JP2006516534A - Ｈａｓ化ポリペプチド、特にｈａｓ化エリスロポエチン - Google Patents

Ｈａｓ化ポリペプチド、特にｈａｓ化エリスロポエチン Download PDF

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Abstract

本発明は、１個以上のＨＡＳ分子を含み、各ＨＡＳが糖質部分またはチオエーテルを介してポリペプチドにコンジュゲートされている、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−ポリペプチドコンジュゲート（ＨＡＳ−ポリペプチド）、ならびにその製造方法に関する。好ましい一実施形態では、前記ポリペプチドがエリスロポエチン（ＥＰＯ）である。

Description

本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプンにコンジュゲートしたポリペプチド、特にエリスロポエチンに関する。
特定の生理学的効果を得るために循環系にポリペプチド、特に酵素またはサイトカインを適用することは、現代医学では周知の手段である。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆細胞が赤血球に成熟するのに必要な糖タンパク質ホルモンであり、ヒト成人では腎臓で産生される。ＥＰＯは循環中の赤血球レベルの調節には不可欠である。低い組織酸素レベルを特徴とする状態は、ＥＰＯの生合成の増加を惹起し、続いてそのＥＰＯが赤血球生成を刺激する。例えば慢性腎不全で見られるような腎機能の喪失は、通例、ＥＰＯの生合成の低下をもたらし、それに伴って赤血球の減少をもたらす。
エリスロポエチンは約３４，０００Ｄａの酸性糖タンパク質ホルモンである。ヒトエリスロポエチンは、自然状態では単量体として存在する１６６アミノ酸ポリペプチドである（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＰＮＡＳ ８２，７５８０−７５８４、ＥＰ １４８ ６０５ Ｂ２、ＥＰ ４１１ ６７８ Ｂ２）。エリスロポエチンをコード化する遺伝子の同定、クローニングおよび発現は、例えば米国特許第４，７０３，００８号などに記載されている。組換えエリスロポエチンプラスミドを含む哺乳類細胞の成長を支持する細胞培養培地からの組換えエリスロポエチンの精製は、例えば米国特許第４，６６７，０１６号に記載されている。
この技術分野では、インビボでのＥＰＯの生物活性は、主として、ＥＰＯに結合しているシアル酸の度合いに依存すると、一般に考えられている（例えばＥＰ ４２８ ２６７ Ｂ１参照）。理論上、１分子のＥＰＯには、Ｎ−グリコシル化部位およびＯ−グリコシル化部位に連結している糖質側鎖の末端に、１４分子のシアル酸を結合させることができる。高度にシアリル化したＥＰＯ調製物を得るには、非常に手の込んだ精製ステップが必要である。
エリスロポエチンに関するさらに詳細な情報については、Ｋｒａｎｔｚ，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７（３）：４１９−３４（総説）およびＣｅｒａｍｉ，Ｂｅｙｏｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ：ｎｏｖｅｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，２００１，Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．，（３ Ｓｕｐｐｌ ７）：３３−９（総説）を参照されたい。
ポリペプチドおよび酵素の応用に伴う周知の課題は、これらのタンパク質の安定性が多くの場合、十分ではないということである。特にエリスロポエチンは比較的短い血漿半減期を有する（ＳｐｉｖａｋおよびＨｏｇａｎｓ，１９８９，Ｂｌｏｏｄ ７３，９０；ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ ７６，１７１８）。これは、治療血漿レベルが迅速に失われ、静脈内投与を反復して行わなければならないことを意味している。さらに、場合によっては、そのペプチドに対する免疫応答も観察される。
ポリペプチドをポリマー分子とつなぐことにより、そのポリペプチドの安定性を向上させることができ、そのポリペプチドに対する免疫応答が減少することは、一般に認められている。ＷＯ ９４／２８０２４には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された生理活性ポリペプチドが、免疫原性および抗原性の低下を示し、非複合体タンパク質よりもかなり長く血流中を循環する（すなわち遅いクリアランス速度を有する）ことが開示されている。
しかしＰＥＧ薬物コンジュゲートには、例えば、インビボ分解経路の要素によって認識され得る天然の構造を示さないことなど、いくつかの欠点がある。したがって、ＰＥＧコンジュゲートの他に、他のコンジュゲートおよびタンパク質ポリメレート（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｔｅｓ）も製造されている。文献には、様々なタンパク質および高分子（例えばポリメラーゼ）を架橋する方法が、数多く記載されている（例えばＷｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３，ＣＲＣＳ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は天然アミロペクチンの誘導体であり、体内のα−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳタンパク質コンジュゲートの製造は先行技術に記載されている（例えばＤＥ ２６ １６ ０８６またはＤＥ ２６ ４６ ８５４のＨＥＳ−ヘモグロビンコンジュゲートを参照されたい）。
ＤＥ ２６ ４６ ８５４には、ヘモグロビンとＨＥＳとのコンジュゲーション方法が開示されている。これらの方法では、ＨＥＳを過ヨウ素酸ナトリウムと反応させてジアルデヒドを生成させ、それをヘモグロビンに連結する。これに対し、ＤＥ ２６ １６ ０８６に開示されているヘモグロビンとＨＥＳとのコンジュゲーション方法では、まず架橋剤（例えば臭化シアン）をＨＥＳに結合し、次にヘモグロビンをその中間体生成物に連結する。
ＨＥＳは、トウモロコシデンプンに最高９５重量％の濃度で存在する糖質ポリマー、アミロペクチンの置換誘導体である。ＨＥＳは有利な生物学的性質を示し、診療現場では循環血液量補充剤として使用されると共に、血液希釈療法にも使用される（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，８（８），２７１−２７８およびＷｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，４１，４９４−４９８）。
アミロペクチンはグルコース部分からなっていて、主鎖にはα−１，４−グリコシド結合が存在し、分岐部位にはα−１，６−グリコシド結合が見いだされる。この分子の物理化学的性質は、主としてグリコシド結合のタイプによって決まる。切れ目が入ったα−１，４−グリコシド結合により、１巻きあたり約６個のグルコース単量体を含むらせん構造が生成する。
ポリマーの物理化学的性質および生化学的性質は置換によって改変することができる。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリヒドロキシエチル化によって達成することができる。反応条件を調節すれば、無置換グルコース単量体中の各ヒドロキシ基がヒドロキシエチル化に対して持っている異なる反応性を利用することが可能である。この事実のおかげで、当業者は、置換パターンに、ある程度は影響を及ぼすことができる。
したがって、ＨＥＳは主に、分子量分布および置換度によって特徴付けられる。置換度を記述するには２つの手段が考えられる。すなわち、
１．置換度は全グルコース部分（ＤＳ）に対する置換グルコース単量体の割合に関して記載することができる。
２．置換度は「モル置換度」（ＭＳ）として記述することもでき、この場合はグルコース部分１個あたりのヒドロキシエチル基数が記載される。
ＨＥＳ溶液は、各分子が重合度、分岐部位数、分岐パターンおよび置換パターンに関して互いに異なっている多分散組成物として存在する。したがってＨＥＳは異なる分子量を有する化合物の混合物である。そのため、特定のＨＥＳ溶液は、統計的手段を使って、平均分子量によって決定される。この場合、Ｍnは、分子数に依存する相加平均として計算される。また、重量平均Ｍwは、ＨＥＳの質量に依存する単位を表す。
当分野で開示されているＨＥＳ−薬物コンジュゲートには、ＨＥＳが薬物に部位特異的にはコンジュゲートされないという欠点がある。そのため、コンジュゲーションは多くの成分を有する極めて不均質な生成物をもたらし、それらの成分は、コンジュゲーションステップ中に起こる３次元構造の破壊により、不活性になっている可能性がある。
要約すると、改良された安定性および／または生物活性を有する、さらに改良されたポリペプチドが今なお必要とされている。シアル酸度が高くそれゆえに高い活性を有するアイソフォームをシアル酸度の低いアイソフォームから精製する必要があるエリスロポエチンの場合は、特にそうであると言える（ＥＰ ４２８ ２６７ Ｂ１を参照）。したがって、甚だしい精製を必要とせずに高活性なポリペプチドが得られる製造方法があれば、極めて有利だろう。残念ながら、細菌または昆虫細胞でのポリペプチドの製造は困難であることが多い。なぜなら、ポリペプチドは正しく折りたたまれた未変性コンフォメーションでは産生されないことが多く、適切なグリコシル化も起こらないからである。
したがって、インビボで高い生物活性を持ち、容易に安価な費用で製造することができるポリペプチド誘導体、特にエリスロポエチン誘導体を提供することが、本発明の目的である。さらに、実行が容易であり、かつ高い生物活性を有する生成物をもたらすポリペプチド誘導体の製造方法を提供することが、本発明のもう一つの目的である。高い生物活性を有するポリペプチド誘導体を含む医薬組成物を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
本発明の一態様によれば、この課題は、１個以上のＨＡＳ分子を含み、各ＨＡＳが
ａ）糖質部分、または
ｂ）チオエーテル
を介してＥＰＯにコンジュゲートされている、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−エリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲート（ＨＡＳ−ＥＰＯ）によって解決される。
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯには、コンジュゲーション前のエリスロポエチンと比較して、改善された生物学的安定性を示すという利点がある。そのうえ、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯは、標準ＢＲＰ ＥＰＯよりも高い生物活性を示す。これは主として、ＨＡＳ−ＥＰＯが、肝臓および腎臓の除去系によって認識されにくいか、または全く認識されず、したがってより長い期間、循環系内に残るという事実による。さらにまた、ＨＡＳは部位特異的に取り付けられるので、ＨＡＳをＥＰＯにコンジュゲートすることによってＥＰＯのインビボ生物活性が破壊されてしまう危険は、最小限に抑えられる。
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯは、主として２つの成分、すなわちエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチドと、それに連結したヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とを持っている。
ＥＰＯは、任意のヒト由来ＥＰＯ（例えばＩｎｏｕｅ，Ｗａｄａ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，１９９４，Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ａｎｅｍｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．１７（２），１８０−４；Ｍｉｙａｋｅ，Ｋｕｎｇ，Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，１９７７，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２５２（１５），５５５８−６４）または他の哺乳類由来ＥＰＯであることができ、ヒト腎臓、ヒト胎児肝臓、または動物（好ましくはサル）腎臓などの天然供給源からの精製によって得ることができる。さらに、「エリスロポエチン」または「ＥＰＯ」という表現は、１個以上（たとえば１〜２５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１または２個）のアミノ酸が別のアミノ酸に交換されており、かつエリスロポエチン活性を示すＥＰＯ変異体も包含する（例えばＥＰ ６４０ ６１９ Ｂ１）。エリスロポエチン活性の測定は当分野に記載がある（インビトロ活性の測定については、例えばＦｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７，１２０３ｆｆ；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓ．，１４０，３２３−３３４を参照されたい。また、インビボＥＰＯ活性の測定については、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２００１，９１１−９１７、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２０００，１３１６ エリスロポエチン濃縮溶液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ ｓｏｌｕｔｉｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ），７８０−７８５、欧州薬局方（１９９６／２０００）、欧州薬局方，１９９６，エリスロポエチン濃縮溶液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ），Ｐｈａｒｍａｅｕｒｏｐａ．，８，３７１−３７７、Ｆｉｂｉ，Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ，Ｐａｕｌｙ，Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ．，１９９５，Ｎ− ａｎｄ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｕｔｅｉｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ，８５（５），１２２９−３６を参照されたい（ＥＰＯおよび修飾型ＥＰＯを１日目、２日目および３日目に雌ＮＭＲＩマウスに注射し（等量のタンパク質５０ｎｇ／マウス）、４日目に血液試料を採取して、網状赤血球が決定された））。ＥＰＯ活性を測定するための試験が記載されているものには、他にも以下の刊行物がある。Ｂａｒｂｏｎｅ，Ａｐａｒｉｃｉｏ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｒｉｔｃｈｉｅ，１９９４，Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｓ ａ ｂｉｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１２（４），５１５−２２、Ｂｏｗｅｎ，Ｃｕｌｌｉｇａｎ，Ｂｅｇｕｉｎ，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｖｉｌｌｉｓ，１９９４，Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｕｓｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｗｉｔｈ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｌｅｕｋｅｍｉ，８（１），１５１−５、Ｄｅｌｏｒｍｅ，Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ，Ｇｉｆｆｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｂｏｏｎｅ，Ｅｌｌｉｏｔｔ，１９９２，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４１），９８７１−６、Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｏｈ−ｅｄａ，Ｋｕｂｏｎｉｗａ，Ｔｏｍｏｎｏｈ，Ｓｈｉｍｏｎａｋａ，Ｏｃｈｉ，１９９２，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（１１），７７０３−９、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ａｋａｉ，Ｋａｗａｎｉｓｈｉ，Ｕｅｄａ，Ｍａｓｕｄａ，Ｓａｓａｋｉ，１９９１，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｏｎ ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３０），２０４３４−９、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｉｎｏｕｅ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｋｕｂｏｔａ，Ｗａｄａ，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈｏｓｈｉ，Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ，Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９８９，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（２０），７８１９−２２、Ｋｕｒｔｚ，Ｅｃｋａｒｄｔ，１９８９，Ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｎｅｐｈｒｏｎ．，５１（１），１１−４（ドイツ）、Ｚｕｃａｌｉ，Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，１９８５，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ａｎｄ ｓｉｌｉｃｉｃ ａｃｉｄ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１３（３），８３３−７、Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８３，Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＥＥＦ），ａ ｌａｔｅ ａｃｔｉｎｇ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１１（１），１８−３１。
好ましくはＥＰＯは組換え生産される。これには、真核細胞または原核細胞、好ましくは哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、またはＥＰＯの組換え生産にとって好都合な他の任意の細胞タイプでの生産が含まれる。さらに、ＥＰＯは、トランスジェニック動物で（例えば乳汁、血液などの体液中に）、トランスジェニック鳥（特に家禽、好ましくはニワトリ）の卵で、またはトランスジェニック植物で発現させることもできる。
ポリペプチドの組換え生産は当分野では知られている。一般に、これには、適当な発現ベクターによる宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの生産を可能にする条件での宿主細胞の培養、および宿主細胞からのポリペプチドの精製が含まれる。詳細な情報は、例えばＫｒｙｓｔａｌ，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｆａｒｂｅｒ，Ｓｍａｒｔ，１９８６，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｔｏ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｂｙ ａ ｒａｐｉｄ ｆｉｖｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｂｌｏｏｄ，６７（１），７１−９、Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７、ＥＰ ６４０ ６１９ Ｂ１およびＥＰ ６６８ ３５１ Ｂ１などを参照されたい。
好ましい一実施形態では、ＥＰＯはヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する（ＥＰ １４８ ６０５ Ｂ２参照）。
ＥＰＯは、Ｎ−および／またはＯ−結合グリコシル化によってＥＰＯに取り付けられた１個以上（好ましくは１〜４個、好ましくは４個）の糖質側鎖を含み得る。すなわちＥＰＯはグリコシル化される。ＥＰＯが真核細胞中で産生される場合、通常、そのポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。したがって哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞での生合成中にＥＰＯには糖質側鎖が取り付けられているだろう。グリコシル化ＥＰＯの構造と性質は当分野では詳しく研究されている（ＥＰ ４２８ ２６７ Ｂ１、ＥＰ ６４０ ６１９ Ｂ１、Ｒｕｓｈ，Ｄｅｒｂｙ，Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｒｒｙ，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｒｏｈｄｅ，Ｋａｔｔａ，１９９５，Ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，６７（８），１４４２−５２、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋｏｂａｔａ，１９９１，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（４），３３７−４６（総説）を参照されたい）。
ＨＡＳはＥＰＯに直接コンジュゲートするか、またはリンカー分子を介してコンジュゲートすることができる。リンカー分子の性質は、ＨＡＳをＥＰＯに連結する方法に依存する。リンカー分子の官能基として考えられるものを表１に示し、以下に説明する。市販のリンカーもいくつかある（例えばＰｉｅｒｃｅ製品、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（ドイツ・ボン）から入手可能）。好適なリンカーを表２にいくつか示す。リンカーの性質とその目的は、後にＨＥＳ−ＥＰＯの製造方法に関する項で詳述する。
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートの好ましい一実施形態では、糖質部分を介してＥＰＯにＨＡＳをコンジュゲートする。
本発明に関して「糖質部分」という用語は、ヒドロキシアルデヒドまたはヒドロキシケトンならびにその化学修飾物を指す（「Ｒｏｅｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ」Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ（ドイツ・シュトゥットガルト），第９版，１９９０，第９巻，２２８１−２２８５頁およびそこに挙げられている文献を参照されたい）。さらに、この用語は、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸などの天然糖質部分の誘導体も表す。また、この用語は、環構造が開かれている化学的に酸化された天然糖質部分も包含する。
上記糖質部分はＥＰＯポリペプチド主鎖に直接連結することができる。好ましくは、上記糖質部分は糖質側鎖の一部である。この場合は、ＨＡＳを連結させる糖質部分とＥＰＯポリペプチド主鎖との間に、さらなる糖質部分が存在してもよい。より好ましくは、上記糖質部分は糖質側鎖の末端部分である。
より好ましい一実施形態では、糖質側鎖のガラクトース残基に、好ましくは糖質側鎖の末端ガラクトース残基に、ＨＡＳをコンジュゲートする。このガラクトース残基は、末端シアル酸を除去してから酸化を行うことによって、コンジュゲーションに利用できるようにすることができる（下記参照）。
もう一つのより好ましい実施形態では、糖質側鎖のシアル酸残基に、好ましくは糖質側鎖の末端シアル酸残基に、ＨＡＳをコンジュゲートする。
さらに、ＨＡＳは、チオエーテルを介してＥＰＯにコンジュゲートすることもできる。以下に詳述するように、このＳ原子は、ＥＰＯに結合している任意のＳＨ基（元から存在するＳＨ基でも元々は存在しないＳＨ基でもよい）に由来することができる。
好ましい一実施形態として、上記Ｓ原子は、ＨＥＳの酸化型糖質部分、好ましくはＥＰＯの糖質側鎖の一部である酸化型糖質部分に導入されているＳＨ基に由来し得る（下記参照）。
好ましくは、上記チオエーテル中のＳ原子は、元から存在するシステインまたは付加されたシステインに由来する。より好ましくは、ＥＰＯはヒトＥＰＯのアミノ酸配列を持ち、元から存在するシステインはシステイン２９および／または３３である。より好ましい一実施形態では、ＨＡＳはシステイン２９にコンジュゲートされ、システイン３３は別のアミノ酸で置換される。または、ＨＡＳをシステイン３３にコンジュゲートし、システイン２９を別のアミノ酸で置換することもできる。
本発明に関して、「付加されたシステイン」という用語は、そのポリペプチド（好ましくはＥＰＯ）が、野生型ポリペプチドには存在しないシステイン残基を有することを意味する。
本発明のこの態様に関して、上記システインは、ＥＰＯのＮ末端またはＣ末端に付加された追加アミノ酸であることができる。
さらにまた、付加されたシステインは、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものであってもよい。適切な方法は当分野では知られている（上記参照）。本発明のこの態様に関して、好ましくは、ＥＰＯはヒトＥＰＯであり、置換されるアミノ酸残基はセリン１２６である。
ＨＡＳ−ＥＰＯの第２成分はヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）である。
本発明において「ヒドロキシアルキルデンプン」という用語は、ヒドロキシアルキル基で置換されているデンプン誘導体を示すために用いられる。この場合、アルキル基は置換されていてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキルは、２〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子を含有する。したがって「ヒドロキシアルキルデンプン」には、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンが含まれ、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは好ましい。
ＨＡＳのヒドロキシアルキル基は少なくとも１個のＯＨ基を含有する。
「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現には、アルキル基が一置換または多置換されている誘導体も含まれる。この場合、アルキル基は、ＨＡＳが水溶性のままであるという条件の下で、ハロゲン（特にフッ素）またはアリール基で置換されていることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキルの末端ヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化することができる。また、ヒドロキシアルキルデンプンのアルキル基は線状でも分岐状でもよい。
さらに、アルキルの代わりに、線状または分岐状の置換または無置換アルケン基も使用することができる。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明のどの実施形態にとっても、最も好ましい。
本発明に関して、ヒドロキシエチルデンプンは１〜３００ｋＤａの平均分子量（重量平均）を有することができ、５〜１００ｋＤａの平均分子量はより好ましい。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、ヒドロキシエチル基に関して、０．１〜０．８のモル置換度および２〜２０の範囲のＣ2：Ｃ6置換比を示し得る。
本ＨＡＳ−ＥＰＯは、ＥＰＯ１分子あたり１〜１２個、好ましくは１〜９個、１〜６個または１〜３個、最も好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含み得る。ＥＰＯ１分子あたりのＨＡＳ分子数は、生成物の加水分解と得られた単糖類の誘導体化後にＧＣ−ＭＳを使って定量的糖組成分析を行うことにより、決定することができる（ＣｈａｐｌｉｎおよびＫｅｎｎｅｄｙ編，１９８６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈシリーズ（ＩＳＢＮ ０−９４７９４６−４４−３）、特に第１章「Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」１−３６頁、第２章「Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」３７−５３頁、第３章「Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」５５−９６頁を参照されたい）。
インビトロ生物活性ではＥＰＯ受容体への結合親和性しか測定しないので、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートは、組換え未変性ＥＰＯと基本的に同じインビトロ生物活性を示し得る。インビトロ生物活性を決定する方法は当分野では知られている（上記参照）。
さらにＨＡＳ−ＥＰＯは、コンジュゲーションの出発物質として使用されるＥＰＯ（未コンジュゲートＥＰＯ）よりも高いインビボ活性を示す。インビボ生物活性を決定する方法は、当分野では知られている（上記参照）。さらに、インビボおよびインビトロＥＰＯ活性を決定するためのアッセイを、実施例９および１０に記載する。
未コンジュゲートＥＰＯのインビボ活性を１００％とすると、ＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートは、１１０〜５００％、好ましくは３００〜４００％または１１０％〜３００％、好ましくは１１０％〜２００％、より好ましくは１１０％〜１８０％または１１０％〜１５０％、最も好ましくは１１０％〜１４０％のインビボ活性を示し得る。
Ａｍｇｅｎの高シアリル化ＥＰＯ（ＥＰ ４２８ ２６７ Ｂ１参照）と比較した場合、高シアリル化ＥＰＯのインビボ活性を１００％とすると、ＨＡＳ−ＥＰＯは、高シアリル化ＥＰＯのインビボ活性の好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、または少なくとも９５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％もしくは少なくとも３００％を示す。最も好ましくは、ＨＡＳ−ＥＰＯは高シアリル化ＥＰＯのインビボ活性の少なくとも９５％を示す。
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートの高いインビボ生物活性は、主として、ＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートは肝臓の除去系によって認識されにくく、分子量が高いため腎クリアランスも低下するので、未コンジュゲートＥＰＯよりも長く循環中に留まるという事実に起因している。循環中のＥＰＯのインビボ半減期を決定する方法は当分野では知られている（Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ，Ｌｕｎｎ，Ｄａｖｉｓ，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｓｉｅｋｍａｎ，１９９８，Ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｄｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（３），１１８４−８）。
したがって、現在市販されているＥＰＯ調製物よりも投与回数を減らすことのできるＨＡＳ−ＥＰＯが得られるという点が、本発明の大きな利点である。標準的なＥＰＯ調製物は少なくとも３日ごとに投与する必要があるが、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートは好ましくは週２回、より好ましくは週１回投与される。
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ製造方法との関連で以下に開示するＥＰＯまたはＨＡＳの性質に関する実施形態は、全て、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートにも当てはまる。
ヒドロキシアルキルデンプンはデンプンのエーテル誘導体である。本発明では、このエーテル誘導体だけでなく、他のデンプン誘導体も使用することができる。例えば、エステル化されたヒドロキシ基を有する誘導体は有用である。これらの誘導体は、例えば、２〜１２個の炭素原子を有する無置換モノカルボン酸または無置換ジカルボン酸の誘導体、またはその置換誘導体であることができる。とりわけ有用なものは２〜６個の炭素原子を有する無置換モノカルボン酸（特に酢酸）の誘導体である。これに関連して、アセチルデンプン、ブチルデンプンまたはプロピルデンプンも好ましい。
また、２〜６個の炭素原子を有する無置換ジカルボン酸の誘導体も好ましい。
ジカルボン酸の誘導体の場合は、ジカルボン酸の第２カルボキシ基もエステル化されていると有用である。また、本発明においては、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体も好適である。
置換モノカルボン酸または置換ジカルボン酸の場合、置換基は、好ましくは、置換アルキル残基に関して上に挙げたものと同じであることができる。
デンプンをエステル化するための技術は当分野では知られている（例えばＫｌｅｍｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２巻，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ワインハイム・ニューヨーク、特に４．４章「Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ」（ＩＳＢＮ ３−５２７−２９４８９−９）を参照されたい）。
もう一つの態様として、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−エリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲート（ＨＡＳ−ＥＰＯ）を製造する方法であって、
ａ）修飾ＨＡＳと反応する能力を有するＥＰＯを提供するステップ、
ｂ）ステップａ）のＥＰＯと反応する能力を有する修飾ＨＡＳを提供するステップ、および
ｃ）ステップａ）のＥＰＯをステップｂ）のＨＡＳと反応させることにより、１個以上のＨＡＳ分子を含み、各ＨＡＳがＥＰＯに、
ｉ）糖質部分、または
ｉｉ）チオエーテル
を介してコンジュゲートされているＨＡＳ−ＥＰＯを製造するステップ、
を含む方法に関する。
本発明の方法には、高い生物活性を示すＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートが製造されるという利点がある。また、本発明の方法には、最終的な収量を低下させる大がかりで時間のかかる精製ステップは含まれていない（例えば、インビボ生物活性が低いかまたは全くないことが知られている低シアリル化型ＥＰＯを精製除去する必要がない）ので、有効なＥＰＯ誘導体を低コストで製造することができるという利点もある。特に実施例２０では、わずかな修飾ステップ数で製造されたＨＥＳ−ＥＰＯが、標準ＢＲＰ ＥＰＯより３倍高い活性を示すことを実証する。
したがって、本発明の方法の第１ステップでは、修飾ＨＡＳと反応する能力を有するＥＰＯを提供する。
本発明で使用する「提供する」という用語は、各ステップ後に所望の性質を有する分子（ステップａ）ではＥＰＯ、ステップｂ）ではＨＡＳ）が利用できるようになるというふうに解釈する必要がある。
ステップａ）の場合、これには、天然供給源からのＥＰＯの精製および宿主細胞または宿主生物での組換え生産と、必要ならばそのようにして得たＥＰＯの修飾が含まれる。
本発明の出発物質であるＥＰＯについては、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲートの一部であるエリスロポエチンの場合と同じことが言える。これに関連して、上に開示した好ましい実施形態は、本発明の方法にも当てはまる。
したがって、好ましい一実施形態では、ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する。
好ましくはＥＰＯは組換え生産される。これには、真核細胞または原核細胞、好ましくは哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、またはＥＰＯの組換え生産にとって好都合な他の任意の細胞タイプでの生産が含まれる。さらに、ＥＰＯは、トランスジェニック動物で（例えば乳汁、血液などの体液中に）、トランスジェニック鳥（特に家禽、好ましくはニワトリ）の卵で、またはトランスジェニック植物で発現させることもできる。
ポリペプチドの組換え生産は当分野では知られている。一般に、これには、適当な発現ベクターによる宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの生産を可能にする条件での宿主細胞の培養、および宿主細胞からのポリペプチドの精製が含まれる（Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｆａｒｂｅｒ，Ｓｍａｒｔ，１９８６，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｔｏ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｂｙ ａ ｒａｐｉｄ ｆｉｖｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｂｌｏｏｄ，６７（１），７１−９、Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７、ＥＰ ６４０ ６１９ Ｂ１およびＥＰ ６６８ ３５１ Ｂ１）。
ＥＰＯは、Ｎ−および／またはＯ−結合グリコシル化によってＥＰＯに取り付けられた１個以上の糖質側鎖を含み得る。すなわちＥＰＯはグリコシル化される。ＥＰＯが真核細胞中で産生される場合、通常、そのポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。したがって哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞（これらはトランスジェニック動物（上記参照）の細胞（当該動物から抽出されたものまたはまだ当該動物中にあるもの）であってもよい）での生産中に、ＥＰＯには糖質側鎖が取り付けられているだろう。
これらの糖質側鎖は、適当な細胞中で発現させた後に、例えば１個以上の糖質部分を除去または付加することなどによって、化学的または酵素的に修飾されていてもよい（例えばＤｉｔｔｍａｒ，Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｈａｕｓｅｒ，Ｈｏｆｅｒ，Ｌｉｎ−ｄｅｎｍａｉｅｒ，１９８９，「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ」Ｂｌｏｅｃｋｅｒ，Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｃｈｏｍｂｕｒｇ編，ＧＢＦ−Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，１２，２３１−２４６，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ワインハイム・ニューヨーク・ケンブリッジを参照されたい）。
１個以上のＨＡＳ分子を含み、そのＨＡＳが糖質部分（ｉ）を介して、またはチオエーテル（ｉｉ）を介して、ＥＰＯにコンジュゲートされているＨＡＳ−ＥＰＯを提供することが、本発明の方法の目的である。したがって、ステップａ）で用意されるＥＰＯは、糖質部分および／またはチオエーテルを介したコンジュゲーションが可能であるような性質を有するべきである。したがって、ステップａ）後のＥＰＯは、好ましくは、
（１）スルフィド基または糖質部分に直接またはリンカー分子を介して連結している少なくとも１個の反応性基であって、ＨＥＳまたは修飾ＨＥＳと反応する能力を有するもの、
（２）修飾ＨＡＳをコンジュゲートさせることができる少なくとも１個の糖質部分、
および／または
（３）少なくとも１個の遊離ＳＨ基、
を持ち得る。
上記の選択肢（１）に関して、ステップａ）のＥＰＯは、好ましくは、ＥＰＯのＳＨ基または糖質部分に適当なリンカー分子をコンジュゲートすることによって得ることができる。そのような修飾ＥＰＯの一例を実施例４の２．１に示す。リンカー分子の付加がＥＰＯを傷つけないことを保証することが重要である。しかしこれは当業者には知られている。
上記の選択肢（２）に関して、好ましい一実施形態では、修飾ＨＡＳが糖質部分を介してＥＰＯにコンジュゲートされる。
糖質部分はＥＰＯポリペプチド主鎖に直接連結することができる。好ましくは、糖質部分は糖質側鎖の一部である。この場合は、ＨＡＳを連結させる糖質部分とＥＰＯポリペプチド主鎖との間に、さらなる糖質部分が存在してもよい。より好ましくは、上記糖質部分は糖質側鎖の末端部分である。
したがって、好ましい一実施形態では、修飾ＨＡＳが、ＥＰＯのＮ−および／またはＯ−グリコシル化部位に連結した糖質鎖に（リンカーを介して、またはリンカーを介さずに（下記参照））取り付けられる。
しかし、ＥＰＯが他の糖質部分を持ち、そこに修飾ＨＡＳをコンジュゲートすることも、本発明の範囲に包含される。ポリペプチドに酵素的に糖質部分を取り付ける技術、または遺伝子操作とそれに続く適当な細胞での発現とによってポリペプチドに糖質部分を取り付ける技術は、当分野では知られている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｇｒｅｂｅｒ，Ｍｏｓｂａｃｈ，１９８６，Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｅｎｄｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｈ−ｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０３（１），６４−８、Ｄｉｔｔｍａｒ，Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｈａｕｓｅｒ，Ｈｏｆｅｒ，Ｌｉｎｄｅｎｍａｉｅｒ，１９８９，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ，Ｂｌｏｅｃｋｅｒ，Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｃｈｏｍｂｕｒｇ編，ＧＢＦ−Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，１２，２３１−２４６，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ワインハイム・ニューヨーク・ケンブリッジ）。
本発明の方法の好ましい一実施形態では、修飾ＨＡＳと反応することができるように、糖質部分を酸化する。この酸化は化学的または酵素的に行うことができる。
ポリペプチドの糖質部分を化学的に酸化する方法は当分野では知られており、過ヨウ素酸塩で処理する方法などがある（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６−１５９２２）。
化学的酸化では、ほとんどの場合、あらゆる糖質部分を（それが末端にあっても末端になくても）酸化することが可能である。しかし、穏和な条件（１０ｍＭ過ヨウ素酸塩、室温で１時間という苛酷な条件ではなく、１ｍＭ 過ヨウ素酸、０℃）を選択することにより、糖質側鎖の末端糖質部分（例えばシアル酸またはガラクトース）を優先的に酸化することが可能である。
もう一つの選択肢として、糖質部分を酵素的に酸化することもできる。個々の糖質部分を酸化するための酵素は当分野では知られており、例えばガラクトースの場合なら、その酵素はガラクトースオキシダーゼである。
末端ガラクトース部分を酸化したい場合、そのＥＰＯが糖質鎖にシアル酸を取り付ける能力を有する細胞中で（例えば哺乳類細胞中で）産生されるか、糖質鎖にシアル酸を取り付ける能力を有するように遺伝子改変されている細胞中で産生されたものであるならば、最終的には末端シアル酸を（部分的にまたは完全に）除去する必要があるだろう。シアル酸の化学的または酵素的除去方法は当分野では知られている（ＣｈａｐｌｉｎおよびＫｅｎｎｅｄｙ編，１９９６，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈシリーズ（ＩＳＢＮ ０−９４７９４６−４４−３）、特に第５章、Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌｌ著「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」１７５−１７７頁）。
しかし、修飾ＨＡＳを取り付けることになる糖質部分を、ステップａ）内で、ＥＰＯに取り付けることも、本発明の範囲に含まれる。ガラクトースを取り付けることを望む場合は、ガラクトシルトランスフェラーゼを利用してこれを達成することができる。その方法は当分野では知られている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｇｒｅｂｅｒ，Ｍｏｓｂａｃｈ，１９８６，Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｅｎｄｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｈ−ｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０３（１），６４−８）。
最も好ましい一実施形態では、ステップａ）において、好ましくは必要に応じて末端シアル酸を部分的にまたは完全に（酵素的および／または化学的に）除去した後で、ＥＰＯの１個以上の糖質側鎖の少なくとも１個の末端糖単位（好ましくはガラクトース）を酸化することによって、ＥＰＯを修飾する。
したがって、好ましくは、糖質鎖の酸化型末端糖単位（好ましくはガラクトース）に、修飾ＨＡＳをコンジュゲートする。
また、末端シアル酸（好ましくは本発明の方法のステップａ）で酸化されるもの）に修飾ＨＡＳをコンジュゲートすることも好ましいだろう。
もう一つの好ましい実施形態（上記の項目（３）を参照）では、ＥＰＯが少なくとも１個の遊離ＳＨ基を有する。
好ましい一実施形態として、このＳＨ基は、例えばヒドロキシルアミン誘導体（例：２−（アミノオキシ）エチルメルカプタン塩酸塩）を使ったり（Ｂａｕｅｒ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３０，９４９）、ヒドラジド誘導体（例：チオグリコール酸ヒドラジド）を使ったりして（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４２，３３２）、好ましくは酸化型糖質部分に連結することができる。これらの分子をＥＰＯの酸化型糖質部分にコンジュゲートする方法としては、プロトコール例８および９に記載の方法に類似する方法が挙げられる。
もう一つの好ましい実施形態では、遊離ＳＨ基が、元から存在するシステインまたは付加されたシステインの一部である。
哺乳類ＥＰＯはいくつかのシステインを持ち、それらは通常、ジスルフィド結合を形成する。しかし、それらのシステインの少なくとも１つを別のアミノ酸で（例えば組換え手段によって）置換することにより、元から存在するシステインの少なくとも１つが遊離のＳＨ基を含むＥＰＯを得ることができる。アミノ酸を置換する方法は当分野では知られている（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ，Ｃｈａｎｇ，Ｂａｒｚｉｌａｙ，Ｄｅｌｏｒｍｅ，１９９７，Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｂｌｏｏｄ，８９（２），４９３−５０２、Ｂｏｉｓｓｅｌ，Ｌｅｅ，Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，Ｃｏｈｅｎ，Ｂｕｎｎ，１９９３，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｔｅｓｔ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６８（２１），１５９８３−９３））。
好ましくは、ＥＰＯはヒトＥＰＯのアミノ酸配列を持ち、元から存在するシステインはシステイン２９および／または３３である。
したがって、好ましい一実施形態では、システイン３３を別のアミノ酸で置換し、ステップｃ）では、修飾ＨＡＳをシステイン２９にコンジュゲートする。
もう一つの好ましい実施形態では、システイン２９を別のアミノ酸で置換し、ステップｃ）では、修飾ＨＡＳをシステイン３３にコンジュゲートする。
本発明に関して、「付加されたシステイン」という用語は、そのポリペプチド（好ましくはＥＰＯ）が、野生型ポリペプチドには存在しないシステイン残基を有することを意味する。これは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステイン残基を（例えば組換え手段によって）付加するか、または元から存在するアミノ酸を（例えば組換え手段により）システインで置換することによって達成することができる。それぞれの方法は当業者には知られている（上記参照）。
好ましくは、付加されたシステインは、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものである。
好ましい一実施形態では、ＥＰＯはヒトＥＰＯであり、置換されるアミノ酸残基はセリン１２６である。
好ましくは、ステップｃ）において、修飾ＨＡＳを、付加されたシステインにコンジュゲートする。
本発明の方法のステップｂ）では、ステップａ）のＥＰＯと反応する能力を有する修飾ＨＡＳを提供する。
これに関して、ＨＡＳは、好ましくはその還元末端を修飾することができる。これには、化学反応を容易に制御することができ、ＨＡＳのどの基が反応中に修飾されるかを当業者が確信できるという利点がある。ＨＡＳに導入される基は１つだけなので、多官能性ＨＡＳ分子による異なるＥＰＯ分子間の架橋および他の副反応を防止することができる。
したがって、修飾ＨＡＳは、
（１）ＥＰＯのスルフィド基または糖質部分に直接またはリンカー分子を介して連結している少なくとも１個の基、
（２）好ましくは酸化されている少なくとも１個の糖質部分、および／または
（３）少なくとも１個の遊離ＳＨ基、
と反応する能力を持ち得る。
上記の項目（１）に関して、ＨＡＳの修飾は、ＥＰＯに連結している基に依存することになる。基礎をなす機序は当分野では知られている。実施例４の２．１に一例を示す。
上記の項目（２）および（３）に関して、ＨＡＳを修飾する方法は当分野ではいくつか知られている。これらの方法の基礎をなす基本的原理は、糖質部分またはＳＨ基と反応する能力を有するようにＨＡＳの反応性基を修飾するか、糖質部分またはＳＨ基と反応する能力を有する反応性基を含んでいるリンカー分子をＨＡＳにコンジュゲートすることである。
項目（２）の場合、修飾ＨＡＳは、酸化型糖質部分、好ましくは末端糖残基、より好ましくはガラクトース、または末端シアル酸と反応する能力を持ち得る。
酸化型（好ましくは末端）糖残基と反応する能力を有するようにＨＡＳを修飾する方法はいくつか知られている。上述のように、この修飾は、ＨＥＳ鎖の還元末端に位置選択的に導入することができる。この場合は、第１ステップとして、アルデヒド基をラクトンに酸化する。修飾には、例えばヒドラジド、アミノ（ヒドロキシアミノでもよい）、セミカルバジドまたはチオール官能基のＨＡＳへの直接的な付加またはリンカーを介した付加などがあるが、これらに限るわけではない。これらの技術については実施例２〜４で詳述する。また、その機序自体は当分野では知られている（例えばＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１、Ｈｐｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，９１，３９、Ｆｉｓｓｅｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２，４７、Ｆｒｉｅ，１９９８，卒業論文，ハンブルク専門大学（Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｍｂｕｒｇ），ドイツを参照されたい）。
本発明では、ヒドラジドまたはヒドロキシアミノ官能基の付加が好ましい。この場合、本発明の方法のステップｃ）の反応を好ましくはｐＨ５．５で行うことにより、リジン側鎖と酸化型糖残基とのイミン形成による分子間または分子内ＥＰＯ架橋が起こらずに、修飾ＨＡＳがＥＰＯの酸化型糖質部分と選択的に反応することが保証される。
項目（３）の場合も、遊離ＳＨ基と反応する能力を有するようにＨＡＳを修飾方法はいくつか知られている。好ましくは、この修飾はＨＥＳ鎖の還元末端に位置選択的に導入される。その方法には、例えばマレイミド、ジスルフィドまたはハロゲン化アセトアミド官能基のＨＡＳへの付加などがあるが、これらに限るわけではない。これらの技術については実施例２〜４で詳述する。
これらの技術に関するさらなる詳細は、Ｃｈａｍｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４０，６３；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，６６００ならびに実施例２の１．３に挙げる文献から得ることができる。
他の考え得る官能基を表１に列挙する。この表は、考え得るリンカー分子の体系的な全体像を示している。また、その機序自体は当分野では知られている。
本発明に役立ついくつかのリンカー分子は当分野では知られているか、市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ製、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（ドイツ・ボン）から入手可能）。表２にその例を示す。
本発明の方法のステップｃ）では、ステップａ）のＥＰＯをステップｂ）のＨＡＳと反応させることにより、１個以上のＨＡＳ分子を含み、そのＨＡＳが糖質部分またはチオエーテルを介してＥＰＯにコンジュゲートされているＨＡＳ−ＥＰＯを製造する。
基本的に、ＥＰＯを修飾ＨＡＳと反応させる方法の詳細は、ＥＰＯおよび／またはＨＡＳの個々の修飾に依存し、当分野では知られている（例えばＲｏｓｅ，１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，３０、Ｏ’ＳｈａｎｎｅｓｓａｙおよびＷｉｃｈｅｋ，１９９０，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９１，１、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ．，１４０，６３；Ｃｈａｍｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１５９１６を参照されたい）。
本発明で例示する方法については実施例２〜４、特に実施例４に詳述する。
ステップｃ）は少なくとも１０重量％のＨ2Ｏを含む反応媒体で行うことができる。
本発明の方法のこの好ましい実施形態における反応媒体は、少なくとも１０重量％（好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％または最高１００％まで）の水を含む。有機溶媒の割合はそれぞれに計算される。したがって反応は水相で起こる。好ましい反応媒体は水である。
本発明の方法のこの実施形態の利点の一つは、毒物学的に危険な溶媒を使用する必要がなく、したがって、溶媒による汚染を避けるためにそれらの溶媒を製造工程後に除去する必要がないということである。また、毒物学的に危険な溶媒の残留に関して、余分な品質管理を行う必要もない。毒物学的に危険でないエタノールやプロピレングリコールのような溶媒を有機溶媒として使用することが好ましい。
本発明の方法のもう一つの利点は、有機溶媒によって誘発される不可逆的または可逆的な構造変化が避けられるということである。したがって、本発明の方法によって得られるポリペプチドは、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中で製造されたものとは異なる。
また、驚いたことに、ＨＡＳを水溶液中で薬物にコンジュゲートすることにより、副反応が最小限に抑えられるか、または副反応が回避されることも観察された。その結果、本発明の方法のこの実施形態は、高い純度を有する改良された生成物をもたらす。
本発明に関して、「ヒドロキシアルキルデンプン」という用語は、ヒドロキシアルキル基で置換されているデンプン誘導体を示すために用いられる。この場合、アルキル基は置換されていてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキルは、２〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子を含有する。したがって「ヒドロキシアルキルデンプン」には、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンが含まれ、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは好ましい。
ＨＡＳのヒドロキシアルキル基は少なくとも１個のＯＨ基を含有する。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明のどの実施形態にとっても、最も好ましい。
「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現には、アルキル基が一置換または多置換されている誘導体も含まれる。この場合、アルキル基は、ＨＡＳが水溶性のままであるという条件の下で、ハロゲン（特にフッ素）またはアリール基で置換されていることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキルの末端ヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化することができる。また、ヒドロキシアルキルデンプンのアルキル基は線状でも分岐状でもよい。
さらに、アルキルの代わりに、線状または分岐状の置換または無置換アルキレン基も使用することができる。
本発明に関して、ヒドロキシエチルデンプンは１〜３００ｋＤａの平均分子量（重量平均）を有することができ、５〜１００ｋＤａの平均分子量はより好ましい。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、ヒドロキシエチル基に関して、０．１〜０．８のモル置換度および２〜２０の範囲のＣ2：Ｃ6置換比を示し得る。
本発明の方法によって製造されるＨＡＳ−ＥＰＯは、以下のように精製し、特徴付けることができる。
ＨＡＳ−ＥＰＯの単離は、天然および組換えＥＰＯの既知の精製手法（例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、実施例２０．８に記載の手法、またはそれらの組合せなど）を使って行うことができる。
ＥＰＯポリペプチドへのＨＡＳの共有結合は、修飾タンパク質の加水分解後に糖組成分析を行うことによって確認することができる（ＥＰＯのＮ−グリコシル化部位上に存在するヒドロキシエチルグルコースとマンノースの比）。
ＥＰＯのＮ−結合型オリゴ糖のＨＡＳ修飾は、ＨＡＳ修飾Ｎ−グリカンを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＋／−ウェスタンブロッティング分析で予想通り高移動度側にシフトすることを観察することによって、実証することができる。
システイン残基におけるＥＰＯのＨＡＳ修飾は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳで、ＨＡＳ修飾生成物のタンパク質分解断片中に、対応するタンパク質分解Ｃｙｓ−ペプチドを検出することができないということによって、実証することができる（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９（１３），２３４８−５５）。Ｃｙｓ修飾ＥＰＯのタンパク質分解消化後にＨＡＳ含有画分を単離すれば、従来のアミノ酸組成分析によってこの画分中に対応ペプチドを確認することが可能になる。
本発明のＨＡＳ−ＥＰＯとの関連で上に開示したＥＰＯまたはＨＡＳの性質に関する実施形態は、全て、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ製造方法にも当てはまる。
さらに本発明は、本発明の方法によって得ることができるＨＡＳ−ＥＰＯに関する。好ましくは、このＨＡＳ−ＥＰＯは、本発明の上記ＨＡＳ−ＥＰＯについて説明した特徴を有する。
さらに本発明は、ヒトまたは動物の身体を処置する方法で使用するための、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯにも関係する。
さらに本発明は、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯを含む医薬組成物にも関係する。好ましい一実施形態では、本医薬組成物はさらに、エリスロポエチン療法に役立つ医薬的に許容できる希釈剤、佐剤および／または担体を少なくとも１つは含む。
本医薬組成物は好ましくは貧血障害もしくは造血機能不全障害またはそれらに関係する疾患の処置に使用される。
本明細書にいう「治療有効量」は、ある状態および投与方法に関して、治療効果をもたらす量を指す。エリスロポエチンアイソフォームの投与は好ましくは非経口経路で行われる。選択される具体的経路は、処置される状態に依存するだろう。エリスロポエチンアイソフォームの投与は、好ましくは、適当な担体（例えばヒト血清アルブミン）、適当な希釈剤（例えば緩衝食塩溶液）および／または適当な佐剤を含有する製剤の一部として行われる。必要な投与量は患者のヘマトクリットを上昇させるのに十分な量であり、処置される状態の重症度、使用する投与方法などに依存して変動するだろう。
本発明の医薬組成物による処置の目的は、好ましくは、６．８ｍｍｏｌ／ｌを超える血中ヘモグロビン値の増加である。これを達成するには、ヘモグロビン値の増加量が毎週０．６ｍｍｏｌ／ｌ〜１．６ｍｍｏｌ／ｌになるように、本医薬組成物を投与することができる。ヘモグロビン値が８．７ｍｍｏｌ／ｌを超えたら、ヘモグロビン値が８．１ｍｍｏｌ／ｌ未満になるまで、好ましくは治療を中断するべきである。
本発明の組成物は、好ましくは、皮下注射、静脈内注射または非経口注射に適した製剤に使用される。この場合、好適な賦形剤および担体は、例えばリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ＨＳＡおよび注射用水などである。本組成物は週３回、好ましくは週２回、より好ましくは週１回、最も好ましくは２週間に１回、投与することができる。
好ましくは、本医薬組成物は、０．０１〜１０μｇ／ｋｇ患者体重、より好ましくは０．１〜５μｇ／ｋｇ、０．１〜１μｇ／ｋｇ、または０．２〜０．９μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．３〜０．７μｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは０．４〜０．６μｇ／ｋｇ体重の量で投与される。
一般に、１回の投与につき、好ましくは１０μｇ〜２００μｇ、好ましくは１５μｇ〜１００μｇを投与する。
さらに本発明は、貧血障害もしくは造血機能不全障害またはそれらに関係する疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯの使用にも関係する。
本発明のもう一つの態様によれば、上記の課題は、１個以上のＨＡＳ分子を含み、各ＨＡＳが
ａ）糖質部分、または
ｂ）チオエーテル、
を介してポリペプチドにコンジュゲートされている、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−ポリペプチドコンジュゲート（ＨＡＳ−ポリペプチド）によって解決される。
本発明のＨＡＳ−ポリペプチドには、コンジュゲーション前のポリペプチドと比較して、改善された生物学的安定性を示すという利点がある。これは主として、ＨＡＳ−ポリペプチドが、肝臓および腎臓の除去系によって認識されにくいか、または全く認識されず、したがってより長い期間、循環系内に残るという事実による。さらにまた、ＨＡＳは部位特異的に取り付けられるので、ＨＡＳをポリペプチドにコンジュゲートすることによってポリペプチドのインビボ生物活性が破壊されてしまう危険は、最小限に抑えられる。
本発明のＨＡＳ−ポリペプチドは、主として２つの成分、すなわちポリペプチドと、それに連結したヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）とを持っている。
ポリペプチドはヒト由来または動物由来であることができる。好ましい実施形態ではポリペプチドはヒトに由来する。
ポリペプチドとしては、例えばサイトカイン、特にエリスロポエチン、アンチトロンビン（ＡＴ）、例えばＡＴ ＩＩＩ、インターロイキン、特にインターロイキン−２、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、インターロイキン−６、および治療用抗体などが挙げられる。
好ましい一実施形態によれば、ポリペプチドはアンチトロンビン（ＡＴ）、好ましくはＡＴ ＩＩＩ（Ｌｅｖｙ ＪＨ，Ｗｅｉｓｉｎｇｅｒ Ａ，Ｚｉｏｍｅｋ ＣＡ，Ｅｃｈｅｌａｒｄ Ｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２７，４（２００１）４０５−４１６、Ｅｄｍｕｎｄｓ Ｔ，Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ ＳＭ，Ｐｏｌｌｏｃｋ Ｊ，Ｈａｎｓｏｎ Ｅ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ Ｒ，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｅ，Ｍａｎａｖａｌａｎ Ｐ，Ｚｉｏｍｅｋ Ｃ，Ｍｅａｄｅ Ｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｊ，Ｃｏｌｅ ＥＳ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｂｌｏｏｄ ９１，１２（１９９８）４６６１−４６７１、Ｍｉｎｎｅｍａ ＭＣ，Ｃｈａｎｇ ＡＣＫ，Ｊａｎｓｅｎ ＰＭ，Ｌｕｂｂｅｒｓ ＹＴＰ，Ｐｒａｔｔ ＢＭ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＢＧ，Ｔａｙｌｏｒ ＦＢ，Ｈａｃｋ ＣＥ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｂ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｂｌｏｏｄ ９５，４（２０００）１１１７−１１２３；Ｖａｎ Ｐａｔｔｅｎ ＳＭ，Ｈａｎｓｏｎ ＥＨ，Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ Ｒ，Ｚｈａｎｇ Ｋ，Ｍａｎａｖａｌｎ Ｐ，Ｃｏｌｅ ＥＳ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＪＭ，Ｅｄｍｕｎｄｓ Ｔ，Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４，１５（１９９９）１０２６８−１０２７６）。
もう一つの好ましい実施形態では、ポリペプチドがヒトＩＦＮ−β、特にＩＦＮ−β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、ＲＥＢＩＦ（登録商標）参照）およびＩＦＮ−β１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標））である。
もう一つの好ましいポリペプチドはヒトＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）である。例えばＮａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｗｏ ｍＲＮＡｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．５：５７５−５８１，１９８６、Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２（１９８６）６１−６５、ならびにＲｏｄｎｅｙ ＰｅａｒｌｍａｎおよびＹ．Ｊｏｈｎ Ｗａｎｇ編，Ｆｏｒｍｕｌａｌｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｒｕｇｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９６）の３０３−３２８頁，Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｕｐｏｇｅｎ(R)（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ），ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，などを参照されたい。
エリスロポエチンについては、上に開示した全ての実施形態が、ここにも当てはまる。
好ましくはポリペプチドは組換え生産される。これには、真核細胞または原核細胞、好ましくは哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、または当該ポリペプチドの組換え生産にとって好都合な他の任意の細胞タイプでの生産が含まれる。さらに、ポリペプチドは、トランスジェニック動物で（例えば乳汁、血液などの体液中に）、トランスジェニック鳥（特に家禽、好ましくはニワトリ）の卵で、またはトランスジェニック植物で発現させることもできる。
ポリペプチドの組換え生産は当分野では知られている。一般に、これには、適当な発現ベクターによる宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの生産を可能にする条件での宿主細胞の培養、および宿主細胞からのポリペプチドの精製が含まれる。詳細な情報は、例えばＫｒｙｓｔａｌ，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｆａｒｂｅｒ，Ｓｍａｒｔ，１９８６，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｔｏ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｂｙ ａ ｒａｐｉｄ ｆｉｖｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｂｌｏｏｄ，６７（１），７１−９、Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７、ＥＰ ６４０ ６１９ Ｂ１およびＥＰ ６６８ ３５１ Ｂ１などを参照されたい。
ポリペプチドは、Ｎ−および／またはＯ−結合グリコシル化によってポリペプチドに取り付けられた１個以上の糖質側鎖を含み得る。すなわちポリペプチドはグリコシル化される。あるポリペプチドが真核細胞中で産生される場合、通常、そのポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。したがって哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞での生合成中に、ポリペプチドには糖質側鎖が取り付けられているだろう。
ＨＡＳはポリペプチドに直接コンジュゲートするか、またはリンカー分子を介してコンジュゲートすることができる。リンカー分子の性質は、ＨＡＳをポリペプチドに連結する方法に依存する。いくつかのリンカーは市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ製品、上記参照）。リンカーの性質とその目的は、後にＨＥＳ−ポリペプチドの製造方法に関する項で詳述する。
本発明のＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲートの好ましい一実施形態では、糖質部分を介してポリペプチドにＨＡＳをコンジュゲートする。好ましくは、ポリペプチドがアンチトロンビン、好ましくはＡＴ ＩＩＩである場合に、これを適用する。
本発明に関して「糖質部分」という用語は、ヒドロキシアルデヒドまたはヒドロキシケトンならびにその化学修飾物を指す（「Ｒｏｅｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ」１９９０，Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ（ドイツ・シュトゥットガルト），第９版，第９巻，２２８１−２２８５頁およびそこに挙げられている文献を参照されたい）。さらに、この用語は、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸などの天然糖質部分の誘導体も表す。また、この用語は、環構造が開かれている化学的に酸化された天然糖質部分も包含する。
上記糖質部分はポリペプチド主鎖に直接連結することができる。好ましくは、上記糖質部分は糖質側鎖の一部である。この場合は、ＨＡＳを連結させる糖質部分とポリペプチド主鎖との間に、さらなる糖質部分が存在してもよい。より好ましくは、上記糖質部分は糖質側鎖の末端部分である。
より好ましい一実施形態では、糖質側鎖のガラクトース残基に、好ましくは糖質側鎖の末端ガラクトース残基に、ＨＡＳをコンジュゲートする。このガラクトース残基は、末端シアル酸を除去した後、酸化を行うことによって、コンジュゲーションに利用できるようにすることができる（下記参照）。
もう一つのより好ましい実施形態では、糖質側鎖のシアル酸残基に、好ましくは糖質側鎖の末端シアル酸残基に、ＨＡＳをコンジュゲートする。
さらに、ＨＡＳは、チオエーテルを介してポリペプチドにコンジュゲートすることもできる。以下に詳述するように、このＳ原子は、ポリペプチドに結合している任意のＳＨ基（元から存在するＳＨ基でも元々は存在しないＳＨ基でもよい）に由来することができる。
好ましい一実施形態として、上記Ｓ原子は、ＨＥＳの酸化型糖質部分、好ましくはポリペプチドの糖質側鎖の一部である酸化型糖質部分に導入されているＳＨ基に由来し得る（下記参照）。
好ましくは、上記チオエーテル中のＳ原子は、元から存在するシステインまたは付加されたシステインに由来する。
本発明に関して、「付加されたシステイン」という用語は、そのポリペプチドが、野生型ポリペプチドには存在しないシステイン残基を有することを意味する。
本発明のこの態様に関して、上記システインは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加された追加アミノ酸であることができる。
さらにまた、付加されたシステインは、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものであってもよい。
ＨＡＳ−ポリペプチドの第２成分はＨＡＳである。
本発明において「ヒドロキシアルキルデンプン」という用語は、ヒドロキシアルキル基で置換されているデンプン誘導体を示すために用いられる。この場合、アルキル基は置換されていてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキルは、２〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子を含有する。したがって「ヒドロキシアルキルデンプン」には、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンが含まれ、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは好ましい。
ＨＡＳのヒドロキシアルキル基は少なくとも１個のＯＨ基を含有する。
「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現には、アルキル基が一置換または多置換されている誘導体も含まれる。この場合、アルキル基は、ＨＡＳが水溶性のままであるという条件の下で、ハロゲン（特にフッ素）またはアリール基で置換されていることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキルの末端ヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化することができる。また、ヒドロキシアルキルデンプンのアルキル基は線状でも分岐状でもよい。
さらに、アルキルの代わりに、線状または分岐状の置換または無置換アルケン基も使用することができる。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明のどの実施形態にとっても、最も好ましい。
本発明に関して、ヒドロキシエチルデンプンは１〜３００ｋＤａの平均分子量（重量平均）を有することができ、５〜１００ｋＤａの平均分子量はより好ましい。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、ヒドロキシエチル基に関して、０．１〜０．８のモル置換度および２〜２０の範囲のＣ2：Ｃ6置換比を示し得る。
本ＨＡＳ−ポリペプチドは、ポリペプチド１分子あたり１〜１２個、好ましくは１〜９個、１〜６個または１〜３個、最も好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含み得る。ポリペプチド１分子あたりのＨＡＳ分子数は、生成物の加水分解と得られた単糖類の誘導体化後にＧＣ−ＭＳを使って定量的糖組成分析を行うことにより、決定することができる（ＣｈａｐｌｉｎおよびＫｅｎｎｅｄｙ編，１９８６「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈシリーズ（ＩＳＢＮ ０−９４７９４６−４４−３）、特に第１章「Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」１−３６頁、第２章「Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」３７−５３頁、第３章「Ｎｅｕｔｒａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」５５−９６頁を参照されたい）。
本発明のＨＡＳ−ポリペプチド製造方法との関連で以下に開示するポリペプチドまたはＨＡＳの性質に関する実施形態は、全て、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドにも当てはまる。また、ＨＡＳ−ＥＰＯまたはその製造方法との関連で上に開示したペプチド全般またはＨＡＳに関係する実施形態は、全て、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドにも当てはまる。
ヒドロキシアルキルデンプンはデンプンのエーテル誘導体である。本発明では、このエーテル誘導体だけでなく、他のデンプン誘導体も使用することができる。例えば、エステル化されたヒドロキシ基を有する誘導体は有用である。これらの誘導体は、例えば、２〜１２個の炭素原子を有する無置換モノカルボン酸または無置換ジカルボン酸の誘導体、またはその置換誘導体であることができる。とりわけ有用なものは２〜６個の炭素原子を有する無置換モノカルボン酸（特に酢酸）の誘導体である。これに関連して、アセチルデンプン、ブチルデンプンまたはプロピルデンプンも好ましい。
また、２〜６個の炭素原子を有する無置換ジカルボン酸の誘導体も好ましい。
ジカルボン酸の誘導体の場合は、ジカルボン酸の第２カルボキシ基もエステル化されていると有用である。また、本発明においては、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体も好適である。
置換モノカルボン酸または置換ジカルボン酸の場合、置換基は、好ましくは、置換アルキル残基に関して上に挙げたものと同じであることができる。
デンプンをエステル化するための技術は当分野では知られている（例えばＫｌｅｍｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２巻，１９９８，Ｗｈｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ワインハイム・ニューヨーク、特に４．４章「Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ」（ＩＳＢＮ ３−５２７−２９４８９−９）を参照されたい）。
もう一つの態様として、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−ポリペプチドコンジュゲート（ＨＡＳ−ポリペプチド）を製造する方法であって、
ａ）修飾ＨＡＳと反応する能力を有するポリペプチドを提供するステップ、
ｂ）ステップａ）のポリペプチドと反応する能力を有する修飾ＨＡＳを提供するステップ、および
ｃ）ステップａ）のポリペプチドをステップｂ）のＨＡＳと反応させることにより、１個以上のＨＡＳ分子を含み、そのＨＡＳがポリペプチドに、
ｉ）糖質部分、または
ｉｉ）チオエーテル
を介してコンジュゲートされているＨＡＳ−ポリペプチドを製造するステップ、
を含む方法に関する。
本発明の方法には、高い生物活性を示すＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲートが製造されるという利点がある。また、本発明の方法には、最終的な収量を低下させる大がかりで時間のかかる精製ステップは含まれていないので、有効なポリペプチド誘導体を低コストで製造することができるという利点もある。
したがって、本発明の方法の第１ステップでは、修飾ＨＡＳと反応する能力を有するポリペプチドを提供する。
本発明で使用する「提供する」という用語は、各ステップ後に所望の性質を有する分子（ステップａ）ではポリペプチド、ステップｂ）ではＨＡＳ）が利用できるようになるというふうに解釈する必要がある。
ステップａ）の場合、これには、天然供給源からのポリペプチドの精製および宿主細胞または宿主生物での組換え生産と、必要ならばそのようにして得たポリペプチドの修飾が含まれる。
本発明の出発物質であるポリペプチドについては、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲートの一部であるエリスロポエチンの場合と同じことが言える。これに関連して、上に開示した好ましい実施形態は、本発明の方法にも当てはまる。
ポリペプチドは好ましくは組換え生産される。これには、真核細胞または原核細胞、好ましくは哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、または当該ポリペプチドの組換え生産にとって好都合な他の任意の細胞タイプでの生産が含まれる。さらに、ポリペプチドは、トランスジェニック動物で（例えば乳汁、血液などの体液中に）、トランスジェニック鳥（特に家禽、好ましくはニワトリ）の卵で、またはトランスジェニック植物で発現させることもできる。
ポリペプチドの組換え生産は当分野では知られている。一般に、これには、適当な発現ベクターによる宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの生産を可能にする条件での宿主細胞の培養、および宿主細胞からのポリペプチドの精製が含まれる（Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｆａｒｂｅｒ，Ｓｍａｒｔ，１９８６，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｔｏ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｂｙ ａ ｒａｐｉｄ ｆｉｖｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｂｌｏｏｄ，６７（１），７１−９、Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７、ＥＰ ６４０ ６１９ Ｂ１およびＥＰ ６６８ ３５１ Ｂ１）。
ポリペプチドは、Ｎ−および／またはＯ−結合グリコシル化によってポリペプチドに取り付けられた１個以上の糖質側鎖を含み得る。すなわちポリペプチドはグリコシル化される。ポリペプチドが真核細胞中で産生される場合、通常、そのポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。したがって哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞（これらの細胞はトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物（上記参照）の細胞であってもよい）での生産中に、ポリペプチドには糖質側鎖が取り付けられているだろう。
これらの糖質側鎖は、適当な細胞中で発現させた後に、例えば１個以上の糖質部分を除去または付加することなどによって、化学的または酵素的に修飾されていてもよい（例えばＤｉｔｔｍａｒ，Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｈａｕｓｅｒ，Ｈｏｆｅｒ，Ｌｉｎ−ｄｅｎｍａｉｅｒ，１９８９，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ，Ｂｌｏｅｃｋｅｒ，Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｃｈｏｍｂｕｒｇ編，ＧＢＦ−Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，１２，２３１−２４６，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ワインハイム・ニューヨーク・ケンブリッジを参照されたい）。
１個以上のＨＡＳ分子を含み、そのＨＡＳが糖質部分（ｉ）を介して、またはチオエーテル（ｉｉ）を介して、ポリペプチドにコンジュゲートされているＨＡＳ−ポリペプチドを提供することが、本発明の方法の目的である。したがって、ステップａ）で用意されるポリペプチドは、糖質部分および／またはチオエーテルを介したコンジュゲーションが可能であるような性質を有するべきである。したがって、ステップａ）後のポリペプチドは、好ましくは、
（１）スルフィド基または糖質部分に直接またはリンカー分子を介して連結している少なくとも１個の反応性基であって、ＨＥＳまたは修飾ＨＥＳと反応する能力を有するもの、
（２）修飾ＨＡＳをコンジュゲートすることができる少なくとも１個の糖質部分、
および／または
（３）少なくとも１個の遊離ＳＨ基、
を持ち得る。
上記の選択肢（１）に関して、ステップａ）のポリペプチドは、好ましくは、ポリペプチドのＳＨ基または糖質部分に適当なリンカー分子をコンジュゲートすることによって得ることができる。そのような修飾ポリペプチドの一例を実施例４の２．１に示す。リンカー分子の付加がポリペプチドを傷つけないことを保証することが重要である。しかしこれは当業者には知られている。
上記の選択肢（２）に関して、好ましい一実施形態では、修飾ＨＡＳが糖質部分を介してポリペプチドにコンジュゲートされる。
糖質部分はポリペプチド主鎖に直接連結することができる。好ましくは、糖質部分は糖質側鎖の一部である。この場合は、ＨＡＳを連結させる糖質部分とポリペプチド主鎖との間に、さらなる糖質部分が存在してもよい。より好ましくは、上記糖質部分は糖質側鎖の末端部分である。
したがって、好ましい一実施形態では、修飾ＨＡＳが、ポリペプチドのＮ−および／またはＯ−グリコシル化部位に連結した糖質鎖に（リンカーを介して、またはリンカーを介さずに（下記参照））取り付けられる。
しかし、ポリペプチドが他の糖質部分を持ち、そこに修飾ＨＡＳをコンジュゲートすることも、本発明の範囲に包含される。ポリペプチドに酵素的に糖質部分を取り付ける技術、または遺伝子操作とそれに続く適当な細胞での発現とによってポリペプチドに糖質部分を取り付ける技術は、当分野では知られている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｇｒｅｂｅｒ，Ｍｏｓｂａｃｈ，１９８６，Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｅｎｄｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｈ−ｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０３（１），６４−８、Ｄｉｔｔｍａｒ，Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｈａｕｓｅｒ，Ｈｏｆｅｒ，Ｌｉｎｄｅｎｍａｉｅｒ，１９８９，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ，Ｂｌｏｅｃｋｅｒ，Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｃｈｏｍｂｕｒｇ編，ＧＢＦ−Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，１２，２３１−２４６，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ワインハイム・ニューヨーク・ケンブリッジ）。
本発明の方法の好ましい一実施形態では、修飾ＨＡＳと反応することができるように、糖質部分を酸化する。この酸化は化学的または酵素的に行うことができる。
ポリペプチドの糖質部分を化学的に酸化する方法は当分野では知られており、過ヨウ素酸塩で処理する方法などがある（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６−１５９２２）。
化学的酸化では、ほとんどの場合、あらゆる糖質部分を（それが末端にあっても末端になくても）酸化することが可能である。しかし、穏和な条件（１０ｍＭ過ヨウ素酸塩、室温で１時間という苛酷な条件ではなく、１ｍＭ 過ヨウ素酸、０℃）を選択することにより、糖質側鎖の末端糖質部分（例えばシアル酸またはガラクトース）を優先的に酸化することが可能である。
または、糖質部分を酵素的に酸化することもできる。個々の糖質部分を酸化するための酵素は当分野では知られており、例えばガラクトースの場合なら、その酵素はガラクトースオキシダーゼである。
末端ガラクトース部分を酸化したい場合、そのポリペプチドが糖質鎖にシアル酸を取り付ける能力を有する細胞中で（例えば哺乳類細胞中で）産生されるか、糖質鎖にシアル酸を取り付ける能力を有するように遺伝子改変されている細胞中で産生されたものであるならば、最終的には末端シアル酸を（部分的にまたは完全に）除去する必要があるだろう。シアル酸の化学的または酵素的除去方法は当分野では知られている（ＣｈａｐｌｉｎおよびＫｅｎｎｅｄｙ編，１９９６「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈシリーズ（ＩＳＢＮ ０−９４７９４６−４４−３）、特に第５章、Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌｌ著「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」１７５−１７７頁）。
しかし、修飾ＨＡＳを取り付けることになる糖質部分を、ステップａ）内で、ポリペプチドに取り付けることも、本発明の範囲に含まれる。ガラクトースを取り付けることを望む場合は、ガラクトシルトランスフェラーゼを利用してこれを達成することができる。その方法は当分野では知られている（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｇｒｅｂｅｒ，Ｍｏｓｂａｃｈ，１９８６，Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｅｎｄｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ｈ−ｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｒｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０３（１），６４−８）。
最も好ましい一実施形態では、ステップａ）において、好ましくは必要に応じて末端シアル酸を部分的にまたは完全に（酵素的および／または化学的に）除去した後で、ポリペプチドの１個以上の糖質側鎖の少なくとも１個の末端糖単位（好ましくはガラクトース）を酸化することによって、ポリペプチドを修飾する。
したがって、好ましくは、糖質鎖の酸化型末端糖単位（好ましくはガラクトース）に、修飾ＨＡＳをコンジュゲートする。
もう一つの好ましい実施形態（上記の項目（３）を参照）では、ポリペプチドが少なくとも１個の遊離ＳＨ基を有する。
好ましい一実施形態では、この遊離ＳＨ基が、元から存在するシステインまたは付加されたシステインの一部である。
アミノ酸を置換する方法は当分野では知られている（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ，Ｃｈａｎｇ，Ｂａｒｚｉｌａｙ，Ｄｅｌｏｒｍｅ，１９９７，Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｂｌｏｏｄ，８９（２），４９３−５０２、Ｂｏｉｓｓｅｌ，Ｌｅｅ，Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，Ｃｏｈｅｎ，Ｂｕｎｎ，１９９３，Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｔｅｓｔ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６８（２１），１５９８３−９３））。
本発明に関して、「付加されたシステイン」という用語は、そのポリペプチドが、野生型ポリペプチドには存在しないシステイン残基を有することを意味する。これは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステイン残基を（例えば組換え手段によって）付加するか、または元から存在するアミノ酸を（例えば組換え手段により）システインで置換することによって達成することができる。それぞれの方法は当業者には知られている（上記参照）。
好ましくは、付加されたシステインは、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものである。
好ましくは、ステップｃ）において、修飾ＨＡＳを、付加されたシステインにコンジュゲートする。
本発明の方法のステップｂ）では、ステップａ）のポリペプチドと反応する能力を有する修飾ＨＡＳを提供する。
これに関して、ＨＡＳは、好ましくはその還元末端を修飾することができる。これには、化学反応を容易に制御することができ、ＨＡＳのどの基が反応中に修飾されるかを当業者が確信できるという利点がある。ＨＡＳに導入される基は１つだけなので、多官能性ＨＡＳ分子による異なるポリペプチド分子間の架橋および他の副反応を防止することができる。
したがって、修飾ＨＡＳは、
（１）ポリペプチドのスルフィド基または糖質部分に直接またはリンカー分子を介して連結している少なくとも１個の基、
（２）好ましくは酸化されている少なくとも１個の糖質部分、および／または
（３）少なくとも１個の遊離ＳＨ基、
と反応する能力を持ち得る。
上記の項目（１）に関して、ＨＡＳの修飾は、ポリペプチドに連結している基に依存することになる。基礎をなす機序は当分野では知られている。実施例４の２．１に一例を示す。
上記の項目（２）および（３）に関して、ＨＡＳを修飾する方法は当分野ではいくつか知られている。これらの方法の基礎をなす基本的原理は、糖質部分またはＳＨ基と反応する能力を有するようにＨＡＳの反応性基を修飾するか、糖質部分またはＳＨ基と反応する能力を有する反応性基を含んでいるリンカー分子をＨＡＳにコンジュゲートすることである。
項目（２）の場合、修飾ＨＡＳは、酸化型糖質部分、好ましくは末端糖残基、より好ましくはガラクトース、または末端シアル酸と反応する能力を持ち得る。
酸化型（好ましくは末端）糖残基と反応する能力を有するようにＨＡＳを修飾する方法はいくつか知られている。上述のように、この修飾は、ＨＥＳ鎖の還元末端に位置選択的に導入することができる。この場合は、第１ステップとして、アルデヒド基をラクトンに酸化する。修飾には、例えばヒドラジド、アミノ（ヒドロキシアミノでもよい）、セミカルバジドまたはチオール官能基のＨＡＳへの直接的な付加またはリンカーを介した付加などがあるが、これらに限るわけではない。これらの技術については実施例２〜４で詳述する。また、その機序自体は当分野で知られている（例えばＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１；Ｈｐｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，９１，３９；Ｆｉｓｓｅｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２，４７、Ｆｒｉｅ，１９９８，卒業論文，ハンブルク専門大学（Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｍｂｕｒｇ），ドイツを参照されたい）。
本発明では、ヒドラジドまたはヒドロキシアミノ官能基の付加が好ましい。この場合、本発明の方法のステップｃ）の反応を好ましくはｐＨ５．５で行うことにより、リジン側鎖と酸化型糖残基とのイミン形成によるポリペプチド間架橋またはポリペプチド内架橋が起こらずに、修飾ＨＡＳがポリペプチドの酸化型糖質部分と選択的に反応することが保証される。
項目（３）の場合も、遊離ＳＨ基と反応する能力を有するようにＨＡＳを修飾方法はいくつか知られている。好ましくは、この修飾はＨＥＳ鎖の還元末端に位置選択的に導入される。その方法には、例えばマレイミド、ジスルフィドまたはハロゲン化アセトアミド官能基のＨＡＳへの付加があるが、これらに限るわけではない。これらの技術については実施例２〜４で詳述する。
これらの技術に関するさらなる詳細は、Ｃｈａｍｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４０，６３；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，６６００ならびに実施例２の１．３に挙げる文献から得ることができる。
他の考え得る官能基を表１に列挙する。この表は、考え得るリンカー分子の体系的な全体像を示している。また、その機序自体は当分野では知られている。
本発明に役立ついくつかのリンカー分子は当分野では知られているか、市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ製、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（ドイツ・ボン）から入手可能）。
本発明の方法のステップｃ）では、ステップａ）のポリペプチドをステップｂ）のＨＡＳと反応させることにより、１個以上のＨＡＳ分子を含み、そのＨＡＳが糖質部分またはチオエーテルを介してポリペプチドにコンジュゲートされているＨＡＳ−ポリペプチドを製造する。
基本的に、ポリペプチドを修飾ＨＡＳと反応させる方法の詳細は、ポリペプチドおよび／またはＨＡＳの個々の修飾に依存し、当分野では知られている（例えばＲｏｓｅ，１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，３０；Ｏ’ＳｈａｎｎｅｓｓａｙおよびＷｉｃｈｅｋ，１９９０，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９１，１；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４０，６３、Ｃｈａｍｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１５９１６を参照されたい）。
本発明で例示する方法については実施例２〜４、特に実施例４に詳述する。
ステップｃ）は少なくとも１０重量％のＨ2Ｏを含む反応媒体で行うことができる。
本発明の方法のこの好ましい実施形態における反応媒体は、少なくとも１０重量％（好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば９０％または最高１００％まで）の水を含む。有機溶媒の割合はそれぞれに計算される。したがって反応は水相で起こる。好ましい反応媒体は水である。
本発明のこの実施形態の利点の一つは、毒物学的に危険な溶媒を使用する必要がなく、したがって、溶媒による汚染を避けるためにそれらの溶媒を製造工程後に除去する必要がないということである。また、毒物学的に危険な溶媒の残留に関して、余分な品質管理を行う必要もない。毒物学的に危険でないエタノールやプロピレングリコールのような溶媒を有機溶媒として使用することが好ましい。
本発明の方法のもう一つの利点は、有機溶媒によって誘発される不可逆的または可逆的な構造変化が避けられるということである。したがって、本発明の方法によって得られるポリペプチドは、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中で製造されたものとは異なる。
また、驚いたことに、ＨＡＳを水溶液中で薬物にコンジュゲートすることにより、副反応が回避されることも観察された。その結果、本発明の方法のこの実施形態は、高い純度を有する改良された生成物をもたらす。
本発明に関して、「ヒドロキシアルキルデンプン」という用語は、ヒドロキシアルキル基で置換されているデンプン誘導体を示すために用いられる。この場合、アルキル基は置換されていてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキルは、２〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子を含有する。したがって「ヒドロキシアルキルデンプン」には、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンが含まれ、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは好ましい。
ＨＡＳのヒドロキシアルキル基は少なくとも１個のＯＨ基を含有する。
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明のどの実施形態にとっても、最も好ましい。
「ヒドロキシアルキルデンプン」という表現には、アルキル基が一置換または多置換されている誘導体も含まれる。この場合、アルキル基は、ＨＡＳが水溶性のままであるという条件の下で、ハロゲン（特にフッ素）またはアリール基で置換されていることが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキルの末端ヒドロキシ基はエステル化またはエーテル化することができる。また、ヒドロキシアルキルデンプンのアルキル基は線状でも分岐状でもよい。
さらに、アルキルの代わりに、線状または分岐状の置換または無置換アルキレン基も使用することができる。
本発明に関して、ヒドロキシエチルデンプンは１〜３００ｋＤａの平均分子量（重量平均）を有することができ、５〜１００ｋＤａの平均分子量はより好ましい。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、ヒドロキシエチル基に関して、０．１〜０．８のモル置換度および２〜２０の範囲のＣ2：Ｃ6置換比を示し得る。
本発明の方法によって製造されるＨＡＳ−ポリペプチドは、以下のように精製し、特徴付けることができる。
ＨＡＳ−ポリペプチドの単離は、天然および組換えポリペプチドの既知の精製手法（例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、実施例２０．８に記載の手法、またはそれらの組合せなど）を使って行うことができる。
ポリペプチドへのＨＡＳの共有結合は、修飾タンパク質の加水分解後に糖組成分析を行うことによって確認することができる。
ポリペプチドのＮ−結合型オリゴ糖のＨＡＳ修飾は、ＨＡＳ修飾Ｎ−グリカンを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＋／−ウェスタンブロッティング分析で予想通り高移動度側にシフトすることを観察することによって、実証することができる。
システイン残基におけるポリペプチドのＨＡＳ修飾は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳで、ＨＡＳ修飾生成物のタンパク質分解断片中に、対応するタンパク質分解Ｃｙｓ−ペプチドを検出することができないということによって、実証することができる（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９（１３），２３４８−５５）。Ｃｙｓ修飾ポリペプチドのタンパク質分解消化後にＨＡＳ含有画分を単離すれば、従来のアミノ酸組成分析によってこの画分中に対応ペプチドを確認することが可能になる。
本発明のＨＡＳ−ポリペプチドとの関連で上に開示したポリペプチドまたはＨＡＳの性質に関する実施形態は、全て、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲート製造方法にも当てはまる。また、ＨＡＳ−ＥＰＯまたはその製造方法との関連で上に開示したペプチド全般またはＨＡＳに関係する実施形態は、全て、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲート製造方法にも当てはまる。
さらに本発明は、本発明の方法によって得ることができるＨＡＳ−ポリペプチドに関する。好ましくは、このＨＡＳ−ポリペプチドは、本発明の上記ＨＡＳ−ポリペプチドについて説明した特徴を有する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、使用されるＨＡＳは次式（Ｉ）で表される。
Figure 2006516534
 ［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、水素または線状もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である］。煩雑になるのを避けるために、式（Ｉ）では、末端糖質部分がヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2および／またはＲ3を含んでいる化合物を示したが、本発明で使用する「ヒドロキシアルキルデンプン」という用語は、これらの化合物に限定されるわけではなく、末端糖質部分中および／またはデンプン分子の残りの部分ＨＡＳ’中のどこかに存在する少なくとも１個のヒドロキシ基が、ヒドロキシアルキル基Ｒ1、Ｒ2またはＲ3で置換されている化合物も表す。この場合、アルキル基は、適当に置換されていてもよい線状または分岐状アルキル基であることができる。ヒドロキシアルキル基は、好ましくは１〜１０個の炭素原子、より好ましくは１〜６個の炭素原子、さらに好ましくは１〜４個の炭素原子、さらに好ましくは２〜４個の炭素原子を有する。したがって好ましくは、「ヒドロキシアルキルデンプン」には、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンが含まれ、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンは特に好ましく、ヒドロキシエチルデンプンはとりわけ好ましい。
ＨＡＳおよび好ましくはＨＥＳは、ＨＡＳ（好ましくはＨＥＳ）およびポリペプチド（上述したポリペプチドなど）と反応する架橋化合物と反応させることができる。
ＨＡＳと架橋化合物との反応は、ＨＡＳの還元末端またはＨＡＳの酸化型還元末端で起こり得る。したがって、式（Ｉ）：
Figure 2006516534
 の構造を有するＨＡＳ、および／または還元末端が酸化されている場合には、式（ＩＩａ）：
Figure 2006516534
 および／または式（ＩＩｂ）：
Figure 2006516534
 の構造を有するＨＡＳを、反応させることができる。
式（Ｉ）のＨＡＳを架橋化合物と反応させる場合は、その反応を、好ましくは、水性媒体中で行う。式（ＩＩａ）および／または（ＩＩｂ）のＨＡＳを架橋化合物と反応させる場合は、その反応を、好ましくは、非水性媒体中（例えばＤＭＳＯおよび／またはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒または溶媒混合物中）で行う。
ＨＡＳと架橋化合物とを含むＨＡＳ誘導体を、ポリペプチドの酸化型糖質部分と反応させることによって、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲートを製造する場合、架橋化合物は、好ましくは、以下の化合物である。
Figure 2006516534
Figure 2006516534
ＨＡＳと少なくとも１個の架橋化合物とを含むＨＡＳ誘導体を、ポリペプチドのチオ基と反応させることによって、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲートを製造する場合は、ＨＡＳを、酸化されていてもよいその還元末端で、好ましくは以下の化合物である第１架橋化合物と反応させ、
Figure 2006516534
Figure 2006516534
Figure 2006516534
 得られたＨＡＳ誘導体を、そのＨＡＳ誘導体およびポリペプチドのチオ基と反応する能力を有する第２架橋化合物と反応させることが好ましい。例えば、ＨＡＳ誘導体が、第２架橋化合物と反応する官能基として、上に詳述したように−ＮＨ−という構造を有する場合は、官能基Ｆ１およびＦ２を有する以下のタイプの第２架橋化合物が、とりわけ好ましい。
Figure 2006516534
第１架橋化合物の特に好ましい例は、
Figure 2006516534
 であり、化合物
Figure 2006516534
 はとりわけ好ましい。また、以下の第２架橋化合物、
Figure 2006516534
 は好ましく、化合物：
Figure 2006516534
 は、特に好ましい。
各反応条件、使用する溶媒もしくは溶媒混合物、および／または水性媒体中でＨＡＳと反応させる化合物Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’のＲ’および／またはＲ’’残基に依存して、上記の方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、以下の構造（ＩＩＩａ）を持ち得る。
Figure 2006516534
したがって本発明は、式（ＩＩＩａ）の構造を有する上述のヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関係する。
また、例えばＲ’が水素である場合、上述した方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体は、下記の構造（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）を有することができ、この場合、（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）は、一定の平衡分布で、反応混合物中に両方とも存在し得る。
Figure 2006516534
したがって本発明は、式（ＩＩＩｂ）の構造を有する上述のヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関係する。
さらに本発明は式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）で表される構造の混合物として存在する上述のヒドロキシアルキルデンプン誘導体にも関係する。
反応条件および／または反応に使用する化合物Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’の化学的性質に依存して、式（ＩＩＩａ）の化合物はＮ原子をエクアトリアル位に有する状態またはＮ原子をアキシャル位に有する状態で存在することができ、一定の平衡分布を有する両者の混合物も存在し得る。
反応条件および／または反応に用いる化合物Ｒ’−ＮＨ−Ｒ’’の化学的性質に依存して、式（ＩＩＩｂ）の化合物は、Ｃ−Ｎ二重結合がＥ配置をとっている状態、またはＺ配置をとっている状態で存在することができ、一定の平衡分布を有する両者の混合物も存在し得る。
式（ＩＩＩａ）の化合物を安定化することが望ましい場合もあり得る。特に、式（ＩＩＩａ）の化合物が水溶液中で製造および／または使用される場合は、これに該当する。安定化する方法としては、式（ＩＩＩａ）の化合物のアシル化がとりわけ好ましく、Ｒ’が水素である場合には特にそうである。所望する式（ＩＶａ）のヒドロキシアルキルデンプン誘導体をもたらす適当な試薬は全て、アシル化試薬として、使用することができる。
Figure 2006516534
本発明の特に好ましい実施形態によれば、アシル化試薬の一部である残基Ｒａはメチルである。アシル化試薬としては、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物およびカルボン酸活性エステルが、好ましく使用される。
したがって本発明は、上述の方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、式（ＩＶａ）の構造を有するものにも関係する。
アシル化は、０〜３０℃の範囲内、好ましくは２〜２０℃の範囲内、特に好ましくは４〜１０℃の範囲内の温度で行われる。
逆に、式（ＩＩＩｂ）の化合物を安定化することが望ましい場合もあり得る。特に、式（ＩＩＩｂ）の化合物が水溶液中で製造および／または使用される場合は、これに該当する。安定化する方法としては、式（ＩＩＩｂ）の化合物の還元がとりわけ好ましく、Ｒ’が水素である場合は特に好ましい。所望する式（ＩＶｂ）のヒドロキシアルキルデンプン誘導体をもたらす適当な試薬は全て、還元試薬として、使用することができる。
Figure 2006516534
本発明の特に好ましい実施形態では、還元試薬として、ＮａＣＮＢＨ3またはＮａＢＨ4などのホウ水素化物を使用する。
したがって本発明は、上述の方法によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、式（ＩＶｂ）の構造を有するものにも関係する。
還元は４〜１００℃の範囲内、好ましくは１０〜９０℃の範囲内、特に好ましくは２５〜８０℃の範囲内の温度で行われる。
さらに本発明は、化合物（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）、化合物（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）、化合物（ＩＩＩａ）と（ＩＶａ）、化合物（ＩＩＩａ）と（ＩＶｂ）、化合物（ＩＩＩｂ）と（ＩＶａ）、化合物（ＩＩＩｂ）と（ＩＶｂ）、化合物（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）と（ＩＶａ）、化合物（ＩＩＩａ）と（ＩＩＩｂ）と（ＩＶｂ）、化合物（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）と（ＩｌＩａ）、ならびに化合物（ＩＶａ）と（ＩＶｂ）と（ＩＩＩｂ）の混合物（ここに、（ＩＩＩａ）および／または（ＩＶａ）は独立して、Ｎ原子がエクアトリアル位またはアキシャル位になるような配置をとることができ、（ＩＩＩｂ）のＣ−Ｎ二重結合はＥ配置またはＺ配置をとることができる）にも関係する。
さらに本発明は、ヒトまたは動物の身体を処置する方法で使用するための、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドにも関係する。
さらに本発明は、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドを含む医薬組成物にも関係する。好ましい一実施形態では、本医薬組成物はさらに、エリスロポエチン療法に役立つ医薬的に許容できる希釈剤、佐剤および／または担体を少なくとも１つは含む。
さらに本発明は、貧血障害もしくは造血機能不全障害またはそれらに関係する疾患を処置するための医薬品の製造を目的とする、本発明のＨＡＳ−ポリペプチドの使用にも関係する。
以下の図、表および実施例によって、本発明をさらに詳しく説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
組換えＥＰＯの生産
Ａ）哺乳類細胞での生産
組換えＥＰＯをＣＨＯ細胞中で以下のように生産した。
ヒトＥＰＯ ｃＤＮＡを有するプラスミドを真核発現ベクター（ｐＣＲ３、以後、ｐＣＲＥＰＯと呼ぶ）にクローニングした。文献に記載の標準的方法を使って部位特異的突然変異誘発を行った（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ １，３／４−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ＩＩＩ−ＶＩＩ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ（ｘ）ａｎｄ ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ（ｘ）ｍｏｔｉｆｓ ｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ −Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−ｔｒａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（４７），３０９８５−３０９９４）。
文献（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．）に記載されているように、ヒトＥＰＯまたはそのアミノ酸変異体（例えばＣｙｓ−２９→Ｓｅｒ／ＡｌａまたはＣｙｓ−３３→Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ−１２６→Ａｌａなど）を安定に発現させるＣＨＯをリン酸カルシウム沈殿法によって作製し、Ｇ４１８硫酸で選択した。トランスフェクションの３日後に、細胞を１：５に継代し、１０％ＦＢＳと１．５ｇ／リットルのＧ４１８硫酸とを含むＤＭＥＭ中で選択した。
この選択手法を用いると、通常は１００〜５００個のクローンが生き残り、選択培地中でさらに２〜３週間にわたって増殖した。次に、コンフルエントに成長した単層の細胞培養上清を、ウェスタンブロット分析およびＩＥＦ／ウェスタンブロット分析によって、ＥＰＯ発現レベルについて分析した。
ＥＰＯは、スピナーフラスコまたは２リットル潅流反応槽で、ステーブルなサブクローンから生産した。様々な量のＮｅｕＡｃ（例えば２〜８、４〜１０、８〜１２個のＮｅｕＡｃ残基）を有するＥＰＯの様々なグリコフォームを、後述する種々のクロマトグラフィー法を併用して、公表されたプロトコールに従って単離した。
文献：
Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ａｎｄ ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｓｐｅｃｉｆｙ ｔｈｅｉｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｏｌｇｉ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７４（５１），３６１０７−１６、Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｐｏｈｌ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．，１６（２），８１−９７、Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒａｄｔ，Ｈａｕｓｅｒ，１９９９，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６５（５），５２９−５３６、Ｓｃｈｌｅｎｋｅ，Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｎｉｍｔｚ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９９，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ−ｔｙｐｅ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（１−３），１７−２５。
Ｂ）昆虫細胞での生産
文献に記載されているとおり、ポリヘドリンプロモーターの制御下にヒトＥＰＯ ｃＤＮＡを持っている組換えバキュロウイルスベクターに細胞を感染させることにより、組換えヒトＥＰＯを昆虫細胞株ＳＦ９およびＳＦ２１から産生させた。
無血清培養培地で生育した細胞を２×１０6または２×１０7細胞／ｍＬの細胞密度で感染させ、細胞培養上清中のＥＰＯ力価を毎日決定した。ＥＰＯを、ブルーセファロースクロマトグラフィー、Ｑ−セファロースでのイオン交換クロマトグラフィー、そして最後にＣ4相でのＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ−末端配列決定によって産物の純度をチェックした。詳細な糖質構造分析（Ｎ−およびＯ−グリコシル化）は公表された手法に従って行った。
文献：
Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，Ｈｏｆｅｒ，Ｎｉｍｔｚ，Ｊａｇｅｒ，Ｃｏｎｒａｄｔ，１９９３，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｓｆ２１ ｃｅｌｌｓ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏ− ｃｈｅｍ．，２１５（１），１８９−９７、Ｑｕｅｌｌｅ，Ｃａｓｌａｋｅ，Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，１９８９，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｌｏｏｄ，７４（２），６５２−７。
反応性ＨＥＳ誘導体の形成
１．ＳＨ反応性ＨＥＳ
１．１ ＥＭＣＨとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応によるＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂの形成
Figure 2006516534
 ０．１４４ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓのドイツ特許ＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１）を０．３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、それを、ＤＭＳＯ １．５ｍＬ中のＥＭＣＨ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）３４ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。６０℃で１９時間撹拌した後、反応混合物を、エタノールとアセトンの１：１混合物１６ｍＬに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、３ｍＬのＤＭＳＯに再溶解し、再び上述のように沈殿させた。遠心分離し、減圧下で乾燥することにより、ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂを得た。チオ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については、実施例３の２．２で説明する。
別法
この反応には、スペーサーで分離されたヒドラジド官能基およびマレイミド官能基を有する架橋剤は、全て使用することができる。この群に属する分子であって、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（ドイツ・ボン）から入手できるものの他の例を表２に示し、「Ａ」と記す。また、マレイミド官能基の代わりに活性化ジスルフィド官能基を有するもう一つの架橋剤群も使用することができるだろう。
１．２ ＨＥＳグリコシルアミンのハロゲン化アセトアミド誘導体
ａ）グリコシルアミン形成1)
ＨＥＳ１２ＫＤの試料１ｍｇを３ｍＬの飽和重炭酸アンモニウム溶液に溶解した。次に、３０℃で１２０時間インキュベートする間に、溶液の飽和状態を維持するために、重炭酸アンモニウム固体を追加した。反応混合物を直接凍結乾燥することにより、アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｃを脱塩した。
1Ｍａｎｇｅｒ，Ｗｏｎｇ，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ，Ｄｗｅｋ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１０７３３−１０７４０、Ｍａｎｇｅｒ，Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ，Ｄｗｅｋ，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１０７２４−１０７３２。
ｂ）クロロ酢酸無水物によるグリコシルアミンＣのアシル化
アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｃの試料１ｍｇを１ｍＬの１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液に溶解し、氷で冷却した。これに、クロロ酢酸無水物固体の結晶（約５ｍｇ）を加え、反応混合物を室温まで温めた。ｐＨを監視し、ｐＨが７．０未満に低下したら塩基を追加した。室温で２時間後に塩基および無水物を追加した。６時間後に、混床式アンバーライトＭＢ−３（Ｈ）（ＯＨ）イオン交換樹脂を通すことによって、生成物クロロアセトアミド−ＨＥＳ Ｄ１（Ｘ＝Ｃｌ）を脱塩した。
ｃ）ブロモ酢酸無水物によるグリコシルアミンのアシル化2
ブロモ酢酸無水物はＴｈｏｍａｓ3が記載しているように製造した。アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｃの試料１ｍｇを０．１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、氷で冷却し、５ｍｇのブロモ酢酸無水物を加えた。反応混合物をゆっくりと室温にして、その溶液を３時間撹拌した。反応混合物を、−２０℃で、エタノールとアセトンの１：１混合物１ｍＬに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、０．１ｍＬのＤＭＦに再溶解し、再び上述のように沈殿させた。遠心分離し、減圧下で乾燥することにより、ブロモアセトアミド−ＨＥＳ Ｄ２（Ｘ＝Ｂｒ）を得た。チオ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については実施例３の１．２で説明する。
2 Ｂｌａｃｋ，Ｋｉｓｓ，Ｔｕｌｌ，Ｗｉｔｈｅｒｓ，１９９３，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２５０，１９５
3 Ｔｈｏｍａｓ，１９７７，Ｍｅｔｈｏｄｅｓ Ｅｎｙｍｏｌ．，４６，３６２
ｄ）Ｄ２の説明と同様にして、対応するヨード誘導体Ｄ３（Ｘ＝Ｉ）を合成した。ブロモ酢酸無水物の代わりにヨード酢酸Ｎ−スクシンイミジルを使用し、全工程を暗所で行った。
Figure 2006516534
別法
アミノ基のアシル化には、ハロゲン酸性酸（ｈａｌｏｇｅｎ ａｃｉｄｉｃ ａｃｉｄ）の他の活性型、例えば、
・臭化物または塩化物
・エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、置換フェノール類（ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、トリクロロフェノールなど）とのエステル、
などを使用することもできる。
さらに、スペーサーで分離されたアミノ反応性基とハロゲン化アセチル官能基とを有する架橋剤は全て使用することができるだろう。その一例はＳＢＡＰである。この分子は、他の分子と共に、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（ドイツ・ボン）から入手することができる。それらを表２では「Ｄ」と記す。ハロゲン化アセトアミド−ＨＥＳ誘導体を単離せずにアミノ−ＨＥＳをチオ−ＥＰＯと連結するための架橋剤としての使用については、実施例３の１．２に記載の注を参照されたい。
１．３ アミノ−ＨＥＳ Ｅ1のハロゲン化アセトアミド誘導体
ａ）１，４−ジアミノブタンとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応によるアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅの生成4
4 Ｓ．Ｆｒｉｅ，Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ，Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｍｂｕｒｇ，１９９８
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを３ｍＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、それを、ＤＭＳＯ １５ｍＬ中の１，４−ジアミノブタン １．５１ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。４０℃で１９時間撹拌した後、反応混合物を、エタノールとアセトンの１：１混合物１６０ｍＬに加えた。沈殿物アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅを遠心分離によって集め、４０ｍＬの水に再溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ，３．５ＫＤカットオフ，Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
Figure 2006516534
ｂ）上記１．３のクロロアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｄ１の説明と同様にして、クロロアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｆ１を製造した。
ｃ）上記１．３のブロモアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｄ２の説明と同様にして、ブロモアセトアミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｆ２（Ｘ＝Ｂｒ）を製造した。チオ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については実施例３の１．２で説明する。
ｄ）対応するヨード誘導体Ｆ３（Ｘ＝Ｉ）はチオＥＰＯとの反応に先立って単離しなかった。実験は実施例３の１．１で説明する。
別法
上記１．２参照。
２．ＣＨＯ−反応性ＨＥＳ
２．１ ヒドラジド−ＨＥＳ
ａ）ヒドラジンとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応
Figure 2006516534
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、それを、ＤＭＳＯ １５ｍＬ中のヒドラジン０．４７ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。４０℃で１９時間撹拌した後、反応混合物を、エタノールとアセトンの１：１混合物１６０ｍＬに加えた。沈殿した生成物Ｊを遠心分離によって集め、４０ｍＬの水に再溶解し、０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ，３．５ＫＤカットオフ，Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。酸化型グリコ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については、実施例４の２．２で説明する。
ｂ）アジピン酸ジヒドラジドとオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤとの反応
Figure 2006516534
１．７４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のアジピン酸ジヒドラジドを６５℃の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２０ｍＬに溶解し、３ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを窒素下で滴下した。６０℃で６８時間撹拌した後、反応混合物を２００ｍＬに水に加えた。Ｌを含有する溶液を０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ，３．５ＫＤカットオフ，Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。酸化型グリコ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については、実施例４の２．２で説明する。
別法
さらに、２つのヒドラジド基が任意のスペーサーで分離されている誘導体も使用することができる。
３．他のアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ誘導体ＩおよびＨ1
各ハロゲン化アセトアミドの試料１ｍｇを０．１ｍＬの飽和炭酸アンモニウム溶液に溶解することによって、ＤまたはＦのアンモノリシスを個別に行った。次に、３０℃で１２０時間インキュベートする間に、溶液の飽和状態を維持するために、炭酸アンモニウム固体を追加した。反応混合物を、エタノールとアセトンの１：１混合物１ｍＬに−２０℃で加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、０．０５ｍＬの水に再溶解し、上述のように再び沈殿させた。遠心分離し、減圧下で乾燥することにより、生成物アミノＨＥＳ ＨまたはＩを得た。酸化型グリコ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については実施例４の４．１で説明する。
Figure 2006516534
４．ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋ
Figure 2006516534
Ｏ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを、Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．5が記述しているように、市販の材料から２段階で合成した。１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ １５ｍＬ中のＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミン２．０４ｇ（１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。６５℃で４８時間撹拌した後、反応混合物をエタノールとアセトンの１：１混合物１６０ｍＬに加えた。沈殿した生成物Ｋを遠心分離によって集め、水４０ｍＬに再溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ，３．５ＫＤカットオフ，Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。酸化型グリコ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については実施例４の３．１で説明する。
5 Ｂｏｔｕｒｙｎ，Ｂｏｕｄａｌｉ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｌｈｏｍｍｅ，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，５４８５
別法
また、２つのヒドロキシルアミン基が任意のスペーサーで分離されている誘導体を使用することもできるだろう。
５．チオ−ＨＥＳ１２ＫＤ
５．１ オキソ−ＨＥＳ１２ＫＤへの付加
Figure 2006516534
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１２ＫＤを３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ １５ｍＬ中のシステアミン１．１６ｇ（１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。４０℃で２４時間撹拌した後、反応混合物をエタノールとアセトンの１：１混合物１６０ｍＬに加えた。沈殿した生成物Ｍを遠心分離によって集め、水４０ｍＬに再懸濁し、０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ，３．５ＫＤカットオフ，Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。酸化型グリコ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応については実施例４の２．１で説明する。
別法
アミノ基とチオ官能基とが任意のスペーサーによって分離されている誘導体を使用することができるだろう。さらに、誘導体中のアミノ基はヒドラジン、ヒドラジドまたはヒドロキシルアミンで置き換えることができるだろう。チオ官能基は、例えばジスルフィド誘導体またはトリチル誘導体などの形で保護することができるだろう。しかし、この場合は、コンジュゲーションに先立って、Ｍと類似する成分が遊離されるように、脱保護ステップを実施しなければならない。
５．２ アミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、ＨまたはＩの修飾
ａ）ＳＡＴＡ／ＳＡＴＰによる修飾
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、ＨまたはＩを３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ ５ｍＬ中のＳＡＴＡ １３９ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。室温で２４時間撹拌した後、反応混合物をエタノールとアセトンの１：１混合物１６０ｍＬに加えた。沈殿した生成物Ｎを遠心分離によって集め、水４０ｍＬに再溶解し、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ，３．５ＫＤカットオフ，Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍヒドロキシルアミンを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で、脱保護を室温で２時間行い、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析することによって、生成物Ｏを精製した。脱保護反応は、実施例４の２．１で説明するコンジュゲーション反応の直前に行った。
Figure 2006516534
 脱保護 脱保護
ｂ）ＳＰＤＰによる修飾
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、ＨまたはＩを３ｍＬの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ ５ｍＬ中のＳＰＤＰ １８７ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。室温で２４時間撹拌した後、反応混合物をエタノールとアセトンの１：１混合物１６０ｍＬに加えた。沈殿した生成物Ｐを遠心分離によって集め、水４０ｍＬに再溶解し、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ，３．５ＫＤカットオフ，Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．５ｍＬに対してジチオスレイトール（ＤＴＴ）１２ｍｇの溶液中で、脱保護を室温で３０分間行い、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対する透析によって、生成物Ｑを精製した。この脱保護反応は、実施例４の２．１で説明するコンジュゲーション反応の直前に行った。
別法
アミノ基から遊離型または保護型のチオール基への変換には、いくつかの試薬を利用することができる。修飾後は生成物を単離することができるだろう。あるいは、架橋剤を使用する場合に認められるように、好ましくは精製ステップ後に、コンジュゲーション反応に直接使用することもできるだろう。チオ−ＨＥＳ誘導体の単離と貯蔵には、保護型のチオ−ＨＥＳ誘導体の合成が役立ち得る。そのためには、任意のスペーサーで分離された活性エステル官能基とチオエステル官能基とを持っている、ＳＡＴＡ類似の誘導体を、どれでも使用することができるだろう。この群のもう１つのメンバーであるＳＡＴＰを表２に示し、「Ｈ」と記す。ＳＰＤＰ類似の誘導体は、任意のスペーサーで分離されている活性エステル官能基とジスルフィド官能基とを持ち得る。これらの群の他のメンバーを表２に示し、「Ｆ」と記す。他の類似誘導体として、エステル官能基と、トリチル誘導体として保護されたチオール官能基とが、任意のスペーサーで分離されているものを挙げることができる。
チオ−ＥＰＯとのコンジュゲーション反応
１．チオ−ＥＰＯとハロゲン化アセトアミド修飾ＳＨ反応性ＨＥＳとの反応
１．１ プロトコール例１
ＮＨＳ活性エステル基とヨードアセトアミド基とを含有する架橋剤（例えばＳＩＡ6）を使ったアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、ＨまたはＩ）へのチオＥＰＯのコンジュゲーション
材料
Ａ．ホウ酸緩衝液．組成は５０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．３、５ｍＭ ＥＤＴＡとした。
Ｂ．ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
Ｃ．アミノＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、ＨまたはＩ．ホウ酸緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬになるように調製。
Ｄ．架橋剤原液：１４ｍｇのＳＩＡを１ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。
Ｅ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム、ベッド体積５ｍＬ×２（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｆ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｇ．チオＥＰＯ溶液：ホウ酸緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ １。
Ｈ．マイクロ濃縮器：マイクロコンＹＭ−３（アミコン，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，ドイツ・エシュボルン）。
6 Ｃｕｍｂｅｒ，Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，Ｆｏｘｗｅｌｌ，Ｒｏｓｓ，Ｔｈｏｒｐｅ，１９８５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｒｙｍｏｌ．，１１２，２０７。
方法
１００μＬのＳＩＡ溶液を４００μＬのアミノＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ溶液に加え、撹拌しながら室温で０．５時間反応させた。マイクロ濃縮器を使って試料を１４０００×ｇで６０分間遠心分離することにより、過剰の架橋剤を除去した。遠心分離後に試料をホウ酸緩衝液で元の体積に戻し、この工程をさらに２回繰り返した。残留液を１ｍＬのチオＥＰＯ溶液に加え、その反応混合物を室温で１６時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後に最終濃度が１０ｍＭになるようにシステインを加えることにより、過剰のヨードアセトアミドの反応性を消失させた。ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムに反応混合物をのせ、各画分のタンパク質含量をクーマシータンパク質アッセイ試薬で監視した。タンパク質コンジュゲートを含有する画分を全てプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することによって、コンジュゲートを得た。
別法
この反応には、スペーサーによって分離されているスクシンイミド官能基またはスルホスクシンイミド官能基とヨードアセトアミド官能基とを有する全ての架橋剤を使用することができるだろう。他の例を表２に示す。これらは「Ｃ」と記し、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（ドイツ・ボン）から入手できる。
１．２ プロトコール例２
ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２、Ｆ２またはヨードアセトアミドＤ３へのチオＥＰＯ １のコンジュゲーション7
7 ｄｅ Ｖａｌａｓｃｏ，Ｍｅｒｋｕｓ，Ａｎｄｅｒｔｏｎ，Ｖｅｒｈｅｕｌ，Ｌｉｚｚｉｏ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，ｖａｎＥｄｅｎ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｓｎｉｐｐｅ，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３，９６１。
材料
Ａ．リン酸緩衝液．組成は１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．１、５ｍＭ ＥＤＴＡとした。
Ｂ．ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
Ｃ．ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２．リン酸緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬになるように調製。
Ｄ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム、ベッド体積５ｍｌ×２（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｆ．チオＥＰＯ溶液：リン酸緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ １。
7 ｄｅ Ｖａｌａｓｃｏ，Ｍｅｒｋｕｓ，Ａｎｄｅｒｔｏｎ，Ｖｅｒｈｅｕｌ，Ｌｉｚｚｉｏ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ，ｖａｎ Ｅｄｅｎ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｖｅｒｈｏｅｆ，Ｓｎｉｐｐｅ，１９９５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３，９６１。
方法
１ｍＬのＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤブロモアセトアミドＤ２溶液と１ｍＬにチオ−ＥＰＯ溶液とを混合し、その反応混合物を室温で４８時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後に最終濃度が１０ｍＭになるようにシステインを加えることにより、過剰なブロモアセトアミドの反応性を消失させた。ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムに反応混合物をのせた。各画分のタンパク質含量をクーマシータンパク質アッセイ試薬で監視して、タンパク質コンジュゲートを含有する全画分をプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することによって、コンジュゲートを得た。
別法
ＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ−ブロモアセトアミドＤ２を単離する代わりに、スクシンイミド官能基およびブロモアセトアミド官能基を介して、アミノＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、Ｉ）を、架橋剤と連結することもできるだろう（上記１．１参照）。ＳＢＡＰはこの架橋剤群の一メンバーであり、これを表２に「Ｄ」と記して記載する。
２．チオ−ＥＰＯとマレイミド修飾ＳＨ反応性ＨＥＳとの反応
２．１ プロトコール例３
ヒドラジド官能基とマレイミド官能基とを有する架橋剤（例えばＭ2Ｃ2Ｈ）を使ったＨＥＳ１２ＫＤへのチオＥＰＯのコンジュゲーション
材料
Ａ．Ｍ2Ｃ2Ｈ原液：ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍＬ Ｍ２Ｃ２Ｈ、新しく調製。
Ｂ．ＨＥＳ１２ＫＤ：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、１０ｍｇ／ｍＬ。
Ｃ．チオＥＰＯ溶液：リン酸／ＮａＣＩ緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ。
Ｄ．リン酸／ＮａＣＩ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣＩ、ｐＨ７．０。
Ｅ．マイクロ濃縮器：マイクロコンＹＭ−３（アミコン，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，ドイツ・エシュボルン）。
Ｆ．ゲル濾過カラム：例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）。
Ｇ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｈ．ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
方法
４００μＬのＨＥＳ１２ＫＤ溶液に、最終濃度が１ｍＭになるようにＭ2Ｃ2Ｈ溶液を加え、撹拌しながら室温で２時間反応させた。マイクロ濃縮器を使って試料を１４０００×ｇで６０分間遠心分離することにより、過剰の架橋剤を除去した。遠心分離後に試料をリン酸／ＮａＣＩ緩衝液で元の体積に戻し、この工程をさらに２回繰り返した。このＭ2Ｃ2Ｈ修飾ＨＥＳ１２ＫＤに、０．５ｍＬのチオＥＰＯ溶液を加え、その反応混合物を室温で２時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後に最終濃度が１０ｍＭになるようにシステインを加えることにより、過剰のマレイミドの反応性を消失させた。ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）に反応混合物をのせ、各１ｍＬの画分を集めた。各画分のタンパク質含量をクーマシータンパク質アッセイ試薬で監視した。タンパク質コンジュゲートを含有する画分を全てプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することによって、コンジュゲートを得た。
製法上の注意
ヒドラゾン付加物は極端なｐＨでは安定性がわずかに低下する。低ｐＨでの処理が含まれ得る用途の場合は、ＰＢＳ緩衝液中の３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより、ヒドラゾンをヒドラジンに還元した。ほとんどの用途には、この追加ステップは必要なかった。
２．２ プロトコール例４
マレイミドＨＥＳ１２ＫＤ ＢへのチオＥＰＯのコンジュゲーション
材料
Ａ．マレイミド−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂ：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、１０ｍｇ／ｍＬ。
Ｂ．チオＥＰＯ溶液：リン酸／ＮａＣＩ緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ。
Ｃ．リン酸／ＮａＣＩ：０．１Ｍリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣＩ、ｐＨ７．０。
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）。
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｆ．ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
方法
１ｍＬのＳＨ反応性ＨＥＳ１２ＫＤ Ｂ溶液と１ｍＬのチオＥＰＯ １溶液とを混合し、その反応混合物を室温で２時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後に最終濃度が１０ｍＭになるようにシステインを加えることにより、過剰なマレイミドの反応性を消失させた。ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）に反応混合物をのせ、各１ｍＬの画分を集めた。各画分のタンパク質含量をクーマシータンパク質アッセイ試薬で監視した。タンパク質コンジュゲートを含有する全画分をプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することによって、コンジュゲートを得た。
２．３ プロトコール例１２
ＮＨＳ活性エステルとマレイミド基とを含有する架橋剤（例えばＳＭＣＣ）を使ったアミノＨＥＳ１２ＫＤ（Ｅ、Ｈ、Ｉ）へのチオＥＰＯのコンジュゲーション
材料
Ａ．マイクロ濃縮器：マイクロコンＹＭ−１０（アミコン，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，ドイツ・エシュボルン）。
Ｂ．ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
Ｃ．アミノＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ、ＨまたはＩ：ＰＢＳ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍＬになるように調製。
Ｄ．ＳＭＣＣ溶液：１ｍｇ ＳＭＣＣを５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。
Ｅ．Ｄ−Ｓａｌｔ（商標）デキストラン脱塩カラム、ベッド体積５ｍＬ×２（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｆ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｇ．チオＥＰＯ １溶液：ＰＢＳ緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのチオＥＰＯ １。
方法
５０μＬのＳＭＣＣ溶液に４００μＬのアミノＨＥＳ１２ＫＤ Ｅ溶液を加え、その反応混合物を撹拌しながら室温で８０分間、そして４６℃で１０分間反応させた。マイクロ濃縮器を使って反応混合物を１４０００×ｇで６０分間遠心分離することにより、過剰の架橋剤を除去した。体積をＰＢＳ緩衝液で４５０μＬにし、この工程をさらに２回繰り返した。最後の遠心分離後に、残留溶液をＰＢＳで４５０μＬにし、１ｍＬのチオＥＰＯに加え、その反応混合物を室温で１６時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後に最終濃度が１０ｍＭになるようにシステインを加えることにより、過剰なマレイミドの反応性を消失させた。ＰＢＳ緩衝液で平衡化した脱塩カラムに反応混合物をのせた。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使って各画分のタンパク質含量を監視して、タンパク質コンジュゲートを含む全画分をプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することによってコンジュゲートを得た。
別法
この反応では、スペーサーによって分離されたスクシンイミド官能基またはスルホスクシンイミド官能基とマレイミド官能基とを持っている架橋剤は全て使用することができるだろう。Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ（ドイツ・ボン）から入手できるこの分子群のさらなる例を表２に示し、「Ｅ」と記す。マレイミド官能基の代わりに活性化されたジスルフィド官能基を持っているもう一つの架橋剤群がある。コンジュゲーションにはこれらの架橋剤も使用できるだろう。ただしコンジュゲートのジスルフィド結合は還元条件下で切断可能である。この群のメンバーを表２では「Ｆ」と記す。第３の架橋剤群ではマレイミド官能基の代わりにビニルスルホン官能基をＳＨ反応性基として使用する。この群の一メンバー「ＳＶＳＢ」を表２では「Ｇ」と記す。
酸化型ＥＰＯとのコンジュゲーション反応
１．グリコ−ＥＰＯの酸化
１．１ メタ過ヨウ素酸ナトリウムによるグリコ−ＥＰＯの酸化：プロトコール例５
材料
Ａ．グリコ−ＥＰＯ溶液：酢酸緩衝液中、１０ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯ。
Ｂ．メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液：酢酸緩衝液中の１０ｍＭまたは１００ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム、新たに調製したもの。暗所に保存。これらの溶液を使って、酸化反応混合物中の過ヨウ素酸ナトリウムの最終濃度を、それぞれ１ｍＭまたは１０ｍＭにする。
Ｃ．酢酸ナトリウム：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５。
Ｄ．グリセロール。
Ｅ．マイクロ濃縮器：マイクロコンＹＭ−３（アミコン，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，ドイツ・エシュボルン）。
方法
全工程を暗所で行った。
１ｍＬの冷グリコ−ＥＰＯ溶液に、０．１ｍＬの冷メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加え、酸化反応を暗所で１時間進行させた。酸化対象であるグリコ−ＥＰＯがシアル酸残基を含有する場合は、酸化条件を１ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム、０℃とした。その他の場合は、室温で１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを使用した。酸化を停止させるために、最終濃度が１５ｍＭになるようにグリセロールを加え、０℃で５分間インキュベートした。マイクロ濃縮器を使って生成物を１４０００×ｇで６０分間遠心分離することにより、過剰の試薬と副生成物を除去した。遠心分離後に、次の修飾ステップで使用する緩衝液（例えば酢酸緩衝液）で試料を元の体積にした。この工程をさらに２回繰り返した。
１．２ グリコ−ＥＰＯの酵素的酸化：プロトコール例６
ＥＰＯの酵素的酸化は別の刊行物に記載されている（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１５９１６−１５９２２）。
２．ヒドラジン／ヒドラジド誘導体によるコンジュゲーション
２．１ プロトコール例７
ヒドラジド官能基とマレイミド官能基とを含有する架橋剤（例えばＭ2Ｃ2Ｈ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン））によるチオ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｍ、ＯまたはＱへの酸化型グリコ−ＥＰＯのコンジュゲーション。
材料
Ａ．Ｍ2Ｃ2Ｈ原液：ＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍＬ Ｍ2Ｃ2Ｈ、新しく調製。
Ｂ．６．１．１で得られる酸化型グリコ−ＥＰＯ溶液：酢酸緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯ。
Ｃ．チオ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｍ、ＯまたはＱ：リン酸／ＮａＣｌ緩衝液中、１０ｍｇ／ｍＬ。
Ｄ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５。
Ｅ．リン酸／ＮａＣＩ：０．１Ｍリン酸ナトリウム，５０ｍＭ ＮａＣＩ，ｐＨ７．０。
Ｆ．マイクロ濃縮器：マイクロコンＹＭ−３（アミコン，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ ＧｍｂＨ，ドイツ・エシュボルン）。
Ｇ．ゲル濾過カラム：例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）。
Ｈ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｉ．ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
方法
Ｍ2Ｃ2Ｈ原液を１ｍＬの酸化型グリコ−ＥＰＯに最終濃度が１ｍＭになるように加え、撹拌しながら室温で２時間反応させた。マイクロ濃縮器を使って試料を１４０００×ｇで６０分間遠心分離することにより、過剰の架橋剤を除去した。遠心分離後に、試料をリン酸／ＮａＣＩ緩衝液で元の体積にし、この工程をさらに２回繰り返した。このＭ2Ｃ2Ｈ修飾グリコ−ＥＰＯに、１ｍＬのチオ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｍ、ＯまたはＱ溶液を加え、その反応混合物を室温で１６時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後にシステインを加えることにより、過剰のマレイミドの反応性を消失させた。その反応混合物をＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にのせ、各１ｍＬの画分を集めた。各画分のタンパク質含量をクーマシータンパク質アッセイ試薬で監視して、タンパク質コンジュゲートを含有する全画分をプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することによって、コンジュゲートを得た。
製法上の注意
ヒドラゾン付加物は極端なｐＨでは安定性がわずかに低下する。低ｐＨでの処理が含まれ得る用途の場合は、ＰＢＳ緩衝液中の３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより、ヒドラゾンをヒドラジンに還元した。ほとんどの用途には、この追加ステップは必要なかった。
２．２ プロトコール例８
ヒドラジド−ＨＥＳ１２ＫＤ ＬまたはＪへの酸化型グリコ−ＥＰＯの直接コンジュゲーション。
材料
Ａ．６．１．１で得られる酸化型グリコ−ＥＰＯ溶液：酢酸緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯ。
Ｂ．ヒドラジド−ＨＥＳ１２ＫＤ ＬまたはＪ：酢酸緩衝液中、１０ｍｇ／ｍＬ。
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５。
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）。
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｆ．ＰＢＳ，リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
方法
１ｍＬのヒドラジド−ＨＥＳ１２ＫＤ ＬまたはＪ溶液と１ｍＬの酸化型グリコ−ＥＰＯ溶液とを混合し、その反応混合物を撹拌しながら室温で１６時間反応させた。反応混合物をＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にのせ、各１ｍＬの画分を集めた。各画分のタンパク質含量をクーマシータンパク質アッセイ試薬で監視して、タンパク質コンジュゲートを含有する全画分をプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することにより、コンジュゲートを得た。このコンジュゲーションの結果を図２４に示す。観察された分子シフトは、コンジュゲーションが成功したことを証明している。スメアはＨＥＳの不均質性に起因している。図２５は、ＨＥＳが糖質側鎖の糖質部分にコンジュゲートされることを証明している。
製法上の注意
ヒドラゾン付加物は極端なｐＨでは安定性がわずかに低下する。低ｐＨでの処理が含まれ得る用途の場合は、ＰＢＳ緩衝液中の３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムで処理することにより、ヒドラゾンをヒドラジンに還元した。ほとんどの用途には、この追加ステップは必要なかった。
３．ヒドロキシアミン誘導体によるコンジュゲーション8
３．１ プロトコール例９
ヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋへの酸化型グリコ−ＥＰＯのコンジュゲーション
材料
Ａ．６．１．１で得られる酸化型グリコ−ＥＰＯ溶液：酢酸緩衝液中、５ｍｇ／ｍＬのグリコ−ＥＰＯ。
Ｂ．ヒドロキシルアミノ−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋ：酢酸緩衝液中、１０ｍｇ／ｍＬ。
Ｃ．酢酸緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５。
Ｄ．ゲル濾過カラム：例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）。
Ｅ．Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）。
Ｆ．ＰＢＳ，リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。
8 Ｒｏｓｅ，１９９４，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，３０
方法
１ｍＬのヒドロキシルアミン−ＨＥＳ１２ＫＤ Ｋ溶液と１ｍＬの酸化型グリコ−ＥＰＯ溶液とを混合し、その反応混合物を撹拌しながら室温で１６時間反応させた。反応混合物をＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２００（１．５×４５ｃｍ）にのせ、各１ｍＬの画分を集めた。各画分のタンパク質含量をクーマシータンパク質アッセイ試薬で監視して、タンパク質コンジュゲートを含有する全画分をプールし、水に対して一晩透析してから凍結乾燥することにより、コンジュゲートを得た。このコンジュゲーションの結果を図２４に示す。レーン２に観察される分子シフトは、コンジュゲーションが成功したことを証明している。スメアはＨＥＳの不均質性に起因している。図２５は、ＨＥＳが糖質側鎖の糖質部分にコンジュゲートされることを証明している。
ガラクトースオキシダーゼ処理したＥＰＯ Ｎ−グリカンの特性解析
組換え型ＥＰＯまたは部分脱シアリル化型ＥＰＯ（限定的で穏和な酸加水分解によって生成したもの）を、０．０５Ｍリン酸−Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）中、カタラーゼの存在下で、３７℃で３０分〜３７℃で４時間にわたって、ガラクトースオキシダーゼと共にインキュベートした。５０μｇのＥＰＯを取り出し、次にそのタンパク質をポリペプチドＮ−グリカナーゼで処理することにより、反応の進行を監視した。
遊離したＮ−結合型オリゴ糖（脱Ｎ−グリコシル化ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出によって監視）を、シアル酸除去前およびシアル酸除去後に、刊行物に記載されているように（Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３／１９９４、Ｓｃｈｌｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッピングにかけた。個々のＥＰＯオリゴ糖中の酸化型ガラクトース残基の定量は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで観察される典型的なシフトによって行うと共に、オリゴ糖混合物のＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳによって検証した。
ＨＡＳ修飾ＥＰＯの特性解析
未反応ＥＰＯおよびＨＡＳ前駆体分子からのＨＡＳ修飾型ＥＰＯの分離は、例えばＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ４４／５４または同様のゲル濾過媒体を使ったゲル濾過によって達成した。あるいは、アフィゲル（ＢｉｏＲａｄ）につないだモノクローナル抗体を含む４ｍＬカラムで、ＥＰＯのイムノアフィニティー単離を行うことによって、未反応ＨＡＳを除去し、次にゲル濾過（例えば２０ｋＤａ〜２００ｋＤａの相対分子質量を有する球状タンパク質を分離することができるマトリックスを使用）によって無修飾ＥＰＯを分離した。
ＨＡＳ修飾ＥＰＯは、クーマーシーブリリアントブルーでゲルを染色したときにそれらが無修飾ＥＰＯよりも高い分子量を示すことを利用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１２．５％または１０％アクリルアミドゲルを使用）によって同定した。ＨＡＳ修飾ＥＰＯポリペプチドの高い分子量は、組換えヒトＥＰＯに対して産生させたポリクローナル抗体を使って、試料のウェスタンブロット分析でも確認した。
各種ＥＰＯのＮ−グリカン修飾は、それらがポリペプチドＮ−グリカナーゼ（２５単位／ｍｇ−ＥＰＯタンパク質のＲｏｃｈｅ（ドイツ）製組換えＮ−グリコシダーゼを３７℃で１６時間使用）でＥＰＯタンパク質からうまく除去されることによって証明した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、Ｎ−グリコシダーゼ処理した無修飾ＥＰＯ（約２０ＫＤａ）の移動位置まで、ＥＰＯ−タンパク質の典型的なシフトが起こった。
Ｓｅｒ１２６に位置する唯一の脱シアリル化ガラクトースオキシダーゼ処理ＥＰＯ Ｏ−グリカンの修飾は、脱Ｎ−グリコシル化生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動により、その移動位置を未反応の脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯと比較して検出することで証明した。必要なら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に先だって、修飾ＥＰＯをＣ８相でのＲＰ−ＨＰＬＣによって分画した。ＥＰＯのＨＡＳ Ｏ−グリカン修飾は、Ｏ−グリカンのβ−解離および組換えヒトＥＰＯに対して産生させたポリクローナル抗体を使ったウェスタンブロットでのＯ−グリコシル化型ＥＰＯの検出によっても分析した。
ＥＰＯおよび修飾型ＥＰＯの定量
各種ＥＰＯをＰｈ．Ｅｕｒ（２０００，エリスロポエチン濃縮液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ ｓｏｌｕｔｉｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ），１３１６，７８０−７８５）に記載されているＵＶ測定で定量し、国際ＢＲＰ基準ＥＰＯスタンダードと比較した。あるいは、ＥＰＯ濃度を、ＲＰ−Ｃ４カラムと２５４ｎｍでの吸光度とを使ったＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにより、２０、４０、８０および１２０μｇのＢＲＰ標準ＥＰＯ基準品を較正に使って決定した。
ＨＥＳ修飾組換えヒトＥＰＯのインビトロ生物活性
Ｋｒｙｓｔａｌが記述したエリスロポエチン生物活性アッセイ［Ｋｒｙｓｔａｌ，１９８４，Ｅｘｐ．Ｈｅａｍｏｔａｌ．，１１，６４９−６６０］を使って、精製ＨＥＳ修飾ＥＰＯを、活性について調べた。
フェニルヒドラジン塩酸塩で処置することによってＮＭＲＩマウスに貧血を誘発し、脾臓細胞を収集し、［Ｆｉｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７７，１２０３以降］に記載されているように使用した。ＥＰＯの希釈液を９６穴マイクロタイタープレートで３×１０5細胞／ウェルでインキュベートした。湿潤雰囲気（５％ＣＯ2）中、３７℃で２４時間後に、細胞を１ウェルあたり１μＣｉの3Ｈ−チミジンで４時間ラベルした。組み込まれた放射能を液体シンチレーション計数法によって決定した。比較用に国際基準ＥＰＯスタンダード（ＢＲＰスタンダード）を用いた。
あるいは、ＥＰＯ感受性細胞株ＴＦ−１を使ったインビトロアッセイによって、ＥＰＯ生物活性を測定した［Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓ．，１４０，３２３−３３４］。指数増殖期の細胞を洗浄して成長因子を取り除き、ＥＰＯの連続希釈液の存在下でさらに４８時間インキュベートした。Ｍｏｓｍａｎｎが記述したＭＴＴ還元アッセイ［Ｍｏｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３］を使って、細胞の増殖を調べた。
ＥＰＯおよびＨＡＳ修飾型ＥＰＯのインビボ活性決定
インビボ活性の決定は、動物に既知用量のＥＰＯまたは修飾型ＥＰＯを投与した４日後に、網状赤血球の増加を測定することにより、赤血球正常マウスで行った。アッセイは、赤血球増加症マウスアッセイでＷＨＯ ＥＰＯスタンダードに対して較正したＢＲＰ ＥＰＯスタンダードを使って行った。１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸緩衝食塩水でＥＰＯ試料を希釈した。
動物１匹につきダルベッコ緩衝食塩水中のＥＰＯ試験溶液０．５ｍｌ（１００、８０、４０または２０ＩＵ／ｍｌのＢＲＰ標準ＥＰＯ相当のＥＰＯタンパク質量に相当）を皮下投与した。注射の４日後に血液試料を採取し、網状赤血球をアクリジンオレンジで染色した。網状赤血球の定量はフローサイトメトリーにより、血液試料を採取してから５時間以内に合計３０，０００個の血球をカウントすることによって行った（Ｐｈ．Ｅｕｒ．，２０００，エリスロポエチン濃縮溶液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎｉ ｓｏｌｕｔｉｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔａ），１３１６，７８０〜７８５頁および欧州薬局方（１９９６／２０００，追補２００２）を参照されたい）。
インビボ半減期の決定
所定の量の無修飾型ＥＰＯまたはＨＡＳ修飾型ＥＰＯをウサギに静脈内注射した。所定の時間に血液試料を採取し、血清を調製した。インビトロバイオアッセイまたはＥＰＯ特異的な市販のＥＬＩＳＡによって、血清エリスロポエチンレベルを決定した。
インビボ薬物動態
マウスの場合：各動物に３００ＩＵ／ｋｇのＥＰＯを皮下投与した。７日後に、各動物の処置後ヘマトクリットを決定した。ヘマトクリットの大幅な増加が修飾ＥＰＯで処置した全ての動物に観察された。これは、無処理ＥＰＯの比較的短い半減期から見て、予想される結果である。修飾ＥＰＯ処置群のヘマトクリットの平均変化は、無処理ＥＰＯ群および対照群とは有意差があった。
ウサギの場合：２００ｎｇ／ｋｇ体重または最高８００ｎｇ／ｋｇ体重に相当する量の無修飾ＥＰＯおよびＨＡＳ修飾ＥＰＯで、ウサギを単回処置した。２、６、１６、２４および４８時間後に、市販のＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡを使って血液試料を分析することにより、血漿濃度を決定した。平均血漿ＥＰＯ濃度を決定し、平均初期半減期（α相）および終末半減期（β相）を、ＥＬＩＳＡ値から、刊行物（Ｚｅｔｔｌｍｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２１１５３−２１１５９）に記載されているように計算した。
文献：
Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ，Ｌｕｎｎ，ＲｉｓｉｎｇｅｒおよびＤａｖｉｓ，１９９９，Ａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｅｘｈｉｂｉｔｉｓ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｉｔｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２４７７３−２４７７８。
ＨＥＳ修飾組換えヒトＩＬ−２のインビトロ生物活性の評価
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４でのゲル濾過によって修飾ＩＬ２を回収した。対応する画分の一部を滅菌濾過し、ＩＬ２依存性ネズミＣＴＬＬ−２細胞株を使ってＩＬ２生物活性を決定した［Ｇｉｌｌｉｓ，Ｆｅｒｍ，ＯｎおよびＳｍｉｔｈ，１９７８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２０，２０２７−２０３２］。活性を国際基準ＩＬ２標準品に関係づけた。
非酸化型還元末端の還元的アミノ化によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
［実施例１３．１］
ヒドロキシエチルデンプンと１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンとの反応
Figure 2006516534
 ａ）５ｍｌの水に溶解した２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４））に、０．８３ｍｍｏｌの１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3を加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。反応混合物を、アセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
ｂ）０．８３ｍｍｏｌの１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3とを、ヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液に加えることによって得た混合物を、２５℃で３日間インキュベートすることも可能だった。
［実施例１３．２］
ヒドロキシエチルデンプンと１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンとの反応
Figure 2006516534
 ａ）５ｍｌの水に溶解した２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４））に、０．８３ｍｍｏｌの１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3を加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。反応混合物を、アセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
Ｇ．Ａｖｉｇａｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３４（１９８３）４４９−５０４に記載されているように、反応生成物中の１，２−ジオールを過ヨウ素酸塩で酸化的に切断することによって生じるホルムアルデヒドを定量することにより、１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンとＨＥＳとの反応を、間接的に確認した。
ｂ）０．８３ｍｍｏｌの１，２−ジヒドロキシ−３−アミノプロパンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3とを、ヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液に加えることによって得た混合物を、２５℃で３日間インキュベートすることも可能だった。
［実施例１３．３］
ヒドロキシエチルデンプンと１，４−ジアミノブタンとの反応
Figure 2006516534
 ａ）５ｍｌの水に溶解した２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４））に、０．８３ｍｍｏｌの１，４−ジアミノブタンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3を加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。反応混合物を、アセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
ｂ）０．８３ｍｍｏｌの１，４−ジアミノブタンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3とを、ヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液に加えることによって得た混合物を、２５℃で３日間インキュベートすることも可能だった。
［実施例１３．４］
ヒドロキシエチルデンプンと１−メルカプト−２−アミノエタンとの反応
Figure 2006516534
 ａ）５ｍｌの水に溶解した２００ｍｇのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４））に、０．８３ｍｍｏｌの１−メルカプト−２−アミノエタンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3を加えた。得られた混合物を８０℃で１７時間インキュベートした。反応混合物を、アセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
ｂ）０．８３ｍｍｏｌの１−メルカプト−２−アミノエタンと５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＣＮＢＨ3とを、ヒドロキシエチルデンプン２００ｍｇの溶液に加えることによって得た混合物を、２５℃で３日間インキュベートすることも可能だった。
非酸化型還元末端とのコンジュゲーションによるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
［実施例１４．１］
ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
Figure 2006516534
 ０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのカルボヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）を加えた。２５℃で１８時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿した生成物を遠心分離によって集め、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１４．２］
ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジドとの反応
Figure 2006516534
 ０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのアジピン酸ジヒドラジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ドイツ・フランクフルト／マイン）を加えた。２５℃で１８時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿した生成を遠心分離によって集め、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１４．３］
ヒドロキシエチルデンプンと１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジドとの反応
Figure 2006516534
 ０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌの１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ドイツ・フランクフルト／マイン）を加えた。２５℃で１８時間撹拌した後、８ｍｌの水を反応混合物に加え、その懸濁液を４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。透明な上清をデカントして、アセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿した生成物を遠心分離によって集め、４０ｍｌの水に再溶解し、４，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。透明な上清を水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１４．４］
ヒドロキシエチルデンプンとＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンとの反応
Figure 2006516534
 Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３（１９９７）５４８５−５４９２頁に記載されているように、市販の材料から２段階で、Ｏ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した。
０．９６ｇのＨＥＳ１８／０．４（ＭＷ＝１８，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４）を８ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝水溶液（ｐＨ５．２）に溶解し、８ｍｍｏｌのＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを加えた。２５℃で１８時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿した生成物を遠心分離によって集め、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して３日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
酸化型還元末端との反応によるヒドロキシエチルデンプン誘導体の形成
［実施例１５．１］
ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
Figure 2006516534
 ０．１２ｍｍｏｌのオキソ−ＨＥＳ１０／０．４（ＭＷ＝１０，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４、ＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１に従って製造したもの）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ １５ｍｌ中のカルボヒドラジド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）１５ｍｍｏｌの混合物に、窒素下で滴下した。６５℃で８８時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１５．２］
ヒドロキシエチルデンプンと１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジドとの反応
Figure 2006516534
 ０．１２ｍｍｏｌのオキソ−ＨＥＳ１０／０．４（ＭＷ＝１０，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４、ＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１に従って製造したもの）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ １５ｍｌ中の１，４−フェニレン−ビス−３−チオセミカルバジド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ドイツ・フランクフルト／マイン）１５ｍｍｏｌの混合物に、窒素下で滴下した。６５℃で８８時間撹拌した後、反応混合物をアセトンとエタノールの冷１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離によって集め、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１５．３］
ヒドロキシエチルデンプンとヒドラジンとの反応
Figure 2006516534
 １．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１０／０．４（ＭＷ＝１０，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４、ＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１に従って製造したもの）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ １５ｍｌ中のヒドラジン０．４７ｍｌ（１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。４０℃で１９時間撹拌した後、反応混合物をエタノールとアセトンの１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿した生成物を遠心分離によって集め、４０ｍｌの水に再溶解し、０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１５．４］
ヒドロキシエチルデンプンとヒドロキシルアミンとの反応
Figure 2006516534
 Ｂｏｔｕｒｙｎ ｅｔ ａｌ．が記述したように、市販の材料から２段階で、Ｏ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミンを合成した（Ｂｏｔｕｒｙｎ，Ｂｏｕｄａｌｉ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｌｈｏｍｍｅ，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３，５４８５）。
１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１０／０．４（ＭＷ＝１０，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４、ＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１に従って製造したもの）を３ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ １５ｍｌ中のＯ−［２−（２−アミノオキシ−エトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミン２．０４ｇ（１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。６５℃で４８時間撹拌した後、反応混合物をエタノールとアセトンの１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿した生成物を遠心分離によって集め、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１５．５］
ヒドロキシエチルデンプンとアジピン酸ジヒドラジドとの反応
Figure 2006516534
 １．７４ｇ（１５ｍｍｏｌ）のアジピン酸ジヒドラジドを６５℃の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２０ｍｌに溶解し、３ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解した１．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１０／０．４（ＭＷ＝１０，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４、ＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１に従って製造したもの）を窒素下で滴下した。６０℃で６８時間撹拌した後、反応混合物を２００ｍｌの水に加えた。反応生成物を含有する溶液を０．５％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン水溶液に対して２日間、水に対して２日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
［実施例１５．６］
ヒドロキシエチルデンプンと１，４−ジアミノブタンとの反応
Figure 2006516534
 １．４４ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のオキソ−ＨＥＳ１０／０．４（ＭＷ＝１０，０００Ｄ，ＤＳ＝０．４、ＤＥ １９６ ２８ ７０５ Ａ１に従って製造したもの）を３ｍｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、ＤＭＳＯ １５ｍｌ中の１，４−ジアミノブタン１．５１ｍｌ（１５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素下で滴下した。４０℃で１９時間撹拌した後、反応混合物をエタノールとアセトンの１：１混合物（ｖ／ｖ）１６０ｍｌに加えた。沈殿したアミノ−ＨＥＳ１０ＫＤ／０．４を遠心分離によって集め、４０ｍｌの水に再溶解し、水に対して４日間透析し（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析チューブ、３．５ＫＤカットオフ、Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，ドイツ・ボン）、凍結乾燥した。
エリスロポエチンの酸化
酸化型エリスロポエチンを実施例２０に記述するように製造した。酸化型エリスロポエチンとして、実施例２０．１１（ｃ）に記載のＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ（穏和な過ヨウ素酸酸化処理を施し、酸加水分解を行っていないＥＰＯ−ＧＴ−１）を使用した。
ヒドロキシエチルデンプン誘導体と実施例４の酸化型エリスロポエチンとのコンジュゲーション
［実施例１７．１］
酸化型エリスロポエチンと実施例１４．１の反応生成物との反応
２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中の酸化型ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調節した。このＥＰＯ溶液１９μｌに、実施例１４．１に従って製造したＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ １８ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中、１８．７μｇ／μｌ）１８μｌを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図３に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１７．２］
酸化型エリスロポエチンと実施例１４．３の反応生成物との反応
２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中の酸化型ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調節した。このＥＰＯ溶液１９μｌに、実施例１４．３に従って製造したＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ １８ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中、１８．７μｇ／μｌ）１８μｌを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。
［実施例１７．３］
酸化型エリスロポエチンと実施例１４．４の反応生成物との反応
２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中の酸化型ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調節した。このＥＰＯ溶液１９μｌに、実施例１４．４に従って製造したＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ １８ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中、１８．７μｇ／μｌ）１８μｌを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図４に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１７．４］
酸化型エリスロポエチンと実施例１５．１の反応生成物との反応
２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中の酸化型ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調節した。このＥＰＯ溶液１９μｌに、実施例１５．１に従って製造したＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ １０ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中、１８．７μｇ／μｌ）１８μｌを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図５に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１７．５］
酸化型エリスロポエチンと実施例１５．２の反応生成物との反応
２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液中の酸化型ＥＰＯ（１．０５５μｇ／μｌ）を５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）でｐＨ５．３に調節した。このＥＰＯ溶液１９μｌに、実施例１５．１に従って製造したＨＥＳ誘導体の溶液（ＭＷ １０ｋＤ；０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中、１８．７μｇ／μｌ）１８μｌを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図５に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
エリスロポエチンの還元によるチオ−ＥＰＯの形成
５００μｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，英国モーカム）、ｐＨ８．３中の２４１．５μｇのエリスロポエチン（ＥＰＯ−ＧＴ−１、実施例２０参照）を、３７℃で１時間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器１０ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過した後、ホウ酸緩衝で３回洗浄し、リン酸緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）で２回洗浄することにより、ＤＴＴを除去した。
架橋化合物を使ったヒドロキシルエチルデンプン誘導体とチオ−エリスロポエチンとのコンジュゲーション
以下の各実施例では、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）を架橋化合物として使用した。
Figure 2006516534
［実施例１９．１］
チオ−エリスロポエチンと実施例１４．１の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１４．１に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加えた。その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、残っているＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．２］
チオ−エリスロポエチンと実施例１４．２の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１４．２に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加えた。その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、残っているＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図７に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．３］
チオ−エリスロポエチンと実施例１４．３の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１４．３に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加えた。その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、残っているＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図７に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．４］
チオ−エリスロポエチンと実施例１４．４の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１４．４に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加えた。その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、残っているＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図６に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．５］
チオ−エリスロポエチンと実施例１３．１の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１３．１に従って、８０℃で１７時間および２５℃で３日間というインキュベーション条件で製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加えた。その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、残っているＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図７に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．６］
チオ−エリスロポエチンと実施例１３．３の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１３．３に従って、８０℃で１７時間および２５℃で３日間というインキュベーション条件で製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加えた。その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、残っているＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図７に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．７］
チオ−エリスロポエチンと実施例１５．１の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１５．１に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加え、その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、ＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオ−ＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図８に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．８］
チオ−エリスロポエチンと実施例１５．２の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１５．２に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加え、その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、ＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオ−ＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図８に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．９］
チオ−エリスロポエチンと実施例１５．３の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１５．３に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加え、その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、ＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオ−ＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図８に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．１０］
チオ−エリスロポエチンと実施例１５．４の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１５．４に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加え、その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、ＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオ−ＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図８に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．１１］
チオ−エリスロポエチンと実施例１５．５の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１５．５に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加え、その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、ＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオ−ＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図８に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
［実施例１９．１２］
チオ−エリスロポエチンと実施例１５．６の反応生成物および架橋化合物との反応
実施例１５．６に従って製造した５０ｎｍｏｌのＨＥＳ誘導体を、２００μｌのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，９．１５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２）に溶解したものに、ＡＭＡＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・タウフキルヘン）２．５μｍｏｌのＤＭＳＯ溶液１０μｌを加え、その透明な溶液を２５℃で８０分間、そして４０℃で２０分間インキュベートした。ＶＩＶＡＳＰＩＮ ０．５ｍｌ濃縮器５ＫＤ ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ，ドイツ・ハノーバー）を使って１３，０００ｒｐｍで遠心濾過し、リン酸緩衝液で３０分間、４回洗浄することによって、ＡＭＡＳを除去した。
残存溶液に、実施例１８に従って製造したチオ−ＥＰＯ（リン酸緩衝液中１μｇ／μｌ）１５μｇを加え、その混合物を２５℃で１６時間インキュベートした。凍結乾燥後に、ＮｕＰＡＧＥ １０％ビス−トリスゲル／ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールズバッド）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に記載されているとおりに、粗生成物を分析した。ゲルはＲｏｔｉ−Ｂｌｕｅクーマシー染色試薬（Ｒｏｔｈ，ドイツ・カールスルーエ）で一晩染色する。
実験結果を図８に示す。コンジュゲーションの成功は、タンパク質バンドが高分子量側に移動することによって示される。バンド幅の増加は、使用したＨＥＳ誘導体の分子量分布と、タンパク質に連結しているＨＥＳ誘導体の数とによるものである。
ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートの予備製造
要約
ＨＥＳ誘導体（平均ｍｗ１８，０００ダルトン、ヒドロキシエチル置換度０．４）を、組換えヒトＥＰＯのオリゴ糖鎖上の部分的に（穏和な過ヨウ素酸）酸化されたシアル酸残基につなぐことによって、ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートを合成した。糖質構造分析によれば、導入された修飾はコアオリゴ糖鎖の構造上の完全性には影響を及ぼさなかった。というのも、穏和な酸処理を行ったＨＥＳ修飾グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳでは、無修飾ＥＰＯ産物に観察されるものと識別することができない無傷の中性Ｎ−アセチルラクトサミン型鎖が認められたからである。得られた結果は、前もって部分的シアル酸除去を行わずに修飾したＥＰＯ調製物の場合は、ＥＰＯ１分子につき少なくとも３個の修飾ＨＥＳ残基が取り付けられていることを示している。このタンパク質のシアル酸残基の約５０％を欠くＥＰＯ変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、同様に見かけ上高分子量の移動度を示した（ＢＲＰ ＥＰＯスタンダードの４０ＫＤａに対して６０〜１１０ＫＤａ）。ＨＥＳ修飾ＥＰＯは標準的なイオン交換クロマトグラフィー条件下、室温、ｐＨ３〜１０で安定である。
赤血球正常マウス系でのＥＰＯバイオアッセイによれば、ＨＥＳ修飾ＥＰＯは、欧州薬局方に記載のＵＶ吸収値を使ったタンパク質量決定およびＢＲＰ ＥＰＯ標準品に対して較正したＲＰ−ＨＰＬＣ ＥＰＯタンパク質量決定法に基づいて、国際ＢＲＰ ＥＰＯ基準スタンダードと比較すると、このアッセイでは２．５〜３．０倍高い比活性（ＩＵ／ｍｇ）を有することがわかる。
［実施例２０．１］
材料と方法
（ａ）Ｎ−グリコシダーゼ消化によるＮ−結合型オリゴ糖の遊離
試料を２５単位（製造者の仕様書による、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ））の組換えＰＮＧａｓｅ Ｆと共に３７℃で一晩インキュベートした。。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の特異的な移動度シフトによって、完全な消化を監視した。放出されたＮ−グリカンは、３体積の冷１００％エタノールを加え、−２０℃で少なくとも２時間インキュベートすることによって、ポリペプチドから分離した（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。沈殿したタンパク質を１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離することによって除去した。次に、そのペレットを５００μｌの氷冷７５％エタノールでさらに２回洗浄した。プールした上清中のオリゴ糖を減圧遠心機（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮器、Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，米国）で乾燥した。使用に先だって、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（２５ｍｇまたは１００ｍｇのＨｙｐｅｒＣａｒｂ）を以下のように使って、グリカン試料を脱塩した。すなわち、カラムを０．１％ＴＦＡ中の８０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）５００μｌ×３で洗浄し、次に水５００μｌ×３で洗浄した。最終体積が３００μｌ〜６００μｌになるように試料を水で希釈してからカートリッジにのせ、次に水で十分に洗浄した。０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）を含有する水中の２５％アセトニトリル１．２ｍｌ（２５ｍｇカートリッジ；１００ｍｇカートリッジの場合は１．８ｍｌ）で、オリゴ糖を溶出させた。溶出したオリゴ糖を２Ｍ ＮＨ4ＯＨで中和し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮器で乾燥した。場合によっては、総（糖）タンパク質量が１００μｇ未満である試料から得た消化混合物を１００ｍｇ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジに吸着させることによって、Ｎ−グリコシダーゼ遊離オリゴ糖の脱塩を行った。
（ｂ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ）によるオリゴ糖の分析
Ｂｒｕｋｅｒ ＵＬＴＲＡＦＬＥＸ飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）装置を使用した。２，５−ジヒドロキシ安息香酸をＵＶ吸収材として使用し、正イオンモードおよび負イオンモードで、どちらの場合もリフレクトロンを使って、未変性脱シアリル化オリゴ糖を分析した。ＭＳ−ＭＳ分析では、選択した親イオンをレーザー脱離（ＬＩＤ）にかけ、生成した断片イオンを装置の第２ＴＯＦステージ（ＬＩＦＴ）によって分離した。約１〜１０ｐｍｏｌ・μｌ-1の濃度を有する試料溶液１μｌを等量の各マトリックスと混合した。この混合物をステンレス鋼ターゲット上にスポットし、室温で乾燥してから分析した。
［実施例２０．２］
組換えヒトＥＰＯ（ＥＰＯ−ＧＴ−１）の製造および特性解析
文献（Ｍｕｅｌｌｅｒ ＰＰ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｄｏｒｎｅｒ ＡＪ ｅｔ ａｌ．，１９８４）に記載されているようにＥＰＯを組換えＣＨＯ細胞から発現させ、その調製物をＥｕｒ．Ｐｈａｒ．（Ｐｈ．Ｅｕｒ．４，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ ０１／２００２：１３１６：エリスロポエチン濃縮溶液（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））に記載の方法に従って特徴付けた。最終生成物のシアル酸含量はタンパク質１ｎＭｏｌあたり１２ｎＭｏｌ（±１．５ｎＭｏｌ）だった。Ｎ−結合型オリゴ糖の構造は、文献（Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｇｒａｂｅｎｈｏｒｓｔ，１９９９）に記載されているように、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤおよびＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって決定した。得られたＥＰＯ調製物はジ−、トリ−およびテトラ−シアリル化オリゴ糖を含んでいた（それぞれ２〜１２％、１５〜２８％および６０〜８０％、硫酸化鎖およびペンタシアリル化鎖が少量存在した）。ＥＰＯ調製物の全体的なグリコシル化特徴は、国際ＢＲＰ ＥＰＯ標準品と類似していた。
組換えＥＰＯの等電点電気泳動パターンは、国際ＢＲＰ基準ＥＰＯ標準品と類似していて、対応するアイソフォームを示した。ＥＰＯタンパク質の２５％ではポリペプチド鎖のＳｅｒ126がＯ−グリコシル化されていなかった。
［実施例８．３］
部分脱シアリル化型ＥＰＯの製造
ＥＰＯ ＧＴ−１タンパク質（２．８４ｍｇ／ｍｌ）を２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）中で８０℃まで加熱した後、ＥＰＯ溶液１ｍｌにつき１００μｌの１Ｎ Ｈ2ＳＯ4を加えた。インキュベーションをそれぞれ５分間、１０分間および６０分間続けることにより、シアリル化度が異なるＥＰＯ調製物を得た。ポリペプチドＮ−グリコシダーゼでオリゴ糖を遊離させ、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジ（２５ｍｇ ＨｙｐｅｒＳｅｐ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ；Ｔｈｅｒｍｏ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，英国）を使って脱塩することにより、Ｎ結合鎖の単離を行ってから、０〜４個のシアル酸を有するオリゴ糖の定量を行った。１Ｎ ＮａＯＨを添加することによってＥＰＯ調製物を中和し、液体Ｎ2中で凍結し、後に使用するまで−２０℃で保存した。
［実施例２０．４］
シアリル化型ＥＰＯの過ヨウ素酸酸化
３．５ｍｌの２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した無処理ＥＰＯまたは穏和な酸処理済みＥＰＯ １０ｍｇに、１．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、その混合物を氷浴で０℃に冷却した。５００μｌの１０ｍＭ過ヨウ素酸Ｎａを加え、反応混合物を０℃で暗所に６０分間維持した。次に、１０μｌのグリセロールを加え、インキュベーションを暗所でさらに１０分間続けた。ＶＩＶＡＳＰＩＮ濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ，ＰＥＳ Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ ＡＧ，ドイツ・ハノーバー）を、製造者の推奨に従って、固定アングルローターを装着した実験用遠心機中、３０００ｒｐｍで使用して、脱塩することにより、部分酸化型ＥＰＯを試薬類から分離した。液体窒素で凍結した後、最終体積４ｍｌのＥＰＯ調製物を−２０℃で保存した。
各１００μｇの部分酸化型ＥＰＯ調製物をＮ−グリコシダーゼ処理にかけ、上述のようにＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを使ってオリゴ糖を単離した。オリゴ糖を穏和な酸処理によって脱シアリル化して、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析し、それらの保持時間を文献（Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０および１９９３）に記載されている標準オリゴ糖スタンダードの保持時間と比較した。
［実施例２０．５］
ジチオエリスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｅｉｔｉｏｌ）によるＥＰＯジスルフィドの還元
０．１Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．１）中で５ｍｇのＥＰＯ−ＧＴ−１を３０ｍＭジチオエリスレイトール（ＤＴＴ）の存在下に３７℃で６０分間インキュベートした。４℃でＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮器を使用し、緩衝液交換を４サイクル行って、ＤＴＴを除去した。最終還元型ＥＰＯ調製物を液体窒素で凍結し、５０ｍＭ酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）中、−２０℃で保存した。
［実施例２０．６］
ＥＰＯタンパク質量の決定
ＥＰＯタンパク質量の定量的決定は、光路長１ｃｍのキュベットでＥｕｒ．Ｐｈａｒ．（欧州薬局方４，モノグラフ０１／２００２：１３１６：エリスロポエチン濃縮溶液（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ））に従って２８０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することによって行った。また、ＲＰ−Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ４，カタログ番号２１４ＴＰ５４１０，Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ，米国カリフォルニア州）を使ったＲＰ−ＨＰＬＣ法を応用することによっても、ＥＰＯを定量した。このＨＰＬＣ法はエリスロポエチンＢＲＰ １基準スタンダード（欧州薬局方，欧州評議会，Ｂ．Ｐ．９０７−Ｆ６７０２９，ストラスブール Ｃｅｄｅｘ １）を使って較正した。
［実施例２０．７］
ガラクトースオキシダーゼによる脱シアリル化ＥＰＯの酸化
完全に脱シアリル化したＥＰＯ ４．４８５ｍｇを、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．８）中、１６μｌのカタラーゼ（６２１４単位／２００ｍｌ）および８０μｌのガラクトースオキシダーゼ（２２５０単位／ｍｌ、ダクチリウム・デンドロイデス（Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓ）由来（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ・シュタインハイム））の存在下でインキュベートした。インキュベーションは３７℃で終夜行った。２０μｌのガラクトースオキシダーゼを、インキュベーションを開始してから４時間後と８時間後に、２回追加した。
［実施例２０．８］
バイオアッセイ用ＥＰＯ試料の調製
過ヨウ素酸酸化またはガラクトースオキシダーゼ酸化したＥＰＯタンパク質調製物と活性化ＨＥＳとのインキュベーション液からのＥＰＯの精製
ＥＰＯ試料の精製（未反応ＨＥＳ誘導体の除去）は室温で行った。ＥＰＯインキュベーション混合物（約５ｍｇのＥＰＯタンパク質）を緩衝液Ａ（再蒸留Ｈ2Ｏ中の２０ｍＭ Ｎ−モルホリンプロパンスルホン酸［ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ］，ｐＨ８．０）で１：１０希釈し、１０カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａで平衡化した３ｍｌのＱ−セファロースＨＰを含有するカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａコード番号１７−１０１４−０３，ロット番号２２０２１１）に、０．５ｍｌ／分の流速でのせた。カラムを６〜８ＣＶの緩衝液Ａ（流速＝０．８ｍｌ／分）で洗浄し、流速０．５ｍｌ／分の緩衝液Ｂ（再蒸留Ｈ2Ｏ中の２０ｍＭモルホリンエタンスルホン酸［ＭＥＳ／ＮａＯＨ］，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ６．５）を使って、溶出を行った。ＥＰＯは２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出し、約６ｍｌに溶出させた。３ＣＶの緩衝液Ｃ（Ｈ2Ｏ中の２０ｍＭ ＭＥＳ，１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５に調節）を使ってカラムを再生し、１０ＣＶの緩衝液Ａ（流速＝０．７ｍｌ／分）を使ってカラムを再平衡化した。
Ｑ−セファロース工程で得たＥＰＯ溶出液の緩衝液交換は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器とリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とを使用して、１試料につき各３回の遠心分離サイクルで行った。試料をＰＢＳで２ｍｌに調節し、−２０℃で保存した。
部分的に脱シアリル化してから穏和な過ヨウ素酸酸化を行ったＥＰＯをＨＥＳ修飾にかけたものは２５％未満しかＱ−セファロース溶出液から得られなかった。使用した条件では、塩基性ＥＰＯがＱ−セファロースに結合せず、未反応ＨＥＳ誘導体と一緒に素通り画分中に見いだされたからである。
［実施例２０．９］
パルスアンペロメトリー検出器を備えた高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ−ｐＨ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）
精製した未変性および脱シアリル化オリゴ糖を、パルスドアンペロメトリー検出器（ＰＡＤ）と組み合わせたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（０．４×２５ｃｍ）を備えるＤｉｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，米国）を使って、高ｐＨ陰イオン交換（ＨＰＡＥ）クロマトグラフィーによって分析した（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｎｉｍｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。検出電位（Ｅ）およびパルス幅（Ｔ）は、Ｅ１：＋５０ｍＶ、Ｔ１：４８０ｍｓ；Ｅ２：＋５００ｍＶ、Ｔ２：１２０ｍｓ；Ｅ３：−５００ｍＶ、Ｔ３：６０ｍｓとし、出力範囲は５００〜１５００ｎＡとした。次に、１００％溶媒Ａで平衡化したＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムにオリゴ糖を注入した。脱シアリル化オリゴ糖の場合、溶出（流速：１ｍｌ・分-1）は、溶媒Ｂの直線的勾配（０→２０％）を４０分間で適用した後、溶媒Ｂを５分間で２０→１００％に直線的に増加させることによって行った。溶媒Ａは再蒸留Ｈ2Ｏ中の０．２Ｍ ＮａＯＨであり、溶媒Ｂは溶媒Ａ中の０．６Ｍ ＮａＯＡｃからなった。未変性オリゴ糖の場合は、カラムを１００％溶媒Ｃ（再蒸留Ｈ2Ｏ中の０．１Ｍ ＮａＯＨ）で平衡化し、溶出（流速：１ｍｌ・分-1）は、溶媒Ｄの直線的勾配（０→３５％）を４８分間で適用した後、溶媒Ｄを１０分間で３５→１００％に直線的に増加させることによって行った。溶媒Ｄは溶媒Ｃ中の０．６Ｍ ＮａＡｃからなった。
［実施例２０．１０］
ＧＣ−ＭＳによるＮ−グリカン、ＨＥＳ修飾Ｎ−グリカンおよびＥＰＯタンパク質の単糖組成分析
ＧＣ／ＭＳにより、メタノリシス、Ｎ−再アセチル化およびトリメチルシリル化後に、単糖を対応するメチルグリコシドとして分析した［Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｆ．（１９８２），Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３，３３６−３４１］。分析は、３０ｍ ＤＢ５キャピラリーカラムを装着し正イオンＥＩモードで稼働するＦｉｎｎｉｇａｎ ＧＣＱイオントラップ質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州サンホゼ）で行った。温度プログラム：８０℃で２分間等温の後、３００℃まで毎分１０度。
単糖は、その保持時間と特徴的な断片化パターンによって同定した。定量には未補正の電子的ピーク積分結果を使用した。アノマー性および／またはフラノイド型とピラノイド型の存在により２個以上のピークを与える単糖は、全ての主要ピークを加えることによって定量した。０．５μｇのミオイノシトールを内部標準化合物として使用した。
［実施例２０．１１］
結果
［実施例２０．１１（ａ）］
穏和な酸処理を施した（部分的に脱シアリル化した）ＥＰＯ−ＧＴ−１のＮ−グリカンの特性解析
５、１０または６０分間の穏和な酸処理を施したＥＰＯ−ＧＴ−１調製物を、図９に示すように、Ｎ−グリコシダーゼとのインキュベーションによるＮ−結合型オリゴ糖の遊離前後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｎ−結合型オリゴ糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤオリゴ糖マッピングにかけた（図１０）。無処理のＥＰＯ−ＧＴ−１では９０％を超えるＮ−結合型オリゴ糖が３〜４個のシアル酸残基を持っていたが、穏和な酸の存在下で５分間インキュベートすると、３または４個のシアル酸残基を有するものは、糖質鎖の４０％未満になった。脱シアリル化Ｎ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤでは、無処理ＥＰＯ−ＧＴ−１に検出される中性オリゴ糖の比は、５、１０または６０分の酸処理にかけた調製物でも依然として安定であることがわかった。脱シアリル化グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳでは、近位フコースの９０％未満がタンパク質の穏和な酸処理後に存在していることが明らかになった。
［実施例２０．１１（ｂ）］
過ヨウ素酸処理したＥＰＯ−ＧＴ−１の特性解析
前もって５分間および１０分間の酸処理を施してから、または酸処理を施さずに、穏和な過ヨウ素酸処理にかけたＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度を、図１２で比較する。シアル酸の過ヨウ素酸酸化に使用した条件では、ＥＰＯ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは変化しなかった（図９と比較されたい）。シアル酸の酸化は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析において、オリゴ糖を、溶出時間が早くなる方向にシフトさせた（図１０および１３と比較されたい）。
［実施例２０．１１（ｃ）］
ＨＥＳ修飾ＥＰＯ誘導体の特性解析
（ａａ）実施例１４．４に従って製造したヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体ＸによるＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＨＥＳ修飾の時間経過
４００μｇのヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘを、０．５Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）２０μＬ中のＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ（穏和な過ヨウ素酸酸化を行ったＥＰＯ、穏和な過ヨウ素酸酸化に先だって酸加水分解していないもの）２０μｇに加え、それぞれ３０分後、２時間後、４時間後および１７時間後に、液体窒素中で試料を凍結させることによって、反応を停止した。次に、さらなる分析を行うまで、試料を−２０℃で保存しておいた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を加え、試料を９０℃に加熱し、ＳＤＳゲルにのせた。図１４に示すように、インキュベーション時間が増加すると、高分子量タンパク質側へのシフトが増加した。ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘの存在下で１７時間インキュベートした後では、分子量スタンダードの位置に基づいて６０ｋＤａと１１ＫＤａの間の領域に移動する拡散したクーマシー染色タンパク質バンドが検出された（図１４の左側を参照されたい）。Ｎ−グリコシダーゼで処理すると、タンパク質の大半は、脱−Ｎ−グリコシル化ＥＰＯの位置に向かってシフトした（図１４の右側のゲルを参照されたい；矢印ＡはＮ−グリコシダーゼの移動位置を示し、矢印Ｂは脱−Ｎ−グリコシル化ＥＰＯの移動位置を示している；２８ＫＤａ分子量スタンダードと３６ＫＤａ分子量スタンダードの間の領域に見える拡散したタンパク質バンドは、おそらく、分子のＯ−グリコシル化部位およびＨＥＳによって修飾されているＥＰＯに相当するのだろう）。Ｎ−グリコシダーゼの特異性を考慮して、本発明者らは、この結果から、ＨＥＳ修飾は実際にはＥＰＯタンパク質グリカンの過ヨウ素酸酸化されたシアル酸残基で起こると結論する。
（ｂｂ）ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートの特性解析
ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートＩ（穏和な過ヨウ素酸酸化後のＥＰＯ−ＧＴ−１、すなわちＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａから得られるもの）、ＩＩ（５分間の酸加水分解および穏和な過ヨウ素酸酸化にかけたＥＰＯ−ＧＴ−１から得られるもの）、ＩＩＩ（１０分間の酸加水分解および穏和な過ヨウ素酸酸化にかけたＥＰＯ−ＧＴ−１から得られるもの）を、前述のように合成した。等価な量の無修飾ＨＥＳを添加した同じ緩衝液条件下の無修飾ＥＰＯ−ＧＴ−１が入っている対照インキュベーション液（Ｋ）を含めた。インキュベーション混合物をさらなる精製にかけてから、ＨＥＳ−ＥＰＯ誘導体の生化学的分析を行った。
イオン交換カラムの素通り画分に入ると予想される過剰の未反応ＨＥＳ試薬を除去するために、ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートＩ、ＩＩおよびＩＩＩのインキュベーション液ならびに対照インキュベーション液Ｋを、「材料と方法」の項（実施例２０．８）で説明したＱ−セファロース精製工程にかけた。前もって酸処理した試料ＩＩおよびＩＩＩには大量の塩基性ＥＰＯが含まれるので、これらのインキュベーション液からは、かなりの量の修飾ＥＰＯ生成物が素通り画分に入ると、本発明者らは予想した。図１５に示すように、試料Ｉ中のＥＰＯ材料のほとんど全てがＱ−セファロースカラムに保持されたのに対して、試料ＩＩＩおよびＩＩでは約２０〜３０％が高塩濃度で溶出する画分中に回収されただけだった。ＨＥＳ誘導体Ｘと共にインキュベートすることによって得たタンパク質材料は全て、素通り画分でも、高塩濃度で溶出する画分でも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、対照ＥＰＯよりも見かけ上高い分子量を持っていた。
より詳細に特徴付けるために、ＨＥＳ修飾ＥＰＯ試料ＡおよびＫ（図１３参照）を、過ヨウ素酸酸化体ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａと比較した。試料をＮ−グリコシダーゼ処理にかけたところ、図１６ａおよび図１６ｂに示すように、Ｎ−グリカンの遊離により、標準ＥＰＯ調製物のＯ−グリコシル化ＥＰＯおよび非グリコシル化ＥＰＯの位置に、２本の低分子量バンドが生じた。試料Ａの場合は、２８ＫＤａの分子量スタンダードの位置に移動するもう１本のバンドが検出されたことから、このＥＰＯ変異体のＯ−グリカンでのＨＥＳ修飾が示唆される（実施例２０．１１（ｃ）（ａａ）参照）。このバンド（と、大量にＨＥＳ修飾された高ｍｗ型のＮ−グリコシル化ＥＰＯ、図１６ａおよび図１６ｂ参照）は、試料を穏和な加水分解にかけると消失した。これは、ＨＥＳ修飾がエリスロポエチンの酸化されたシアル酸残基で起こったという見解と一致する。
Ｎ−グリコシダーゼインキュベーション混合物の一部を、シアル酸残基（とシアル酸に連結しているＨＥＳ誘導体）をオリゴ糖から完全な除去し得る条件で加水分解した。次に、中和後に、その混合物を脱塩用の小さいＨｙｐｅｒｃａｒｂカラムに吸収させた。カラムを水で十分に洗浄した後、結合している中性オリゴ糖を、０．１％のトリフルオロ酢酸を含有するＨ2Ｏ中の４０％アセトニトリルで溶出させた。得られたオリゴ糖をＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳにかけた。試料Ａ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａおよび試料Ｋから得られる脱シアリル化オリゴ糖画分のスペクトルは、同じ複合型オリゴ糖の質量を、ｍ／ｚ＝１８１０Ｄａ（二本鎖）、２１７５＝三本鎖、２５４０＝四本鎖、２９０６＝四本鎖＋１Ｎ−アセチルラクトサミンリピートおよび３２７１＝四本鎖＋２Ｎ−アセチルラクトサミンリピートに示した。また、フコースの欠如（−１４６）およびガラクトースの欠如（−１６２）に相当する小さいシグナルが検出された。これらはシアル酸除去のために適用した酸加水分解条件に起因すると考えられる（ＭＡＬＤＩ−図１９、２０および２１参照）。
並行実験として、Ｎ−グリコシダーゼ消化混合物を１ｍｌのＲＰ−Ｃ１８カートリッジに吸収させ（事前のオリゴ糖の酸加水分解なし）、０．１％のＴＦＡを含有する水中の５％アセトニトリルで溶出を行った。これらの条件下では、ＥＰＯタンパク質はＲＰ材上に完全に保持され、０．１％ＴＦＡを含有するＨ2Ｏ中の５％アセトニトリルによって、オリゴ糖がカラムから洗い流された。脱−Ｎ−グリコシル化ＥＰＯタンパク質は、０．１％ＴＦＡを含有するＨ2Ｏ中の７０％アセトニトリルで溶出した。Ｎ−ガラクトシダーゼ処理した試料Ａ、ＥＰＯ ＧＴ−１−Ａおよび試料ＫのＲＰ−Ｃ１８工程で得られるオリゴ糖画分を中和し、前述のようにＨｙｐｅｒｃａｒｂカートリッジを使った脱塩にかけた。単離されたオリゴ糖を、グリカンからシアル酸を定量的に除去することができる条件での穏和な酸処理の前（図１７参照）および後（図１８参照）に、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッピングにかけた。
ＨＥＳ修飾試料Ａから得た未変性材料のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロフィールがオリゴ糖シグナルを無視できる程度にしか示さなかったのに対して、ＥＰＯ ＧＴ−１−Ａ由来のオリゴ糖は、図１３に示すもの（穏和な過ヨウ素酸処理後のＥＰＯ−ＧＴ−１と名付けられた試料）と同じグリカンプロフィールを示した。対照ＥＰＯ試料（Ｋ）から得られるオリゴ糖の溶出プロフィールは、予想通りのパターンをもたらした（図１０のプロフィールと比較されたい）。比較のために、国際ＢＲＰ−ＥＰＯスタンダードの未変性オリゴ糖プロフィールを、比較用の基準スタンダードとして含める。
穏和な酸加水分解後は、全てのオリゴ糖調製物が、本研究の出発物質として使用したＥＰＯ調製物について方法の項で説明したように、予想どおりの二本鎖、三本鎖および四本鎖複合型糖質鎖の定性的および定量的組成を有する同一の中性オリゴ糖構造の溶出プロフィールを示した（図１８参照）。この結果は、ＥＰＯ試料のＨＥＳ修飾によってＨＥＳ誘導体の共有結合が起こること、そしてそれは、Ｎ−グリコシダーゼによってＥＰＯタンパク質から脱離すること、また、糖質を脱シアリル化することが知られている穏和な酸処理条件でＮ−グリカンから除去されるので酸不安定性であること（図１６ａ＋ｂ参照）を、証明している。
（ｃｃ）ＨＥＳ−ＥＰＯおよびＨＥＳ−ＥＰＯ Ｎ−グリカンのＧＣ−ＭＳによる単糖組成分析
ＥＰＯのＨＥＳ修飾が分子のＮ−グリカンで起こっていることをさらに確認するために、ＥＰＯ試料をＮ−グリコシダーゼで消化し、ＥＰＯタンパク質をＲＰ−Ｃ１８カートリッジに吸着させると共に、オリゴ糖物質を上述のように洗い流した。表３に示すように、グルコースおよびヒドロキシエチル化グルコース誘導体は、システイン残基でのＨＥＳ修飾にかけたＥＰＯタンパク質と、ＥＰＯ試料Ａ２のオリゴ糖画分だけに検出された。
［実施例２０．１１（ｄ）］
ＨＥＳ修飾ＥＰＯの生物活性のインビボアッセイ
赤血球正常マウス系でのＥＰＯバイオアッセイは、欧州薬局方に記載されている手法に従って行った。ＥＰＯアッセイを行った実験室では、国際ＢＲＰ ＥＰＯ基準標準品を使用していた。ＨＥＳ修飾ＥＰＯ Ａ２調製物の場合、比活性の平均値はＥＰＯタンパク質１ｍｇあたり２９４，６００単位と決定され、活性アッセイ用に送られた試料に含まれていた国際ＢＲＰ ＥＰＯ基準標準品と比較して、約３倍高い比活性を示した。
研究の結果を表４に要約する。
実施例１３〜２０の参考文献
Ｎｉｍｔｚ Ｍ，Ｎｏｌｌ Ｇ，Ｐａｑｕｅｓ ＥＰ，Ｃｏｎｒａｄｔ ＨＳ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９０ Ｏｃｔ．１；２７１（１−２）：１４−８
Ｄｏｒｎｅｒ ＡＪ，Ｗａｓｌｅｙ ＬＣ，Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｕｔｙｒａｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８９ Ｄｅｃ ５；２６４（３４）：２０６０２−７
Ｍｕｅｌｌｅｒ ＰＰ，Ｓｃｈｌｅｎｋｅ Ｐ，Ｎｉｍｔｚ Ｍ，Ｃｏｎｒａｄｔ ＨＳ，Ｈａｕｓｅｒ Ｈ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１９９９ Ｄｅｃ ５；６５（５）：５２９−３６
Ｎｉｍｔｚ Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ Ｗ，Ｗｒａｙ Ｖ，Ｋｌｏｐｐｅｌ ＫＤ，Ａｕｇｕｓｔｉｎ Ｊ，Ｃｏｎｒａｄｔ ＨＳ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒｅｃｏｂｍｉｎａｎｔ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３ Ａｐｒ．１；２１３（１）：３９−５６
Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ Ｐ，Ｗｉｔｚｅｌ Ｒ，Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ＪＦ，Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ ＪＰ，Ｎｉｍｔｚ Ｍ，Ｃｏｎｒａｄｔ ＨＳ．Ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｐｈ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２ Ｊｕｎ；２０３（２）：２８１−９
Ｓｃｈｒｏｔｅｒ Ｓ，Ｄｅｒｒ Ｐ，Ｃｏｎｒａｄｔ ＨＳ，Ｎｉｍｔｚ Ｍ，Ｈａｌｅ Ｇ，Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ Ｃ．Ｍａｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ５２．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｏｃｔ．１５；２７４（４２）：２９８６２−７３
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Figure 2006516534
２つのＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 ｍｗ：マーカー レーン１：プロトコール例８に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯ。ＥＰＯはヒドラジド−ＨＥＳ １２ＫＤ Ｌにコンジュゲートされる。 レーン２：プロトコール例９に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯ。ＥＰＯはヒドロキシルアミノＨＥＳ １２ＫＤ Ｋにコンジュゲートされる。 Ｃ：対照（未コンジュゲートＥＰＯ）、上側のバンドはＥＰＯ二量体を表す。 ポリペプチドＮグリコシダーゼによるＨＡＳ修飾ＥＰＯの消化を示すことによってＨＥＳが糖質側鎖の糖質部分にコンジュゲートされことを実証している図である。 レーン１：Ｎ−グリコシダーゼによる消化後の、プロトコール例８に従って製造したＨＥＳ−ＥＰＯ レーン２：Ｎ−グリコシダーゼによる消化後の、プロトコール例９に従って製造したＨＥＳ−ＥＰＯ レーン３：ＢＲＰ ＥＰＯスタンダード レーン４：Ｎ−グリコシダーゼによる消化後の、ＢＲＰ ＥＰＯスタンダード ｍｗ：マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｌｏｗ ｒａｎｇｅ、カタログ番号１６１−０３０５、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州ヘラクレス）） 実施例１７．１に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，ドイツ・カールスルーエ）；タンパク質マーカーの分子量（単位ｋＤ）上から下に向かって：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４および１７。 レーンＢ：実施例１７．１に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＣ：ＥＰＯ出発物質。 実施例１７．３に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーンＡ：実施例１７．３に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＢ：ＥＰＯ出発物質。 レーンＣ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，ドイツ・カールスルーエ）；タンパク質マーカーの分子量（単位ｋＤ）上から下に向かって：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４および１７。 実施例１７．４および１７．５に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，ドイツ・カールスルーエ）；タンパク質マーカーの分子量（単位ｋＤ）上から下に向かって：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４および１７。 レーンＢ：実施例１７．４に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＣ：実施例１７．５に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＤ：ＥＰＯ出発物質。 実施例１９．１および１９．４に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，ドイツ・カールスルーエ）；タンパク質マーカーの分子量（単位ｋＤ）上から下に向かって：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４および１７。 レーンＢ：実施例１９．４に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＣ：実施例１９．１に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＤ：ＥＰＯ出発物質。 実施例１９．２、１９．３、１９．５および１９．６に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，ドイツ・カールスルーエ）；タンパク質マーカーの分子量（単位ｋＤ）上から下に向かって：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４および１７。 レーンＢ：実施例１３．３ｂ）に基づき、実施例１９．６に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＣ：実施例１３．１ｂ）に基づき、実施例１９．５に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＤ：実施例１３．３ａ）に基づき、実施例１９．６に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＥ：実施例１３．１ａ）に基づき、実施例１９．５に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＦ：実施例１９．２に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＧ：実施例１９．３に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＫ：ＥＰＯ出発物質。 実施例１９．７、１９．８、１９．９、１９．１０、１９．１１および１９．１２に従って製造したＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 レーンＡ：タンパク質マーカーＲｏｔｉ（登録商標）−Ｍａｒｋ ＰＲＥＳＴＡＩＮＥＤ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋Ｃｏ，ドイツ・カールスルーエ）；タンパク質マーカーの分子量（単位ｋＤ）上から下に向かって：２４５、１２３、７７、４２、３０、２５．４および１７。 レーンＢ：実施例１９．１１に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＣ：実施例１９．１０に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＤ：実施例１９．７に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＥ：実施例１９．８に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＦ：実施例１９．１２に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 レーンＧ：ＥＰＯ出発物質。 レーンＫ：実施例１９．９に従ってコンジュゲーションを行った後の粗生成物。 穏和な酸処理を５分間（レーン２）、１０分間（レーン３）および６０分間（レーン４）行ったＥＰＯ−ＧＴ−１ならびに無処理ＥＰＯ（レーン１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｎ−グリカンを除去した後のＥＰＯの移動度シフトを示す（＋ＰＮＧＡＳＥ）。 無処理のＥＰＯならびに穏和な酸加水分解条件下で５分間、１０分間および６０分間インキュベートしたＥＰＯから単離したオリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターン。ローマ数字Ｉ〜Ｖは、Ｉ＝脱シアリル化二本鎖構造、ＩＩ＝トリシアリル化三本鎖構造（２個の異性体）、ＩＩＩ＝本鎖構造、ＩＩ＝トリシアリル化三本鎖構造（２個の異性体）、ＩＩＩ＝テトラシアリル化四本鎖構造＋２Ｎ−アセチルラクトサミンリピート、ＩＶ＝テトラシアリル化四本鎖構造＋１Ｎ−アセチルラクトサミンリピート、Ｖ＝テトラシアリル化四本鎖構造＋Ｎ−アセチルラクトサミンリピートなし、の溶出位置を示している。シアル酸を持たないオリゴ糖構造および１〜４個のシアル酸を有するオリゴ糖構造の溶出範囲を、括弧で示す。 脱シアリル化後のＮ−オリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ。Ｎ−アセチルノイラミン酸の溶出位置を示す。１〜９の番号は、オリゴ糖スタンダードの溶出位置を示す：１＝二本鎖、２＝三本鎖（２−４異性体）、３＝三本鎖（２−６異性体）、４＝四本鎖、５＝三本鎖＋１リピート、６＝四本鎖＋１リピート、７＝三本鎖＋２リピート、８＝四本鎖＋２リピート、９＝四本鎖＋３リピート。 穏和な処理を施したＥＰＯまたは無処理のＥＰＯをシアル酸残基の過ヨウ素酸酸化にかけた試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。１＝過ヨウ素酸酸化物、酸処理なし。２＝過ヨウ素酸酸化、酸処理５分。３＝過ヨウ素酸酸化および酸処理１０分。４＝過ヨウ素酸酸化、酸処理なし。５＝ＢＲＰ ＥＰＯスタンダード、過ヨウ素酸処理なし、酸処理なし。 無処理ＥＰＯから単離した未変性オリゴ糖、および穏和な酸加水分解条件下で５分間および１０分間インキュベートした後、過ヨウ素酸処理を行ったＥＰＯから単離した未変性オリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤパターン。シアル酸を持たないオリゴ糖構造および１〜４個のシアル酸を有するオリゴ糖の溶出範囲を１〜５の括弧で示す。 ＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＨＥＳ修飾の時間経過のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。２０μｇのＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａをヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体Ｘと３０分間、２時間、４時間および１７時間反応させた。レーン１＝反応時間３０分、レーン２＝反応時間２時間、レーン３＝反応時間４時間、レーン４＝反応時間１７時間、レーン５＝ＨＥＳ修飾なしのＥＰＯ−ＧＴ−１Ａ。左側の図は、ヒドロキシルアミン修飾ＨＥＳ誘導体（流量：１ｍｌ・分-1）Ｘの存在下でのインキュベーション時間の増加に伴うＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａの移動度のシフトを示す。レーン１＝反応時間３０分、レーン２＝反応時間２時間、レーン３＝反応時間４時間、レーン４＝反応時間１７時間、レーン５＝ＨＥＳ修飾されたＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ。右側の図は、同じ試料をＮ−グリコシダーゼで処理した後の分析を示す。 ＨＥＳ−ＥＰＯコンジュゲートのＱ−セファロース画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。素通り画分の１％と、高塩濃度で溶出する画分の１％とを、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ濃縮器で濃縮し、試料緩衝液中のゲルに載せた。ＥＰＯタンパク質をクーマシーブルーで染色した。Ａ＝試料Ｉ、Ｂ＝試料ＩＩ、Ｃ＝試料ＩＩＩ、Ｋ＝対照ＥＰＯ−ＧＴ−１、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１およびＫ１は素通り画分を示し、Ａ２、Ｂ２、Ｃ２およびＫ２は高塩濃度で溶出する画分を示す。 図１６ａ：ＨＥＳ修飾ＥＰＯ試料Ａ２（図１５参照）、対照ＥＰＯ試料Ｋ２およびＥＰＯ−ＧＴ−１−ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｎ−結合型オリゴ糖を除去するために、ＥＰＯ調製物をＮ−グリコシダーゼの存在下で消化した。全てのＥＰＯ試料が、Ｏ−グリカンを欠くまたはＯ−グリカンを有する低分子量型への移動度シフトを示した。ＨＥＳ修飾ＥＰＯ試料Ａ２の場合は、脱Ｎ−グリコシル化後に観察されるＯ−グリコシル化および非グリコシル化タンパク質バンドの割合が低く、拡散したタンパク質バンドが３０ＫＤａ付近に検出された。これはおそらく、Ｏ−グリカン残基のシアル酸で起こるＨＥＳ修飾を表しているのだろう（アスタリスクを付けた矢印を参照のこと）。 図１６ｂ：無処理の、またはＮ結合型オリゴ糖を除去するためにＮ−グリコシダーゼの存在下で消化した（図１６ａ参照）、ＨＥＳ修飾ＥＰＯ試料Ａ２（図１５参照）、対照ＥＰＯ試料Ｋ２およびＥＰＯ−ＧＴ−１Ａの穏和な加水分解後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｎ−グリコシダーゼ処理前Ａ２およびＮ−グリコシダーゼ処理後Ａの高分子量型（矢印付きの括弧および矢印なしの括弧を参照）はどちらも、試料を酸処理すると消失した。比較用に流したＢＲＰ ＥＰＯスタンダードには穏和な酸処理を行っていない。 ＨＥＳ修飾試料Ａ、ＥＰＯ−ＧＴ−１−Ａ、および無修飾ＨＥＳと共にインキュベートした対照ＥＰＯ試料（Ｋ）から遊離されるＮ−結合型オリゴ糖材料のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析。ローマ数字Ｉ〜Ｖは、Ｉ＝ジシアリル化二本鎖構造、ＩＩ＝トリシアリル化三本鎖構造（２つの異性体）、ＩＩＩ＝テトラシアリル化四本鎖構造＋２Ｎ−アセチルラクトサミンリピート、ＩＶ＝テトラシアリル化四本鎖構造＋１Ｎ−アセチルラクトサミンリピート、Ｖ＝テトラシアリル化四本鎖構造＋Ｎ−アセチルラクトサミンリピートなし、の溶出位置を示す。括弧は、図１０および図１３の説明に記載したジシアリル化、トリシアリル化およびテトラシアリル化Ｎ−グリカンの溶出範囲を示す。 ＨＥＳ修飾試料Ａ、ＥＰＯ−ＧＴ−１Ａ、および無修飾ＨＥＳと共にインキュベートした対照ＥＰＯ試料（Ｋ）から遊離されるＮ−結合型オリゴ糖材料のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析。オリゴ糖スタンダードの混合物の保持時間を示す。１〜９の番号はオリゴ糖スタンダードの溶出位置を示す：１＝二本鎖、２＝三本鎖（２−４異性体）、３＝三本鎖（２−６異性体）、４＝四本鎖、５＝三本鎖＋１リピート、６＝四本鎖＋１リピート、７＝三本鎖＋２リピート、８＝四本鎖＋２リピート、９＝四本鎖＋３リピート。 図１９〜２５は、ＨＥＳ修飾ＥＰＯ調製物および対照ＥＰＯ調製物から単離された、酵素的に遊離させ化学的に脱シアリル化したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析を表す。ｍ／ｚ １８０９．７、２１７４．８、２５３９．９、２９０５．０および３２７０．１（［Ｍ＋Ｎａ］+）の主シグナルは、０、１または２個のＮ−アセチルラクトサミンリピートを有する二〜四本鎖複合型Ｎ−グリカン構造に対応し、ＭＳ分析用に試料を脱シアリル化するために使用する酸加水分解条件によって起こるフコースまたはガラクトースの喪失による弱いシグナルを伴っている。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＨＥＳ修飾ＥＰＯ Ａ２の脱シアリル化オリゴ糖。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ ＧＴ−１−Ａの脱シアリル化オリゴ糖。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ Ｋ２の脱シアリル化オリゴ糖。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：ＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴ糖。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：酸加水分解を５分間行ったＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴ糖。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：酸加水分解を１０分間行ったＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴ糖。 ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦスペクトル：酸加水分解を６０分間行ったＥＰＯ−ＧＴ−１の脱シアリル化オリゴ糖。

Claims (85)

  1. １個以上のヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）分子を含み、該ＨＡＳが
    ａ）糖質部分、または
    ｂ）チオエーテル
    を介してエリスロポエチン（ＥＰＯ）にコンジュゲートされている、ＨＡＳ−ＥＰＯコンジュゲート（ＨＡＳ−ＥＰＯ）。
  2. 前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  3. 前記ＥＰＯが、Ｎ−結合および／またはＯ−結合グリコシル化によってＥＰＯに取り付けられた１個以上の糖質側鎖を含む、請求項１または２に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  4. 前記糖質側鎖が、哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞での生産中にＥＰＯに取り付けられている、請求項３に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  5. 前記ＨＡＳが、リンカー分子を介して前記ＥＰＯにコンジュゲートされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  6. 前記ＨＡＳが、糖質側鎖の一部であり好ましくは酸化されている糖質部分を介して、ＥＰＯにコンジュゲートされている、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  7. 前記ＨＡＳが、糖質側鎖のガラクトース残基またはシアル酸残基にコンジュゲートされている、請求項６に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  8. 前記チオエーテルのＳ原子が、元から存在するシステインまたは付加されたシステインに由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  9. 前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を持ち、前記元から存在するシステインがシステイン２９および／または３３である、請求項８に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  10. 前記ＨＡＳが、システイン２９にコンジュゲートされ、前記システイン３３が、別のアミノ酸で置換されている、請求項９に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  11. 前記ＨＡＳが、システイン３３にコンジュゲートされ、前記システイン２９が、別のアミノ酸で置換されている、請求項９に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  12. 前記付加されたシステインが、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものである、請求項８〜１１に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  13. 前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯであり、前記置換されたアミノ酸残基が、セリン１２６である、請求項１２に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  14. 前記ＥＰＯ１分子あたり１〜１２個、好ましくは１〜６個または１〜３個、最も好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  15. 前記ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンからなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  16. 前記ＨＡＳがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項１５に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  17. 前記ＨＥＳが１〜３００ｋＤａ、好ましくは５〜１００ＫＤａの分子量を有する、請求項１６に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  18. 前記ＨＥＳが、ヒドロキシエチル基に関して、０．１〜０．８のモル置換度および２〜２０の範囲のＣ2：Ｃ6置換比を示す、請求項１６または１７に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  19. ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−エリスロポエチン（ＥＰＯ）コンジュゲート（ＨＡＳ−ＥＰＯ）の製造方法であって、
    ａ）修飾ＨＡＳと反応可能なＥＰＯを提供するステップ、
    ｂ）ステップａ）のＥＰＯと反応可能な修飾ＨＡＳを提供するステップ、および
    ｃ）ステップａ）のＥＰＯをステップｂ）のＨＡＳと反応させるステップであって、１個以上のＨＡＳ分子を含み、該ＨＡＳがＥＰＯに、
    ｉ）糖質部分、または
    ｉｉ）チオエーテル
    を介してコンジュゲートされているＨＡＳ−ＥＰＯが得られるステップ、
    を含む方法。
  20. 前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＥＰＯが、組換え生産される、請求項１９または２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＥＰＯが、Ｎ−結合および／またはＯ−結合グリコシル化によってＥＰＯに取り付けられた１個以上の糖質側鎖を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記糖質側鎖が、哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞での生産中にＥＰＯに取り付けられている、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＨＡＳが、糖質側鎖の一部である糖質部分を介してＥＰＯにコンジュゲートされている、請求項２２または２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. ステップａ）において、前記ＥＰＯが、ＥＰＯの１個以上の糖質側鎖の少なくとも１個の糖質部分、好ましくは少なくとも１個の末端糖単位、より好ましくはガラクトースを酸化することによって修飾される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記末端糖単位が、末端シアル酸の部分的なまたは完全な（酵素的および／または化学的）除去後に酸化される、請求項２５に記載の方法。
  27. ステップｃ）において、前記修飾ＨＡＳが、前記酸化された末端糖単位にコンジュゲートされる、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 前記ＥＰＯが、少なくとも１つの遊離ＳＨ基を含む、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記遊離ＳＨ基が、元から存在するシステインまたは付加されたシステインの一部である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を持ち、前記元から存在するシステインがシステイン２９および／または３３である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記システイン３３が別のアミノ酸で置換され、ステップｃ）において、前記修飾ＨＡＳがシステイン２９にコンジュゲートされる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記システイン２９が別のアミノ酸で置換され、ステップｃ）において、前記修飾ＨＡＳがシステイン３３にコンジュゲートされる、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記付加されたシステインが、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯであり、前記置換されたアミノ酸残基がセリン１２６である、請求項３３に記載の方法。
  35. ステップｃ）において、前記修飾ＨＡＳが、付加されたシステインにコンジュゲートされる、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 酸化された糖質部分にＨＡＳをコンジュゲートする場合は、ＨＡＳが遊離のヒドラジド、ヒドロキシルアミン、チオールまたはセミカルバジド官能基を含むように、また、ＨＡＳをＳＨ基にコンジュゲートする場合は、ＨＡＳが遊離のマレイミド、ジスルフィドまたはハロゲン化アセトアミド官能基を含むように、ＨＡＳが修飾される、請求項１９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ステップｃ）が少なくとも１０重量％のＨ2Ｏを含む反応媒体中で行われる、請求項１９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ＨＡＳが、リンカー分子を介してＥＰＯにコンジュゲートされる、請求項１９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンまたはヒドロキシブチルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項１９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＨＥＳが、請求項１７または１８に記載の性質を有する、請求項３９に記載の方法。
  41. 請求項１９〜４０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるＨＡＳ−ＥＰＯ。
  42. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の特徴を有する、請求項４１に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  43. ヒトまたは動物の身体を処置する方法で使用するための、請求項１〜１８、４１または４２のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯ。
  44. 請求項１〜１８、４１または４２のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯを含む医薬組成物。
  45. 少なくとも１つの医薬的に許容できる担体をさらに含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
  46. 貧血障害または造血機能不全障害を処置するための医薬品の製造を目的とする、請求項１〜１８、４１または４２のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ＥＰＯの使用。
  47. １個以上のヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）分子を含み、該ＨＡＳが
    ａ）糖質部分、または
    ｂ）チオエーテル、
    を介してポリペプチドにコンジュゲートされている、ＨＡＳ−ポリペプチドコンジュゲート（ＨＡＳ−ポリペプチド）。
  48. 前記ポリペプチドが、ヒト由来のポリペプチドである、請求項４７に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  49. 前記ポリペプチドが、エリスロポエチン、インターロイキン、特にインターロイキン−２、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、インターロイキン６および治療用抗体を含む群より選択される、請求項４７または４８に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  50. 前記ポリペプチドが、Ｎ−結合および／またはＯ−結合グリコシル化によってそのポリペプチドに取り付けられた１個以上の糖質側鎖を含む、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  51. 前記糖質側鎖が、哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞での生産中にポリペプチドに取り付けられている、請求項５０に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  52. 前記ＨＡＳが、リンカー分子を介してポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項４７〜５１にいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  53. 前記ＨＡＳが、糖質側鎖の一部であり好ましくは酸化されている糖質部分を介して、ポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  54. 前記ＨＡＳが、糖質側鎖のガラクトース残基にコンジュゲートされている、請求項５３に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  55. 前記チオエーテルのＳ原子が、元から存在するシステインまたは付加されたシステインに由来する、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  56. 前記付加されたシステインが、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものである、請求項５５に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  57. ポリペプチド１分子あたり１〜１２個、好ましくは１〜６個または１〜３個、最も好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含む、請求項４７〜５６のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  58. 前記ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンからなる群より選択される、請求項４７〜５７のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  59. 前記ＨＡＳがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項５８に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  60. ＨＥＳが、１〜３００ｋＤａ、好ましくは５〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項５９に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  61. 前記ＨＥＳが、ヒドロキシエチル基に関して、０．１〜０．８のモル置換度および２〜２０の範囲のＣ2：Ｃ6置換比を示す、請求項５９または６０に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  62. ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−ポリペプチドコンジュゲート（ＨＡＳ−ポリペプチド）の製造方法であって、
    ｄ）修飾ＨＡＳと反応可能なポリペプチドを提供するステップ、
    ｅ）ステップａ）のポリペプチドと反応可能な修飾ＨＡＳを提供するステップ、および
    ｆ）ステップａ）のポリペプチドをステップｂ）のＨＡＳと反応させるステップであって、１個以上のＨＡＳ分子を含み、該ＨＡＳがポリペプチドに、
    ｉ）糖質部分、または
    ｉｉ）チオエーテル
    を介してコンジュゲートされているＨＡＳ−ポリペプチドが得られるステップ、
    を含む方法。
  63. 前記ポリペプチドが、ヒト由来のポリペプチドである、請求項６２の方法。
  64. 前記ポリペプチドが、エリスロポエチン、インターロイキン、特にインターロイキン−２、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、インターロイキン６および治療用抗体を含む群より選択される、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記ポリペプチドが、組換え生産される、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記ポリペプチドが、Ｎ−結合および／またはＯ−結合グリコシル化によってそのポリペプチドに取り付けられた１個以上の糖質側鎖を含む、請求項６２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記哺乳類（特にヒト）細胞、昆虫細胞または酵母細胞での生産中に糖質側鎖がポリペプチドに取り付けられている、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ＨＡＳが、糖質側鎖の一部である糖質部分を介してポリペプチドにコンジュゲートされる、請求項６６または６７に記載の方法。
  69. ステップａ）において、前記ポリペプチドがポリペプチドの１個以上の糖質側鎖の少なくとも１個の糖質部分、好ましくは少なくとも１個の末端糖単位、より好ましくはガラクトースを酸化することによって修飾される、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記末端糖単位が、末端シアル酸の部分的なまたは完全な（酵素的および／または化学的）除去後に酸化される、請求項６９に記載の方法。
  71. ステップｃ）において、前記修飾ＨＡＳが、前記酸化された末端糖単位にコンジュゲートされる、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. 前記ポリペプチドが少なくとも１個の遊離ＳＨ基を含む、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記遊離ＳＨ基が、元から存在するシステインまたは付加されたシステインの一部である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記付加されたシステインが、元から存在するアミノ酸をシステインで置換することによって付加されたものである、請求項６２〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. ステップｃ）において、前記修飾ＨＡＳが、付加されたシステインにコンジュゲートされる、請求項７３または７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 酸化された糖質部分にＨＡＳをコンジュゲートする場合は、ＨＡＳが遊離のヒドラジド、ヒドロキシルアミン、チオールまたはセミカルバジド官能基を含むように、また、ＨＡＳをＳＨ基にコンジュゲートする場合は、ＨＡＳが遊離のマレイミド、ジスルフィドまたはハロゲン化アセトアミド官能基を含むように、ＨＡＳが修飾される、請求項６２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. ステップｃ）が少なくとも１０重量％のＨ2Ｏを含む反応媒体中で行われる、請求項６２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ＨＡＳが、リンカー分子を介してポリペプチドにコンジュゲートされる、請求項６２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンまたはヒドロキシブチルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項６２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ＨＡＳが、請求項６０または６１のいずれか一項に記載の性質を有する、請求項７９に記載の方法。
  81. 請求項６２〜８０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるＨＡＳ−ポリペプチド。
  82. 請求項４７〜６１のいずれか一項に記載の特徴を有する、請求項４１に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  83. ヒトまたは動物の身体を処置する方法で使用するための、請求項４７〜６１、８１または８２のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチド。
  84. 請求項４７〜６１、８１または８２のいずれか一項に記載のＨＡＳ−ポリペプチドを含む医薬組成物。
  85. 少なくとも１つの医薬的に許容できる担体をさらに含む、請求項８４に記載の医薬組成物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006505635A (ja) * 2002-09-11 2006-02-16 フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法
JP2013500375A (ja) * 2009-07-27 2013-01-07 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
JP2016113626A (ja) * 2009-07-27 2016-06-23 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化

Families Citing this family (153)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
WO2004024776A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
AU2003273413A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10256558A1 (de) * 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1653991A2 (en) * 2003-08-08 2006-05-10 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
WO2005014050A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
US20080274948A1 (en) * 2003-08-08 2008-11-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of Hydroxyalkyl Starch and G-Csf
US8754031B2 (en) 2004-03-08 2014-06-17 Oncolix, Inc. Use of prolactin receptor antagonists in combination with an agent that inactivates the HER2/neu signaling pathway
TWI417303B (zh) 2004-03-11 2013-12-01 Fresenius Kabi De Gmbh 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
CN102302787A (zh) * 2004-03-11 2012-01-04 费森尤斯卡比德国有限公司 羟烷基淀粉和蛋白质的接合物
AR048918A1 (es) * 2004-03-11 2006-06-14 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxietilo y eritropoyetina
US7589063B2 (en) 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
WO2006094826A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method for coupling enzymatically activated glycoconjugates to a hydroxyalkyl starch
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
US8470963B2 (en) 2006-06-30 2013-06-25 Sku Asset Management Gmbh Multifunctional compounds for pharmaceutical purposes
ATE467642T1 (de) 2006-07-25 2010-05-15 Lipoxen Technologies Ltd Derivatisierung des granulozytenkoloniestimulierenden faktors
JP2010510794A (ja) 2006-11-28 2010-04-08 ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途
DK2101821T3 (da) * 2006-12-15 2014-10-06 Baxter Healthcare Sa Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo
PL2457919T3 (pl) 2007-01-18 2019-12-31 Genzyme Corporation Oligosacharydy zawierające grupę aminooksylową i ich koniugaty
US8383114B2 (en) 2007-09-27 2013-02-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP2219602A1 (en) 2007-11-15 2010-08-25 Amgen, Inc Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
CN104888264B (zh) 2008-01-14 2018-01-09 北京环球利康科技有限公司 生物相容性止血、防粘连、促愈合、外科封闭的变性淀粉材料
EP2574628B1 (en) 2008-01-25 2015-05-20 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
CA2722425A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Surmodics, Inc. Poly-.alpha.(1-4)glucopyranose-based matrices with hydrazide crosslinking
EP2294087B1 (en) 2008-05-01 2014-05-14 Amgen, Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
PE20110426A1 (es) 2008-07-23 2011-07-01 Ambrx Inc Polipeptidos g-csf bovinos modificados
US20110166063A1 (en) 2008-09-19 2011-07-07 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
CN102215869B (zh) 2008-11-13 2015-05-13 通用医疗公司 用于通过调整bmp-6来调节铁稳态的方法和组合物
RU2519225C2 (ru) 2008-12-06 2014-06-10 Б. Браун Мельзунген Аг Опосредующие транспорт коллоидные лекарственные соединения
US8648046B2 (en) 2009-02-26 2014-02-11 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
AU2010218261B2 (en) 2009-02-26 2015-08-20 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
BRPI1013656B1 (pt) * 2009-03-31 2019-04-30 B. Braun Melsungen Ag Produto de ligação e seu uso, formulação farmacêutica e processo para preparar um produto de ligação
CN102497884A (zh) 2009-07-27 2012-06-13 巴克斯特国际公司 凝血蛋白缀合物
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
CA2784793A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
CA2784800A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
FI2575935T4 (fi) 2010-06-07 2023-11-23 Amgen Inc Lääkeaineen vapautuslaite
EP2590678A1 (en) * 2010-07-09 2013-05-15 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
EP2591009A1 (en) 2010-07-09 2013-05-15 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Nitric oxide delivering hydroxyalkyl starch derivatives
US20130178437A1 (en) * 2010-07-09 2013-07-11 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
EP2590681A1 (en) * 2010-07-09 2013-05-15 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
LT2598172T (lt) 2010-07-30 2019-08-26 Baxalta GmbH Nukleofiliniai katalizatoriai, skirti oksiminei jungčiai sudaryti
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
NZ612320A (en) 2010-12-22 2015-06-26 Baxter Healthcare Sa Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
US10092706B2 (en) 2011-04-20 2018-10-09 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
JP2014520094A (ja) 2011-05-27 2014-08-21 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 増加した半減期を有する治療用タンパク質およびそれを調製する方法
WO2012170396A1 (en) * 2011-06-07 2012-12-13 Philadelphia Health & Education Corporation Spla2 monitoring strip
WO2013021056A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Ludwig-Maximilians-Universität München Method for the controlled intracellular delivery of nucleic acids
EP3045188B1 (en) 2011-10-14 2020-12-23 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2013113503A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an oligonucleotide
AU2013204754C1 (en) 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
CA2884887C (en) 2012-11-21 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device including insertion member and reservoir
US10202469B2 (en) * 2012-11-30 2019-02-12 Glytech, Inc. Sugar chain-attached linker, compound containing sugar chain-attached linker and physiologically active substance or salt thereof, and method for producing same
BR112015022123B1 (pt) 2013-03-15 2022-08-09 Intrinsic Lifesciences, Llc Anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à hepcidina ou um peptídeo de hepcidina, uso, meio contentor e kit
EP3593839A1 (en) 2013-03-15 2020-01-15 Amgen Inc. Drug cassette
US10092703B2 (en) 2013-03-15 2018-10-09 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
AU2014234271A1 (en) * 2013-03-20 2015-10-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Process for the preparation of thiol functionalized hydroxyalkyl starch derivatives
WO2014147175A1 (en) * 2013-03-20 2014-09-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
US20160311934A1 (en) * 2013-03-20 2016-10-27 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
BR112015024282B1 (pt) 2013-03-22 2022-05-17 Amgen Inc Injetor e método de montagem do injetor
EP3050893B1 (en) 2013-09-24 2020-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Glycoamino acid and use thereof
EP3060281B1 (en) 2013-10-24 2019-01-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
AU2014340171B2 (en) 2013-10-24 2019-05-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
JP2017512133A (ja) * 2014-02-10 2017-05-18 ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッド 液相フッ素化のための反応器デザイン
EP3114138B1 (en) 2014-03-05 2021-11-17 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
WO2015171777A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN106488782B (zh) 2014-06-03 2021-03-09 安姆根有限公司 用于辅助药物递送装置的用户的装置和方法
CN104072608A (zh) * 2014-06-23 2014-10-01 山东齐都药业有限公司 含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
NZ730186A (en) 2014-09-22 2020-04-24 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
AU2015332557B2 (en) 2014-10-14 2020-05-14 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
WO2016100055A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US10583245B2 (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
JP2018512184A (ja) 2015-02-27 2018-05-17 アムジエン・インコーポレーテツド 針ガードの移動に対する抵抗力の閾値が調整可能な針ガード機構を備えた薬物送達装置
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
CA3018426A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US20190169268A1 (en) 2016-05-20 2019-06-06 Octapharma Ag Glycosylated vwf fusion proteins with improved pharmacokinetics
GB201609083D0 (en) 2016-05-24 2016-07-06 Syntab Therapeutics Gmbh Synthetic compound
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
WO2018136398A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
WO2018152073A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
MX2019010544A (es) 2017-03-06 2019-10-21 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con caracteristica de prevencion de la activacion.
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
WO2018172219A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
MX2019011416A (es) 2017-03-28 2019-11-01 Amgen Inc Sistema y metodo para conjunto de jeringa y vastago de embolo.
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MA49461A (fr) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc Dispositif électronique d'administration de médicament comprenant un bouchon activé par un ensemble commutateur
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
WO2019018169A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Amgen Inc. PERMEABLE GAS SEALING ELEMENT FOR MEDICINE CONTAINER AND METHODS OF ASSEMBLY
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
EP3691716B1 (en) 2017-10-06 2023-11-29 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
JP2021501616A (ja) 2017-11-06 2021-01-21 アムジエン・インコーポレーテツド 配置及び流量検出を備える薬物送達デバイス
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
JP7247174B2 (ja) 2017-11-10 2023-03-28 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスのプランジャ
CA3084486A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
CN108503718B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用
CN108219019B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种巯基化羟乙基淀粉及其修饰的纳米材料和制备方法
CN108403641B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种载药纳米材料及其制备方法
US11191806B2 (en) * 2018-05-04 2021-12-07 Boris Farber Polymyxin-based pharmaceutical composition for treating infectious diseases
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
CN112469454B (zh) 2018-07-24 2024-01-26 安进公司 用于施用药物的输送装置
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
IL281469B1 (en) 2018-09-28 2024-04-01 Amgen Inc Assembling a memory alloy ejector activation assembly for a drug delivery device
AR116679A1 (es) 2018-10-02 2021-06-02 Amgen Inc Sistemas de inyección para la administración de fármacos con transmisión de fuerza interna
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
TW202031306A (zh) 2018-10-15 2020-09-01 美商安進公司 用於藥物遞送裝置之平台組裝方法
KR20210076935A (ko) 2018-10-15 2021-06-24 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
WO2020092056A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
CN111157736A (zh) * 2018-11-08 2020-05-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法
JP2022529319A (ja) 2019-04-24 2022-06-21 アムジエン・インコーポレーテツド シリンジ滅菌確認アセンブリ及び方法
JP2022545227A (ja) 2019-08-23 2022-10-26 アムジエン・インコーポレーテツド 構成可能な針シールド係合構成要素を備えた薬物送達デバイス及び関連方法
EP4341161A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (ja)
US3191291A (en) 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
CH385787A (de) 1960-10-04 1964-09-15 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von nassechten Färbungen auf Cellulosetextilmaterialien
GB1385403A (en) 1971-07-14 1975-02-26 Unilever Ltd Process for preparing oxidised carbohydrates
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4061736A (en) * 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001401A (en) 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4001200A (en) 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4053590A (en) 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) * 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
EP0019403B1 (en) * 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
US4454161A (en) 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
FI82266C (fi) 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
IE58011B1 (en) 1983-05-27 1993-06-16 Texas A & M Univ Sys Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
IN163192B (ja) 1983-10-11 1988-08-20 Fidia Spa
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
DE3501616A1 (de) 1985-01-17 1986-07-17 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Verfahren zur herstellung von hydroxylamin-derivaten
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5217998A (en) * 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US4863964A (en) * 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JP2594123B2 (ja) 1987-09-12 1997-03-26 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US6261800B1 (en) * 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE19975071I2 (de) 1989-06-16 2000-02-03 Fresenius Ag Hydroxyethylstaerke als Plasmaexpander Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
JP2838800B2 (ja) 1989-09-02 1998-12-16 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
WO1991005867A1 (en) 1989-10-13 1991-05-02 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
JP2975632B2 (ja) 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
AU5098193A (en) * 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
FI935485A (fi) 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG-hydratsoni- ja PEG-oksiimisidoksen muodostavat reagenssit ja niiden proteiinijohdannaiset
CA2110543A1 (en) 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
EP0601417A3 (de) * 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
DK0646130T3 (da) 1993-03-16 1997-06-02 Hemosol Inc Selektiv tværbinding af hæmoglobiner ved hjælp af oxiderede, ringåbnede saccharider
AU7097094A (en) * 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
CN1057534C (zh) 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
US5840900A (en) 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
JPH07188291A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Hayashibara Biochem Lab Inc 蛋白質とその製造方法並びに用途
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6214331B1 (en) 1995-06-06 2001-04-10 C. R. Bard, Inc. Process for the preparation of aqueous dispersions of particles of water-soluble polymers and the particles obtained
US5736533A (en) 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
WO1997021452A2 (en) 1995-12-14 1997-06-19 Advanced Magnetics, Inc. Macromolecular prodrugs of nucleotide analogs
US5723589A (en) 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
ATE314843T1 (de) 1996-03-12 2006-02-15 Pg Txl Co Lp Wasserlösliche paclitaxel-prodrogen
US5696152A (en) 1996-05-07 1997-12-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Taxol composition for use as organ preservation and cardioplegic agents
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE19628705A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
US5851984A (en) 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US6011008A (en) 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) * 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
WO1999007719A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Utah Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US5847110A (en) 1997-08-15 1998-12-08 Biomedical Frontiers, Inc. Method of reducing a schiff base
US6875594B2 (en) * 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
WO1999045163A1 (fr) 1998-03-05 1999-09-10 Asahi Glass Company Ltd. Cible de pulverisation cathodique, film conducteur transparent et son procede de production
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6261594B1 (en) 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
EP1035137A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7279176B1 (en) 1999-09-02 2007-10-09 Rice University Nitric oxide-producing hydrogel materials
US20020065410A1 (en) 1999-12-02 2002-05-30 Antrim Richard L. Branched starches and branched starch hydrolyzates
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2001294601A (ja) 2000-04-11 2001-10-23 Akita Prefecture 高度分岐澱粉と該高度分岐澱粉の製造方法
JP2002003398A (ja) 2000-04-17 2002-01-09 Ltt Institute Co Ltd 徐放製剤、その製造法及びワクチン
DE10023051B4 (de) * 2000-05-11 2004-02-19 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin, dessen Verwendung und Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin enthaltende diagnostische Zubereitung
FR2811967B1 (fr) 2000-07-24 2002-12-13 Cebal Tube muni d'une tete de fixation pour divers bouchages et les divers bouchages munis de moyens de fixation sur ledit tube
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
US6417347B1 (en) 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
EP1318827A4 (en) 2000-09-08 2005-09-14 Gryphon Therapeutics Inc POLYMER MODIFIED SYNTHESIS PROTEINS
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7629456B2 (en) 2001-10-26 2009-12-08 Noxxon Pharma Ag Modified L-nucleic acid
US6375846B1 (en) * 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
DE10207072A1 (de) * 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
WO2003076490A1 (fr) 2002-03-13 2003-09-18 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Derive polymere hydrophile a ramification de type y et procede de preparation d'un composite medical contenant le compose precite
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
WO2003102018A2 (en) 2002-06-03 2003-12-11 The Institute For Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
EP1591467A1 (en) 2002-09-09 2005-11-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
AP2005003249A0 (en) 2002-09-09 2005-03-31 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals.
DE02020425T1 (de) 2002-09-11 2004-07-15 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hasylierte Polypeptide, besonders hasyliertes Erythropoietin
WO2004024776A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
DE10242076A1 (de) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
AU2003273413A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1653991A2 (en) 2003-08-08 2006-05-10 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
US20080274948A1 (en) 2003-08-08 2008-11-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of Hydroxyalkyl Starch and G-Csf
WO2005014050A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
WO2005072778A2 (en) 2004-01-29 2005-08-11 Biosynexus, Inc. Use of amino-oxy functional groups in the preparation of vaccines conjugates
DE102004009783A1 (de) 2004-02-28 2005-09-15 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Hyperverzweigte Stärkefraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Konjugate mit pharmazeutischen Wirkstoffen
AR048918A1 (es) 2004-03-11 2006-06-14 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxietilo y eritropoyetina
TWI417303B (zh) 2004-03-11 2013-12-01 Fresenius Kabi De Gmbh 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
CN102302787A (zh) 2004-03-11 2012-01-04 费森尤斯卡比德国有限公司 羟烷基淀粉和蛋白质的接合物
WO2005112954A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 William Marsh Rice University Nitric oxide releasing compositions and associated methods
AU2006222187A1 (en) 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
CA2628055C (en) 2005-10-31 2013-10-01 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services Polysaccharide-derived nitric oxide-releasing carbon-bound diazeniumdiolates
JP2009093397A (ja) 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
WO2010042638A2 (en) 2008-10-07 2010-04-15 Young Bok Lee Hpma - docetaxel or gemcitabine conjugates and uses therefore

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006505635A (ja) * 2002-09-11 2006-02-16 フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法
JP2006511635A (ja) * 2002-09-11 2006-04-06 フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプン誘導体
JP4688494B2 (ja) * 2002-09-11 2011-05-25 フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法
JP4692958B2 (ja) * 2002-09-11 2011-06-01 フレセニウス・カビ・ドイッチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプン誘導体
JP2013500375A (ja) * 2009-07-27 2013-01-07 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
JP2016113626A (ja) * 2009-07-27 2016-06-23 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
US9795683B2 (en) 2009-07-27 2017-10-24 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
JP2018024882A (ja) * 2009-07-27 2018-02-15 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
JP2020037701A (ja) * 2009-07-27 2020-03-12 バクサルタ インコーポレイテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
US10772968B2 (en) 2009-07-27 2020-09-15 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
JP2022058911A (ja) * 2009-07-27 2022-04-12 バクサルタ インコーポレイテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化

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Publication number Publication date
PT1398328E (pt) 2010-02-19
IL166931A (en) 2012-06-28
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ES2399006T3 (es) 2013-03-25
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CA2496317C (en) 2014-02-18
US20110054152A1 (en) 2011-03-03
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DE03020424T1 (de) 2004-07-15
US7815893B2 (en) 2010-10-19
ES2213507T3 (es) 2010-04-15
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EP2272865A2 (en) 2011-01-12
KR101045401B1 (ko) 2011-06-30
AU2003260393A1 (en) 2004-04-30
ES2213506T1 (es) 2004-09-01
AU2003253399A1 (en) 2004-04-30
JP2011089125A (ja) 2011-05-06
KR101045422B1 (ko) 2011-06-30
EP2143736A1 (en) 2010-01-13
US20120046240A9 (en) 2012-02-23
EP1398322A1 (en) 2004-03-17
PL217085B1 (pl) 2014-06-30
PL374969A1 (en) 2005-11-14
PT1398327E (pt) 2008-10-31
DE03020425T1 (de) 2004-07-15
DE60304640D1 (de) 2006-05-24
DK1398327T3 (da) 2008-11-10
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DE20321836U1 (de) 2011-04-07
AR041097A1 (es) 2005-05-04
JP5455821B2 (ja) 2014-03-26
DK1398322T3 (da) 2006-08-21
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US20060019877A1 (en) 2006-01-26
ATE406387T1 (de) 2008-09-15
DE60304640T2 (de) 2007-05-16
AU2011200158B2 (en) 2012-08-02
EP1398328B1 (en) 2009-11-18
EP2316850A3 (en) 2011-11-09
WO2004024777A1 (en) 2004-03-25
US20100317609A1 (en) 2010-12-16
ES2213506T3 (es) 2009-02-16
SI1398327T1 (sl) 2009-02-28
RU2005110423A (ru) 2006-01-20

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