PT1398328E - Derivados de hidroxialquil amido - Google Patents

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PT1398328E PT03020425T PT03020425T PT1398328E PT 1398328 E PT1398328 E PT 1398328E PT 03020425 T PT03020425 T PT 03020425T PT 03020425 T PT03020425 T PT 03020425T PT 1398328 E PT1398328 E PT 1398328E
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Wolfram Eichner
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Description

1
DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE HIDROXIALQUIL AMIDO"
Descrição: A presente invenção refere-se a derivados de hidroxialquil amido, particularmente derivados de hidroxialquil amido, obtidos por um processo em que o hidroxialquil amido é feito reaqir com um qrupo amino primário ou secundário de um composto linker. De acordo com uma forma de realização especialmente preferida, a presente invenção refere-se a derivados de hidroxialquil amido, que podem ser obtidos segundo um processo de acordo com o qual o hidroxialquil amido é feito reagir com um grupo amino primário ou secundário de um composto linker e o produto da reacção resultante é feito reagir com um polipeptideo, de preferência com uma glicoproteína e especialmente preferido com eritropoietina, através de pelo menos um grupo reactivo do composto linker. Um hidroxialquil amido que é especialmente preferido é hidroxietil amido. De acordo com a presente invenção, o hidroxialquil amido e de preferência o hidroxietil amido é feito reagir com o composto linker no seu terminal redutor, que não é oxidado antes da reacção mencionada. 0 hidroxietil amido (HES) é um derivado de amilopectina natural e é degradado pela alfa-amilase no corpo. HES é um derivado substituído do polímero hidrato de carbono amilopectina, que está presente no amido de milho a uma concentração até 95 % em peso. HES exibe vantajosas propriedades biológicas e é utilizado como agente de substituição do volume sanguíneo e na terapia de 2 hemidiluição em clínicas (Sommermeyer et al., 1987,
Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; and Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498). A amilopectina consiste em fracções glucose, em que existem ligações alfa-1,4-glicosídicas na cadeia principal e nos locais de ramificação encontram-se ligações alfa-1,6-glicosídicas. As propriedades físico-químicas desta molécula são determinadas principalmente pelo tipo de ligações glicosídicas. Devido à ligação alfa-1,4- glicosídica cortada são produzidas estruturas helicoidais com cerca de seis monómeros de glucose por volta. As propriedades físico-químicas e bioquímicas do polímero podem ser modificadas por substituição. A introdução de um grupo hidroxietil pode ser alcançada por hidroxietilação alcalina. Adaptando as condições da reacção é possível explorar a diferente reactividade do grupo hidroxi respectivo no monómero de glucose não substituído, relativamente à hidroxietilação. Por este motivo, um especialista na técnica é capaz de influenciar o padrão de substituição até um dado limite.
Algumas formas de produzir um derivado de hidroxietil amido estão descritas na técnica. A DE 26 16 086 divulga a conjugação de hemoglobina em hidroxietil amido, em que, numa primeira fase, um agente de reticulação, por exemplo bromociano, é ligado a hidroxietil amido e depois a hemoglobina é ligada ao produto intermediário.
Uma importante área de utilização de HES é a estabilização de polipeptídeos que são aplicados, por exemplo no sistema circulatório, de forma a obter um efeito fisiológico 3 particular. Um exemplo específico destes polipeptídeos é a eritropoietina, uma glicoproteína ácida com aproximadamente 34.000 kD, que é essencial na regulação do nível de hemácias na circulação.
Um problema bem conhecido com a aplicação de polipeptídeos e enzimas consiste no facto de estas proteínas exibirem frequentemente uma estabilidade insatisfatória. Especialmente a eritropoietina possui uma semi-vida no plasma relativamente curta (Spivak and Hogans, 1989, Blood 73, 90; McMahon et al., 1990, Blood 76, 1718). Quer isto dizer que os níveis terapêuticos no plasma se perdem rapidamente e têm de ser efectuadas repetidas administrações intravenosas. Além disso, nalgumas circunstâncias observa-se uma resposta imunitária contra os peptídeos. É geralmente aceite que a estabilidade dos polipeptídeos pode ser melhorada e a resposta imunitária contra estes polipeptídeos é reduzida quando os polipeptídeos são acoplados a moléculas poliméricas. A WO 94/28024 divulga que polipeptídeos fisiologicamente activos, modificados com polietilenoglicol (PEG) exibem imunogenicidade e antigenicidade reduzida e circulam na corrente sanguínea por um tempo consideravelmente mais longo do que as proteínas não conjugadas, isto é, têm uma velocidade de depuração mais longa. No entanto, os conjugados PEG-fármaco exibem várias desvantagens, por exemplo, não exibem uma estrutura natural que pode ser reconhecida por elementos de vias de degradação in vivo. Por conseguinte, à parte dos conjugados com PEG, têm sido produzidos outros conjugados e polimerizados proteicos. Têm 4 sido descritos na literatura múltiplos métodos de reticulação de várias proteínas e macromoléculas, tal como polimerase {vide, por exemplo, Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, 1993, CRCS, Inc).
Os conjugados de HES-medicamento divulgados na técnica sofrem da desvantagem de o HES não ser conjugado para um sítio específico do fármaco. Consequentemente, a conjugação resulta num produto muito heterogéneo, com muitos componentes que podem ser inactivos devido à destruição da estrutura tridimensional durante a fase de conjugação. Por conseguinte, há falta de conjugados de HES-polipeptídeos mais aperfeiçoados, com estabilidade e/ou bioactividade melhorada.
Um método para a produção destes conjugados utiliza, como material de partida, uma forma oxidada de HES, que é feita reagir com um composto reticulante, em que o produto resultante é feito reagir com um polipeptídeo ou modificado mais profundamente e posteriormente feito reagir com um polipeptídeo. Uma grande desvantagem deste método consiste, numa primeira fase, em que o HES original tem de ser oxidado selectivamente, geralmente no seu terminal redutor, por meio da oxidação do grupo aldeído terminal e/ou grupo hemiacetal numa lactona, tornando assim o processo em geral mais difícil e caro. A WO 02/080979 A2 divulga compostos com um conjugado de um agente activo e um hidroxialquil amido, em que o agente activo e hidroxialquil amido ou são ligados directamente ou são ligados por um composto linker. No que se refere à ligação directa, a reacção do agente activo e hidroxialquil amido é efectuada num meio aquoso contendo pelo menos 10 % 5 em peso de água. Não são indicados exemplo dirigidos a um derivado de hidroxialquil amido, produzido por meio da reacção de hidroxialquil amido no seu terminal redutor com um composto reticulante, compreendendo a unidade estrutural -NH- num meio aquoso. Todos os exemplos são dirigidos para hidroxialquil amido, oxidado antes de qualquer reacção, dado que os conhecimentos específicos da WO 02/080979 A2 possuem as desvantagens mencionadas.
Thomas et al., Crit Care Med 2000, vol. 28, No. 3. Descreve a reacção do hidroxietil amido com dicloridrato de putrescina para reduzir a base de Schiff assim formada por meio de um complexo de borano/piridina e fazendo reagir o hidroxietil amido aminado obtido assim com isocianato fluorescente para obter um hidroxietil amido fluorescente. Thomas et al não descreve a utilização de um polipeptídeo nesta reacção, isto é, a reacção de hidroxietil amido com um composto linker e a reacção do produto obtido com um polipeptídeo não é divulgada em Thomas et al. A WO 03/074087 divulga a acoplagem de proteínas a um polissacárido modificado. Para ligar as funções SH e CHO, são divulgados BMPH, EMC A, KMUH, M2C2H, MPBH e PDPH como moléculas linkers específicas. A utilização de moléculas linkers, em particular o uso das moléculas linkers anteriormente mencionadas, não é divulgada em qualquer um dos exemplos da WO 03/074087.
Por conseguinte, é um objectivo da presente invenção proporcionar um método de produção de um derivado de hidroxialquil amido que permite a reacção de hidroxialquil amido no seu terminal redutor com um composto adequado, em que o terminal redutor do amido não é oxidado antes da reacção. 6
Um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um método de produção de um derivado de hidroxialquil amido, que permite a reacção de hidroxialquil amido no seu terminal redutor com um composto adequado, em que o terminal redutor do amino não é oxidado antes da reacção, sendo este método caracterizado ainda por se fazer reagir ainda o produto da reacção do hidroxialquil amido no seu terminal redutor com um composto adequado, com pelo menos um outro composto. É ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método tal como anteriormente descrito, em que pelo menos um outro composto é um polipeptideo, de preferência uma proteina, mais preferencialmente eritropoietina. É ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um derivado de hidroxialquil amido, que pode ser obtido pelo método anteriormente descrito, que compreende a reacção de hidroxialquil amido no seu terminal redutor com um composto adequado, em que o terminal redutor do amido não é oxidado antes da reacção.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um método de produção de um derivado de hidroxialquil amido compreendendo a reacção de hidroxialquil amido (HAS) da fórmula (I)
7 no seu terminal redutor, que não é oxidado antes da reacção mencionada, com um composto da fórmula (II) R'-NH-R" (II) em que Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou um grupo hidroxialquil de cadeia linear ou ramificada e em que R' ou R'' ou R' e R'' compreendem pelo menos um grupo funcional X capaz de ser feito reagir com pelo menos um outro composto antes ou após a reacção de (I) e (II) e em que o composto (II) é feito reagir pela ligação por ponte do grupo NH entre R' e R'' e o composto (I) no seu terminal redutor que não é oxidado e em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é feito reagir com um grupo funcional Y de um outro composto, através do pelo menos um grupo funcional X e pelo menos um outro composto é um polipeptídeo ou em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é feito reagir com um outro composto através de pelo menos um grupo funcional X e pelo menos um outro composto é um composto reticulante e o produto da reacção com o composto reticulante é feito reagir com um grupo funcional Y de um outro segundo composto e o outro segundo composto é um polipeptídeo.
Desde que o produto da reacção do composto (I) e compostos (II) seja feito reagir com um grupo funcional Y de um outro composto através de pelo menos um grupo funcional X e o pelo menos outro composto seja um polipeptídeo, o composto da fórmula (II) não é BMF (hidrazida do N- (ácido beta-maleimidopropiónico) TFA) ; EMCA (hidrazida do N-(ácido epsilon-maleimido-capróico)), KMUH (hidrazida do N-(ácido kappa-maleimidoundecanóico)), M2C2H (4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxil-hidrazida HC1), MPBH (hidrazida do ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico HC1) , PDF (3-(2-piridil-ditio)-propionil-hidrazida).
No contexto da presente invenção, o termo "hidroxialquil amido" (HAS) refere-se a um derivado de amido que foi substituído por pelo menos um grupo hidroxialquilo. Por conseguinte, o termo hidroxialquil amido, tal como utilizado na presente invenção, não está limitado aos compostos em que a fracção hidrato de carbono terminal inclui grupos hidroxialquilo Ri, R2 e/ou R3, como descrito, para abreviar, na fórmula (I) , mas refere-se também aos compostos em que pelo menos um grupo hidroxi presente onde quer que seja, tanto no hidrato de carbono terminal e/ou no restante da molécula de amido, HAS', é substituído por um grupo hidroxialquilo Ri, R2 ou R3.
Neste contexto, o grupo alquilo pode ser um grupo alquilo e cadeia linear ou ramificada, que pode ser adequadamente substituído. Preferencialmente, o grupo hidroxialquilo contém 1 a 10 átomos de carbono, de preferência 1 a 6 átomos de carbono, mais preferencialmente 4 átomos de carbono e ainda mais preferencialmente 2-4 átomos de carbono. Por conseguinte "hidroxialquil amido" inclui de preferência hidroxietil amido, hidroxipropil amido e hidroxibutil amido, em que hidroxietil amido e hidroxipropil amido são particularmente preferidos. É também possível hidroxialquil amido compreendendo dois ou mais grupos hidroxialquil diferentes. 0 pelo menos um grupo hidroxialquil compreendido em HAS possui dois ou mais grupos hidroxilo. De acordo com uma forma de forma de realização preferida, o pelo menos um 9 grupo hidroxialquil compreendido em HAS contém um grupo hidroxilo. A expressão "hidroxialquil amido" inclui também derivados em que o grupo alquilo é monossubstituido ou polissubstituido. Neste contexto é preferido que o grupo alquilo seja substituído por um halogénio, em especial flúor ou por um grupo arilo, desde que o HAS permaneça solúvel em água. Além disso, o grupo hidroxilo terminal do grupo hidroxialquil pode ser esterifiçado ou eterifiçado.
Além disso, em vez de alquilo, podem também ser utilizados grupos alceno de cadeia linear ou ramificada, substituídos ou não substituídos. 0 hidroxialquil amido é um derivado éter do amido. Para além dos derivados éter mencionados, podem também ser utilizados outros derivados do amido no contexto da presente invenção. Por exemplo, os derivados úteis são os que compreendem grupos hidroxilo esterifiçados. Estes derivados podem ser, por exemplo, derivados de ácidos monocarboxílicos ou dicarboxílicos não substituídos, com 2-12 átomos de carbono ou dos respectivos derivados substituídos. São especialmente úteis os derivados de ácidos monocarboxílicos não substituídos, com 2-6 átomos de carbono, especialmente derivados de ácido acético. Neste contexto, amido acetilo, amido butilo e amido propilo são preferidos.
Além disso, os derivados de ácidos dicarboxílicos não substituídos, com 2-6 átomos de carbono são preferidos.
No caso de derivados de ácido dicarboxílico é útil que o segundo grupo carboxilo do ácido dicarboxílico seja também esterifiçado. Além disso, os derivados de ésteres 10 monoalquílicos dos ácidos dicarboxílicos são também adequados no contexto da presente invenção.
Para os ácidos monocarboxilicos ou dicarboxilicos substituídos, os grupos de substituintes podem ser preferencialmente iguais aos mencionados anteriormente para resíduos alquilo substituídos.
As técnicas para a esterificação do amido são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, em especial o capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9). O hidroxietil amido (HES) é o mais preferido para todas as concretizações da presente invenção.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que o hidroxialquil amido é hidroxietil amido. HES é caracterizado principalmente pelo peso molecular, distribuição e grau de substituição. Existem duas possibilidades de descrever o grau de substituição: 1. O grau de substituição pode ser descrito relativamente à porção de monómeros de glucose substituídos, relativamente à totalidade das fracções de glucose (DS) . 2. O grau de substituição pode ser descrito como "substituição molar" (MS), em que o número de grupos hidroxietil por fracção de glucose está descrito.
As soluções HES estão presentes como composições polidispersas, em que cada molécula difere da outra no que respeita ao grau de polimerização, número e padrão de pontos de ramificação e padrão de substituição. Por 11 conseguinte, HES é uma mistura de compostos com diferente peso molecular. Consequentemente, uma solução HES particular é determinada pelo peso molecular médio com a ajuda de meios estatísticos. Neste contexto, Mn é calculado como a média aritmética dependendo do número de molécula. Em alternativa, Mw, a média de peso, representa uma unidade que depende da massa de HES.
No contexto da presente invenção, hidroxietil amido pode ter um peso molecular médio (média em peso) entre 1 e 300 kDa, em que o peso molecular médio entre 5 e 100 kDa é o mais preferido. Hidroxietil amido pode ainda exibir um grau molar de substituição entre 0,1 e 0,8 e uma proporção entre C2:C6 entre 2 e 6, relativamente aos grupos hidroxietil.
No que se refere aos resíduos Ri, R2 e R3 de acordo com a fórmula (I), não existem limitações específicas dado qeu o composto (I) permanece capaz de reagir com um composto de acordo com a fórmula (II) . De acordo com uma forma de realização preferida, Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou um grupo hidroxialquilo, um grupo hidroxiarilo, um grupo hidroxiaralquilo ou um grupo hidroxialcarilo com 1 a 10 átomos de carbono. O hidrogénio e grupos hidroxialquilo com entre 1 a 6 átomos de carbono são preferidos. O grupo alquilo, arilo, aralquilo e/ou alcarilo pode ser linear ou ramificado e adequadamente substituído.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou um grupo hidroxialquilo de cadeia linear ou ramificada, com entre 1 a 6 átomos de carbono. 12
Assim, Ri, R2 e R3 pode ser hidroxi-hexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo tal como 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 1-hidroxiisopropilo, 2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo tal como 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo ou hidroximetilo. Hidrogénio e grupos hidroxietilo são preferidos, são especialmente preferidos hidrogénio e o grupo 2-hidroxietilo.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou um grupo 2-hidroxietilo.
De acordo com a presente invenção, hidroxialquil amido é feito reagir com um composto da fórmula (II), em que o composto (II) pode ser feito reagir com outro composto antes da reacção com o composto (I) , para se obter um derivado de hidroxialquil amido. Quanto ao composto (II), não existem limitações especificas se o composto (II) é capaz de reagir pelo grupo NH que liga R' e R'' ao composto (I) no seu terminal redutor, que não é oxidado, para se obter um derivado de hidroxialquil amido.
Os residuos preferidos R' do composto (II) são hidrogénio e residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo ou cicloalquilarilo, podendo os resíduos cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo ou cicloalquilarilo ser ligados directamente ao grupo NH que liga R' e R'' do composto (II) ou, de acordo com outra forma de realização, pode ser ligado por uma ponte de oxigénio ao grupo NH que liga R' e R'' do composto (II) . Os resíduos alquilo, arilo, aralquilo ou alcarilo podem ser adequadamente substituídos. Como substituintes 13 preferidos podem ser apontados F, Cl ou Br. Os resíduos especialmente preferidos R' são hidrogénio, grupos alquilo e alcoxilo e ainda mais preferidos são hidrogénio e grupos alquilo e alcoxilo não substituídos.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que R' é hidrogénio ou um grupo alquilo ou alcoxilo de cadeia linear ou ramificada.
Entre os grupos alquilo e alcoxilo, são preferidos os grupos com 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 átomos de carbono. São mais preferidos os grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi e isopropoxi. São especialmente preferidos metilo, etilo, metoxi, etoxi dá-se especial preferência ao metilo ou metoxi.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que R' é hidrogénio ou um grupo metilo ou metoxi. À parte do grupo funcional X, R'' pode incluir pelo menos um grupo funcional adicional W. Este pelo menos um grupo funcional adicional W pode encontrar-se normalmente em qualquer parte de R'' . De preferência, W está directamente ligado ao grupo NH a que está ligado R'.
Em geral, não existem limitações específicas no que se refere ao grupo funcional. W dado que o composto (I) e'capaz de reagir com o composto (II). Em concretizações preferidas, o grupo funcional W inclui a unidade estrutural -NH- e/ou a unidade estrutural -(C=G)-, em que G é 0 ou S e/ou a unidade estrutural -S02-. De acordo com concretizações mais preferidas, o grupo funcional W é seleccionado do grupo constituído por 14
e
Τ
G
em que, se G estiver presente duas vezes é independentemente 0 ou S.
De acordo com concretizações preferidas da presente invenção, onde R' for H e w estiver ligado directamente ao grupo NH ligando R' e R'' e o grupo NH ligando R' e R'' formam, em conjunto com W, um dos seguintes grupos:
O Η H H
G
Na medida em que pelo menos um grupo funcional W, que é incluido em R' e/ou R'', de preferência em R'', não existe qualquer limitação especifica. Em geral, todos os grupos funcionais são possíveis, o que permite a reacção com pelo menos um outro composto.
No que se refere a esta reacção com um composto adicional, são possíveis todos os tipos de interacções de pelo menos um grupo funcional com o pelo menos um composto adicional. Entre outras, são possíveis as reacções do pelo menos um grupo funcional X com um composto adicional que conduzem a 15 uma ligação covalente, uma ligação iónica e/ou uma ligação de van-der-Waals, sendo especialmente preferida a ligação covalente.
Entre outros, são citados os grupos funcionais X seguinte:
Ligações duplas C-C- ou ligações triplas C-C- ou ligações C-C- aromáticas; 0 grupo tio ou os grupos hidroxilo;
Hidrazida de ácido alquilsulfónico, hidrazida de ácido arilsulfónico; 1.2- dióis; 1.2- aminoálcoois: 0 grupo amino -NH2 ou derivados dos grupos amino com a unidade estrutural -NH-, tal como grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupo aminoaralquilo ou grupos alcarilamino; 0 grupo hidroxilamino -0-NH2 ou derivados dos grupos hidroxilamino com a unidade estrutural -O-NH-, tal como grupos hidroxilalquilamino, grupo hidroxilarilamino, grupo hidroxilaralquilamino ou grupos hidroxilalcarilamino; grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino ou grupos alcariloxiamino, compreendendo cada a unidade estrutural -NH-0-;
Resíduos com um grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, em que G é 0 ou S e M é por exemplo, -OH ou -SH; um grupo alcoxi, um grupo ariloxi, um grupo aralquiloxi ou um grupo alcariloxi; 16 um grupo alquiltio, um grupo ariltio, um grupo aralquiltio ou um grupo alcariltio; um grupo alquilcarboniloxi, um grupo arilcarboniloxi, um grupo aralquilcarboniloxi, um grupo alcarilcarboniloxi: Ésteres activados, tais como ésteres de hidroxilaminas com estrutura imida, tal como N-hidroxisuccinimida, ou com uma unidade estrutural 0-N, em que N é parte de um composto heteroarilo ou, com G = 0 e Q ausente, tal como compostos ariloxi com um resíduo arilo substituído, tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo ou triclorofenilo; em que Q está ausente ou NH ou um heteroátomo tal como S ou 0 -NH-NH2, ou -NH-NH-; -N02; o grupo nitrilo; grupos carbonilo, tal como o grupo aldeído ou o grupo ceto; o grupo carboxilo; o grupo -N=C=0 ou o grupo -N=C=S; grupos haleto de vinilo, tal como o grupo iodeto de vinilo ou brometo de vinilo ou triflato de vinilo; -C=C-H; -(C=NH2Cl)-0 alquilo grupos -(C=0)-CH2-Hal em que Hal é Cl, Br ou I; -CH=CH-S02-; um grupo dissulfureto com a estrutura -S-S-; 17
o grupo ο ο grupo
Entre estes grupos, são especialmente preferidos o grupo tio, o grupo amino, o grupo hidroxilamino, o grupo alcoxiamino e os seguintes grupos:
HA
O li -s:
II 0
G **Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que o pelo menos um grupo funcional X é seleccionado do grupo constituído por -SH, - NH2, -0-NH2, -NH-O-alquil, -(C=G)-NH-NH2, -G-(C=G)-NH-NH2, -NH-(C=G)-NH-NH2 e -S02 -NH-NH2, em que G e'0 ou Se, se G estiver presente duas vezes, é independentemente 0 ou S.
No que se refere aos grupos alcoxiamino, dá-se particular preferência ao grupo propoxiamino, o grupo etoxiamino e o grupo metoxiamino, sendo especialmente preferido o grupo metoxiamino -NH-0-CH3.
De acordo com mais um aspecto da presente invenção, o pelo menos um grupo funcional X pode ser um grupo que não é capaz de reagir directamente com um dado outro composto, 18 mas que pode ser quimicamente modificado de modo a ser capaz de reagir da forma desejada. Esta modificação do grupo funcional X compreendida no composto (II) pode ser efectuada tanto antes da reacção do composto (II) com o composto (I) ou depois da reacção do composto (II) com o composto (I). Se o composto (II) compreende pelo menos dois grupos funcionais X, opcionalmente quimicamente diferentes, é possível modificar pelo menos um grupo funcional X antes da reacção do composto (II) com o composto (I) e pelo menos um grupo funcional X depois da reacção do composto (II) com o composto (I).
Como exemplo de um grupo funcional X que será modificado antes da reacção com um outro composto, pode-se indicar um 1,2-aminoálcool ou um 1,2-diol que será modificado, por exemplo por meio de oxidação para formar um aldeído ou um grupo ceto.
Outro exemplo de um grupo funcional X que será modificado antes da reacção com um outro composto é um grupo -NH2, que é modificado pela reacção com, por exemplo um composto de acordo com a seguinte fórmula
para se obter a estrutura da seguinte fórmula ,0 19 ,0 19 Ο
Ν
I Η que é por exemplo reactiva em relação ao grupo tio.
Outro exemplo de um grupo funcional X que será modificado antes da reacção com um outro composto é um grupo -NH2, que é modificado pela reacção com, por exemplo um composto de acordo com a seguinte fórmula 0
0 para se obter a estrutura da seguinte fórmula
O que é, por exemplo, reactiva em relação ao grupo tio. 0 pelo menos um grupo funcional X pode ser ligado directamente ao grupo NH ligando R' e R'' . Assim, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, o grupo funcional X é equivalente a R'' . Exemplos específicos dos compostos em que X está ligado directamente ao grupo NH ligando R' e R'' são, entre outros, H2N-NH2 ou 20
Η H ou Η H
Outro exemplo específico de um composto destes, também incluído na presente invenção, é NH3.
De acordo com outra forma de realização da presente invenção, o grupo NH ligando R' e R'' pode ser separado do pelo menos um grupo funcional X por um grupo alquilo ou cicloalquilo ou arilo ou aralquilo ou arilcicloalquilo ou aralquilo ou cicloalquilarilo, de cadeia linear ou ramificada, em que estes grupos podem incluir pelo menos um heteroátomo, tal como N, O, S e em que estes grupos podem ser adequadamente substituídos. A dimensão do grupo que separa NH, ligando R' e R'' e o pelo menos um grupo funcional X pode ser adaptada às necessidades específicas. Geralmente, o grupo separador tem, normalmente, de 1 a 60, de preferência 1 a 40, mais preferencialmente entre 1 e 20, mais preferencialmente entre 1 e 10, mais preferencialmente 1 a 6 e com especial preferência 1 a 4 átomos de carbono. Se estiverem presentes heteroátomos, o grupo separador compreende geralmente 1 a 20, de preferência 1 a 8 e com especial preferência de 1 a 4 heteroátomos. De acordo com concretizações particularmente preferidas da presente invenção, o grupo separador compreende 1 a 4 átomos de oxigénio. O grupo separador pode incluir uma cadeia alquilo opcionalmente ramificada ou um grupo arilo ou um grupo cicloalquilo com, por exemplo, entre 5 e 7 átomos de carbono ou ser um grupo aralquilo, um grupo aralquilo em que a parte alquilo pode ser um grupo alquilo linear e/ou cíclico. De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, o grupo separador é uma cadeia alquilo com entre 21 1 e 20, de preferência 1 e 8, mais preferencialmente entre 1 e 6, mais preferencialmente entre 1 e 4 e com especial preferência entre 2 e 4 átomos de carbono. No caso de estarem presentes heteroátomos, é particularmente preferida uma cadeia com 1 a 4 átomos de oxigénio.
Exemplos específicos dos compostos (II) em que X está separado do grupo NH ligando R' e R'' são, entre outros,
NH, OH h,n--^coch ΛΝ 22
η2νο.
OH νη2
η5ν ..2 \ ,0
η2ν ΟΗ
Η$'^\Χ'Χ0ΝΗ2 2 23ΗΛ Ν Η
Η Η
kó< Η8/νγΝνΝΗ2 Ο Ο grupo que separa ΝΗ, ligando R' e R'' e o pelo menos um grupo funcional X pode ser adequadamente substituído. Os substituintes preferidos são, por exemplo, halogenetos tais como F, Cl, Br ou I.
Os grupos que separam NH, ligando R' e R'' e o pelo menos um grupo funcional X pode podem incluir um ou mais do que um locais de clivagem tal como. -s-s-
24HO
OH
Y o \
que permitem uma fácil clivagem de um composto resultante num local pré-determinado.
De acordo com uma forma de realização especialmente preferido da presente invenção, o composto (II) é 0-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina
ou carbo-hidrazida
. O
Η,Ν^ A „NH2 2 N N 2 , Η H
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que o composto (II) é 0-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina ou carbo-hidrazida.
No caso do composto (II) compreender um ou mais do que um centro quiral, o composto (II) pode encontrar-se na conformação R ou na conformação S ou como composto racémico relativamente a cada centro quiral. A reacção do composto (I) com o composto (II) em si pode ser efectuada em pelo menos um solvente adequado. 0 solvente respectivo ou mistura de um ou mais solventes pode ser adaptado às necessidades especificas das condições de reacção e a natureza química dos compostos (I) e (II) . De acordo com uma forma de realização especialmente preferida 25 da presente invenção, é utilizada água como solvente, seja isoladamente ou em combinação com pelo menos um outro solvente. Pode-se apontar como o pelo menos outro solvente, DMSO, DMF, metanol e etanol. Os solventes preferidos diferentes de água são DMSO, DMF, metanol e etanol.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que a reacção do composto (I) com o composto (II) é efectuada num sistema aquoso. 0 termo "sistema aquoso", tal como utilizado no contexto da presente invenção, refere-se a um solvente ou mistura de solventes, compreendendo água entre pelo menos 10 % em peso, de preferência pelo menos 50 % em peso, mais preferencialmente pelo menos 80 % em peso, ainda mais preferencialmente pelo menos 90 % em peso ou até 100 % em peso, com base no peso dos solventes envolvidos. O meio de reacção preferido é água.
No que se refere às temperaturas aplicadas durante a reacção não existem limitações específicas, dado que a reacção tem como resultado o derivado de hidroxialquil amido desejado.
No caso do composto (I) reagir com o composto (II), sendo o composto (II) uma hidroxilamina ou uma hidrazida, a temperatura situa-se preferencialmente entre 5 e 45 °C, mais preferencialmente entre 10 e 30 °C e com especial preferência entre 15 e 25 °C.
No caso de o composto (I) reagir com o composto (II), sendo a reacção mencionada uma aminação redutiva, a temperatura é preferivelmente até 100 °C, mais preferencialmente entre 20 e 95 °C, mais preferencialmente entre 25 e 90 °C, mais 26 preferencialmente entre 70 e 90 °C e com especial preferência entre 75 e 85 °C.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que a reacção do composto (I) e o composto (II), sendo o composto (II) uma hidroxilamina ou uma hidrazida, é efectuada a uma temperatura entre 5 e 45 °C.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que a reacção do composto (I) e o composto (II), sendo a reacção mencionada uma aminação redutiva, é efectuada a uma temperatura entre 25 e 90 °C.
Durante a evolução da reacção a temperatura pode variar, de preferência dentro dos limites indicados anteriormente, ou manter-se constante. O tempo de reacção para a reacção do composto (I) com (II) pode ser adaptado às necessidades especificas e situa-se geralmente entre 1 h a 7 d.
No caso do composto (II), é uma hidroxilamina ou hidrazida, o tempo de reacção é preferencialmente entre 1 h a 3 d e mais preferencialmente entre 2 h a 48 h.
No caso da reacção do composto (I) e composto (II) ser uma aminação redutiva, o tempo de reacção é preferivelmente entre 2 h a 7 d. O valor de pH da reacção do composto (I) com (II) pode ser adaptado às necessidades especificas, tal como a natureza quimica dos reagentes. 27
No caso de o composto (II) ser uma hidroxilamina ou hidrazida, o valor do pH situa-se preferivelmente entre 4,5 e 6,5.
No caso da reacção do composto (I) e composto (II) ser uma aminação redutiva, o valor de NH é preferivelmente entre 8 e 12.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que a reacção do composto (I) e o composto (II), sendo o composto (II) uma hidroxilamina ou uma hidrazida, é efectuada a um valor de pH entre 4,5 e 6,5.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que a reacção do composto (I) e o composto (II), sendo a reacção mencionada uma aminação redutiva, é efectuada a um pH entre 8 e 12.
Exemplos específicos das condições de reacção anteriormente mencionadas são, por exemplo, uma temperatura de reacção a cerca de 25 °C e a um pH de cerca de 5,5 no caso de o composto ser uma hidroxilamina e uma temperatura de reacção de cerca de 80 °C e um pH de cerca de 11 no caso da reacção do composto (I) e composto (II) ser uma aminação redutiva. O valor de pH adequado da mistura reaccional pode ser ajustado adicionando pelo menos um tampão adequado. Entre os tampões preferidos podem-se apontar tampão de acetato de sódio, tampões de fosfato ou borato.
De acordo com uma forma de realização da presente invenção, o produto da reacção resultante da reacção do composto (I) com o composto (II) é feito reagir com pelo menos um outro composto através de pelo menos um grupo funcional X. 28
Se necessário, o pelo menos um grupo funcional X pode ser protegido com pelo menos um grupo de protecção adequado antes da reacção do composto (I) com o composto (II). Neste contexto, são possíveis todos os grupos de protecção concebíveis que impedem o composto protegido (II) de reagir com o composto (I) através de pelo menos um grupo funcional X. Portanto, o grupo de protecção pode ser escolhido conforme a natureza química do grupo funcional X a ser protegido de, por exemplo, o solvente em que a reacção é efectuada ou o pH da mistura reaccional. Os grupos de protecção preferidos são, entre outros, o grupo benziloxicarbonilo, o grupo terc-butoxicarbonilo, o grupo metoxifenilo, o grupo 2,4-dimetoxifenilo, grupos triarlimetilo, tritilo, o grupo monometoxitritilo, o grupo dimetoxitritilo, o grupo monometiltritilo, o grupo dimetiltritilo, o grupo trifluoracetilo, compostos ftalimina, compostos 2-(trialquilsilil)etoxi carbonilo, Fmoc, o grupo orto-butilo ou grupos trialquilsililo.
Se dois ou mais grupos funcionais X diferentes estiverem presentes no composto (II), pelo menos um grupo pode ser protegido enquanto pelo menos outro grupo pode ser deixado desprotegido.
Após a reacção do composto (I) com o composto (II), o pelo menos um grupo de protecção pode ser deixado no produto da reacção ou removido pelos métodos adequados, tal como métodos convencionais conhecidos do perito na especialidade. Se são protegidos dois grupos funcionais X diferentes com grupos de protecção adequados é possível remover pelo menos um grupo de protecção de forma a disponibilizar pelo menos um grupo funcional X para outra reacção com pelo menos um outro composto e deixar pelo 29 menos outro grupo funcional protegido até o produto da reacção do composto (I) com o composto (II) reagir com o outro composto. Seguidamente, o grupo de protecção do grupo funcional ainda protegido pode ser removido para disponibilizar o restante grupo funcional X com mas um outro composto. A utilização de pelo menos um grupo de protecção pode ser importante para impedir que a reacção tenha como resultado um derivado de hidroxialquil amido que consiste num composto (II) que reagiu com dois ou mais composto (I), isto é, um composto (II) substituído HAS múltiplo. Contudo, pode-se alcançar o mesmo resultado fazendo reagir o composto (I) com um excesso de composto (II) . Se é utilizada uma quantidade excedentária de composto (II) no processo da presente invenção, a proporção molar de composto (II) para composto (I) encontra-se preferivelmente entre 2 e 100.
Assim que o produto da reacção do composto (I) com composto (II) é formado, pode ser isolado da mistura reaccional por meio de pelo menos um método adequado. Se necessário, o produto da reacção pode ser precipitado antes do isolamento por pelo menos um método adequado.
Se o produto da reacção precipita primeiro, é possível, por exemplo pôr em contacto a mistura reaccional com pelo menos um solvente ou mistura de solventes, diferente do solvente ou mistura de solventes presente na mistura reaccional a temperaturas adequadas. De acordo com uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção, em que se utiliza água como solvente, a mistura reaccional é posta em contacto com uma mistura de etanol e acetona, de 30 preferência uma mistura de 1:1, indicando volumes iguais dos compostos mencionados, a uma temperatura, de preferência entre -20 a +50 °C e especialmente preferível entre 0 e 25 °C. O isolamento do produto da reacção pode ser efectuado por um processo adequado, que pode compreender uma ou mais do que uma fase. De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o produto da reacção é primeiro separado da mistura reaccional para a mistura da mistura reaccional com por exemplo, a mistura etanol-acetona, por meio de um método adequado, tal como centrifugação ou filtração. Numa segunda fase, o produto da reacção separado pode ser sujeito a um tratamento mais aprofundado, tal como um tratamento a posteriori como diálise, filtração por centrifugação ou filtração à pressão, cromatografia de permuta iónica, HPLC, MPLC, filtração com gel e/ou liofilizaçâo. De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, o produto da reacção separado é primeiro dialisado, de preferência contra água, e depois é liofilizado até o teor de solvente do produto da reacção ser suficientemente baixo, de acordo com as especificações do produto desejadas. A liofilizaçâo pode ser efectuada a uma temperatura entre 20 e 35 °C, de preferência entre 25 e 30 °C. O produto da reacção assim isolado do composto (I) e composto (II) é ainda feito reagir com pelo menos um outro composto através de pelo menos um grupo funcional X, incluído no produto da reacção mencionado.
Para esta reacção, um ou mais do que um solvente adequado pode ser utilizado e todos os parâmetros da reacção, tal 31 como a temperatura durante a reacção, tempo de reacção, as proporções dos reagentes ou o valor de pH da mistura reaccional podem ser adaptados às necessidades especificas.
De acordo com a primeira forma de realização da presente invenção, o pelo menos um composto capaz de formar uma ligação química com o pelo menos um grupo funcional X é um polipeptídeo ou uma mistura de pelo menos dois polipeptídeos diferentes.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que o produto da reacção do composto (I) e o composto (II) é feito reagir com um polipeptídeo através do grupo funcional X incluído no composto (II) .
De acordo com a segunda forma de realização da presente invenção, o pelo menos um outro composto capaz de formar uma ligação química com o pelo menos um grupo funcional X é um composto de reticulação que é capaz de formar uma primeira ligação química com o pelo menos um grupo funcional X do produto da reacção do composto (I) e composto (II) e uma segunda ligação química com um segundo outro composto, que é um polipeptídeo ou uma mistura de pelo menos dois polipeptídeos diferentes.
No contexto desta forma de realização da presente invenção, o produto da reacção do composto (I) e composto (II), o primeiro derivado de hidroxialquil amido, é feito reagir com o composto reticulante para produzir um segundo derivado de hidroxialquil amido. Este segundo derivado de hidroxialquil amido é depois feito reagir com o segundo outro composto, o polipeptídeo, para produzir um terceiro derivado de hidroxialquil amido. 32
Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um método tal como anteriormente descrito, em que o produto da reacção dos compostos (I) e (II) é feito reagir com um outro composto, composto esse que é um composto reticulante, através de reacção de um grupo funcional V, compreendido no composto reticulante e um grupo funcional X, compreendido no produto da reacção dos compostos (I) e (II) ·
De acordo com concretizações especialmente preferidas da presente invenção, os compostos reticulantes são utilizados para formar uma ponte quimica entre o produto da reacção dos compostos (I) e (II) e um outro segundo composto, em que o grupo funcional do outro segundo composto, que reage com o composto reticulante é um grupo -SH ou um grupo aldeído ou um grupo ceto e o grupo funcional do produto da reacção dos compostos (I) e (II) que reage com o composto reticulante é um grupo contendo a estrutura -NH-, particularmente preferido -NH2.
No contexto da presente invenção, o termo "composto reticulante" refere-se a compostos químicos que são capazes de formar uma ligação entre o produto da reacção dos compostos (I) e (II) e pelo menos um determinado segundo composto adicional. Conforme a natureza química do segundo composto adicional, o composto reticulante compreende pelo menos um grupo funcional V capaz de reagir com o grupo funcional X, incluído no produto da reacção dos compostos (I) e (II) e pelo menos um grupo funcional adicional, que é capaz de formar uma ligação quimica com o segundo composto adicional. Este pelo menos um grupo funcional adicional, incluído no composto reticulante, pode ser um grupo 33 funcional do tipo discutido anteriormente, relativamente ao grupo funcional X. 0 composto reticulante pode ser utilizado para aumentar o comprimento da ponte química geral entre o composto (I) e o segundo composto adicional, um polipeptídeo, e/ou para influenciar a natureza química do produto da reacção resultante, tanto com como sem o segundo composto adicional e/ou proporcionar a possibilidade de formar uma ligação entre vários segundos compostos adicionais e o produto da reacção do composto (I), (II) e o composto reticulante e/ou para modificar quimicamente o grupo funcional X, incluído no produto da reacção do composto (I) e (II) , de modo a tornar o produto da reacção mencionado capaz de reagir com um determinado composto adicional.
Assim, as concretizações da presente invenção discutidas anteriormente e que estão relacionadas com a modificação química do grupo funcional X, sendo um grupo -NH2, com um composto adicional, por exemplo 9 o
ou o.
.0 34 de modo a proporcionar a possibilidade da reacção com um grupo -SH incluído num segundo composto adicional, um polipeptídeo, são exemplos específicos de reacção do produto da reacção dos compostos (I) e (II) com um composto reticulante.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o grupo funcional V pode ser um grupo funcional do tipo discutido anteriormente como grupo X.
De acordo com outra forma de realização preferida, o grupo funcional X ou o grupo funcional V é um grupo tio e um grupo funcional V ou um grupo funcional X é preferencialmente seleccionado do grupo constituído por
em que Hal é Cl, Br ou I, de preferência Br ou I. de acordo com ainda outra forma de realização preferida, o grupo funcional X ou o grupo funcional V seleccionado do grupo constituído por um éster activado, tal como anteriormente descrito ou um grupo carboxilo, que é opcionalmente transformado num éster activado. Neste caso particular, o grupo funcional V ou o grupo funcional X, respectivamente, inclui a estrutura química -NH-.
Por conseguinte, o composto reticulante é um composto com pelo menos dois grupos funcionais, que são iguais ou diferentes. No caso de dois grupos funcionais, o composto reticulante pode ser homo-bifuncional ou hetero-bifuncional. Um composto reticulante homo-bifuncional, por 35 exemplo proporciona a possibilidade de formar uma ponte entre o produto da reacção dos compostos (I) com (II) e um segundo composto adicional, possuindo o produto da reacção e o composto adicional o mesmo tipo de grupos funcionais. Um composto reticulante hetero-bifuncional, por exemplo proporciona a possibilidade de formar uma ponte entre o produto da reacção dos compostos (I) com (II) e um segundo composto adicional, possuindo o produto da reacção e o composto adicional grupos funcionais que não são capazes de reagir entre si.
Os pelo menos dois grupos funcionais do composto reticulante podem ser ligados directamente entre si ou podem ser separados por um grupo alquilo ou cicloalquilo ou arilo ou aralquilo ou arilcicloalquilo ou alcarilo ou cicloalquilarilo, de cadeia linear ou ramificada, em que estes grupos podem incluir pelo menos um heteroátomo, tal como N, 0, S e em que estes grupos podem ser adequadamente substituídos. 0 comprimento do grupo que separa os pelo menos dois grupos funcionais do composto reticulante pode ser adaptado às necessidades específicas. Geralmente, o grupo separador tem, normalmente, de 1 a 60, de preferência 1 a 40, mais preferencialmente entre 1 e 20, mais preferencialmente entre 1 e 10, mais preferencialmente 5 a 10 átomos de carbono. Se estiverem presentes heteroátomos, o grupo separador compreende geralmente 1 a 20, de preferência 1 a 8 e com especial preferência de 1 a 4 heteroátomos. De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, o grupo separador é uma cadeia alquilo ou aralquilo com 1 a 20 átomos de carbono. Além disso, o composto reticulante pode ainda conter pelo menos um local 36 de clivagem, tal como anteriormente discutido relativamente ao composto (II).
Outros exemplos de compostos reticulantes que serão mencionados no contexto da presente invenção podem ser classificados, por exemplo de acordo com a lista seguinte:
Tipo de composto reticulante Grupo funcional capaz de reagir com um segundo composto adicional, de preferência um polipeptídeo. Grupo funcional V A Hidrazida (reactiva ao aldeído) Maleimido (reactivo ao SH) B Hidrazida (reactiva ao aldeído) Pidrididitio (reactivo ao SH) C Iodoalquilo (reactivo ao SH) reactivo a ne) Éster de N- succinimida (ami- D Bromoalquilo (reactivo ao SH) Éster de N-succinimida (reactivo a amina) E Maleimido (reactivo ao SH) Éster de N-succinimida (reactivo a amina) F Pidrididitio (reactivo ao SH) Éster de N-succinimida (reactivo a amina) G Vinilssulfona (reactivo ao SH) Éster de N-succinimida (reactivo a amina)
No quadro 1, no fim da presente descrição, são enumerados alguns dos exemplos preferidos de compostos reticulantes.
No caso de pelo menos um composto adicional, por exemplo o composto reticulante, compreender um ou mais do que um centro quiral, o pelo menos um composto adicional pode 37 encontrar-se na conformação R ou na conformação S ou como composto racémico relativamente a cada centro quiral. 0 termo "polipeptídeo" tal como utilizado no contexto da presente invenção, refere-se a compostos que incluem pelo menos 2 aminoácidos, que estão ligados através de uma ligação peptideo, isto é uma ligação com a estrutura -(C=0)-NH-. 0 polipeptídeo pode ser um composto que ocorre naturalmente ou um polipeptídeo que naõ ocorra naturalmente, compreendendo este último aminoácidos naturais e/ou pelo menos um aminoácido que não ocorra naturalmente. A cadeia principal do polipeptídeo, a cadeia de polipeptídeo, pode ser ainda substituída por pelo menos um substituinte adequado, possuindo assim pelo menos uma cadeia lateral. 0 pelo menos um grupo funcional pode ser parte da cadeia principal do polipeptídeo ou de pelo menos um substituinte da cadeia principal, sendo possíveis concretizações compreendendo pelo menos um grupo funcional que faz parte da cadeia principal do polipeptídeo e pelo menos um grupo funcional que faz parte do pelo menos um substituinte da cadeia principal do polipeptídeo.
No que se refere ao polipeptídeo, não existem restrições, dado que o polipeptídeo inclui pelo menos um grupo funcional Y. 0 grupo funcional Y pode ser ligado directamente à cadeia principal do polipeptídeo ou ser parte de uma cadeia lateral da cadeia principal. A cadeia lateral ou o grupo funcional Y ou ambos podem fazer parte de um polipeptídeo natural ou podem ser introduzidos num polipeptídeo natural ou num polipeptídeo que, pelo menos parcialmente, não ocorre naturalmente, antes da reacção com o grupo funcional X. 38
Além disso, o polipeptídeo pode ser, pelo menos parcialmente, de origem humana ou animal. Numa forma de realização preferida o polipeptídeo é de origem humana. 0 polipeptídeo pode ser uma citoquina, em especial eritropoietina, uma antitrombina (AT), tal como AT III, uam interleuquina, especialmente interleuquina-2, IFN-beta, IFN-alfa, G-CSF, interleuquina-6 e anticorpos terapêuticos.
De acordo com uma forma de realização preferida, o polipeptídeo é uma antitrombina (AT), de preferência AT III (Levy JH, Weisinger,A, Ziomek CA, Echelard Y, Recombinant Antithrombin: Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4 (2001) 405-416; Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, Hanson E, Bernasconi R, Higgins E, Manavalan P, Ziomek C, Meade H, McPherson J, Cole ES, Transgenically, Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671; Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM, Lubbers YTP, Pratt BM, Whittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons lethally challenged with Escherichia coli, Blood 95, 4 (2000) 1117-1123; Van Patten SM, Hanson EH, Bernasconi R, Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McPherson JM, Edmunds T, Oxidation of Methionine Residues in Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274, 15 (1999) 10268-10276 ).
De acordo com outra forma de realização preferida, o polipeptídeo é IFN-beta humano, em particular IFN-beta la (cf. Avonex®, REBIF®) e IFN-beta lb (cf. BETASERON®). 39
Um polipeptídeo preferido adicional é G-CSF humano (factor estimulante da colónia de granulócitos). Vide, por exemplo Nagata et al., The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor, EMBO J. 5: 575-581, 1986; Souza et al., Recombinant human, granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 232 (1986) 61-65; and Herman et al., Characterization, formulation, and stability of Neupogen® (Filgrastim), a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor, in: Formulation, characterization, and stability of protein drugs; Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Press, Nova Iorque, 1996,303-328.
Se for utilizada uma mistura de pelo menos dois polipeptideos diferentes, os pelo menos dois polipeptídeos podem diferir, por exemplo em massa molecular, número e/ou sequência de aminoácidos, diferentes graus de glicosilação, número e/ou natureza química dos substituintes ou o número de cadeias de polipeptídeos ligadas por ligações químicas adequadas, tal como pontes dissulfureto.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o produto da reacção do composto (I) e composto (II), opcionalmente feitos reagir ainda com um composto reticulante, é isolado, de preferência de acordo com pelo menos um dos processos anteriormente mencionados e depois é feito reagir com um polipeptídeo com pelo menos um grupo funcional Y, capaz de ser feito reagir com pelo menos um grupo funcional X do produto da reacção do composto (I) e composto (II), opcionalmente feito ainda reagir com um composto reticulante, para formar pelo menos uma ligação química. Os grupos funcionais Y de polipeptídeos, tal como proteínas são por exemplo, 40
SH -OH ou uma fracção hidrato de carbono que pode ser ligada ao polipeptideo por N-glicosilação ou O-glicosilação.
No contexto da presente invenção, o termo "fracção hidrato de carbono" refere-se a hidroxialdeidos ou hidroxicetonas, bem como modificações químicas destes (vide Rõmpp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Germany, 9a edição 1990, Volume 9, páginas 2281-2285 e literatura citada) . ALém disso, refere-se também aos derivados de fracções de hidrato de carbono naturais, como glucose, galactose, manose, ácido siálico e semelhantes. O termo inclui também fracções hidrato de carbono naturais, quimicamente oxidadas. A estrutura da fracção hidrato de carbono oxidada pode ser cíclica ou linear. A fracção hidrato de carbono pode ser directamente ligada à cadeia principal polipeptideo. De preferência, a fracção hidrato de carbono faz parte de uma cadeia lateral hidrato de carbono. Mais preferencialmente, a fracção hidrato de carbono é a fracção terminal da cadeia lateral hidrato de carbono. 41
Numa forma de realização ainda mais preferida, a fracção hidrato de carbono é um resíduo galactose da cadeia lateral hidrato de carbono, de preferência o resíduo galactose terminal da cadeia lateral hidrato de carbono. Este resíduo galactose pode ser disponibilizado para reacção com o produto da reacção do composto (I) e composto (II) por meio de remoção dos ácidos siálicos terminais, seguida de oxidação como se descreve de seguida.
Numa forma de realização ainda mais preferida, o produto da reacção do composto (I) e (II) está ligada a um resíduo ácido siálico das cadeias laterais hidrato de carbono, de preferência o resíduo ácido siálico terminal da cadeia lateral hidrato de carbono. A oxidação das fracções hidrato de carbono terminais pode ser efectuada quimicamente ou enzimaticamente.
Os métodos para a oxidação química das fracções hidrato de carbono de polipeptídeos são conhecidos na técnica e incluem o tratamento com periodato (Chamow et al., 1992 J. Biol. Chem., 267, 15916-15922).
Por meio de oxidação química é, em princípio, possível oxidar qualquer fracção hidrato de carbono, quer esteja em posição terminal ou não. No entanto, ao eleger condições fracas (1 mM de periodato, 0 °C) em contraste com condições agressivas (10 mM de periodato 1 h à temperatura ambiente) é possível oxidar de preferência o ácido siálico terminal de uma cadeia lateral hidrato de carbono.
Em alternativa, a fracção hidrato de carbono pode ser oxidada enzimaticamente. As enzimas para a oxidação das fracções hidrato de carbono individuais são conhecidas na técnica, por exemplo no caso da galactose a enzima é 42 galactose oxidase. Caso se pretenda oxidar as fracções galactose terminais, será eventualmente necessário remover os ácidos siálicos terminais (parcialmente ou integralmente) se o polipeptideo foi produzido em células capazes de ligar ácidos siálicos a cadeias de hidrato de carbono, por exemplo em células de mamífero ou em células geneticamente modificada para serem capazes de ligar ácidos siálicos a cadeias de hidratos de carbono. Os métodos químicos ou enzimáticos para a remoção dos ácidos siálicos são conhecidos na técnica (Chaplin e Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, especialmente capítulo 5 Montreuill, Glycoproteins, páginas 175-177; IRL Press Practical approach série (ISBN 0-947946-44-3 )).
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é feito reagir com o polipeptideo através de uma fracçâo hidrato de carbono oxidada, contida no polipeptideo.
De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, o grupo funcional do polipeptideo é o grupo tio. Por conseguinte, o produto da reacção (I) e (II) pode ser ligado ao polipeptideo através de um grupo tioéter, em que o átomo S pode ser derivado a partir de qualquer grupo tio contido no polipeptideo. O grupo tio pode encontrar-se no polipeptideo em si mesmo. Além disso é possível introduzir um grupo tio no polipeptideo de acordo com um método adequado. Podem-se citar, entre outros, métodos químicos. Se estiver presente uma ponte dissulfureto no polipeptideo é possível reduzir a estrutura -S-S- para obter um grupo tio. É também possível 43 transformar um grupo amino presente no polipeptídeo num grupo SH por meio de reacção do polipeptídeo através do grupo amino com um composto com pelo menos dois grupos funcionais diferentes, um dos quais é capaz de ser feito reagir com o grupo amino e o outro é um grupo SH ou um precursor de um grupo SH. Esta modificação de um grupo amino pode ser encarada como um exemplo em que a proteína reage primeiro com um composto (L), que tem pelo menos dois grupos funcionais diferentes, um dos quais é capaz de reagir com o grupo amino e o outro é um grupo SH e o produto da reacção resultante reage depois com, por exemplo, um derivado HAS compreendendo HAS e um composto (D) , compreendendo o derivado mencionado um grupo funcional capaz de reagir com o grupo SH. É também possível introduzir um grupo SH por mutação do polipeptídeo, tal como por meio da introdução de uma cisteína ou um aminoácido funcional SH adequado no polipeptídeo ou removendo uma cisteína do polipeptídeo de forma a impedir que outra cisteína no polipeptídeo forme uma ponte dissulfureto.
No contexto destas concretizações é particularmente preferido fazer reagir o polipeptídeo com um produto da reacção, resultante da reacção do produto da reacção dos compostos (I) e (II) com um composto reticulante.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é feito reagir com um composto reticulante e o produto da reacção resultante é feito ainda reagir com o polipeptídeo através de uma fracção hidrato de carbono oxidada e/ou grupo tio contido no polipeptídeo. 44 A eritropoietina (EPO) é utilizada como um polipeptídeo especialmente preferido.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como anteriormente descrito, em que o polipeptídeo é eritropoietina. A EPO pode ser de qualquer fonte humana (vide Inoue, Wada, Takeuchi. 1994, An improved method for the purification of human erythropoietin with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol. Pharm. Buli. 17(2), 180-4; Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythropoietin., J. Biol. Chem., 252(15), 5558-64) ou outro mamífero e pode ser obtida por purificação a partir de fontes naturais, como rim humano, fígado humano embriónico ou rim animal, de preferência de macaco. Além disso, a expressão "eritropoietina" ou "EPO" engloba ainda uma EPO variante, em que um ou mais do que um aminoácido (por exemplo, 1 a 25, de preferência 1 a 10, mais preferido 1 a 5, o mais preferido 1 ou 2) foram trocados por outro aminoácido e que exibe actividade eritropoética (vide, por exemplo, EP 640 619 Bl) . A medição da actividade eritropoética é descrita na técnica (para medição da actividade in vitro vide, por exemplo, Fibi et al., 1991, Blood, 77, 1203 ff; Kitamura et al, 1989, J. Cell Phys., 140, 323-334; para medição da actividade EPO in vivo vide Ph. Eur. 2001, 911-917; Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata, 780- 785; European Pharmacopoeia (1996/2000); European Pharmacopoeia, 1996, Erythropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa., 8, 371-377; Fibi,
Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl., 1995, N- and 0- glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85(5), 1229-36; (EPO e 45 formas modificadas de EPO foram injectadas em ratinhos NMRI fêmeas (quantidades iguais de proteína 50 ng/ratinho) no dia 1, 2 e 3 foram recolhidas amostras de sangue no dia 4 e determinaram-se os reticulócitos)). Outras publicações em que são descritos os ensaios de medição da actividade de EPO são Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4), 515-22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythropoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(1), 151-5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin, Biochemistry, 31(41), 9871-6; Higuchi, Oheda, Kuboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992;Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol. Chem., 267(11), 7703-9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties, J. Biol. Chem.; 266(30), 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85(20), 7819-22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythropoietin, Nephron., 51(1), 11-4 (German ); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinary erythropoietin on controlled- 46 pore glass and silicic acid, Exp. Hematol., 13(3), 833 — 7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoietic simulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol., 11 (1), 18-31.
De preferência, a EPO é produzida por recombinação. Este processo inclui a produção em células eucariotas ou procariotas, de preferência células de mamífero, de insecto, levedura, bactérias ou qualquer outro tipo de células que for conveniente para a produção recombinante da EPO. Além disso, a EPO pode ser expressa em animais transgénicos (por exemplo, em fluidos corporais como leite, sangue, etc.) nos ovos de aves transgénicas, em especial aves de capoeira, de preferência galináceos ou em plantas transgénicas. A produção recombinante de um polipeptídeo é conhecida na técnica. Em geral, inclui-se assim a transfecção de células hospedeiras com um vector de expressão adequado, a cultura de células hospedeiras em condições que permitem a produção do polipeptídeo e a purificação do polipeptídeo das células hospedeiras. Para informações pormenorizadas consultar, por exemplo, Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 BI e EP 668 351 BI.
Numa forma de realização preferida, a EPO tem a sequência de aminoácidos da EPO humana (vide EP 148605 B2) . 47 A EPO pode incluir uma ou mais do que uma cadeias laterais de hidratos de carbono, de preferência 1 a 12, mais preferivelmente 1 a 9, ainda mais preferivelmente 1 a 6 e particularmente 1 a 4, é especialmente preferível 4 cadeias laterais de hidratos de carbono ligadas à EPO por glicosilação ligada por N e/ou ligada por 0, isto é a EPO é glicosilada. Normalmente, quando é produzida EPO em célula eucariotas, o polipeptídeo é glicosilado de forma pós-traducional. Consequentemente, as cadeias laterais de hidrato de carbono podem ter sido ligadas ao EPO durante a biossíntese em células de mamífero, especialmente de humano, insecto ou levedura. A estrutura e propriedades da EPO glicosilada têm sido extensivamente estudadas na técnica (vide EP 428 267 Bl; EP 640 619 Bl; Rush, Derby, Smith, Merry, Rogers, Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure, Anal Chem., 67(8), 1442-52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins, Glycobiology, 1 (4), 337-46 (artigo).
Por conseguinte, o derivado de hidroxialquil amido de acordo com a presente invenção pode incluir pelo menos um, preferencialmente 1 a 12, mais preferencialmente 1 a 9, ainda mais preferencialmente 1 a 6 e particularmente preferível 1 a 4 moléculas HAS por molécula EPO. 0 número de moléculas HAS por molécula EPO pode ser determinado por análise quantitativa da composição de hidratos de carbono, utilizando GC-MS após hidrólise do produto e derivatização dos monossacáridos resultantes (vide Chaplin and Kennedy (eds.), 1986, Carbohydrate Analysis: a practical approach, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3), 48 especially Chapter 1, Monosaccharides, páginas 1-36; capítulo 2, Oligosaccharides, página 37-53, capítulo 3, Neutral Polysaccharides, página 55-96).
De acordo com uma forma de realização especialmente preferida da presente invenção, a fracção hidrato de carbono ligada à EPO faz parte de uma cadeia lateral hidrato de carbono. Mais preferencialmente, a fracção hidrato de carbono é a fracção terminal da cadeia lateral hidrato de carbono. Numa forma de realização ainda mais preferida, a fracção hidrato de carbono é um resíduo galactose da cadeia lateral hidrato de carbono, de preferência o resíduo galactose terminal da cadeia lateral hidrato de carbono. Este resíduo galactose pode ser disponibilizado para reacção com o produto da reacção do composto (I) e composto (II) por meio de remoção dos ácidos siálicos terminais, seguida de oxidação como se descreve de seguida. Numa forma de realização ainda mais preferida, o produto da reacção do composto (I) e (II) está ligada a um resíduo ácido siálico das cadeias laterais hidrato de carbono, de preferência o resíduo ácido siálico terminal da cadeia lateral hidrato de carbono. 0 ácido siálico é oxidado como descrito.
Com particular preferência, este resíduo galactose é disponibilizado para reacção com o produto da reacção dos compostos (I) e (II) ou com o produto da reacção da reacção do produto da reacção dos compostos (I) e (II) e um composto reticulante através do grupo funcional X por meio de remoção do ácido siálico terminal seguido de oxidação.
Como anteriormente mencionado, o produto da reacção do composto (I) e composto (II), opcionalmente feito reagir 49 com um composto reticulante, pode ser feito reagir com um grupo tio incluído na EPO. É também possível fazer reagir o produto da reacção do composto (I) e composto (II), opcionalmente feito reagir com um composto reticulante, com um grupo tio bem como com uma fracção hidrato de carbono, cada um incluído no polipeptídeo, mais preferencialmente eritropoietina.
De acordo com uma forma de realização preferida, este grupo SH pode ser ligado a uma fracção hidrato de carbono preferencialmente oxidada, por exemplo utilizando derivados de hidroxilamina, por exemplo cloridrato de 2-(aminooxi)etilmercaptano (Bauer L. et al., 1965, J. Org., Chem., 30, 949) ou utilizando um derivado de hidrazida, por exemplo hidrazida de ácido tioglicólico (Whitesides et al., 1977, J. Org. Chem., 42, 332).
De acordo com uma outra forma de realização preferida, o grupo tio é preferivelmente introduzido numa fracção hidrato de carbono oxidada da EPO, mais preferencialmente uma fracção hidrato de carbono oxidada que faz parte de uma cadeia lateral hidrato de carbono da EPO.
De preferência, o grupo tio é derivado de uma cisteína natural ou de uma cisteína adicionada. Mais preferencialmente, a EPO possui a sequência de aminoácidos da EPO humana e as cisteínas naturais são cisteínas 29 e/ou 33. Numa forma de realização mais preferida, o produto da reacção (I) e composto (II), opcionalmente feitos reagir com um composto reticulante, é feito reagir com cisteína 29, enquanto a cisteína 33 é substituída por outro aminoácido. Em alternativa, o produto da reacção (I) e composto (II), opcionalmente feitos reagir com um composto 50 reticulante, é feito reagir com cisteina 33, enquanto a cisteina 29 é substituída por outro aminoácido.
No contexto da presente invenção, o termo "cisteínas adicionadas" indica que os polipeptídeos, de preferência EPO, incluem um resíduo cisteina que não está presente no polipeptídeo de tipo selvagem.
No contexto deste aspecto da presente invenção, a cisteina pode ser um aminoácido adicional na extremidade terminal N-ou C- da EPO.
Além disso, a cisteina adicionada pode ter sido adicionada por substituição de um aminoácido natural por cisteina ou uma cisteina adequadamente substituída. De preferência, no contexto deste aspecto da presente invenção, a EPO é EPO humana e o resíduo de aminoácido substituído é serina 126.
As condições de reacção da reacção do produto da reacção dos compostos (I) e (II), opcionalmente feitos reagir com um composto reticulante, com o polipeptídeo podem ser adaptadas às necessidades específicas da reacção respectiva. Podem ser utilizados como compostos tampão pelo menos um dos compostos anteriormente mencionados. Pode ser utilizado como solvente ou mistura de solvente, pelo menos um dos solventes anteriormente mencionados. O isolamento e/ou tratamento posterior pode ser efectuado, seleccionando-se os métodos preferidos de entre os métodos discutidos anteriormente.
Se o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é, por exemplo, feito reagir ainda com um polipeptídeo como composto adicional, de preferência EPO, utiliza-se preferencialmente água como solvente para a reacção. Para além da água, poderá estar presente pelo menos um outro 51 solvente. Pode-se citar como possível solvente adicional preferido DMSO, DMF, metanol ou etanol.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com um polipeptídeo, de preferência EPO, é efectuado num sistema aquoso.
No que se refere às temperaturas aplicada durante a reacção, não são indicados limites específicos, dado que a reacção resulta no derivado de hidroxialquil amido desejado, compreendendo o produto da reacção de compostos (I) e (II) feito reagir com o polipeptídeo através de pelo menos um grupo funcional X. A temperatura da reacção situa-se de preferência entre 4 e 37 °C, mais preferencialmente entre 10 e 30 °C, especialmente preferido entre 15 e 25 °C.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com um polipeptídeo é efectuada a uma temperatura entre 4 e 37 °C.
Durante a reacção a temperatura pode variar, de preferência dentro dos limites apontados anteriormente, ou manter-se essencialmente constante. O tempo de reacção da reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com o polipeptídeo pode ser adaptado às necessidades especificas e situa-se geralmente entre 0,5 e 48 h, de preferência entre 2 e 24 h e especialmente preferido entre 10 e 20h. O valor de pH para a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com o polipeptídeo pode ser 52 adaptado às necessidades específicas, tal como a natureza química dos reagentes.
Se, por exemplo, o produto da reacção do composto (I) e (II) é feito reagir com um outro composto através da reacção de um grupo funcional C, que é um grupo hidroxilamino -0-NH2, com pelo menos um grupo aldeído, incluído no polipeptídeo, o pH situa-se preferencialmente entre 4,5 a 6, mais preferencialmente a cerca de 5,5.
Se o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é, por exemplo, feito reagir ainda com um composto reticulante como composto adicional, utiliza-se preferencialmente água como solvente para a reacção. Para além da água, poderá estar presente pelo menos um outro solvente. Pode-se citar como possível solvente adicional preferido DMSO, DMF, metanol ou etanol.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com um composto reticulante é efectuado num sistema aquoso.
No que se refere às temperaturas aplicada durante a reacção, não são indicados limites específicos, dado que a reacção resulta no derivado de hidroxialquil amido desejado, compreendendo o produto da reacção de compostos (I) e (II) feito reagir com o composto reticulante através de pelo menos um grupo funcional X. A temperatura da reacção situa-se de preferência entre 4 e 37 °C, mais preferencialmente entre 10 e 30 °C, especialmente preferido entre 15 e 25 °C.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que a reacção do 53 produto da reacção do composto (I) e composto (II) com um composto reticulante é efectuada a uma temperatura entre 4 e 37 °C.
Durante a reacção a temperatura pode variar, de preferência dentro dos limites apontados anteriormente, ou manter-se essencialmente constante. 0 tempo de reacção da reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com o composto reticulante pode ser adaptado às necessidades especificas e situa-se geralmente entre 10 min e 10 h, de preferência entre 20 min e 5 h e especialmente preferido entre 30 min e 2 h. O valor de pH para a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com o composto reticulante pode ser adaptado às necessidades especificas, tal como a natureza quimica dos reagentes.
Se, por exemplo, o produto da reacção do composto (I) e (II) é feito reagir com um composto reticulante através de um grupo funcional X, incluído no produto da reacção do composto (I) e (II) e é um grupo amino -NH2, o pH situa-se preferencialmente entre 7 a 8,5, mais preferencialmente a cerca de 7,2.
Se o produto da reacção do composto da reacção da reacção dos compostos (I) e (II) e um composto reticulante é, por exemplo, feito reagir ainda com um polipeptídeo como composto adicional, de preferência EPO, utiliza-se preferencialmente água como solvente para a reacção. Para além da água, poderá estar presente pelo menos um outro solvente. Pode-se citar como possível solvente adicional preferido DMSO, DMF, metanol ou etanol. 54
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II), que é ainda feito reagir com compostos reticulantes, com um polipeptideo é efectuado num sistema aquoso.
No que se refere às temperaturas aplicada durante a reacção, não são indicados limites específicos, dado que a reacção resulta no derivado de hidroxialquil amido desejado, compreendendo o produto da reacção de compostos (I) e (II) feito reagir com um composto reticulante e feito ainda reagir com um polipeptideo através de pelo menos um grupo funcional X, incluído no composto reticulante. A temperatura da reacção situa-se de preferência entre 4 e 37 °C, mais preferencialmente entre 10 e 30 °C, especialmente preferido entre 15 e 25 °C.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um método tal como descrito anteriormente, em que a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II), feito ainda reagir com um composto reticulante, com o polipeptideo é efectuada a uma temperatura entre 4 e 37 °C.
Durante a reacção a temperatura pode variar, de preferência dentro dos limites apontados anteriormente, ou manter-se essencialmente constante. O tempo de reacção da reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II), feito ainda reagir com um composto reticulante, com o polipeptideo pode ser adaptado às necessidades específicas e situa-se geralmente entre 0,5 e 48 h, de preferência entre 2 e 24 h e especialmente preferido entre 10 e 20h. 55 0 valor de pH para a reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II), feito ainda reagir com um composto reticulante, com o composto reticulante pode ser adaptado às necessidades especificas, tal como a natureza química dos reagentes.
Se, por exemplo, o produto da reacção do composto (I) e (II) é feito ainda reagir com um composto reticulante, é feito reagir com um polipeptídeo através de um grupo funcional X, incluído no composto reticulante e é um grupo amino -NH2, o pH situa-se preferencialmente entre 7 a 8,5, mais preferencialmente a cerca de 7,2. 0 valor de pH adequado da mistura reaccional pode ser ajustado em cada caso por meio da adição de pelo menos um tampão adequado. Entre os tampões preferidos podem-se indicar tampão de acetato de sódio, tampão de fosfato de sódio ou tampões de borato. 0 produto da reacção resultante da reacção do produto da reacção do composto (I) e composto (II) com o pelo menos um composto adicional, sendo o pelo menos um composto adicional um polipeptídeo ou um composto reticulante, e incluindo ainda o produto da reacção os compostos resultantes das reacções do composto (I), composto (II), um composto reticulante e um polipeptídeo podem ser isolados a partir da mistura reaccional por pelo menos um método adequado e sujeitos a pelo menos um tratamento adicional, tal como pelo menos um pós-tratamento, tal como diálise e/ou liofilização.
Assim que estiver formado o produto da reacção mencionado poderá ser isolado da mistura reaccional por meio de pelo menos um método adequado. 56 0 isolamento do produto da reacção pode ser efectuado por meio de um processo adequado, que poderá incluir uma ou mais do que uma etapa.
De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, em que o produto da reacção não inclui um polipeptideo, o produto da reacção é primeiro separado da mistura reaccional ou mistura da mistura reaccional, de preferência por filtração centrífuga. Numa segunda etapa, o produto da reacção separado poderá ser sujeito a um tratamento adicional, tal como um pós-tratamento como diálise e/ou liofilização. De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, o produto da reacção separado é primeiro dialisado, de preferência com água, e depois é liofilizado até o teor de solvente do produto da reacção ser suficientemente baixo, de acordo com as especificações desejadas do produto.
De acordo com outra forma de realização da presente invenção, em que o produto da reacção inclui um polipeptideo, o produto da reacção é preferivelmente isolado, como descrito no exemplo 7.8.
Geralmente, o isolamento do conjugado HAS-polipeptídeo, seja com ou sem composto reticulante, pode ser efectuado recorrendo a procedimentos conhecidos para a purificação de polipeptídeos naturais e recombinantes, tal como cromatografia de exclusão molecular, cromatografia de permuta iónica, RP-HPLC, cromatografia com hidroxiapatite, cromatografia de interacção hidrófoba ou combinações de pelo menos dois métodos destes. 57 A ligação covalente de HAS ao polipeptídeo pode ser diversificada pela análise composicional de hidratos de carbono após a hidrólise da proteina modificada. A demonstração da modificação HAS nos oligossacáridos ligados em N do polipeptideo pode ser atingida por meio da remoção dos N-glicanos modificados HAS e observação da deslocação prevista para maior mobilidade em SDS-PAGE +/-análise de mancha de Western. A modificação HAS do polipeptideo nos resíduos cisteína pode ser demonstrada pela incapacidade de detectar o peptídeo Cys proteolítico correspondente me RP-HPLC e MALDI/TOF-MA nos fragmentos proteolíticos do produto modificado em HAS (Zhou et al., 1998, Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospray-mass spectrometry and matrix-assisted laserdesorption/ionization - time off flight - mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin, Electrophoresis, 19(13), 2348-55). 0 isolamento da fracção contendo HAS, após a digestão proteolítica do polipeptídeo modificado em Cys permite a verificação nesta fracção do peptídeo correspondente por meio de análise composicional do aminoácido convencional.
Todas as concretizações apresentadas anteriormente, relativamente ao HAS-polipeptídeo da presente invenção, no que se refere às propriedades do polipeptídeo ou HAS aplicam-se também ao método da presente invenção para a produção do conjugado de HAS-polipeptídeo. Além disso, todas as concretizações apresentadas anteriormente, relativamente ao HAS-EPO ou sua preparação, no que se refere aos peptídeo em geral ou a HAS também se aplicam ao 58 método da presente invenção para a produção de um conjugado HAS-polipeptídeo.
De acordo com uma forma de realização especialmente preferida da presente invenção, faz-se reagir hidroxietil amido com um composto (II), de preferência seleccionado de entre os compostos homo-bifuncionais e hetero-bifuncionais descritos anteriormente, e o produto da reacção resultante é feito reagir com uma glicoproteina, de preferência eritropoietina, de preferência com a fracção hidrato de carbono terminal oxidada de uma cadeia lateral hidrato de carbono EPO.
De acordo com outra forma de realização especialmente preferida da presente invenção, faz-se reagir hidroxietil amido com um composto (II), de preferência seleccionado de entre os compostos homo-bifuncionais e hetero-bifuncionais descritos anteriormente, para se obter um primeiro derivado de hidroxietil amido. 0 primeiro derivado de hidroxietil amido é depois feito reagir com um composto reticulante para se obter um segundo derivado de hidroxietil amido. Este segundo derivado de hidroxietil amido é depois feito reagir com uma glicoproteina, de preferência eritropoietina, de preferência com um grupo -SH incluído na glicoproteina, para produzir um terceiro derivado de hidroxietil amido. De preferência, o composto reticulante é um composto hetero-bifuncional. Mais preferencialmente, o composto reticulante é feito reagir com um grupo funcional contendo a estrutura -NH-, que é compreendida no primeiro derivado de hidroxietil amido. Mais preferencialmente, este grupo funcional é -NH2. 59
Uma vantagem da presente invenção reside em já não ser necessário utilizar solventes críticos do ponto de vista tóxico em pelo menos uma etapa da reacção, de preferência em todas as etapas da reacção, a etapa da reacção envolvida e, deste modo, não é necessário remover estes solventes após o processo de produção, de modo a evitar a contaminação dos produtos com o solvente. Além disso, não é necessário efectuar controlos adicionais da qualidade no que se refere aos solventes críticos do ponto de vista tóxico residuais. Se forem utilizados solventes orgânicos, de preferência para além da água, prefere-se a utilização de solventes não críticos do ponto de vista tóxico, tal como etanol e/ou propilenoglicol.
Outra vantagem da presente invenção consiste em evitarem-se os agentes de carga estruturalmente irreversíveis ou reversíveis nas etapas em que se utiliza um sistema aquoso como solvente, que são, de contrário, induzidas por solventes orgânicos. Consequentemente, os derivados de polipeptídeo obtidos de acordo com o método da presente invenção são diferentes dos preparados em solventes orgânicos, tal como DMSO.
Além disso, observou-se surpreendentemente que a conjugação de HAS com polipeptídeos, tais como PEO numa solução aquosa minimiza ou evita as reacções secundárias. Consequentemente, esta forma de realização do método da presente invenção conduz a produtos de hidroxialquil amido de elevado grau de pureza.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se também ao derivado de hidroxialquil amido, obtido por um 60 processo compreendendo a reacção de hidroxialquil amido (HAS da fórmula (I) no seu terminal redutor que não é oxidado antes da reacção mencionada com um composto da fórmula (II), em que Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou um grupo hidroxialquil de cadeia linear ou ramificada e em que R' ou R'' ou R' e R'' incluem pelo menos um grupo funcional X, capaz de se fazer reagir com pelo menos um composto adicional antes ou após a reacção de (I) e (II) e em que se faz reagir o composto (II) através do grupo NH ligando R' e R' ' com o composto (I) no seu terminal redutor que não é oxidado e em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é feito reagir com um grupo funcional Y de um outro composto, através de pelo menos um grupo funcional X e o pelo menos um composto adicional é um polipeptídeo ou em que o produto da reacção do composto (I) e compostos (II) é feito reagir com um outro composto através do pelo menos um grupo funcional X e o pelo menos um composto adicional é um composto reticulante e o produto da reacção com o composto reticulante é feito reagir com um grupo funcional Y de um segundo composto adicional e o segundo composto adicional é um polipeptídeo;
Com a condição de, se o produto da reacção do composto (I) e composto (II) for feito reagir com um grupo funcional Y de um composto adicional, através do pelo menos um grupo funcional X e o pelo menos um composto adicional é um polipeptídeo, o composto da fórmula (II) não é BMPH (hidrazida N-(ácido beta-maleimidopropiónico) TFA); EMCA (hidrazida N-(ácido epsilon-maleimido-capróico)), KMUH 61 (hidrazida N-(ácido kappa-maleimidoundecanóico)), M2C2H (4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxil-hidrazida HC1), MPBH (hidrazida ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico HC1), PDPH (hidrazida 3-(2-piridil-ditio)-propionil ), e com a condição de o produto da reacção do composto da fórmula (II)e o composto adicional que possui um grupo funcional Y e que é um polipeptídeo não ser insulina.
Como já anteriormente descrito no contexto dos métodos da presente invenção, 0-2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina é utilizado como um composto (II) preferido e é utilizado hidroxietil amido como um hidroxialquil amido preferido.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um derivado de hidroxialquil amido obtido por meio de um método em que se faz reagir o hidroxietil amido através do seu termina redutor com 2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]- hidroxilamina.
Conforme as respectivas condições de reacção, do solvente ou mistura de solventes utilizado e/ou resíduos R' e/ou R'' é possível que o derivado de hidroxialquil amido obtido segundo o método ou métodos, descritos anteriormente poderá ter as seguintes constituições (Illa):
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um derivado de hidroxialquil amido, tal como anteriormente 62 descrito, com uma constituição de acordo com a fórmula (IIa) . É também possível, por exemplo no caso em que R' é hidrogénio, que o derivado de hidroxialquil amido obtido pelo método ou métodos descritos anteriormente possa ter as seguintes constituições (Illa) ou (Illa), em que (Illa) e (Illb) podem estar ambos presentes na mistura reaccional com um certo equilíbrio da distribuição:
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um derivado de hidroxialquil amido, tal como anteriormente descrito, com uma constituição de acordo com a fórmula (Illb).
Além disso, a presente invenção refere-se também a um derivado de hidroxialquil amido, tal como anteriormente descrito, presente numa mistura de constituições de acordo com as fórmulas (Illa) e (Illb).
Dependendo das condições de reacção e/ou da natureza química do composto (II) utilizado para a reacção, os 63 compostos de acordo com a fórmula (Illa) podem estar presentes com o átomo N na posição equatorial ou axial, onde pode também estar presente uma mistura de ambas as formas, com um certo equilíbrio de distribuição.
Dependendo das condições de reacção e/ou da natureza química do composto (II) utilizado para a reacção, os compostos de acordo com a fórmula (Illb) podem estar presentes com a dupla ligação C-N na conformação E ou Z, onde pode também estar presente uma mistura de ambas as formas, com um certo equilíbrio de distribuição.
Nalguns casos poderá ser desejável estabilizar o composto de acordo com a fórmula (Illa) . Em especial, é este o caso em que o composto de acordo com a fórmula (Illa) é produzido e/ou utilizado numa solução aquosa. 0 método de estabilização particularmente preferido é a acilação do composto de acordo com a fórmula (Illa), especialmente no caso em que R' é hidrogénio. Como reagente de acilação, podem ser utilizados todos os reagentes adequados que resultam no derivado de hidroxialquil amido de acordo com a fórmula (IVa) OR.
H
De acordo com concretizações especialmente preferidas da presente invenção, o resíduo Ra que faz parte do reagente de acilação é metilo. São preferencialmente utilizados como reagentes de acilação os anidridos de ácido carboxilico, 64 halogenetos de ácido carboxílico e ésteres activos de ácido carboxilico.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um derivado de hidroxialquil amido, obtido por meio de um método como anteriormente descrito, possuindo o derivado mencionado uma constituição de acordo com a fórmula (IVa). A acilação é efectuada a uma temperatura entre 0 e 30 °C, preferencialmente entre 2 e 20 °C, especialmente preferível entre 4 e 10 °C.
Noutros casos poderá ser desejável estabilizar o composto de acordo com a fórmula (Illb). Em especial, é este o caso em que o composto de acordo com a fórmula (Illb) é produzido e/ou utilizado numa solução aquosa. O método de estabilização particularmente preferido é a redução do composto de acordo com a fórmula (Illb), especialmente no caso em que R' é hidrogénio. Como reagente de redução, podem ser utilizados todos os reagentes adequados que resultam no derivado de hidroxialquil amido de acordo com a fórmula (IVb)
De acordo com concretizações especialmente preferidas da presente invenção, são utilizados como reagentes de redução boro-hidretos tais como NaCNBH3 ou NaBH4. 65
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um derivado de hidroxialquil amido, obtido por meio de um método como anteriormente descrito, possuindo o derivado mencionado uma constituição de acordo com a fórmula (IVb). A redução é efectuada a uma temperatura entre 4 e 100 °C, preferencialmente entre 10 e 90 °C, especialmente preferível entre 25 e 80 °C. A presente invenção refere-se ainda a misturas dos compostos Illa) e (Illb), (IVa) e (IVb), (Illa) e (IVa), (llla) e (IVb), (Illb) e (IVa), (Illb) e (IVb), (Illa) e (lllb) e (IVa), (Illa) e (Illb) e (IVb), (IVa) e (IVb) e (Illa) , e (IVa) e (IVb) e (Illb) em que (Illa) e/ou (IVa) podem estar independentemente presentes numa conformação em que o átomo N pode estar presente numa posição equatorial ou axial e/ou em que (Illb) pode estar presente com a dupla ligação C-N em conformação E ou Z.
De acordo com um aspecto da presente invenção, o composto (I) é feito reagir com o composto (II) para se obter um primeiro produto da reacção. O primeiro produto da reacção mencionado é depois estabilizado opticamente, de acordo com pelo menos um dos métodos descritos anteriormente. O primeiro produto da reacção opcionalmente estabilizado é depois feito reagir com pelo menos mais um composto através de reacção de pelo menos um grupo funcional X compreendido em R' ' do primeiro produto da reacção, com pelo menos um grupo funcional Y compreendido no pelo menos um composto adicional, para produzir um segundo produto da reacção. O segundo produto da reacção mencionado é depois estabilizado opcionalmente, de acordo com pelo menos um dos métodos descritos anteriormente. 66
De acordo com a presente invenção, o pelo menos um composto adicional é um polipeptideo ou um composto reticulante. No caso de o pelo menos um composto adicional ser um polipeptideo, o grupo funcional Y está incluído no polipeptideo. No caso de o pelo menos um composto adicional ser um composto reticulante, o grupo funcional Y está incluído no composto reticulante e opcionalmente também no polipeptideo.
De acordo com uma forma de realização especialmente preferida da presente invenção, é utilizado hidroxietil amido como composto (I) 0-2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina é utilizado como composto (II) e EPO, possuindo uma fracção hidrato de carbono terminal oxidada de uma cadeia lateral hidrato de carbono é utilizada como composto adicional. Mais preferencialmente, faz-se reagir hidroxietil amido com 0-2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina para produzir um primeiro derivado de hidroxietil amido e esse primeiro derivado é ainda feito reagir com EPO com uma fracção hidrato de carbono terminal oxidada de uma cadeia lateral hidrato de carbono para produzir um segundo derivado de hidroxietil amido. Neste caso específico, não tem de ser efectuada qualquer reacção de estabilização.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um derivado de hidroxialquil amido obtido por meio de um método em que se faz reagir o hidroxietil amido através do seu terminal redutor com 0-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina e o produto da reacção é feito reagir com eritropoietina através da fracção hidrato de carbono terminal oxidada de uma cadeia lateral hidrato de carbono da eritropoietina. 67
De acordo com ainda outra forma de realização especialmente preferida da presente invenção, é utilizado hidroxietil amido como composto (I), 0-2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina é utilizado como composto (II), um composto reticulante hetero-bifuncional com um grupo maleimida e um grupo éster activo succinimida N-hidroxi e EPO, possuindo pelo menos um grupo -SH (designado TioEPO) é utilizada como polipeptideo. Mais preferencialmente, faz-se reagir hidroxietil amido com 0-2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina para produzir um primeiro derivado de hidroxietil amido, esse primeiro derivado é ainda feito reagir com o grupo éster activo N-hidroxi succinimida do composto reticulante para produzir um segundo derivado e o segundo derivado é feito reagir através do grupo maleimida com o TioEPO para produzir um terceiro derivado de hidroxietil amido. 0 derivado de hidroxialquil amido, doravante designado como conjugado HAS-EPO e que é formado pela reacção do composto (I) com o composto (II) e possivelmente um composto reticulante e eritropoietina tem a vantagem de exibir uma melhor estabilidade biológica em comparação com a eritropoietina antes da conjugação. Tal deve-se principalmente ao facto de este derivado de hidroxialquil amido ser menos reconhecido ou não ser reconhecido de todo pelos sistemas de remoção hepáticos e renais e persistir, por conseguinte, no sistema circulatório por um período de tempo mais longo. Além disso, uma vez que HAS está ligado de forma específica do sítio, é minimizado o risco de destruição da actividade biológica in vivo da EPO, pela conjugação de HAS com EPO. 68 0 conjugado HAS-EPO da presente invenção pode exibir essencialmente a mesma actividade biológica in vitro que o PEO recombinante nativo, uma vez que a actividade biológica in vitro mede apenas a afinidade de ligação ao receptor de EPO. Os métodos de determinação da actividade biológica in vitro são conhecidos na técnica.
Além disso, o HAS-EPO exibe uma maior actividade in vivo do que a EPO utilizada como material de partida para a conjugação (EPO não conjugada). Os métodos de determinação da actividade biológica in vivo são conhecidos na técnica. 0 conjugado HAS-EPO poderá exibir uma actividade in vivo entre 110 % a 300 %, de preferência 110 % a 200 %, mais preferencialmente entre 110 % e 180 % ou entre 110 e 150 %, mais preferível entre 110 % e 140 % se a actividade in vivo da EPO não conjugada for definida como 100 %.
Em comparação com a EPO muito sialilada da Amgen (vide EP 428 2 67 Bl) , o HAS-EPO exibe preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70 %, ainda mais preferencialmente pelo menos 85 % ou pelo menos 95 %, pelo menos 150 %, pelo menos 200 % ou pelo menos 300 % da actividade in vivo da EPO muito sialilada se a actividade in vivo da EPO muito sialilada estiver definida como 100 %. Mais preferivelmente, exibe pelo menos 95 % da actividade in vivo da EPO muito sililada. A elevada actividade biológica in vivo do conjugado HAS-EPO da presente invenção resulta principalmente do facto de o conjugado HAS-EPO permanecer por mais tempo na circulação do que o EPO não conjugado porque é menos reconhecido pelos sistemas de remoção hepáticos e porque a eliminação renal é reduzida devido ao elevado peso molecular. Os métodos para 69 a determinação do tempo de semi-vida in vivo da EPO na circulação são conhecidos na técnica (Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95 (3), 1184-8 ) .
Consequentemente, é uma grande vantagem da presente invenção a apresentação de um conjugado HAS-EPO que pode ser administrado com menos frequência do que as preparações de EPO comercialmente presentemente disponíveis. Enquanto as preparações padrão EPO têm de ser administradas pelo menos de 3 em 3 dias, o conjugado HAS-EPO da presente invenção é preferencialmente administrado duas vezes por semana, mais preferencialmente uma vez por semana.
Além disso, o método da presente invenção tem a vantagem de permitir a produção de um derivado EPO eficaz a custos reduzidos, uma vez que o método não inclui grandes etapas de purificação prolongadas, que resultam num rendimento final baixo, por exemplo não é necessário purificar com sialilado. As formas EPO são conhecidas por apresentarem uma actividade biológica in vivo baixa ou mesmo nenhuma.
Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo, numa quantidade com eficácia terapêutica, o conjugado do HAS-polipeptideo, de preferência o conjugado HAS-EPO, mais preferencialmente o conjugado HES-EPO da presente invenção. Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica inclui ainda pelo menos um diluente, um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável úteis na terapia por eritropoietina. 70
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade com eficácia terapêutica de um derivado de hidroxialquil amido tal como anteriormente descrito, em que o produto da reacção do composto (I) com o composto (II) é feito reagir através do pelo menos um grupo funcional X, compreendido no composto (II), com pelo menos um composto adicional, em que o pelo menos um composto adicional é um polipeptideo.
De acordo com as concretizações preferidas da presente invenção, o polipeptideo, de preferência eritropoietina é feito reagir com o produto da reacção do composto (I) e composto (II) através de um grupo tio ou uma fracção hidrato de carbono oxidada, contida no polipeptideo.
De acordo com concretizações ainda mais preferidas da presente invenção, o polipeptideo, de preferência eritropoietina, é feito reagir com o produto da reacção do composto (I) e composto (II) através de uma fracção hidrato de carbono oxidada, contida no polipeptideo.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica tal como descrita anteriormente, em que o polipeptideo é feito reagir com o produto da reacção do composto (I) e composto (II) através de uma fracção hidrato de carbono oxidada, contida no polipeptideo.
De acordo com as concretizações preferidas, o polipeptideo é GCS-F, AT III, IFN-beta ou eritropoietina, mais preferencialmente eritropoietina.
Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica tal como anteriormente descrito, em que o polipeptideo é eritropoietina. 71
De acordo com uma forma de realização especialmente preferida da presente invenção, a composição farmacêutica, tal como anteriormente descrita é produzida por meio da reacção de hidroxietil amido num meio aquoso com um composto de acordo com a seguinte fórmula
e por meio da reacção do produto da reacção com eritropoietina.
De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, a eritropoietina é oxidada com periodato de sódio antes da reacção mencionada.
De acordo com outra forma de realização particularmente preferida, a eritropoietina é parcialmente dessialilada e depois oxidada com periodato de sódio antes da reacção mencionada.
De acordo com uma outra forma de realização preferida da presente invenção, são excluídas as composições farmacêuticas com derivado de hidroxialquil amido, que são produzidas com base num Tio-EPO completamente reduzido, de acordo com o exemplo 5.
De acordo com outra forma de realização preferida, a presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade com eficácia terapêutica de um derivado de hidroxialquil amido tal como anteriormente descrito, em que o produto da reacção do composto (I) com o composto (II) é feito reagir através do pelo menos um grupo funcional X, compreendido no composto (II), com pelo menos um composto adicional, em que o pelo 72 menos um composto adicional é um composto reticulante e o produto da reacção do produto da reacção dos compostos (I) e (II) com o composto reticulante é feito reagir com um polipeptideo.
De acordo com mais uma forma de realização preferida, a presente invenção refere-se à composição farmacêutica anteriormente mencionada, em que o polipeptideo é eritropoietina. A composição farmacêutica anteriormente mencionada é especialmente adequada para o tratamento de perturbações anémicas ou perturbações com disfunção hematopoiética ou doenças relacionadas.
Uma "quantidade com eficácia terapêutica" tal como presentemente utilizado refere-se à quantidade que proporciona efeito terapêutico para um dado estado e regime de administração. A administração de isoformas da eritropoietina é efectuada de preferência pelas vias parentéricas. A via especifica escolhida irá depender do estado em tratamento. A administração da eritropoietina é feita de preferência enquanto parte de uma formulação contendo um veiculo adequado, tal como albumina de soro humano, um diluente adequado, tal como uma solução tampão salina e/ou um adjuvante adequado. A dosagem necessária será em quantidades suficientes para aumentar o hematócrito do paciente e irá variar conforme a gravidade do estado em tratamento, método de administração utilizado e outros aspectos. 0 objectivo do tratamento com a composição farmacêutica da presente invenção é preferencialmente um aumento do índice de hemoglobina superior a 6,8 mmol/1 no sangue. Com este 73 objectivo, a composição farmacêutica pode ser administrada de forma que o índice de hemoglobina aumente entre 0,6 mmol/1 e 1,6 mmol/1 semanais. Se o índice de hemoglobina exceder 8,7 mmol/1, a terapia deverá, preferencialmente, ser interrompida até que o índice de hemoglobina desça abaixo de 8,1 mmol/1. A composição da presente invenção é utilizada de preferência numa formulação adequada a injecção subcutânea ou intravenosa ou parentérica. Com este objectivo, os excipientes e veículos adequados são por exemplo di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato dissódico, clorato de sódio, polissorbato 80, HSA e água para injecção. A composição pode ser administrada três vezes por semana, de preferência duas vezes por semana, mais preferencialmente uma vez por semana e o mais preferível a cada duas semanas.
De preferência, a composição farmacêutica é administrada numa porção de 0,01-10 pg/kg de peso corporal do paciente, mais preferencialmente, 0,1 a 5 pg/kg, 0,1 a 1 pg/kg ou 0,2-0,9 pg/kg, mais preferível 0,3-0,7 pg/kg e o mais preferido é 0,4-0,6 pg/kg de peso corporal.
Em geral, por dose são administrados entre 10 pg e 200 pg, de preferência entre 15 pg e 100 pg. A presente invenção refere-se ainda a HAS-polipeptídeo de acordo com a presente invenção para utilização em método de tratamento do corpo humano ou animal. A presente invenção refere-se ainda à utilização de um conjugado HAS-EPO da presente invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de perturbações anémicas 74 ou perturbações com disfunção hematopoiética ou doenças relacionadas. A presente invenção é ilustrada mais detalhadamente pelos exemplos, quadros e figuras seguintes que não pretendem restringir de forma alguma o âmbito da presente invenção.
Breve descrição das figuras
Figura 1 A figura 1 apresenta uma análise de SDS-page do conjugado HES-EPO produzido de acordo com o exemplo 4.1.
Pista A:
Marcador proteico Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); pesos moleculares (em kD) do marcador proteico de cima para baixo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 e 17.
Pista B:
Produto bruto após conjugação de acordo com o exemplo 4.1. Pista C: EPO, material de partida.
Figura 2 A figura 2 apresenta uma análise de SDS-page do conjugado HES-EPO produzido de acordo com o exemplo 4,3.
Pista A:
Produto bruto após conjugação de acordo com o exemplo 4,3. Pista B: EPO, material de partida.
Pista C: 75
Marcador proteico Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); pesos moleculares (em kD) do marcador proteico de cima para baixo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4, e 17.
Figura 3 A figura 3 apresenta uma análise de SDS-page do conjugado HES-EPO produzido de acordo com o exemplo 6,1.
Pista A:
Marcador proteico Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); pesos moleculares (em kD) do marcador proteico de cima para baixo: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 e 17.
Pista B:
Produto bruto após conjugação de acordo com o exemplo 6,4. Pista C:
Produto bruto após conjugação de acordo com o exemplo 6,1. Pista D: EPO, material de partida.
Figura 4 A figura 4 apresenta uma análise de SDS-page de conjugados HES-EPO produzidos de acordo com os exemplos 6,2, 6,3, 6.5 e 6.6.
Pista A:
Marcador proteico Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); pesos moleculares (em kD) do marcador proteico de cima para baixo: 245, 1,23, 77, 42, 30, 25,4 e 17. 76 Pista B: Produto bruto após conjugação com base no exemplo 1.3b). Pista C: Produto bruto após conjugação com base no exemplo 1.1 b). Pista D: Produto bruto após conjugação com base no exemplo 1.3 a). Pista E: Produto bruto após conjugação com base no exemplo 1,1a). Pista F: de acordo com o exemplo 6.6, de acordo com o exemplo 6,5, de acordo com o exemplo 6,6, de acordo com o exemplo 6,5,
Produto bruto após conjugação de acordo com o exemplo 6,2. Pista G:
Produto bruto após conjugação de acordo com o exemplo 6,3. Pista K: EPO, material de partida.
Figura 5
Análises por SDS-PAGE de EPO-GT-1 submetida a tratamento por ácido suave durante 5 min = pista 2; 10 min = pista 3, 60 min = pista 4 e EPO não tratada = pista 1; apresenta-se o desvio de mobilidade da EPO após remoção de N-glicanos (+PNGASE).
Figura 6 77
Padrão de HPAEC-PAD de oligossacáridos isolados a partir de EPO não tratada e a partir de EPO incubada durante 5 min, 10 min e 60 min sob condições de hidrólise ácida suave. A numeração romana IV indica a posição de eluição de I = estrutura diantenária dessialilada, II = estruturas triantenárias trissialiladas (dois isómeros) , III = estrutura tertraantenária tertrassialilada +2 repetições de N-acetil-lactosamina, IV = estrutura tertraantenária tertrassialilada +1 repetição de N-acetil-lactosamina; V = estrutura tertraantenária tertrassialilada + sem repetição de N-acetil-lactosamina. A área de eluição de estruturas de oligossacáridos sem, com 1 a 4 ácido siálico está indicada por parêntesis.
Figura 7 HPAEC-PAD de oligossacáridos ligados por N após dessialilação; apresenta-se a posição de eluição de ácido N-acetilneuramínico; os números 1 a 9 indicam a posição de eluição de oligossacáridos padrão: 1 = diantenária; 2 = triantenária (isómeros 2 a 4), 3 = triantenária (isómeros 2 a 6); 4 = tetraantenária; 5 = triantenária com 1 repetição; 6 = tetraantenária com 1 repetição; 7 = triantenária com 2 repeições; 8 = tetraantenária com 2 repetições e 9 = tetraantenária com 3 repetições.
Figura 8
Análise por SDS-PAGE de EPO tratada suavemente e não tratada que foi submetida a oxidação por periodato de residuos de ácido siálico. 1 = oxidada por periodato sem tratamento por ácido; 2 = oxidada por periodato com tratamento por ácido de 5 min; 3 = oxidada por periodato com tratamento por ácido de 10 min; 4 = oxidada por 78 periodato sem tratamento por ácido; 5 = padrão de EPO BRP sem periodato e sem tratamento por ácido.
Figura 9
Padrão de HPAEC-PAD de oligossacáridos nativos isolados a partir de EPO não tratada e a partir de EPO incubada durante 5 min e 10 min sob condições de hidrólise ácida suave e subsequente tratamento por periodato. A área de eluiçâo de estruturas de oligossacáridos sem e com 1 a 4 ácido siálico está indicada por parêntesis 1 a 5.
Figura 10
Análise por SDS-PAGE do decurso temporal da modificação por HES EPO-GT-l-A: Fizeram-se reagir alíquotas de 20 pg de EPO-GT-l-A com o derivado X de HES modificado por hidroxilamina durante 30 min, 2, 4 e 17 horas. Pista 1 = tempo de reacção 30 min; pista 2 = tempo de reacção 2 horas; pista 3 = tempo de reacção 4 horas; pista 4 = tempo de reacção 17 horas; pista 5 = EPO-GT-l-A sem modificação por HES. A figura da esquerda apresenta o desvio em mobilidade de EPO-GT-l-A com o aumento do tempo de incubação na presença do derivado de HES modificado com hidroxilamina (caudal: 1 ml-min -1 ) X : Pista 1 = tempo de reacção 30 min; pista 2 = tempo de reacção 2 horas; pista 3 = tempo de reacção 4 horas; pista 4 = tempo de reacção 17 horas; pista 5 = EPO-GT-l-A com modificação por HES. A figura na direita apresenta uma análise das mesmas amostras após tratamento com N-glicosidase.
Figura 11
Análise por SDS-PAGE de fracções de Q-Sepharose de conjugados de HES-EPO. Concentraram-se alíquotas de 1% do 79 caudal resultante e 1% da fracção que foi eluída a elevadas concentrações salinas num concentrador Speed Vac e carregaram-se nos géis em tampão de amostra. A proteína EPO foi corada por Azul Coomassie. A = amostra I; B amostra II; C = amostra III; K = EPO-GT-1 de controlo; Al, Bl, Cl e Kl indicam a fracção de caudal resultante; A2, B2, C2 e K2 indicam a fracção eluída com elevada concentração salina.
Figura 12a
Análise por SDS-PAGE de amostra A2 de EPO modificada por HES (ver fig. 7), a amostra K2 de EPO de controlo e a EPO do preparado EP0-GT-1-A foram digeridas na presença de N-glicosidase a fim de remover os oligossacáridos ligados por N. Todas as amostras de EPO apresentaram um desvio de mobilidade no sentido das formas de baixo peso molecular sem ou com O-glicano. Observou-se uma proporção inferior da banda da proteína O-glicosilada e não glicosilada para a amostra A2 de EPO modificada por HES após N-glicosilação e detectou-se uma banda difusa de proteína ao redor de 30 kDa, presumivelmente representando uma modificação por HES no ácido siálico do resíduo O-glicano (ver a flecha marcada por um asterisco).
Figura 12b
Análise por SDS-PAGE após hidrólise suave de amostra A2 de EPO modificada por HES (ver fig. 11), a amostra K2 de EPO de controlo e EPO-GT-l-A não foram tratadas ou digeridas na presença de N-glicosidase a fim de remover os oligossacáridos ligados por N (ver figura 12a). Tanto a forma de elevado peso molecular de A2 antes como a de A após o tratamento por N-glicosidase (ver parêntesis com e sem flecha) desapareceram por tratamento ácido das 80 amostras. O padrão de EPO BRP que foi feito correr para comparação U não submetido a tratamento ácido suave.
Figura 13
Análise por HPAEC-PAD de material de oligossacárido ligado por N libertado a partir de amostra A modificada por HES, a partir de EP0-GT-1-A e a partir de uma amostra de EPO de controlo incubada com HES não modificado (K) . A numeração romana I a V indica a posição de eluição de I = estrutura diantenária dissialilada, II = estruturas triantenárias trissialiladas (dois isómeros), III = estrutura tertraantenária tertrassialilada +2 repetições de N-acetil-lactosamina, IV = estrutura tertraantenária tertrassialilada +1 repetição de N-acetil-lactosamina; V = estrutura tertraantenária tertrassialilada + sem repetição de N-acetil-lactosamina; os parêntesis indicam a área de eluição de N-glicanos di-, tri- e tetrassialilados conforme indicado nas legendas das figuras 6 e 9.
Figura 14
Análise por HPAEC-PAD de material de oligossacárido ligado por N libertado a partir de amostra A modificada por HES, a partir de EPO-GT-1A e a partir de uma amostra de EPO de controlo (K) incubada com HES não modificado. Apresenta-se o tempo de retenção de uma mistura de oligossacáridos padrão: os números 1 a 9 indicam a posição de eluição de oligossacáridos padrão: 1 = diantenária; 2 = triantenária (isómeros 2 a 4); 3 = triantenária (isómeros 2 a 6) ; 4 = tetraantenária; 5 = triantenária com 1 repetição; 6 = tetraantenária com 1 repetição; 7 = triantenária com 2 repeições; 8 = tetraantenária com 2 repetições e 9 = tetraantenária com 3 repetições. 81
Figuras 15 a 21
As figuras 15 a 21 representam espectros de massa MALDI/TOF de N-glicanos dessialilados libertados por via enzimática e química isolados a partir de preparações de EPO modificada por HES e de EPO de controlo. Os sinais principais a m / z 1809,7, 2174,8, 2539,9, 2905,0 e 3270,1 ([M+Na] + ) correspondem a estruturas de N-glicano di- a tetra-antenárias do tipo complexo sem e com uma ou duas repetições de N-acetil-lactosamina acompanhados por sinais fracos devido a perda de fucose ou galactose que são devidos a condições de hidrólise ácida utilizada para a dessialilação de amostras para análise de EM.
Figura 15
Espectro de MALDI/TOF: Oligossacáridos dessialilados de EPO A2 modificada por HES:
Figura 16
Espectro de MALDI/TOF: oligossacáridos dessialilados de EPO GT-l-A.
Figura 17
Espectro de MALDI/TOF: oligossacáridos dessialilados de EPO K2.
Figura 18
Espectro de MALDI/TOF: oligossacáridos dessialilados de EPO-GT-1.
Figura 19
Espectro de MALDI/TOF: oligossacáridos dessialilados de EPO-GT-1 submetidos a hidrólise ácida durante 5 min.
Figura 20 82
Espectro de MALDI/TOF: oligossacáridos dessialilados de EPO-GT-1 submetidos a hidrólise ácida durante 10 min.
Figura 21
Espectro de MALDI/TOF: oligossacáridos dessialilados de EPO-GT-1 submetidos a hidrólise ácida durante 60 min.
Exemplos
Exemplo 1: Formação de derivados de hidroxietil amido por aminação redutiva
Exemplo 1.1 Reacção de hidroxietil amido com 1,3-diamino-2-hidroxipropano a) Para uma solução de 200 mg de hidroxietil amido HES18/0.4 (MW = 18.000 D, DS=0.4)) em 5 ml de água, foram adicionados 0,83 mmol de 1,3-diamino-2-hidroxipropano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH 3. A mistura resultante foi incubada a 80 °C durante 17 horas. A mistura reaccional foi adicionada a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v). 0 precipitado foi recolhido por meio de centrifugação e dialisado durante 4 dias contra água (tubos de diálise SnakeSkin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), e liofilizado. b) Foi também possível a incubação da mistura resultante da adição de 0,83 mmol de 1,3-diamino-2-hidroxipropano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH 3 à solução de 200 mg de hidroxietil amido, realizada a 25 °C durante 3 dias.
Exemplo 1.2 Reacção de hidroxietil amido com 1,2-dihidroxi-3-aminopropano 83 83
«V ,Η
OH a) Para uma solução de 200 mg de hidroxietil amido (HES18/0.4 (MW = 18.000 D, DS=0.4)) em 5 ml de água, foram adicionados 0,83 mmol de 1,2-dihidroxi-3-aminopropano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH 3. A mistura resultante foi incubada a 80 °C durante 17 horas. A mistura reaccional foi adicionada a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v). O precipitado foi recolhido por meio de centrifugação e dialisado durante 4 dias contra água (tubos de diálise SnakeSkin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), e liofilizado. b) Foi também possível a incubação da mistura resultante da adição de 0.83 mmol de 1,2-dihidroxi-3-aminopropano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH 3 à solução de 200 mg de hidroxietil amido, realizada a 25 °C durante 3. A reacção de 1,2-dihidroxi-3-aminopropano com HES foi confirmada indirectamente pela quantificação de formaldeído, resultante da clivagem oxidativa de 1,2-diol no produto da reacção por periodato, conforme descrito em G. Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983) 449-504 .
Exemplo 13 Reacção de hidroxietil amido com 1,4-diaminobutano
NH
a) Para uma solução de 200 mg de hidroxietil amido (HES18/0.4 (MW = 18.000 D, DS=0.4)) em 5 ml de água, foram adicionados 0,83 mmol de 1,4-diaminobutano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH 3. A mistura resultante 84 foi incubada a 80 °C durante 17 horas. A mistura reaccional foi adicionada a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v). O precipitado foi recolhido por meio de centrifugação e dialisado durante 4 dias contra água (tubos de diálise SnakeSkin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), e liofilizado. b) Foi também possível a incubação da mistura resultante da adição de 0.83 mmol de 1,4-diaminobutano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH 3 à solução de 200 mg de hidroxietil amido, realizada a 25 °C durante 3.
Exemplo 1.4 Reacção de hidroxietil amido com l-mercapto-2-aminoetano
a) Para uma solução de 200 mg de hidroxietil amido (HES18/0.4 (MW = 18.000 D, DS=0.4)) em 5 ml de água, foram adicionados 0,83 mmol de l-mercapto-2-aminoetano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH 3. A mistura resultante foi incubada a 80 °C durante 17 horas. A mistura reaccional foi adicionada a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v). O precipitado foi recolhido por meio de centrifugação e dialisado durante 4 dias contra água (tubos de diálise SnakeSkin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), e liofilizado. b) Foi também possível a incubação da mistura resultante da adição de 0.83 mmol de l-mercapto-2-aminoetano e 50 mg de cianoboro-hidreto de sódio NaCNBH3 à solução de 200 mg de hidroxietil amido, realizada a 25 °C durante 3.
Exemplo 2: Formação de derivados de hidroxietil amido por conjugação 85
Exemplo 2,1: Reacção de hidroxietil amido com carbo-hidrazida
O
Foram dissolvidos 0,96 g de HES 18/0.4 (mw = 18.000 D, DS=0.4) em 8 ml de 0,1 M de tampão de acetato de sódio aquoso, pH 5.2, e adicionados 8 mmol de carbo-hidrazida (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) . A mistura resultante foi incubada a 25 °C durante 18 horas. A mistura reaccional foi adicionada a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v). O precipitado foi recolhido por meio de centrifugação, redissolvido em 40 ml de água, e dialisado durante 3 dias contra água (tubos de diálise Snakskin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) , e liofilizado.
Exemplo 2,2: Reacção de hidroxietil amido com di-hidrazida adipica 0
0
Foram dissolvidos 0,96 g de HES 18/0.4 (MW = 18.000 D, DS=0.4) em 8 ml de 0,1 M de tampão de acetato de sódio aquoso, pH 5.2, e adicionados 8 mmol de di-hidrazida adipica (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) . Após agitação a 25 °C durante 18 horas, a mistura reaccional foi adicionada a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v). O precipitado foi recolhido por meio de centrifugação, 86 redissolvido em 40 ml de água, e dialisado durante 3 dias contra água (tubos de diálise Snakskin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), e liofilizado.
Exemplo 2,3: Reacção de hidroxietil amido com 1,4-feniteno-bis-3-tiosemicarbazida
Foram dissolvidos 0,96 g de HES 18/0.4 (MW = 18.000 D, DS=0.4) em 8 ml de 0,1 M de tampão de acetato de sódio aquoso, pH 5.2, e adicionados 8 mmol de 1,4-feniteno-bis-3-tiosemicarbazida (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D). Após agitação durante 18 horas e a 25°C, foram adicionados 8 ml de água à mistura reaccional, e a suspensão foi adicionada durante 15 minutos a 4 500 rpm. O sobrenadante claro foi decantado e consequentemente adicionado a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v. O produto precipitado foi recolhido por meio de centrifugação, redissolvido em 40 ml de água, e centrifugado durante 15 minutos a 4 500 rpm. O sobrenadante claro foi dialisado durante 3 dias contra água (tubos de diálise SnakeSkin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), e liofilizado.
Exemplo 2.4: Reacção de hidroxietil amido com O—[2 — (2 — aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina "nh2 87
Foi sintetizada 0-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina conforme descrito em Boturyn et al. Tetrahedron 53 (1997) p. 5485-5492 em 2 fases e a partir de materiais comercialmente disponíveis.
Foram dissolvidos 0,96 g de HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS=0,4) em 8 ml de 0,1 M de tampão de acetato de sódio aquoso, pH 5,2, e adicionados 8 mmol de O-[2-(2-aminooxi-etoxi) -etil]-hidroxilamina. Após agitação a 25 °C durante 18 horas, a mistura reaccional foi adicionada a 160 ml de uma mistura fria 1:1 de acetona e etanol (v/v). O precipitado foi recolhido por meio de centrifugação, redissolvido em 40 ml de água, e dialisado durante 3 dias contra água (tubos de diálise Snakskin, limite de 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D), e liofilizado.
Exemplo 3 Oxidação de eritropoietina A eritropoietina oxidada foi produzida conforme descrito no Exemplo 7. Como eritropoietina exidizada, foi utilizada EPO-GT-l-A, conforme descrito no Exemplo 7.11 (c) (EPO-GT-1 sem hidrólise ácida, tratada com uma suave oxidação de periodato).
Exemplo 4: Conjugação de derivados de hidroxietil amido com a eritropoietina oxidada do exemplo 3
Exemplo 4,1 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 2,1
Foi ajustado EPO oxidado (1,055 pg/pl)em 20 mM de tampão de PBS com pH 5,3 e 5 M de tampão de acetato de sódio, pH 5,2. Foi adicionado a 19 μΐ da solução EPO, 18 μΐ de uma solução do derivado HES conforme produzido de acordo com o exemplo 2.1 (MW 18 kD; 18,7 pg/μΐ em 0,1 M de tampão de acetato de 88 sódio, pH 5,2), e a mistura foi incubada durante 16 h a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto doi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), conforme descrito nas instruções dadas pela Invitrogen. O gel é durante a noite manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). O resultado experimental é visualizado na Fig. 1. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteína para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteína.
Exemplo 4,2 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 2,3
Foi ajustado EPO oxidado (1,055 yg/yl)em 20 mM de tampão de PBS com pH 5,3 e 5 M de tampão de acetato de sódio, pH 5,2. Foi adicionado a 19 μΐ da solução EPO, 18 μΐ de uma solução do derivado HES conforme produzido de acordo com o exemplo 2,3 (MW 18 kD; 18,7 pg/μΐ em 0,1 M de tampão de acetato de sódio, pH 5,2), e a mistura foi incubada durante 16 h a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), conforme descrito nas instruções dadas pela Invitrogen.
Exemplo 4.3 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 2.4
Foi ajustado EPO oxidado (1,055 pg/pl)em 20 mM de tampão de PBS com pH 5,3 e 5 M de tampão de acetato de sódio, pH 5,2. Foi adicionado a 19 μΐ da solução EPO, 18 μΐ de uma solução 89 do derivado HES conforme produzido de acordo com o exemplo 2,4 (MW 18 kD; 18,7 yg/μΐ em 0,1 M de tampão de acetato de sódio, pH 5,2), e a mistura foi incubada durante 16 h a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), conforme descrito nas instruções dadas pela Invitrogen. O gel é durante a noite manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). O resultado experimental é visualizado na Fig. 2. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteína para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteína.
Exemplo 5 Formação de Tio-EPO por redução de eritropoietina 241,5 yg de eritropoietina (EPO-GT-1, ver exemplo 7) foram incubados em 500 μΐ de 0,1 M de tampão de borato de sódio, 5 mM de EDTA, 10 mM de DTT (Lancaster, Morcambe, UK) , pH 8,3, durante 1 h a 37 °C. O DTT foi removido por filtração centrífuga com um concentrador VIVASPIN 0,5 ml, 10 KD de MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13 000 rpm, consequente lavagem, 3 vezes com tampão de borato e duas vezes com um tampão de fosfato (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2).
Exemplo 6: Conjugação de derivados de hidroxietil amido com tioeritropoietina com recurso a um composto reticulante
Em cada um dos exemplos que se seguem, foi utilizado N-(alfa-maleimidoacetoxi) succinimida na forma de éster (AMAS) 90 90
Ο Ο como composto reticulante.
Exemplo 6,1 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 2,1 e o composto reticulante
Foram adicionados a 50 nmol de derivados HES, produzidos de acordo com o exemplo 2.1 e dissolvidos em 200 μΐ de 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), 10 μΐ de uma solução de 2,5 pmol de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) em DMSO. A solução clara foi incubada durante 80 min a 25 °C e 20 min a 40 °C. O restante AMAS foi removido por meio de filtração centrífuga com um concentrador VIVASPIN 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 vezes e 30 min com tampão de fosfato. À solução residual foram adicionados 15 pg de ThioEPO, produzidos de acordo com o exemplo 5 (1 pg/μΐ em tampão de fosfato), e a mistura foi incubada durante 16 horas a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, USA), conforme descrito nas instruções dadas por Invitrogen. O gel é durante a noite 91 manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). 0 resultado experimental é visualizado na Fig. 3. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteína para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteína.
Exemplo 6,2 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 2,2 e o composto reticulante
Foram adicionados a 50 nmol de derivados HES, produzidos de acordo com o exemplo 2,2 e dissolvidos em 200 μΐ de 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), 10 μΐ de uma solução de 2,5 μιηοΐ de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) em DMSO. A solução clara foi incubada durante 80 min a 25 °C e 20 min a 40 °C. O restante AMAS foi removido por meio de filtração centrífuga com um concentrador VIVASPIN 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 vezes e 30 min com tampão de fosfato. À solução residual foram adicionados 15 pg de ThioEPO, produzidos de acordo com o exemplo 5 (1 pg/pl em tampão de fosfato), e a mistura foi incubada durante 16 horas a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, USA), conforme descrito nas 92 instruções dadas por Invitrogen. 0 gel é durante a noite manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). 0 resultado experimental é visualizado na Fig. 4. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteina para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteina.
Exemplo 6,3 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 2,3 e o composto reticulante
Foram adicionados a 50 nmol de derivados HES, produzidos de acordo com o exemplo 2,3 e dissolvidos em 200 μΐ de 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), 10 μΐ de uma solução de 2,5 pmol de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) em DMSO. A solução clara foi incubada durante 80 min a 25 °C e 20 min a 40 °C. O restante AMAS foi removido por meio de filtração centrífuga com um concentrador VIVASPIN 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 vezes e 30 min com tampão de fosfato. À solução residual foram adicionados 15 pg de ThioEPO, produzidos de acordo com o exemplo 5 (1 pg/μΐ em tampão de fosfato), e a mistura foi incubada durante 16 horas a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris com tampão
NuPAGE 10% 93
Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, USA), conforme descrito nas instruções dadas por Invitrogen. 0 gel é durante a noite manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). 0 resultado experimental é visualizado na Fig. 4. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteína para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteína.
Exemplo 6,4 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 2,4 e o composto reticulante
Foram adicionados a 50 nmol de derivados HES, produzidos de acordo com o exemplo 2.4 e dissolvidos em 200 μΐ de 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), 10 μΐ de uma solução de 2,5 μιηοΐ de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) em DMSO. A solução clara foi incubada durante 80 min a 25 °C e 20 min a 40 °C. O restante AMAS foi removido por meio de filtração centrífuga com um concentrador VIVASPIN 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 vezes e 30 min com tampão de fosfato. À solução residual foram adicionados 15 yg de ThioEPO, produzidos de acordo com o exemplo 5 (1 yg/μΐ em tampão de fosfato), e a mistura foi incubada durante 16 horas a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, USA), conforme descrito nas instruções dadas por Invitrogen. O gel é durante a noite 94 manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). 0 resultado experimental é visualizado na Fig. 3. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteina para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteina.
Exemplo 6,5 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 1,1 e o composto reticulante
Foram adicionados a 50 nmol de derivados HES, produzidos de acordo com o exemplo 1.1 e dissolvidos em 200 μΐ de 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), 10 μΐ de uma solução de 2,5 μιηοΐ de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) em DMSO. A solução clara foi incubada durante 80 min a 25°C e 20 min a 40 °C. O restante AMAS foi removido por meio de filtração centrífuga com um concentrador VIVASPIN 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, lavando 4 vezes e 30 min com tampão de fosfato. À solução residual foram adicionados 15 pg de ThioEPO, produzidos de acordo com o exemplo 5 (1 pg/μΐ em tampão de fosfato), e a mistura foi incubada durante 16 horas a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, USA), conforme descrito nas instruções dadas por Invitrogen. O gel é durante a noite manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). 95 0 resultado experimental é visualizado na Fig. 4. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteína para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteína.
Exemplo 6.6 Reacção da eritropoietina oxidada com o produto reaccional do exemplo 1.3 e o composto reticulante
Foram adicionados a 50 nmol de derivados HES, produzidos de acordo com o exemplo 1.3, em condições de incubação de 80°C e 17 horas (Exemplo 1.3 a)), bem como a 25°C e 3d (Exemplo 1.3 b) , e dissolvidos em 200 μΐ de 0,1 M de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), 0,10 μΐ de uma solução de 2,5 μιηοΐ de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) em DMSO. A solução clara foi incubada durante 80 min a 25 °C e 20 min a 40 °C. O restante AMAS foi removido por meio de filtração centrífuga com um concentrador VIVASPIN 0,5 ml, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13 000 rpm, lavando 4 vezes e 30 min com tampão de fosfato. À solução residual foram adicionados 15 pg de ThioEPO, produzidos de acordo com o exemplo 5 (1 pg/pl em tampão de fosfato) , e a mistura foi incubada durante 16 horas a 25 °C. Após liofilização, o produto bruto foi analisado por SDS-Page com tampão NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/MOPS(Invitrogen, Carlsbad, USA), conforme descrito nas instruções dadas por Invitrogen. O gel é durante a noite manchado com reagente colorante Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D). 96 0 resultado experimental é visualizado na Fig. 4. É indicada uma conjugação bem sucedida por meio da migração da banda proteína para pesos moleculares maiores. A largura de banda aumentada é devida a uma distribuição do peso molecular dos derivados HES e ao número de derivados HES ligados à proteína.
Exemplo 7 Produção preparativa de conjugados HES-EPO Resumo
Os conjugados HES-EPO foram sintetizados por meio do acoplamento de derivados HES (média mw de 18 000 Daltons; grau de substituição de hidroxietil de 0,4) aos resíduos de ácido siálico parcialmente oxidado (periodato suave) nas cadeias de oligossacárido do EPO de humano recombinante. Com base na análise estrutural do hidrato de carbono, as modificações introduzidas não afectaram a integridade estrutural das cadeias de oligossacárido nucleares, uma vez que a MALDI/TOF-MS dos glicanos modificados HES tratados com ácido suave revelou cadeias do tipo N-acetilactosamina neutras não distinguíveis das observadas no produto EPO não modificado. Os resultados obtidos indicam que são anexados pelo menos 3 resíduos HES modificados por molécula EPO no caso da preparação EPO que foi sujeita a modificação sem anterior remoção parcial de ácido siálico. Uma EPO variante com falta de cerca de 50% de resíduos de ácido siálico da anterior proteína mostrou uma similar mobilidade do peso molecular, aparentemente elevada em SDS-PAGE (60-110 KDa vs 40 KDa para a norma BRP EPO. A HES modificada de acordo com a EPO é estável em condições de cromatografia padronizada de permuta iónica a uma temperatura ambiente e pH 3-10. 97
Os ensaios de bioanálise EPO no sistema normocitémico dos ratinhos indica que a HES modificada de acordo com a EPO tem uma actividade especifica 2,5 a 3 vezes mais elevada (IU/mg) neste ensaio em comparação com a norma internacional BRP EPO, baseada na determinação da proteína com o recurso ao valor de absorção UV da European Pharmacopeia e um método de determinação da proteína RP-HPLC EPO, calibrado contra a preparação segundo a norma BRP EPO.
Exemplo 7.1 Materiais e métodos (a) Libertação de oligossacáridos com ligação N por digestão com N-glicosidase.
Durante a noite, foram incubadas amostras com 25 unidades (de acordo com as especificações do fabricante, Roche Diagnostics, Alemanha) de PNGase F recombinante a 37°C. Foi monitorizada uma completa digestão por uma mudança especial da mobilidade da proteína em SDS-PAGE. Os N-glicanos libertados foram separados do polipeptídeo com a adição de 3 volumes de etanol a 100% frio e incubação a -20°C durante pelo menos 2 horas (Schroeter S et al., 1999). A proteína precipitada foi removida por centrifugação durante 10 minutos a 4°C e a 13 000 rpm. O pellet foi então sujeito a duas lavagens adicionais com 500 μΐ de etanol a 75% gelado. Os oligossacáridos nos sobrenadantes recolhidos foram secos numa centrifugação a vácuo (Speed Vac concentrator, Savant Instruments Inc., USA). Antes da respectiva utilização, as amostras de glicano foram dessalinizados com recurso a cartuchos Hypercarb (25 mg ou 100 mg de HyperCarb), conforme se segue: as colunas foram lavadas com 3 x 500 μΐ de 80% de acetonitrilo (v/v) em 0,1% de TFA, seguido de 98 lavagens com 3 x 500 μΐ de água. As amostras foram diluídas com água a um volume final de 300 μΐ - 600 μΐ antes de carregar no cartucho que com rigor foi posteriormente lavado com água. Os oligossacáridos foram eluídos com 1,2 ml (25 mg de cartuchos; 1,8 ml no caso de 100 mg de cartuchos) 25% de acetonitrilo em água contendo 0,1% de ácido trifluoroacético(v/v). Os oligossacáridos eluídos foram neutralizados com 2 Μ NH 4 OH e secos num cincentrador Speed Vac. Nalguns casos, a dessalinização de oligossacáridos libertados da N-glicosidase foi realizada pela adsorção da mistura de digestão das amostras < 100 pg da(glico)proteína total em 100 mg de cartuchos Hypercarb. (b) Análise de oligossacáridos por meio da desorção a laser assistida por matriz/ionização, espectrometria de massa de tempo-de-voo MALDI-TOF (MALDI/TOF/TOF-MS).
Foi utilizada um tempo-de-voo Bruker ULTRAFLEX(TOF/TOF): os oligossacáridos dessialilados nativos foram analisados utilizando 2,5-ácido dihidroxibenzóico(ácido dihidroxibenzóico como material adsorvente no modo iónico positivo bem como negativo usando um reflectron em ambos os casos. Para as análises MS-MS, os iões parentes seleccionados foram sujeitos a uma dissociação induzida a laser (LID) e os iões fragmentados resultantes separados pela segunda fase TOF(LIFT) do instrumento. As soluções amostra de 1 μΐ e uma concentração aproximada de 1-10 pmol-μΐ -1 foram misturadas com quantidades iguais da respectiva matriz. Esta mistura foi colocada num alvo em aço inoxidável e seca a uma temperatura ambiente antes da análise. 99
Exemplo 7.2 Preparação e caracterização de humano recombinante EPO (EPO-GT-1) A EPO foi expressa a partir de células CHO recombinantes, conforme descrito em Mueller PP et al., 1999, Dorner AJ et al., 1984) e as preparações foram caracterizadas em conformidade com os métodos descritos em Eur. Phar. (Ph. Eur. 4, Monography 01 / 2002:1316: solução concentrada de eritropoietina). O produto final tinha um conteúdo em ácido siálico de 12 nMol (+/-1,5 nMol) por nMol de proteína. As estruturas de oligossacáridos com ligação N foram determinadas por HPAEC-PAD e por MALDI/TOF-MS, conforme descrito em (Nimtz et al., 1999, Grabenhorst, 1999). As preparações EPO que foram obtidas continham oligossacáridos des-, tri- and tetrassialilados (2-12%, 15-28% e 60-80%, respectivamente, e foram apresentadas cadeias sulfatadas e pentassialiladas em pequena quantidade). As características gerais da glicosilação das preparações EPO foram similares às da preparação segundo a norma internacional BRP EPO. O padrão com foco isoeléctrico do EPO recombinante foi comparável ao da norma preparação segundo a norma BRP EPO mostrando as isoformas correspondentes. 25% da proteína EPO tinha falta de O-glicosilação a Ser 126 da cadeia de polipeptídeo.
Exemplo 7.3 Preparação de formas EPO parcialmente dessialiladas A proteína EPO GT-1(2,84 mg/ml) foi aquecida até 80°C em 20 mM de Tampão NA de fosfato pH 7,0 e depois foram adicionados 100 μΐ de 1 N H 2 SO 4 por 1 ml da solução EPO; a incubação foi continuada durante 5 min, 10 min e 60 min, respectivamente, rendendo preparações EPO de diferente grau 100 de sialilação. Foi realizada uma quantificação de oligossacáridos com 0-4 de ácidos siálicos após libertação de oligossacáridos com polipeptideo. A N-glycosidase e o isolamento of cadeias foram realizados por dessalinização utilizando cartuchos Hypercarb (25 mg HyperSep Hypercarb; ThermoHypersil-Keystone, UK) . As preparações EPO foram neutralizadas por adição de 1 N NaOH, congeladas em liquido N 2 e armazenadas a -20°C até posterior utilização.
Exemplo 7.4 Oxidação de periodato de formas EPO sialiladas
Foi adicionado a 10 mg de EPO tratada com ácido não tratado dissolvida em 3,5 ml de 20 mM de Tampão NA de fosfato 7,0, 1,5 ml de 0,1 M Tampão NA de acetato pH 5,5, tendo a mistura sido arrefecida a 0°C num banho a gelo; 500 μΐ de 10 mM de Na-periodato foi adicionado e a mistura reaccional foi mantida no escuro durante 60 min a 0°C. Depois foram adicionados 10 μΐ de glicerol e a incubação continuou por mais 10 min no escuro. As formas EPO oxidadas parcialmente foram separadas dos reagentes por meio de dessalinização utilizando concentradores VIVASPIN(10000 MWCO, PES Vivascience AG, Hanover, Alemanha), de acordo com as recomendações do fabricante a 3 000 rpm em centrifugação em laboratório equipado com um rotor de ângulo fixo. Após congelamento em azoto líquido, as preparações EPO foram armazenadas num volume final de 4 ml a -20°C. 100 pg de aliquotas da preparação EPO parcialmente oxidada foram sujeitos a um tratamento de N-glicosidase e os oligossacáridos foram isolados com o recurso a cartuchos Hypercarb, conforme descrito. Os oligossacáridos foram dessialilados por meio de um tratamento com ácido suave e analisados por HPAEC-PAD e os seus tempos de retenção 101 comparados aos dos oligossacáridos padronizados autênticos, conforme descrito (Nimtz et al., 1990 e 1993).
Exemplo 7.5 Redução de dissulfuretos EPO com ditioeritreitol 5 mg de EPO-GTl foi incubado em 5 ml de 0,1 M de tampão Tris/HCl pH 8,1 na presença de 30 mM de ditioeritreitol (DTT) a 37°C durante 60 minutes; a remoção de DTT foi conseguida utilizando um concentrador Vivaspin a 4°C, 4 ciclos de permuta de tampão. A preparação final EPO foi congelada em azoto liquido e armazenada a -20°C em 50 mM de Tampão NA de acetato pH 5,5.
Exemplo 7.6 Determinação da proteína EPO A determinação quantitativa da proteína EPO foi realizada por meio da medição da absorção de UV absorption a 280 nm e de acordo com a Eur. Phar. (European Pharmacopeia 4,
Monography 01/2002: 1316: solução concentrada de eritropoietina) numa cuvette com 1 cm de comprimento. Para além disso, a EPO foi quantificada por meio da aplicação de um método RP-HPLC utilizando uma coluna RP-C4 (Proteína Vydac C4, Cat.# 214TP5410, Grace Vydac, Ca, US) ; 0 método HPLC foi calibrado utilizando uma norma BRP 1 referente à eritropoietina (European Pharmacopeia, Conseil de 1'Europe B.P. 907-F67029, Estrasburgo Cedex 1).
Exemplo 7.7 Oxidação de EPO dessialilada com oxidase de galactose 4,485 mg de EPO completamente dessialilado foi incubado em 20 mM de Tampão NA de fosfato pH 6,8 na presença de 16 μΐ de catalase (6214 unidades/200 ml) e 80 μΐ de oxidase de galactona (2250 unidades/ml de dendroides de 102 dactilio(Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha); a incubação a 37°C foi realizada durante a noite; 20 μΐ de oxidase de galactose foram adicionadas 2 vezes após 4 horas e depois de 8 horas após o início da incubação.
Exemplo 7.8 Preparação de amostras EPO para ensaios de bioanálise
Purificação de EPO a partir de incubações de preparações de proteína EPO oxidada com oxidase de periodato ou galactose com HES acativada A purificação de amostras EPO (remoção de derivados HES não reactivos) foi realizada a temperatura ambiente. As misturas da incubação da EPO (aproximadamente 5 mg de proteína EPO) foram diluídas 1:10 com tampão A (20 mM de ácido sulfónico propano N-morpolina [MOPS/NaOH] em H20 bidest, pH 8,0) e foram aplicadas a uma coluna com 3 ml de Q-sefarose HP (Pharmacia Code no. 17-1014-03, Lot no. 220211) equilibrada com 10 volumes de coluna (CV) de tampão A utilizando uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A coluna foi lavada com 6-8 CV de tampão A (taxa de fluxo = 0,8 ml/min) e a eluição foi levada a cabo com recurso ao tampão B(20 mM de ácido sulfónico de etano de morfolina [MES/NaOH], 0,5 M de NaCl em H20 bidest, pH 6,5) a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A EPO foi detectada por absorção UV a 280 nm e eluída em cerca de 6 ml. A coluna foi regenerada utilizando 3 CV de tampão C (20 mM MES, 1,5 M de NaCl em H20 ajustados a pH 6,5) e foi reequilibrada com recurso a 10 CV de tampão A (taxa de fluxo =0,7 ml/min). A permuta de tampão dos eluídos EPO obtidos a partir da fase Q-sefarose foi realizada utilizando concentradores Vivaspin e soro fisiológico com tampão de fosfato PBS) com 103 3 ciclos de centrifugação por amostra; as amostras foram ajustadas para 2 ml com PBS e armazenadas a -20°C.
Apenas <25% das formas EPO oxidadas parcialmente dessialiladas parcialmente e consequentemente oxidadas com periodato suave que foram sujeitas a uma modificação HES foram obtidas a partir de eluido de Q-sefarose uma vez que sob as condições empregues as formas básicas EPO não ligavam a Q-sefarose e foram encontradas no fluxo junto com derivados HES não reactivos.
Exemplo 7.9 Cromotografia de permuta de aniões com elevado pH com detecção amperométrica pulsada HPAEC-PAD)
Foram analisados oligossacáridos purificados nativos e dessialilados por meio de cromatografia de permuta de aniões de elevado pH (HPAE) utilizando um sistema Dionex BioLC (Dionex, USA) equipado com uma coluna CarboPac PAI (0,4 x 25 cm) em combinação com um detector amperométrico pulsado (PAD) (Schrõter et al., 1999; Nimtz et al., 1999). Os potenciais do detector (E) e durações do impulso (T) foram: El: +50 mV, Tl: 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms; E3: -500 mV, T3: 60 ms, e o resultado foi 500-1500 nA. Os oligossacáridos foram depois injectados na coluna CarboPac PAI que foi equilibrada com 100% de solvente A. Para uma eluição dos oligossacáridos dessialilados(taxa de fluxo: 1 ml-min -1 ) foi realizado aplicando um gradiente linear (0-20%) de solvente B durante um período de 40 min, seguido de um aumento linear de 20-100% de solvente B durante 5 min. O solvente A foi 0,2 M NaOH em H20 bidestilado, o solvente B compreendeu 0,6 M de NaOAc em solvente A. Para oligossacáridos nativos, a coluna foi equilibrada com 100% de solvente C (0,1 M de NaOH em H20 bidestilado) e 104 eluição(taxa de fluxo: 1 ml-min -1 ) foi realizado aplicando um gradiente linear (0-35%) de solvente D durante um período de 4 8 min seguido de um aumento linear de 35-100% de solvente D durante 10 min. O solvente D compreendeu 0,6 M de NaAc em solvente C.
Exemplo 7.10. Análise composicional de monossacárido de N-glicanos, N-glicanos modificados em HES e proteína EPO por GC-MS
Os monossacáridos foram analisados como os correspondentes glicosidos de metilo depois da metanólise, da N- reacetilação e trimetilsililação por GC/MS [Chaplin, M.F. (1982) A rapid and sensitive method for the analysis of carbohydrate. Anal. Biochem. 123 , 336-341]. As análises foram realizadas num espectrómetro de massa de iões Finnigan GCQ (Finnigan MAT corp., San Jose, CA) com funcionamento em modo EI iónico positivo equipado com uma coluna capilar de 30 m DB5. Programa de temperatura: 2 min isotérmico a 80°C, depois 10 graus min -1 a 300°C.
Os monossacáridos foram identificados pelo seu tempo de retenção e padrão de fragmentação característico. Os resultados incorrectos da integração de pico electrónico foram usados para quantificação. Os monossacáridos retendo mais de um pico devido a anomericidade e/ou presença de formas furanóides e piranóides foram quantificados adicionando todos os picos mais elevados. Foi usado 0,5 yg de mio-inositol como composto padrão interno.
Exemplo 7.11 Resultados
Exemplo 7.11 (a) Caracterização de N-glicanos de EPO-GT-1 com tratamento com ácido suave (parcialmente dessialilados) 105
As preparações de EPO-GT-1 sujeitas a um tratamento com ácido suave durante 5, 10 ou 60 min. foram analisadas por SDS-PAGE antes e depois da libertação de oligossacáridos com ligação N por incubação com N-glicosidase conforme mostra a Figura 5, os oligossacáridos com ligação N foram sujeitos a um mapeamento HPAEC-PAD dos oligossacáridos(Figura 6). O EPO-GT-1 não tratado continha >90% de oligossacáridos com ligação N com 3 ou 4 resíduos de ácido siálico enquanto que após 5 min de incubação na presença de ácido suave <40% de cadeias de hidrato de carbono tinham 3 ou 4 resíduos de ácido siálico. A HPAEC-PAD dos N-glicanos dessialilados revelou que o rácio de oligossacáridos neutros que foram detectados para um EPO-GT-1 sem tratamento e que ficavam estáveis nas preparações sujeitas ao tratamento com ácido durante 5, 10 or 60 min. MALDI/TOF-MS dos glicanos dessialilados revelou que <90% da fucose proximal estavam presentes após tratamento com ácido suave da proteína.
Exemplo 7.11(b) Caracterização de EPO-GT-1 com tratamento com periodato A mobilidade SDS-PAGE das formas EPO tratadas com periodato suave e que foram sujeitas previamente a um tratamento de 5 e 10 minutos com ácido ou não foram tratadas foram comparadas e poderão ser visualizadas na Figura 8. As condições utilizadas para a oxidação de periodato de ácidos siálicos não alteraram o padrão SDS-PAGE das preparações EPO (comparar a Fig. 5) . A oxidação dos ácidos siálicos resultou numa alteração de oligossacáridos numa análise HPAEC-PAD para anteriores tempos de eluição (comparar as Figuras 6 e 9) . 106
Exemplo 7.11(c) Caracterização de derivados EPO modificados
em HES (aa) Duração da modificação de EPO-GT-l-A com derivado X HES modificado com hidroxilamina, produzido de acordo com o Exemplo 2.4
Foram adicionados 400 yg de derivado X HES modificado em hidroxilamina a 20 yg de EPO-GT-l-A (EPO oxidado com periodato suave, hidrolizado sem ácido antes da oxidação com periodato suave) em 20 yL de 0,5 M de NaOAc tampão pH 5,5 e a reacção parou após 30 min, 2,4, e 17 horas, respectivamente, congelando amostras em azoto líquido. As amostras foram depois armazenadas a -20°C até posterior análise.
Foi adicionado o tampão da amostra SDS PAGE e as amostras foram aquecidas até 90°C e aplicadas em gel SDS. Conforme mostra a figura 10, os tempos de incubação aumentados resultaram em alterações também aumentadas em relação ao peso molecular mais elevado da proteína. Após 17 horas de incubação na presença de derivado X HES modificado em hidroxilamina, foi detectada uma banda de proteína difusa Coomassie migrando numa área entre 60 e 11 KDa, com base na posição de padrões de peso molecular (ver parte esquerda da Fig. 10 ) . Com o tratamento com N-glicosidase, a maior parte da proteína foi alterada para a posição de EPO de-N -glicosilado (ver Fig. 10, gel da direita; a seta A indica a posição de migração da N-glicosidase, a seta B indica a posição de migração da EPO de-N-glicosilado; a banda da proteína difusa visível na região entre os padrões de peso molecular 28 KDa e 36 KDa representa presumidamente as formas EPO que são modificadas por HES e o local de O- 107 glicosilação da molécula. Na perspectiva da especificidade da N-glicosidase, concluimos deste resultado que de facto a modificação HES ocorre nos residuos de ácido siálico oxidado com periodato dos glicanos da proteína EPO.
(bb) Caracterização dos conjugados HES-EPO
Os conjugados HES-EPO I (originados de EPO-GT-1 após oxidação com periodato suave, i.e. de EPO-GT-l-A), II (resultantes de EPO-GT-1 sujeitos a uma hidrólise com ácido de 5 min e oxidação com periodato suave), III (resultantes de EPO-GT-1 sujeito a uma hidrólise com ácido de 10 min e oxidação com periodato suave) foram sintetizados conforme descrito anteriormente. Foi incluída uma incubação de controlo(K) contendo EPO-GT-1 não modificado sob as mesmas condições e ao qual foi adicionada uma quantidade igual de HES não modificado. As misturas da incubação foram sujeitas a posterior purificação para uma consequente análise bioquímica dos derivados HES-EPO.
As incubações dos conjugados HES-EPO I , II e III, bem como a incubação de controlo K foram sujeitas a uma fase de purificação com Q-sefarose, conforme descrito em "Material e Métodos" (Exemplo 7.8), no sentido de remover o excesso de reagente HES não reactivo que foi esperado no fluxo da coluna de permuta iónica. Devido às enormes quantidades de formas EPO básicas contidas em amostras previamente tratadas com ácido II e III, esperávamos quantidades consideráveis de produto EPO modificado destas incubações no fluxo. Conforme mostra a Figura 11, quase todo o material EPO das amostras foi retido por uma coluna de Q-sefarose, enquanto que apenas aproximadamente 20-30% das amostras III e II foi recuperado na fracção eluíndo com uma 108 elevada concentração de sal. Todo o material da proteína das incubações com derivado X HES, ambos no fluxo e as fracções eluíndo com elevado sal tinham um peso molecular aparentemente mais elevado em SDS-PAGE quando comparado com o controlo EPO.
No sentido de caracterizar com maior pormenor, as amostras A e K de EPO modificado em HES (ver Figura 11) foram comparadas com a forma EPO-GT-l-A oxidada com periodato. As amostras foram sujeitas a um tratamento com N-glicosidase, e conforme descrito nas Figuras 12a e 12b, a libertação de N-glicanos resultou em duas reduzidas bandas de peso molecular na posição das formas EPO O-glIcosiladas e não glicosiladas da preparação EPO. No caso da amostra A, foi detectada uma outra banda que migrava na posição do padrão 28 KDa mw sugerindo uma modificação HES no O-glicano desta variante EPO (cf. Exemplo 7.11 (c) (aa)) . Esta banda (e também a forma mw altamente modificada em HES de EPO N-glicosilado, ver Figs. 12a e 12b) desapareceu após uma sujeição das amostras a uma hidrólise suave que está de acordo com a perspectiva de que a modificação HES foi atingida nos resíduos de ácido siálico oxidado com periodato de eritropoietina.
Foram hidrolizadas alíquotas das misturas da incubação de N-glicosidase utilizando condições que permitissem a completa remoção de resíduos de ácidos siálicos (e também o derivado HES com ligação de ácido siálico) de oligossacáridos; após neutralização, as misturas foram então absorvidas em pequenas colunas Hypercarb para a respectiva dessalinização. As colunas foram rigorosamente lavadas com água e posteriormente seguiu-se uma eluição de oligossacáridos neutros com 40% de acetonitrilo em H20 109 contendo 0,1% de ácido trifluoracético. Os oligossacáridos resultantes foram sujeitos a MALDI/TOF-MS. Os espectros de fracções de oligossacáridos dessialilados da amostra A, EPO-GT-l-A e amostra K mostraram massas idênticas para oligossacáridos do tipo complexo a m/z =1810 Da (diantenário), 2175 = triantenário, 2540 = tetraantenário, 2906 = tetraantenário plus 1 repetição N-acetilactosamina e 3271 = tetraanteário plus 2 repetições N-acetilactosamina; foram detectados pequenos sinais correspondendo à falta de fucose (-146) e galactose (menos 162), atribuída às condições da hidrólise com ácido aplicadas para remoção do ácido siálico (ver MALDI-Figuras 15, 16 e 17) .
Numa experiência paralela, a mistura da digestão com N-glicosidase foi absorvida no em 1 ml de cartucho RP-C18 (sem anterior hidrólise de oligossacáridos com ácido) e a eluição foi realizada com 5% de acetonitrilo em água contendo 0,1% de TFA; nas mesmas condições, a proteína EPO foi completamente retida no material RP e os oligossacáridos foram lavados da coluna com 5% de acetonitrilo em H20 contendo 0,1% de TFA. A proteína EPO de-N-glicosilada foi eluida com 70% de acetonitrilo em H20 contendo 0,1% de TFA. As fracções de oligossacáridos da fase RP-C18 da amostra A tratada com N-glicosidase, a EPO GT-l-A e a amostra K foram neutralizadas e sujeitas a uma dessalinização com cartuchos Hypercarb, conforme descrito anteriormente. Os oligossacáridos isolados foram sujeitos a um mapeamento HPAEC-PAD anterior (ver Figuras 13) e depois do tratamento com ácido suave nas condições que permitiram a remoção de ácidos siálicos dos glicanos (ver Figuras 14). O perfil HPAEC-PAD para o material nativo obtido a partir das amostras A modificadas em HES mostrou apenas sinais 110 negligenciáveis para os oligossacáridos, enquanto que os oligossacáridos derivados de EPO GT-l-A exibiram o mesmo perfil de glicano, conforme mostra a Fig. 9 (amostra designada de EPO-GT-1 após tratamento com periodato suave). 0 perfil de eluição dos oligossacáridos obtidos a partir da amostra EPO de controlo (K) reteve o padrão esperado (comparar perfil na Figura 6). Para comparação, está incluído o perfil dos oligossacáridos nativos da norma internacional BRP-EPO e como referência.
Após uma hidrólise com ácido suave, todos os oligossacáridos e preparações mostraram um perfil de eluição idêntico de estruturas de oligossacáridos neutros (ver Figuras 14) com a esperada composição quantitativa e qualitativa de cadeias de hidrato de carbono do tipo complexo, conforme descrito nos métodos para preparação EPO e que foi utilizado como material de partida no presente estudo. Este resultado demonstra que a modificação em HES da amostra EPO resulta numa ligação covalente dos derivados HES, e que é separada da proteína EPO por N-glicosidase e é lábil de ácido, uma vez que é removido dos N-glicanos por meio de um tratamento com ácido suave conhecido dos hidratos de carbono dessialilados(ver Figuras 12a+b).
(cc) Análise composicional de monossacárido de HES-EPO e N-glicanos HES-EPO por GC-MS
No sentido de confirmar a modificação em HES de EPO nos N-glicanos da molécula, as amostras EPO foram digeridas com N-glicosidase e a proteína EPO foi adsorvida nos cartuchos RP-C18, enquanto que o material de oligossacárido foi lavado conforme já descrito. De acordo com o Quadro 3, foram detectados glucose e os derivados de glucose 111 hidroxietilada apenas na proteína EPO, que foi sujeita a uma modificação em HES em resíduos de cisteína e em fracções de oligossacáridos da amostra A2 EPO.
Exemplo 7.11(d)Ensaio in-vivo da actividade biológica de EPO modificada em HES 0 ensaios de bioanálise EPO no sistema normocitémico dos ratinhos indica que foi levado a cabo de acordo com os procedimentos descritos em European Pharmacopeia; o laboratório que o realizou utilizou a preparação conforme a norma internacional BRP EPO. Para a EPO modificada em HES. Foi determinada uma preparação de um valor médio para a actividade específica de 294 600 unidades por mg EPO de proteína, justificando uma actividade específica aproximadamente 3 vezes maior quando comparada com a norma internacional BRP que foi incluída nas amostras enviadas para os ensaios da actividade.
Os resultados do estudo encontram-se resumidos no quadro 3. Bibliografia:
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Quadro 1
Abre Nome químico Tip viat o ura
éster N-(a-AMAS Maleimidoacetox E i) succinimida
hidrazida Ν-(β-BMPH Maleimidopropió A nico ácido) TFA 113
113 BMPS éster N- (β-Maleimidopropil
E oxi) succinimida hidrazida N-(e-Maleimidocaprói A co ácido)
EMC Η
EMCS éster N-(ε- Maleimidocaproi loxi) succinimida
E
GMBS éster Ν-γ-
Maleimidobutiri loxi- succinimida
E
KMUH hidrazida N-(k-Maleimidoundeca A nóico ácido)
RH,
LC- SMCC 4- (N- maleimidometil) ciclohexane-1-
E carboxi- (6- amido-caproato)
Succinimidilo
114
114 LC- SPDP 6 — (3 ' — [ 2 — piridil- ditio]propionam F ido) hexanoato Succinimidilo
MBS éster m- Maleimidobenzoi 1-N- E hidroxisuccinim ida
M2C2H 4- (N- Maleimidometil) -ciclohexane-1- A carboxil-hidrazida HC-1/2 dioxano
Hidrazida ácido
MPBH 4- (4 —N— Maleimidofenil -butírico -HCl
A er%i
SATA
SATP acetato de N-Succinimidil S-H acetiltio propionato de N-Succinimidil H S-acetiltio
115 SBAP propionato de succinimidil 3-(bromoacetamido ) tf . ®
Bf
SIA iodoacetato de N-Succinimidilo
STAB N-
Succinimidil(4-iodoacetil)amin obenzoato
SMCC 4- (N- maleimidometil) ciclohexane-1- E carboxilato Succinimidilo
SMPB 4- (p- mueimidofenil)b utirato succinimidil
SMPH
Succinimidil-6- (β- maleimidopropio E namido) hexanoato
4- 116
Succinimidiloxi -carbonil-
SMPT F metil-a- (2- piridilditio)to lueno N-
Succinimidil3-SPDP (2- F piridilditio)pr opionato éster N- (ε-
Sulf Maleimidocaproi o- loxi) E EMCS sulfosuccinimid a éster Ν-γ-
Sulf Maleimidobutril o- oxi- E GMBS sulfosuccinimid a éster N- (k-
Sulf Maleimidoundeca o- noiloxi)- E KMUS sulfosuccinimid
§
n ’
n 3. 117 6 — (3 ' — [ 2 — K*’r *
Sulf piridilditio]pr o- opionamido)
F LC- hexanoato SPDP sulfosuccinimid ilo éster m-
Sulf Maieimtdobenzoi
o- 1-N- E MBS hidroxisulfossu ccmimida (4-
Sulf iodoacetil)amin «*» Λ" 'L o- obenzoato de C γ SIAB sulfosuccinimid il Sulfosuccinimid Sulf il4- (N- i**>r Ú & | 0- maleimidometil) E ê* V SMCC ciclohexane-1- carboxilato Sulf o- SMPB Sulfosuccinimid il4- (p- E maleimidofenil) butirato **Ό· V | MN »** ' & 118 6- (a-metil-a-[2-
Sulf
piridilditio]-o-
toluamido)hexan F LC- oato de
SMPT suflosuccinimid ilo N-Succinimidil- (4-
SVSB G vinilsulfonil)b enzoato
Quadro 2
Análise composicional de monossacáridos dos glicanos de HES-EPO modificada e amostras de controlo VI. II. IV. Protein I III. III. V. glican glicin a EPO **Monossacár glican glican glicin glican os de as de modific idos os de os de as de os de EPO- EPO- ada Az K2 A2 K2 GT-1A GT-1A cistein a* fucose 1,935 3,924 2,602 2,246 4,461 2,601 2,181 mannose 6,028 11,0209,198 6,379 11,6686,117 6,260 galactose 8,886 19, 935 14,427 10,570 16, 911 11,555 10,386 119 119 glucose 17,968 --- --- 21,193 trace trace 33,021 GlcNAc 7,839 21,310 14,440 11, 360 15, 953 10,503 10, 498 GlcHel 5,583 5,926 — 14,857 GlcHe2 1,380 1,552 — 3,775 NeuNAc 5,461 822 4,504 3,895 4,871 13,562 13,003 inositol 1,230 2,310 1, 620 2,050 1,320 1,134 1,087 * o equivalente da proteína EPO modificada Cys-HES foi sujeito a análise composicional; a proteína EPO foi isolada da mistura de incubação EPO por cromatografia numa coluna de Q Sepharose, como anteriormente descrito e foi dessalinizada por centrifugação utilizando um dispositivo de separação 5 Vivaspin. ** As determinações de monossacáridos foram efectuadas a partir de passagens GC únicas dis inetilglicósidos pertrimetillililados; os valores da integração electrónica dos picos são indicados sem correcção de perdas durante o processo de derivatização ecuperações de cada composto.
Quadro 3
Amostra Descrição n° amostra
Actividade específica calculada da da amostra EPO (com base em determinação A280 e RP-HPLC) 120 850247 850248 850249 850250 850251 850252 850253 850254 1. HES-EPO A2 344,000 U/mg modificada 2. EPO-GT-l-A 82,268 U/mg 3. EPO K2 controlo 121,410 U/mg 4. BRP EPO padrão 86,702 U/mg
1. Diluído com 4 volume de PBS 309,129 U/mg
2. Diluído com 4 volume de PUBS 94,500 U/mg
3. Diluído com 4 volume de PBS 114,100 U/mg
4. Diluído com 4 volume de PBS 81,200 U/mg 1. Diluído com 4 850255
volume de PBS 230,720 U/mg 121
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO A lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • DE 2616086 [0005] • WO 9428024 A [0008] • WO 02080979 A2 [0011] • WO 03074087 A, Thomas [0013] • EP 640619 BI [0136] [0138] [0140] • EP 668351 BI [0138] • EP 148605 B2 [0139] • EP 428267 BI [0140] [0221]
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Lisboa, 11/02/2010

Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de um derivado de hidroxialquil amido, compreendendo a reacção de hidroxialquil amido da fórmula (I)
no seu terminal redutor, que não é oxidado antes da reacção mencionada, com um composto da fórmula (II) R'-NH-R" (II) em que Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou um grupo hidroxialquil de cadeia linear ou ramificada e em que R' ou R'' ou R' e R'' incluem pelo menos um grupo funcional X, capaz de ser submetido a uma reacção com pelo menos um composto adicional antes ou após a reacção de (I) e (II) e em que se faz reagir o composto (II) através do grupo NH ligando R' e R'' com o composto (I) no seu terminal redutor que não é oxidado e - em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é submetido a uma reacção com um grupo funcional Y de um outro composto, através de pelo menos um grupo funcional X e o pelo menos um composto adicional é um polipeptideo ou 2 - em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é submetido a uma reacção com um outro composto através do pelo menos um grupo funcional X e o pelo menos um composto adicional é um composto reticulante e o produto da reacção com o composto reticulante é submetido a uma reacção com um grupo funcional Y de um segundo composto adicional e o segundo composto adicional é um polipeptídeo; com a condição de que se o produto da reacção do composto (I) e composto (II) for submetido a uma reacção com um grupo funcional Y de um composto adicional, através do pelo menos um grupo funcional X e o pelo menos um composto adicional é um polipeptídeo, o composto da fórmula (II) não é BMPH (hidrazida do N-(ácido beta-maleimidopropiónico) TFA); EMCA (hidrazida do N-(ácido épsilon-maleimido-capróico)), KMUH (hidrazida do N-(ácido kappa-maleimidoundecanóico)), M2C2H (4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxil-hidrazida HC1), MPBH (hidrazida do ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico HC1), PDPH (3-(2-piridil-ditio)-propionilhidrazida).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo funcional Y é 3 3
OH ou uma fracção hidrato de carbono que pode ser ligada ao polipeptideo por N-glicosilação ou O-glicosilação.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o hidroxialquil amido é hidroxietil amido.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que Ri, R2 e R3 são independentemente hidrogénio ou um grupo 2-hidroxietilo.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que R' é hidrogénio ou um alquilo ou grupo alcoxi de cadeia linear ou ramificada, de preferência hidrogénio ou um grupo metilo ou metoxi.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que à parte do grupo funcional X, R'' inclui pelo menos um grupo funcional W adicional, que está directamente ligado ao grupo NH ligando R' e R'', sendo o grupo funcional W seleccionado do grupo constituído por 4 Η
Ο II N-S-Η II Ο e
G em que G é Ο ou S e, se estiver presente duas vezes, G é independentemente O ou S.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que, se R' for H, R' e o grupo NH ligando R' e R'' formam conjuntamente com W um dos seguintes grupos: HjN H2N O . II N-S-H II O Η H H.N YY x Y G JI g H.N YY x Y G H G
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o pelo menos um grupo funcional X é seleccionado do grupo constituído por -SH, - NH2, -0-NH2, -NH-O-alquilo, - (C=G)-NH-NH2, -G-(C=G)-NH-NH2, -NH-(C=G)-NH-NH2 e -S02-NH-NH2, em que G é 0 ou S e, se G estiver presente duas vezes, é independentemente 0 ou S. 5
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 8, em que o composto de acordo com a fórmula (II) é 0-[2-(2-aminooxi-etoxi)-etil]-hidroxilamina ou carbo-hidrazida.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 9, em que a reacção do composto (I) e composto (II), sendo o composto (II) uma hidroxilamina ou um hidrazida, é efectuada a uma temperatura entre 5e45°CeaumpH entre 4,5 e 6,5 num meio aquoso.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 9, em que a reacção do composto (I) e composto (II), sendo a reacção mencionada uma aminação redutiva, é efectuada a uma temperatura entre 25 e 90 °C e a um pH entre 8 e 12 num meio aquoso.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, em que o produto da reacção do composto (I) e composto (II) é submetido a uma reacção com um composto adicional através de pelo menos um grupo funcional X, sendo o composto adicional um polipeptideo, de preferência eritropoietina e em que o pelo menos um composto adicional é submetido a uma reacção através de um grupo tio ou uma fracção hidrato de carbono oxidada, compreendida no pelo menos um composto adicional. 6
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a reacção é efectuada a uma temperatura entre 4 e 37 °C e/ou num meio aquoso.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o segundo composto adicional é submetido a uma reacção através de um grupo tio ou uma fracção hidrato de carbono oxidada no pelo menos um composto adicional.
15. Derivado de hidroxialquil amido obtido por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, com a condição de o produto da reacção do composto da fórmula (II) e o composto adicional que possui um grupo funcional Y e que é um polipeptídeo não ser insulina.
16. Derivado de hidroxialquil amido de acordo com a reivindicação 15, em que o derivado mencionado tem uma constituição de acordo com a fórmula (Illa)
/ i \ R* R" H HAS (Ma)
17. Derivado de hidroxialquil amido de acordo com a reivindicação 15, em que R' é hidrogénio e em que o derivado é um composto da fórmula (Illa) ou um composto da 7 fórmula (Illb) ou uma mistura de compostos das fórmulas (Illa) e (Illb) HAS'
(Illa) (Illb)
18. Composição farmacêutica que compreende um derivado de hidroxialquil amido de acordo com a reivindicação 15 numa quantidade terapeuticamente eficaz
19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, em que o polipeptídeo, de preferência eritropoietina, é submetido a uma reacção com o produto da reacção do composto (I) e composto (II) através de uma fracção hidrato de carbono oxidada, contida no polipeptídeo.
20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, em que o hidroxietil amido é submetido a uma reacção num meio aquoso com um composto de acordo com a seguinte fórmula h2n .0 NHj e o produto da reacção é submetido a uma reacção com eritropoietina.
21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, em que a eritropoietina é oxidada com periodato de sódio antes da reacção.
22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, em que a eritropoietina é parcialmente dessialilada e depois oxidada com periodato de sódio antes da reacção. Lisboa, 11/02/2010
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