U/mg
850253 3. 4용적의 PBS로 희석됨 114,100 U/mg
850254 4. 4용적의 PBS로 희석됨 81,200 U/mg
850255 1. 4용적의 PBS로 희석됨 230,720 U/mg

Claims (52)

  1. - 다음 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 또는
    - 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 이러한 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1과 하나 이상의 작용성 그룹 W를 포함하는 화합물 (D)와 반응시킴으로써 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를
    - 상기 하이드록시알킬 전분과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1, 또는 상기 하이드록시알킬 전분 유도체 내에 포함된 작용성 그룹 W와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z2와,
    추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X(상기 작용성 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 및 티오 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)
    를 포함하는 화합물(L)과 반응시키는 단계를 포함하는, 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법으로서, 상기 하이드록시알킬 전분이 다음 화학식 I에 따르는 구조를 갖는 방법:
    화학식 I
  2. 제1항에 있어서, R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 선형 또는 분지된 하이드록시알킬 그룹인 방법.
  3. 제2항에 있어서, R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 2-하이드록시에틸 그룹인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분이 하이드록시에틸 전분인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Z1이 구조 -NH-를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, Z1이 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법:
    상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 X가 구조 -NH-를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법:
    상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
  9. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Y가 -SH이고 작용성 그룹 X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법:
    상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법:
    상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
  11. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법:
    상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을, 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시키지 않음으로써, 이러한 하이드록시알킬 전분이 화학식 I에 따르는 구조를 갖는 방법:
    화학식 I
  13. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을, 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시킴으로써, 이러한 하이드록시알킬 전분이 화학식 IIa 및/또는 화학식 IIb에 따르는 구조를 갖는 방법:
    화학식 IIa
    화학식 IIb
  14. 제13항에 있어서, 환원성 말단을 알칼리성 요오드 용액에 의해 산화시키는 방법.
  15. 제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키고; 이로써 생성된 반응 생성물을, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 하이드록시알킬 전분과 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는 방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시켜 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체와 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시키는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 화합물(M)이 폴리펩티드인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 방법.
  22. - 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 또는
    - 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 이러한 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1과 하나 이상의 작용성 그룹 W를 포함하는 화합물 (D)와 반응시킴으로써 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를
    - 상기 하이드록시알킬 전분과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1, 또는 상기 하이드록시알킬 전분 유도체 내에 포함된 작용성 그룹 W와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z2와,
    추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X(상기 작용성 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 또는 티오 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)
    를 포함하는 화합물(L)과 반응시키는 단계를 포함하는, 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체로서, 상기 하이드록시알킬 전분이 다음 화학식 I에 따르는 구조를 갖는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    화학식 I
  23. 제22항에 있어서, R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 선형 또는 분지된 하이드록시알킬 그룹인 하이드록시알킬 전분 유도체.
  24. 제23항에 있어서, R1, R2 및 R3이 독립적으로 수소, 또는 2-하이드록시에틸 그룹인 하이드록시알킬 전분 유도체.
  25. 제22항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분이 하이드록시에틸 전분인 하이드록시알킬 전분 유도체.
  26. 제22항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Z1이 구조 -NH-를 포함하는 하이드록시알킬 전분 유도체.
  27. 제26항에 있어서, Z1이 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
  28. 제22항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 X가 구조 -NH-를 포함하는 하이드록시알킬 전분 유도체.
  29. 제28항에 있어서, X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
  30. 제22항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Y가 -SH이고 작용성 그룹 X가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
  31. 제22항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다.
  32. 제22항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다.
  33. 제22항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을, 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시키지 않음으로써, 이러한 하이드록시알킬 전분이 화학식 I에 따르는 구조를 갖는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    화학식 I
  34. 제22항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분의 환원성 말단을, 화합물(D) 또는 화합물(L)과 반응시키기에 앞서 산화시킴으로써, 이러한 하이드록시알킬 전분이 화학식 IIa 및/또는 화학식 IIb에 따르는 구조를 갖는 하이드록시알킬 전분 유도체:
    화학식 IIa
    화학식 IIb
  35. 제34항에 있어서, 환원성 말단을 알칼리성 요오드 용액에 의해 산화시킨 하이드록시알킬 전분 유도체.
  36. 제22항 내지 제30항 및 제33항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키고; 이로써 생성된 반응 생성물을, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시킨 하이드록시알킬 전분 유도체.
  37. 제22항 내지 제30항 및 제33항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 하이드록시알킬 전분과 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시킨 하이드록시알킬 전분 유도체.
  38. 제22항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시켜 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하는 하이드록시알킬 전분 유도체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 제2의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시킨 하이드록시알킬 전분 유도체.
  40. 제22항 내지 제35항 중의 어느 한 항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 Z1과 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과의 반응을 통하여 화합물(D)과 반응시켜 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를 수득하고; 이러한 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체를, 화합물(D) 내에 포함된 작용성 그룹 W와 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 Z2와의 반응을 통하여 화합물(L)과 반응시키는데, 화합물(L)을 제1의 하이드록시알킬 전분 유도체와 반응시키기에 앞서, 화합물(L) 내에 포함된 작용성 그룹 X와 추가 화합물(M) 내에 포함된 작용성 그룹 Y와의 반응을 통하여 추가 화합물(M)과 반응시킨 하이드록시알킬 전분 유도체.
  41. 제22항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 화합물(M)이 폴리펩티드인 하이드록시알킬 전분 유도체.
  42. 제41항에 있어서, 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 하이드록시알킬 전분 유도체.
  43. - 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 또는
    - 화학식 I의 하이드록시알킬 전분을 이의 임의 산화된 환원성 말단에서, 이러한 하이드록시알킬 전분의 임의 산화된 환원성 말단과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1과 하나 이상의 작용성 그룹 W를 포함하는 화합물 (D)와 반응시킴으로써 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를
    - 상기 하이드록시알킬 전분과 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z1, 또는 상기 하이드록시알킬 전분 유도체 내에 포함된 작용성 그룹 W와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 Z2와,
    추가 화합물(M)의 작용성 그룹 Y와 반응될 수 있는 하나 이상의 작용성 그룹 X(상기 작용성 그룹 Y는 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹, 아세탈 그룹 또는 티오 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다)
    를 포함하는 화합물(L)과 반응시키는 단계를 포함하고, 하이드록시알킬 전분, 화합물(L) 및 임의 화합물(D)를 포함하는 반응 생성물을 추가 화합물(M)[여기서, 하나 이상의 추가 화합물은 폴리펩티드이다]과 반응시키는 단계를 추가로 포함하는, 하이드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 의해 수득될 수 있는 하이드록시알킬 전분 유도체를 치료학적 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 하이드록시알킬 전분이 다음 화학식 I에 따르는 구조를 갖는 약제학적 조성물:
    화학식 I
  44. 제43항에 있어서, 폴리펩티드가 AT III인 약제학적 조성물.
  45. 제43항에 있어서, 폴리펩티드가 에리트로포이에틴인 약제학적 조성물.
  46. 제43항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Y가 -SH이고, 화합물(L)이 구조식 Z1-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
    [상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, L'가 Z1과 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는 약제학적 조성물.
  47. 제43항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 화합물(L)이 구조식 Z1-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 아릴사이클로알킬, 알카릴 또는 사이클로알킬아릴이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, L'가 Z1과 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는 약제학적 조성물.
  48. 제43항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 그룹 Y가 -SH이고, 화합물(D)가 구조식 Z1-D'-W의 화합물이며 화합물(L)이 구조식 Z2-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
    [상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
    [상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나, 또는 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, D'가 Z1과 W를 브릿징하는 유기 쇄이거나 D'가 부재하고, L'가 Z2와 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는 약제학적 조성물.
  49. 제43항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서,작용성 그룹 Y가 알데히드 그룹, 케토 그룹, 헤미아세탈 그룹 및 아세탈 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 화합물(D)가 구조식 Z1-D'-W의 화합물이며 화합물(L)이 구조식 Z2-L'-X의 화합물이며 작용성 그룹 Z1이
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 X가
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 -SH이고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
    [상기에서, Hal은 Cl, Br 또는 I이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되거나, 또는 작용성 그룹 W 또는 작용성 그룹 Z2가 활성화 에스테르, 또는 활성화 에스테르로 임의로 변환되는 카복시 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 작용성 그룹 Z2 또는 작용성 그룹 W가
    [상기에서, G는 O 또는 S이고, 이것이 2회 존재하는 경우, 이는 독립적으로 O 또는 S이며, R'는 메틸이다]으로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, D'가 Z1과 W를 브릿징하는 유기 쇄이거나 D'가 부재하고, L'가 Z2와 X를 브릿징하는 유기 쇄이거나 L'가 부재하는 약제학적 조성물.
  50. 제43항에 있어서, 하이드록시알킬 전분을 수성 매질 중에서 다음 식에 따르는 화합물과 반응시키고, 이러한 반응 생성물을 에리트로포이에틴과 반응시키는, 약제학적 조성물:
  51. 제50항에 있어서, 에리트로포이에틴을 반응에 앞서 과요오드화나트륨으로 산화시키는, 약제학적 조성물.
  52. 제50항에 있어서, 에리트로포이에틴을 부분 탈시알릴화시키고, 반응에 앞서 과요오드화나트륨으로 후속 산화시키는, 약제학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
ES2214166T1 (es) * 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
KR101174510B1 (ko) 2002-09-11 2012-08-16 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 하이드록시알킬전분화 폴리펩티드, 특히 하이드록시알킬전분화 에리트로포이에틴
DE60323756D1 (de) 2002-10-08 2008-11-06 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
DE10256558A1 (de) * 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
WO2005014024A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
SG145746A1 (en) * 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
CA2534418A1 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
US8754031B2 (en) 2004-03-08 2014-06-17 Oncolix, Inc. Use of prolactin receptor antagonists in combination with an agent that inactivates the HER2/neu signaling pathway
ES2390885T3 (es) * 2004-03-11 2012-11-19 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
TW200603818A (en) * 2004-03-11 2006-02-01 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
EP2336192A1 (en) * 2004-03-11 2011-06-22 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
US7589063B2 (en) 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
WO2006094826A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method for coupling enzymatically activated glycoconjugates to a hydroxyalkyl starch
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
CN101528263B (zh) 2006-06-30 2013-01-23 Sku资产管理有限公司 用于癌症的先天性免疫方法的缀合物
EP2041167B1 (en) * 2006-07-25 2010-05-12 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor
EP2120998B1 (en) 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
WO2008074032A1 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
ES2744574T3 (es) 2007-01-18 2020-02-25 Genzyme Corp Oligosacáridos que comprenden un grupo aminooxi y conjugados de los mismos
AU2008304111B2 (en) 2007-09-27 2014-04-24 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
CN104888263B (zh) 2008-01-14 2018-11-30 北京环球利康科技有限公司 生物相容性止血、防粘连、促愈合、外科封闭的变性淀粉材料
US9175078B2 (en) 2008-01-25 2015-11-03 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
US8790701B2 (en) * 2008-04-28 2014-07-29 Surmodics, Inc. Poly-α(1→4)glucopyranose-based matrices with hydrazide crosslinking
JP2011519279A (ja) 2008-05-01 2011-07-07 アムジエン・インコーポレーテツド 抗ヘプシジン抗体及び使用の方法
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
NZ600382A (en) 2008-07-23 2013-11-29 Ambrx Inc Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
EP2350118B1 (en) 2008-09-19 2016-03-30 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
EP2349332B1 (en) 2008-11-13 2019-10-23 The General Hospital Corporation Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation bmp-6
CN102238966B (zh) 2008-12-06 2014-08-06 贝朗医疗有限公司 转运介导的胶体药用化合物
KR101672401B1 (ko) 2009-02-26 2016-11-16 온코릭스, 아이엔씨. 암 줄기 세포를 가시화하고 제거하기 위한 조성물 및 방법
US8648046B2 (en) 2009-02-26 2014-02-11 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
ES2859625T3 (es) * 2009-03-31 2021-10-04 Braun Melsungen Ag Productos de enlace de polisacáridos aminados
NZ597600A (en) * 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
PL2459224T3 (pl) 2009-07-27 2017-08-31 Baxalta GmbH Koniugaty białka związanego z krzepnięciem krwi
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
DK2459224T3 (en) 2009-07-27 2016-07-25 Baxalta GmbH Blodstørkningsproteinkonjugater
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
JP2013515080A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されているウシのソマトトロピンポリペプチドおよびそれらの使用
AU2010341518B2 (en) 2009-12-21 2014-01-09 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
WO2011156373A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2012004007A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
CA2804545A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
WO2012004009A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
EP2591009A1 (en) 2010-07-09 2013-05-15 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Nitric oxide delivering hydroxyalkyl starch derivatives
KR102172133B1 (ko) 2010-07-30 2020-11-02 박스알타 인코퍼레이티드 옥심 결합용 친핵성 촉매
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
HUE049352T2 (hu) 2010-12-22 2020-09-28 Baxalta GmbH Anyagok és módszerek egy vízoldható zsírsavszármazéknak egy fehérjéhez való konjugálására
US9480624B2 (en) 2011-03-31 2016-11-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2699293B8 (en) 2011-04-20 2022-07-20 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
EP3412314A1 (en) 2011-05-27 2018-12-12 Baxalta GmbH Therapeutic proteins conjugated to polysialic acid and methods of preparing same
WO2012170396A1 (en) * 2011-06-07 2012-12-13 Philadelphia Health & Education Corporation Spla2 monitoring strip
EP2741780A1 (en) 2011-08-10 2014-06-18 Ludwig-Maximilians-Universität München Method for the controlled intracellular delivery of nucleic acids
HUE043691T2 (hu) 2011-10-14 2019-09-30 Amgen Inc Befecskendezõ eszköz és összeszerelési eljárás
WO2013113503A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an oligonucleotide
AU2013204754C1 (en) 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
EP4234694A3 (en) 2012-11-21 2023-09-06 Amgen Inc. Drug delivery device
EP2926829B1 (en) * 2012-11-30 2018-07-25 Glytech, Inc. Sugar chain-attached linker, compound containing sugar chain-attached linker and physiologically active substance or salt thereof, and method for producing same
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
EP2968503B1 (en) 2013-03-15 2018-08-15 Intrinsic LifeSciences LLC Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
TWI639453B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
TWI592183B (zh) 2013-03-15 2017-07-21 安美基公司 本體輪廓可調適之自動注射器裝置
EP2976364A1 (en) * 2013-03-20 2016-01-27 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
US20160311933A1 (en) * 2013-03-20 2016-10-27 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Process for the preparation of thiol functionalized hydroxyalkyl starch derivatives
WO2014147175A1 (en) * 2013-03-20 2014-09-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
EP2976117B1 (en) 2013-03-22 2020-12-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3050893B1 (en) 2013-09-24 2020-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Glycoamino acid and use thereof
AU2014340171B2 (en) 2013-10-24 2019-05-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN105960277A (zh) * 2014-02-10 2016-09-21 霍尼韦尔国际公司 用于液相氟化的反应器设计
EP3114138B1 (en) 2014-03-05 2021-11-17 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
MX2016014561A (es) 2014-05-07 2017-06-21 Amgen Inc Autoinyetor con elementos reductores del shock.
MX2016015854A (es) 2014-06-03 2017-07-19 Amgen Inc Sistema de suministro de farmacos controlable y metodo de uso.
CN104072608A (zh) * 2014-06-23 2014-10-01 山东齐都药业有限公司 含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
CA2961917A1 (en) 2014-09-22 2016-03-31 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
EP3943135A3 (en) 2014-10-14 2022-06-29 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
EP3233163B1 (en) 2014-12-19 2021-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
WO2016133947A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
JP2018512184A (ja) 2015-02-27 2018-05-17 アムジエン・インコーポレーテツド 針ガードの移動に対する抵抗力の閾値が調整可能な針ガード機構を備えた薬物送達装置
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3386573B1 (en) 2015-12-09 2019-10-02 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
WO2017160799A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
JP2019522962A (ja) 2016-05-20 2019-08-22 オクタファルマ アクチェン ゲゼルシャフト 改善された薬物動態を有する、グリコシル化ｖｗｆ融合タンパク質
GB201609083D0 (en) 2016-05-24 2016-07-06 Syntab Therapeutics Gmbh Synthetic compound
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
EP3582825A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
AU2018230546B2 (en) 2017-03-07 2024-03-21 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
US11986624B2 (en) 2017-03-09 2024-05-21 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
WO2018172219A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
DK3600491T3 (da) 2017-03-28 2023-10-23 Amgen Inc Stempelstang og sprøjtekonstruktionssystem samt fremgangsmåde
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
WO2018236619A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. REDUCING THE IMPACTS / IMPACTS OF ACTIVATION OF A DEVICE
US11395880B2 (en) 2017-06-23 2022-07-26 Amgen Inc. Electronic drug delivery device
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
WO2019032482A2 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Amgen Inc. HYDRAULIC-PNEUMATIC PRESSURE CHAMBER DELIVERY SYSTEM
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
US11305026B2 (en) 2017-11-03 2022-04-19 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MA50903A (fr) 2017-11-16 2021-05-12 Amgen Inc Auto-injecteur avec détection de décrochage et de point d'extrémité
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
CN108503718B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用
CN108403641B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种载药纳米材料及其制备方法
CN108219019B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种巯基化羟乙基淀粉及其修饰的纳米材料和制备方法
US11191806B2 (en) * 2018-05-04 2021-12-07 Boris Farber Polymyxin-based pharmaceutical composition for treating infectious diseases
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US12115360B2 (en) 2018-07-24 2024-10-15 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US20210260279A1 (en) 2018-07-24 2021-08-26 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Assembling a memory alloy ejector activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
MA53818A (fr) 2018-10-05 2022-01-12 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament ayant un indicateur de dose
AR116704A1 (es) 2018-10-15 2021-06-02 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con mecanismo de amortiguación
EA202191038A1 (ru) 2018-10-15 2021-07-06 Эмджен Инк. Способ платформенной сборки для устройства доставки лекарственного средства
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN111157736A (zh) * 2018-11-08 2020-05-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (ko)
US3191291A (en) 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
NL269801A (nl) 1960-10-04 1964-03-10 Farbwerke Höchst Ag Werkwijze ter bereiding van in water onoplosbare kleurstoffen
DE2233977A1 (de) 1971-07-14 1973-02-01 Unilever Nv Verfahren zur herstellung oxydierter kohlenhydrate
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) * 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4001401A (en) * 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4001200A (en) 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4061736A (en) * 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4053590A (en) 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) * 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
EP0019403B1 (en) * 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
US4454161A (en) 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
IE56026B1 (en) 1982-10-19 1991-03-27 Cetus Corp Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
DE3485810T2 (de) 1983-05-27 1992-12-10 Texas A & M University Syst Verfahren zur herstellung eines rekombinanten baculovirus-expressionsvektors.
DE3482812D1 (de) 1983-10-11 1990-08-30 Fidia Spa Fraktionen von hyaluronsaeure mit pharmazeutischer aktivitaet, verfahren zu deren herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
DE3501616A1 (de) 1985-01-17 1986-07-17 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Verfahren zur herstellung von hydroxylamin-derivaten
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5217998A (en) 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US4863964A (en) 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5214132A (en) 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JP2594123B2 (ja) 1987-09-12 1997-03-26 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US6261800B1 (en) 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE3919729C3 (de) 1989-06-16 1997-06-19 Fresenius Ag Hydroxyethylstärke als Plasmaexpander, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
JP2838800B2 (ja) 1989-09-02 1998-12-16 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
KR100263845B1 (ko) 1989-10-13 2000-08-16 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 동형체와 그의 제조방법 및 그를 포함하는제약학적 조성물
JP2975632B2 (ja) 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
DK130991D0 (da) 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
AU5098193A (en) * 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
CA2110543A1 (en) 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
NO934477L (no) * 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG hydrazon- og PEG oksim-bindingdannende reagenser og proteinderivater derav
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
EP0601417A3 (de) 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
ATE146189T1 (de) 1993-03-16 1996-12-15 Hemosol Inc Selektive vernetzung von hemoglobin mittels oxidierten, ringgeöffneten sacchariden
AU7097094A (en) * 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5840900A (en) 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
JPH07188291A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Hayashibara Biochem Lab Inc 蛋白質とその製造方法並びに用途
US5876980A (en) 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6214331B1 (en) 1995-06-06 2001-04-10 C. R. Bard, Inc. Process for the preparation of aqueous dispersions of particles of water-soluble polymers and the particles obtained
US5736533A (en) 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5981507A (en) 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5723589A (en) 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
SI0932399T1 (sl) 1996-03-12 2006-10-31 Pg Txl Co Lp Vodotopna paklitakselna predzdravila
US5696152A (en) 1996-05-07 1997-12-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Taxol composition for use as organ preservation and cardioplegic agents
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE19628705A1 (de) 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
US5851984A (en) 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US6011008A (en) 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
AU750916C (en) 1997-08-07 2003-05-22 University Of Utah, The Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US5847110A (en) 1997-08-15 1998-12-08 Biomedical Frontiers, Inc. Method of reducing a schiff base
US6875594B2 (en) 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
US6596135B1 (en) 1998-03-05 2003-07-22 Asahi Glass Company, Limited Sputtering target, transparent conductive film, and method for producing the same
CA2233725A1 (en) 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6261594B1 (en) 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
EP1035137A1 (en) 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7279176B1 (en) 1999-09-02 2007-10-09 Rice University Nitric oxide-producing hydrogel materials
US20020065410A1 (en) 1999-12-02 2002-05-30 Antrim Richard L. Branched starches and branched starch hydrolyzates
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2001294601A (ja) 2000-04-11 2001-10-23 Akita Prefecture 高度分岐澱粉と該高度分岐澱粉の製造方法
JP2002003398A (ja) 2000-04-17 2002-01-09 Ltt Institute Co Ltd 徐放製剤、その製造法及びワクチン
DE10023051B4 (de) * 2000-05-11 2004-02-19 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin, dessen Verwendung und Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin enthaltende diagnostische Zubereitung
FR2811967B1 (fr) 2000-07-24 2002-12-13 Cebal Tube muni d'une tete de fixation pour divers bouchages et les divers bouchages munis de moyens de fixation sur ledit tube
US6417347B1 (en) 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
CN1457257A (zh) 2000-09-08 2003-11-19 格莱风治疗公司 “拟”天然化学连接
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) * 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US7629456B2 (en) 2001-10-26 2009-12-08 Noxxon Pharma Ag Modified L-nucleic acid
US6375846B1 (en) 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
DE10207072A1 (de) 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE60315145T2 (de) 2002-03-13 2008-04-30 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Hydrophiles polymerderivat mit y-verzweigung und herstellungsverfahren dafür; obige verbindung enthaltender medizinischer verbundwerkstoff
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
EP1514107B1 (en) 2002-06-03 2013-05-15 The Institute for Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
EP1591467A1 (en) 2002-09-09 2005-11-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
MXPA05002620A (es) 2002-09-09 2005-05-05 Nektar Therapeutics Al Corp Alcanales polimericos solubles en agua.
DE10242076A1 (de) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
ES2214166T1 (es) 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
KR101174510B1 (ko) * 2002-09-11 2012-08-16 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 하이드록시알킬전분화 폴리펩티드, 특히 하이드록시알킬전분화 에리트로포이에틴
DE60323756D1 (de) 2002-10-08 2008-11-06 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
WO2005014024A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
SG145746A1 (en) 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
CA2534418A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
JP2007519746A (ja) 2004-01-29 2007-07-19 バイオシネクサス インコーポレーティッド ワクチン調製におけるアミノ−オキシ官能基の使用
DE102004009783A1 (de) 2004-02-28 2005-09-15 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Hyperverzweigte Stärkefraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Konjugate mit pharmazeutischen Wirkstoffen
EP2336192A1 (en) 2004-03-11 2011-06-22 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
ES2390885T3 (es) 2004-03-11 2012-11-19 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
TW200603818A (en) 2004-03-11 2006-02-01 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
WO2005112954A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 William Marsh Rice University Nitric oxide releasing compositions and associated methods
AU2006222187A1 (en) 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
US7928079B2 (en) 2005-10-31 2011-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polysaccharide-derived nitric oxide-releasing carbon-bound diazeniumdiolates
JP2009093397A (ja) 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
AU2009302387B2 (en) 2008-10-07 2014-12-04 Rexahn Pharmaceuticals, Inc HPMA - docetaxel or gemcitabine conjugates and uses therefore

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