TW200418875A - HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin - Google Patents

HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin Download PDF

Info

Publication number
TW200418875A
TW200418875A TW092124954A TW92124954A TW200418875A TW 200418875 A TW200418875 A TW 200418875A TW 092124954 A TW092124954 A TW 092124954A TW 92124954 A TW92124954 A TW 92124954A TW 200418875 A TW200418875 A TW 200418875A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
epo
scope
patent application
polypeptide
item
Prior art date
Application number
TW092124954A
Other languages
English (en)
Inventor
Harald S Conradt
Eckart Grabenhorst
Manfred Nimtz
Norbert Zander
Ronald Frank
Eichner Wolfram
Original Assignee
Fresenius Kabi De Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=31995520&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW200418875(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from EP02020425A external-priority patent/EP1400533A1/en
Application filed by Fresenius Kabi De Gmbh filed Critical Fresenius Kabi De Gmbh
Publication of TW200418875A publication Critical patent/TW200418875A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/08—Ethers
    • C08B31/12—Ethers having alkyl or cycloalkyl radicals substituted by heteroatoms, e.g. hydroxyalkyl or carboxyalkyl starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/08—Ethers
    • C08B31/10—Alkyl or cycloalkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/003—Crosslinking of starch
    • C08B31/006—Crosslinking of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/08—Ethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/18—Oxidised starch
    • C08B31/185—Derivatives of oxidised starch, e.g. crosslinked oxidised starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

200418875 A7 B7 五、發明說明（1) 本發明係關於多肽，特別是共軛接合於羥烷基澱粉 (HAS)(尤其是羥乙基澱粉)之紅血球生成素。 應用多肽’尤其是酵素類或細胞激素類，至循環系統 以達到特別的生理效果是現代醫學上被充分已知的方 5 式。 紅血球生成素(EPO)是紅血球樣的細胞前身（erythroid progenitor)成熟變成紅血球所需要的一種醣蛋白荷爾蒙， 於人類成年人中，其係產生於腎臟中，EPO在循環系統 中對於調節紅血球細胞的值是極重要的，明顯的低的組 10織氧值會喚起增加EP0的生合成，其再回頭刺激紅血球 生成，例如，在慢性腎衰竭中所見的喪失腎功能時，典 型地會導致減少EPO的生合成並伴隨減少紅血球。 紅血球生成素是一種約為34,000 Da的酸性醣蛋白荷 爾蒙，人類紅血球生成素是一種包含166個胺基酸的多 15肽’為天然存在的單體型式(Lin et al” 1985，PNAS 82, 7580-7584, EP 148 605 B2, EP 411 678 B2)，其鑑定、無性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 繁殖與編碼紅血球生成素基因的表現被揭露於，例如， U.S·專利4,703,008，從支持含重組紅血球生成素質粒的 哺乳類細胞生長之細胞培養基純化重組紅血球生成素的 20 方法被揭露於，例如：美國專利4,667,016。 在此技術領域中通常相信，.EP0在活體内的生物活 性主要受束缚至EP0的唾液酸的程度影響（見，例如Ep 428 267 B1) ’理論上，在>5炭水化合物連結至與糖化 位置的末端可有14個分子的唾液酸被束缚於一個分子的 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（2) EPO,為得到高度唾液酸化的EPO製劑有必要經歷極精 緻的純化步驟。 有關紅血球生成素的詳細資訊可參考Krantz, Erythropoietin, 1991，Blood, 77(3):419-34 (Review) and 5 Cerami, Beyond erythropoiesis: novel application for recombinant human erythopoietin, 2001, Semin Hematol., (3 Suppl 7):33-9 (Review)。 應用多肽與酵素方面為人所知的問題是：這些蛋白質 常呈現不令人滿意的安定性問題’特別地，紅血球生成 10 素具有相對短的血漿半生期（Spivak and Hogans，1989,
Blood 73, 90; McMahon et al·，1990, Blood 76, 1718)，這表 示治療時其在血漿中的濃度將迅速地降低且需重覆地進 行靜脈投與，再者，某些情況下，可觀察到對於這些多 肽有免疫反應發生。 15 通常已被接受，當多肽被偶合至聚合性分子時，可以 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 改善多肽的安定性與減少對抗這些多肽的免疫反應，WO 94/28024揭露，以聚乙二醇(PEG)修飾的生理活性之多肽 顯現減弱的免疫性與抗原性且在血流中，其較未經共軛 結合的蛋白質循環得更久，即，具有更長的廓清率。 20 然而，PEG-藥物共輛接合物呈現許多的缺點，例 如，它們不出現在活體降解路徑中可被要素辨認之天然 結構’故’除了 PEG-共輛接合物，已有其他的共輛接合 物與蛋白質聚合物被製造，供交錯連結不同蛋白質與巨 分子（例如聚合酶）的多種方法已被揭露於文獻中（例如， -4- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 Α7 Β7 五、發明說明（3 ) linking, 1993, CRCS，Inc.) 〇 羥乙基殿粉(HES)是一種天然出現的枝鏈澱粉之衍生 物，且其在體内可被α-澱粉酶降解，HES-蛋白質共輛接 5 合物的製備在文獻中已有記載（參考，例如^^8- hemoglobin-conjugates in DE 26 16 086 或 DE 26 46 854) ° DE 26 46 854揭露血紅素接合至HES的方法，這些 方法中，HES是與過蛾酸納反應，產生二齡，以之接至 血紅素，相對地，DE 26 16 086揭露血紅素接合至HES 1〇 的方法為，令其中第一種交錯結合劑(例如，溴氰)被接合 至HES ’接者讓血紅素接合至此中間產物。 HES是一種經取代的碳水化合物聚合物枝鏈澱粉的 衍生物，其係以至多達95%的重量比例濃度存在於玉米 澱粉中，HES呈現有利的生物特性且被用作為血液容積 15 替代劑與被用在臨床中的企液稀釋療法(s〇mmermeyer et al” 1987, Krankenhauspharmazide，8(8)，271 -278; Weidler et al·，1991，Arzneim.-Forschung/Drug Res·，41，494-498) o 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 枝鏈澱粉包括葡萄糖部位，其中存在的主鏈為a-l，4_ 糖苷鍵結與分枝部位為α-1，6-糖苷鍵結，此分子的物理一 20 化學性質主要由糖苷鍵結的型態決定，由於有缺口的 1，4-糖苷鍵結，因此產生以約六個葡萄糖-單體為一圈的螺 旋形結構。 此聚合物的物理-化學性質以及生化學性質可經由取 代作用加以修飾，經由鹼性經基乙基化反應可引入經乙 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7
基，此羥基乙基化反應，經改編反應條件，有可能於未 經取代的葡萄糖單體上，開發分別的羥基之不：皮應 性，基於這鮮實，精財技藝者能影_代樣極 致。 5 故，HES主要受分子量分佈與取代度_，有兩種 可能性用於描述取代度： 1·取代度可被描述成經取代的葡萄糖單體的部位相對於 全部的葡萄糖部位(DS)。 2·取代度可被描述成“莫耳取代度，，（MS)，其中指出每 10 葡萄糖部位中的羥乙基基團數目。 HES是以聚合分散的組成物出現，其中各分子的聚 合度、數目與分枝位置的樣式與取代度樣式各自不同， HES因此是具不同分子量的化合物之混合物，因此，特 別的HES溶液是由平均分子量及統計方式測定，於本文 15内，Μη指的是根據分子的數目之算術平均值，或者， Mw之重量平均值代表根據HES的質量之平均單位。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 文獻中被揭露的HES-藥物共軛接合物遭遇的缺點 為：HES不是位置-專性地共輊接合於藥物，因此，此種 接合導致非常雜相的產物，其中的組分可能因接合時的 20 二度空間結構破壞而變成不具活性。 簡言之，仍有進一步需要改善多肽的穩定性及/或生 物活性’尤其適用於紅血球生成素，其中具高度唾液酸 並因此為具高活性之等形物必須純化自具低度唾液酸之 等形物（見EP 428 267 B1)，故，如果能得到可提供高度 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇x297公釐） 200418875 A7 ___ B7 五、發明說明（5) 活性的多肽類而不需全面地再純化的製造方法，將是極 為有利的不幸地，在細_或尾蟲細胞中的多肤生產常 是相當困難的，乃由於常無法製成具適當折疊、天然結 構的多肽且缺乏適當的糖化作用。 5 故，本發明的目的為提供在活體内具高生物活性、減 少成本下易於生產之多肽衍生物，尤其是紅血球生成素 衍生物，此外，本發明的另一目的為提供製備多肽衍生 物的方法，係易於操作且能製備出具高生物活性的產物 之方法，本發明的另一目的為提供藥學組成物，其係包 10 含具高生物活性之多肽衍生物類。 根據本發明的一種看法’問題可以利用包含一或多個 HAS分子的經基烧基澱粉(HAS)-紅血球生成素(ep〇)_共 軛接合物(HAS-EPO)解決，其中各HAS共軛接合至EP0 是經由 15 a)碳水化合物部分；或 b)硫鱗。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的HAS-EPO的優點為’相較於共辆接合前的 紅血球生成素，它呈現改進的生物穩定性，此外，它較 標準的BRP EPO呈現較高的生物活性，這主要是由於 20 HAS-EPO較少，甚至不被肝臟或腎臟的移除系統辨識並 因此能持續留在循環系統達更久的時間，此外，既然 HAS是位置·專性地附接，藉共輛接合HAS至EPO而導 致摧毀EPO的活體内生物活性的危險性就會減少了。 本發明的HAS-EPO具有主要的兩組分，即相接合的 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 _____________________________ B7 五、發明說明（6) 紅血球生成素(EPO)-多肽與羥基烷基澱粉(HAS)。 EPO可以是屬於任何人種（見，例如In〇ue，Wada， Takeuchi，1994 ’從貧血病人的尿液純化具高體内活性的 人類紅血球生成素之改進的方法，Bi〇1 pharm Bull. 17(2)， 5 180-4，Miyake，Kung，Goldwasser，1977，人類紅血球生成 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 素的純化，J Biol Chem·，252(15)，5558-64)或其他哺乳類 來源且可得自經純化天然出現的來源，例如人類腎臟、 胚胎的人類肝臟或動物，宜為猴子腎臟，此外，“紅血 球生成素”或“EPO”也涵蓋EPO變體(variant)，其為其 10中一或多個胺基酸(例如1至25，較佳為1至10，更佳為 1至5 ’最好為1或2個)被他種的胺基酸取代且呈現紅血 球生成素活性者(參考，例如EP 640 619 B1)，紅血球生 成素活性的測定法被揭露於文獻（試管活性的測定可參 考，例如 Fibi et al·，1991，Blood，77, 1203 ff; Kitamura et 15 al，1989, J· Cell Phys·，140, 323-334 ;活體内的 EPO 活性 測定可參考 Ph· Eur· 2001, 911-917; Ph. Eur. 2000，1316 Erythropoietini solutio concentrata，780-785 ;歐洲藥典 (1996/2000);歐洲藥典，19%，紅血球生成素濃縮的溶 液 ’ Pharmaeuropa” 8，371-377; Fibi，Hermentin，Pauly， 20 Lauffer，Zettlmeissl·，1995，從 BHK-21 細胞分泌的重組之 人類紅血球的N-與〇-糖化的muteins，Blood，85(5)，1229-36; (EPO與修飾的EPO型在第1，2與3天被注射入雌性 NMRI小鼠(相當於蛋白質量50奈克/小鼠），第4天採取 血樣並測定網織紅細胞的量)），其他已公開資料用於測定 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（7) EPO 的活性之試驗為 Barbone，Aparicio，Anderson， Natarajan，Ritchie，1994，測定網織紅細胞作為紅血球生成 素的生物分析，J. Pharm· Biomed· Anal.，12(4)，515_22; Bowen，Gulligan，Beguin，Kendall，Villis，1994，配合自動 5 化的網織紅細胞參數，使用血清鐵傳遞蛋白受體與紅血 球生成素濃度評估脊髓發育不良症中之有效的與總紅血 球生成，Leukemi，8(1)，151-5; Delorme，Lorenzini，Giffm， Martin, Jacobsen，Boone, Elliott, 1992 ;糖化作用在分泌與 紅血球生成素的生物活性的角色，Biochemistry，31(41)， 10 9871-6; Higuchi，Oh-eda，Kuboniwa，Tomonoh，Shimonaka， 經濟部智慧財產局員工消費合作钍印製
Ochi，1992 ;糖鏈在表現人類紅血球生成素的生物活性的 角色，J· Biol· Chem·，267(11)，7703_9; Yamaguchi, Akai， Kawanishi，Ueda，Masuda，Sasaki，1991 ;人類紅血球生成 素中，位置導向的移除N-糖化作用位置對其產生與生物 15 性質的影響，J. Biol· Chem·，266(30)，20434-9; Takeuchi， Inoue，Strickland，Kubota，Wada，Shimizu，Hoshi，Kozutsumi， Takasaki，Kobata，1989;中國倉鼠卵巢細胞中產生的重組 的人類紅血球生成素之糖鏈結構與生物活性間的相關 性，Proc· Natl. Acad· Sci. USA，85(20)，7819-22; Kurtz， 20 Eckardt，1989 ;紅血球生成素的分析方法，Nephron.， 51(1)，11-4 (German); Zucali，Sulkowski，1985，於控制的-孔(pore)玻璃與矽酸上進行人類尿紅血球生成素的純化， Exp· Hematol·，13(3)，833-7; Krystal，1983，紅血球母細胞 提昇因子(EEF)的物理與生物的鑑定，來自紅血球生成素 紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 __B7 五、發明說明（Ο "" ^ 於血衆中之-種後期作用的紅血球生成的刺激物，師· Hematol·，11(1)，18-31。 較佳地’ EPO是經重組地產生，這包括產生於真核 細胞或原核細胞，宜為哺乳類、昆蟲、酵母、細菌細胞 5或任何方便重組產生EP〇的其他細胞類型，此外，此 EPO也可被表現於徹基因的動物巾（勤於像是牛奶、 血液等等舰巾），於轉殖基@的鳥類(尤其是家禽，宜為 雞)之卵中，或於轉殖基因的植物中。 多肽的重組產製為本技藝中已知者，通常，此包括以 10適當的表現媒質轉移感染宿主細胞，在能產生多肽的條 件下培育宿主細胞並從宿主細胞純化多肽，更詳細的資 訊可參看，例如，Krystal，Pankratz，Farber，Smart，1暢， 利用快速的五步驟製程，純化人類紅血球生成素成均質 性 ’ Blood，67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, 15 Wojchowski，1989，使用桿菌病毒(baculovims)媒質產生的 重組的人類紅血球生成素的高-階表現與純化，Blood， 74(2)，652-7; EP 640 619 B1 與 EP 668 351 B1。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於一較佳具體實例中，EPO具有人類EPO的胺基酸 序列（見 EP 148 605 B2)。 20 此EPO可包含一或多個碳水化合物側鏈（宜為1-4， 較好為4個）經由N-及/或0-連結的糖化作用被附接至 EPO，即，此EPO是被糖化的，通常，當EPO被產生於 真核細胞，多肽是後轉譯地被糖化，故，碳水化合物可 能在哺乳類（特別是人類）、昆蟲或酵母細胞中生合成階段 -10- 尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（9) 被附接至EPO，糖化的EPO的結構與性質在文獻中已有 大量研究（見 EP 428 267 Bl; EP 640 619 Bl; Rush，Derby， smith，Merry，Rogers，Rohde，Katta，1995，血紅素生成素碳 水化合物結構的微異質性，Anal Chem.，67(8)，1442-52; 5 Takeuchi，Kobata，1991，人類紅血球生成素的糖鏈之結構 與功能角色，Glycobiology，1(14)，337-46(回顧）。 HAS可直接或經由聯結子(linker)共軛接合至EPO， 聯結子的本性要看HAS如何連結至EPO的方式而定，聯 結子之可能的官能基被揭露於表1及後面，許多的聯結 10 子為可購得物（例如，得自Pierce，available from Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，Germany))，一些適當的 聯結子被揭露於表2，聯結子的本質與其目的被更詳述於 產製HES-EPO的方法的單元中。 根據本發明之一較佳的HAS-EPO共軛接合物，此 15 HAS係經由碳水化合物部位共軛接合至EPO。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在本發明的說明文中，“碳水化合物部位”代表羥基 酸或經基酮類以及其化學修飾物（見R5mpp Chemielexikon， Thieme Verlag Stuttgart，Germany，9th edition 1990, Volume 9, pages 2281-2285及其中提及的文獻），此外，其也關於 20 天然發生的碳水化合物（例如葡萄糖，半乳糖，甘露糖， 唾液酸等）之衍生物，此名詞也包括其環狀結構已被打開 之化學氧化的天然出現之碳水化合物部位。 此碳水化合物部位可被直接地接至EPO多肽主支架 上，較佳地，此碳水化合物部位是碳水化合物側鏈的一 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 邛分，於此情況下，另外的碳水化合物部位可能出現於 介於HAS被連結的碳水化合物部位與Ep〇多肽主支架 間，更佳地，此破水化合物部位為碳水化合物側鏈的末 端部位。 5 於較佳的具體實例，HAS係共軛接合至碳水化合物 側鏈之半乳糖殘基，較好是碳水化合物側鏈之末端半乳 糖殘基，此半乳糖殘基可在進行氧化作用後經除去末端 唾液酸而供共輛接合（見下面）。 於更佳的具體實例，HAS係共軛接合至碳水化合物 10側鏈之唾液酸殘基，較好是碳水化合物側鏈之末端唾液 酸殘基。 此外，HAS可經由硫醚共軛接合至EPO，如下面詳 述的，S原子可被衍生自附接在EPO之任何的SH基，包 括天然的或非天然出現物兩者。
15 於較佳的具體實例，S原子可衍生自已被引入至HES 的氧化之碳水化合物部位的SH基，較好是EPO的碳水 化合物側鏈之一部分之氧化的碳水化合物部位（見下面）。 較佳地，硫醚中的S原子是衍生自天然出現的半胱胺 酸或得自加入的半胱胺酸，更佳地，EPO具有人類EPO 20的胺基酸序列且天然出現的半胱胺酸為半胱胺酸29及/或 33 ’於更佳的具體實例，HAS係共軛接合至半胱胺酸29 且半胱胺酸33被取代成另外的胺基酸，或者，HAS可能 被共軛接合至半胱胺酸33且半胱胺酸29被取代成另外 的胺基酸。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）
200418875 A7 B7 五、發明說明（u) 本發明的内文中，“加入的半胱胺酸，，一詞係指多肽 (且為EPO)包含著未存在於野生_型多肽之半胱胺酸殘 基。 本發明情況的說明文中，此半胱胺酸可能為另外加入 5 至EPO的N-或C_端的胺基酸。 此外，加入的半胱胺酸可能藉取代天然出現的胺基酸 成半胱胺酸而被加入，適當的方法可得自已知文獻（見前 面）’較佳地，依本說明文的情況，EPO為人類EPO且被 取代的胺基酸殘基為絲胺酸126。 10 HAS_EP0的第二個組分為羥烷基澱粉(HAS)。 本發明的内文中，故烧基澱粉”一詞係指經經基烧 基取代的澱粉衍生物，本說明文中，烷基可能經取代， 較佳地，經基烧基含有2-10個碳原子，更佳為含有2一4 個碳原子，“羥基烷基澱粉，，因此宜包含羥乙基澱粉， 15羥丙基澱粉與羥丁基澱粉，其中以羥乙基澱粉與羥丙基 殿粉為較佳者。 HAS的羥烧基含有至少一個oh-基。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 罗里烧基殿粉，也代表其中烧基經一個或多個取代之 衍生物，於本說明文中，較佳地，烷基為經_素（尤其是 20氟）或經芳基取代，只要HAS仍為可溶解於水中者，此 外，备燒基的終端經基可能被酯化或被鱗化，此外，經 烧基殿粉的烧基可為線型或分枝型。 此外，烷基部分也可改為直線型或分枝型經取代或無 取代之烯烴基。 -13- A7 B7
經濟部智慧財產局員K消費合作、社印製 200418875 經乙基殿粉(HES)為本發明中最佳的具體實例。 本發明說明文中，羥乙基澱粉可能具有平均分子量 (重量平均）為l_300 kDa，以5_l〇〇kDa者最佳，羥乙基殿 粉另可呈現〇·1至〇·8的莫耳取代度與以羥乙基而言，具 5 有介於C2:C6-取代度的比例為2-20。 HAS-EPO中，相對每一 EP0分子，可包含h2，宜 為1-9，1-6或1-3，最好為1-4個HAS分子，對每一 EPO分子之HAS-分子的數目可經定量碳水化合物組成分 析，可於產物水解，將所得的單醣類衍化後，使用Gc_ 10 MS 分析（見 Chaplin and Kennedy (eds)，1986，碳水化合物 分析·實際方法 ’ HIL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)，尤其是第1章，單醣類，第丨-% 頁；第2章，募醣類，第37-53頁，第3章，天然的多醣 類，第55-96頁）。 15 本發明的HAS-EPO共轭接合物可顯現如同重組體天 然的EPO之相同的試管生物活性，是由於試管生物活性 僅測量結合至EPO受體的親和性，測定試管生物活性的 方法為文獻中已知方法(如前所述）。 此外，HAS-EPO顯現較作為供進行共軛接合的起始 20 材料的EP0(未共輛接合的EPO)有較大的活體内活性，測 定活體内生物活性的方法為文獻中已知方法(如前所述）， 此外，測定活體内與試管EP0活性的分析方法被説明於 實例9與10中。 如果未共軛接合的EPO之活體内活性被設定為1〇〇°/〇 -14-
尺度週財關家標準(CNS)A4規格（210 X 297公3lT
200418875 A7 B7 五、發明說明（13) 時’ HAS-EPO共軛接合物可能顯現活體内活性為11〇至 500%，宜為 300 至 400%，或 110%至 300%，宜為 ιι〇〇/0 至200%，更好為11〇%至180%或110至15〇%，最好為 110%至 140%。 5 相比於Amgen(見EP 428 267 B1)之高度唾液酸化的 EPO ’如果高度唾液酸化的EPO之活體内活性被設定為 100%時，HAS-EPO顯現宜至少50%，更佳為至少70%， 甚至更佳為至少85%或至少95%，至少150%，至少 200%或至少300%的活體内活性，最佳地，它顯現高度唾 10 液酸化的EPO的活體内活性至少95%。 本發明的HAS_EPO共辆接合物之高活體内生物活性 主要得自相較於未共輛接合的EPO，HAS-EPO共輛接合 物保留較長的循環時間，是由於其較不易被肝臟的移除 糸統辨識且由於腎臟的麻清因較高分子量而減少之故， 15 EPO在活體内循環中的半生期的測定方法為文獻中已知 方法（Sytkowski，Lunn，Davis，Feldman，Siekman，1998，具 明顯提昇的活體内活性之人類紅血球生成素二元體，pr〇c.
Natl· Acad· Sci· USA，95(3), 1184-8)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 因此，本發明的極大優點為：提供的HAS_Ep〇可較 20目前可購得的EPO製劑投與較少的次數，標準的Ep〇製 劑一生期中至少需投與二天而本發明的HAS-EPO共輛接 合物可一星期投與二次，更好為一星期一次。 所有揭露如下的具體實例，與本發明相關的製法產製 HAS-EPO相關的EP0或HAS的性質也適用於本發明之 -15- ϋ張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格210x297公餐j----------- 200418875 A7 ___ B7 五、發明說明（14) HAS-EPO共軛接合物之性質。 羥烷基殿粉是一種澱粉的醚衍生物，除了所述的醚衍 生物，也有其他澱粉衍生物類可被使用於本發明的内涵 中，例如，有用的衍生物包含酯化的羥基團，這些衍生 5物可以是，例如具2-12個碳原子之無取代的單-或雙-羧 酸，或是其經取代的衍生物，尤其有用者為具2-6個碳原 子之無取代的單羧酸的衍生物，尤其是乙酸，其中以乙 醢基澱粉，丁基殿粉或是丙基殿粉為較佳。 此外，具2-6個碳原子之無取代的二羧酸衍生物也是 10 較佳者。 二羧酸的衍生物之情況，有用者也包括二羧酸的第二 個羧基也被酯化者，此外，二羧酸類的單烷基酯的衍生 物也適於本發明内涵。 就經取代的單-或雙竣酸類，取代基宜同於上述經取 15 代的烷基殘基中提及者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 殿粉的S旨化技術為本技藝中已知者（見，例如KLemm D· et al，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol· 2，1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especially chapter 4.4? Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9)。 20 另一方面，本發明係關於產製羥基烷基澱粉(HAS)-血 紅素生成素(EPO)-共軛接合物(HAS-EPO)的方法，係包括 以下的步驟：
a) 提供可與修飾的HAS反應之EPO b) 提供可與a)步驟的EPO反應之修飾的HAS，且 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公餐1 200418875 A7 B7 五、發明說明（15 ) c)以步驟b)之HAS與步驟a)的EPO反應，由之產生 HAS-EPO其係包含一個或多個HAS分子，其中各 HAS被共軛接合至EPO，係經由 i)碳水化合物部位；或 5 ii)硫醚。 本發明的方法的優點為，產生的HAS-EPO共軛接合 物呈現高生物的活性，此外，本發明的方法具有的優點 為，減少成本下可製得有效的EPO衍生物，由於此方法 不包含昂貴的與耗時的純化步驟導致最後的低收量，例 10 如，沒有必要純化掉唾液酸化的EPO型，其已知呈現低 或不具活體内生物活性者，特別是實例20證明，產製具 少量修飾步驟的HES-EPO呈現較標準brp EPO高3-倍 之活性。 因此，在本發明的第一步驟中，提供可與修飾的 15 HAS反應之EPO。 在本發明中，“提供” 一詞被解釋成在個別的步驟 中，可製得具所要分子特性之EPO於步驟a)及HAS於步 驟b)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在步驟a)的情況，包括從天然來源純化Ep〇以及於 20宿主細胞或有機體内重組體之產生，以及，如有必要， 將如此取得的EPO修飾。 就EPO為本發明的起始材料而言，同樣適於紅血球 血紅素為本發明的HAS-EPO共軛接合物的部分，於本内 涵中揭硌於上的較佳具體實例也適用於本發明的方 -17-
200418875 B7 A7
法。 因此，於較佳的具體實例，EPO具有人類Ep〇的胺 基酸序列。 較佳地，EPO是藉由重組產生，這包括在真核細胞 5或原核細胞中’且為哺乳類，昆蟲、酵母、細胞細胞或任 何其他細胞類型，其為方便於重組產生EP〇者，此外， EPO可被表現於轉殖基因的動物（例如於牛奶、血液等體 液），於轉殖基因的鳥類之卵中，尤其是家禽，特別是 雞，或於轉殖基因的植物中。 10 多肽的重組體生產是本技藝中已知者，通常，這包括 以適當的表現媒質轉移感染宿主細胞’在能產生多肽的條 件下培育宿主細胞與從宿主細胞純化多肽（Krystal， Pankrata，Farber，Smart，1986，藉一種快速、五步驟程序 純化人類紅血球生成素成均質性，Blood，67(1)，71-9; 15 Quelle’ Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，高水平表現 與純化利用巴氏病毒媒質產生的重組的人類紅血球生成 素，Blood，74(2)，652-7; EP 640 619 B1 與 EP 668 351 B1)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 EPO可能包含一或多個碳水化合物側鏈經由N-及/或 20 〇-連結的糖化作用附接至EPO，即EPO是被糖化的，不 平常地，當EPO被產生於真核細胞時，多肽是轉譯後進 行糖化，因此，碳水化合物側鏈可能在產製於哺乳類（特 別是人類）、昆蟲或酵母細胞時己被附接至EPO，這些細 胞可爿b疋轉殖基因動物的（見前面），或是萃取自動物或仍 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（17) 在動物中者。 在適當的細胞中表現後，這些碳水化合物側鏈可能已 被化學地或酵素地修飾，例如經移除或加入一個或多個破 水化合物部位（見，例如 Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer， 5 Lindenmaier，1989，Advances in Protein design; Blocker， Collins，Schmidt，and Schomburg eds·，GBF_Monographs，12, 231-246， VCH Publishers, Weinheim，New York， Cambridge)。 本發明的方法的目的為提供HAS-EPO，其係包含一 10 或多個HAS分子，其中HAS係經由碳水化合物部位⑴或 經由硫醚(ii)共軛接合至EPO，故，步驟a)提供之EPO應 為具有經由碳水化合物部位及/或經由硫醚共輛接合的性 質’故於步骤a)之後的EPO宜含有·· (1) 至少一個具反應性的基（直接地或經由聯結子分子)被
15 連結至硫化物基或碳水化合物部位，其為能與HES 或修飾的HES反應者， (2) 至少一個碳水化合物部位，其可被修飾的HAS共軛 接合上，及/或 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制取 (3) 至少一個游離的SH-基。 20 就上述（1)的可能性，步驟a)的EPO宜得自經共軛接 合一適當的聯結子分子至SH-基(群)或EPO的碳水化合物 部位’這類經修飾的EPO的實例被提供於實例4, 2.1，很 重要的一點為，應保證添加聯結子分子時不會損害 EP〇 ’無論如何，此為精於本技藝者所熟知者。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（ι〇 就上述(2)的可能性，於較佳的具體實例，修飾的 HAS係經由碳水化合物部位共軛接合至EPO。 碳水化合物部位可被直接地連結至EPO多肽的骨架 上，較佳地，此碳水化合物部位是破水化合物側鏈的一部 5 分，此情況下，另外的碳水化合物部位可出現於介於被 HAS連結的碳水化合物部位與EPO多肽骨架間，更佳 地，碳水化合物部位是碳水化合物側鏈之末端部位。 因此，於較佳的具體實例中，此修飾的has是(經由 一聯結子或不是，見下面）被附接至破水化合物鏈被連結 10 至EPO的N-及/或0-糖化作用位置。 無論如何，本發明也包括EPO含有被修飾的HAS共 軛連接的另外的的碳水化合物部位，將碳水化合物部位附 接至多肽類的技術，不管是酵素的或基因工程的，接著表 現於適當的細胞者’為本技藝中已知者(Berger，Greber， 15 Mosbach，1986，試管中錯合物之半乳糖苷基轉移酶-依賴 的唾液酸化作用與内乙醯基葡糖胺酶H-處理的核心队 聚’ FEBS Lett” 203(1)，64-8; Dittmar，Conradt，Hauser， Hofer，Lindenmaier，1989，Advances in Protein design; 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Bloecker, Collins, Schmidt, and Schomburg eds.5 GBF-20 Monographs, 125 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge) 〇 本發明的方法之一較佳具體實例中，碳水化合物部位 被氧化以便能與修飾的has反應，此氧化反應可藉由化 學的或酵素的方式進行。 -20-
Sl¥?^NS)A4^721Q x 297 Ml---— 200418875
多肽的碳水化合物部位的化學氧化的方法為本技 被熟知者且包括以過峨酸處理的方式(chamowetal λ Biol. Chem” 267, 15916_1922)。 ’ 藉化學的氧化時，原則上可能氧化任何的碳水化合物 5雜，為末端位置或;ρ是’無論如何，㈣擇溫和的條件 (1 mM過猶，（TC ’相對的嚴苛條件為：1()福過碟 酸’於室温下-小時），有可能較佳地氧化碳水化合物側 鏈的終端碳水化合物部位，例如唾液酸或半乳糖。 或者，碳水化合物部位可利用酵素氧化，供個別的碳 10水化合物部位進行酵素氧化之酵素類為本技藝中已知者， 例如，當為半乳糖時，可使用半乳糖氧化酶之酵素。
如果目的為氧化末端的半乳糖部位，如果Ep〇已產 生於能附接唾液酸至碳水化合物鏈的細胞（例如哺乳類細 胞）或經基因修飾能附接唾液酸至碳水化合物鏈的細胞中 15時’最後必需（部分地或完全地)除去末端的唾液酸，除去 唾液酸的化學的或酵素的方法為本技藝中已知者(Chaplin and Kennedy (eds·)，1996，碳水化合物分析：實際方法， 尤其是第5章Montreuill，酶蛋白，第175_177頁；IRL 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3))。 20 無論如何，本發明也包括經修飾的HAS將被附接的 碳水化合物部位被附接至步驟a)之EPO，此情況下，有 需要附接半乳糖，此可利用半乳糖苷基轉移酶達成，此方 法為本技藝已知者(Berger，Greber，Mosbach，1986，試管 中錯合物之半乳糖苷基轉移酶-依賴的唾液酸化作用與内- -21- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（20 ) N-乙醯基葡糖胺酶H_處理的核心N_聚醣，FEBS Lett.， 203(1)，64-8)。 於最佳的具體實例，步驟a)中，Ep〇被氧化修飾於 EPO的一或多個碳水化合物側鏈之至少一個末端醣單 5元，宜為半乳糖，如有必要，宜在部分地或完全地（酵素 的及/或化學的）移除末端唾液酸之後進行(如上述）。 因此，較佳地，修飾的HAS是共扼接合至碳水化合 物鏈之氧化的末端醣單元，宜為半乳糖。 此外，此修飾的HAS宜共軛接合至末端唾液酸，其 10宜為在a)步驟依本發明的方法被氧化者。 於另一較佳具體實例（見上述第（3)點），此EP〇包含 至少一個游離SH-基。 ^根據一較佳的具體實例，此SH基可被連至較佳地經 氧化的碳水化合物部位，例如藉由使用羥基胺衍生物，例 15如，2_(胺基氧）乙基氫硫基鹽酸鹽(Bauer L. et d” 1965, 了. Chem·，30, 949)或藉由使用一種醯肼衍生物，例如， 硫罗工基乙酸醯肼（Whitesides et al·，1977,】· chem，42 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 f 2)，將這些分子共軛接合至Ep〇之氧化的碳水化合物 部位之方法類似於揭露於實例操作手冊8與9中。 2〇 根據另一較佳的具體實例，此游離的SH-基為天然出 現的半胱胺酸或加入的半胱胺酸。 、 、哺礼類EP0具有許多通常形成雙硫鍵的半胱胺酸， 經以另外的胺基酸取代至少其中之—的半胱胺酸 (歹’重組方法），有可能得到一種 EP0，其中至少一個天 -22- 200418875 A7 B7 五、發明說明（21) 然出現的半胱胺酸包含一個游離的SH-基，胺基酸的取代 方法為本技藝中已知的技術（Elliott，Lorenzini，Chang， Barzilay，delorme，1997，Mapping of the active site of replacement human erythropoietin，Blood，89(2)，493-502; 5 Boissel，Lee，Presnell，Cohen，Bunn，1993，紅血球結構··功 能相關性，以變異的蛋白質試驗三級結構的模式，J Biol Chem·，268(21)，15983-93))。 較佳地，此EPO具有人類EPO的胺基酸序列且天然 出現的半胱胺酸為半胱胺酸29及/或33。 10 因此，一較佳的具體實例中，半胱胺酸33被取代成 另種胺基酸而於步驟c)，經修飾的HAS被共軛接合至半 胱胺酸29。 於另一較佳的具體實例中，半胱胺酸29被取代成另 種胺基酸而於步驟c)，經修飾的HAS被共軛接合至半胱 15 胺酸33。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本說明書中，“加入的半胱胺酸”一詞是指一種多 肽，宜為EPO，包含不在野生型多肽中出現的半胱胺酸 殘基，此可藉由加入(例如，使用重組的方法）半胱胺酸殘 基於多肽的N-端或於C-端，或藉由取代(例如重組的方法) 2〇 一種天然出現的胺基酸成半胺胺酸的方式，精於本技藝者 了解此各別的方法(如前之述）。 較佳地，此加入的半胱胺酸是經由取代天然出現的胺 基酸成半脱胺酸而得。 於一較佳的具體實例，EPO為人類EPO且被取代的 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規‘ (21〇 X 297公愛） 200418875 A7
胺基酸殘基為絲胺酸126。 較佳地，在步驟c)中，修飾的HAS係共軛接合至加 入的半胱胺酸。 於本發明方法的步驟b)，提供能與步驟a)的EPQ反 5 應的經修飾的HAS。 本說明書巾，HAS宜被料於其還原端，其優點為 化學反應可被容易控制且精於本技藝者能確保於反應期間 HAS基被修飾，由於僅有一個基被引入至has，可防止 不同EPO分子間被？官能的HAS分子發生交聯與其他副 10 反應。 因此，經修飾的HAS可能與下列者發生反應： (1) 至少一基被連接至硫化物基或Ep〇的碳水化合物部 位，是直接連接或是經由一聯結子分子連接， (2) 至少一個碳水化合物部位，其宜為被氧化的，及/或 15 (3)至少一個游離的SH-基。 就上述第（1)點’ HAS的修飾作用將視連接至epo的 基而定，其中的機制為本技藝中已知者，一實例被舉例於 實例4, 2.1。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 就上述第（2)與第（3)點，本技藝中已知有多種的has 20的修飾法，這些方法下的基本原則為，或是修飾HAS的 具反應性基以便其能與碳水化合物部位反應，或是基 或聯結子分子被共軛接合至HAS，其含有具反應性的基 可與碳水化合物部位或SH-基反應。 於第（2)點的情況，經修飾的Has可具有與氧化的碳 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公釐 200418875 A7 B7 五、發明說明（23) 水化合物部位，特別是末端醣類殘基，更佳為半乳糖，或 末唾液酸反應能力。 很多方法已知可用於修飾HAS使其能與氧化的，宜 為末知酷類殘基反應，如上述的，此修飾作用可被引導成 5在HES-鏈的還原端造成特定選擇性反應。此情況下，於 第一步驟，搭基被氧化成内_，修飾作用包括，但非僅限 於加入醯肼、胺基(也包括經基胺基）、半卡二驢肼或硫醇 官能基至HAS，直接或經由一種聯結子，這些技術被更 詳述於實例2-4，此外，其中的機制也已知於本技藝中 10 (見，例如 DE 196 28 705 Al; Hpoe et al·，1981， Carbohydrate Res” 91，39; Fissekis et al” 1960, Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry，2, 47; Frie，1998, diploma thesis，Fachhochschule Hamburg，DE)。 本發明中，加入醯肼或羥基胺基官能是較佳的，於此 15情況下，本發明的步驟c)宜在pH 5.5下進行，用於保證 經修飾的HAS選擇地與EPO的氧化的碳水化合物部位反 應而不是藉離胺酸侧鏈與氧化的醣類殘基形成亞胺基造成 分子内或分子間EPO交聯反應。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於第（3)點情況，修飾HAS使之可與游離SH-基反應 20 也有許多的方法為已知，較佳地，此修飾作用是特定選擇 地被引入至HES-鏈的還原端，此方法包括，但非僅限於 加入馬來醯亞胺、二硫化物或i素乙醯胺官能至HAS， 這些技藝被更詳述於實例2-4。 此外，有關這些技術的細節可得自Chamov et al·， -25- 本纸張尺度適用中备^家標準(CNS)A4規格一（2i〇x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（Μ) 1992，J· Biol· Chem·，267, 15916; Thorpe et al·，1984, Eur. J· Biochem·，140, 63; Greenfield et al·，1990, Cancer Research， 50, 6600以及實例2, 1.3中提及的文獻。 另外可能的官能基團被列於表1，提供系統地縱觀可 5 能的聯結子分子，此外，其中的機制已知於本技藝中。 有用於本發明之許多的聯結子分子為文獻中所知或可 購得者（例如’由 Pierce，得自 Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，Germany)，實例被列舉於表2 〇
於本發明方法的步驟c)中，令步驟a)的EPO與步驟 10 b)之HAS反應，其間產生HAS-EPO，包含一或多個HAS 分子，其中HAS是藉由碳水化合物部位或經由硫醚被共 軛接合至EPO〇 原則上’方法中的細節，EPO如何與修飾的HAS作 用要視EPO的個別修飾作用及/或HAS而定且為文獻中 15 已知者（見’例如 Rose，1994, J· Am· Chem· Soc” 116, 30, O Shannessay and Wichek，1990，Analytical Biochemistry， 191，1; Thorpe et al·，1984，Eur· J· Biochem·，140，63; Chamov et al” 1992, j· Biol· Chem. 267, 15916)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明所舉實例中，細節被置於實例2-4，尤其是實 20 例 4。 步驟C)可於包含至少10%重量的水中進行。 本發明的方法之較佳具體實例中，反應介質包含至少 10,重，的水，宜為至少5G%，更好為至少嶋，例如 90/。或同達ι00%，有機溶劑的量係分別計算，因此，反 -26-
200418875 A7 B7 五、發明說明（25 ) 應係於水溶液相中進行，較佳的反應介質為水。 發明的方法之具體實例之優點為：不需要使用到有 毋性危險的溶劑類，且不必為了避免受到溶劑的污染而需 於產製過程後移除這些溶劑，再者，就殘留的毒性臨界量 5的溶劑而言，它不需進行額外的品管控制，較佳地為使用 無毒性問題的有機溶劑，例如乙醇或丙二醇。 本發明方法的另-優點為，避免了受有機溶劑影塑的 不可逆的或可逆的結構改冑，因此，根據本發明方法㈣ 的多肽類與使用有機溶劑（例如DMS〇)製備得者是不同 10 的。 α 此外，令人驚訝地觀察到，在水溶液中將HAS乒軛 接合至藥物可弱化或避免副反應，因此，本發明方法^具 體實例可獲取具高純度的改進的產物。 15 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 本發明說明書中，“羥烷基澱粉，，一詞係用於指明已 經被羥烷基團取代之澱粉衍生物，於說明文中，燒基可⑲ 取代，較佳地，羥烷基含有2-10個碳原子，更佳為含有 2-4個碳原子，“羥烷基澱粉”因此宜包含羥乙基澱粉， 輕·丙基殺粉與經丁基殿粉，其中以經乙基；殿粉與經丙基澱 粉為較佳。 20 HAS的經烧基（團）含有至少一個OH-基。 羥乙基澱粉(HES)為本發明所有具體實例中為最佳 者。 罗！烧基殿粉之含意也包含衍生物類，其中燒美為 經單-或多取代的，本說明文中，較佳地，烷基係經取代 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（26) 鹵素，尤其是氟，或經芳基取代，製得仍為可溶於水之 HAS，此外，羥烷基的末端羥基可被酯化或醚化，此外， 羥烷基澱粉的烷基可為線型或分枝物。 此外，除了烷基，也可使用線型或分枝的經取代或無 5 取代之烯烴基。 本發明說明内文中，羥乙基澱粉可具有平均分子量 (重量平均）為1-300 kDa，其中以平均分子量為5-100 kDa 為最佳者，羥乙基澱粉可另呈現莫耳取代度為0.1至0β8 且介於C2:C6-取代度的比例為2-20範圍，是就羥乙基基 10 團而言者。 依本發明的方法產生之HAS-EPO可經純化及鑑定如 下： HAS-EPO的單離可使用已知的供純化天然的與重組 的EPO的程序進行[例如：分子大小篩濾層析法（size 15 exclusion chromatography)，離子交換層析法，Rp_ HPLC ’奈米氫氧基鱗灰石（hydroxyapatite)層析，疏水性 交互作用層析，實例20.8中揭露的方法或其混合法]。 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 HAS的共價附接至EPO多肽可將修飾的蛋白質經水 解後進行碳水化合物的組成分析得到應證（羥乙基葡萄糖 20 與甘露糖出現於EPO的三個N-糖化位置）。 證明HAS修飾於EPO的N-連結的寡醣類上可經移 除HAS修飾的N-聚醣與觀察多肽在SDS-PAGE+/-西方墨 點分析中被遷移至較高的位置而知。 EP〇在半胱胺酸殘基的HAS修飾作用可證明自： -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875
HAS_修飾的產物之蛋白質水解的斷片中，於RP_HPU^ MALDI/TOF-MS中，無法㈣得相關的蛋白質分解的 Cys-多肽(Zhou et al·，1998，應用毛細胞電泳法、，液相層 析法’電麗-質譜光譜法與基質·輔助的雷射吸收/離子化曰_ 飛過時間-質譜鑑定再重組的人類紅血球生成素， mectr〇phoresis，叫⑼，洲却，在蛋白質水解消化加 修飾的EP〇之後單離含HAS之劃分可使轉統的胺基酸 組成分析，證明相關的肽在此劃分中。 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 有關本發明的HAS_EP0—露於上的所有具體實例 中相關EPO或HAS的性質也適用於本發明供製備腿_ EPO的方法者。 本發明另關於一種HAS_Ep〇,得自本發明的方法 者，此HAS-EPO具有如上述本發明的HAS_Ep〇所定義 之特徵。 本發明另關於根據本發明的HAS-EPO,供使用於治 療人類或動物身體的方法。 此外，本發明關於一種醫藥組成物，其係包含本發明 HAS-EPO，於較佳的具體實例中，此藥學組成物另包含 至少一種藥學可接受的稀釋劑、佐劑及/或載劑，有用於 紅血球生成素療法。 此藥學的組成物宜被使用於供治療貧血疾病或造血功 月色不良疾病或其相關的疾病。 本說明中所稱“治療有效的量，，是指所用的量對於病 況與投與法能提供治療效果，紅血球生成素等形物宜以非 -29-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7
經消化道的投與途徑投與，此被選擇的特別途徑將視受治 療的病況而定，投與紅血球生成素宜將其作成配方的一部 分，含有適當的載劑（例如人類血漿白蛋白），適當的稀釋 劑(例如缓衝的鹽溶液)及/或適當的佐劑，所要的劑量為足 5以提昇病人的血容量且將視受治療的病況嚴重度、投與的 方式等而改變。 ' 以本發明的卣學組成物治療的目的為，宜用於 血球值至超過6.8毫莫耳/升血液，為此，藥學 可被以一種方式投與使紅血球值增加至在每星期介於 10毫莫耳/升與1·6毫莫耳/升間，如果血紅素超過8·7毫莫 耳/升’治療宜中斷直到血紅素低於8·1毫莫耳/升。 、 本發明的組成物宜用於適於皮下或靜脈内或非經胃腸 的注射之配方中，為此，適當的賦型劑與載劑為，例如供 注射之磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，氯化鈉，聚山梨醇酯 15 8〇，HAS與水，此組成物可一星期投與三次，宜一星^ 一-人，更好為一星期一次，且最好每兩星期一次。 較佳地，此藥學組成物的投與量，對病人每公斤體重 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 投與〇_〇M〇微克的量，更佳為〇1至5微克，〇1至J微 克，或0.2-0.9微克，最好為〇·3_〇·7微克，且最好為〇 ‘ 20 0.6微克。 … 通常，每劑宜為介於10微克與200微克間，更好為 介於15微克與ι〇〇微克間。 … 本發明也關於本發明的HAS-EPO的用途，用於製備 一種供治療貧血疾病或造血功能不良疾病或其相關的疾疒 -30- 200418875 Α7 Β7 五、發明說明（29) 之醫藥品。 根據本發明的另一目的，可以藉由包含一或多個 HAS分子之羥基烷基澱粉(HAS)-多肽-共軛接合物(HAS-多肽)解決問題，其中各HAS被共軛接合至多肽是經由 5 a)碳水化合物部位；或 b)硫醚。 本發明的HAS-多肽具有優點為：相較於被共軛接合 前的多肽，其呈現改進的生物穩定性，這主要是由於 HAS-多肽較少或不被肝臟與腎臟的移除系統辨認並因此 10 在循環系統中能較持久之故，再者，由於HAS是位置-專 一地附接，多肽藉HAS的共輛接合至EPO而導致摧毀多 肽的活體内生物活性的危險性就被弱化了。 本發明的HAS-多肽具有主要的兩組分，即多肽與被 連接的羥基烷基澱粉(HAS)。 15 此多肽可以是屬於任何人種或動物來源，較佳的具體 實例中，多肽是源自於人類。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 多肽可能為細胞激素，尤其是紅血球生成素，為一種 抗凝血酶(AT)，例如AT III，一種介白質，特別是第二介 白質，/9-IFN，α-IFN，G_CSF，CSF，第 6 六介白質與 20 治療用抗體類。 根據一較佳的具體實例，此多肽為一種抗凝血酶 (AT) ’ 宜為 AT III(Levy JH，Weisinger A，zi〇mek CA，
Echelard Y，重組的抗凝血酶：生產與在心血管疾病中的 角色，血检形成與止金的專題討論27, 4 (2001> 405-416$ -31- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公釐） 200418875 經濟部智慧財產局員工消費合作、社印製 A7 B7 五、發明說明（3〇)
Edmunds T5 Van Patten SM, Polock J, Hanson E5 Bernasconi r? Higgins E Manavalan P3 Ziomek C? Meade H, McPherson J? Cole ES，轉殖基因地產生人類抗凝血酶：人類血漿-衍生 的抗凝血酶之結構與功能的比較，Blood 91，12 (1998) 5 4661-4671; Minnema MC? Chang ACK, Jansen PM? Lubbers YTP，Pratt BM，Whittaker BG，Taylor FB，Hack CE， Friedman B，以Escherichia coli激發致死的狒狒模式下， 重組的人類抗凝血酶III可增加倖存率及緩和發炎反應， Blood 95, 4 (2000) 1117-1123; Van Patten SM, Hanson EH? 10 Bernasconi R，Zhang K，Manavaln P，Cole ES，McPherson JM，Edmunds T，在抗凝血酶中氧化甲硫胺酸殘基，j. Biol· Chemistry 274, 15 (1999) 10268-10276)。 根據另一較佳具體實例，此多肽為人類IFN-/3，特 別是 IFN_/3 la (參考，Avonex®，REBIF®與 IFN-/5 lb (參 15 考 BETASERON®)。 另一較佳的多肽為人類G-CSF(粒細胞群體刺激因 子），見，例如Nagata et al·，染色體的基因結構與作為人 類粒細胞群體-刺激因子之兩iriRNAs，EMBOJ. 5: 575-581， 1986; Souza et al·，重組的人類粒細胞群體-刺激因子：對 20 正常的與白血病的髓樣細胞的影響，Science 232 (1986) 61-65 ;與 Herman et al·，Neupogen®的鑑定，配製，與安 定性（Filgrastim)，一種重組的人類粒細胞-群體刺激因 子，於：蛋白質藥物的配製劑，鑑定，與穩定性， Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Press, -32-
週 度 尺 張 f 準 冢 雜 釐 公 97 200418875 A7 _B7_ 五、發明說明（3i) ~ ~
New York，1996, 303-328 〇 就紅血球生成素而言，所有揭露如前的具體實例均適 用於此。 較佳地，此多肽是經重組地產生，這包括產生於真核 5細胞或原核細胞’宜為哺乳類、昆蟲、酵母、細菌細胞或 任何方便重組產生此多肽的其他細胞類型，此外，此多肽 也可被表現於轉殖基因的動物中（例如於像是牛奶、血液 等等體液中），於轉殖基因的鳥類（尤其是家禽，宜為雞） 之印中，或於轉殖基因的植物中。 10 多肽的重組產製為本技藝中已知者，通常，此包括以 適當的表現媒質轉移感染宿主細胞，在能產生多肽的條件 下培育宿主細胞並從宿主細胞純化多肽，更詳細的資訊可 參看，例如，Krystal，Pankratz，Farber，Smart，1986，利用 快速的五步驟製程，純化人類紅血球生成素成均質性， 15 Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989，使用桿菌病毒(baculovirus)媒質產生的重組的人類 紅血球生成素的高-階表現與純化，Blood, 74(2)，652-7; EP 640 619 B1 與 EP 668 351 B 卜 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此多肽可包含一或多個碳水化合物側鏈經由N-及/或 2〇 0-連結的糖化作用被附接至多肽，即，此多肽是被糖化 的，通常，當多肽被產生於真核細胞，此多肽是後轉譯地 被糖化，故，碳水化合物可能在哺乳類（特別是人類）、昆 蟲或酵母細胞中生合成階段被附接至多肽。 HAS可能被直接或經由聯結子(iinker)共軛接合至多 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A7 B7 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 合 作 '社 印 製 五、發明說明（3〇 肽，聯結子的本性要看HAS如何連結至多肽的方式而 定，許多的聯結子為可購得物（例如，得自pierce，見之 前的說明），聯結子的本質與其目的被更詳述於產製HES-多肽的方法的相關單元中討論。 5 根據本發明之一較佳的HAS-多肽共軛接合物，此 HAS係經由碳水化合物部位共軛接合至多肽，較佳地， 其此種應用下如果多狀是一種抗凝血酶時，宜為AT III。 在本發明的說明文中，“碳水化合物部位，，代表羥基 醛或羥基酮類以及其化學修飾物（見R5mpp Chemielexikon， 10 1990, Thieme Verlag Stuttgart，Germany，9th edition 1990, 9, 2281-2285及其中提及的文獻），此外，其也關於天然發生 的碳水化合物（例如葡萄糖，半乳糖，甘露糖，唾液酸等） 之衍生物，此名詞也包括經化學氧化的其環狀結構被打開 之天然出現之碳水化合物部位。 15 20 此碳水化合物部位可被直接地接至多肽主支架上，較 佳地’此碳水化合物部位是碳水化合物側鍵的一部分，於 此情況下’另外的碳水化合物部位可能出現於介於has 被連結的碳水化合物部位與多肽主支架間，更佳地，此碳 水化合物部位為碳水化合物側鏈的末端部位。 於更佳的具體實例，HAS係共軛接合至碳水化合物 側鍵之半乳糖殘基’較好是碳水化合物侧鍵之末端半乳糖 殘基’此半乳糖殘基可在進行氧化作用後經除去末端唾液 酸而供共軛接合（見下面）。 於更佳的具體實例，HAS係共輛接合至碳水化合物 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（33 ) 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 20 側鏈之唾紐絲，較好是碳桃合物峨之末端唾液酸 殘基。 此外，HAS可經由硫醚共輊接合至多肽，如下面詳 述的，s原子可被衍生自附接在多肽之任何的SH基，包 括天然的或非天然出現物兩者。 於車父佳的具體實例，S原子可衍生自已被引入至HES 的氧化之碳水化合物部位的SH基，較好是多肽的碳水化 合物側鏈之一部分之氧化的複水化合物部位（見下面）。 較佳地’硫醚中的S原子是衍生自天然出現的半胱胺 酸或得自加入的半胱胺酸。 本發明的内文中，“加入的半胱胺酸，，一詞係指多肽 包含未存在於野生-型多肽之半胱胺酸殘基。 本發明情況的說明文中，此半胱胺酸可能為另外加入 至多肽的N_或C-端的胺基酸。 此外’加入的半胱胺酸可能藉取代天然出現的胺基酸 成半胱胺酸而被加入。 HAS-多肽的第二個組分為HAS。 本發明的内文中，“羥烷基澱粉”一詞係指經羥基烷 基取代的澱粉衍生物，本說明文中，烷基可能經取代， 佳地，羥基烷基含有2-1〇個碳原子，更佳為含有2-4 碳原子，“羥基烷基澱粉，，因此宜包含羥乙基澱粉，羥 基澱粉與羥丁基澱粉，其中以羥乙基澱粉與羥丙基澱粉為 較佳者。 HAS的羥烷基（團）含有至少一個oh-基。 個 丙 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2l7T297公逢7 200418875
“經烧基婦，，也代表其中絲經—個❹個 取代之衍生物，於本說明文巾，較麵，絲為經^ (尤其疋虱)或經芳基取代，只要HAS仍為可溶解於水中 者’，此外，妓基的終端經基可能被s旨化或被醚化，此 外，羥烷基澱粉的烷基可為線型或分枝型。 此外，烧基也可取代為直線型或分枝型經取 代之烯烴基。 '乂…取 羥乙基澱粉(HES)最適於本發明的所有具體實例。 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 20 本發明說明文中，羥乙基澱粉可能具有平均分子量 (重量平均）為M〇0kDa，以5-1〇〇_者最佳羥乙基澱 粉另可呈現0·1至0.8的莫耳取代度與以經乙基而言，具 有介於C2:C6-取代度的比例為2-20。 HAS-多肽’相對每一多版分子，可包含丨_12，宜為 19 16或1-3，隶好為ι_4個HAS分子，對每一多肽分 子之HAS-分子的數目可經定量碳水化合物組成分析，可 於產物水解，將所得的單醣類衍化後，使用GC-MS分析 (見 Chaplin and Kennedy，1986，破水化合物分析（eds): practical approach ed.，第 1 章，單醣類，第 1-36 頁；第 2章，募醣類，第37-53頁，第3章，天然的多醣類，第 55-96 頁；IRL presS practiCal approach series (ISBN 0-947946-44-3)。 有關本發明的方法產製HAS-多肽而揭露於上的所有 具體實例中相關的多肽或HAS的性質也適用於本發明的 HAS-多肽，此外所有揭露如前具體實例有關HAS-EPO或 •36- 本紙張尺度適用T _冢標準(CNS)A4 (21Q χ 297公愛） 200418875 A7 _ B7 五、發明說明（35) 其製備法中相關的多肽或has應用也適用於本發明的 HAS-多肽。 羥烷基澱粉是一種澱粉的醚衍生物，除了所述的醚衍 生物’也有其他澱粉衍生物類可被使用於本發明的内涵 5 中’例如，有用的衍生物包含酯化的羥基團，這些衍生物 可以是，例如具2-12個碳原子之無取代的單_或雙-羧 酸’或是其經取代的衍生物，尤其有用者為具2-6個碳原 子之無取代的單羧酸的衍生物，尤其是乙酸，其中以乙醯 基殿粉’丁基澱粉或是丙基澱粉為較佳。 1〇 此外，具2-6個碳原子之無取代的二羧酸的衍生物是 較佳者。 二羧酸的衍生物之情況，有用者也包括二羧酸的第二 個羧基也被酯化者，此外，二羧酸類的單烷基酯的衍生物 也適於本發明内涵。 15 就經取代的單-或雙幾酸類，取代基宜同於上述經取 代的烧基殘基中提及者。 殿粉的酯化技術為本技藝中已知者（見，例如KLemm D. et al，Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2，1998, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Whiley-VCH, Weinheim, New York, especially chapter 4.4? 20 Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9)。 另一方面，本發明係關於產製羥基烷基澱粉(HAS卜多 肽-共輊接合物(HAS-多肽)的方法，係包括以下的步驟： a) 提供可與修飾的HAS反應之多肽， b) 提供可與a)步驟的多肽反應之修都的，且 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（36) c)以步驟b)之HAS與步驟a)的多肽反應，由之產生 HAS-多肽其係包含一個或多個HAS分子，其中各 HAS被共輛接合至多肽，係經由 i) 礙水化合物部位；或 5 ϋ) 硫醚。 本發明的方法的優點為，產生的HAS-多肽共軛接合 物呈現高生物的活性，此外，本發明的方法具有的優點 為，減少成本下可製得有效的多肽衍生物，由於此方法不 •包含昂貴的與耗時的純化步驟導致最後的低收量。 10 因此，在本發明的第一步驟中，提供可與修飾的 HAS反應多肽。 在本發明中，‘‘提供，，一詞被解釋成在個別的步驟 中，可製得具所要分子特性之多肽(於步驟幻及11八8(於步 驟 b))。 15 好驟a)的情況，包括從天絲_化纽以及於宿 主細胞或有機體内產生重組體，以及，如有必要，將如此 取得的多狀加以修飾。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 就多肽為本發明的起始材料而言，同樣適於紅企球血 紅素為本發明的HAS-多狀共輛接合物的部分，於本内涵 2〇中，揭露於上的較佳具體實例也適用於本發明的方法。 較佳地，揭是藉由重纟且產生，這包括在真核細胞 或原核細胞中，宜為喷乳類，昆蟲、酵母、細胞細胞或任 何其他細胞類型，其為方便於重組產生多肽者，此外，此 夕敗可被表現於轉絲_動物(例如於牛奶、血液等體 -38- 200418875 A7 B7 五、發明說明（37 ) 液），於轉殖基因的鳥類之卵中，尤其是家禽，特別是 雞，或於轉殖基因的植物中。 多肽的重組體生產是本技藝中已知者，通常，這包括 以適當的表現媒質轉移感染宿主細胞，在能產生多肽的條 5件下培育宿主細胞與從宿主細胞純化多肽（Krystal， Pankrata，Farber，Smart，1986，藉一種快速、五步驟程序 純化人類紅血球生成素成均質性，Blood，67(1)，71-9;
Quelle，Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，高水平表現 與純化利用巴氏病毒媒質產生的重組的人類紅血球生成 10 素，Blood，74(2)，652-7; EP 640 619 B1 與 EP 668 351 B1)。 此多肽可包含一或多個碳水化合物側鏈經由N-及/或 Ο-連結的糖化作用附接至多肽，即多肽是被糖化的，不 平常地，當多肽被產生於真核細胞時，此多肽是轉譯後進 15 行糖化，因此，碳水化合物側鏈可能在產製於哺乳類（特 別是人類）、昆蟲或酵母細胞時己被附接至多肽，其中細 胞可能是那些轉殖基因的動物或植物者（見前面）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在適當的細胞中表現後，這些碳水化合物侧鏈可能已 被化學地或酵素地修飾，例如經移除或加入一個或多個碳 20 水化合物部位（見，例如 Dittmar，Conradt，Hauser，Hofer， Lindenmaier，1989，Advances in Protein design; Blocker， Collins，Schmidt，and Schomburg eds” GBF-Monographs，12, 231-246，VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge) ° -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（38) 本發明的方法的目的為提供包含一或多個HAS分子 之HAS-多肽，其中HAS係經由碳水化合物部位⑴或經由 硫醚(ii)共軛接合至多肽，故，步驟a)提供之多肽應為具 有經由破水化合物部位及/或經由硫醚共軛接合的性質， 5 故於步驟a)之後的多肽宜含有： (1) 至少一個具反應性的基（直接地或經由聯結子分子)被 連結至硫化物基或碳水化合物部位，其為能與HES 或經修飾的HES反應者， (2) 至少一個碳水化合物部位，其可被修飾的HAS共軛 接合上，及/或 (3) 至少一個游離的SH-基。 就上述（1)的可能性，步驟a)的多肽宜得自經共軛接 合一適當的聯結子分子至SH-基(群)或多肽的碳水化合物 部位，這類經修飾的多肽的實例被提供於實例4, 2.1，很 15 重要的一點為’應保證添加聯結子分子時不會損害多狀， 無論如何，此為精於本技藝者所熟知者。 就上述（2)的可能性，於較佳的具體實例，修飾的 HAS係經由碳水化合物部位共軛接合至多肽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 碳水化合物部位可被直接地連結至多肽的骨架上，較 20 佳地，此碳水化合物部位是碳水化合物側鍵的一部分，此 情況下，另外的碳水化合物部位可出現於介於被HAS連 結的碳水化合物部位與多肽骨架間，更佳地，碳水化合物 部位是碳水化合物側鏈之末端部位。 因此，於較佳的具體實例中，此修飾的HAS是(經由 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（39 ) 一聯結子或不是，見下面）被附接至碳水化合物被連結至 多肽的N-及/或0-糖化作用位置。 無論如何，本發明也包括多肽含有另外的被修飾的 HAS共軛接合的碳水化合物部位，將碳水化合物部位接 5 至多肽類的技術，不管是酵素的或基因工程的，接著表現 於適當的細胞者，為本技藝中已知者（Berger，Greber， Mosbach，1986，試管中錯合物之半乳糖苷基轉移酶-依賴 的唾液酸化作用與内-N-乙醯基葡糖胺酶處理的核心乂 聚·’ FEBS Lett” 203(1)，64-8; Dittmar，Conradt，Hauser， 10 Hofer，Lindenmaier，1989，Advances in Protein design;
Bloecker, Collins, Schmidt, and Schomburg eds.? GBF-
Monographs，12, 231_246, VCH Publishers，Weinheim，New
York，Cambridge) o 本發明的方法之一較佳具體實例中，碳水化合物部位 15被氧化以便能與修飾的HAS反應，此氧化反應可藉由化 學的或酵素的方式進行。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 多肽的碳水化合物部位的化學氧化的方法為本技藝中 被熟知者且包括以過填酸處理的方式（Chamow et al” 1992, J. Biol. Chem” 267, 15916-1922)。 20 藉化學的氧化時，原則上可能氧化任何的碳水化合物 部位，為末端位置或不是，無論如何，經選擇溫和的條件 (1 mM過碘酸，（TC，相對的嚴苛條件為：1〇 mM過碘 酸，於室溫下一小時），有可能較佳地氧化碳水化合物側 鍵的終端碳水化合物部位，例如唾液酸或半乳糖。
—本紙張尺度通用巾s國家標準(CNS)A4規格（210 X -41- 200418875 A7 B7
或者，碳水化合物部位可利用酵素氧化，供個別的碳 水化合物部位進行酵素氧化之酵素類為本技藝中已知者， 例如，當為半乳糖時，可使用半乳糖氧化酶之酵素。 如果目的為氧化末端的半乳糖部位，如果多肽已被產 5生於旎附接唾液酸至碳水化合物鏈的細胞（例如哺乳類細 胞）或經基因修飾能附接唾液酸至碳水化合物鏈的細胞中 時，最後必需（部分地或完全地)除去末端的唾液酸，除去 唾液酸的化學的或酵素的方法為本技藝中已知者(Chapiin and Kennedy (eds·)，1996，石炭水化合物分析：實際方法， 10尤其是第5章Montreuill，_蛋白，第丨75_丨77頁；
Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)) 〇 無論如何，本發明也包括經修飾的HAS將被附接的 碳水化合物部位被附接至步驟a)之多肽，此情況下，有 需要附接半乳糖，此可利用半乳糖苷基轉移酶達成，此方 15法為本技藝已知者(Berger，Greber，Mosbach，1986，試管 中錯合物之半乳糖苷基轉移酶-依賴的唾液酸化作用與内-N_乙酿基葡糖胺酶Η-處理的核心N_聚醣，FEBS Lett.， 203(1)，64-8)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於最佳的具體實例，步驟a)中，此多肽被氧化修飾於 20多肽的一或多個碳水化合物侧鏈之至少一個末端醣單元， 宜為半乳糖，如有必要，宜在部分地或完全地(酵素的及/ 或化學的）移除末端唾液酸之後進行(如上述）。 因此，較佳地，此修飾的HAS是被共軛接合至碳水 化合物鏈之氧化的末端醣單元，宜為半乳糖。 -42- 本紙張尺度 規格（210x297公釐） 200418875 Α7 Β7 五、發明說明（41) 於另一較較佳具體實例（見上述第（3)點），此多肽包含 至少一個游離SH-基。 根據另一較佳的具體實例，此游離的SH-基為天然出 現的半胱胺酸或加入的半胱胺酸。 5 置換胺基酸的方法為本技藝中已知的技術（Elliott，
Lorenzini, Chang, Barzilay, delorme, 1997, Mapping of the active site of replacement human erythropoietin, Blood, 89(2)，493_502; Boissel，Lee，Presnell，Cohen，Bunn，1993， 紅血球結構-功能相關性，以變異的蛋白質試驗三級結構 10 的模式，J Biol Chem·，268(21)，15983-93))。 本說明書中，“加入的半胱胺酸”一詞是指一種包含 不在野生型多肽中出現的半胱胺酸殘基之多肽，此可藉由 加入(例如，使用重組的方法）半胱胺酸殘基於多肽的N-端 或於C-端，或藉由取代(例如重組的方法）一種天然出現的 15胺基酸成半胺胺酸的方式達成，精於本技藝者了解此各別 的方法(如前之述）。 較佳地，此加入的半胱胺酸是經由取代天然出現的胺 基酸成半脱胺酸而得。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 較佳地，在步驟c)中，經修飾的HAS被共軛接合至 20 加入的半胱胺酸。 於本發明方法的步驟b)，提供能與步驟a)的多肽反 應的經修飾的HAS。 本說明書中，HAS宜被修飾於其還原端，其優點為 化學反應可被容易控制且精於本技藝者能確保於反應期間 -43_ 尺度適用歹國國家規格（210乂297公釐_--- HAS基被修飾，㈣财—個基被狀至has，可防止 不同EPO分子間被多官能的㈣分子發生交聯與其他副 反應。 因此，經修飾的HAS可能與下列者發生反應： (1) 至y曰基被連接至硫化物基或多肽的碳水化合物部 位，是直接連接或是經由一聯結子分子連接， (2) h個奴水化合物部位，其宜為被氧化的，及/或 (3) 至少一個游離的SH_基。 就上述第（1)點，HAS的修飾作用將視連接至Ep〇的 基而疋，其中的機制為本技藝中已知者，一實例被舉例於 實例 4,2·1。 、 就上述第（2)與第（3)點，本技藝中已知有多種的has 的修飾法，這些方法下的基本原則為，或是修飾has的 具反應性基以便其能與碳水化合物部位反應，或是SH_基 或聯結子分子被共轭接合至HAS，其含有具反應性的基 可與碳水化合物部位或SH-基反應。 於第（2)點的情況，經修飾的HAS可具有與氧化的碳 水化合物部位，特別是末端醣類殘基，更佳為半乳糖，或 末唾液酸反應能力。 很多方法已知可用於修飾HAS使其能與氧化的，宜 為末端醣類殘基反應，如上述的，此修飾作用可被引導成 在HES-鏈的還原端造成特定選擇性反應。此情況下，於 第一步驟，醛基被氧化成内酮，修飾作用包括，但非僅限 於加入醯肼、胺基(也包括經基胺基）、半卡二醯肼或硫醇 200418875 A7 B7 五、發明說明（43 ) 官能基至HAS，直接或經由一種聯結子，這些技術被更 詳述於實例2-4，此外，其中的機制也已知於本技藝中 (見，例如 DE 196 28 705 Al; Hpoe et al·，1981， Carbohydrate Res·，91，39; Fissekis et al·，1960, Journal of 5 Medicinal and Pharmaceutical Chemistry，2，47; Frie，1998, diploma thesis, Fachhochschule Hamburg, DE) ° 本發明中，以加入醯肼或羥基胺基官能是較佳的，於 此情況下，本發明的步驟c)宜在pH 5.5下進行，用於保 證經修飾的HAS選擇地與EPO的氧化的碳水化合物部位 10 反應而不是藉離胺酸側鏈與氧化的醣類殘基形成亞胺基造 成分子内或分子間EPO交聯反應。 於第（3)點情況，修飾HAS使之可與游離SH-基反應 也有許多的方法為已知，較佳地，此修飾作用是特定選擇 地被引入至HES-鍵的還原端，此方法包括，但非僅限於 15 加入馬來醯亞胺、二硫化物或鹵素乙醯胺官能至HAS， 這些技藝被更詳述於實例2-4。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此外，有關這些技術的細節可得自Chamov et al.， 1992，J. Biol. Chem·，267, 15916; Thorpe et al·，1984, Eur. J· Biochem·，140, 63; Greenfield et al·，1990, Cancer Research, 20 50, 6600以及實例2, 1.3中提及的文獻。 另外可能的官能基團被列於表1，提供系統地縱觀可 能的聯結子分子，此外，其中的機制已知於本技藝中。 有用於本發明之許多的聯結子分子為文獻中所知或可 購得者（例如，由 Pierce，得自 Perbio Science Deutschland -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 ___ B7 五、發明說明（44)
GmbH，Bonn，Germany)。
於本發明方法的步驟c)中，令步驟a)的多肽與步驟b) 之HAS反應，其間產生HAS-多肽，包含一或多個HAS 分子’其中HAS是藉由碳水化合物部位或經由硫醚被共 5 軛接合至多肽。 原則上，方法中的細節，多肽如何與修飾的HAS作 用要視多肽的個別修飾作用及/或HAS而定且為文獻中已 知者（見，例如 R0se，1994, j. Am· chem· s〇c·，116, 3〇, 0 Shannessay and Wichek, 1990, Analytical Biochemistry, 10 191, 1; Thorpe et al.? 1984, Eur. J. Biochem., 140? 63;
Chamov et al·，1992, J· Biol· Chem· 267, 15916)。 本發明所舉實例中，細節被置於實例2-4，尤其是實 例4 〇 步驟c)可於包含至少10%重量的水中進行。 15 本發明的方法之較佳具體實例中，反應介質包含至少 10/。重里的水，宜為至少5〇%，更好為至少8〇%，例如 90%或高達1〇0%，有機溶劑的量係分別計算，因此，反 應係於水溶液相中進行，較佳的反應介質為水。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的方法之具體實例之優點為：不需要使用到有 20毒性危險的溶劑類，且不必為了避免受到溶劑的污染而需 於產製過程後移除這些溶劑，再者，就殘留的毒性臨界量 的溶劑而言，它不需進行額外的品管控制，較佳地為使用 無毒性問題的有機溶劑，例如乙醇或丙二醇。 本發明方法的另一優點為，避免了受有機溶劑影響的 -46- 本紙張尺錢肖干國國冢標準(CNS)A4^7-21(fx 297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（45 ) 不玎逆的或可逆的結構改變，因此，根據本發明方法製得 的多肽類與使用有機溶劑（例如DMSO)製備得者是不石 的。 此外，令人驚訝地觀察到，在水溶液中將HAS共輪 5 接合至藥物可弱化或避免副反應，因此，本發明方法的具 體實例可獲取具高純度的改進的產物。 本發明說明書中’ “經烧基殿粉”一詞偽用於指明已 經被羥烷基團取代之澱粉衍生物，於說明文中，燒基可柄 取代，較佳地，經烧基含有2-10個礙原子，更佳為含有 10 2-4個碳原子，“羥烷基澱粉”因此宜包含羥乙基殿粉， 羥丙基澱粉與羥丁基澱粉，其中以羥乙基澱粉與經丙基殿 粉為較佳。 HAS的羥烧基（團）含有至少一個oh-基。 經乙基殿粉(HES)為最適於本發明所有具體實例中 15 者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經烧基版粉之含意也包含衍生物類，其中燒基為 經單-或多取代的，本說明文中，較佳地，烷基係經取代 鹵素，尤其是氟，或經芳基取代，製得仍為可溶於水之 HAS，此外，羥烷基的末端羥基可被酯化或醚化，此外， 20 輕烧基氣粉的烧基可為線型或分枝物。 此外，除了烷基，也可使用線型或分枝的經取代或無 取代之烯烴基。 本發明說明内文中，羥乙基澱粉可具有平均分子量 (重量平均）為1-300 kDa，其中以平均分子量為5_1〇() kDa -47- 本紙張尺度適用T @if^^(CNS)A4 ΛϋΐΟ χ297公釐）_ 200418875 A7 __ B7 五、發明說明（46) 為最佳者，羥乙基澱粉可另呈現莫耳取代度為01至0·8 且介於C2:C6-取代度的比例為2-20範圍，是就羥乙基基 團而言者。 依本發明的方法產生之HAS-多肽可被純化及鑑定如 5 下： HAS_多肽的單離可使用已知供純化天然的與重組的 多肽類的程序進行[例如：分子大小篩濾層析法（si^ exclusion chromatography)，離子交換層析法，处、 HPLC ’奈米氫氧基麟灰石㈣心巧叩故加)層析，疏水性 10交互作用層析，實例20·8中揭露的方法或其混合法]。 HAS的共價附接至多肽可將修飾的蛋白質經水解後 進行碳水化合物的組成分析得到應證。 證明HAS修飾於多肽的N-連結的寡醣類上可經移除 HAS修飾的N_聚醣與觀察多肽在SDS_PAGE+/_S方墨點 15分析中被遷移至較高的位置而知。 … 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 多肽在半胱胺酸殘基的has修飾作用可證明自： HAS-修飾的產物之蛋白質水解的斷片中，於Rp_HpLc與 MALDI/TOF-MS中，無法偵測得相關的蛋白質分解的 Cys-多肽(Zhou et al·，1998，應用毛細胞電泳法，液相層 20析法，電灑-質譜光譜法與基質-輔助的雷射吸收/離子化、 飛過時間-質譜鑑定再重組的人類紅血球生成素，
Electrophoresis，19(13)，2348-55)，在蛋白質水解消化 cys、 修飾的EPO之後單離含HAS之劃分可使用傳統的胺基竣 組成分析，證明相關的肽在此劃分中。 -48- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2i〇x297公爱） 200418875 A7
有關本發_ HAS_^_露於上 =多狀或職的性質也適用於本發明供製借J多 ==此外，所有如前而相關於祕EP0或其配製 ^ 的性質也適祕本發明供製備祕多版 5 共軛接合物的方法。 本發明另關於以本發明方法製得的HAS_多肤，較佳 地，此HAS-多版具有如上述本發明的HAs_Ep 之特徵。 裝 根據本發明-較佳具體實例，所用的似$ 10式⑴的化學式 15 has’
OH η (ΐ) 計 線 羥 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 簡 的 一其中R1，R2與R3分別獨立地為氫或線型或分枝的 烧基本發明中所用的經烧基殺粉，，一詞不限於化合物 其末端碳水化合物部位包含所指明之Ri，^及/或R3， 潔起見，式(I)，以及其至少一個羥基出現於任一位置π 化合物，或在末端碳水化合物部位及/或在澱粉分子的其 餘部位，HAS，，均為經羥烷基Ri，r2或r3取代，於本 说明書中，羥烷基宜含有M〇個碳原子，較好為含有i -49- 本紙張尺度顧T關家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱) 200418875 五、發明說明（48) 2至46^炭原子’更好為含有1 1 4個碳原子且又更好含 經丙“舰基澱粉”目此宜包含紅基澱粉、 :从;刀與趣丁基澱粉，其中以經乙基殿粉與經丙基殿 卷為較佳者，又以羥乙基澱粉為最佳。 與較適宜的HES可被與可與HAS(宜為HES)反 應之交聯的化合物，以及多肽(例如前面描述之多肽類）反 應。 HAS與交聯的化合物間的反應可發生於HAS的末端 或於HAS的經氧化的還原端，故，HAS可能以具有下述 10結構被反應： 根據式(I)的的結構 15 HASf
(I) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 及/或’如果還原端被氧化的話，根據式(IIa)的結構
(Ha) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNSW規格（2ΐδ·χ297 ϋΤ 200418875 A7 B7 五、發明說明（49 ) 及/或，根據式(lib)的結構 (Hb) 10 如果HAS是以根據式⑴的結構與交聯的化合物反應 時，此反應宜於水溶液介質中進行，如果是以根據式(Ila) 及/或(lib)的結構與交聯的化合物反應時，此反應宜於非-水溶液介質中進行，例如於極性質子惰性溶劑或溶劑混合 物，例如DMSO及/或於DMF中進行。 15 HAS，
C〇〇H 如果本發明的HAS-多肽共軛接合物是由HAS衍生物 的反應產生，包括HAS與交聯的化合物，與多肽之氧化 的碳水化合物部位反應時，此交聯的化合物宜為 S Λ /ΝΗ2 η2ν、 ο 人 /ΝΗ2
HnN 一 NH 2 或 h2n、 2 N Η 或 或
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 200418875 A7 B7 五 5 ο tx
5 IX 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 如果本發明的HAS-多肽共軛接合物是由HAS衍生物 的反應產生，包括HAS與交聯的化合物，與多肽之硫基 反應時，宜讓HAS於其選擇地氧化的還原端與第一個交 聯的化合物反應，此交聯的化合物宜為 H2N—NH2 或 或 HS^
hUN 5 2 Η2ΝΓ
S 人 2、K f 2 η2ν、νΑν 為
.NK
.COOH 或 Λ Η Η
NHL -52 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（51) 10
HW 丫 、〇H OH
H2NCT
.COOH
OH
H,N-N OH 2 H h2n
OH
OH h2no h2no
OH
OH
OH
NH. OH
H2N〇\ 入 /NK H2N、 .0
H2N OH 15
H2N、 .0 N-
HO OH HA 々〇
N一\ /—OH
OH h2、"〇
AcHN OH H2N、力〇 ΌΗ
NK
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（52 ) Ν 2 Η ΗΝ
OHSHO Η Ν / ΗΝ I onsno
10 並使所得的HAS衍生物與第二個交聯的化合物反應，其 為能與HAS衍生物與多肽之硫基起反應者，如果，例 如，HAS衍生物包含作為官能基，與第二個交聯的化合 物（-NH-之結構，如上面被詳述者）反應時，具官能基F1 與F2的下述類型的第二個交聯的化合物為較佳者： 15 化合物的類型(L) F1 F2 C 填烧基 N-琥珀醯亞胺酯 D 溴烧基 N-琥珀醯亞胺酯 E 馬來醯亞胺基 N-琥J0酸亞胺酉旨 F 1:7比基—硫基 N-琥珀醯亞胺酯 G 乙稀基石風 N-琥珀醯亞胺酯 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 尤其佳的第一類交聯的化合物之實例為 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7B7 五、發明說明（53 ) 10
Η Η Η /Ν\/Ν Ν' Η2Ν 丫 ΝΗ2 2 II
人 /ΝΗ2 Ν Ν 2 Η Η η2ν、 Η〆 與 Ή Μ 以下面兩化合物
H2hT
NK 與 〇¥、人Ν， Η Η 裝 計 為特別佳的化合物。 下面為較佳的第二類交聯的化合物
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 54 五、發明說明 為最佳者。 10 現個別的反應條件，所用的溶劑或溶劑化 ，"之在水溶液介質中作用之化合物r，_n^4,及/或 基R及/或R” ，有可能經此方法或前述的方法取彳^殘 烧土救粉衍生物具有下述的結構組成物(Ilia): HAS，
N R· Η (Ilia) R" 故，本發明也關於上述具有根據式(nia)的結構組成 之每烧基殿粉衍生物。 15 也有可能，例如，如果R，為氫時，根據經此方法或 述的方法取得的經烧基澱粉衍生物可能具有下述的結構 組成物(Ilia)或(Illb)，其中(Ilia)或(Illb)可能同時以某種平 衡狀態分佈出現於反應混合物中： 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 OR, 20 Η / 1 HAS’
H (Hla)
N \ -56- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（55 )
(nib)
N \ R·， 故，本發明也關於上述具有根據式(mb)的結構組成 之羥烷基澱粉衍生物。 再者，本發明也關於上述具有根據式(Ilia)與(Mb)的 10 混合物之結構組成之羥烷基澱粉衍生物。 視個別的反應條件及/或用於反應之化合物R’-NH-R” 的化學性質，根據式(Ilia)的化合物可能以N原子成水平 向（equatorial)或軸向（axial)位置出現，其中也包括混合物 以某種平衡分佈出現者。 15 視個別的反應條件及/或用於反應之化合物R’_NH-R” 的化學性質，根據式(Illb)的化合物可能以C-N雙鍵成五 或Z構型出現，其中也包括兩型的混合物以某種平衡分 佈出現者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 某些情況下，有必要安定根據式（Ilia)的化合物，尤 2〇 其是其間根據式(Ilia)的化合物是產生及/或使用於水溶液 的情況下，至於安定的方法，最好是將根據式（Ilia)的化 合物予以醯化，特別是當其中R，為氫之情況，至於醯化 劑，可以使用所有適合產生所要的根據式(IVa)的羥烷基 殿粉衍生物之試劑 -57- 本紙張尺度適用甲國國家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公餐了 200418875 A7 五、發明說明（56 HAS，
N、 Η
Ra R" (IVa) 根據本發明的尤其佳的具體實例，作為醯化劑的—部 分之殘基Ra為甲基，至於醯化劑，較好使用羧酸酐類， 羧酸鹵化物類與羧酸活化的酯類。 10 裝 故，本發明也關於依上述方法製得的羥烷基澱粉衍生 物，其中的衍生物具有根據式(IVa)的結構組成。 計 醯化作用是在0至30°C的溫度範圍間，宜在2至20。(： 且尤其是在4至l〇°c之溫度範圍間進行。 線 另種情況下，有可能要安定根據式(Illb)的化合物， 15尤其是其間根據式(Illb)的化合物是產生及/或使用於水溶 液的情況下，至於安定的方法，最好是將根據式(inb)的 化合物予以部分還原最佳，特別是當其中R，為氫之情 況，至於還原劑，可以使用所有適合產生所要的根據式 (IV b )的經烧基殿粉衍生物之試劑 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 25 HAS1
-58- (IVb) 本纸張尺度通用中國國豕標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公餐） 200418875 A7 ___ B7 五、發明說明（57) 根據本發明的尤其佳的具體實例，還原劑係使用氫硼 化鈉，例如NaCNBH3或NaBH4。 故’本發明也關於依上述方法製得的羥烷基澱粉衍生 物，其中的衍生物具有根據式(IVb)的結構組成。 5 還原作用是在介於4至l〇〇°C的溫度範圍間，宜在1〇 至90°C且尤其是在25至80°C之溫度範圍間進行。 本發明另與下列化合物的混合物相關：（IIIa)與 (Illb) ’（IVa)與(IVb)，（Ilia)與(IVa)，（Ilia)與(IVb)，（Illb) 與(IVa)，（Illb)與(IVb)，（Ilia)與(Illb)與(Iva)，（Ilia)與(Illb) 10 與(IVb)，(IVa)與(IVb)與(Ilia)，與(IVa)與(IVb)與(Illb)，其 中（Ilia)及/或(IVa)可分別獨立地呈一種構型其中n原子位 於水平向（equatorial)或軸向（axial)位置及/或其中（Illb)可使 其中C-N雙鍵呈現五或z構型。 本發明另關於根據本發明的HAS-多肽供使用於供治 15 療人類或動物身體之方法。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此外，本發明係關於包含本發明的HAS-多肽之一種 醫藥組成物，於一較佳的具體實例中，此醫藥組成物另包 含至少一種藥學可接受的稀釋劑、佐劑及/或有用於紅血 球生成素療法之載劑。 20 本發明另關於使用本發明的HAS-多肽配製一種供治 療貧血疾病或造血機能不良疾病或與之相關的疾病之醫藥 品。 本發明將以下述的圖、表與實例作更詳細的說明，不 代表本發明的範圍僅限於此。 -59- 張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（58) 各圖之簡短說明 圖1 圖1示出兩種HES-EPO共軛接合物之SDS page分析 mw : 標記物
通道1 : 根據實例程序8產生的HES-EPO: EPO被共軛 接合至醯肼-HES 12KDL 通道2 : 根據實例程序9產生的HES-EPO: EPO被共軛 接合至羥基胺基HES 12KD K C : 對照組（未共軛接合的EPO);較上面的帶，代 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表 EPO 二元體(dimer) 圖2 圖2證明HES是被共軛接合至碳水化合物側鏈的碳水化 合物部位，是以多肽N-糖苷酶消化HAS修飾的EPO型 結果 通道1 : 通道2 : 20 通道3 : 通道4 : mw ：
根據實例程序8，以多肽N-糖苷酶消化後的 HES-EPO 根據實例程序9，以多肽N-糖苷酶消化後的
HES-EPO BRPEP0標準品 以多肽N-糖苷酶消化後的BRP EPO標準品 標記物（Bio-Rad SDS-PAGE Standards Low Catalog No 161-0305，Bio-Rad Laboratories， Hercules，CA，USA) -60- 本紙張尺度適用中國國家標準((〕]^习八4規格（21〇x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（59) 圖3 圖3顯示根據實例17.1產生的HES-EPO共軛接合物之 SDS page分析結果 5 通道 A :蛋白質標記物 R〇ti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co，Karlsruhe，D);蛋白質標記物 的分子量(kD)，從頂至底為：245, 123, 77, 42, 30, 25.4，與 17。 通道B:根據實例17.1共軛接合作用後製得之粗製品。 10 通道C : EPO起始材料。 圖4 圖4顯示根據實例17.3產生的HES-EPO共軛接合物之 SDSpage分析結果 15通道A :根據實例17.3共軛接合作用後製得之粗製品。 通道B : EPO起始材料。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 通道 C :蛋白質標記物 R〇ti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co，Karlsruhe，D);蛋白質標記物 的分子量(kD)，從頂至底為：245，123, 77, 42, 20 30, 25.4，與 17。 圖5 圖5顯示根據實例17.4與17.5產生的HES-EPO共軛接 合物之SDS page分析結果 -61- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（6〇
通道A
通道B 通道C 通道D 蛋白質標記物 Roti®-Mark PRESTAINED Roth GmbH+Co，Karlsruhe，D);蛋白質標記物 .的分子量(kD)，從頂至底為：245，123, 77, 42, 30, 25·4，與 17。 根據實例17.4共軛接合作用後製得之粗製品。 根據實例17.5共輛接合作用後製得之粗製品。 ΕΡΟ起始材料。 圖 10圖6顯示根據實例19·1與19.4產生的HES-EPO共軛接 合物之SDS page分析結果 通道 A :蛋白質標記物 Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co，Karlsruhe，D);蛋白質標記物 的分子量(kD)，從頂至底為：245，123，77，42, 15 30, 25.4，與 17。 通道B :根據實例19.4共軛接合作用後製得之粗製品。 通道C :根據實例19.1共軛接合作用後製得之粗製品。 通道D : EPO起始材料。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 圖7 圖7顯示根據實例19.2，19.3，19.5，與19.6產生的 HES-EPO共輛接合物之SDS page分析結果 通道 A :蛋白質標記物 Roti@_Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co，Karlsruhe，D);蛋白質標記物 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（W) 的分子量(kD)，從頂至底為：245，123, 77, 42, 30, 25.4，與 17 〇 通道B :根據實例19.6，基於實例13.3 b)共軛接合作用 後製得之粗製品。 5通道C :根據實例19·5，基於實例13.1 b)共軛接合作用 後製得之粗製品。 通道D :根據實例19.6，基於實例13.3 a)共軛接合作用 後製得之粗製品。 通道E:根據實例19.5，基於實例13.1 a)共軛接合作用 10 後製得之粗製品。 通道F :根據實例19.2，共軛接合作用後製得之粗製 品。 通道G:根據實例19.3,共軛接合作用後製得之粗製 品。 15 通道K: EPO起始材料。 圖 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖 8 顯示根據實例 19.7，19.8，19.9，19.10，19.11，與 19.12產生的HES-EPO共軛接合物之SDS page分析結果 20 通道 A ··蛋白質標記物 Roti⑨-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co，Karlsruhe，D);蛋白質標記物 的分子量(kD)，從頂至底為：245，123, 77, 42, 30, 25.4，與 17。
通道B 根據實例19.11，共軛接合作用後製得之粗製 -63· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 _ B7 五、發明說明（62 ) 10 品。 通道C:根據實例191〇，共軛接合作用後製得之粗製 品。 通道D:根據實例19.7，共軛接合作用後製得之粗製 品。 通道Ε:根據實例19 8,共軛接合作用後製得之粗製 品。 通道F:根據實例19.12，共軛接合作用後製得之粗製 通道G · ΕΡΟ起始材料。 通道Κ :根據實例19·9，共軛接合作用後製得之粗製 品。 显9 15將EPO-GT-1進行溫和的酸處理5分鐘=通道2 ; 10 通道3 ; 60分鐘=通道4與不處理的EPO通道1 ;顯^ ; 除去Ν-聚醣後ΕΡΟ的變遷(+PNGASE)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖10 酿 2〇將ΕΡΟ皁離自未經處理的ΕΡΟ與得自ΕΡΟ在，和 Α ,μ篡醣& 水解條件下培育5分鐘、10分鐘、與60分鐘後的费a HPAGEC-PAD圖樣，羅馬數字I-V指出下列物質被 ， 出的位置：1=二唾液酸的二觸角（diantennary)結構 唾液酸的三觸角結構（兩異構物），111=四唾液酸的 四觸角 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 _ B7 五、發明說明（63 ) 結構+2 N_乙醯基乙醢胺重覆單元，四唾液酸的四觸角 結構+1 N-乙醯基乙醯胺重覆單元，v=四唾液酸的四觸角 結構+不含N-乙醯基乙醯胺重覆單元，寡醣結構的流洗地 f以括孤指出不帶或帶有ι_4個唾液酸之處。 5 ΜΛ1 N-連結的寡醣類於脫唾液酸後的HpAEC>pAD;顯示出 N-乙醯基神經胺酸的流洗位置；ι_9數字指出標準的寡醣 類的流洗位置；1 =二觸角的（diantennaiy) ; 2 =三觸角的 10 (2_4個異構物）；3 =三觸角的(2-6個異構物）；4 =四觸角 的；5 ==四觸角的加1重覆；6=四觸角的加i重覆；7 =四 觸角的加2重覆；8=四觸角的加2重覆與9=四觸角的加 3重覆。 15 MJ2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經溫和的處理與不處理的EP0進行唾液酸殘基之過碘酸 氧化作用後之SDS-PAGE分析，1 =以過峨酸氧化而未經 酸處理者；2 =過碘酸氧化與酸處理5分鐘；3 ==過碘酸氧 化與酸處理10分鐘；4 =過蛾酸氧化與未經酸處理；5 20 =BRPEP〇標準品，未經過碘酸與未經酸處理。 圖13 單離自未處理的EPO與經溫和的酸水解條件下培育5分 鐘與10分鐘並接著進行過碳酸處理的Epo之天然寡醣類 -65- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A7 ______ B7 五、發明說明（64 ) 之HPAEC-PAD圖譜，不帶及帶有ι-4唾液酸之募醣結構 的流洗地帶以括孤指出。 圖14 5 EP0-GT-1-A的HES-修飾作用的時間經過之SDS-PAGE 分析：20微克分量的EP0_GT-1_a被與羥基胺-修飾的 HES衍生物X作用30分鐘、2小時、4小時與17小時， 通道1 =30分鐘反應時間；通道2 =2小時反應時間；通 道3 =4小時反應時間；通道4 =17小時反應時間；通道5 10 =不經HES-修飾之EPO-GT-1-A ;左方圖顯示EPO-GT-1- A在羥基胺-修飾的HES衍生物X(流速：1毫升/分鐘)存 在下，隨增加的培育時間之移動性變遷：通道1 =30分鐘 反應時間；通道2 =2小時反應時間；通道3 =4小時反應 時間；通道4 =17小時反應時間；通道5 =經HES-修飾之 15 EPGK}T-1-A ;右方圖顯示相同樣品經N-糖苷酶處理之後 的分析。 圖15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 HES-EPO共輛接合物的Q-sepharose劃分的SDS-PAGE 20 分析：各1%的流通物(flow-through)與1%在高鹽濃度下 的流洗劃分被置於Speed Vac濃縮器内濃縮並載入至樣品 缓衝液中之凝膠上，利用考馬斯藍（Coomassie Blue)將 EPO蛋白質染色，a =樣品I ; B =樣品II ; C =樣品III ; κ =對照的EPO-GT-1 ; A卜Bl，Cl與K1為流通的劃 -66- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公釐） 200418875 A7 ___________ B7 五、發明說明（65) 分；A2，B2，C2與K2為以高鹽濃度流洗之劃分。 圖16a HES-修飾的EPO樣品A2的SDS-PAGE分析（見圖， 5對照的EP〇樣品K2與EPO-GT-1-A EP〇製劑，在N-糖 苷酶存在下進行消化以除去N-連結的寡聽類，缺少或含 有0-聚醣之所有的EP0樣品顯現移動變遷至較低分子量 處，在脫I糖化作用後，觀察到HES-修飾的EP〇樣品 A2有較低比例的〇_糖化的與未糖化的蛋白質且在3〇 10 KDa附近偵_擴散的蛋白f帶，可_删_修飾作用 發生於0-聚_殘基之唾液酸位置（見以星號標示之箭號 處）。 圖16b 15 HES-修飾的EP0樣品A2sds_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 PAGE分析（見圖15) ’對照的EPO樣品K2與EPO-GT-1-A EPO製劑’其為未處理或在N•糖苷酶存在下進行消化 以除去N-連結的寡聽類者（見圖⑽），兩種高分子量型 A2(N-料酶處理前)與举㈣酶處理後)(見括弧部分有 及沒有前料分），經酸處理樣品後消失了，作為比較的 BRPEP0鮮^敍細:溫和的酸處理。 圖17 釋放自HES-修飾的樣品A、釋放自Ep〇_GT小a與釋放 I紙張尺錢时S目緖準 -67- 200418875 A7 ——:-~ _ B7 五、發明說明(66) ---- 自與未修飾的HES -起培育之對照的EpQ樣品(κ)的ν_ 連結的募醣類材料的HPAEC_PAD分析，羅馬數字”指 出下列物質被流洗出的位置：1=二唾液酸的二觸角 (dmntennary)結構，11=三唾液酸的三觸角結構（兩異構 5 ，），ΙΠ=四唾液酸的四觸角結構+2 N_乙醯基乙醯胺重覆 單兀，IV=四唾液酸的四觸角結構+1 N_乙醯基乙醯胺重覆 單元四唾液酸的四觸角結構+不含N_乙醯基乙醯胺 重覆單元，括弧指出二…三_與四唾液酸化的N_聚醣類 之流洗處’如圖10與13中說明。 10 圖18 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 釋放自HES_修飾的樣品A、釋放自epo-GT-IA與釋放自 與未修飾的HES —起培育之對照的EPO樣品(K)的N-連 結的寡醣類材料的HPAEC-PAD分析，標準的寡醣類的混 15合物之滯留時間為：1-9數字指出標準的寡醣類的流洗位 置；1 =二觸角的（diantennary) ; 2 =三觸角的（2_4個異構 物），3 —二觸角的（2_6個異構物）；4 =四觸角的；5 =四觸 角的加1重覆；6 =四觸角的加1重覆；7 =四觸角的加2 重覆；8=四觸角的加2重覆與9=四觸角的加3重覆。 20 圖19至25 圖19至25代表分離自HES-修飾的EPO與對照的EPO 製劑經酵素釋放或化學脫唾液酸的N-聚醣之MALDI/TOF 質譜’主要的訊號出現於m/z 1809.7，2174.8，2539.9， -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 _______________ B7 五、發明說明（67) 29〇5·0與327〇.l([M+Na]+)，相當於二至四-觸角的錯合 物-類型义聚_結構帶有〇，1或2個的N_乙醯基乙醯胺 重覆單元者；另外伴隨的弱訊號是因為用於脫除樣品的 唾液酸供MS分析之酸性條件下，造成海藻糖或半乳糖的 5 損失而來。 圖19 MALDI/TOF譜：HES-修飾的EPO A2之脫唾液酸的寡醣 類。 10 圖20 MALDI/TOF譜·· EPO GT-1-A之脫唾液酸的寡醣類。 圖21 15 MALDI/TOF譜：EPOK2之脫唾液酸的寡醣類。 圖22 MALDI/TOF譜：EPO-GT_l之脫唾液酸的寡醣類。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 圖 23 MALDI/TOF譜··對EPO-GT-1進行5分鐘的酸水解後之 脫唾液酸的寡醣類。 圖24 -69- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（68 ) MALDI/T〇F譜：對EPOGTM進行1〇分鐘的酸水解後之 脫唾液酸的募酶類。 圖25 5 MALDI/T〇F譜：對EP0-GT-1進行6〇分鐘的酸水解後之 脫唾液酸的募醣類。 實例 實例1
10 生產重組的EPO A)生產於哺乳類細胞 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用下述方法於CHO細胞生產重組的EPO 含有人類EPO cNAD的質粒被克隆(ci〇ned)進入真核 細胞的表現媒質(pCR3，後面稱之為pCREPO)，係使用標 15 準程序（Grabenhorst，Nimtz，Costa et al·，1998，In vivo specificity of human alpha 1,3/4-fucosyltransferases III-VII in the biosynthesis of Lewis(x) and sialyl Lewis(x) motifs on complex-type N-glycans-Coexpression studies from BHK-21 cells together with human beta-trace protein, J. Biol. Chem.? 20 273(47)，30985-30994)進行位置定向的誘變作用（site directed mutagenesis) ° CHO細胞能穩定地表現人類EPO或胺基酸變體(例如
Cys-29—Ser/Ala，或 Cys-33—Ser/Ala，Ser-126—Ala 等 等），故如所揭露的（Grabenhorsy et aL)被以鱗酸#5沈殿法 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（6 9) 及選擇的與G418-硫酸鹽產生，於轉殖感染三天後，將細 胞以1 ·· 5進行次培養並在含i〇%fbs與1,5克/升G418 硫酸鹽中選擇。 使用此種選擇步驟，通常存活100-500克隆並將其置 5於篩選介質中再繁殖2-3星期，再將匯合生長的單層物之 細胞培養物的上澄液，以西方墨點分析法及IEF/西方墨 點分析法，進行分析EPO表現值。 EPO從穩定的次克隆中被產生於旋轉式燒瓶或2升 的灌流反應器内，具不同量NeuAc(例如2-8，4-10，8-12 10 NeuAc殘基)之不同的EPO之糖化型是根據已公開的作業 書，使用如下描述的各種層析程序的混合方法進行。 文獻： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Grabenhorst, Conradt， 1999， The cytoplasmic， 15 transmembrane, and stem regions of glycosyltransferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi” J Biol mChem·，274(51)，36107-16; Grabenhorst，Schlenke，Pohl，Nimtz，Conradt，1999，Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the 20 glycosylation pathway in mammalian host cells, Glycoconj J.5 16(2)，81-97; Mueller，Schlenke，Nimtz，Conradt，Hauser， 1999， Recombinant glycoprotein product quality in proliferation-controlled BHK-21 cells, Biotechnology and bioengineering，65(5)，529-536; Schlenke, Grabenhorst, -71- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（70)
Nimtz, Conradt, 1999, Construction and characterization of stably transfected BHK-21 cells with human-type sialylation characteristic，Cytotechnology，30(1-3)，17-25 o 5 B)生產於昆蟲細胞 依照文獻中揭露的方法在polyhedrin啟動子的控制下 將含有人類EPO cNAD的重組的桿狀病毒(baculovirus)媒 質感染入昆蟲細胞株SF9與SF 21，使之產生重組的人類 EPO 〇 10 將細胞培養在不含血清的培養基中，感染的細胞密度 為每毫升中為2xl06或X 107且每天在細胞培養上澄液測 定EPO滴定度，EPO的純化是於Q-Sepharose上，利用 Blue sepharose層析、離子交換層析與最後於C4-Phase上 進行RP-HPLC而得。 15 文獻： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Grabenhorst，Hofer，Nimtz，Jager, Conradt， 1993, Biosynthesis and secretion of human interleukin 2 glycoprotein variants from baculovirus-infected Sf21 cells 5 20 Characterization of polypeptides and posttranslational modifications，Eur J Biochem·，215(1)，189-97; Quelle, Caslake，Burkert，Wojchowski，1989，High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector，Blood，74(2)，652-7 o -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（71) 實例2
具反應性的HES衍生物的形成 1. SH-反應性HES
1.1 EMCH與酮基-HES12KD反應以形成SH-反應性的 HES12KDB
B 10 HES^
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將 0.144 克(0·012 毫莫耳）的酮基-HES12KD(Fresenius 15 German Patent DE 196 28 705 A1)溶解於 〇·3 毫升的絕對二 甲亞砜（DMSO)，在氮氣層下，被滴入置在1.5毫升 DMSO中之34毫克(0.15毫莫耳)EMCH混合液中（Perbio Science，Deutschland GmbH，Bonn，Germany)，在 60〇C 下 攪拌19小時後，將反應混合物加至16毫升1:1的乙醇 20 與丙酮的混合液内，經離心收集沈澱，再溶解至3毫升 DMSO内，再進行一次沈澱，離心後可得SH-反應性的-HES12KD B，置於真空下乾燥，與硫-EPO的共軛接合反 應被說明於實例3, 2.2。 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（72) 另種方法： 於此反應中，可使用呈現醯肼-與馬醯亞胺官能，以 間隔區（spacer)分開之所有的交聯_聯結子，那種基的分子 之另外的實例可取自 Perbio Science，Deutschland GmbH， 5 Bonn，Germany，被示於表2 ;以“A”標記者，此外，也 可取代馬來醯亞胺官能而以呈現活化的二硫化物官能的另 種交聯-聯結子取代。 1.2 HES糖甘基胺類的鹵基乙酿胺-衍生物類 10 a)糖苷基胺-形成1 將1毫克的-HES12KD溶解於3毫升飽和的碳酸氳銨 中，在30°C培育120小時期間，另加入額外的碳酸氫銨 以維持溶液的飽和狀態，藉將反應混合物的直接冷凍乾燥 將此胺基-HES12KDC脫鹽。 15
b)以氯乙酸酐醯化糖苷基胺C 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1毫克的胺基-HES12KD C溶解於1毫升的1M碳 酸氫銨溶液中並置於冰上冷卻，對其加入氣乙酸酐（約5 毫克）的晶體，令反應混合物回溫至室溫，監測其PH，如 20 果酸鹼值掉至7.0以下時，再加入少許鹼，在室溫下反應 2小時後，加入第二次量的鹼與酸酐，六小時後，將產物 氣乙酿胺-HES D1 (X =C1)脫鹽，是使其通過混合的
Manger, Wong, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10733-10740; Manger, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10724-10732 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（73 )
Amberlite MB-3(H)(0H)離子交換樹脂床進行 10 c)以溴乙酸酐醯化糖苷基胺2 依據Thomas3揭露的方法製備溴乙酸酐，將！毫克的 胺基-HES12KD C樣品溶解於〇」毫升的乾中並置 於冰上冷卻，對其加入溴乙酸酐，令反應混合物慢慢回溫 至室溫並將其攪拌3小時，在-2CTC下，將反應混合物加 至1毫升的1 : 1的乙醇與丙酮的混合物中，離心收集沈 瓜’再浴解至0·1毫升DMF中，再進行一次沈殿，離心 後可得溴乙醯胺-HES D2 (X=Br)，置於真空下乾燥，與 硫-EPO的共軛接合反應被說明於實例3, 12。 d)相關的碘-衍生物D3 (X=I)的合成法如同製備D2的說 明，只是溴乙酸酐醯被取代成N-琥珀醯亞胺基碘乙酸 15 醋酯且所有的步驟在黑暗中進行。 HES、
HES、
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 或者： 為醯化胺基，鹵素酸性酸類的其他經活化的類型可使 用，例如
Black, Kiss, Tull, Withers, 1993, Carbohydr. Res., 250, 195 3 Thomas, 1977, Methodes EnzymoL, 46, 362 -75- 本紙張尺度適用中闕家標準(CNS)A4規格（21GX297公爱 1 " ------ 200418875 A7 B7 五、發明說明（74 ) - 溴化物類或-i化物類 -自旨類’例如N-每基玻ίό酸亞胺g旨，與經取代的苯紛類 (對-硝基酚、五氟酚、三氣酚等等）形成之酯類 此外’所有具有具反應性胺基與鹵素乙酿基官能，欲 5間隔區分開的交聯-聯結子均可被使用，其中實例為 SBAP ’此種分子與其他物質可得自perbi〇 Science，
Deutschland GmbH，Bonn，Germany，在表 2，它門被標言己 成“D” ’作為交聯-聯結子使用以連結胺基-HES與硫_ EPO而不進行鹵素乙醯胺-HES衍生物分離的方法，見實 10 例3, 1.2的說明。 1.3胺基-HES E的鹵素乙醯胺-衍生物類1 a) 1，4-二胺基丁烷與酮基-HES12KD反應以形成胺基-HES12KD E4 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1.44克(0·12毫莫耳）的酮基-HES12KD溶解於3毫 升的乾燥二曱亞砜(DMSO)，在氮氣層下，滴入置在15毫 升DMSO中之1.51毫升（15毫莫耳）的1，4-二胺基丁烷的 混合液中，在40°C下攪拌19小時後，將反應混合物加至 20 160毫升1 : 1的乙醇與丙酮的混合液中，離心收集胺基— HES12KD E之沈澱，再溶解至40毫升水中，以水透析4 天（SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science， S. Frie, Diplomarbeit, Fachhochschule Hamburg, 1998 -76- 主紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（75)
Deutschland GmbH，Bonn，Germany)並予以冷;東乾燥。
b) 依上述1·3中製備氯乙醯胺-HES12KD D1的方法製備 氯乙醯胺-HES12KDF1 c) 依上述1.3中製備溴乙醯胺-HES12KD D2的方法製備 溴乙醯胺-HES12KD F2(X=Br) 10 d)相關的碘-衍生物F3(X=I)，在其與硫-EPO反應之前不 予以分離開，此實驗被揭露於實例3, 1.1。 或者： 見上述1.2 15
2.具CHO-反應的HES 2.1 醯肼-HES a)醯胼與酮基-HES12KD的反應 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
J -77- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（76 ) 將1.44克(〇·12愛莫耳）的酮基-HES12KD溶解於3毫 升的絕對二甲亞艰(DMSO)，在氮氣層下，滴入置在15毫 升DMSO中之〇·47毫升（15毫莫耳）的醯肼混合液中，在 40°C下攪拌19小時後，將反應混合物加至ι6〇毫升1 : 1 5 的乙醇與丙酮的混合液中，離心收集產物J，再溶解至40 毫升水中，以含有〇.5%(v/v)三乙基胺的水溶液透析2天 後，再以水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5 KD cut off， Perbio Science，Deutschland GmbH，Bonn，Germany)並予以 冷凍乾燥，與氧化的醣-EPO的共軛接合反應被描述於實 10 例 4, 2.2。 b)以酮基-HES12KD與己二醯肼的反應 HES. 15 、〇、丁 η ΗΟΛ Η Μ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 HES、
〇H \〇 將1.74克（15毫莫耳）的己二醯胼在65°c下溶解於20 20毫升的絕對二曱亞颯(DMSO)，再於氮氣層下，滴入溶解 於3毫升絕對DMSO中之1.44克(〇·12毫莫耳）的酮基-HES12KD ’在6〇〇C下攪拌68小時後，將反應混合物加至 200毫升的水中，溶液中含有的乙以含有〇·5%(ν/ν)三乙 基胺的水溶液透析2天後，再以水透析2天(SnakeSkin透 -78- 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 _____B7 五、發明說明（ 析管，3.5 KD cut off，perbio Science, Deutschland GmbH， Bonn，Germany)並予以冷凍乾燥，與氧化的醣_EP〇的共 輛接合反應被描述於實例4, 2.2。 5 或者·· 此外，也可使用其中2醯肼基被任何間隔區（spacer) 分開之衍生物。 3·另外的胺基-HES12KD衍生物類I與H1 10 分別將D或F進行胺解反應，將各1毫克的鹵素乙 醯胺溶解於0.1毫升的飽和的碳酸銨溶液内，在30°c下培 育120小時期間另添入固體碳酸銨以維持成飽和的溶液， 在-20°C下，將反應混合物加至1毫升的1 ·· 1的乙醇與丙 酮的混合物中，離心收集沈澱，再溶解至0 05毫升水 15 中，再進行一次沈澱，離心取得產物胺基HES Η或I，置 於真空下乾燥，與氧化的醃-ΕΡΟ的共輛接合反應被說明 於實例4, 4.1。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 ES,
Η —
X
(/ο -2 Η.- 本紙張尺度適用中國國家標規格（21〇χ297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（7〇
4.經經基胺-修飾的HES12KDK
κ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 根據Boturyn et al描述的方法，.從購得的材料1，以2 步驟合成〇-[2-(2-胺基氧·乙氧基)_乙基]-經基胺，將1.44 10克(〇·12毫莫耳）的酮基-HES12KD溶解於3毫升的絕對二 甲亞颯(DMSO)中，再於氮氣層下，滴入溶解於15毫升 DMSO中之2·04克(15毫莫耳)的σ·[2-(2_胺基氧-乙氧基)_ 乙基]-羥基胺混合物内，在65°C下攪拌48小時後，將反 應混合物加至160毫升的1 : 1之乙醇與丙酮的混合物 15 中，離心收集沈澱的產物K，再溶解入40毫升水内，以 水透析 4 天（SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science，Deutschland GmbH，Bonn，Germany)並予以冷;東乾 燥，與氧化的醣-EPO的共軛接合反應被描述於實例4, 3·1。 20 或者： 此外，也可使用其中二個羥基胺基被任何間隔區 1
Boturyn, Boudali, constant, Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7
五、發明說明（79) (spacer)分開之衍生物。 5.硫-HES12KD 5.1加至酮基-HES12KD
HES
^ 〇H '〇
HES
NH
SH 10 Μ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1.44克(〇·12毫莫耳）的酮基-HES12KD溶解於3毫 升的絕對二甲亞砜(DMSO)中，再於氮氣層下，滴入置於 15毫升DMSO中之1·16克（15毫莫耳）的半胱胺醯胺混合 15 物内，在40°C下攪拌24小時後，將反應混合物加至160 毫升的1 : 1之乙醇與丙酮的混合物中，離心收集沈澱的 產物Μ，再溶解入40毫升水内，以含有0.5% (v/v)三乙 基胺之水溶液透析2天並再以水透析2天（SnakeSkin透析 管，3.5 KD cut off，Perbio Science，Deutschland GmbH， 20 Bonn，Germany)並予以冷康乾燥，與氧化的醣-EPO的共 軛接合反應被描述於實例4, 2.1。 或者： 此外，也可使用其中的胺基與硫-官能基為被任何間 -81-
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 Α7 Β7 五、發明說明（8〇 ) 隔區（spacer)分開之衍生物，此外，於衍生物中之胺基可 被取代成聯胺、醯肼或羥基胺，硫-官能基可為被保護型 式，例如二硫化物或三苯甲基_衍生物，無論如何，此情 況下在進行共輛接合反應之前必須進行脫保護反應以釋 5 放出類似於Μ之化合物。 5·2胺基-HES12KDE，H或I的修飾反應 a)以 SATA/SATP 修飾 將1·44克(0.12毫莫耳）的胺基_HES12KD Ε，η或I溶 10解於3毫升的絕對一曱亞石風(DMSO)中，再於氮氣層下， 滴入置於5毫升DMSO中之139毫克(〇·6毫莫耳）的 SATA混合物内，在室溫下攪拌24小時後，將反應混合 物加至160毫升的1 : 1之乙醇與丙酮的混合物中，離心 收集沈)¾的產物N ’再溶解入4 0愛升水内，以水透析2 15 天（SnakeSkin 透析管，3·5 KD cut off，perbio Science， Deutschland GmbH，Bonn，Germany)並予以冷康乾燥。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 脫保護反應是於含有25 mM EDTA與0·5 M經基 胺，pH 7.5的50 mM的填酸鈉緩衝液中，，於室溫下進行 2小時，利用含有1 mM EDTA，pH 5·5的〇·ιμ乙酸納緩 20 衝液透析純化，脫保護反應之後立即進行共輛接合反應， 其方法被描述於實例4, 2.1。 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 _____ B7 五、發明說明（ Η ^〇Η HES、
HES'
\
Deprotection
15 b)以SPDP修飾 將1·44克(0.12毫莫耳）的胺*-HES12KD Ε，η或I溶 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 解於3毫升的絕對二甲亞砚①MS〇)中，再於氮氣層下， 滴入置於5毫升DMSO中之187毫克(0.6毫莫耳）的 SPDP混合物内，在室溫下攪拌24小時後，將反應混合 物加至160毫升的1 : 1之乙醇與丙酮的混合物中，離心 收集沈澱的產物P，再溶解入40毫升水内，以水透析2 天（SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science， Deutschland GmbH，Bonn，Germany)旅予以冷康乾燥。 脫保護反應是於含有每0.5毫升的100 mM醋酸鈉緩 -83 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（82)
，液含有12宅克二碳赤蘚糖醇(DTT)的溶液，含100 mM 氯化納’於pH 4·5，室溫下進行30分鐘，利用含有1 mM EDTA ’ pH 5.5的01M 6酸鈉緩衝液透析純化，脫 保護反應之後立即進行共軛接合反應，其方法被描述於實 5 例 4, 2.1。 或者： ^為將胺基-轉變至硫醇基-，不管是呈游離態或被保護 悲，可取得多種的試劑，在修飾後，可將產物單離出來， 10或者’作為可被接受使用於交聯劑時，它們可被直接使用 於共軛接合反應’宜為經純化處理後進行，為單離與儲存 硫-HES衍生物類，宜製備呈保護的型態之硫-HES衍生物 類’為此’可使用使用類似於SATA的所有衍生物類， 其具有活化的酯-官能與硫醚-官能並以間隔區分開；此基 15的另一員，SATP，在表2中，以“η”標記者，此衍生 物類與SPDP類似，可具有一活化的酯_官能與二硫化物_ 官能，並以任意間隔區分開。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 這類基的另外族群，在表2中，以“F”標記，另外 的類似竹生物類可具有活化的醋-官能與硫醇-官能，呈三 20苯曱基衍生物被保護，以任意間隔區分開。 實例3 臭硫-EPO的共軛接合及應 1.硫-EPO與鹵素乙醯胺_修飾的SH-反應性的HES之反 25 應 -84- 本紙張尺度適用中國軋家標準(CNS)A4規格（210χ297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（83 ) 1.1實例作業手冊1 以含NH S -活性的-酯與碘乙醯胺基之交聯-聯結子(例 如SIA6)將硫-EPO共軛接合至胺基-HES12KD(E，Η或I) 5 材料 Α.硼酸緩衝液，組成分為50 mM硼酸鈉，pH 8.3，5 mM EDTA。 Β· PBS，磷酸鹽缓衝的鹽水：1〇 mM填酸鈉，150 mM NaCn，pH 7.4。 10 C.胺基HES12KDE，H或I，製成在硼酸鹽緩衝液中的1 毫克/毫升。
D.交聯連結劑儲備溶液：14毫克SIA被溶解於1毫升 DMSO E· D-，TMDextran脫鹽的柱層，2x5毫升，柱層床容量 15 (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany) F· Coomassie® 蛋白質分析試劑（Perbio Science， Deutschland GmbH, Bonn，Germany) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 G·硫-EPO溶液：在硼酸鹽缓衝液中的5毫克/毫升的硫-EPO 丄。 20 H.微濃縮器：Mcrocon YM-3 (amicon，Milipore GmbH， Eschborn，Germany)
Cumber, Forrester, Foxwell, Ross, Thorpe, 1985, Methods EnzymoL, 112, 207 -8 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） 200418875 A7 -----B7 五 '發明說明（84) 方法 將100微升SIA溶液加至400微升的胺基fjES12KD E溶液，在室溫下攪拌〇·5小時使之反應，使用微濃縮器 在14000 X g下將樣品離心除去過量的交聯連結劑，離心 5後將樣品置於原體積量的硼酸緩衝液中，再重覆此程序兩 遍，殘留的溶液被加至1毫升的硫疋％)溶液並將此反應 混合物置於室溫下培育16小時，過量的碘乙醯胺的反應 性於培育期終了時經添加半胱胺酸至最後濃度為10 mM 而中止’將反應混合物施加至以PBS缓衝液平衡的脫鹽 10的柱層且蛋白質含量使用Coomassie蛋白質分析試劑監 測’所有含蛋白質共扼接合物的劃分被收集在一處，經水 透析過夜後，將所得的共輛接合物予以冷凍乾燥。 或者： 15 於此反應中，也可使用其具有琥珀醯亞胺-或硫琥珀 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 醯亞胺官能與碘乙醯胺官能基被間隔區（spacer)分開之交 聯-聯結子，其他的實例被列於表2，標記為“C”者，其 可購自 Perbio Science，Deutschland GmbH，Bonn， Germany。 20 1·2實例作業手冊2 將硫-EPO JL共軛接合至SH-反應性HES12KD溴乙醯 -86- 本紙張尺度適甩中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A7 _B7________ 五、發明說明（85 ) 胺D2，F2或碘乙醯胺D3.1 材料 A·磷酸緩衝液，組成分為100 mM磷酸鈉，PH 6·1，5 5 mM EDTA 〇 B. PBS，磷酸鹽緩衝的鹽水：10 mM磷酸鈉，150 mM NaCn，pH 7.4 〇 C. SH反應的HES12KD溴乙醯胺D2，製成在磷酸鹽缓 衝液中的10毫克/毫升溶液。 10 D· D-鹽TM Dextran脫鹽的柱層，2 X 5毫升，柱層床容量 (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany) E. Coomassie® 蛋白質分析試劑（Perbi0 Science， Deutschland GmbH, Bonn, Germany)
F·硫-EPO溶液：在磷酸鹽缓衝液中的5毫克/毫升的硫-15 EPO 方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1毫升的SH反應性的HES12KD溴乙醯胺D2溶 液與1毫升的硫-EPO溶液併合，在室溫下將混合物培育 20 48小時，過量的溴乙醯胺的反應性於培育期終了時經添 加半胱胺酸至最後濃度為10 mM而中止，將反應混合物 施加至以PBS缓衝液平衡著的脫鹽的柱層，蛋白質含量 1 de Valasco, Merkus, Anderton, Verheul, Lizzio, Van der Zee, van Eden, Hoffmann, Verhoef, Snippe, 1995, Infect. Immun., 63, 961 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（86 ) 使用Coomassie蛋白質分析試劑監測，所有含蛋白質共軛 接合物的劃分被收集在一處，經水透析過夜後，將所得的 共輛接合物予以冷;東乾燥。 5 或者： 除了分離SH反應性的HES12KD-溴乙醯胺D2，胺基 HES12KD(E，H，I)可被與交聯-聯結子經由琥珀醯亞胺-與 溴琥珀醯亞胺官能（見前述之1·1)連結，SBAP是這類交 聯-聯結子之一員，其他的實例被列於表2，標記為“D” 10 者。 2. Thio_EPO與馬來醯亞胺-修飾的SH-反應性HES的反應 2.1實例作業手冊3 以含有醯肼與馬來醯亞胺官能基之交聯-聯結子（例如 15 M2C2H)使 ThioEPO 共軛接合至 HES12KD 材料 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A· M2C2H儲備液：1〇毫克/毫升m2C2H，溶於DMSO， 新鮮配製 20 B· HES12KD : 10毫克/毫升，於〇.1 μ醋酸鈉缓衝液， pH 5.5 C· ThioEPO溶液：5毫克/毫升的ThioEPO，於磷酸鹽 /NaCl-緩衝液中 D·填酸鹽/NaCl : 0·1 Μ 填酸鹽，50 mMNaC卜 pH 7·0。 -88- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（87 ) E.微濃縮器· Microcon YM-3(amicon，Milipore GmbH， Eschborn, Germany) F·凝膠過濾柱層：例如，Sepharose®G-200(1.5 X 45 cm) G· Coomassie® 蛋白質分析試劑（perbi〇 Science， 5 Deutschland GmbH, Bonn, Germany) H. PBS，磷酸鹽緩衝的鹽水：i〇 mM磷酸鈉，150 mM NaQ，pH 7·4 〇 方法 10 將ΜΑΗ溶液加至400微升的HES12KD溶液至最 後為1 mM的濃度並在室溫下攪動反應2小時，過量的交 聯-聯結子是使用微濃縮器在14000 X g下離心樣品60分 鐘而除去，離心後將樣品置於原體積量的磷酸/NaCl緩衝 液中，再重覆此程序兩遍，對M2C2H-修飾的HES12KD 15溶液加入0·5毫升的ThioEPO溶液，在室溫下將此反應混 合物培育2小時，過量的馬來醯亞胺類的反應性於培育期 終了時經添加半胱胺酸至最後濃度為 10 mM而中止，將 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 反應混合物施加至以PBS緩衝液平衡的86口1^1036©〇-20〇 (1·5 X 45 cm)柱層並收集1毫升劃分，劃分中的蛋白 20質含量使用Coomassie蛋白質分析試劑監測，所有含蛋白 質共軛接合物的劃分被收集在一處，經水透析過夜後，將 所仔的共輛接合物予以冷;東乾燥。 處理過程應注意事項： -89- 玉紙張尺度適用家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公楚） 200418875 A7 _ B7 五、發明說明（88) 在極端pH下，腓(hydrazone)加合物不太安定，應用 時可能需包含在低pH下處置，我們以30 mM的氰基氫 蝴化納在PBS缓衝液内將腓還原成聯胺(hydrazine)，大部 分的應用，並不需要此額外步驟。 5 2.2實例作業手冊4
將ThioEPO共軛接合至馬來醯亞胺基-HES12KDB 材料 10 A·馬來醯亞胺基-HES12KD B ·· 10毫克/毫升，於0.1M 醋酸鈉緩衝液，pH 5.5 Β· ThioEPO溶液：5毫克/毫升的ThioEPO，於磷酸鹽 /NaOk緩衝液 C·磷酸鹽/NaCl-緩衝液：0.1M磷酸鈉緩衝液，50 mM 15 NaCl? pH 7.0 D·凝膠渡過柱層：例如，Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) Ε· Coomassie® 蛋白質分析試劑（Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 F. PBS磷酸鹽緩衝的食鹽液：i〇 mM磷酸鈉，150 mM 20 NaCl，pH 7.4 方法 將1毫升的SH-反應性的HES12KD B溶液與1毫升 的ThioEPO U容液併合，在室溫下將混合物培育2小時， -90- }紙張尺度適用中_家標準(CNS)A4規格（ ho χ297公餐)--- 200418875 A7 B7 五、發明說明（89 ) 過量的馬來醯亞胺類的反應性於培育期終了時經添加半胱 胺酸至最後濃度為10 mM而中止，將反應混合物施加至 以 PBS 缓衝液平衡著的 Sepharose® G-200 (1.5 X 45 cm)柱 層並收集1毫升劃分，劃分中的蛋白質含量使用 5 Coomassie蛋白質分析試劑監測，所有含蛋白質共軛接合 物的劃分被收集在一處，經水透析過夜後，將所得的共扼 接合物予以冷凍乾燥。 2.3實例作業手冊12 10 以含有NHS-活性的-酯與馬來醯亞胺基之交聯-聯結 子(例如SMCC)使ThioEPO共輊接合至HES12KD (E，H，I) 材料 A. 微濃縮器：Microcon YM_10 (amicon，Milipore GmbH， 15 Eschborn, Germany) B. PBS，磷酸鹽缓衝的鹽水：10 mM磷酸鈉，150 mM NaQ，pH 7·4 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 C·胺基HES12KD E，H或I，10毫克/毫升，溶於PBS緩衝 液中
20 D. SMCC溶液：1毫克SMCC溶於50微升DMSO E. D-鹽™ Dextran脫鹽的柱層，2 X 5毫升，柱層床容量 (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany) F· Coomassie® 蛋白質分析試劑（Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Germany) -91- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 五、發明說明（9〇). G· ThioEPO 1溶液：在碟酸蜂绾免、> t —分狀你〜畋盟緩衝液中的5毫克/毫升的
ThioEPCM。 方法 對50微升的SMCC溶液，加入獅微升的胺基 HESUKD E紐並在室溫下縣反應⑽_及在抓 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 下反應1G分鐘，過量的交聯，聯結子是使用微濃縮器在 刚⑽X g下離心樣品60分鐘而除去，離心後以pBs缓 衝液將樣品體積加至450微升，再重覆此程序兩遍，最後 一次離心後，殘留溶液經PBS補充至45〇微升，並被加 至1毫升的ThioEPO溶液，在室溫下將此反應混合物培 月16小時，過量的馬來酿亞胺的反應性於培育期終了時 經添加半胱胺酸至最後濃度為1〇 mM而中止，將反應混 合物施加至以PBS緩衝液平衡的脫鹽的柱層，劃分中的 蛋白質含量使用Coomassie蛋白質分析試劑監測，所有含 蛋白質共扼接合物的劃分被收集在一處，經水透析過夜 後’將所得的共輛接合物予以冷束乾燥。 或者： 於此反應中，也可使用其具有琥珀醯亞胺-或硫琥珀 醯亞胺官能與馬來醯亞胺-官能基被間隔區分開之交聯_聯 結子，此類分子的實例被列於表2，標記為“E”者，其 可購自 Perbio Science, Deutschland GmbH，Bonn，
Germany。另有一類交聯聯結子，其具有取代馬來醯亞胺 -92- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 ____ B7 五、發明說明（91) 功能之經活化的二硫化物功能，這些交聯-聯結子也可被 使用於共扼接合反應，無論如何，此共軛接合物的二硫化 物鍵在還原性條件下是可被斷裂的，此類分子的實例被列 於表2，標記為“F，，，第三類作為交聯_聯結子用途，以 5具有SH-活化的基之乙烯基砚功能取代馬來醯亞胺功能 者，為在表2中以“g”標記之“svSB” 。 實例4 與氧也共軛接合的反應 10 1·醣-EPO的氧化 1.1以偏-過碘酸鈉氧化醣_EP〇 :實例作業手冊5 材料
A·酷-EPO溶液，溶於乙酸緩衝液中之10毫克/毫升醣_ 15 EPO 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
B·偏-過碘酸鈉溶液：1〇 mM或100 mM過碘酸鈉溶於 乙酸緩衝液，新鮮配製，保存於黑暗中，使用迢些溶 液時’在氧化混合物中的過碘酸的濃度分別為1mM 或 10 mM 20 C·醋酸緩衝液：〇·ΐΜ醋酸缓衝液，pH5.5 D. 甘油 E. 微濃縮器：Microcon YM，3(amicon，Milipore GmbH， Eschborn, Germany) -93- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 ---- B7 五、發明說明~---- 方法 所有步驟均在黑暗中進行。 對1.毫升冷卻的醣-EPO溶液，加入Q1毫升的冷的 偏-過碘酸溶液，讓此氧化反應在黑暗中進行一小時，如 5果將被氧化的醣·Ep〇含有唾液酸殘基，則氧化條件為i mM的過碘酸鈉，，耍不然使用1〇 mM過碘酸鈉， 室溫下進仃，為終止氧化，將甘油加入至最後濃度為15 mM曲並於（TC下培育5分鐘，過量的試劑與副產物是使用 微濃縮器在14000 x g下離心樣品6〇分鐘而除去，離心 10後以緩衝液將樣品體積弄回原體積，進行下一步的修飾步 驟，例如，置於醋酸緩衝液内，此程序被再重覆兩次。 1.2醣-EPO的酵素氧化作用：實例作業手冊6 EPO的酵素氧化作用被揭露於他處(Chamow et al·， 15 1992, J· Biol. Chem·，267, 15916-15922)。 2·與聯胺/酿肼·衍生物進行共輛接合作用 2·1實例作業手冊7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以含酸肼與馬來醯亞胺官能基的交聯_聯結子（例如 20 M2C2H)共輟接合氧化的醣-ΕΡΟ至Thio-HES12KD Μ，Ο或 Q (Perbio Science，Deutschland GmbH，Bonn，Germany) 〇 材料 A· M2C2H儲備液：10毫克/毫升m2C2H，溶於DMSO， -94- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（93 ) 新鮮配製 B·氧化的醣-EPO溶液，得自6丄1 : 5毫克/毫升的醣-EPO，於醋酸鈉緩衝液中 C· Thio-HES12KD M，〇或Q : 1〇毫克/毫升，於磷酸鹽 5 /NaCl緩衝液中 D.醋酸緩衝液：0·1 Μ醋酸鈉緩衝液，pH 5.5 Ε·磷酸鹽/NaCl : 0·1 Μ 磷酸鹽，50 mMNaQ，pH 7.0 F·微濃縮器：Microcon YM_3(amicon，Milipore GmbH， Eschborn, Germany) 10 G.凝膠過濾柱層：例如，Sepharose® G-200(1.5 X 45 cm) H· Coomassie® 蛋白質分析試劑（perbi〇 Science， Deutschland GmbH，Bonn，Germany) I· PBS，填酸鹽缓衝的鹽水：i〇 mM鱗酸納，150 mM NaQ，pH 7.4。 15 方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將M2C2H儲備溶液加至1毫升的氧化的醣-EPO至最 後為1 mM的濃度，在室溫下攪動反應2小時，過量的交 聯-聯結子是使用微濃縮器在14000 X g下離心樣品60分 20 鐘而除去，離心後將樣品置於原體積量的磷酸/NaCl缓衝 液中，再重覆此程序兩遍，對經M2C2H-修飾的醣_EP0溶 液加入1毫升的Thio-HES12KD Μ，Ο或Q溶液，在室溫 下將此反應混合物培育16小時，過量的馬來醯亞胺類的 反應性於培育期終了時經添加半胱胺酸中止，將反應混合 -95- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（94) 物施加至以PBS緩衝液平衡的Sepharose® G_2〇0 (1·5 X 45 cm)柱層並收集1毫升劃分，劃分中的蛋白質含量使用 Coomassie蛋白質分析試劑監測，所有含蛋白質共輛接合 物的劃分被收集在一處，經水透析過夜後，將所得的共辆 5 接合物予以冷涞乾燥。 處理過程應注意事項： 在極端pH下，腓(hydrazone)加合物不太安定，應用 時可能需包含在低pH下處置，我們以30 mM的氰基氫 10 领化鈉在PBS緩衝液内將腓還原成聯胺(hydrazine)，大部 分的應用，並不需要此額外步驟。 2.2實例作業手冊8
直接共軛接合氧化的醣-EPO至醯肼基-HES12KD L 15 或J 材料 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A·得自6·1·1之氧化的醣-EPO溶液：5毫克/毫升的醣-ΕΡΟ，於醋酸鹽緩衝液内 20 Β·醯胼基-HES12KD L或J : 10毫克/毫升，於醋酸鹽緩 衝液内 C·醋酸緩衝液：〇·ιμ醋酸鈉緩衝液，ρΗ 5.5 D.凝膠濾過柱層：例如，Sephadex@G-200 (1.5 x 45 cm) Ε· Coomassie® 蛋白質分析試劑（perbi〇 Science -96- 本紙張尺度適用中@ @家標準(CNS)A4規格（210 χ297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（95 )
Deutschland GmbH, Bonn, Germany) F· PBS磷酸鹽緩衝的食鹽液·· 10 mM磷酸鈉，150 mM NaCl，pH7.4 5 方法 將1毫升的醯肼-L或J溶液與1毫升的經氧化的醣-EPO溶液併合，在室溫下將混合物攪拌16小時，將反應 混合物施加至以PBS緩衝液平衡著的Sepharose® G_200 (1·5 x 45 cm)柱層並收集1毫升劃分，劃分中的蛋白質含 10 量使用Coomassie蛋白質分析試劑監測，所有含蛋白質共 輛接合物的劃分被收集在一處，經水透析過夜後，將所得 的共輛接合物予以冷束乾燥，所得的共輛接合物被示於圖 24，觀察到的分子遷移證明共輛接合作用極為成功，拖曳 的斑點是來自HES之異源性(heterogenity)，圖25證明 15 HES是共輛接合至破水化合物側鏈之破水化合物一部 位。 處理過程應注意事項： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在極端pH下，腓(hydrazone)加合物不太安定，應用 20時可能需包含在低PH下處置，我們以30 mM的氰基氣 观化納在PBS缓衝液内將排還原成聯胺(hydrazine)，大部 分的應用，並不需要此額外步驟。 -97- 200418875 A7 B7 五、發明說明（96 ) 3·與沒基胺-竹生物進行共辆接合(c〇njUgati〇n) 3.1實例計劃書9
將氧化的 (Glyco)-EPO共輛接合至經基胺基_ HES12KDK 5 材料 A·取自6.1.1之氧化的醣_EP〇溶液：5毫克/毫升之醣― EPO，於醋酸鹽緩衝液 B·羥基胺基-HES12DK:l〇毫克/毫升，於醋酸緩衝液 10 C·醋酸鹽緩衝液：0.1M醋酸鈉緩衝液，pH 5·5 D.凝膠濾過柱層：例如，Sephadex®G-200 (1.5 x 45 cm) Ε· Coomassie®蛋白質分析試劑(perbi〇 Science Deutschland GmbH，Bonn，Germany) F· PBS磷酸鹽緩衝的食鹽液：i〇 mM磷酸鈉，150 mM 15 NaCl, pH 7.4 方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1毫升的羥基胺基-HES12KD K與1毫升的氧化的 醣-ΕΡΟ溶液混合，於室溫下攪動16小時使之反應，將反 20 應混合物置入以PBS平衡著之Sephadex® G-200 (1·5 X 45 cm)柱層，收集1毫升的劃分，劃分中的蛋白質含量以考 馬斯(Coomassie)蛋白質分析試劑測試監測，所有含蛋白
Rose, 1994, Am. Chem. Soc., 116, 30 -98- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 ----- B7 五、發明說明（97) 質共軛接合物的劃分被收集一起，經水透析過夜後將共輥 接合物冷凍乾燥，所得接合結果被示於圖24，觀測到的 分子變遷(shift)被移至第二通道(laile)，證明共軛接合極為 成功，拖曳的斑點是來自HES之異源性(heterogenity)， 5圖Μ證明HES是共輛接合至碳水化合物侧鏈之碳水化合 物一部位。 缓息it半乳糖氣化酶處理之ΕΡΟΝ-聚醣 ^ 將重組體ΕΡΟ或部分地脫唾液酸(desialylated)EPO型 (由限制的溫和酸水解產生)與半乳糖氧化酶一起在37°C、 過氧化氫酶存在下、pH 7·0之0.05M磷酸鈉緩衝液中培 育，經30分鐘至4小時，經取出50微克的ΕΡΟ分量並 接著以多肽Ν-聚醣酶處理蛋白質監測反應的進展。 15 釋放出的Ν-連結的寡醣類（由SDS-PAGE技術分析 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 脫糖化的多肽予以監測），在除去唾液酸之前與之後， 依所述方法（Grabenhorst et al., 1999，Nimtz et al.， 1993/1994; Schlenke et al·，1999)進行 HPAEC-PAD 繪圖， 個別的ΕΡΟ募醣類中之氧化的半乳糖殘基之定量是於 2〇 HPAEC-PAD中觀測到的典型的變遷判定，也使用募醣混 合物之MALDI/TOF MS予以確認。 實例6
鑑定HAS倏飾的EPO -99- @張尺度適用中國國家標準(CNS)M規格(210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（98 ) 將未作用的EPO及HAS-先驅物分子與經HAS修飾 的EPO型分離的方法是藉由凝膠過濾法達成，例如使用 Ultrogel AcA 44/54或類似的凝膠過濾介質，或者，未作 用的HAS的移除是使用含有偶合至Affigel (Bi〇Rad)的單 5株抗體之4耄升柱層進行EPO的免疫親和性單離並接著 藉由凝膠過濾法分離未修飾的Ep〇(例如使用可分離相對 分子量介於20kDa與200 kDa之球蛋白之基質）。 HAS修飾的EPOs可使用SDS_pAGE技術分析確定 (使用12.5或10%丙烯醯胺凝膠），經考馬斯亮藍 10 (Coomassie Brillant Blue)將凝膠染色後，與未修飾的Ep〇 比較，測得其具有較的高分子量而確定，經HAS修飾的 EPO多肽類的較高分子量也可使用多株抗體對抗重組體 人類EPO產生的西方墨點分析法確認。 EPO型的N-聚醣修飾作用，是藉由其以多肽N_聚醣 15酶能成功的再自EPO蛋白質除去而被證明（重組體N_糖苷 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 酶，得自Roche，Germany，應用25單位/毫克EPO蛋白 質，於37°C下作用16小時）；經SDS-PAGE分析，EPO 蛋白質的典型變遷，相對《 N-糖苷酶處理的未經修飾的 EPO移動位置為約20Kda。 20 單獨的脫唾液酸的與在Ser 126經半乳糖氧化酶處理 的EPO〇_聚醣之修飾作用是藉由偵測脫糖化的產物在 SDS-PAGE分析中移動位置，相較於未反應的脫糖化 的EP0之移動位置而來，如有需要，在進行SDS-PAGE 分析前，可藉由RP-HPLC於CM目上將修飾的EPO予以 -100- 本紙張尺度剌+國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（99 ) 分劃’ EPO的HAS 〇-聚醣修飾作用也可使用0-聚醣的 /5-消除法分析並使用多株抗體對抗重組體人類Epo產生 的西方墨點分析法偵測EP〇的脫_〇_糖化型式。 實例7 EPO與修飾的ΕΡ(Ί型式之定詈 ΕΡ0型是使用Ph Eur揭露的υν測量法定量(2〇〇〇,
Erythropoietmi solutio concentrata，1316, 780-785)，並對照 於國際BRP參考EP0標準品，或者，EP〇濃度的測定可 藉由RP-HPLC分析，係使用rp_C4_柱層及在254 nm下 的吸光’應用20，40，80與120微克之BRP標準EP0 參考製劑予以校正。 實例8 15 HES-修飾的會組體人類HES夕試營生物活性： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 利用Krystal揭露之方法[Krystal，刚4，Εχρ· Heamatol·，11，649-660]，以紅血球生成素生物活性分析法 測试純化的經HES，修飾的EP0之活性，以苯基聯胺鹽酸 鹽處理NMRI小鼠使之產生貧血，收集脾臟細胞並參照 20 揭露於[Fibi et al” 1991，Blood，77, 1203 ff.]之方法使用， EPO的稀釋物以3 χ i〇5細胞/槽的量被培育於％槽的微 滴定板上，在濕氣(5% C〇2)中，37°C下24小時後，每槽 以1微居里的Η腦腺核苷(thymidine)予以標識4小時， 加入的放射性經液體閃爍計數測定，以國際參考EPO標 -101- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格〔210x297公爱y 200418875 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（100) 準品(BRP標準品)作為比較。 或者，EPO生物活性經由試管分析測定，使用Ep〇_ 敏感的細胞株 TF-l(Kitamura et al” [J. cell Phys.，140. 323-334]，將對數生長期的細胞洗除生長因子並培育於一系列 5稀釋的EPO中再經48小時，細胞的增殖使用Mosmann 揭露的MTT還原分析法評估[M〇sman，1983, J.Jmmunol.
Methods，65, 55_63]。 實例9 10 !?〇與HAS-修飾的EPO型之活體内生物活性測定 活體内活性測定是於normoCythemic小鼠中進行，是 於動物接受預知劑量的EPO或修飾的EPO型後4天，測 定其網織紅細胞的增加而來，分析是使用BRP EPO標準 進行，其使用在polycythemic老鼠分析中的WHO EPO標 15準校正過，EPO樣品是以含1毫克/毫升的牛血清白蛋白 (Sigma)的磷酸緩衝的鹽水稀釋。 對每隻動物經皮下注入置於Dulbecco，s緩衝鹽水中之 〇·5毫升的EPO試驗溶液(EPO蛋白質當量相當於BRP標 準ΕΡΟ之1〇〇，80，40或20 IU/毫升)，注射後四天，採 20 取血樣並以丫唆橙(acridine orange)將網織紅細胞染色；網 織紅細胞的計罝是使用流動-細胞儀（Gow-cytometry)，於 採取血樣後5小時内計數總數30,000血球方式進行（見Ph. Eur，2000, Erythropoietini solutio concentrata，1316, pages 780-785)與歐洲的藥典（1996/2000，附錄 2002)。 -102- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 χ 297公釐）
200418875 A7 B7 五、發明說明（101) 實例10 活體内丰生期測定 經靜脈注射對兔子施予特定量的未修 飾式時刻採取血樣，並製備血清，使用 试官生化分析或跡專性的市售的elisa 紅血球生成素值。 ^ 實例11 10 活體内藥動學 於小鼠：各隻動物經皮下注射入3〇〇 Il; Ep〇/&斤， 處理後七天，測定各隻動物的血球容積，在經修飾的 EPO處理的所有動物均發現血球容積有增加，相對地， 未經處理的EPO有相對較短的半生期，經修飾的Ep〇處 15 理的群組的血球容積平均改變明顯不同於對照的未經修飾 的EPO處理的群組。 少 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 於兔子：以相當於200或至多達800奈克/公斤一 的單獨劑量之未經修飾的或HAS-修飾的EPO處理兔子重 於2，6，16，24與48小時後取樣分析，使用市隹’、 EPO-專性的ELISA供定量血漿濃度，測定平均的二許 EPO濃度與由所述的ELISA值測定平均最初的+ (α-相）與最後的半生期（/S-相XZettlmissal et ai·，1989 ^ Biol· Chem·，264, 21153-21159)。 ’ · -103- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（1〇2) 文獻：
Sytkowski，Lunn，Risinger，and Davis，1999，An Erythropoietin Fusion Protein Comprised of Identical Repeating Domains Exhibitis Enhanced Biological Properites, 5 J· Biol· Chem·，274, 24773-24778。 實例12 HES-修飾的重組艚人類IL_2的詖管生物活性的評估 將修飾的IL-2置於Ultrogel AcA 54上經凝膠過濾回 10收，將相當劃分的分量進行滅菌過濾，使用IL2依賴的鼠 類CTLL-2細胞株進行IL2生物活性之測定[Gims，Ferm，
On，and Smith，1978, J. Immimol·，12〇, 2027_2032]，活性參 照國際參考IL2標準製劑。 實例13:藉由魏化的縣端之_,眺基化作用形成 羥乙基澱粉衍生物 實例13.1以1，3_ 一胺基-2令基丙燒作用經乙基殿粉 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20
H0N
a)對，奋解於5笑升水的2〇〇毫克輕乙基殿粉(册^襲·4 (娜=撃0D，DS=0.4)溶液，加人〇 83毫莫耳的以 一胺基-2-羥基丙烷與5〇毫克氰基氫硼化 NaCNBH3 ’將所得混合物置於啊下培育17小時 納 -104- 200418875 A7 B7 五、發明說明（103) 反應混合物被加至160毫升之冷的丙_與乙醇之混合 液中（1 ·· 1 v/v)，離心收集沈澱並以水透析4天 (SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn，D)，並冷束乾燥。 5 b)也可將得自添加0.83毫莫耳的1，3-二胺基-2-羥基丙烷 與50毫克氰基氫硼化鈉NaCNBH3至200毫克羥乙基 澱粉溶液的混合物予以培育，置於25°C下歷經3天。 實例13.2 以1，2-二每基-3-胺基丙烧作用經乙基殿粉 10
a)對溶解於5毫升水的200毫克經乙基澱粉(heS 18/0.4 (MW=18,000 D，DS=0.4)溶液，加入 0.83 毫莫耳的 1，2-15 二經基-3-胺基丙烧與50毫克氰基氩棚化納 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
NaCNBH3，將戶斤得混合物置於80〇C下培育17小時， 反應混合物被加至160毫升之冷的丙嗣與乙醇之混合 ‘液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈澱並以水透析4天 (SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，perbio Science 20 Deutschland GmbH，Bonn，D)，並冷柬乾燥。 1，2-二經基-3-胺基丙烧與HES的反應可間接由定量甲 醛而確認，其係得自依照G. Avigad揭露於Anal. Biochem. 134 (1983) 449-504中方法，利用過破酸對產 物進行1，2-二醇的氧化斷裂反應而得者。 -105- 本紙張尺度遇用1f國國冢標毕規格（210x297公釐） 200418875 A7 --- B7 五、發明說明（1()4) b)也可將得自添加0.83毫莫耳的1，2-二羥基-3-胺基丙烷 與50毫克氰基氫硼化鈉NaCNBH3至200毫克羥乙基 凝粉溶液的混合物予以培育，置於25°C下歷經3天。 5實例13.3以1，4-二胺基丁烷作用羥乙基澱粉
H2N V a) 對溶解於5毫升水的2〇〇毫克羥乙基澱粉(HES 18/0.4 (MW=18,〇〇〇 D，DS=0.4)溶液，加入 0.83 毫莫耳的 1，4- 10 二胺基丁烷與50毫克氰基氫硼化鈉NaCNBH3，將所 得混合物置於8(TC下培育17小時，反應混合物被加至 16〇毫升之冷的丙酮與乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離 心收集沈澱並以水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5KD cut off，perbi〇 Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，予 15 以冷凍乾燥。 b) 也可將得自添加0.83毫莫耳的1，‘二胺基丁烧與5〇毫 克氰基氫侧化納NaCNBH3至200毫克經乙基殿粉溶液 的混合物予以培育，置於25°C下歷經3天。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20實例13.4以1-氫硫基-2-胺基乙燒作用羥乙基澱粉 hs^/NH2 a)對溶解於5毫升水的200毫克羥乙基澱粉(hes 18/〇4 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準(dNS)A4規格（2丨〇 X 297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（105 ) (MW=18,000 D，DS=0.4)溶液，加入〇·83毫莫耳的卜氫 硫基-2-胺基乙烷與50毫克氰基氫硼化鈉NaCNBH3, 將所得混合物置於80°C下培育17小時，反應混合物被 加至160毫升之冷的丙酮與乙醇之混合液中（1 : 1 5 v/v)，離心收集沈殿並以水透析4天（SnakeSkin透析 管，3.5 KD cut off, Perbio Science Deutschland GmbH， Bonn，D)，予以冷凍乾燥。 b)也可將得自添加0.83毫莫耳的1-氫硫基-2-胺基乙烷與 50毫克氰基氫硼化鈉NaCNBH3至200毫克羥乙基澱 10 粉溶液的混合物予以培育，置於25°C下歷經3天。 實例14:與非氧化的還原端藉由共軛接合形成羥乙基澱 粉衍生物 實例14.1以卡二醯肼(carbohydrazide)作用輕乙基殿粉 15 〇 A%人N， Η Η 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
將 〇·96 克的 HES18/0.4 (MW=18,000 D，DS=0.4)溶解 20 於8毫升，pH 5.2的0·1Μ醋酸納缓衝液液，加入8毫莫 耳的卡二醯肼（Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)，於 25°C 下 攪拌18小時後，將反應混合物加至160毫升之冷的丙酮 與乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈澱，再溶解入 40毫升水中，以水透析3天(SnakeSkin透析管，3,5 KD -107- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（1〇6) cut off，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D) ’ 予以 冷凍乾燥。 實例14.2以己二醯肼(adepic dihydrazide)作用經乙基殿粉 H2N、
將 〇·96 克的 HES18/0.4 (MW=18,000 D，DS=0.4)溶解 10 於8毫升，pH 5·2的0·1Μ醋酸鈉緩衝液液，加入8毫莫 耳的己二醯肼(Lancaster Synthesis，Frankfurt/Main，D) ’ 於 25°C下攪拌18小時後，將反應混合物加至160毫升之冷 的丙酮與乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈澱，再 溶解入40毫升水中，以水透析3天(SnakeSkin透析管’ 15 3.5 KD cut off, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D)，予以冷凍乾燥。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 實例14·3 以1，4-苯撐-雙-3-硫半二酿肼（l，4-phylene-bis-3-thiosemicarbazide)作用經乙基殿粉
.NK -108- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（107) 將 0.96 克的 HES18/0.4 (MW=18,000 D，DS=0.4)溶解 於8毫升，ρΗ5·2的0·1Μ醋酸鈉缓衝液液，加入8毫莫 耳的 1，4-苯撐-雙-3_ 硫半二醯肼（Lancaster Synthesis， Frankfurt/Main，D)，於25°C下攪拌18小時後，加入8毫 5 升的水至反應混合物内，於4,500 rpm下將之離心15分 鐘，倒出澄清的上澄液，接著加至160毫升之冷的丙酮與 乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈澱，再溶解入40 毫升水中，並於4,500 rpm下將之離心15分鐘，澄清的 上澄液經水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5 KD cut off， 10 Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn, D)，予以冷束乾 燥0 實例14.4 以〇-[2-(2-胺基氧乙氧基)-乙基]-羥基胺作用 羥乙基澱粉 15 ,〇、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以2步雜’從講得的材料，依照揭露於Boturyn et al. Tetrahedron 53 (1997) ρ· 5485_5492 之方法合成 〇-[2-(2-胺 20 基氧-乙氧基)-乙基]-羥基胺。 將 〇·96 克的 HES18/0.4 (MW=18,000 D，DS=0.4)溶解 於8毫升，pH 5.2的0.1M醋酸鈉缓衝液液，加入8毫莫 耳的0-[2-(2-胺基氧-乙氧基)-乙基]-羥基胺，於25°C下攪 拌18小時後，將反應混合物加至160毫升之冷的丙酮與 -109- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A7 B7 五、發明說明（108) 乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈殿，再溶解入40 毫升水中，並經水透析3天(SnakeSkin透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn, D)，予以 冷凍乾燥。 5 實例15 :與氧化的還原端反應形成羥乙基澱粉衍生物 實例15 · 1 以卡二醯肼(carbohydrazide)作用經乙基殿粉
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將 〇·12 毫莫耳的酮基-HES 10/0.4 (MW=10,000 D， DS=0.4，根據DE 196 28 705 A1製備)溶解於3毫升的絕 對二曱亞砜(DMSO)並在氮氣層中滴至溶解於15毫升 15 DMSO中之15毫莫耳的卡二醯肼（Sigma Aldrich, Taufkirchen，D)混合物中，於65°C下攪拌88小時後，將 反應混合物加至160毫升之冷的丙酮與乙醇之混合液中 (1 : 1 v/v)，離心收集沈殿，再經水透析4天（SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science Deutschland GmbH， 20 Bonn，D)，予以冷凍乾燥。 實例15.2 以1，4-苯撐-雙-3-硫半二醯肼作用羥乙基澱粉 -no- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（1〇9)
N Η Η 將 0.12 毫莫耳的酮基-HES 10/0.4 (MW=l〇,〇〇〇 D DS=0.4，根據DE 196 28 705 A1製備)溶解於3毫升的絕 對二甲亞颯(DMSO)並在氮氣層中滴至溶解於15毫升 DMSO中之15毫莫耳的1，4-苯撐-雙-3_硫半二酿月井 10 (Lancaster Synthesis，Frankfurt/Main，D)混合物中，於 65〇c 下攪拌88小時後，將反應混合物加至160毫升之冷的丙 酮與乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈殿，再經水 透析 4 天（SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，perbi〇 Science Deutschland GmbH，Bonn，D) ’ 予以冷;東乾燥。 15 實例15.3以聯胺作用羥乙基澱粉 η2ν—νη2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 將U4克（0·12毫莫耳）的酮基-HES 10/0.4 (MW==10,〇〇〇 D，DS=0.4，根據 DE 196 28 705 A1 製備)溶 解於3毫升的絕對二甲亞颯〇DMSO)並在氮氣層中滴至溶 解於15毫升DMSO中之〇·47毫升（15毫莫耳）的聯胺混合 物中，於4〇°C下攪拌19小時後，將反應混合物加至160 -111- 本紙張尺纟細 ^ ^ (210 X 297 ^ ) 200418875 A7 B7 五、發明說明（110 ) 毫升之冷的丙酮與乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集 沈澱，再溶解於40毫升的水並以0·5% (v/v)三乙基胺之 水溶液透析2天及經水透析2天(SnakeSkin透析管，3.5 KD cut off, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) ^ 5 予以冷;東乾燥。 實例15·4以羥基胺作用羥乙基澱粉 10 0-[2-(2-胺基氧-乙氧基)-乙基]-經基胺的合成，是根 據Boturyn等人揭露的方法，從購得的材料以2步驟合成 (Boturyn，Boudali, Constant, Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485) ° 15 將1.44克（0.12毫莫耳）的酮基-HES 10/0.4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 (MW=10,000 D，DS=0.4，根據 DE 196 28 705 A1 製備)溶 解於3毫升的絕對二.曱亞艰(DMSO)並在氮氣層中滴至溶 解於15毫升DMSO中之2.04克（15毫莫耳）的〇-[2-(2-胺 基氧-乙氧基)-乙基l·羥基胺混合物中，於65°C下攪拌48 20 小時後，將反應混合物加至160毫升之冷的丙酮與乙醇之 混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈澱，再溶解於40毫升的 水並經水透析4天（SnakeSkin透析管，3.5 KD cut off， Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，予以冷束乾 燥。 -112- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公麓） 200418875 A7 B7 五、發明說明（m) 實例15.5以己二酸肼（adepic dihydrazide)作用羥乙基殿粉 H2N、
在65°C下，將1·74克（15毫莫耳）的己二醯肼溶解於 20毫升的絕對二甲亞颯(DMSO)並在氮氣層中滴入溶解於 3毫升DMSO中之1.44克(0.12毫莫耳）的酮基-HES 10/0.4 10 (MW=10,000 D，DS=0.4，根據 DE 196 28 705 Α1 製備)溶 液，於60°C下攪拌68小時後，將反應混合物加至200毫 升之水，以0·5% (v/v)三乙基胺之水溶液透析2天及經水 透析 2 天（SnakeSkin 透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，予以冷;東乾燥。 15 實例15.6 以1，4_二胺基丁烷作用羥乙基澱粉
HUNT 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 20 將1·44克（0.12毫莫耳）的酮基-HES 10/0.4 (MW=10,000 D，DS=0.4，根據 DE 196 28 705 A1 製備)溶 解於3毫升的絕對二曱亞砜(；DMSO)並在氮氣層中滴至溶 解於15毫升DMSO中之1.51毫升（15毫莫耳）的1，4-二胺 基丁烷之混合物中，於40°C下攪拌19小時後，將反應混 -113- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（in) 合物加至160毫升之冷的丙嗣與乙醇之混合液中（1 : 1 v/v)，離心收集沈澱，胺基-HES10KD/0.4，再溶解於40 毫升的水並以水透析4天(SnakeSkin透析管，3.5 KD cut off，Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn，D)，予以冷 5 凍乾燥。 實例16 紅血球生成素的氧化作用 氧化的紅血球生成素是根據實例20描述的方法產 生，至於氧化的紅血球生成素，是使用實例20.11(c)描述 10 之EPO-GT_l-A(不經酸水解之EPO-GT-1，經溫和的過碘 酸氧化作用處理者）。 實例17 : 以實例4之氧化的紅血球生成素共軛接合羥 乙基澱粉衍生物 15 實例17.1 以實例14·1的反應產物與氧化的紅血球生成 素作用 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 將溶解於20 mM PBS緩衝液的氧化的ΕΡΟ (1.055微 克/微升)溶液以pH為5.2之5M醋酸鈉緩衝液將其pH調 至5.3，對19微升的EPO溶液，加入根據實例14.1製備 20 得的18微升的HES衍生物溶液(MW 18 kD ; 18·7微克/微 升，溶於0.1Μ醋酸鈉缓衝液，pH 5.2)，在25°C下將此混 合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivitrogen戶斤給說 -114- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 Α7 Β7 五、發明說明（113) 明進行，凝膠以Roti_Blue Coomassie染色劑（Roth，
Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖3,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 5用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的RES衍 生物的數目所致。 實例17.2以實例14.3的反應產物與氧化的紅血球生成 素作用 10 將溶解於20 mM PBS緩衝液的氧化的EPO (1.055微 克/微升)溶液以pH為5.2之5M酷酸納緩衝液將其pH調 至5.3，對19微升的EPO溶液，加入根據實例H3製備 得的18微升的HES衍生物溶液(MW 18 kD ; 18.7微克/微 升，溶於0·1Μ醋酸鈉緩衝液，pH 5.2)，在25°C下將此混 15合物培育16小時，冷涞乾燥後，以SDS-Page與 PAGE 10% Bis_Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen， Cadsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivitr〇gen所給說 明進行。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20實例17·3以實例14.4的反應產物與氧化的紅血球生成 素作用 將溶解於20 mM PBS緩衝液的氧化的epo (1.055微 克/微升)溶液以pH為5.2之5M酷酸鈉緩衝液將其pH調 至5.3，對19微升的EPO溶液，加入根據實例ΐ4·4製備 -115- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（ 114 ) 得的18微升的HES衍生物溶液(MW 18 kD ; 18.7微克/微 升，溶於0.1M醋酸鈉緩衝液，pH 5.2)，在25。(：下將此混 合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與
NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitr〇gen， 5 Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivitr〇gen所給說 明進行旋膠以Roti-Blue Coomassie染色劑（R〇th Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖4，可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 10用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的hes衍 生物的數目所致。 實例17.4以實例15.1的反應產物與氧化的紅血球生成 素作用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 將溶解於20 mM PBS緩衝液的氧化的EPO (1.055微 克/微升)溶液以pH為5.2之5M醋酸鈉緩衝液將其pH調 至5.3，對19微升的EPO溶液，加入根據實例ΐ5·1製備 得的18微升的HES衍生物溶液(MW 18 kD ; 18.7微克/微 升，溶於0.1M酷酸鈉緩衝液，pH 5.2)，在25°C下將此混 20 合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與
NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（invitr〇gen， Carlsbad，CA，USA)分析粗製品’是依據Ivitrogen所給說 明進行，凝膠以Roti_Blue Coomassie染色劑（R〇th， Karlsruhe，D)染色過夜。 -116- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（ll5 ) 實驗結果被示於圖5，可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 5 實例17·5以實例15·2的反應產物與氧化的紅血球生成 素作用 將溶解於20 mM PBS缓衝液的氧化的ΕΡΟ (1·〇55微 克/微升)溶液以pH為5.2之5Μ醋酸鈉緩衝液將其pH調 10 至5.3，對19微升的EPO溶液，加入根據實例15.2製備 得的18微升的HES衍生物溶液(MW 18kD ; 18.7微克/微 升，溶於0.1M醋酸鈉緩衝液，pH 5.2)，在25°C下將此混 合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（invitr〇gen， 15 Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據ivitr〇geil所給說 明進行，凝膠以Roti-Blue Coomassie染色劑（R〇th， Karlsruhe，D)染色過夜。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實驗結果被示於圖5,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 20用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 實例18 藉還原紅血球生成素形成硫_EP〇 將置於500微升的0.1M调酸納緩衝液，5 mM EDTA， -117- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（116) 10 mM DTT(Lancaster，Morcambe，UK)，pH 8.3，之 241.5 微克紅血球生成素(EPO-GT-1，見實例20)，在37°c下培 育1小時’使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，1〇 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,〇〇〇 rpm 5下，離心過濾除去DTT，接著以硼酸鹽缓衝液洗滌三 遍、以磷酸緩衝液(〇·1Μ，9·15 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.2)洗務二遍。 實例19 :使用交聯的化合物將硫-紅血球生成素共輛接合 1〇 至羥乙基澱粉 下面各實例中，使用下面之Ν-(α-馬來醯亞胺基乙氧 基)琥珀醯亞胺酯(AMAS)作為交聯的化合物。
〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 實例19·1 使用實例14·1的反應產物與交聯的化合物作 用硫-紅血球生成素 20 將根據實例14·1製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 解於200微升的ο.ιμ磷酸鈉緩衝液(0.1Μ，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7.2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 的 2·5 微莫耳 AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘、在40°C下培育 -118- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（117) 20分鐘，使用VIVASPIN 0·5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,〇〇〇 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以填酸鹽缓衝液洗務 四遍及30分鐘。 5 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的
ThioEPO(l微克/微升，溶於填酸鹽缓衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與
NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen， Carlsbad，USA)分析粗製品，是依據Ivitrogen所給說明進 10 行，凝膠以 Roti-Blue Coomassie 染色劑(R〇th，Karlsruhe， D)染色過夜。 實驗結果被示於圖6,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共輛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 15 生物的數目所致。 實例19.2使用實例14.2的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將根據實例14.2製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 20 解於200微升的0.1M磷酸鈉緩衝液(0.1M，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7·2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 的 2.5 微莫耳 AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶
液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘、在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD -119- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 、 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（118) MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗滌 四遍及30分鐘。 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 5 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽缓衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen， Carlsbad，USA)分析粗製品，是依據Ivitrogen所給說明進 行’凝膠以 R〇ti_Blue Coomassie 染色劑(R〇th，Karlsruhe, 10 D)染色過夜。 實驗結果被示於圖7,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 15 實例19.3使用實例14.3的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素 將根據實例14.3製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 解於200微升的0.1M磷酸鈉緩衝液(0.1M，9.15 M NaCl， 20 50 mM EDTA，pH 7.2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 的 2.5 微莫耳 AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover, D)，在 13,000 rpm -120- 本紙張尺度週用T國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱）
200418875 A7 B7 五、發明說明（119) 下’離心過濾、除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗務 四遍及30分鐘。 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽緩衝液），在25°C下將 5此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與
NuPAGE 10% Bis_Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen，
Cadsbad，USA)分析粗製品，是依據Ivitrogen所給說明進 行’凝膠以 Roti-Blue Coomassie 染色劑（Roth，Karlsruhe， D)染色過夜。 10 實驗結果被示於圖7，可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 15實例19.4使用實例14.4的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將根據實例14·4製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 解於200微升的0.1Μ磷酸鈉缓衝液(0.1Μ，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7.2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 20 的 2.5 微莫耳 AMAS(Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0·5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽缓衝液洗務 25 四遍及30分鐘。 -121- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（no ) 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽緩衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen， 5 Carlsbad，USA)分析粗製品，是依據lvitr〇gen所給說明進 行’凝膠以 Roti-Blue Coomassie 染色劑(R〇th，Karlsruhe， D)染色過夜。 實驗結果被示於圖6,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 10用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 實例19.5使用實例13.1的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素 15 將根據實例13.1製備得的50奈莫耳HES衍生物， 在80°C與17小時以及25°C及3天的培育條件下，被溶解 於200微升的〇·1Μ磷酸鈉緩衝液(0.1M，9·15. M NaCl，50 mM EDTA，pH 7·2)溶液，加入溶在DMSO之10微升的 2.5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶液， 20 將澄清溶液置於25t：下培育80分鐘及在40°C下培育20 分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過 濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽缓衝液洗滌四遍及30分 鐘。 -122- 木紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 一 "
200418875 A7 B7 五、發明說明（121) 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 ThioEPO(l微克/微升，溶於構酸鹽緩衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis_Tris Gels/MOPS 緩衝液（lnvitr〇gen， 5 Carlsbad，USA)分析粗製品，是依據Ivitr〇gen所給說明進 行，凝膠以 Roti-Blue Coomassie 染色劑(R〇th，Karlsruhe， D)染色過夜。 實驗結果被示於圖7，可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 10用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 實例19·6使用實例13.3的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素 15 將根據實例13.3製備得的50奈莫耳HES衍生物， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在80°C與17小時以及25°C及3天的培育條件下，被溶解 於200微升的〇·ΐΜ磷酸鈉缓衝液(0.1M，9.15 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.2)溶液，加入溶在DMSO之10微升的 2.5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶液， 20將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育20 分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過 濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗滌四遍及30分 鐘。 -123- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 _ B7 五、發明說明（I22 ) 殘留的溶液’加入根據實例18製備得的15微克的 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽緩衝液），在2yc下將 此混合物培育16小時，冷束乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10/。Bis_Tris Gels/MOPS 緩衝液（invitr〇gen， 5 Cadsbad，USA)分析粗製品，是依據lvitr〇gen所給說明進 行，凝膠以 Roti-Blue Coomassie 染色劑（Roth，Karlsruhe， D)染色過夜。 實驗結果被示於圖7，可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 10用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 實例19.7使用實例15.1的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素
5 IX 經濟部智慧財產局員X消費合作社印製 20 將根據實例15.1製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 解於200微升的〇·1Μ磷酸鈉缓衝液(0.1Μ，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7.2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 的 2·5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,〇〇〇 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗蘇 四遍及30分鐘。 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 -124- 紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875
ThioEPO(l微克/微升，溶於碟酸鹽緩衝液），在25°c下將 此混合物培育16小時，冷;東乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivitr〇gen所給說 5明進行’凝膠以Roti_Blue Coomassie染色劑（R〇th Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖8,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 10 生物的數目所致。 實例19.8使用實例15.2的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素 將根據實例15.2製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 15 解於200微升的〇·1Μ磷酸鈉缓衝液(0.1M，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7.2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 的 2·5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD 20 MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗滌 四遍及30分鐘。 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽緩衝液），在25°C下將 -125- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 裝 計 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200418875 A7 B7 五、發明說明（124 ) 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS_page與
NuPAGE 10% Bis_Tds Gels/MOPS 緩衝液（lnvitr〇gen， Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據ivitr〇gell所給說 明進行’凝膠*以Roti-Blue Coomassie染色劑（R〇th， 5 Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖8,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 10 實例19.9使用實例15.3的反應產物與交聯的化合物作用 硫-紅血球生成素 將根據實例15.3製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 解於200微升的0.1M磷酸鈉緩衝液(0.1M，9.15 M NaCl， 15 50 mM EDTA，pH 7·2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 的 2.5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0·5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 20 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗滌 四遍及30分鐘。 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽緩衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 -126- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 五、發明說明（l25)
NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/M〇ps 緩衝液（Invi加卿，Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivkr〇gen所給說 明進行，凝膠以Roti-Blue Coomassie染色劑（Roth Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖8,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 % 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10實例19·1〇使用實例15.4的反應產物與交聯的化合物作 用硫-紅金球生成素 將根據實例15.4製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 解於200微升的0.1M磷酸鈉緩衝液(〇·ιμ，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7·2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 15 的 2.5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽缓衝液洗滌 20 四遍及30分鐘。 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽緩衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（Invitrogen， -127- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝 計 線 200418875 A7 ___-______ B7 五、發明說明（126)
Cadsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivitr〇gen所給說 明進行’政膠以R〇ti-Blue Coomassie染色劑（R〇th， Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖8，可由蛋白質帶己遷移至較高分 5子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的hes衍 生物的數目所致。 實例19.11使用實例15·5的反應產物與交聯的化合物作 10 用硫紅血球生成素 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將根據實例15·5製備得的50奈莫耳HES衍生物溶 解於200微升的0.1Μ磷酸鈉緩衝液(0.1Μ，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7.2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 的 2.5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 15 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 20分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗滌 四遍及30分鐘。 20 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的
ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽缓衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液（InvitiOgen， Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivitrogen所給說 -128- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（127 ) 明進行’凝膠以Roti-Blue Coomassie染色劑（R〇th， Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖8,可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 5用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的HES衍 生物的數目所致。 實例19.12使用實例15.6的反應產物與交聯的化合物作 用硫··紅血球生成素 10 將根據實例15.6製備得的50奈莫耳HES衍生物溶
解於200微升的0.1M磷酸鈉緩衝液(0.1M，9.15 M NaCl， 50 mM EDTA，pH 7·2)溶液，加入溶在DMSO之10微升 的 2.5 微莫耳 AMAS (Sigma Aldrich，Taufkirchen，D)溶 液，將澄清溶液置於25°C下培育80分鐘及在40°C下培育 15 20分鐘，使用VIVASPIN 0.5毫升的濃縮器，5 KD MWCO (VIVASCIENCE，Hannover，D)，在 13,000 rpm 下，離心過濾除去殘留的AMAS，以磷酸鹽緩衝液洗滌 四遍及30分鐘。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 殘留的溶液，加入根據實例18製備得的15微克的 20 ThioEPO(l微克/微升，溶於磷酸鹽緩衝液），在25°C下將 此混合物培育16小時，冷凍乾燥後，以SDS-Page技術 與 NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS 緩衝液(Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)分析粗製品，是依據Ivitrogen所給說 明進行，凝膠以Roti-Blue Coomassie染色劑（Roth， -129- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（128 )
Karlsruhe，D)染色過夜。 實驗結果被示於圖8，可由蛋白質帶己遷移至較高分 子量而證明已成功的達到共軛接合，增加的帶寬是由於所 用的HES衍生物的分子量分佈及連結至蛋白質的jjES衍 5 生物的數目所致。 實例20 HES-EPO共軛接合物的準備生產 摘要說明 10 HES-EPO共軛接合物的合成，是將HES衍生物(平均 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 分子量為18,000道爾頓(Dalton);羥乙基取代度為〇.4)偶 合至位於重組體人類EPO的寡醣鏈上之部分地(溫和過蛾 酸化）經氧化的唾液酸殘基上，根據醣類結構的分析，由 於溫和的酸處理的HES-修飾的聚醣的MALD/TOF-MS展 15現完好的天然的N-乙醯基内酯胺-類型鏈，經觀察其與未 經修飾的EPO產物無法區別，故引入此種修飾不會影響 核心券聽鍵之結構的完整性，所得結果顯示至少3個經修 飾的HES-殘基被附接每一 EPO分子於EPO製備物中， 其不需先移除部分唾液酸而被引入修飾，缺乏約50%的 20唾液酸殘基之前者蛋白質之EPO變體，在SDS-PAGE(60-110 Kda對40 KDa對BRP EPO標準）之技術分析中，顯 現類似的清楚高分子量移動性HES修飾的EPO，在室溫 及pH 3-10下之標準的離子_交換層析條件下是安定的。 於normocythaemic小鼠系統中之EPO-生物分析顯 -130- 本紙張尺度 T關家標準(C>JS)A4規格⑵〇 χ 297公爱） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200418875 A7 B7 五、發明說明（l29) 示，在此分析中，當相較於根據歐洲藥典使用uv吸光值 之蛋白質測定的國際BRP EPO參考標準與校準對照於 BRP EPO鮮製料之奶^^咖蛋自制定法時， 經HES修飾的EPO料2.5_3.〇倍高的專性活性⑽毫 5 克）。 實例20.1 材料與方法 (a)以N-糖苷酶消化作用釋放N_連結的募醣類 樣品被與25單位（根據製造者的說明，R〇che 10 Diagnostics, Germany)的重組體 PNGase F —起在 37π 下 過夜，藉由蛋白質在SDS-PAGE中之特殊的移動變遷監 測是否已完全消化，從多肽中分離出被釋放的聚醣類，是 藉由添加3體積冷的100%乙醇與在_2〇。(：下培育至少2小 時達成（Schroeter S et al” 1999)，於 4。(：、13000 rpm 下離 15心1〇分鐘將沈澱的蛋白質移出，再將沈澱物以500微升 的冰-冷的75%乙醇再洗滌二次，收集於上澄液中的寡醣 被置於真空離心機中乾燥（Speed Vac concentrator，Savant Instruments Inc” USA)，使用先前使用之 Hypercarb 筒形 容器（25毫克或100毫克的HyperCarb)將聚醣樣品脫鹽： 2〇柱層經3 X 500微升溶於〇.i%tfa的80%乙腈(v/v)洗滌， 再經3 X 500微升的水洗滌，樣品在載入至筒形物前，經 水稀釋至最後體積為300微升-600微升，然後再精密地 經水洗滌，募醣以1·2毫升溶於水中，含〇·1%三氟醋酸 (ν/ν)之25%乙腈流洗(25毫克筒形物；1〇〇毫克的筒形物 -131- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） '" 一
200418875 A7 B7 五、發明說明（UO) 的情況為1·8毫升），流出的募醣類以2M NH4OH中和且 於Speed Vac濃縮器内乾燥，一些N-糖菩酶釋放的寡醣 之脫鹽情況的進行是藉由從樣品<100微克的總(醣)蛋白質 吸附消化的混合物至1〇〇毫克的Hypercarb筒形物。 5 (b)藉由基質-輔助的雷射脫吸附/離子化時間之飛行質量-光譜儀法(matrix-旦ssisted_laster desorption/ionization time-of flight mass-spectrometry)(MALDI/TOF/T〇F-MS) 分析寡si類 10 使用 Bmker ULTRAFLEX time-of-flight (TOF/TOF)之 儀器：分析天然的脫唾液酸的寡醣類，使用2,5-二羥基苯 甲酸作為UV-吸收材料於陽性以及於陰性離子模式，使用 反射處(reflectron)於兩情況中，就MS-MS分析，選擇的 母體離子被導至雷射誘發的分離(LID)並將產生的斷片離 15子經儀器的第二個TOF階段(LIFT)分離，1微升的樣品溶 液與約1-10 pmol.微升-1濃度，混合等量的各別基質，將 此混合物點入不銹鋼標靶並在分析前經室温下乾燥。 經濟部智慧財產局員K消費合作、社印製 實例2〇·2 重組體人類EPO(EPO-GT-l)之製備與鑑定 20 從重組體CHO細胞表現EPO(採用Mueller PP et al”1999, Domer AJ et al” 1984 揭露之方法）並根據 Em*.
Phar·中揭露之方法鑑定製備品（外.叩办 01/2002:1316:Erythrop〇ietin solution)，最後 的產物具有相對在每nMol的蛋白質中唾液酸含量為i2 -132- 軾張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公髮） 200418875 A7 B7 五、發明說明（131 ) nMol (+/- 1·5 nMol)，N-連結的募醣類的結構的測定是如 所述的藉由 HPAEC-PAD 與藉由 MALDI/TOF-MS(Nimtz et al·，1999，Grabenhorst, 1999)，由此製得的 EPO 製劑含 有二-，三-與四唾液酸化的寡醣類（分別為2-12%，15-28% 5 與60-80%，硫酸化與五唾液酸化鏈少量存在），EPO製劑 的總糖化作用特性，類似於國際BRPEPO標準製劑者。 重組體EPO的等電聚焦圖相比於國際BRP EPO標準 製劑，顯現相關的等型物(isoforms)，25%的EPO蛋白質 在多肽鏈的Ser126沒有〇_糖化作用。 10 實例20·3 部分地脫唾液酸的EPO型之製備 EPO GT-1蛋白質(2.84毫克/毫升)被置於pH 7.0之20 mM磷酸鈉緩衝液中，然後對每一毫升的epo溶液加入 100微升的1N硫酸，分別連續培育5分鐘、1〇分鐘與6〇 15分鐘’製得具不同程度的脫唾液酸作用之EPO製劑，在 以多狀N-糖苷酶釋放募酷類後，以〇_4唾液酸定量寡聽 類且N-連結的鏈的單離是使用Hypercarb筒形物經脫鹽進 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 行(25 毫克 HyperSep Hypercarb; Thermo_Hypersil-Keystone， UK) ’EPO製劑經添加1N氫氧化鈉中和並於液態氮中冷 20凍並儲存於-2(TC下直到再使用。 實例20.4唾液酸化的EP〇型之過碘酸氧化作用 對溶解於3·5毫升，pH 7.0之20 mM磷酸鈉緩衝液 中之宅克未經處理或溫和酸處理之EPO，加入1 5毫 -133- 200418875 A7 B7 五、發明說明（ 升、pH 5·5之0.1M醋酸鈉緩衝液，在冰浴中將混合物冷 卻至0°C ;然後加入500微升的10 mM過碘酸鈉，將反 應混合物置於黑暗中，〇°C下60分鐘，再加入1〇微升的 甘油’於黑暗中繼續再培育1〇分鐘，經部分氧化的Epo 5型，利用VIVASPIN濃縮器經脫鹽使之與試劑分開 (10,000 MWCO，PES Vivascience AG，Hannover，
Germany)，是依照製造者推荐的方法，在3〇〇〇 rpm下， 於附有固定角度旋轉器的實驗室離心機中進行，於液態氮 中冷凍後’將EPO製劑以最後為4毫升體積儲存於-2(TC 10 下。 將部分氧化的EPO製劑之100微升分量以N_糖苷酶 處理’且使用上述的Hypercarb筒形物分離寡醣類，經溫 和的酸處理將募醣類進行脫唾液酸作用，並藉HPAEC-PAD分析，其滯留時間被與所述的authentic標準刼寡醣 15 類之滯留時間相互比較(Nimtz et al·，1990 and 1993)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實例20.5 以二硫赤蘚糖醇(dithioerythreitol)還原EPO 於37°C下，將5毫克的EPOGT-1置於30 mM二硫 赤蘚糖醇(DTT)存在的5毫升、ρΗ8·1之0.1MTris/HCl緩 20衝液中培育60分鐘；使用Vivaspin濃縮器，在4°C下將 DTT移除，交換四次缓衝液，將最後還原得的EPO製劑 以液態氮冷凍並置於50 mM、pH 5.5之醋酸鈉緩衝液 中，儲存於-20°C下。 -134- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（l33 ) 實例20.6 測定EPO蛋白質 EPO的定量是根據Eur Phar.的方法，測量280 nm下 之路徑為1公分的觀測管之UV吸光而得（歐洲藥典4, Monography 01/2002 : 1316 ··紅血球生成素濃縮的溶 5液），此外，EPO的定量也應用rp-HPLC方法，使用rp_ C4 柱層（Vydac Protein C4, Cat.#214TP541〇, Grace Vydac，
Ca，US)進行；HPLC方法使用紅血球生成素brp l參考 標準（歐洲藥典，Conseil de I’Europe Β·Ρ· 907-F67029
Strasbourg Cedex 1)予以校正。 10
實例20.7以半乳糖氧化酶氧化脫唾液酸的EPO 4.485耄克完全地脫唾液酸的EPO被置於含16微升 過氧化氫酶(6214單位/200毫升)與80微升的半乳糖氧化 酶(2250單位/毫升，製自办瓜^·如（sigma_ 15 Aldrich，Stemheim，Germany))的 20 mM、pH 6.8 之鱗酸鈉 緩衝液中，係於37t：下培育過夜；開始培育後，於4小 時及8小時後再各加一次2〇微升的半乳糖氧化酶。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實例20.8製備EPO樣品供生物分析 20從過碘酸-或半乳糖氧化酶氧化的EPO蛋白質配製物與活 化的HES之培養物進行Ep〇的純化 EPO樣品的純化（除去未反應的HES衍生物）之進行 是於室溫下進行，EPO培養物混合物（約5毫克的EP〇蛋 白質）以1 · 10比例與緩衝液A (20 mM N-嗎啉丙烷續酸 -135- 200418875 A7 B7 五、發明說明（I34) [MOPS/NaOH]，in H20 bidest，pH 8·0)稀釋並施加至含 3 毫 升 Q-Sepharose HP (Pharmacia Code no. 17-1014-03, Lot no. 220211)之柱層，以10倍柱層體積（CV)之緩衝液A平 衡，流速為0.5毫升/分鐘，柱層經6-8 CV的緩衝液A洗 5 滌(流速=0.8毫升/分鐘)並以缓衝液B (20 mM嗎啉乙烷磺 酸[MES/NaOH]，0·5 M NaCl in H20 bidest，pH 6.5)流洗， 流速為0.5毫升/分鐘，EPO的偵測是利用UV吸光，於 280 nm及流洗約6毫升下測定，柱層的再生是使用3 CV 的緩衝液C (20 Mmmes，1·5 M NaCl，於水中，調至pH 10 6.5)且使用10 CV的緩衝液A再平衡(流速=〇·7毫升/分 鐘）。 得自Q-Sepharose步驟的EPO流出物之緩衝液交換是 使用Vivaspin濃縮器與磷酸緩衝的鹽液(PBS)進行，每一 樣品各經3次離心循環；樣品以PBS調成2毫升並被儲 15 存於-20°C。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在Q-Sepharose流洗物中，僅有<25%的部分地脫唾液 酸的與接著溫和過蛾酸氧化的EPO型進行HES-修飾作 用，係由於在所用的條件，驗性EPO型不結合q_ Sepharose且與未反應的HES衍生物一起流出。 20 實例20.9 以脈衝電流的彳貞測法進行高pH陰離子交換層 析（iiigh-nH 兰nioruxchange ghromatography with pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD) 使用附有CarboPac PA1柱層（0.4 x 25公分)及脈衝電 -136- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（l35) 流偵測器（PADXSchrdtr et al” 1999; Nimtz et al·，1999)的
Dionex BioLC系統(Di〇nex，USA)，利用高-pH陰離子交 換(HPAE)層析法分析已純化的天然的與脫唾液酸的募酶 類’伯測器電壓(Ε)與脈衝持續時間(丁)為：£1+5〇111\^，1'1: 5 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms; E3: -500 mV513: 60 ms ^ 且向外輸出的犯圍為500-1500 nA，然後將寡·類注入 CarboPAC PA1柱層，其為經1〇〇%溶劑a所平衡者，溶 離脫唾液酸化的寡醣類（流速：1毫升/分鐘)是藉施加線型 梯度(0-20%)的溶劑B組40分鐘，再線性增加20-100%的 10溶劑B經5分鐘，溶劑A為0.2M NaOH於雙蒸餾的水 中，溶劑B包含0.6 Μ溶在溶劑A之醋酸鈉，就天然的 寡醣類，柱層係以100%溶劑C(0J M NaOH於雙蒸餾的 水中）平衡，與流洗（流速：1毫升/分鐘），進行方式為藉 施加線型梯度(0-35%)的溶劑D組48分鐘，再線性增加 15 的溶劑D經10分鐘，溶劑d為溶解於溶劑C之 0·6Μ NaAc 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實例20·10以GC-MS分析Ν-聚醣，HES-修飾的Ν-聚醣 與ΕΡΟ蛋白質的單醣組成 20 單醣是於曱醇化、Ν-再乙醯化與三甲基矽烷基化後， 利用GC/MS分析其相關的曱基糖苷類[Chaplin，M.F. (1982)—種分析碳水化合物之迅速與敏感的方法如α/· 723，336-341] ’ 此分析可於 Finnigan GCQ 離子 捕捉質譜儀上進行(Finnigan MAT corp.，San Jose，CA)，於 -137- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 Α7 Β7 五、發明說明（136) 附有30米長的DB5毛細管柱層之正離子m模式下進 行，溫度的進展為：在8(Tc等溫2分鐘，再每分鐘上升 10 度至 300°C。 醣類是以其滯留時間及特性分劃圖予以鑑定，以未校 5正的電子頂峰積分結果供作定量，單醣類產生多於一個頂 峰是由於反構體性及/或呋喃體或吡喃體的存在之故，被 計量於所有主要頂峰中，使用〇·5微克的肌_肌醇作為内 部的標準化合物。 10 實例20.11 結果 實例20.11(a)溫和的酸處理的（部分地脫唾液酸的）ΕΡΟ-GT-1的Ν-聚醣之鑑定 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將EPO-GT-1製備物經溫和的酸處理5、10或60分 鐘，在與Ν_糖苷酶培育以釋放Ν-連結的募醣類之前、 15後，利用SDS-PAGE技術分析，結果示於圖9，將N-連 結的寡醣類導入HPAEC-PAD寡醣類作圖（圖10)，未處理 的EPO-GT-1含有>90%的具3或4個唾液酸殘基之Ν-連 結的募醣類，而經與溫和的酸存在下培育5分鐘後， <40%的碳水化合物鏈具有3或4個唾液酸殘基，脫唾液 20 酸的Ν-聚醣類的HPAEC-PAD透露，經偵測未經處理的 EPO-GT-1與經溫和的酸處理5、10或60分鐘後，仍安 定地殘留於製劑中之天然的寡醣類之比例，脫唾液酸的聚 醣之MALDI/TOF-MS透露，經溫和的酸處理蛋白質後， 存在<90%的近端的海藻糖。 -138- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（137) 實例20.11(b)過碘酸處理的EP0-GT-1的鑑定
先經5與10分鐘溫和的過碘酸處理或不經處理的 EPO型之SDS-PAGE移動性比較，被示於圖12，用於唾 5 液酸的過碘酸氧化作用條件並未改變EPO製劑的SDS-PAGE圖譜（對照圖9)，在較早的流洗物之HPAEC-PAD 分析中，唾液酸的氧化會導致募醣類的變遷(對照圖10與 13” 10 實例20.1 l(c) HES-修飾的EPO衍生物的鑑定 (aa)以根據實例14·4產生的羥基胺-修飾的HES衍生物 X進行EPO_GT-l_A的HES修铸作用的時間歷程 4〇微克的羥基胺-修飾的HES衍生物X被加至溶解 於20微升，pH 5.5之0·5 M NaOAc缓衝液中的EPO-GT- 15 i-A(溫和過碘酸氧化的EPO，在溫和的過碘酸氧化前非經 酸水解）中，分別於30分鐘，2，4與17小時後，將樣品 於液態氮中冷凍中止反應，接著將樣品儲藏於_2〇cc直到 進一步分析。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 加入SDS-PAGE樣品緩衝液，並將樣品加熱至9(rc 20且置於SDS-凝膠上，如圖14所示，增加培育時間，往較 高蛋白質分子量的變遷也增加，在羥基胺_修飾的HES衍 生物X存在下經17小時的培育後，基於分子量的位置標 準圖，可觀察到擴散的Coomassie染色的蛋白質帶被偵測 遷移介於60與11 KDa的地帶間（見圖14的左半部），經 -139- 200418875 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（U8 以N糖苷酶作用，大部分的蛋白質遷移至脫普糖化的 EPO之位置（見圖Μ右邊凝膠；箭頭a指出N雀菩酶的 遷移位置’箭頭B指出脫I糖化的EPO的遷移位置，在 介於28 KDa與36 KDa分子量標準的地帶之擴散的蛋白 質帶可被侧為代表咖_型，其為被刪修飾與分子的 Ο糖化位I:就N-糖菩酶的專一性而言，我們從這結果 可總結，HES-修飾作用發生於Ep〇蛋白質的聚聽之過蛾 酸氧化的唾液酸殘基。 (bb) HES-EPO共輛接合物的鑑定 依前述方法合成：HES_EP0共扼接合物工（起源於 EPO-GT-1於溫和過碘酸氧化作用後，即，得自Ep〇_GT_ 1-A)，II(將EP〇_GT_l進行5分鐘酸水解與溫和的過蛾酸 氧化作用），III (將EPO-GTM進行1〇分鐘酸水解與溫和 的過碘酸氧化作用），對照組(K)為含有未經修飾的Ep〇一 GT-1，在相同的緩衝條件下，加入等當量的未修飾的 HES ^月的混合物被進行更進一步的純化以供接續 HES-EPO衍生物的生化分析。 將hes-epo共輛接合物I，η與瓜以及對照組κ π 20培育物進行Q-Sepharose純化步驟，方法如“材料與方 法”項目（實例20.8)之方法，是為了除去過量的未反應之 HES-試劑，並會流過離子交換柱層，由於高量的鹼性 EP0型a於先別的酸處理的樣品]j與ΙΠ中，我們預期有 相當量的經修飾的EPO產物在這流出物中，如圖15 10 15 的 的 所 計 線 -140- 本紙張尺度適用中國國家標^^)八4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（l39) 示，幾乎所有來自樣品I的EPO材料被Q-Sepharose柱層 留住，而僅有約20-30%的樣品III與II被回收於以高鹽 濃度流洗的劃分中，所有來自與HES衍生物X培育的蛋 白質材料，在流出液與以高鹽度流洗的劃分中兩者，在 5 SDS-PAGE分析中，當與對照組作比較時，具有明顯較高 的分子量。 為了更仔細區分，HES-修飾的EPO樣品A與K (見 圖13)被與過碘酸氧化型EPO-GT-1-A相比，將樣品以N-糖菩酶處理，如圖16a與16b的繪圖，釋放N-聚產生 10兩低分子量帶於標準的EP0製劑的〇-糖化的與未糖化的 EPO型，於樣品A的情況，有另一帶遷移於28 KDa mw 標準位置被偵測得，暗示HES_修飾作用發生於此EP0異 體的0-聚醣（參考實例20.11(c)(aa))，在將樣品進行溫和 的水解反應後，此帶(也就是N-糖化的EP0之重度HES-15 修飾的南分子量型’見圖16a與16b)會消失，這與HES 修飾作用可在紅血球生成素的過碘酸氧化的唾液酸殘基達 成的觀點一致。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用能完全從募醣類除去唾液酸殘基（以及唾液酸連 結的HES衍生物）的條件，取用N—糖苷酶培育混合物的分 20量予以水解’經中和反應後，將混合物再吸附至小的 Hypercarb柱層以便脫鹽，柱層精密地經水洗滌，再以含 有0.1%二氟乙酸的溶於水中之4〇%乙腈流洗束缚的寡醣 類’所得寡醣類被引入MALDI/TOF-MS分析，得自樣品 A、EP0-GT-A與樣品κ之脫唾液酸的寡醋類劃分的光 -141- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規抬$1〇 χ 297公爱）------- 200418875 A7 B7 五、發明說明（14〇) 譜，就錯合物類型券醋類，顯示相同的質量於m/z=l 810
Da (雙觸角的，diantennary)，2175=三觸角的 (triantermaiy)，2540=四觸角的（tetraantennary)，29〇6=四 觸角的+ 1 N-乙醯基乙酿胺重覆與3271 =四觸角的+2 ]S[-乙 5醯基乙醯胺重覆；偵測到少量的訊號，是與缺少海藻糖(_ 146)與半乳糖(-162)相關，是由於酸水解條件下移走唾液 酸之故（見MALDI-圖19，20與21)。 於平行試驗中，N_糖苷酶消化物混合物被吸附於i毫 升的RP-C18筒形物上（未先進行寡露的水解），以含有 10 0.1% TFA的溶於水中之5%乙腈進行流洗；在這些條件 下，EPO蛋白質被完全保留在Rp-材料上且募醣類被含有 0.1% TFA的溶於水中之5%乙腈自柱層洗出，壓糖化 的EPO蛋白質是以含有〇.1%TFA的溶於水中之7〇%乙 腈流洗’ N-糖苷酶-處理的樣品a，EPO GT-1-A與樣品κ 15經RP_C18步驟中劃分得的寡醣，經中和後，使用前述的 Hypercarb筒形物進行脫鹽，將單離得的寡醣類進行前述 的HPAEC-PAD作圖（見圖17)與之後的在可發生定量自聚 醣移除唾液酸之條件下進行溫和酸處理（見圖18)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 HPAEC-PAD分析中，得自HES_修飾的樣品a的天 20然材料顯示僅有可忽略的寡醣類訊號，而EPO GT-1-A-衍 生的寡醣類顯現相同的聚醣圖樣，如示於圖13者(在經溫 和的過碘酸處理後，稱之為EPO-GT-1樣品），從對照的 EPO樣品(K)取得的寡醣類之流出物製得預期的圖樣（比較 圖的外廓），為了比較，包括國際BPR-EPO標準品之 -142- 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） ---一 200418875 A7 B7 五、發明說明（141) 天然的募醣類圖樣被比較且作為參考標準。 在經溫和的酸水解後，所有的寡醣製備物顯現與天然 的寡醣結構完全相同的流洗圖樣（見圖18)，具預期的定性 與定量的二-、三-與四觸角的（tetraantennary)錯合物-型碳 5 水化合物鏈，如同在本發明研究中製備EPO的方法中作 為原料者，此結果證明，EPO樣品的HES-修飾作用產生 HES衍生物的共價連結，經N-糖苷酶的作用可將其從 EPO-蛋白質脫開，且由於它經過溫和的酸處理（為已知用 於脫唾液酸的碳水化合物條件），被從N-聚醣移開而為酸_ 10 易分解的（見圖16a+b)。 (cc)利用GC-MS對HES-EPO與HES-EPO N-聚醣進行單 酶組成分的分析 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 為能更進一步4認EPO在分子的N-聚醣進行的 15 HES-修飾作用，以N-糖苷酶將EPO樣品消化並將Ep〇 蛋白質吸附至RP-C18筒形物上，而寡醣材料如前述的方 法洗務，如表3所示，葡萄糖與羥乙基化的葡萄糖衍生物 僅在已於半胱胺酸殘基進行HES-修飾作用且於Ep〇樣品 A2的募醣分劃物中被偵測到。 20 實例20.11(d) HES-修飾的EPO之生物活性的活體内分 析 於normocythaemic小鼠系統的EPO-生物分析驗證是 根據歐洲藥典中揭露的方法進行；實驗室中進行Ep〇分 -143- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（⑷ 析是使用國際BRP EPO參考標準的製劑，就HES-修飾的 EPO A2製劑，測得之專一性活性的平均值為：每毫克的 EPO蛋白質為294,600單位，比較也包含於樣品活性分析 之國際BRP EPO參考標準製劑，約為3-倍較高的專一性 活性。 此研究的結果被摘錄於表4。 實例13至20之參考資料：
Nimtz Noll G, Paques EP, Conradt HS. 10 15 表現於重組體中國倉鼠卵巢細胞之人類組織血漿蛋白 原活化劑的碳水化合物結構。 ΐ FEBS Lett. 1990 Oct. 1; 271(1-2):14-8
Domer AJ，Wasley LC，Kaufman RJ. 於丁酸"處理的中國倉鼠卵巢細胞中，分泌的蛋白質 誘發葡萄糖-調節的表現之增加合成作用 J Biol Chem. 1989 Dec 5; 264 (34):20602-7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Mueller PP，Schlenke P，Nimtz M，Conradt HS，Hauser H 20 增殖-控制的BHK-21細胞中的重組體醣蛋白品質。
Biotechnol Bioeng. 1999 Dec 5; 65(5):529-36
Nimtz M，Martin W，Wray V，Kloppel KD，Augustin J， Conradt HS. -144- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（143) 重組體BHK-21細胞表現的人類紅血球生成素的唾液 酸化的募醣類之結構
Eur J Biochem. 1993 Apr. 1;213(1)：39-56 5 Hermentin P，Witzel R，Vliegenthart JF，Kamerling JP， Nimtz M，Conradt HS. 藉高-ph陰離子-交換層析與脈衝的電流偵測法供映象 N-聚醣類的對策。
Anal Biochem. 1992 Jun; 203(2):281-9 10
Schroter S, Derr P, Conradt HS, Nimtz M? Hale G, KirchhoffC. 人類CD52的雄性專一性修飾作用。 J Biol Chem. 1999 Oct. 15;274(42):29862-73 15 表1 聯結子-類型 官能基1 :與多肽(尤其是 EPO)反應 官能基2 ··與HES反應 A 醯肼（醛-反應性） 馬來醯亞胺基(SH-反應性） B 醯肼（醛-反應性） 吡啶基-硫基(SH-反應性） C 碘烷基(SH-反應性） N-琥珀醯亞胺酯(胺-反應性） D 溴烷基(SH-反應性） ^琥珀醯亞胺酯(胺-反應性） E 馬來醯亞胺基(SH-反應性） N-琥珀醯亞胺酯(胺-反應性） F 吡啶基二硫基(SH-反應性） 丘*琥珀醯亞胺S旨(胺-反應性） G 乙烯基颯(SH-反應性） ^號珀醯亞胺酯(胺-反應性） -145- 本紙張尺度適用準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200418875 五、 明說 明發
A B 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
分。 αΗ) 以。 0=< ρ Ζ \ XX Π。 〇 \ X as / X3C \ \ ^ 。分 Γ :1。。 力。 類型 ω < ω < ω ω 化學名稱 Ν-(α -馬來醯亞胺基乙氧基）琥珀醯亞胺酯 Ν-(冷-馬來醯亞胺基丙酸）醯肼-TFA N-(yS -馬來醯亞胺基丙氧基）琥珀醯亞胺酯 Ν-( ε -馬來醯亞胺基己酸）醯肼 [ 1 Ν-( ε -馬來醯亞胺基己氧基）琥珀醯亞胺酯 Ν- r ·馬來醯亞胺基丁醯氧基-琥珀醯亞胺酯 縮寫 1 AMAS BMPS _i EMCH EMCS GMBS EMCH 6 4 .裝丨 計· •線丨 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（l45 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
X / 工工 \ U：； X X j 〇 ' P η \ μ 4 1 °^0 α ο 七。 [隊 ⑽ 0 類型 < ω Ph ω < < 化學名稱 N-(/c-馬來醯亞胺基十一烷酸)醯胼 二 rO i S 3 η 琥珀醯亞胺基6-(3’-[2-吡啶基-二硫]丙醯胺基）己 酸酯 間位-馬來醯亞胺基苯甲醯基-Ν-羥基琥珀醯亞胺 酯 i rO 人 鍥驾 键5 wlT 二 Γ 〇 ^ £ 1 4_(4-N-馬來醯亞胺基苯基>丁酸醯肼.HC1 縮寫 歷 LC- SMCC LC- j SPDP MBS m2c2h MPBH -147- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（I46) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μ A α χ>。 0=^ U% 4 °xi。 as X3： Λ ο α V 7 α ο 。如 1 .¾ α α 。合. m X Q 〇 υ ω 铢 tO 〇 1 05 砩 ϋ 盤 ve ά tO 1 00 i)ai VSI Ο s 通 CO 〇 W 1 Ζ δ- 饍 〇 4 鍩 1 Ζ η!Γ 言 雇 寸 蘩η3 被 槃 C Η < 00 Ph < PQ 00 < cn PQ < 00 〇 U m -148- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7五、發明說明（l47) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣
3 3
PH
PH 3 3 餵毽h(_ i4®-(饽 4讀智 qTCN)- ;^-^^-^黢-^^鍥*|濬眾^丨寸 毽肊(饽-r^^f-<N)CA砩鍥^饍眾^-^ 餵鍩胡_ 9ί 臀(_赫饍ro_^ftlfs«HC- 〇-Ν s§s
ECMS
HPLHNS PHads SUW3-硝齊 8|0丨,彆 -149-
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（I48) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
。♦久 * σ 〇 \ P 4« \ Λ. :\· 。与 •〇-Ve £ β fY° . α o 。☆: .Λ、。· ο .2 V . O a 。女: 〇-« * r° a Ο 〇 。女 •D。 a 广。 '5 a ° «〇 ： 〇 ·· 。 類型 ω Ρη ω ο ω ω 化學名稱 I 镳 1 兴饍 i ^ '1 1 <Ν U—1 1 m 1 . «3 ^ΤΝ 1 Ζ I 饍 δ~ i4 ^ Ϊ 1 W Se 彆 磺基琥珀醯亞胺基（4-碘乙醯基）胺基 苯曱酸酯 ιίΓ 辱ij® 寸 阳 ί 5 饍趑 <n V〇 Ηλ . 鍩 濬 *^4 HiST 1 家 1 寸 m ^ 5 地1滅 縮寫 磺基-KMUS i 磺基-LC-SPDP 磺基-MBS 磺基-SIAB 磺基-SMCC 磺基-SMPB
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） 200418875 A7 B7 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Q :ί t 1 \ 。众。 ° \ a .¾ ㈣=〇 (\ 媒 1¾ o 祖 ^ Dm 1 vg3 V ^ ^ S-鍩丄 辟饽 锺'1 •g 械1 % i i4 5 嫿 爱 ο I I Ζ ^ 槃 1 ο 1 ^ £ PQ CO > 00 -151- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（"〇) ϋ 取樣自經HES-修飾的ΕΡ〇與對照樣品之聚醣(glycan)的單醣 組成的分析 **單醣 I. 聚醣 取自 A2 II. 聚醣 取自 EP0-GT- III. 聚醣 取自 K2 III. 聚醣 取自 A2 聚醣 取自 ΕΡ0- GT-1A V. 聚醣 取自 K2 VI. 半胱胺酸 修飾的 EP0蛋白 質* 果糖 1,935 3,924 ----- 2,602 2,246 4,461 2,601 2,181 甘露糖 6,028 11，〇2〇 9,198 6,379 11,668 6，117 6,260 半乳糖 8,886 19,935 14,427 10,570 16,911 11,555 10,386 葡萄糖 17,968 一- —- 21,193 trace trace 33,021 GlcNAc 7,839 21,310 14,440 11,360 15,953 10,503 10,498 GlcHel 5,583 — 5,926 14,857 GlcHe2 1,380 --- -— 1,552 —— 3,775 NeuNAc 5,461 822 4,504 3,895 ——— 4,871 13,562 13,003 肌醇 1,230 2,310 1620 2,050 1,320 1,134 1,087 *將等當量經Cys-HES-修飾的EPO蛋白質進行組成的分析；Ep〇蛋白質 是以前述方法，使用Q-Sepharose柱層，層析分離自hes-培育物混合‘ 物，並使用Vivaspin5分離裝置，藉離心除去鹽類。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 **單醣的測定是從全三甲基矽烷基化的曱基糖苷的單個的GC流出物(runs) 進行測定；顯示之頂峰之電子集成值未經校正在衍化過程與回收各化合 物時之損失量。 -152- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A7 B7 五、發明說明（m) 表4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -153- 樣品編號 樣品說明 計算的EPO樣品之比活性 (根據 A280 nm 與 RP-HPLC 測定） 850247 1.HES-修飾的 EPO A2 344,000U/毫克 850248 2.EPO-GT-1-A 82,268 U/毫克 850249 3.對照的EPOK2 121,410 U/毫克 850250 4.BRPEPO標準品 86,702U/毫克 850251 1.以4倍容積PBS稀釋 309，129U/毫克 850252 2.以4倍容積PBS稀釋 94,500U/毫克 850253 3.以4倍容積PBS稀釋 114，100U/毫克 850254 4.以4倍容積PBS稀釋 81，200U/毫克 850255 1.以4倍容積PBS稀釋 230,720 U/毫克 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

Claims (1)

  1. 200418875 A8 B8 C8 D8___ 六、申請專利範圍 ~" 1· 一種羥烷基澱粉(HAS)-紅血球生成素(epo)-共軛接合 物(HAS_EPO)，係包含一或多個HAS分子，其中各 HAS被共軛接合至EPO，係經由： a)碳水化合物部位；或 5 b)硫鱗。 2·根據申請專利範圍第1項的HAS_Ep〇，其中Ep〇具 有人類EPO的胺基酸序列。 3·根據申請專利範圍第1或2項中任一項的HAS-Ep〇， 其中EPO包含一或多個碳水化合物側鏈經由乂或〇_ 10 連結的糖化作用附接至EPO。 4·根據申請專利範圍第3項的HAS-EP0，其中碳水化合 物側鏈於生產於哺乳動物（特別是人類）、昆蟲或酵母 細胞期間已被附接至EPO上。 5·根據申請專利範圍第1至4項中任一項的HAS-Ep〇， 15 其中HAS是經由聯結子（iinker)分子被共軛接合至 EPO 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6·根據申請專利範圍第3至5項中任一項的HAS-EPO， 其中HAS是經由碳水化合物部位（其為碳水化合物側 鏈的一部分且其宜為被氧化的)被共扼接合至Ep〇。 20 7·根據申請專利範圍第6項的HAS-EP0，其中HAS是 共軛接合至碳水化合物侧鏈的半乳糖或唾液酸殘基。 8.根據申請專利範圍第1至7項中任一項的HAS-Ep〇， 其中硫醚中的S原子是衍生自天然出現的半胱胺酸或 來自加入的半胱胺酸。 -154 - 92436B專利範圍 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇x297公釐） 200418875 A8 B8 C8 六、申請專利範Ϊ ^ 9·根據申請專利範圍第8項的HAS-EPO，其中ΕΡ〇具 有人類ΕΡΟ的胺基酸序列且天然出現的半胱胺酸為半 胱胺酸29及/或33。 10·根據申請專利範圍第9項的HAS-EPO，其中HAS是 5 共輛接合至半胱胺酸29而半胱胺酸33被取代成其他 的胺基酸。 11·根據申請專利範圍第9項的HAS-EPO，其中HAS是 共輛接合至半胱胺酸33而半胱胺酸29被取代成其他 的胺基酸。 10 12·根據申請專利範圍第8至11項中任一項的HAS- EPO ’其中加入的半胱胺酸是經取代天然胺基酸成半 胱胺酸而被加入。 13·根據申請專利範圍第12項的HAS-EPO，其中EPO為 人類EPO且被取代的胺基酸殘基為絲胺酸126。 I5 ϋ根據申凊專利範圍第1至13項中任一項的HAS-EPO，對每一 EPO分子包含1-12，宜為1-6或1 -3， 最好為1-4個HAS分子。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15·根據申清專利範圍第1至14項中任一項的HAS-EPO，其中has係選自包括下列物質：羥乙基澱粉， 20 經丙基殿粉與經丁基殿粉。 16·根據申請專利範圍第15項的HAS-EPO，其中HAS為 羥乙基澱粉(HES)。 17.根據申請專利範圍第16項的HAS-EPO，其中HAS具 有1至300 kDa，宜為5至100 kDa之分子量。 -155 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200418875 A8 B8 C8 _____ D8 六、申請專利範圍 18.根據申請專利範圍第16或17項中任一項的HAS-EPO，其中HES呈現莫耳取代度為〇·ι至0.8，且就羥 乙基基團而言，介於C2 : C6-取代度的比例為在2-20 範圍間。 5 19· —種產製羥烷基澱粉(HAS)-紅血球生成素(EPO)-共輊 接合物(HAS-EPO)的方法，係包含下列步驟： a) 提供可與修飾的HAS反應之EPO， b) 提供可與步驟a)的EPO反應的經修飾的HAS，與 c) 以步驟b)的HAS分子與步驟a)的EPO反應，產生 10 包含一或多個HAS分子之HAS-EPO，其中各HAS 共軛接合至EPO係經由： i) 碳水化合物部位；或 ii) 硫 。 20.根據申請專利範圍第19項的方法，其中EPO具有人 15 類EPO的胺基酸序列。 21·根據申請專利範圍第19或20項的方法，其中EPO係 由重組產生。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 22·根據申請專利範圍第19至21項中任一項的方法，其 中EPO包含一或多個碳水化合物侧鍵經由N-及/或〇-20 連結的糖化作用被附接至EPO。 23·根據申凊專利範圍第22項的方法，其中石炭水化合物側 鏈於生產於哺乳動物（特別是人類）、昆蟲或酵母細胞 期間已被附接至EP0上。 24·根據申請專利範圍第22或23項中任一項的方法，其 -156 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200418875 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 中HAS疋經由碳水化合物側鏈的一部分之碳水化合物 部位被共輛接合至EPO。 25·根據申清專利範圍第23項的方法，其中於步驟a)中， EPO是經氧化修飾於至少一個碳水化合物部位，宜為 5 EP0之一或多個破水化合物側鏈之至少一個末端醣單 元，更好為半乳糖。 26·根據申睛專利範圍第25項的方法，其中末端聽單元是 於部分或完全的移除(使用酵素及/或化學方法）末端唾 液酸後被氧化。 10 27·根據申請專利範圍第25或26項的方法，其中步驟c) 中，修飾的HAS是被共軛接合至氧化的末端醣單元 上。 28·根據申請專利範圍第19至27項中任一項的方法，其 中EP0包含至少一個游離的SH-基。 15 29·根據申凊專利範圍第28項的方法，其中SH-基為天然 出現的半胱胺酸或加入的半胱胺酸之一部分。 30·根據申請專利範圍第29項的方法，其中Ep〇具有人 類EPO的胺基酸序列且天然出現的半胱胺酸為半胱胺 酸29及/或33。 2〇 31·根據申請專利範圍第3〇項的方法，其中半胱胺酸％ 被取代成另外的胺基酸且於步驟c)，修飾的HAs被共 輛接合至半胱胺酸29。 32.根據中請專利範圍第3〇項的方法，其中半胱胺酸29 被取代成另外的胺基酸且於步驟c)，修飾的職被共 -157 -
    200418875 Αδ B8 C8 D8___ 六、申請專利範圍 — 軛接合至半胱胺酸33。 33·根據申請專利範圍第29至32項中任一項的方法，其 中加入的半胱胺酸是經由取代天然出現的胺基酸成半 脱胺酸而被加入。 5 34·根據申請專利範圍第33項的方法，其中ΕΡΟ為人類 ΕΡΟ且被取代的胺基酸殘基為絲胺酸126。 35·根據申請專利範圍第33或34項中任一項的方法，其 中步驟c)中，修飾的HAS被共軛接合至加入的半胱胺 酸上。 10 36.根據申請專利範圍第19至35項中任一項的方法，其 中’如果HAS係被共軛接合至氧化的碳水化合物部位 時，HAS係被修飾成包含游離的醯肼(hydrazide)、經 基胺、硫醇或半卡二醯肼(semicarbazide)官能，或如果 HAS係被共軛接合至SH-基時，HAS係被修飾成游離 15 馬來醯亞胺、二硫化物或鹵乙醯胺的官能。 37·根據申請專利範圍第19至36項中任一項的方法，其 中c)步驟係於包含至少10%重量計的水之反應介質内 進行9 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 38·根據申請專利範圍第19至37項中任一項的方法，其 20 中HAS是經由聯結子卬吐沉^分子共軛接合至epo。 39·根據申請專利範圍第19至38項中任一項的方法，其 中HAS是羥乙基澱粉，羥丙基澱粉或羥丁基澱粉，宜 為羥乙基澱粉(HES)。 40·根據申請專利範圍第39項的方法，其中HAS具有根 -158 - 本紙張尺度適用中_家標準(QV|S)A4規格（2跑297公楚） 200418875 A8 B8 C8 ____ D8 六、申請專利範圍 據申請專利範圍第17或18中任一項定義之性質。 41· 一種HAS-PEO，其係根據申請專利範圍第19至4〇項 中任一項的方法製備者。 42.根據申請專利範圍第41項的HAS-PEO,其係具有根 5 據申睛專利範圍第1至18項中任一項中定義的特徵 者。 43·根據申請專利範圍第！至18、41或42項中任一項的 HAS-PEO，係被使用於供治療人類或動物身體的方法 中。 10 44· —種醫藥組成物，其係包含根據申請專利範圍第1至 18、41或42項中任一項的HAS-EPO。 45·根據申請專利範圍第44項的醫藥組成物，其另包含至 少一種藥學可接受的載劑。 46·根據申請專利範圍第1至18、41或42項中任一項的 15 HAS-PEO之用途，係被使用於製備供治療貧血或造血 機能不良等疾病之醫藥品。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 47· —種羥烷基澱粉(HAS)-多肽-共軛接合物(HAS-多肽）， 係包含一或多個HAS分子，其中各HAS被共軛接合 至多肽，係經由： 2〇 c)碳水化合物部位；或 d)硫醚。 48·根據申請專利範圍第47項的HAS-多肽，其中多肽是 源自人類。 49·根據申請專利範圍第47或48項中任一項的HAS-多 -159- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） 200418875 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 肽，其中多肽是選自包括紅血球生成素、介白質類 (interleukins) ’ 尤其是第二介白質（interleukin_2)，IFN_ 冷，IFN-α，CSF，第六介白質與治療的抗體類。 50·根據申請專利範圍第47至49項中任一項的HAS-多 5 肽其中夕肽包含一或多個碳水化合物侧鍵經由N-及/ 或〇連結的糖化作用附接至多肽。 51·根據申請專利範圍第50項的HAS_多肽，其中碳水化 合物侧鏈於生產於哺乳動物（特別是人類）、昆蟲或酵 母細胞期間已被附接至多肽上。 10 52.根據申請專利範圍第47至51項中任一項的HAS-多 肽，其中HAS是經由聯結子分子共軛接合至多肽。 53·根據申請專利範圍第49至52項中任一項的HAS-多 肽，其中HAS是經由碳水化合物部位（其為碳水化合 物側鏈的一部分且其宜為被氧化的）被共軛接合至多 15 肽。 54·根據申請專利範圍第53項的HAS-多肽，其中HAS是 被共辆接合至碳水化合物侧鏈的半乳糖殘基上。 55. 根據申請專利範圍第47至54項中任一項的HAS_# 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 狀，其中硫醚中的S原子係衍生自天然發生的半胱胺 20 酸或來自加入的半胱胺酸。 56. 根據申請專利範圍第55項的HAS-多肽，其中加入的 半脱胺酸是經由取代天然出現的胺基酸成半胱胺酸而 被加入。 57. 根據申請專利範圍第47至56項中任一項的HAS-# -160 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 χ297公f —— 一"" 200418875 A8 B8 C8 -----~一 ____ 六、申請專利範圍 肽’對每一多肽分子包含1-12，宜為1-6或1-3，最好 為1-4個HAS分子。 58·根據申請專利範圍第47至57項中任一項的HAS-多 肽’其中HAS係選自包括下列物質：羥乙基澱粉，經 5 丙基澱粉與羥丁基澱粉。 59·根據申請專利範圍第58項的has-多肽，其中HAS係 羥乙基澱粉(HES)。 60·根據申請專利範圍第59項的HAS—多肽，其中HES具 有1至300 kDa，宜為5至100 kDa之分子量。 10 61.根據申請專利範圍第59或60項中任一項的HAS- EPO ’其中HES呈現莫耳取代度為0.1至0.8，且就羥 乙基基團而言，介於C2 : C6-取代度的比例為在2-20 範圍間。 62. —種產製羥烷基澱粉(HAs)-多肽·共軛接合物(HAS-多 15 肽）的方法，係包含下列步驟： d) 提供可與修飾的HAS反應之多肽， e) 提供可與步驟a)的多肽反應的經修飾的HAS，與 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Θ以步驟b)的HAS分子與步驟a)的多肽反應，產生包 含—或多個HAS分子之HAS-多肽，其中各HAS共 20 執接合至多肽係經由： 〇 碳水化合物部位；或 li) 硫醚。 63·根據申請專利範圍第62項的方法，其中多肽是源自人 類。 -161 - 本纸張尺度適用中國國家標準(cns)a4規格（2跑297公爱） 200418875
    8 0〇 8 81 A B c D 合 作 社 印 製 64·根專利範圍第62或63項中任一項的方法，其 中多肽是選自包括紅血球生成素、介白質類，尤其是 第二介白質，IFN^，IFN-α，CSF，第六介白質與治 療的抗體類。 5 65·根據申請專利範圍第62至64項中任一項的方法，其 中多肽是經重組產生。 根據申π專利範圍第62至65項中任_項的方法，其 中多肽包含一或多個碳水化合物侧鏈經由Ν_及/或〇 連結的糖化作用附接至多肽。 10 67.根據申請專利範圍第66項的方法，其中碳水化合物側 鍵於生產於哺乳動物（特別是人類）、昆蟲或酵母細胞 期間已被附接至多肽上。 根據申明專利範圍第66或67項中任一項的方法，其 中HAS是經由碳水化合物側鏈的碳水化合物部位共輛 接合至多肽。 69·^據中請專利範圍第⑼項的方法，其中於步驟^中，=肽疋經氧化修飾於至少一個碳水化合物部位，宜為 多肽之-或多個碳水化合物側鏈之至少一個末端聽單 元’更好為半乳糖。 7〇·根據申請專利範圍第69項的方法，其中末端 於部分或完全的移除(使用酵素及/或化學方法)末端= 液酸後被氧化。 71.根據申請專利範圍第69或7〇項的方法，其甲步驟 中’修飾的HAS是被共輛接合至氧化的末端醋單元 計 15 20 -162 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） 線 200418875 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍
    上 72. 根據申請專利範_62至71項 中多肽包含至少―個游離的邮基。的方去其 73. 根據申：專利範圍第72項的方法 出現的半胱胺料加人的半胱胺酸之-部分。 74·根據=專利範圍第❹乃中任—項的方法，其中 加入的半脱胺酸是經由取代天然出現的胺基酸成半胱 胺酸而被加入。 土夂风千脱 10 75.根據中請專利範圍第乃或％項中任—項的方法，盆 中於步驟e)中，修飾的譲是共輛接合至加入的半耽 胺酸。 15 訂 76·根據申請專利範圍第62至75項中任一項的方法，其 :’如果HAS係被共輛接合至氧化的碳水化合物部位 ^ ’ HAS係被修飾成包含游離的醯肼(hydrazide)、幾 基胺、硫醇或半卡二醯胼(semicarbazide)官能，或如果 HAS係被共軛接合至SH-基時，HAS係被修飾成游離 馬來酿亞胺、二硫化物或鹵乙醯胺的官能。 77·根據申請專利範圍第62至76項中任一項的方法，其 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 中c)步驟係於包含至少1〇%重量計的水之反應介質内 20 進行。 78.根據申請專利範圍第62至78項中任一項的方法，其 中HAS是經由聯結子(iinker)分子共輛接合至多肽。 79·根據申請專利範圍第62至78項中任一項的方法，其 中HAS係羥乙基澱粉，羥丙基澱粉或羥丁基澱粉，以 163 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200418875 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 羥乙基澱粉(HES)較佳。 80. 根據申請專利範圍第79項的方法，其中HAS具有根 據申請專利範圍第60或61項中任一項的性質。 81. —種HAS-多肽，係根據申請專利範圍第62至80項中 5 任一項的方法製備。 82. 根據申請專利範圍第41項之HAS-多肽，具有根據申 請專利範圍第47至61項中任一項中定義的特性。 83. 根據申請專利範圍第47至61、81或82項之HAS-多 肽，係被使用於供治療人類或動物身體的方法中。 10 84. —種醫藥組成物，其係包含根據申請專利範圍第47至 61、81或82項中任一項的HAS-多肽。 85.根據申請專利範圍第84項的醫藥組成物，其另包含至 少一種藥學可接受的載劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -164 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）
TW092124954A 2002-09-11 2003-09-10 HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin TW200418875A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40978102P 2002-09-11 2002-09-11
EP02020425A EP1400533A1 (en) 2002-09-11 2002-09-11 HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
PCT/EP2003/008858 WO2004024761A1 (en) 2002-09-11 2003-08-08 Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW200418875A true TW200418875A (en) 2004-10-01

Family

ID=31995520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW092124954A TW200418875A (en) 2002-09-11 2003-09-10 HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin

Country Status (25)

Country Link
US (5) US7815893B2 (zh)
EP (8) EP2154160A1 (zh)
JP (4) JP2006516534A (zh)
KR (3) KR101045422B1 (zh)
CN (2) CN100348618C (zh)
AR (3) AR041097A1 (zh)
AT (3) ATE323723T1 (zh)
AU (6) AU2003260393B2 (zh)
BR (3) BR0314227A (zh)
CA (2) CA2496317C (zh)
CY (1) CY1109813T1 (zh)
DE (7) DE60330098D1 (zh)
DK (3) DK1398327T3 (zh)
ES (4) ES2213505T3 (zh)
HK (4) HK1063478A1 (zh)
IL (5) IL166506A0 (zh)
MX (4) MXPA05002594A (zh)
NO (2) NO20051427L (zh)
PL (3) PL216545B1 (zh)
PT (3) PT1398322E (zh)
RU (3) RU2329274C2 (zh)
SI (2) SI1398327T1 (zh)
TW (1) TW200418875A (zh)
WO (3) WO2004024761A1 (zh)
ZA (1) ZA200600651B (zh)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
ES2214166T1 (es) * 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
BR0314227A (pt) 2002-09-11 2005-10-25 Fresenius Kabi De Gmbh Derivados de amido de hidroxialquila
EP1549350B1 (en) 2002-10-08 2008-09-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10256558A1 (de) * 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
BRPI0412671A (pt) * 2003-08-08 2006-10-03 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de um polìmero e uma proteìna ligados por um grupo de ligação de oxima
SG145746A1 (en) * 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
RU2370281C2 (ru) * 2003-08-08 2009-10-20 Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и g-csf
US8754031B2 (en) 2004-03-08 2014-06-17 Oncolix, Inc. Use of prolactin receptor antagonists in combination with an agent that inactivates the HER2/neu signaling pathway
EP1725589A1 (en) * 2004-03-11 2006-11-29 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
AR048918A1 (es) * 2004-03-11 2006-06-14 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxietilo y eritropoyetina
JP5396019B2 (ja) * 2004-03-11 2014-01-22 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
US7589063B2 (en) 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
WO2006094826A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method for coupling enzymatically activated glycoconjugates to a hydroxyalkyl starch
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
US8470963B2 (en) 2006-06-30 2013-06-25 Sku Asset Management Gmbh Multifunctional compounds for pharmaceutical purposes
JP5419689B2 (ja) * 2006-07-25 2014-02-19 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 顆粒球コロニー刺激因子の誘導体化
EP2120998B1 (en) 2006-11-28 2013-08-07 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
PT2101821E (pt) * 2006-12-15 2014-10-03 Baxter Int Fator conjugado viia-ácido (poli)siálico com prolongamento do tempo de meia vida in vivo
PT2457920T (pt) 2007-01-18 2018-01-23 Genzyme Corp Oligossacáridos compreendendo um grupo aminooxi e conjugados dos mesmos
CN101485897B (zh) 2008-01-14 2015-05-20 纪欣 生物相容性止血、防粘连、促愈合、外科封闭的变性淀粉材料
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
WO2009094551A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
WO2009134344A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Surmodics, Inc. POLY-α(1→4)GLUCOPYRANOSE-BASED MATRICES WITH HYDRAZIDE CROSSLINKING
EP2816059A1 (en) 2008-05-01 2014-12-24 Amgen, Inc Anti-hepcidin antibodies and methods of use
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
EP3225248B1 (en) 2008-07-23 2023-06-07 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
WO2010033240A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
CA2742871C (en) 2008-11-13 2018-10-23 Herb Lin Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6
BRPI0920896B8 (pt) 2008-12-06 2021-05-25 Braun Melsungen Ag composto de fórmula geral (i) (t-z)n-p (i), formulação farmacêutica e processo para preparar um composto de fórmula geral (i)
CN106177954A (zh) 2009-02-26 2016-12-07 翁科里克斯公司 使癌干细胞可视化并消除癌干细胞的组合物和方法
US8648046B2 (en) 2009-02-26 2014-02-11 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
WO2010136242A1 (de) * 2009-03-31 2010-12-02 B. Braun Melsungen Ag Verknüpfungsprodukte aminierter polysaccharide
CN102573920B (zh) * 2009-07-27 2015-01-14 利普森技术有限公司 非凝血蛋白的糖基多唾液酸化
JP5908401B2 (ja) 2009-07-27 2016-04-26 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 血液凝固タンパク質複合体
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
PL2459224T3 (pl) 2009-07-27 2017-08-31 Baxalta GmbH Koniugaty białka związanego z krzepnięciem krwi
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2805964A1 (en) 2009-12-21 2014-11-26 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
NZ600363A (en) 2009-12-21 2014-07-25 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
AU2011265005B2 (en) 2010-06-07 2015-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device
WO2012004006A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
WO2012004007A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
EP2591009A1 (en) 2010-07-09 2013-05-15 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Nitric oxide delivering hydroxyalkyl starch derivatives
WO2012004009A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
KR102269494B1 (ko) 2010-07-30 2021-06-25 박스알타 인코퍼레이티드 옥심 결합용 친핵성 촉매
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
CN103269723B (zh) 2010-12-22 2017-04-05 百深有限责任公司 用于偶联水溶性脂肪酸衍生物与蛋白质的材料和方法
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
EP4074355A1 (en) 2011-04-20 2022-10-19 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
WO2012166622A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Baxter International Inc. Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
WO2012170396A1 (en) * 2011-06-07 2012-12-13 Philadelphia Health & Education Corporation Spla2 monitoring strip
WO2013021056A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Ludwig-Maximilians-Universität München Method for the controlled intracellular delivery of nucleic acids
CA2851521C (en) 2011-10-14 2020-09-22 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2013113503A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an oligonucleotide
AU2013204754C1 (en) 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
EP2922590B1 (en) 2012-11-21 2020-02-05 Amgen Inc. Drug delivery device
JP6219308B2 (ja) * 2012-11-30 2017-10-25 株式会社糖鎖工学研究所 糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法
WO2014152006A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Intrinsic Lifesciences, Llc Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
TWI639449B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
WO2014144096A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
EP2976364A1 (en) * 2013-03-20 2016-01-27 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
US20160311933A1 (en) * 2013-03-20 2016-10-27 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Process for the preparation of thiol functionalized hydroxyalkyl starch derivatives
CA2907371A1 (en) * 2013-03-20 2014-09-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
AU2014238267B2 (en) 2013-03-22 2019-08-15 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EP3050893B1 (en) 2013-09-24 2020-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Glycoamino acid and use thereof
CA2926110C (en) 2013-10-24 2023-05-23 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
CA2920894C (en) 2013-10-24 2023-03-14 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
WO2015120427A2 (en) * 2014-02-10 2015-08-13 Honeywell International Inc. Reactor design for liquid phase fluorination
EP3114138B1 (en) 2014-03-05 2021-11-17 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
EP3139977B1 (en) 2014-05-07 2021-02-17 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
WO2015187802A1 (en) 2014-06-03 2015-12-10 Amgen Inc. Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
CN104072608A (zh) * 2014-06-23 2014-10-01 山东齐都药业有限公司 含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
US10323088B2 (en) 2014-09-22 2019-06-18 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
EP3943135A3 (en) 2014-10-14 2022-06-29 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
EP3556411B1 (en) 2015-02-17 2021-06-30 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
JP7309363B2 (ja) 2016-05-13 2023-07-18 アムジエン・インコーポレーテツド バイアル・スリーブ組立体
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
AU2017267047B2 (en) 2016-05-20 2023-11-09 Octapharma Ag Glycosylated VWF fusion proteins with improved pharmacokinetics
GB201609083D0 (en) 2016-05-24 2016-07-06 Syntab Therapeutics Gmbh Synthetic compound
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
CA3049780A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
AU2018231107B2 (en) 2017-03-06 2023-04-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
WO2018164829A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
WO2018172219A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
EA037969B1 (ru) 2017-03-28 2021-06-17 Эмджен Инк. Система и способ сборки штока поршня и шприца
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MA49447A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc Réduction des impacts/chocs d'activation d'un dispositif
EP3641861A1 (en) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
MA50528A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Systèmes et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3706830A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
WO2019094138A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MA50904A (fr) 2017-11-16 2020-09-23 Amgen Inc Mécanisme d'insertion d'aiguille pour dispositif d'administration de médicament
CN111263651B (zh) 2017-11-16 2022-06-17 安进公司 具有停顿和终点检测的自动注射器
CN108219019B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种巯基化羟乙基淀粉及其修饰的纳米材料和制备方法
CN108403641B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种载药纳米材料及其制备方法
CN108503718B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用
US11191806B2 (en) * 2018-05-04 2021-12-07 Boris Farber Polymyxin-based pharmaceutical composition for treating infectious diseases
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
US20210369982A1 (en) 2018-07-24 2021-12-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
US20200101229A1 (en) 2018-10-02 2020-04-02 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
AR116607A1 (es) 2018-10-05 2021-05-26 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con indicador de dosis
EA202191038A1 (ru) 2018-10-15 2021-07-06 Эмджен Инк. Способ платформенной сборки для устройства доставки лекарственного средства
BR112021007016A2 (pt) 2018-10-15 2021-07-13 Amgen Inc. dispositivo de administração de fármaco tendo mecanismo de amortecimento
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
US20220031953A1 (en) 2018-11-01 2022-02-03 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN111157736A (zh) * 2018-11-08 2020-05-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法
EP3958934A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
JP2022545227A (ja) 2019-08-23 2022-10-26 アムジエン・インコーポレーテツド 構成可能な針シールド係合構成要素を備えた薬物送達デバイス及び関連方法
AU2022279223A1 (en) 2021-05-21 2023-10-19 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container

Family Cites Families (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (zh)
US3191291A (en) * 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
NL269801A (nl) * 1960-10-04 1964-03-10 Farbwerke Höchst Ag Werkwijze ter bereiding van in water onoplosbare kleurstoffen
DE2233977A1 (de) 1971-07-14 1973-02-01 Unilever Nv Verfahren zur herstellung oxydierter kohlenhydrate
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) * 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4061736A (en) * 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001200A (en) * 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001401A (en) * 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4053590A (en) * 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) * 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
EP0019403B1 (en) * 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
US4454161A (en) * 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
FI82266C (fi) 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
LU85582A1 (fr) 1983-10-11 1985-06-04 Fidia Spa Fractions d'acide hyaluronique ayant une activite pharmaceutique,procedes pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
DE3501616A1 (de) 1985-01-17 1986-07-17 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Verfahren zur herstellung von hydroxylamin-derivaten
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4863964A (en) 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US5217998A (en) * 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JP2594123B2 (ja) * 1987-09-12 1997-03-26 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
FR2630329B1 (fr) * 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) * 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
DE68925966T2 (de) * 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US6261800B1 (en) * 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE19975071I2 (de) 1989-06-16 2000-02-03 Fresenius Ag Hydroxyethylstaerke als Plasmaexpander Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
JP2838800B2 (ja) * 1989-09-02 1998-12-16 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
WO1991005867A1 (en) 1989-10-13 1991-05-02 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
JP2975632B2 (ja) 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) * 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
US6172208B1 (en) * 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
WO1994005332A2 (en) * 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
CA2110543A1 (en) 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
NO934477L (no) 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG hydrazon- og PEG oksim-bindingdannende reagenser og proteinderivater derav
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
EP0601417A3 (de) * 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
CA2131455C (en) 1993-03-16 1998-08-18 Diana Pliura Selective crosslinking of hemoglobin by oxidized, ring-opened saccharides
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
IL192290A0 (en) 1993-08-17 2008-12-29 Kirin Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
JPH07188291A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Hayashibara Biochem Lab Inc 蛋白質とその製造方法並びに用途
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6214331B1 (en) * 1995-06-06 2001-04-10 C. R. Bard, Inc. Process for the preparation of aqueous dispersions of particles of water-soluble polymers and the particles obtained
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5981507A (en) * 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5723589A (en) * 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
PT932399E (pt) * 1996-03-12 2006-05-31 Pg Txl Co Lp Pro-farmacos de paclitaxel hidrossoluveis
US5696152A (en) 1996-05-07 1997-12-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Taxol composition for use as organ preservation and cardioplegic agents
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE19628705A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) * 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) * 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
CA2299271C (en) * 1997-08-07 2009-02-03 University Of Utah Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US5847110A (en) * 1997-08-15 1998-12-08 Biomedical Frontiers, Inc. Method of reducing a schiff base
US6875594B2 (en) * 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
US6596135B1 (en) 1998-03-05 2003-07-22 Asahi Glass Company, Limited Sputtering target, transparent conductive film, and method for producing the same
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6153655A (en) * 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6261594B1 (en) * 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
EP1035137A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7279176B1 (en) 1999-09-02 2007-10-09 Rice University Nitric oxide-producing hydrogel materials
US20020065410A1 (en) * 1999-12-02 2002-05-30 Antrim Richard L. Branched starches and branched starch hydrolyzates
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) * 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2001294601A (ja) 2000-04-11 2001-10-23 Akita Prefecture 高度分岐澱粉と該高度分岐澱粉の製造方法
JP2002003398A (ja) 2000-04-17 2002-01-09 Ltt Institute Co Ltd 徐放製剤、その製造法及びワクチン
DE10023051B4 (de) * 2000-05-11 2004-02-19 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin, dessen Verwendung und Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin enthaltende diagnostische Zubereitung
FR2811967B1 (fr) 2000-07-24 2002-12-13 Cebal Tube muni d'une tete de fixation pour divers bouchages et les divers bouchages munis de moyens de fixation sur ledit tube
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
US6417347B1 (en) * 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
US7030218B2 (en) 2000-09-08 2006-04-18 Gryphon Therapeutics Pseudo native chemical ligation
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
WO2003035665A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-01 Noxxon Pharma Ag Modifizierte l-nukleinsäure
US6375846B1 (en) * 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
DE10207072A1 (de) * 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE10209821A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
JP4272537B2 (ja) 2002-03-13 2009-06-03 北京鍵▲凱▼科技有限公司 Ｙ型分鎖親水性ポリマー誘導体、それらの調製方法、前記誘導体および薬剤分子の結合生成物、ならびに前記結合生成物を含む医薬組成物
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
JP4583168B2 (ja) * 2002-06-03 2010-11-17 ザ インスティテュート フォー システムズ バイオロジー 糖タンパク質を定量的プロテオ−ム分析する方法
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
EP1591467A1 (en) 2002-09-09 2005-11-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
KR100974843B1 (ko) 2002-09-09 2010-08-11 넥타르 테라퓨틱스 수용성 중합체 알카날
ES2214166T1 (es) 2002-09-11 2004-09-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Polipeptidos has-ilados, especialmente, eriptropoyetina has-ilada.
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
BR0314227A (pt) * 2002-09-11 2005-10-25 Fresenius Kabi De Gmbh Derivados de amido de hidroxialquila
EP1549350B1 (en) * 2002-10-08 2008-09-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
SG145746A1 (en) 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
BRPI0412671A (pt) * 2003-08-08 2006-10-03 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de um polìmero e uma proteìna ligados por um grupo de ligação de oxima
RU2370281C2 (ru) 2003-08-08 2009-10-20 Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и g-csf
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
AU2005209303A1 (en) 2004-01-29 2005-08-11 Biosynexus, Inc. Use of amino-oxy functional groups in the preparation of vaccines conjugates
DE102004009783A1 (de) 2004-02-28 2005-09-15 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Hyperverzweigte Stärkefraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Konjugate mit pharmazeutischen Wirkstoffen
EP1725589A1 (en) 2004-03-11 2006-11-29 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
AR048918A1 (es) 2004-03-11 2006-06-14 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugados de almidon de hidroxietilo y eritropoyetina
JP5396019B2 (ja) * 2004-03-11 2014-01-22 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
WO2005112954A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 William Marsh Rice University Nitric oxide releasing compositions and associated methods
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
AU2006309212B2 (en) 2005-10-31 2011-09-15 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Polysaccharide-derived nitric oxide-releasing carbon-bound diazeniumdiolates
JP2009093397A (ja) 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
CA2739757C (en) 2008-10-07 2016-07-05 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. Hpma - docetaxel or gemcitabine conjugates and uses therefore

Also Published As

Publication number Publication date
DE60323192D1 (de) 2008-10-09
AR045235A1 (es) 2005-10-19
KR101045422B1 (ko) 2011-06-30
CA2496317A1 (en) 2004-03-25
CY1109813T1 (el) 2014-09-10
EP1398327A1 (en) 2004-03-17
ES2213506T3 (es) 2009-02-16
IL200150A0 (en) 2011-07-31
EP1398328B1 (en) 2009-11-18
RU2005110423A (ru) 2006-01-20
PL375037A1 (en) 2005-11-14
EP1398322A1 (en) 2004-03-17
EP1398328A1 (en) 2004-03-17
EP2316850A2 (en) 2011-05-04
DE03020425T1 (de) 2004-07-15
DE60304640D1 (de) 2006-05-24
ZA200600651B (en) 2007-04-25
AU2009238372A1 (en) 2009-12-17
US20120046240A9 (en) 2012-02-23
CN1681844A (zh) 2005-10-12
ES2213506T1 (es) 2004-09-01
BR0314107A (pt) 2005-07-19
WO2004024777A1 (en) 2004-03-25
US20110054152A1 (en) 2011-03-03
CA2496317C (en) 2014-02-18
EP2154160A1 (en) 2010-02-17
DE60304640T2 (de) 2007-05-16
ATE406387T1 (de) 2008-09-15
EP1398322B1 (en) 2006-04-19
MXPA05002593A (es) 2005-05-27
AR041097A1 (es) 2005-05-04
PT1398327E (pt) 2008-10-31
DK1398328T3 (da) 2010-03-08
HK1063475A1 (en) 2004-12-31
AU2003255406B2 (en) 2009-09-10
MXPA05002594A (es) 2005-05-27
US20100317609A1 (en) 2010-12-16
RU2329274C2 (ru) 2008-07-20
AU2011200158B2 (en) 2012-08-02
WO2004024761A1 (en) 2004-03-25
PL374490A1 (en) 2005-10-31
DE03020423T1 (de) 2004-07-15
JP5275293B2 (ja) 2013-08-28
CN100348618C (zh) 2007-11-14
PL217085B1 (pl) 2014-06-30
AU2011200219B2 (en) 2012-05-17
IL166506A0 (en) 2006-01-15
ATE449112T1 (de) 2009-12-15
AU2003260393A1 (en) 2004-04-30
EP1398327B1 (en) 2008-08-27
AU2003253399A1 (en) 2004-04-30
PL374969A1 (en) 2005-11-14
DE03020424T1 (de) 2004-07-15
BR0314227A (pt) 2005-10-25
EP2143736A1 (en) 2010-01-13
BR0314106A (pt) 2005-07-19
AU2003260393B2 (en) 2009-10-01
EP2143736B1 (en) 2012-11-07
AU2011200219A1 (en) 2011-02-10
JP5455821B2 (ja) 2014-03-26
RU2005110412A (ru) 2006-01-20
PL216545B1 (pl) 2014-04-30
ES2213507T3 (es) 2010-04-15
AU2009238372B2 (en) 2012-08-23
EP2272865A3 (en) 2014-06-18
CN1681846A (zh) 2005-10-12
SI1398327T1 (sl) 2009-02-28
US20050238723A1 (en) 2005-10-27
EP2017287A2 (en) 2009-01-21
AU2003253399B2 (en) 2010-10-14
IL166506A (en) 2010-02-17
JP2011089125A (ja) 2011-05-06
KR20050061466A (ko) 2005-06-22
US20060019877A1 (en) 2006-01-26
AU2011200158A1 (en) 2011-02-03
HK1136226A1 (en) 2010-06-25
KR101174510B1 (ko) 2012-08-16
IL166930A (en) 2012-08-30
AR045234A1 (es) 2005-10-19
KR20050072417A (ko) 2005-07-11
RU2328505C2 (ru) 2008-07-10
WO2004024777A8 (en) 2005-03-24
DK1398327T3 (da) 2008-11-10
EP2272865A2 (en) 2011-01-12
PT1398322E (pt) 2006-08-31
JP2010248528A (ja) 2010-11-04
MX2010006175A (es) 2010-07-05
DE20321836U1 (de) 2011-04-07
ES2213507T1 (es) 2004-09-01
HK1063477A1 (en) 2004-12-31
WO2004024776A1 (en) 2004-03-25
DE60330098D1 (de) 2009-12-31
AU2003255406A1 (en) 2004-04-30
IL166931A (en) 2012-06-28
RU2005110415A (ru) 2006-08-27
RU2326891C2 (ru) 2008-06-20
EP2316850A3 (en) 2011-11-09
ATE323723T1 (de) 2006-05-15
SI1398328T1 (sl) 2010-02-26
EP2017287A3 (en) 2009-11-04
HK1063478A1 (en) 2004-12-31
NO20051427L (no) 2005-05-31
CA2495242A1 (en) 2004-03-25
NO20051419L (no) 2005-05-30
PT1398328E (pt) 2010-02-19
US8618266B2 (en) 2013-12-31
MXPA05002591A (es) 2005-09-20
ES2213505T1 (es) 2004-09-01
KR20050075336A (ko) 2005-07-20
US20050234230A1 (en) 2005-10-20
ES2399006T3 (es) 2013-03-25
KR101045401B1 (ko) 2011-06-30
JP2010265464A (ja) 2010-11-25
US8475765B2 (en) 2013-07-02
JP2006516534A (ja) 2006-07-06
US7815893B2 (en) 2010-10-19
DK1398322T3 (da) 2006-08-21
ES2213505T3 (es) 2006-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1398322B1 (en) HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
JP4688494B2 (ja) ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法
EP1681303B1 (en) HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
TWI356065B (en) Method of producing hydroxyalkyl starch derivative