MXPA05002594A - Derivados de polipeptidos con hidroxialquilalmidon, especialmente derivados de eritropoyetina con hidroxialquilalmidon. - Google Patents

Derivados de polipeptidos con hidroxialquilalmidon, especialmente derivados de eritropoyetina con hidroxialquilalmidon.

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Abstract

La presente invencion se refiere a un conjugado (HAS-polipeptido) de hidroxialquilalmidon (HAS)-polipeptido que comprende una o mas moleculas de HAS, en donde cada HAS se conjuga con el polipeptido mediante un radical carbohidratado o un tioeter asi como a metodos par ala produccion del mismo. En una modalidad preferida, el polipeptido es eritropoyectina (EPO).

Description

DERIVADOS DE POLIPEPTIDOS CON HIDROXIALQUILALMIDON, ESPECIALMENTE DERIVADOS DE ERITROPOYETINA CON HIDROXIALQUILALMIDON DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polipéptidos, especialmente a la eritropoyetina conjugada con hidroxialquilalmidón (HAS) , especialmente con hidroxieti1almidón . La aplicación de polipéptidos, especialmente enzimas o citocinas, al sistema circulatorio para obtener un efecto fisiológico particular, es una herramienta bien conocida en la medicina moderna. La eritropoyetina (EPO) es una hormona de glicoprotelna necesaria para la maduración de las células progenitoras eritroides en eritrocitos. En los adultos humanos, se produce en el riñon. La EPO es esencial para regular el nivel de glóbulos rojos en la circulación. Las enfermedades marcadas por bajos niveles de oxígeno tisular provocan una biosíntesis elevada de la EPO, que a su vez estimula la eritropoiesis . La pérdida de la función del riñon como puede verse en la deficiencia renal crónica, por ejemplo, da por resultado normalmente una biosíntesis baja de la EPO y una reducción concomitante en los glóbulos rojos. La eritropoyetina es una hormona de glicoproteína Ref. 162382 acida de aproximadamente 34,000 Da. La eritropoyetina humana es un polipéptido de 166 aminoácidos que existe en forma natural como monómero . (Lin y colaboradores, 1985, PNAS 82, 7580-7584, EP 148 605 B2 , EP 411 678 B2) . La identificación, clonación y expresión de los genes que codifican la eritropoyetina se describen, por ejemplo en la Patente Estadounidense No. 4,703,008. La purificación de la eritropoyetina recombinante a partir del medio de cultivo celular que soporta el desarrollo de las células mamíferas que contienen los plásmidos de eritropoyetina recombinante, por ejemplo, se describe en la Patente Estadounidense No. 4, 667, 016. Se cree, en general, en este campo técnico, que la actividad biológica de la EPO in vivo depende principalmente del grado de ácidos siálicos ligados a la EPO (ver por ejemplo, EP 428 267 Bl) . Teóricamente, 14 moléculas de ácido siálico se pueden, ligar a una molécula EPO en los extremos terminales de las cadenas Laterales carbohidratadas enlazadas a los sitios de N- y O- glicosilación. A fin de obtener preparaciones de EPO muy sialiladas, son necesarias etapas de purificación muy sofisticadas. Para mayor información detallada sobre la eritropoyetina, ver Krantz, Erythropoietin, 1991, Blood, 77 (3) :419-34 (Review) y Cerami, Beyond erythropoiesis : novel applications for recombinant human erythropoietin, 2001, Semin Hematol , (3 Suppl 7) :33-9 (Review) . Un problema bien conocido con la aplicación de los polipéptidos y las enzimas es que las proteínas con frecuencia exhiben una estabilidad insatisfactoria . Especialmente, la eritropoyetina tiene un plasma con término medio de vida relativamente corto (Spivak and Hogans, 1989, Blood 73, 90; cMahon y colaboradores, 1990, Blood 76, 1718) . Esto significa que los niveles de plasma terapéuticos se pierden rápidamente y se deben llevar a cabo repetidas administraciones intravenosas. Además, en ciertas circunstancias se observa una respuesta inmune contra los péptidos . En general, se acepta que la estabilidad de los polipéptidos pueda mejorarse y la respuesta inmune contra estos polipéptidos se reduzca cuando los polipéptidos se acoplen a las moléculas poliméricas. La Patente O 94/28024 describe que los polipéptidos fisiológicamente activos modificados con polietilenglicol (PEG) exhiben una baja inmunogenicidad y antigenicidad y circulan en la corriente sanguínea un tiempo considerablemente mayor que las proteínas sin conjugar, es decir tienen un promedio de depuración más largo . Sin embargo, los conjugados de fármaco-PEG exhiben diversas desventajas, por ejemplo, no muestran una estructura natural que pueda ser reconocida por los elementos de las rutas de degradación in vivo. Por lo tanto, a parte de los conjugados-PEG, se han producido otros conjugados y polimeratos de proteína. Se han descrito en la literatura, una pluralidad de métodos para la reticulación de diferentes proteínas y macromoléculas tales como la polimerasa, (ver por ejemplo ong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, 1993, CRCS, Inc.) El hidroxietilalmidón (HES) es un derivado de la amilopectina que se produce en forma natural y se degrada por la a-amilasa en el cuerpo. La preparación de los conjugados de proteínas de HES se describe en la técnica (ver, por ejemplo HES-hemoglobin-conjugates en DE 26 16 086 o DE 26 46 854). La DE 26 46 854 describe los métodos para la conjugación de hemoglobina con HES. En estos métodos, el HES se hace reaccionar con peryodato sódico, que da por resultado la producción de dialdehídos que se enlazan a la hemoglobina. Por el contrario, la DE 26 16 086 describe la conjugación de hemoglobina a HES de acuerdo con un procedimiento en donde primero un agente de reticulación (por ejemplo bromociano) se liga a HES y subsiguientemente la hemoglobina se enlaza al producto intermediario. HES es un derivado sustituido de la amilopectina polimérica carbohidratada, que está presente en el almidón de maíz a una concentración de hasta 95% en peso. HES exhibe propiedades biológicas ventajosas y se utiliza como agente de reemplazo del volumen sanguíneo y en la terapia de hemodilución en medicina clínica (Sommermeyer y colaboradores, 1987, Krankenhauspharmazie , 8(8), 271-278; y Weidler y colaboradores, 1991, Arzneim. -Forschung/Drug Res., 41, 494-498) . La amilopectina consiste de porciones de glucosa, en donde la principal cadena está presente en los enlaces a-1 , 4-glicosídicos y en los sitios de ramificación se hallan los enlaces a-1 , 6-glicosídicos . Las propiedades fisicoquímicas de esta molécula se determinan principalmente mediante el tipo de enlaces glicosídicos . Debido al enlace <x-l,4-glicosídico cortado, se producen estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por vez. Las propiedades físico-químicas como las bioquímicas del polímero se pueden modificar medíante sustitución. La introducción de un grupo hidroxietilo puede lograrse mediante la hidroxietilación alcalina. Al adaptar las condiciones de reacción es posible explotar la diferente reactividad del grupo hidroxi respectivo en el monómero de glucosa no sustituido con respecto a una hidroxietilación. Debido a este hecho, el experto puede influir en el patrón de sustitución hasta un grado limitado. En consecuencia, HES se caracteriza principalmente por la distribución del peso molecular y el grado de sustitución. Existen dos posibilidades de describir el grado de sustitución: 1. El grado de sustitución puede estar descrito en relación a la porción de monomeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los radicales de glucosa (DS) . 2. El grado de sustitución puede describirse como la "sustitución molar" (MS) , en donde se describe la cantidad de grupos hidroxietilo por radical de glucosa. Las soluciones de HES están presentes como composiciones polidispersas, en donde cada molécula difiere de la otra con respecto al grado de polimerización, a la cantidad y patrón de sitios de ramificación y el patrón de sustitución. HES es por lo tanto una mezcla de compuestos con diferentes pesos moleculares. En consecuencia, una solución de HES particular se determina mediante el peso molecular promedio con la ayuda de medios estadísticos. En este contexto, Mn se calcula como el promedio aritmético que depende de la cantidad de moléculas. Alternativamente, Mw, el peso promedio, representa una unidad que depende de la masa del HES . Los conjugados de fármacos de HES descritos en la técnica sufren de la desventaja que HES no está conjugado específicamente en el sitio del fármaco. En consecuencia, la conjugación da por resultado un producto muy heterogéneo que tiene muchos componentes que pueden ser inactivos debido a la destrucción de la estructura tridimensional durante la etapa de conjugación. En resumen, existe todavía una necesidad de otros polipéptidos mejorados con estabilidad y/o bioactividad mejorada. Esto aplica especialmente a la eritropoyetina donde las isoformas con elevado grado de ácidos siálicos y por lo tanto elevada actividad, deben ser purificadas a partir de isoformas con un bajo grado de ácidos siálicos (ver EP 428 267 Bl) . Por lo tanto, sería muy ventajoso si estuvieran disponibles métodos de producción que provean polipéptidos muy activos sin la necesidad de una extensa purificación. Desafortunadamente, la producción de polipéptidos en células de bacterias o insectos, es con frecuencia difícil, dado que los polipéptidos no se producen en una conformación natural plegada adecuadamente y carecen de glicosilación adecuada. En consecuencia, es un objetivo de la presente invención proveer derivados de polipéptidos, especialmente derivados de eritropoyetina, que tienen una actividad biológica elevada in vivo que puede producirse fácilmente y a costos reducidos. Además, es otro objetivo de la presente invención proveer un método para la producción de derivados de polipéptidos que sea fácil de realizar y brinde productos con elevada actividad biológica. Es otro objetivo de la invención proveer composiciones farmacéuticas que comprendan derivados polipéptidos con elevada actividad biológica. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el problema se resuelve mediante un conjugado (HAS-EPO) de eritropoyetina (EPO) e hidroxialquilalmidón (HAS) que comprende una o más moléculas HAS, en donde cada HAS se conjuga a la EPO mediante a) un radical carbohidratado; o b) un tioéter. El HAS-EPO de la invención tiene la ventaja de que exhibe una estabilidad biológica mejorada cuando se compara con la eritropoyetina antes de la conjugación. Además, exhibe una actividad biológica más alta que la BRP EPO estándar. Esto se debe principalmente al hecho de que el HAS-EPO es menos reconocido o aún nada reconocido por los sistemas de eliminación del hígado y riñon y por lo tanto persiste en el sistema circulatorio durante un período de tiempo más largo. Además, dado que HAS se une específicamente al sitio, el riesgo de destruir la actividad biológica in vivo de la EPO por conjugación de HAS se minimiza . El HAS-EPO de la invención tiene principalmente dos componentes, es decir, la eritropoyetina (EPO) -polipéptido e hidroxialquilalmidón (HAS) unido a la misma. La EPO puede ser de cualquier fuente humana (ver por ejemplo, Inoue, Wada, Takeuchi , 1994, An improved method for the purification of human erythropoietin with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol . Pharm Bull. 17(2), 180-4; Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythropoietin, J. Biol. Chem. , 252 (15), 5558-64) u otra fuente mamífera y puede obtenerse mediante purificación de fuentes que se producen en forma natural como el hígado humano, hígado humano embriónico o hígado animal, preferiblemente del mono. Además, la expresión "eritropoyetina" o "EPO" abarca también una variante de EPO en donde uno o más aminoácidos (por ejemplo 1 a 25, preferiblemente 1 a 10, más preferiblemente 1 a 5, mayormente preferido 1 ó 2) han sido intercambiados por otro aminoácido y que exhibe actividad de eritropoyetina (ver por ejemplo EP 640 619 Bl) . La medición de la actividad de la eritropoyetina se describe en la técnica (para la medición de la actividad in vitro ver por ejemplo Fibi y colaboradores, 1991, Blood, 77, 1203 ff; Kitamura y colaboradores, 1989, J. Cell Phys . 140, 323-334; para la medición de la actividad de la EPO in vivo ver Ph. Eu . 2001, 911-917; Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietin solutio concentrata, 780-785; European Pharmacopoiea (1996/2000); European Pharmacopoiea, 1996, Erythropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa, 8, 371-377; Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl . , 1995, N-and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85(5), 1229-36; (EPO and modified EPO forms were injected into female MRI mice (egual amounts of protein 50 ng/mouse) at day 1, 2 and 3 blood samples were taken at day 4 and reticulocytes were determined) ) . Otras publicaciones donde aparecen los ensayos para la medición de la actividad de la EPO son Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reculocytes measureraents as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4), 515-22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferring receptor and erythropoietin concentrations , with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(1), 151-5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin, Biochemistry, 31(41), 9871-6; Higuchi, Oh-eda, uboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992; Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol . Chem. 267(11), 7703-9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties, J. Biol. Chem., 266(30, 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shmizu, Hoshi, Kozutsumi , Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chínese hámster ovary cells, Proc. Natl . Acad. Sci. USA (85(20), 7819-22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythropoietin, Nephron, 51 (1) , 11-4 (Germán) ; Zucali, Sulko ski, 1985, Purification of human urinary erythropoietin on controlled-pore glass and silicio acid, Exp. Hematol., 13(3), 833-7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythropoietin enhancing factor (EEF) , a late acting erythropoetic stimulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol., 11(1), 18-31. Preferiblemente, la EPO se produce en forma recombinante . Esto incluye la producción de células eucarióticas y procarióticas , preferiblemente células de mamíferos, insectos, levadura, bacterias o en cualquier otro tipo de célula que sea conveniente para la producción recombinante de la EPO. Además, la EPO puede expresarse en animales transgénicos (por ejemplo, en fluidos corporales como leche, sangre, etc.), en huevos de pájaros transgénicos, especialmente aves de corral, se prefiere el pollo, o en las plantas transgénicas . La producción recombinante de un polipéptido se conoce en la técnica. En general, esto incluye la transfección de células huésped con un vector de expresión apropiado, el cultivo de las células huésped en condiciones que permiten la producción del polipéptido y la purificación del polipéptido a partir de las células huésped. Para información detallada ver por ejemplo Krytal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogenity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, ojchowski, 1989, High^level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 Bl y EP 668 351 Bl . En una modalidad preferida, la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana (ver EP 148 605 B2) . La EPO puede comprender una o más cadenas laterales carbohidratadas (preferiblemente 1-4, preferiblemente 4) unidas a EPO mediante glicosilación N- y/o O-enlazada, es decir la EPO está glicosilada. Usualmente, cuando la EPO se produce en células eucarióticas , el polipéptido es glicosilado en forma postranslacional . En consecuencia, las cadenas laterales carbohidratadas pueden haber estado unidas a la EPO durante la biosíntesis en células de mamíferos, especialmente humanas, de insectos o de levadura. La estructura y propiedades de la EPO glicosilada se han estudiado extensamente en la técnica (ver EP 428 267 Bl ; Ep 640 619 Bl; Rush, Derby, Smith, erry, Rogers , Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure, Anal Chem. , 67(8) , 1442-52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietin, Glycobiology, 1(4), 337-46 (Review) . El HAS puede estar directamente conjugado a la EPO o, alternativamente, mediante una molécula enlazante. La naturaleza de la molécula enlazante depende de la forma en que el HAS se enlaza a la EPO. Los grupos funcionales posibles de enlazantes se describen en la Tabla 1 y a continuación. Los diversos enlazantes están disponibles en el mercado (por ejemplo de Pierce, de Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) . Algunos enlazantes adecuados se describen en la Tabla 2. La naturaleza del enlazante y su finalidad se describen en detalle a continuación en la sección referente al método para la producción de HES-EPO. De acuerdo con una modalidad preferida del conjugado HAS-EPO de la invención, HAS se conjuga a la EPO mediante un radical carbohidratado . En el contexto de la presente invención, el término "radical carbohidratado" se refiere a hidroxialdehxdos o idroxicetonas como también a modificaciones químicas de los mismos (ver Rómpp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Alemania, 9a ed. 1990, Volumen 9, págs 2281-2285 y la literatura citada en la misma) . Además, se refiere a los derivados de radicales carbohidratados que se producen en forma natural como la glucosa, galactosa, mañosa, ácido siálico y similares. El término también incluye radicales carbohidratados que se producen en forma natural oxidados químicamente en donde la estructura del anillo ha sido abierta . El radical carbohidratado puede estar enlazado directamente a la cadena principal polipéptida de la EPO. Preferiblemente, el radical carbohidratado es parte de una cadena lateral carbohidratada . En este caso, otros radicales carbohidratados pueden estar presentes entre el radical carbohidratado al cual está enlazado HAS y la cadena principal polipéptida de la EPO. Más preferiblemente, el radical carbohidratado es el radical terminal de la cadena lateral carbohidratada. En una modalidad más preferida, el HAS se conjuga con un residuo de galactosa de las cadenas laterales carbohidratadas , preferiblemente el residuo de galactosa terminal de la- cadena lateral carbohidratada.' Este residuo de galactosa puede estar disponible para la conjugación por la eliminación de ácidos siálicos terminales, seguido de oxidación (ver a continuación) . En otra modalidad más preferida, el HAS se conjuga con un residuo de ácido siálico de las cadenas laterales carbohidratadas, preferiblemente el residuo de ácido siálico de la cadena lateral carbohidratada. Además, el HAS puede conjugarse a la EPO mediante un tioéter. Como se explica en detalle debajo, el átomo S puede derivarse de cualquier grupo SH unido a la EPO, producido en forma natural o no natural . En una modalidad preferida, el átomo S puede derivarse de un grupo SH que ha sido introducido en un radical carbohidratado oxidado de HES, preferiblemente un radical carbohidratado oxidado que es parte de una cadena lateral carbohidratada de la EPO (ver a continuación) . Preferiblemente, el átomo S en el tioéter se deriva de una cisterna que se produce en forma natural o de una cisteína agregada. Más preferiblemente, la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana y las cisternas que se producen en forma natural son la cisteína 29 y/o 33. En una modalidad más preferida, el HAS se conjuga a la cisteína 29 y la cisteína 33 se reemplaza por otro aminoácido. Alternativamente, el HAS puede conjugarse a la cisteína 33 y la cisteína 29 se reemplaza por otro aminoácido. En el contexto de la presente invención, el término "cisteínas agregadas" significa que los polipéptidos , preferiblemente la EPO, comprenden un residuo de cisteína que no está presente en el polipéptido de tipo silvestre. En el contexto de este aspecto de la invención, la cisteína puede ser un aminoácido adicional agregado al extremo N- o C-terminal de la EPO. Además, la cisteína agregada puede haber sido agregada reemplazando un aminoácido que se produce en forma natural por una cisteína. Los métodos adecuados se conocen en la técnica (ver anterior) . Preferiblemente, en el contexto de este aspecto de la invención, la EPO es la EPO humana y el residuo de aminoácidos reemplazado es serina 126. El segundo componente del HAS-EPO es el hidroxialquilalmidón (HAS) . En el contexto de la presente invención, el término "hidroxialquilalmidón" se utiliza para indicar los derivados de almidón que han sido sustituidos por los grupos hidroxialquilo . En este contexto, el grupo alquilo puede estar sustituido. Preferiblemente, el hidroxialquilo contiene de 2-10 átomos de carbono, más preferiblemente 2-4 átomos de carbono. "Hidroxialquilalmidón" por lo tanto, preferiblemente, comprende hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón, en donde el hidroxietilalmidón y el hidroxipropilalmidón son los preferidos . El grupo o grupos hidroxialquilo de HAS contiene (n) al menos un grupo OH. La expresión "hidroxialquilalmidón" también incluye los derivados en donde el grupo alquilo es mono o polisustituido . En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo, siempre que el HAS permanezca soluble en agua. Además, el grupo idroxi terminal de hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado. Además, el grupo alquilo del hidroxialquilalmidón puede ser lineal o ramificado . Además, en lugar de alquilo, también se pueden utilizar grupos alqueno sustituidos o no sustituidos lineales o ramificados. El hidroxietilalmidón (HES) es el más preferido para todas las modalidades de la presente invención. En el contexto de la presente invención, el hidroxietilalmidón puede tener un peso molecular promedio (peso promedio) de 1-300 kDa, en donde un peso molecular promedio de 5-100 kDa es el más preferido. El hidroxietilalmidón también puede exhibir un grado molar de sustitución de 0.1 a 0.8 y una relación entre sustitución C2 : C6 en el intervalo de 2-20, con respecto a los grupos hidroxietilo . El HAS-EPO puede comprender 1-12, preferiblemente 1-9, 1-6 ó 1-3, con preferencia de 1-4 moléculas de HAS por molécula de EPO. La cantidad de moléculas de HAS por molécula de EPO puede determinarse mediante el análisis composicional de carbohidratos cuantitativo utilizando GC-?? después de la hidrólisis del producto y la derivación de los monosacáridos resultantes (ver Chaplin y Kennedy (eds.), 1986, Carbohydrate Análisis: a practical approach, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3) , especialmente el Capítulo 1, Monosaccharides , págs . 1-36; Capítulo 2, Oligosaccharides , págs . 37-53, Capítulo 3, Neutral Polysaccharides , págs. 55-96). El conjugado de HAS-EPO de la invención puede exhibir esencialmente la misma actividad biológica in vivo como EPO natural recombinante, dado que la actividad biológica in-vitro sólo mide la afinidad de enlace al receptor de la EPO. Los métodos para determinar la actividad biológica in-vitro se conocen en la técnica (ver anterior) . Además, el HAS-EPO exhibe una actividad in vivo mayor que la EPO utilizada como material de inicio para la conjugación (EPO sin conjugar) . Los métodos para determinar la actividad biológica in vivo se conocen en la técnica (ver anterior) . Además, los ensayos para la determinación de la actividad de la EPO in vivo e in vitro se dan en los Ejemplos 9 y 10. El conjugado HAS-EPO puede exhibir una actividad in vivo de 110 a 500%, preferiblemente 300 a 400%, o 110 a 300%, preferiblemente 110% a 200%, más preferiblemente 110% a 180% o 110% a 150%, el más preferido es 110% a 140%, si la actividad in vivo de la EPO sin conjugar se establece como el 100%. En comparación con la EPO muy sialilada de Amgen (ver EP 428 267 Bl) , el HAS-EPO exhibe preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 85% o al menos 95%, al menos 150%, al menos 200% o al menos 300% de la actividad in vivo de la EPO muy sialilada, si la actividad in vivo de la EPO muy sialilada se establece como 100%. Se prefiere que exhiba al menos 95% de la actividad in vivo de la EPO muy sililada. La elevada actividad biológica in vivo del conjugado HAS-EPO de la invención resulta principalmente del hecho de que el conjugado HAS-EPO permanece más tiempo en la circulación que la EPO no conjugada, dado que es menos reconocida por los sistemas de eliminación del hígado y dado que se reduce la depuración renal debido al peso molecular más alto. Los métodos para la determinación del tiempo de vida medio in vivo de la EPO en la circulación se conocen en la técnica (Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity, Proc. Nati, Acad. Sci . (95(3), 1184-8). En consecuencia, es una gran ventaja de la presente invención que se provea un HAS-EPO que pueda ser administrado en forma menos frecuente que las preparaciones de EPO disponibles en el mercado en la actualidad. Si bien las preparaciones de EPO estándar deben ser administradas al menos los 3 días, el conjugado HAS-EPO de la invención se administra preferiblemente dos veces a la semana, más preferiblemente una vez a la semana.
Todas las modalidades descritas a continuación con respecto al método de la invención para producir un HAS-EPO con las propiedades de la EPO o HAS, se aplican también al conjugado HAS-EPO de la invención. El hidroxialquilalmidón es un derivado éter del almidón. Además de tales derivados de éter, también se pueden utilizar otros derivados de almidón en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, los derivados que son útiles comprenden los grupos hidroxi esterificados . Estos derivados pueden ser por ejemplo derivados de ácidos mono o di-carboxílicos no sustituidos con 2-12 átomos de carbono o de derivados sustituidos de los mismos. Especialmente útiles son los derivados de los ácidos monocarboxílieos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente de ácido acético. En este contexto, se prefieren el acetilalmidón, butilalmidón o propilalmidón. Además, se prefieren los derivados de los ácidos dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono. En el caso de los derivados de ácidos dicarboxílicos, es útil que el segundo grupo carboxi del ácido dicarboxílico también sea esterificado . Además, los derivados de los monoalquilésteres de los ácidos dicarboxílicos son también apropiados en el contexto de la presente invención. Para los ácidos mono- o dicarboxílicos sustituidos, los grupos sustitutos pueden ser preferiblemente los mismos que los mencionados anteriormente para los residuos alquilo sustituidos . Las técnicas para la esterificación del almidón son conocidas en la técnica (ver por ejemplo Klemrn D. y colaboradores, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol . 2 , 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especialmente el capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9) · En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un conjugado (HAS-EPO) de hidroxialquilalmidón (HAS) -eritropoyetina (EPO) , que comprende las etapas de: a) proveer una EPO que sea capaz de reaccionar con el HAS modificado. b) proveer HAS modificado que sea capaz de reaccionar con la EPO de la etapa a) , y c) hacer reaccionar la EPO de la etapa a) con el HAS de la etapa b) , por lo cual se produce un HAS-EPO que comprende una o más moléculas HAS, en donde cada HAS se conjuga con la EPO mediante i) un radical carbohxdratado; o ii) un tioéter. El método de la invención tiene la ventaja de que se produce un conjugado HAS-EPO que exhibe una actividad biológica alta. Además, el método de la invención tiene la ventaja de que se puede producir un derivado de la EPO efectivo a costos reducidos ya que el método no comprende etapas de purificación extensas y consumidoras de tiempo que dan por resultado un rendimiento final bajo, por ejemplo no es necesario purificar las formas de EPO poco sialilada que son conocidas por exhibir actividad biológica baja o no in-vivo. Especialmente el Ejemplo 20 demuestra que un HAS-EPO producido con pocas etapas de modificaciones exhibe una actividad tres veces por sobre la BRP EPO estándar. En consecuencia, en la primera etapa del método de la invención, se provee una EPO que es capaz de reaccionar con el HAS modificado. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "proveer" debe interpretarse en el sentido de que después de la etapa respectiva se dispone de una molécula (en la etapa a) EPO, en la etapa b) HAS) con las propiedades deseadas . En el caso de la etapa a) , ésta incluye la purificación de la EPO a partir de fuentes naturales como también la producción recombinante en las células huésped u organismos, y, si es necesario, la modificación de la EPO obtenida de esta forma. Con respecto a la EPO que es el material de inicio de la presente invención, se aplica lo mismo que para la eritropoyetina que es parte del conjugado HAS-EPO de la invención. En este contexto, las modalidades preferidas descritas anteriormente se aplican también para el método de la invención. En consecuencia, en una modalidad preferida, la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana. Preferiblemente, la EPO se produce en forma recombinante . Esto incluye la producción en células eucarióticas o procarióticas , preferiblemente las células de mamíferos, insectos, levadura, bacterias o en cualquier otro tipo de célula que es conveniente para la producción recombinante de la EPO. Además, la EPO puede expresarse en animales transgénicos (por ejemplo, en fluidos corporales como la leche, sangre, etc.), en huevos de pájaros transgénicos, especialmente aves de corral, se prefiere el pollo, o en plantas transgénicas . La producción recombinante de un polipéptido se conoce en la técnica. En general, esto incluye la transfección de células huésped con un vector de expresión apropiado, el cultivo de las células huésped en condiciones que permiten la producción del polipéptido y la purificación del polipéptido a partir de las células huésped (Cristal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, ojchowski, 1989, High-level expresión and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 Bl y EP 668 351 Bl) . La EPO puede comprender una o más cadenas laterales carbohidratadas unidas a la EPO mediante glicosilacion N~ y/o O-enlazada, es decir la EPO está glicosilada. En forma inusual, cuando se produce la EPO en células eucarióticas , el polipéptido es glicosilado en forma postranslacional . En consecuencia, las cadenas laterales carbohidratadas pueden haberse unido a la EPO durante la producción en células de mamíferos, especialmente humanas, insectos o levadura que pueden ser células de un animal transgénico (ver anterior) , o extraídas del animal o aún en el animal . Estas cadenas laterales carbohidratadas pueden haberse modificado química o enzimáticamente después de la expresión en las células apropiadas, por ejemplo eliminando o agregando uno o más radicales carbohidratados (ver por ejemplo Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt, y Schomburg eds . , GBF-Monographs , .12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge) . Es el objetivo del método de la invención, proveer un HAS-EPO que comprende una o más moléculas de HAS donde el HAS se conjuga con la EPO mediante un radical carbohidratado (i) o mediante un tioéter (ii) . En consecuencia, la EPO suministrada en la etapa a) debe tener las propiedades de modo que sea posible una conjugación mediante un radical carbohidratado y/o mediante un tioéter. Por lo tanto, la EPO después de la etapa a) puede contener preferiblemente (1) al menos un grupo reactivo enlazado, ya sea directa o mediante una molécula enlazante, a los grupos sulfuro o radicales carbohidratados , que es capaz de reaccionar con HES o HES modificado, (2) al menos un radical carbohidratado con el cual se puede conjugar HAS modificado y/o (3) al menos un grupo SH libre. Con respecto a la posibilidad (1) anterior, la EPO de la etapa a) se obtiene preferiblemente conjugando una molécula enlazante apropiada al grupo SH o a los radicales carbohidratados de la EPO. Un ejemplo para tal EPO ¦modificada se provee en el . Ejemplo 4, 2.1. Es importante asegurarse que la adición de la molécula enlazante no daña la EPO. Sin embargo, los expertos en la técnica conocen este tema . Con respecto- a la posibilidad (2) anterior, en una modalidad preferida, el HAS modificado se conjuga con la EPO mediante un radical carbohidratado. El radical carbohidratado puede estar enlazado directamente a la cadena central polipéptida de la EPO. Preferiblemente, el radical carbohidratado es parte de una cadena lateral carbohidratada. En este caso, otros radicales carbo idratados pueden estar presentes entre el radical carbohidratado al cual el HAS está enlazado y la cadena principal polipéptida de la EPO. Más preferiblemente, el radical carbohidratado es la porción terminal de la cadena lateral carbohidratada. En consecuencia, en una modalidad preferida, el HAS modificado se une (mediante un enlace o no, ver a continuación) a las cadenas carbohidratadas enlazadas a los sitios de N- y/o O-glicosilacion de la EPO. Sin embargo, también se incluye dentro de la presente invención que la EPO contiene (a) otros radicales carbohidratados con los cuales se conjuga el HAS modificado. Las técnicas para unir los radicales carbohidratados a los polipéptidos, ya sea mediante ingeniería genética o en forma enzimática, seguido de la expresión en células apropiadas, se conocen en la técnica (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett . , 203(1), 64-8; Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989 Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt, y Schomburg eds . , GBF- onographs , 12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge) . En una modalidad preferida del método de la invención, el radical carbohidratado se oxida para poder reaccionar con el HAS modificado. Esta oxidación puede llevarse a cabo ya sea química o enzimaticamente. Los métodos para la oxidación química de los radicales carbohidratados de los polipéptidos se conocen en la técnica e incluyen el tratamiento con peryodato (Chamow y colaboradores, 1992, J. Biol. Chem. , 267, 15916-15922). Mediante la oxidación química, es posible principalmente oxidar cualquier radical carbohidratado, ya sea que estén posicionados en forma terminal o no. Sin embargo, al elegir las condiciones leves (peryodato 1 mM, 0°C en oposición a condiciones rigurosas: peryodato 10 mM 1 hora a temperatura ambiente) , es posible oxidar preferiblemente el radical carbohidratado terminal, por ejemplo ácido siálico o galactosa, de una cadena lateral carbohidratada . Alternativamente, el radical carbohidratado puede oxidarse en forma enzimática. Las enzimas para la oxidación de los radicales carbohidratados individuales se conocen en la técnica, por ejemplo en el caso de galactosa, la enzima es galactosa oxidasa. Si se intenta oxidar los radicales de galactosa terminales, será necesario eventualmente eliminar los ácidos siálicos terminales (parcial o completamente) si la EPO ha sido producida en células capaces de unir los ácidos siálicos a las cadenas carbohidratadas , por ejemplo en células de mamíferos o en células que han sido modificadas genéticamente para tener la capacidad de unir los ácidos siálicos a las cadenas carbohidratadas . Los métodos químicos o enzimáticos para la eliminación de los ácidos siálicos se conocen en la técnica (Chaplin y Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, especially Chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, págs 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)). Sin embargo, también se incluye en la presente invención que el radical carbohidratado al cual el HAS modificado debe unirse, se une a la EPO dentro de la etapa a) . En el caso que se desee unir galactosa, esto puede lograrse mediante el medio de galactosiltransferas . Los métodos se conocen en la técnica (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett . , 203(1), 64-8). En una modalidad más preferida, en la etapa a) la EPO se modifica mediante la oxidación de al menos una unidad sacárida terminal, preferiblemente galactosa, de la única o más cadenas laterales carbohidratadas de la EPO, preferiblemente después de la eliminación parcial o completa (enzimática y/o química) del ácido siálico terminal, si es necesario (ver anterior) . En consecuencia, preferiblemente el HAS modificado se conjuga con la unidad sacárida terminal oxidada de la cadena carbohidratada, preferiblemente galactosa. Además, el HAS modificado puede conjugarse preferiblemente con un ácido siálico terminal, que se oxida preferiblemente en la etapa a) del método de la invención. En otra modalidad preferida (ver punto (3) anterior), la EPO comprende al menos un grupo SH libre. De acuerdo con una modalidad preferida, este grupo SH puede estar enlazado a un radical carbo idratado oxidado preferiblemente, por ejemplo utilizando un derivado de hidroxilamina , por ejemplo clorhidrato de 2- (aminooxi) etilmercaptan (Bauer L. y colaboradores, 1965, J. Org. Chem., 30, 949) o mediante el uso de un derivado de hidracida, por ejemplo hidracida de ácido tioglicólico (Whitesides y colaboradores, 1977, J. Org. Chem., 42, 332). Los métodos para conjugar estas moléculas con el radical carbohidratado oxidado de la EPO pueden ser análogos a los descritos en los Protocolos de Ejemplos 8 y 9. De acuerdo con otra modalidad preferida, el grupo SH libre es parte de una cisterna que se produce en forma natural o de una cisteína agregada. La EPO mamífera tiene diversas cisteínas que forman normalmente enlaces de disulfuro. Sin embargo, al reemplazar al menos una de las cisteínas por otro aminoácido (por ejemplo, por medios recombinantes) , es posible obtener una EPO donde al menos una de las cisteínas que se produce en forma natural comprende un grupo SH libre . Los métodos para el reemplazo de los aminoácidos se conocen en la técnica (Elliott, Lorenzini, Chang, Barzilay, Delorme, 1997, Mapping of the active site of recombinant human erythropoietin, Blood, 89(2), 493-502; Boissel, Lee, Presnell, Cohén, Bunn, 1993. Erythropoietin structure-function relationships .
Mutant proteins that test a model of tertiary structure, J Biol Chem., 268(21), 15983-93)). Preferiblemente, la EPO tiene la . secuencia de aminoácidos de la EPO humana y las cisteínas que se producen en forma natural son la cisteína 29 y/o 33. En consecuencia, en una modalidad preferida, la cisteina 33 se reemplaza por otro aminoácido y en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la cisteína 29. En otra modalidad preferida, la cisteína 29 se reemplaza pro otro aminoácido y en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la cisteína 33. En el contexto de la presente invención, el término "cisteínas agregadas" significa que los polipéptidos preferiblemente la EPO, comprenden un residuo de cisteína que no está presente en el polipéptido de tipo silvestre. Esto puede lograrse mediante el agregado (por ejemplo por medio recombinante) de una cisteína ya sea en la terminal N o en la terminal C del polipéptido o reemplazando (por ejemplo por medio recombinante) un aminoácido que se produce en forma natural por cistelna. Los expertos en la técnica conocen los métodos respectivos (ver anterior) . Preferiblemente, la cisteína agregada ha sido adicionada reemplazando un aminoácido que se produce en forma natural por una cisterna. En una modalidad preferida, la EPO es una EPO humana y el residuo aminoácido reemplazado es serina 126. Preferiblemente, el HAS modificado se conjuga en la etapa c) con la cisteína agregada. En la etapa b) del método de la invención, se provee un HAS modificado que es capaz de reaccionar con la EPO de la etapa a) . En este contexto, el HAS puede modificarse preferiblemente en su extremo de reducción. Esto tiene la ventaja que la reacción química puede controlarse fácilmente y que la persona experta puede estar segura qué grupo de HAS se modifica durante la reacción. Dado que sólo un grupo se introduce en el HAS, se puede prevenir la reticulación entre las diferentes moléculas de EPO por las moléculas de HAS multifuncionales y otras reacciones laterales. En consecuencia, el HAS modificado puede tener la capacidad de reaccionar con (1) al menos un grupo enlazado, ya sea directamente o mediante una molécula enlazante, a los grupos sulfuro o radicales carbohidratados de la EPO. (2) al menos un radical carbohidratado, que se oxida preferiblemente, y/o (3) al menos un grupo SH libre. Con respecto al punto (1) anterior, la modificación del HAS dependerá del grupo enlazado a la EPO . El mecanismo fundamental se conoce en la técnica. Un ejemplo se da en el Ej emplo , 2.1. Con respecto a los puntos (2) y (3) anteriores, se conocen varios métodos en la técnica para modificar el HAS. El principio básico que destacan estos métodos es que un grupo reactivo de HAS se modifica para poder reaccionar con el radical carbohidratado o el grupo SH o una molécula enlazante se conjuga con HAS que contiene un grupo reactivo que es capaz de reaccionar con el radical carbohidratado o el grupo SH . En el caso del punto (2) , HAS modificado puede ser capaz de reaccionar con los radicales carbohidratados oxidados, preferiblemente un residuo sacárido terminal, más preferiblemente galactosa, o un ácido siálico terminal. Se conocen varias formas para modificar HAS de modo que sea capaz de reaccionar con un residuo sacárido oxidado preferiblemente terminal. Como se mencionó anteriormente, esta modificación puede introducirse en forma regioselectiva en el extremo de reducción de la cadena HES . En este caso, en una primera etapa, el grupo aldehido se oxida a una lactona. Las modificaciones incluyen, pero sin limitarse a la adición de las funciones de hidracida, amino (también hidroxilamino) , semicarbazida o tiol al HAS, ya sea directamente o mediante un enlace. Estas técnicas se explican en mayor detalle en los Ejemplos 2-4. Además, los mecanismos per se se conocen en la técnica (ver por ejemplo DE 196 28 705 Al; Hpoe y colaboradores, 1981, Carbohydrate Res., 91, 39; Pissekis y colaboradores, 1960, Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, 2, 47; Frie, 1998, diploma thesis, Fachhochschule Hamburg, DE) . Dentro de la presente invención, se prefiere la adición de una función hidracida o hidroxilamino. En este caso, al conducir preferiblemente la reacción de la etapa c) del método de la presente invención a un pH de 5.5, se asegura que el HAS modificado reaccione selectivamente con el radical carbohidratado oxidado de la EPO sin reticulación de la EPO inter- o intramolecular por la formación de imina de las cadenas laterales de lisina con el residuo sacárido oxidado . En el caso del punto (3), se conocen también varias formas para modificar HAS de modo que sea capaz de reaccionar con un grupo SH libre. Preferiblemente, esta modificación se introduce en forma regioselectiva en el extremo de reducción de la cadena HES . Los métodos incluyen, pero sin limitarse a la adición de las funciones maleimida, disulfuro o halógeno acetamida al HAS . Estas técnicas se explican en mayor detalle en los Ejemplos 2-4. Otros detalles sobre estas técnicas se pueden obtener de Chamov y colaboradores, 1992, J. Biol . Chem. , 267, 15916; T orpe y colaboradores, 1984, Eur. J. Biochem. , 140, 63; Greenfield y colaboradores, 1990, Cáncer Research, 50, 6600 como también de la literatura mencionada en el Ejemplo 2, 1.3. Otras funciones posibles se enumeran en la Tabla 1, aportando un panorama sistemático sobre las posibles moléculas enlazantes. Además, los mecanismos per se se conocen en la técnica. Varias moléculas enlazantes que son útiles en el contexto de la presente invención se conocen en la técnica o están disponibles en el mercado (por ejemplo de Pierce, disponible de Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) . Los ejemplos se muestran en la Tabla 2. En la etapa c) del método de la presente invención, se hace reaccionar la EPO de la etapa a) con el HAS de la etapa b) por lo que se produce el HAS-EPO que comprende una o más moléculas HAS, en donde HAS se conjuga con la EPO mediante un radical carbohidratado o mediante un tioéter. En principio, los métodos detallados para hacer reaccionar la EPO con HAS modificado dependen de la modificación individual de la EPO y/o el HAS y se conocen en la técnica (ver por ejemplo, Rose, 1994, J. Am. Chem. Soc, 116, 30, O'Shannessay & Wichek, 1990, Analytical Biochemistry, 191,1; Thorpe y colaboradores, 1984, Eur. J. Biochem. , 140, 63; Chamov y colaboradores, 1992, J. Biol . Chem. 267, 15916) . Para los métodos ejemplificados en la presente invención, se aportan detalles en los Ejemplos 2-4, especialmente 4. La etapa c) puede llevarse a cabo en un medio de reacción que comprende al menos 10% en peso de H20. El medio de reacción en esta modalidad preferida del método de la invención comprende al menos 10% en peso de agua, se prefiere al menos 50%, se prefiere aún más al menos 80%, por ejemplo 90% o hasta 100%. El grado de los solventes orgánicos se calcula respectivamente. En consecuencia, la reacción tiene lugar en una fase acuosa. El medio de reacción preferido es agua. Una ventaja de esta modalidad del método de la invención es que no es necesario utilizar solventes críticos en el ámbito toxicológico y que por lo tanto no es necesario eliminar estos solventes después del proceso de producción, para evitar la contaminación con el solvente. Además, no es necesario realizar controles de calidad adicionales con respecto a los solventes críticos en el ámbito toxicológico residuales. Se prefiere utilizar como solventes orgánicos los solventes no críticos en el ámbito toxicológico como etanol o propilenglicol . Otra ventaja del método de la invención es que se evitan los cambios estructurales irreversibles o reversibles que están inducidos por los solventes orgánicos. En consecuencia, los polipéptidos obtenidos de acuerdo con el método de la invención son diferentes de los preparados en solventes orgánicos tal como DMSO. Además , se ha observado sorprendentemente que la conjugación del HAS con los fármacos en una solución acuosa minimiza o evita las reacciones colaterales. En consecuencia, esta modalidad del método de la invención conduce a productos mejorados con gran pureza. En el contexto de la presente invención, el término "hidroxialquilalmidón" se utiliza para indicar los derivados de almidón que han sido sustituidos por los grupos hidroxialquilo. En este contexto, el grupo alquilo puede estar sustituido. Preferiblemente, el hidroxialquilo contiene 2-10 átomos de carbono, más preferiblemente de 2-4 átomos de carbono. Por lo tanto "hidroxialquilalmidón" preferiblemente comprende hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón, en donde se prefieren el hidroxietilalmidón e hidroxipropilalmidón. El grupo o grupos hidroxialquilo de HAS contiene al menos un grupo OH.
Se prefiere el hidroxietilalmidón (HES) para todas las modalidades de la presente invención. La expresión "hidroxialquilalmidón" también incluye los derivados donde el grupo alquilo es mono- o polisustituido . En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo, siempre que el HAS permanezca soluble en agua . Además , el grupo hidroxi terminal del hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado. Además, el grupo alquilo del hidroxialquilalmidón puede ser lineal o ramificado. Además, en lugar de alquilo, también se pueden utilizar grupos alquileno lineales o ramificados sustituidos o no sustituidos. En el contexto de la presente invención, el hidroxietilalmidón puede tener un peso molecular promedio (peso promedio) de 1-300 kDa, en donde se prefiere un peso molecular promedio de 5-100 kDa. El hidroxietilalmidón además puede exhibir un grado molar de sustitución de 0.1 a 0.8 y una relación entre la sustitución C2:C6 en el intervalo de 2-20, con respecto a los grupos hidroxietilo . El HAS-EPO producido por el método de la invención puede purificarse y caracterizarse de la siguiente forma: El aislamiento del HAS-EPO puede llevarse a cabo utilizando los procedimientos conocidos para la purificación de la EPO natural y recombinante (por ejemplo la cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, RP-CLA , cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, el procedimiento descrito en el Ejemplo 20.8 o combinaciones de los mismos) . La unión covalente del HAS al polipeptido de la EPO puede verificarse por el análisis composicional del carbohidrato después de la hidrólisis de la proteína modificada (relación de hidroxietilglucosa y mañosa presente en los tres sitios de N-glicosilación de la EPO) . La demostración de la modificación del HAS en los oligosacáridos N-enlazados de la EPO se puede lograr mediante la eliminación de N-glicanos modificados por HAS y la observación del cambio previsto en la movilidad más alta en SDS-PAGE +/- análisis de Western Blotting. La modificación de HAS de la EPO en los residuos de cisteína se puede demostrar mediante la falla para detectar el Cys-péptido proteolítico correspondiente en RP-CLAR y MALDI/TOF-MS en los fragmentos proteolíticos del producto modificado por HAS (Zhou y colaboradores, 1998, Application of capillary electrophoresis , liquid chromatography, electrospray-mass spectrometry and matrix-assisted laserdesorption/ionization - time of flight - mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin. Electrophoresis, 19(13), 2348-55). El aislamiento de la fracción que contiene HAS después de la digestión proteolítica de la EPO Cys-modificada permite la verificación en esta fracción del péptido correspondiente mediante el análisis composicional del aminoácido convencional. Todas las modalidades descritas anteriormente con respecto al HAS-EPO de la invención referentes a las propiedades de la EPO o HAS aplican también al método de la invención para preparar un HAS-EPO. La invención además se refiere a un HAS-EPO, que se obtiene por el método de la invención. Preferiblemente, este HAS-EPO tiene las características definidas para el HAS-EPO anterior de la invención. La invención además se refiere a un HAS-EPO de acuerdo con la invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal . Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el HAS-EPO de la invención. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende además al menos un diluyente, adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable en la terapia de eritropoyetina . La composición farmacéutica se utiliza preferiblemente para el tratamiento de trastornos anémicos o trastornos por disfunción hematopoyetica o enfermedades relacionadas . Una cantidad "terapéuticamente efectiva" tal como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad que provee efecto terapéutico para una enfermedad y régimen de administración dado. La administración de isoforma de eritropoyetina se realiza preferiblemente por rutas parenterales . La ruta especifica elegida dependerá de la enfermedad a ser tratada. La administración de las isoformas de eritropoyetina se realiza preferiblemente de una formulación que contiene un portador adecuado, tal como albúmina de suero humano, un diluyente adecuado, tal como una solución salina amortiguadora, y/o un adyuvante apropiado. La dosificación requerida será en cantidades suficientes para elevar el hematocrito de los pacientes y variará dependiendo de la severidad de la enfermedad a ser tratada, del método de administración utilizado y similar. El objetivo del tratamiento con la composición farmacéutica de la invención es preferiblemente un incremento del valor de la hemoglobina de más de 6. mmol/1 en la sangre. Para esto, la composición farmacéutica puede administrarse en una forma que el valor de la hemoglobina aumenta entre 0.6 mmol/1 y 1.6 mmol/1 por semana. Si el valor de la hemoglobina excede 8.7 mmol/1, la terapia debe ser interrumpida preferiblemente hasta que el valor de la hemoglobina esté por debajo de 8.1 mmol/1.
La composición de la invención se utiliza preferiblemente en una formulación apropiada para la inyección subcutánea o intravenosa o parenteral . Para esto, los excipientes y portadores adecuados son por ejemplo fosfato dihidrógeno sódico, fosfato hidrógeno disódico, clorato sódico, polisorbato 80, HSA, y agua para inyección. La composición puede administrarse tres veces a la semana, preferiblemente dos veces a la semana, más preferiblemente una vez a la semana, y más preferiblemente cada dos semanas. Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra en una cantidad de 0.01-10 xg/kg de peso corporal del paciente, más preferiblemente 0.1 a 5 //g/kg, 0.1 a 1 /¿g, ó 0,2-0.9 g/kg, más preferiblemente 0.3-0.7 /¿g/kg, y el más preferido es 0.4-0.6 /¿g/kg de peso corporal. En general, preferiblemente entre 10 y 200 µg, preferiblemente entre 15 µg y 100 µg se administran por dosis . La invención además se refiere al uso de un HAS-EPO de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de los trastornos anémicos o trastornos por disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el problema se resuelve mediante un conjugado de hidroxialquilalmidón (HAS) -polipéptido (HAS-polipéptido) que comprende una o más moléculas HAS, en donde cada HAS se conjuga con el polipeptido mediante a) un radical carbohidratado; o b) un tioéter. El HAS-polipeptido de la invención tiene la ventaja que exhibe una estabilidad biológica mejorada cuando se compara con el polipéptido antes de la conjugación. Esto se debe principalmente al hecho de que el HAS-polipéptido es menos o nada reconocido por los sistemas de eliminación del hígado y riñon y por lo tanto persiste en el sistema circulatorio durante un período de tiempo más largo. Además, dado que el HAS se une específicamente al sitio, el riesgo de destruir la actividad biológica in vivo del polipéptido por conjugación del HAS al polipéptido se minimiza. El HAS-polipéptido de la invención tiene principalmente dos componentes, es decir, el polipéptido y el hidroxialquilalmidón (HAS) enlazado al mismo. El polipéptido puede ser de cualquier fuente humana o animal. En una modalidad preferida, el polipéptido es de origen humano . El polipéptido puede ser una citocina, especialmente eritropoyetina, una antitrombina (AT) tal como AT III, una interleucina, especialmente interleucina-2 , IFN-beta, IFN-alfa, G-CSF, CSF, interleucina-6 y anticuerpos terapéuticos . De acuerdo con una modalidad preferida, el polipéptido es una antitrombina (AT) , preferiblemente AT III, (Levy JH, Weisinger A, Ziomek CA, Echelard Y, Recombinant Antithrombin : Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminar in Trombosis and Hemostasis 27, 4 (2001) 405-416; Edmunds T, Van Pattern SM, Pollock J, Hanson E, Bernasconi R, Higgins E, Manavalan P. Ziomek C, Meade H, McPherson J, Colé ES, Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671; Minnema MC, Chang ACK, Jansen P , Lubbers YTP, Pratt BM, hittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons lethally challenged with Escherichia coli, Blood 95, 4 (2000) 1117-1123; Van Pattern SM, Hanson EH, Bernasconi R. Zhang K, Manavalan P. Colé ES, McPherson JM, Edmunds T, Oxidation of Methionine Residues in Antithrombin, J. Biol . Chemistry 274, 15 (1999) 10268-10276). De acuerdo con otra modalidad preferida, el polipéptido es IFN-beta humano, en particular IFN-beta la (ver Abones®, REBIF®) e IFN-beta Ib (cf. BETASERON®) . Otro polipéptido preferido es el G-CSF humano (factor estimulante de la colonia de granulocitos) . Ver, por ejemplo, Nagata y colaboradores, The chromosomal gene structure and t o R Am for human granulocyte colony-stimulating factor, EMBO J. 5: 575-581, 1986; Souza y colaboradores, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 232 (1986) 61-65; and Hermán y colaboradores, Characterization, formulation and stability of Neupogen® (Filgrastim) , a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor, in: Formulation, characterization, and stability of protein drugs, Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Press, New York, 1996, 303-328. Con respecto a la eritropoyetina, todas las modalidades descritas anteriormente también se aplican aquí. Preferiblemente, el polipéptido se produce en forma recombinante . Esto incluye la producción en células eucarióticas o procarióticas , preferiblemente, células mamíferas, de insectos, levadura, bacteriales o en cualquier otro tipo de célula que es conveniente para la producción recombinante del polipéptido. Además, el polipéptido puede expresarse en animales transgénicos (por ejemplo en fluidos corporales como la leche, sangre, etc.), en huevos de pájaros transgénicos, especialmente aves de corral, se prefiere el pollo, o en plantas transgénicas . La producción recombinante de un polipéptido se conoce en la técnica. En general, esto incluye la transfección de células huésped con un vector de expresión apropiado, el cultivo de las células huésped en condiciones que permiten la producción del polipéptido y la purificación del polipéptido a partir de las células huésped. Para información detallada ver por ejemplo Kristal, Pankratz, Farber, Smart , 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert , Wojchowski, 1989, High level expresión and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 Bl y EP 668 351 Bl . El polipéptido puede comprender una o más cadenas laterales carbohidratadas unidas al polipéptido mediante glicosilación N- y/o O-enlazada, es decir el polipéptido está glicosilado. Usualmente, cuando un polipéptido se produce en las células eucarióticas , el polipéptido es glicosilado en forma translacional . En consecuencia, las cadenas laterales carbohidratadas pueden haberse unido al polipéptido durante la biosíntesis en células mamiferas, especialmente humanas, de insectos o de levadura. El HAS puede conjugarse directamente con el polipéptido o, alternativamente, mediante una molécula enlazante. La naturaleza de la molécula enlazante depende la forma en que el HAS se enlaza al polipéptido. Se dispone de varios enlazantes en el comercio (por ejemplo de Pierce, ver anterior) . La naturaleza del enlazante y su finalidad se describen en detalle a continuación en la sección que se refiere al método para la producción de HES-polipéptido .
De acuerdo con una modalidad preferida del conjugado de HAS-polipéptido de la invención, el HAS se conjuga con el polipéptido mediante un radical carbohidratado . Preferiblemente, esto aplica si el polipéptido es una antitrombina, preferiblemente AT III. En el contexto de la presente invención, el término "radical carbohidratado" se refiere a hidroxialdehídos o hidroxicetonas como también a modificaciones químicas de las mismas (ver ómpp Chemielexikon, 1990, Thieme Verlag Stuttgart, Alemania, 9a edición, 9, 2281-2285 y la literatura citada en la misma) . Además, se refiere a derivados de radicales carbohidratados que se producen en forma natural como la glucosa, galactosa, ma osa, ácido siálico, y similares . El término también incluye los radicales carbohidratados que se producen en forma natural oxidados químicamente en donde la estructura del anillo ha sido abierta. El radical carbohidratado puede estar enlazado directamente a la cadena principal polipéptida. Preferiblemente, el radical carbohidratado es parte de una cadena lateral carbohidratada . En este caso, otros radicales carbohidratados pueden estar presentes entre el radical carbohidratado al cual el HAS está enlazado y la cadena principal de polipéptido. Más preferiblemente, el radical carbohidratado es el radical terminal de la cadena lateral carbohidratada . En una modalidad más preferida, el HAS se conjuga con un residuo de galactosa de las cadenas laterales carbohidratadas , preferiblemente el residuo de galactosa terminal de la cadena lateral carbohidratada. Este residuo de galactosa puede estar disponible para la conjugación por la eliminación de ácidos siálicos terminales, seguido de oxidación (ver a continuación) . En otra modalidad preferida, el HAS se conjuga con un residuo de ácido siálico de las cadenas laterales carbohidratadas, preferiblemente el residuo de ácido siálico terminal de la cadena lateral carbohidratada. Además, el HAS puede conjugarse con el polipéptido mediante un tioéter. Como se explica en detalle a continuación, el átomo S puede derivarse de cualquier grupo SH unido al polipéptido, tanto el que se produce en forma natural como en forma no natural . En una modalidad preferida, el átomo S puede derivarse de un grupo SH que ha sido introducido en un radical carbohidratado oxidado de HES, preferiblemente un radical carbohidratado oxidado que es parte de una cadena lateral carbohidratada del polipéptido (ver a continuación) . Preferiblemente, el átomo S en el tioéter se deriva de una cisteína que se produce en forma natural o de una cisteína agregada.
En el contexto de la presente invención, el término "cisteínas agregadas" significa que los polipéptidos comprenden un residuo de cisteína que no está presente en el polipéptido de tipo silvestre. En el contexto de este aspecto de la invención, la cisteína puede ser un aminoácido adicional agregado en el extremo N- o C-terminal del polipéptido. Además, la cisteína agregada puede haberse agregado reemplazando un aminoácido que se produce en .forma natural por una cisteína. El segundo componente del HAS-polipéptido es HAS. En el contexto de la presente invención, el término "hidroxialquilalmidón" se utiliza para indicar los derivados de almidón que han sido sustituidos por los grupos hidroxialquilo . En este contexto, el grupo alquilo puede estar sustituido. Preferiblemente, el hidroxialquilo contiene 2-10 átomos- de carbono, más preferiblemente 2-4 átomos de carbono. "Hidroxialquilalmidón" , por lo tanto, preferiblemente, comprende hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e idroxibutilalmidón, en donde el hidroxietilalmidón e hidroxipropilalmidón son los preferidos. El grupo (s) hidroxialquilo de HAS contiene al menos un grupo OH. La expresión "hidroxialquilalmidón" también incluye los derivados en donde el grupo alquilo es mono o polisustituido . En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo, siempre que el HAS permanezca soluble en agua. Además, el grupo hidroxi terminal de hidroxialquilo puede ser esterificado o eterificado. Además, el grupo alquilo del hidroxialquilalmidón puede ser lineal o ramificado . Además, en lugar de alquilo, también se pueden utilizar grupos alqueno sustituidos o no sustituidos lineales o ramificados. El hidroxietilalmidón (HES) es el más preferido para todas las modalidades de la presente invención. En el contexto de la presente invención, el hidroxietilalmidón puede tener un peso molecular promedio (peso promedio) de 1-300 kDa, en donde un peso molecular promedio de 5-100 kDa es el más preferido. El hidroxietilalmidón también puede exhibir un grado molar de sustitución de 0.1 a 0.8 y una relación entre sustitución C2:C6 en el intervalo de 2-20, con respecto a los grupos hidroxietilo . El HAS-polipéptido puede comprender 1-12, preferiblemente 1-9, 1-6 ó 1-3, con preferencia de 1-4 moléculas de HAS por molécula de polipeptido. La cantidad de moléculas de HAS por molécula de polipeptido puede determinarse mediante análisis composicional cuantitativo de los carbohidratos utilizando GC-MS después de la hidrólisis del producto y la derivación de los monosacáridos resultantes (ver Chaplin y Kennedy (eds.), 1986, Carbohydrate Análisis: a practical approach, Capitulo 1, Monosaccharides, pag. 1-36; Capítulo 2, Oligosaccharides , págs. 37-53, Capítulo 3, Neutral Polysaccharides , págs. 55-96); IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3) . Todas las modalidades descritas a continuación con respecto al método de la invención para producir un HAS-polipéptido con las propiedades del polipéptido o HAS, se aplican también al conjugado HAS-polipéptido de la invención. Además todas las modalidades descritas anteriormente con respecto al HAS-EPO o la preparación del mismo que se refieren a los polipéptidos en general o a HAS se aplican al HAS-polipéptido de la invención. El hidroxialquilalmidón es un derivado éter del almidón. Además de tales derivados de éter también se pueden utilizar otros derivados de almidón en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, los derivados que son útiles comprenden grupos hidroxi esterificados . Estos derivados pueden ser por ejemplo derivados de ácidos mono o di-carboxílicos no sustituidos con 2-12 átomos de carbono o de derivados sustituidos de los mismos. Especialmente útiles son los derivados de los ácidos monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente de ácido acético. En este contexto, se prefieren el acetilalmidón, butilalmidón o propilalmidon. Además, se prefieren los derivados de los ácidos dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono. En el caso de los derivados de ácidos dicarboxílicos, es útil que el segundo grupo carboxi del ácido dicarboxílico también sea esterificado . Además, los derivados de los monoalquilésteres de ácidos dicarboxílicos son también apropiados en el contexto de la presente invención. Para los ácidos mono- o dicarboxílicos sustituidos, los grupos sustitutos pueden ser preferiblemente los mismos que los mencionados anteriormente para los residuos alquilo sustituidos. Las técnicas para la esterificación del almidón son conocidas en el arte (ver por ejemplo Klemm D. y colaboradores, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol . 2, 1998, hiley-VCH, Weinheim, New York, especialmente el capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9) . En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un conjugado (HAS-polipéptido) de hidroxialquilalmidón (HAS) -polipéptido, que comprende las etapas de: a) proveer un polipéptido que sea capaz de reaccionar con HAS modificado. b) proveer HAS modificado que sea capaz de reaccionar con el polipéptido de la etapa a) , y c) hacer reaccionar el polipéptido de la etapa a) con HAS de la etapa b) , por lo cual se produce un HAS-polipéptido que comprende una o más moléculas HAS, en donde cada HAS se conjuga con el polipéptido mediante i) un radical carbohidratado; o ii) un tioéter. El método de la invención tiene la ventaja de que se produce un conjugado HAS-polipéptido que exhibe una actividad biológica alta. Además, el método de la invención tiene la ventaja de que se puede producir un derivado del polipéptido efectivo a costos reducidos ya que el método no comprende etapas de purificación extensas y consumidoras de tiempo que dan por resultado un rendimiento final bajo. En consecuencia," ~en la primera etapa del método de la invención, se provee un polipéptido que es capaz de reaccionar con HAS modificado. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "proveer" debe interpretarse en el sentido de que después de la etapa respectiva, se dispone de una molécula (en la etapa a) un polipéptido, en la etapa b) HAS) con las propiedades deseadas . En el caso de la etapa a) , esto incluye la purificación del polipéptido a partir de fuentes naturales como también la producción recombinante en las células huésped u organismo, y, si es necesario, la modificación del polipeptido obtenido de esta forma. Con respecto al polipeptido que es el material de inicio de la presente invención, se aplica lo mismo que para la eritropoyetina que es parte del conjugado HAS-polipeptido de la invención. En este contexto, las modalidades preferidas descritas anteriormente se aplican también para el método de la invención. Preferiblemente, el polipeptido se produce en forma recombinante . Esto incluye la producción en células eucarióticas o procarióticas , preferiblemente las células de mamíferos, insectos, levadura, bacterias o en cualquier otro tipo de célula que es conveniente para la producción recombinante del polipéptido. Además, el polipéptido puede expresarse en animales transgénicos (por ejemplo, en fluidos corporales como la leche, sangre, etc.), en huevos de pájaros transgénicos, especialmente aves de corral, se prefiere el pollo, o en plantas transgénicas . La producción recombinante de un polipéptido se conoce en la técnica. En general, esto incluye la transfección de células huésped con un vector de expresión apropiado, el cultivo de las células huésped en condiciones que permiten la producción del polipéptido y la purificación del polipéptido de las células huésped (Kristal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietxn to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67 (1) , 71-9; Quelle, Caslake, Burkert , Wojchowski, 1989, High-level expresión and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 Bl y EP 668 351 Bl) . El polipéptido puede comprender una o más cadenas laterales carbohidratadas unidas al polipéptido mediante glicosilación N- y/o O-enlazada, es decir el polipéptido está glicosilado. En forma inusual, cuando se produce el polipéptido en células eucarióticas , ¦ el polipéptido es glicosilado en forma postranslacional . En consecuencia, las cadenas laterales carbohidratadas pueden haberse unido al polipéptido durante la producción en células de mamíferos, especialmente humanas, insectos o levadura que pueden ser células de un animal transgénico o planta (ver anterior) . Estas cadenas laterales carbohidratadas pueden haberse modificado química o enzimáticamente después de la expresión en las células apropiadas, por ejemplo eliminando o agregando uno o más radicales carbohidratados (ver por ejemplo Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt, y Schomburg eds . , GBF-Monographs , 12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge) . Es el objetivo del método de la invención proveer un HAS-polipéptido que comprende una o más moléculas de HAS donde HAS se conjuga con el polipéptido mediante un radical carbohidratado (i) o mediante un tioéter (ii) . En consecuencia, el polipéptido suministrado en la etapa a) debe tener las propiedades de modo que sea posible una conjugación mediante un radical carbohidratado y/o mediante un tioéter. Por lo tanto, el polipéptido después de la etapa a) puede contener preferiblemente (1) al menos un grupo reactivo enlazado, ya sea directa o mediante una molécula enlazante, a los grupos sulfuro o radicales carbohidratados, que es capaz de reaccionar con HES o HES modificado, (2) al menos un radical carbohidratado con el cual se puede conjugar HAS modificado y/o (3) al menos un grupo SH libre. Con respecto a la posibilidad (1) anterior, el polipéptido de la etapa a) se obtiene preferiblemente conjugando una molécula enlazante apropiada al grupo (s) SH o a los radicales carbohidratados del polipéptido. Un ejemplo para tal polipéptido modificado se provee en el Ejemplo 4, 2.1. Es importante asegurarse que la adición de la molécula enlazante no daña el polipéptido. Sin embargo, los expertos en la técnica conocen este tema. Con respecto a la posibilidad (2) anterior, en una modalidad preferida, HAS modificado se conjuga con el polipéptido mediante un radical carbohidratado.
El radical carbohidratado puede estar enlazado directamente a la cadena central polipéptida. Preferiblemente, el radical carbohidratado es parte de una cadena lateral carbohidratada . En este caso, otros radicales carbohidratados pueden estar presentes entre el radical carbohidratado al cual el HAS está enlazado y la cadena principal polipéptida. Más preferiblemente, el radical carbohidratado es el radical terminal de la cadena lateral carbohidratada . En consecuencia, en una modalidad preferida, HAS modificado se une (mediante un enlace o no, ver a continuación) a las cadenas carbohidratadas enlazadas a los sitios de N- y/o O-glicosilación del polipéptido. Sin embargo, también se incluye dentro de la presente invención que el polipéptido contiene (a) otros radicales carbohidratados con los cuales se conjuga HAS modificado. Las técnicas para unir los radicales carbohidratados a los polipéptidos , ya sea mediante ingeniería genética o en forma enzimática, seguido de la expresión en células apropiadas, se conocen en el arte (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett., 203(1), 64-8; Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989 Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt, y Schomburg eds . , GBF-Monograp s, 12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge) . En una modalidad preferida del método de la invención, el radical carbohidratado se oxida para poder reaccionar con HAS modificado. Esta oxidación puede llevarse a cabo ya sea química o enzimaticamente. Los métodos para la oxidación química de los radicales carbohidratados de los polipéptidos se conocen en la técnica e incluyen el tratamiento con peryodato (Chamow y colaboradores, 1992, J. Biol . Chem. , 267, 15916-15922). Mediante la oxidación química, es posible principalmente oxidar cualquier radical carbohidratado, ya sea que estén posicionados en forma terminal o no. Sin embargo, al elegir las condiciones leves (peryodato 1 mM, 0°C en oposición a condiciones rigurosas: peryodato 10 mM 1 hora a temperatura ambiente) , es posible oxidar preferiblemente el radical carbohidratado terminal, por ejemplo ácido siálico o galactosa, de una cadena lateral carbohidratada . Alternativamente, el radical carbohidratado puede oxidarse en forma enzimática. Las enzimas para la oxidación de los radicales carbohidratados individuales se conocen en la técnica, por ejemplo en el caso de galactosa, la enzima es galactosa oxidasa. Si se intenta oxidar las porciones de galactosa terminales, será necesario eventualmente eliminar los ácidos siálicos terminales (parcial o completamente) si el polipéptido ha sido producido en células capaces de unir los ácidos siálicos a las cadenas carbohidratadas , por ejemplo en células de mamíferos o en células que han sido modificadas genéticamente para tener la capacidad de unir los ácidos siálicos a las cadenas carbohidratadas. Los métodos químicos o enzimáticos para la eliminación de los ácidos siálicos se conocen en la técnica (Chaplin y Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, especially Chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, págs 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)). Sin embargo, también se incluye en la presente invención que el radical carbohidratado al cual el HAS modificado debe unirse se une al polipéptido dentro de la etapa a) . En el caso que se desee unir galactosa, esto puede lograrse mediante el medio de galactosa transferasa. Los métodos se conocen en la técnica (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucossaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett . , 203(1), 64-8). En una modalidad más preferida, en la etapa a) el polipéptido se modifica mediante oxidación de al menos una unidad sacárida terminal, preferiblemente galactosa, de la única o más cadenas laterales carbohidratadas del polipéptido, preferiblemente después de la eliminación parcial o completa (enzimática y/o química) del ácido siálico terminal, si es necesario (ver anterior) . En consecuencia, preferiblemente HAS modificado se conjuga con la unidad sacárida terminal oxidada de la cadena carbohidratada, preferiblemente galactosa. En otra modalidad preferida (ver punto (3) anterior) , el polipeptido comprende al menos un grupo SH libre. De acuerdo con otra modalidad preferida, el grupo SH libre es parte de una cisteína que se produce en forma natural o de una cisteína agregada. Los métodos para el reemplazo de los aminoácidos se conocen en la técnica (Elliott, Lorenzini, Chang, Barzilay, Delorme, 1997, Maping of the active site of recombinant human erythropoietin, Blood, 89(2), 493-502; Boissel, Lee, Presnell, Cohén, Bunn, 1993, Erythropoietin structure-function relationships . Mutant proteins that test a model of tertiary structure, J Biol Chem. , 268(21), 15983-93). En el contexto de la presente invención, el término "cisteínas agregadas" significa que los polipéptidos comprenden un residuo de cisteína que no está presente en el polipéptido de tipo silvestre. Esto puede lograrse agregando (por ejemplo por medio recombinante) un residuo de cisteína ya sea en la terminal N- o en la C-terminal del polipéptido o reemplazando (por ejemplo por medio recombinante) un aminoácido que se produce en forma natural por cisteína. Los expertos en la técnica conocen los métodos respectivos (ver anterior) . Preferiblemente, la cisteína agregada ha sido adicionada reemplazando un aminoácido que se produce en forma natural por una cisteina. Preferiblemente, el HAS modificado se conjuga en la etapa c) con la cisteina agregada. En la etapa b) del método de la invención, se provee un HAS modificado que es capaz de reaccionar con el polipéptido de la etapa a) . En este contexto, el HAS puede modificarse preferiblemente en su extremo de reducción. Esto tiene la ventaja que la reacción química puede controlarse fácilmente y que la persona experta puede estar segura qué grupo de HAS se modifica durante la reacción. Dado que sólo un grupo se introduce en el HAS, se puede prevenir la reticulación entre las diferentes moléculas de polipéptido por las moléculas de HAS multifuncionales y otras reacciones laterales . En consecuencia, el HAS modificado puede tener la capacidad de reaccionar con (1) al menos un grupo enlazado, ya sea directamente o mediante una molécula enlazante, a los grupos sulfuro o radicales carbohidratados del polipéptido. (2) al menos un radical carbohidratado, que se oxida preferiblemente, y/o (3) al menos un grupo SH libre. Con respecto al punto (1) anterior, la modificación del HAS dependerá del grupo enlazado al polipéptido. El mecanismo fundamental se conoce en la técnica. Un ejemplo se da en el Ejemplo 4, 2.1. Con respecto a los puntos (2) y (3) anteriores, se conocen varios métodos en la técnica para modificar el HAS. El principio básico que destaca de estos métodos es que un grupo reactivo de HAS se modifica para poder reaccionar con el radical carbohidratado o el grupo SH o una molécula enlazante se conjuga con el HAS que contiene un grupo reactivo que es capaz de reaccionar con el radical carbohidratado o el grupo SH. En el caso del punto (2) , el HAS modificado puede ser capaz de reaccionar con los radicales carbohidratados oxidados, preferiblemente un residuo sacárido terminal, más preferiblemente galactosa, o un ácido si lico terminal. Se conocen varias formas para modificar el HAS de modo que sea capaz de reaccionar con un residuo sacárido oxidado preferiblemente terminal. Como se mencionó anteriormente, esta modificación puede introducirse en forma regioselectiva en el extremo de reducción de la cadena HES . En este caso, en una primera etapa, el grupo aldehido se oxida a una lactona. Las modificaciones incluyen, pero sin limitarse a la adición de las funciones de hidracida, amino (también idroxilamino) , semicarbazida o tiol al HAS , ya sea directamente o mediante un enlace. Estas técnicas se explican en mayor detalle en los Ejemplos 2-4. Además, los mecanismos per se se conocen en la técnica (ver por ejemplo DE 196 28 705 Al; Hpoe y colaboradores, 1981, Carbohydrate Res., 91, 39; Fissekis y colaboradores, 1960, Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, 2, 47; Frie, 1998, diploma thesis, Fachhochschulé Hamburg, DE) . Dentro de la presente invención, se prefiere la adición de una función hidracida o hidroxilamino . En este caso, al conducir preferiblemente la reacción de la etapa c) del método de la presente invención a un pH de 5.5, se asegura que el HAS modificado reaccione selectivamente con el radical carbohidratado oxidado del polipeptido sin la reticulación del polipéptido Ínter- o intramolecular por la formación de imina de las cadenas laterales de lisina con el residuo sacárido oxidado. En el caso del punto (3), se conocen también varias formas para modificar el HAS de modo que sea capaz de reaccionar con un grupo SH libre. Preferiblemente, esta modificación se introduce en forma regioselectiva en el extremo de reducción de la cadena HES . Los métodos incluyen, pero sin limitarse a la adición de las funciones maleimida, disulfuro o halógeno acetamida al HAS. Estas técnicas se explican en mayor detalle en los Ejemplos 2-4.
Otros detalles sobre estas técnicas se pueden obtener de Chamov y colaboradores, 1992, J. Biol . Chem. , 267, 15916; Thorpe y colaboradores, 1984, Eur. J. Biochem. , 140, 63; Greenfield y colaboradores, 1990, Cáncer Research, 50, 6600 así como también de la literatura mencionada en el Ejemplo 2, 1.3. Otras funciones posibles se enumeran en la Tabla 1, aportando un panorama sistemático sobre las posibles moléculas enlazantes. Además, los mecanismos per se se conocen en la técnica. Varias moléculas enlazantes que son útiles en el contexto de la presente invención se conocen en la técnica o están disponibles en el mercado (por ejemplo de Pierce, disponible de Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) . En la etapa c) del método de la presente invención, se hace reaccionar el polipéptido de la etapa a) con el HAS de la etapa b) por lo que se produce el HAS-polipéptido que comprende una o más moléculas HAS, en donde el HAS se conjuga con el polipéptido mediante un radical carbohidratado o mediante un tioéter. En principio, los métodos detallados para hacer reaccionar el polipéptido con el HAS modificado dependen de la modificación individual del polipéptido y/o el HAS y se conocen en la técnica (ver por ejemplo, Rose, 1994, J. Am.
Chem. Soc, 116, 30; O' Shannessay & Wichek, 1990, Analytical Biochemistry, 191, 1; Thorpe y colaboradores, 1984, Eur. J. Biochem. , 140, 63; Chamov y colaboradores, 1992, J. Biol. Chem. 267, 15916) . Para los métodos ejemplificados en la presente invención, se aportan detalles en los Ejemplos 2-4, especialmente el 4. La etapa c) puede llevarse a cabo en un medio de reacción que corrprende al menos 10% en peso de H20. El medio de reacción en esta modalidad preferida del método de la invención comprende al menos 10% en peso de agua, se prefiere al menos 50%, se prefiere aún más al menos 80%, por ejemplo 90% o hasta 100%. El grado de solventes orgánicos se calcula respectivamente. En consecuencia, la reacción tiene lugar en una fase acuosa. El medio de reacción preferido es el agua. Una ventaja de esta modalidad del método de la invención es que no es necesario utilizar solventes críticos en el ámbito toxicológico y que por lo tanto no es necesario eliminar estos solventes después del proceso de producción, para evitar la contaminación con el solvente. Además, no es necesario realizar controles de calidad adicionales con respecto a los solventes críticos en el ámbito toxicológico residuales. Se prefiere utilizar como solventes orgánicos los solventes no críticos en el ámbito toxicológico como etanol o propilenglicol . Otra ventaja del método de la invención es que se evitan los cambios estructurales irreversibles o reversibles que están inducidos por los solventes orgánicos . En consecuencia, los polipéptidos obtenidos de acuerdo con el método de la invención son diferentes de los preparados en solventes orgánicos tal como DMSO. Además, se ha observado sorprendentemente que la conjugación del HAS con los fármacos en una solución acuosa minimiza o evita las reacciones colaterales. En consecuencia, esta modalidad del método de la invención conduce a productos mejorados con gran pureza. En el contexto de la presente invención, el término "hidroxialquilalmidón" se utiliza para indicar los derivados de almidón que han sido sustituidos por los grupos hidroxialquilo . En este contexto, el grupo alquilo puede estar sustituido. Preferiblemente, el hidroxialquilo contiene 2-10 átomos de carbono, más preferiblemente de 2-4 átomos de carbono. Por lo tanto "hidroxialquilalmidón" preferiblemente comprende hidroxietilalmidon, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón, en donde se prefieren el hidroxietilalmidon y el hidroxipropilalmidón. El grupo o grupos hidroxialquilo del HAS contienen al menos un grupo OH. Se prefiere el hidroxietilalmidon (HES) para todas las modalidades de la presente invención. La expresión "hidroxialquilalmidón" también incluye los derivados donde el grupo alquilo es mono- o polisustituido . En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo, siempre que el HAS permanezca soluble en agua . Además , el grupo hidroxi terminal del hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado. Además, el grupo alquilo del hidroxialquilalmidón puede ser lineal o ramificado. Además, en lugar de alquilo, también se pueden utilizar los grupos alquileno lineales o ramificados sustituidos o no sustituidos . En el contexto de la presente invención, el hidroxietilalmidón puede tener un peso molecular promedio (peso promedio) de 1-300 kDa, en donde se prefiere un peso molecular promedio de 5-100 kDa. El hidroxietilalmidón además puede exhibir un grado molar de sustitución de 0.1 a 0.8 y una relación entre la sustitución C2:CS en el intervalo de 2-20, con respecto a los grupos hidroxietilo . El HAS-polipéptido producido por el método de la invención puede purificarse y caracterizarse de la siguiente forma : El aislamiento del HAS-polipéptido puede llevarse a cabo utilizando los procedimientos conocidos para la purificación de los polipéptidos naturales y recombinantes (por ejemplo la cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, RP-CLA , cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, el procedimiento descrito en el Ejemplo 20.8 o combinaciones de los mismos) . La unión covalente del HAS al polipéptido puede verificarse por el análisis composicional del carbohidrato después de la hidrólisis de la proteína modificada. La demostración de la modificación del HAS en los oligosacáridos N-enlazados del polipéptido se puede lograr mediante la eliminación de los N-glicanos modificados por HAS y la observación del cambio previsto en la movilidad más alta en SDS-PAGE +/- análisis de Western Blotting. La modificación del HAS del polipéptido en los residuos de cisteína se puede demostrar mediante la falla para detectar el correspondiente Cys-péptido proteolítico en RP-CLA y MALDI/TOF-MS en los fragmentos proteolíticos del producto modificado por HAS (Zhou y colaboradores, 1998, Application of capillary electrophoresis , liquid chromatography, electrospray-mass spectrometry and matrix-assisted laserdesorption/ionization - time of flight - mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin. Electrophoresis, 19(13), 2348-55). El aislamiento de la fracción que contiene HAS al cabo de la digestión proteolítica de la EPO Cys-modificada permite la verificación en esta fracción del correspondiente péptido mediante el análisis composicional del aminoácido convencional . Todas las modalidades descritas anteriormente con respecto al HAS-polipéptido de la invención referentes a las propiedades del polipéptido o HAS aplican también al método de la invención para la producción de un conjugado HAS-polipéptido. Además, Todas las modalidades descritas anteriormente con respecto al HAS-EPO o la preparación del mismo que se refieren a los péptidos en general o al HAS se aplican también al método de la invención para la producción de un conjugado HAS-polipéptido. La invención además se refiere a un HAS-polipéptido, que se obtiene por el método de la invención. Preferiblemente, este HAS-polipéptido tiene las características definidas para el HAS-polipéptido anterior de la invención. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el HAS utilizado tiene la siguiente fórmula (I) en donde R1# 2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado. El término " idroxialguilalmidón" como se utiliza en la presente invención no está limitado a los compuestos donde el radical carbohidratado terminal comprende los grupos de hidroxialquilo ¾, R2 y/o R3 como se describe, por cuestiones de brevedad, en la Fórmula (I) , pero también se refiere a los compuestos en los cuales al menos un grupo hidroxi presente en cualquier lado, ya sea en el radical carbohidratado terminal y/o en la parte restante de la molécula de almidón, HAS', está sustituido por un grupo hidroxialquilo Rl7 R2, o R3. En este contexto, el grupo alquilo puede ser un grupo alquilo lineal o ramificado que puede estar convenientemente sustituido. Preferiblemente, el grupo hidroxialquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono, y aún más preferiblemente 2-4 átomos de carbono. El "hidroxialquilalmidón" , por lo tanto, comprende preferiblemente hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón, en donde hidroxietilalmidón e hidroxipropilalmidón son preferidos en forma particular, se prefiere especialmente hidroxietilalmidón. El HAS y preferiblemente HES se pueden hacer reaccionar con un compuesto de reticulación que reacciona con el HAS, preferiblemente el HES, y el polipeptido tal como los polipéptidos descritos anteriormente. La reacción entre el HAS y el compuesto de reticulación puede tener lugar en el extremo de reducción del HAS o en el extremo de reducción oxidado del HAS . Por lo tanto, el HAS puede hacerse reaccionar con una estructura de acuerdo con la fórmula (I) y/o, en el caso que el extremo de reducción se oxide, de acuerdo con la fórmula (lia) Si el HAS de acuerdo con la fórmula (I) se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, la reacción preferiblemente tiene lugar en un medio acuoso. Si HAS de acuerdo con la formula (lia) y/o (Ilb) se hace reaccionar con un compuesto de reticulación, la reacción preferiblemente tiene lugar en un medio no-acuoso tal como en un solvente aprótico polar o mezcla de solvente tal como DMSO y/o en D F . Si el conjugado HAS -pol ipépt ido de la presente invención se produce mediante la reacción de un derivado de HAS, que comprende el HAS y un compuesto de re iculación, con el radical carbohidratado oxidado del polipéptido, el compuesto de reticulación es preferiblemente un compuesto.
Si el conjugado HAS-polipéptido de la presente invención se produce mediante la reacción de un derivado de HAS, que comprende HAS y al menos un compuesto de reticulación, con el grupo tio del polipéptido, se prefiere hacer reaccionar HAS en su extremo de reducción opcionalmente oxidado con un primer compuesto de reticulación que es preferiblemente un compuesto y hacer reaccionar el derivado HAS resultante con un segundo compuesto de reticulación que es capaz de reaccionar con el derivado HAS y el grupo tio del polipéptido. Si, por ejemplo, el derivado HAS conprende, como grupo funcional que se hace reaccionar con el segundo compuesto de reticulación, la estructura -NH-, corno se describió anteriormente en detalle, se prefieren los siguientes tipos de segundos compuestos de reticulación con grupos funcionales Fl y F2, entre otros: Tipo de Fl F2 Compuesto (L) C Yodoalquilo N-succinimida éster D Bromoalquilo N-succinimida éster E Maleimido N-succinimida éster F Piridilditio N-succinimida éster G Vinilsulfona N-succinimida éster Los ejemplos especialmente preferidos del primer compuesto de reticulación son son particularmente preferidos, y se prefieren los siguientes segundos compuestos de reticulación, el compuesto es especialmente preferido. Dependiendo de las condiciones de reacción respectivas, el solvente o mezcla de solvente utilizado y/o los residuos R' y/o R" de un compuesto R' -NH-R" , con el cual se hace reaccionar el HAS en un medio acuoso, es posible que el derivado de hidroxialquilalmidón que se obtiene por el método o métodos descritos anteriormente pueden tener las siguientes constituciones (Illa) : Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón como se describió anteriormente con una constitución de acuerdo con la fórmula (Illa) . Es posible que, por ejemplo en el caso donde R' es hidrógeno, el derivado de hidroxialquilalmidón que se obtiene por el método o métodos descritos anteriormente pueda tener las siguientes constituciones (Illa) o (Illb) donde (Illa) y (Illb) pueden estar ambos presentes en la mezcla de reacción que tiene una cierta distribución de equilibrio: (lila) Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón como se describió anteriormente con una constitución de acuerdo con la fórmula (Illb) . Además, la presente invención también se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón como se describió anteriormente en una mezcla de constituciones de acuerdo con las fórmulas (Illa) y (Illb) . Dependiendo de las condiciones de reacción y/o la naturaleza química del compuesto R' -NH-R" utilizado para la reacción, los compuestos de acuerdo con la fórmula (Illa) pueden estar presentes con el átomo N en posición ecuatorial o axial donde además una mezcla de ambas formas puede estar presente con un cierta distribución de equilibrio. Dependiendo de las condiciones de reacción y/o la naturaleza química del compuesto R' -NH-R" utilizado para la reacción, los compuestos de acuerdo con la fórmula (Illb) pueden estar presentes con el enlace C-N doble en la conformación E o Z donde además una mezcla de ambas formas puede estar presente con un cierta distribución de equilibrio . En algunos casos puede ser conveniente estabilizar el compuesto de acuerdo con la fórmula (Illa) . Este es especialmente el caso donde el compuesto de acuerdo con la fórmula (Illa) se produce y/o se utiliza en una solución acuosa. Como método de estabilización, la acilación del compuesto de acuerdo con la fórmula (Illa) se prefiere particularmente, especialmente en el caso donde R' es hidrógeno. Como reactivo de acilación, se pueden utilizar todos los reactivos apropiados lo que da por resultado el derivado de hdiroxi lquilalmidón deseado de acuerdo con la fórmula (IVa) .
De acuerdo con modalidades especialmente preferidas de la presente invención, el residuo Ra que es parte del reactivo de acilación es metilo. Como reactivos de acilación, se utilizan preferiblemente los anhídridos de ácido carboxilico, haluros de ácido carboxilico, y ésteres activados de ácido carboxilico. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a un derivado de hidroxialquilalmidón que se obtiene mediante un método como se describió anteriormente donde tal derivado tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (IVa) . La acilación se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 0 a 30 °C, preferiblemente en el intervalo de 2 a 20 °C y especialmente en forma más preferida en el intervalo de 4 a 10 °C. En otros casos puede ser conveniente estabilizar el compuesto de acuerdo con la fórmula (Illb) . Este es especialmente el caso donde el compuesto de acuerdo con la fórmula (Illb) se produce, y/o se utiliza en una solución acuosa. Como método de estabilización, la reducción del compuesto de acuerdo con la fórmula (Illb) se prefiere particularmente, especialmente en el caso donde R' es hidrógeno. Como reactivo de reducción, se pueden utilizar todos los reactivos apropiados lo que da por resultado el derivado de hidroxialquilalmidón deseado de acuerdo con la fórmula (IVb) .
De acuerdo con modalidades especialmente preferidas de la presente invención, como reactivos de reducción se utilizan los hidruros bóricos tales como NaCNBH3 o NaBH .
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón que se obtiene mediante un método como se describió anteriormente en donde tal derivado tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (IVb) . La reducción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 4 a 100 °C, preferiblemente en el intervalo de 10 a 90 °C y especialmente en forma más preferida en el intervalo de 25 a 80 °C. La presente invención también se refiere a mezclas de compuestos (Illa) y (Illb) , (IVa) y (IVb) , (Illa) y (IVa) , (Illa) y (IVb), (Illb) y (IVa) , (Illb) y (IVb), (Illa) y (Illb) y (IVa) , (Illa) y (Illb) y (IVb) , (IVa) y (IVb) y (Illa) , y (IVa) y (IVb) y(IIIb) en donde (Illa) y/o (IVa) que pueden estar independientemente presentes en una conformación en donde el átomo N en posición ecuatorial o axial y/o en donde (Illb) puede estar presente con el enlace doble C-N en la conformación E o Z. La invención además se refiere a un HAS-polipéptido de acuerdo con la invención para utilizar en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal . Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el HAS-polipéptido de la invención. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende además al menos un diluyente, adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable útil en la terapia de eritropoyetina .
La invención además se refiere al uso de un HAS-polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos anémicos o trastornos de disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas. La invención además se ilustra mediante las siguientes figuras, tablas y ejemplos, que de ninguna manera tienen por intención restringir el alcance de la presente invención. Breve Descripción de las Figuras Figura 1 La Figura 1 muestra un análisis de SDS page de dos conjugados HES-EPO mw: marcador Carril 1: HES-EPO producido de acuerdo con el ejemplo protocolo 8: EPO se conjuga con hidrazido-HES 12 D L Carril 2: HES-EPO producido de acuerdo con el ejemplo protocolo 9: EPO se conjuga con hidroxilamino HES 12 KD K C: Control (EPO no conjugada) ; la banda superior representa el dímero EPO. Figura 2 La Figura 2 muestra que el HES se conjuga con un radical carbohidratado de una cadena lateral carbohidratada al exhibir una digestión de las formas de EPO modificadas con HAS con polipéptido N-glicosidasa . Carril 1: HES-EPO producido de acuerdo con el ejemplo protocolo 8 después de la digestión con N-glicosidasa Carril 2: HES-EPO producido de acuerdo con el ejemplo protocolo 9 después de la digestión con N-glicosidasa Carril 3 : BRP EPO estándar Carril 4 : BRP EPO estándar después de la digestión con N-glicosidasa mw: marcador (Bio-Rad SDS-PAGE Standards Low range Catalog No. 161-0305, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU) Figura 3 La figura 3 muestra un análisis de SDS page del conjugado HES-EPO, producido de acuerdo con el ejemplo 17.1. Carril A: Proteína marcador Roti® -Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D) ; pesos moleculares (en kD) de la proteína marcador de la parte superior a la parte inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 y 17. Carril B: El producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 17.1 Carril C: material de inicio de la EPO. Figura 4 La Figura 4 muestra un análisis de SDS page del conjugado HES-EPO, producido de acuerdo con el ejemplo 17.3 Carril A: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 17.3 Carril B : material de inicio de la EPO. Carril C: Proteína marcador Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D) ; pesos moleculares (en kD) de la protelna marcador de la parte superior a la parte inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 y 17. Figura 5 La Figura 5 muestra un análisis de SDS page del conjugado HES-EPO, producido de acuerdo con los ejemplos 17.4 y 17.5. Carril A: Protelna marcador Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D) ; pesos moleculares (en kD) de la proteína marcador de la parte superior a la parte inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 y 17. Carril B: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 17.4 Carril C: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 17.5 Carril D : material de inicio de la EPO. Figura 6 La Figura 6 muestra un análisis de SDS page del conjugado HES-EPO, producido de acuerdo con los ejemplos 19.1 y 19.4 Carril A: Proteína marcador Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D) ; pesos moleculares (en kD) de la proteína marcador de la parte superior a la parte inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 y 17.
Carril B: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.4 Carril C: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.1 Carril D: material de inicio de la EPO. Figura 7 La Figura 7 muestra un análisis de SDS page de los conjugados HES-EPO, producidos de acuerdo con los ejemplos 19.2, 19.3, 19.5, y 19.6. Carril A: Proteína marcador Roti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D) ; pesos moleculares (en kD) de la proteina marcador de la parte superior a la parte inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 y 17. Carril B: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.6, en base al ejemplo 13.3 b) . Carril C: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.5, en base al ejemplo 13.1 b) . Carril D: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.6, en base al ejemplo 13.3 a) . Carril E : Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.5, en base al ejemplo 13.1 a) . Carril F: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.2. Carril G: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.3.
Carril K: material de inicio de la EPO. Figura 8 La Figura 8 muestra un análisis de SDS page de los conjugados HES-EPO, producidos de acuerdo con los ejemplos 19.7, 19.8, 19.9, 19.10, 19.11 y 19.12.
Carril A: Proteína marcador oti®-Mark PRESTAINED (Cari Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D) ; pesos moleculares (en kD) de la proteína marcador de la parte superior a la parte inferior: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 y 17. Carril B: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.11. Carril C: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el E emplo 19.10. Carril D: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ej emplo 19.7. Carril E: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.8. Carril F: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.12. Carril G: material de inicio de la EPO. Carril K: Producto crudo después de la conjugación de acuerdo con el Ejemplo 19.9.
Figura 9 El análisis de SDS-PAGE de EPO-GT-1 se somete a tratamiento de ácido leve durante 5 min. = carril 2; 10 min. = carril 3; 60 min. = carril 4 y EPO no tratada = carril 1; se muestra el cambio de movilización de la EPO después de la eliminación de los N-glicanos (+PNGASE) . Figura 10 El patrón HPAEC-PAD de los oligosacáridos aislados de la EPO no tratada y de la EPO incubada durante 5 min. , 10 min., y 60 min., en condiciones de hidrólisis de ácido leves. Los números romanos I-V indican la posición de elución de I = estructura diantenaria desialilada, II = estructuras triantenarias trisialiladas (dos isómeros) , III = estructura tenaria, II = estructuras triantenarias trisialiladas (dos isómeros) , III = estructura tetraantenaria tetrasialilada + 2 repeticiones de N-acetillactosamina, IV = estructura tetraantenaria tetrasialilada + 1 repetición de N-acetillactosamina , V=estructura tetraantenaria tetrasialilada + sin repetición de N-acetillactosamina. El área de elución de las estructuras oligosacáridas sin, con ácido 1-4 siálico se indica entre paréntesis. Figura 11 El HPAEC-PAD de los oligosacáridos N-enlazados después de desialilación; se muestra la posición de elución del ácido N-acetilneuramínico ; los números 1-9 indican la posición de elución de los oligosacaridos estándar: 1 = biantenario; 2 = triantenario (2-4 isómeros), 3 = triantenario (2-6 isómeros) ; 4 = tetraantenario; 5 = triantenario más 1 repetición; 6 = tetraantenario más 1 repetición; 7 = triantenario más 2 repeticiones; 8 = tetraantenario más 2 repeticiones y 9 = tetraantenario más 3 repeticiones . Figura 12 El análisis de SDS-PAGE de la EPO sin tratar o con trato suave que está sometida a la oxidación de peryodato de los residuos de ácido siálico. 1 = peryodato oxidado sin tratamiento de ácido; 2 = peryodato oxidado con tratamiento de ácido de 5 min. ; 3 = peryodato oxidado y tratamiento de ácido de 10 min. ; 4 = peryodato oxidado sin tratamiento de ácido; 5 = BRP EPO estándar sin peryodato y sin tratamiento de ácido . Figura 13 El patrón de HPAEC-PAD de los oligosacaridos naturales aislados de la EPO sin tratar y de la EPO incubada durante 5 min y 10 min en condiciones de hidrólisis de ácido leves y subsiguiente tratamiento de peryodato. El área de elución de las estructuras de oligosacáridos y con ácido 1-4 siálico se indica entre paréntesis 1-5. Figura 14 El análisis de SDS-PAGE del transcurso del tiempo de la modificación de HES de la EPO-GT-1-?: 20 µ< alícuotas de EPO-GT-1-? se hizo reaccionar con derivado de HES modificado con hidroxilamina X durante 30 min, 2, 4 y 17 horas. Carril 1 = 30 min de tiempo de reacción; carril 2 = 2 horas de tiempo de reacción; carril 3 = 4 horas de tiempo de reacción; carril 4 = 17 horas de tiempo de reacción; carril 5 = EP0-GT-1-A sin modificación de HES. La figura de la izquierda muestra el cambio en la movilidad de la EPO-GT-1-? con un aumento en el tiempo de incubación en presencia del HES modificado con hidroxilamina (velocidad de flujo: 1 ml-min"1) X: Carril 1 = 30 min de tiempo de reacción; carril 2 = 2 horas de tiempo de reacción; carril 3 = 4 horas de tiempo de reacción; carril 4 = 17 horas de tiempo de reacción; carril 5 = EPO-GT-1-? con modificación de HES. La figura sobre la derecha muestra el análisis de las mismas muestras después de su tratamiento con N-glicosidasa. Figura 15 El análisis de SDS-PAGE de las fracciones de Q-Sefarosa de los conjugados HES-EPO. Cada 1% del flujo que atraviesa y 1% de la fracción que eluye en concentraciones elevadas de sal se concentraron en un concentrador Speed Vac y se cargaron sobre los geles en el amortiguador de muestra. La proteína EPO se manchó con azul de Coomasie. A = muestra I; B = muestra II; C = muestra III; = EPO-GT-1 de control; Al, Bl, Cl y Kl indicaron la fracción de flujo pasante; A2, B2, C2 y K2 indican la fracción eluida con una concentración elevada de sal . Figura 16a El análisis de SDS-PAGE de la muestra A2 de la EPO modificada con HES (ver Fig. 15) , muestra 2 de la EPO control, y preparación de la EPO EPO-GT-l-A se digirieron en presencia de N-glicosidasa para eliminar los oligosac ridos N-enlazados. Todas las muestras de EPO mostraron el cambio de movilidad hacia formas de peso molecular bajo o con contenido de O-glicano. Una relación más baja de la proteína O-glicosilada y no-glicosilada se observó para la muestra A2 de la EPO modificada con HES después de la glicosilación y una banda de proteína difusa se detectó alrededor de 30 KDa, presumiblemente representando la modificación de HES en el ácido siálico del residuo O-glicano (ver la flecha marcada por un asterisco) . Figura 16b Análisis de SDS-PAGE después de la hidrólisis leve de la muestra A2 de EPO modificada con HES (ver Figura 15) , muestra K2 de EPO control y EPO-GT-1A que estaba sin tratar o digerida en presencia de N-glicosidasa para remover los oligosacários N-enlazados (ver Figura 16a) . Tanto la forma de peso molecular alto de A2 antes y A después del tratamiento de N-glicosidasa (ver paréntesis con y sin flecha) desaparecieron con el tratamiento de ácido de las muestras. La BRP EPO estándar que se ejecutó para comparación no se sometió a tratamiento de ácido leve. Figura 17 Análisis HPAEC-PAD del material oligosacárido N-enlazado liberado de la muestra A modificada con HES, de la EPO-GT-1-? y de un control de la muestra de EPO incubada con HES sin modificar (K) . Los números romanos I-V indican la posición de elución de I = estructura diantenaria desialilada, II = estructuras triantenarias trisialiladas (dos isómeros) , III = estructura tetraantenaria tetrasialilada + 2 repeticiones de N-acetillactosamina, IV = estructura tetraantenaria tetrasialilada + 1 repetición de N-acetillactosamina, V = estructura tetraantenaria tetrasialilada + sin repetición de N-acetillactosamina; los paréntesis indican el área de elución de N-glicanos di-, tri-y tetrasialilados como se informa en las leyendas de las Figuras 10 y 13. Figura 18 Análisis HPAEC-PAD del material oligosacárido N-enlazado liberado de la muestra A modificada con ???, de la EPO-GT-1-? ? de un control de la muestra (K) de EPO incubada con HES sin modificar. Se muestran los tiempos de retención de una mezcla de oligosacáridos estándar: los números 1-9 indican la posición de elución de los oligosacáridos estándar: 1 = biantenario; 2 = triantenario (2-4 isómeros), 3 triantenario (2-6 isómeros) ; 4 = tetraantenario; 5 triantenario más 1 repetición; 6 = tetraantenario más 1 repetición; 7 = triantenario más 2 repeticiones; 8 = tetraantenario más 2 repeticiones y 9 tetraantenario más 3 repeticiones. Figuras 19 a 25 Las Figuras 19 a 25 representan un espectro de masa MALDI/TOF de los N-glicanos desialilados químicamente y liberados enzimát reamente aislados de la EPO modificada con HES y las preparaciones de EPO control. Las principales señales en m/ z 1809.7, 2174,8, 2539.9, 2905.0 y 3270.1 ( [M+Na] +) corresponden a las estructuras N-glicano del tipo complejo bi- a tetranantenario con sin, una o dos repeticiones de N-acetillactosamina acompañada de señales débiles debido a la pérdida de fucosa o galactosa que se debe a las condiciones de hidrólisis ácida empleada para la desialilacion de muestras para el análisis de EM. Figura 19 Espectro MALDI/TOF: oligosacaridos desialilados de EPO A2 modificada con HES. Figura 20 Espectro MALDI/TOF : oligosacáridos desialilados de EPO GT-1-A. Figura 21 Espectro MALDI/TOF: oligosacáridos desialilados de EPO 2.
Figura 22 Espectro MALDI/TOF: oligosacáridos desialilados de EPO GT-1. Figura 23 Espectro MALDI/TOF: oligosacáridos desialilados de EPO GT-1 sometidos a hidrólisis de ácido durante 5 minutos . Figura 24 Espectro MALDI/TOF: oligosacáridos desialilados de EPO GT-1 sometidos a hidrólisis de ácido durante 10 minutos . Figura 25 Espectro MALDI/TOF: oligosacáridos desialilados de EPO GT-1 sometidos a hidrólisis de ácido durante 60 minutos . Ej emplos Ej emplo 1 Producción de EPO recombinante A) Producción en células mamíf eras EPO recombinante se produjo en células CHO de la siguiente forma Un plásmido que protege el ADNc de EPO humana se clonó en el vector de expresión eucariótica (pCR3 y se nombró posteriormente pCREPO) . La mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo utilizando los procedimientos estándares como se describieron (Grabenhorst , Nimtz, Costa y colaboradores, 1998, In vivo specificity of human alpha 1,3/4-fucoxyl transferases III-VII in the biosíntesis of Lewis (x) and sialyl Lewis (x) motifs on complex-type N-glycans -Coexpression studies from BHK-21 cells together with human beta-trace protein, J. Biol . Chem., 273(47), 30985-30994) . Las células CHO que expresan de manera estable la EPO humana o las variantes de aminoácidos (por ejemplo Cys - 2 -»Ser/Ala , o Cys -33—»Ser/Ala , Ser-126—»Ala, etc.) de las mismas se generan con el método de precipitación de fosfato de calcio y se seleccionan con G418-sulfato como se describió (Grabenhorst y colaboradores) . Tres días después de la transfección, las células se subcultivaron 1:5 y se seleccionaron en DMEM con contenido de 10% de FBS y 1.5 g/litro de G418 sulfato. Utilizando este procedimiento de selección, usualmente sobrevivieron 100-500 clones y donde se propagaron en el medio de selección durante otro período de tiempo de 2-3 semanas. Los sobrenadantes del cultivo de células de las monocapas que se desarrollan en forma confluente luego se analizaron para los niveles de expresión de la EPO mediante el análisis de Western blot y mediante el análisis de IEF/Western Blot. La EPO se produjo a partir de subclones estables en frascos giratorios o en 21 reactores de perfusión. Se aislaron diferentes glicoformas de la EPO con diferentes cantidades de NeuAc (por ejemplo residuos 2-8, 4-10, 8-12 NeuAc) de acuerdo con los protocolos publicados utilizando las combinaciones de varios procedimientos cromatográficos como se describió anteriormente. Literatura : Graben orst , Conradt , 1999, The cytoplasmic, transmembrane , and stem regions of glycosyl transferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi . , J Biol Chem. , 274(51), 36107 16; Grabenhorst, Schlenke, Pohl , Nimtz, Conradt, 1999, Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells, Glycoconj J. , 16 (2) , 81 97; Mueller, Schlenke, Nimtz, Conradt, Hauser, 1999, Recombinant glycoprotein product quality in proliferation controlled BHK-21 cells, Biotechnology and bioengineering, 65(5), 529 536; Schlenke, Grabenhorst, Nimtz, Conradt, 1999, Construction and characterization of stably transfected BH 21 cells ith human type sialylation characteristic, Cytotechnology, 30(1 3), 17 25. B) Producción en células de Insectos La EPO humana recombinante se produjo a partir de las líneas celulares de insectos SF9 y SF 21 después de la infección de las células con el vector baculovirus recombinante que contiene el ADNc de la EPO humana bajo el control del promotor de polihedrina como se describió en la literatura . Las células desarrolladas en el medio de cultivo libre de suero se infectaron a la densidad celular de 2x10s o X107 células por mi y se determinaron los títulos de la EPO cada día en los sobrenadantes del cultivo celular. La EPO se purificó mediante cromatografía de afinidad en sefarosa Azul, cromatografía de intercambio iónico sobre matriz de Q-Sefarosa y finalmente RP-CLAR sobre Fase-C . La pureza del producto se controló mediante SDS-PAGE y secuenciamiento de N-terminal. El análisis estructural carbohidratado detallado (N- y O-glicosilación) se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos publicados. Literatura: Grabenhorst, Hofer, Nimtz, Jager, Conradt, 1993, Biosynthesis and secretion of human interleukin 2 glycoprotein variants from baculovirus infected Sf21 celia. Characterization of polypeptides and posttranslational modifications, Eur J Biochem. , 215(1), 189 97; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652 7. Ej emplo 2 Formación de derivados de HES reactivos 1. HES con SH reactivo 1.1 Reacción del EMCH con 0xo-HES12KD para formar HES12KD con SH reactivo 0.144 g (0.012 mmol) de Oxo-HES12KD (Fresenius Patente Alemana DE 196 28 705 Al) se disolvieron en 0.3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron en gotas en nitrógeno a una mezcla de 34 mg (0.15 mmol) de EMCH (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) en 1.5 mi de DMSO. Después de agitar durante 19 horas a 60 °C la mezcla de reacción se agregó a 16 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona. El precipitado se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 3 mi de DMSO y se precipitó nuevamente como se describió. El HES12KD b con grupos SH-reactivo se obtuvo por centrifugación y secado a vacío. La reacción de conjugación con Tio-EPO se describe en el Ejemplo 3, 2.2.
Alternativas : En esta reacción, se pueden utilizar todos los agentes de reticulación que exhiben una función hidracida y una función maleimida, separados por un espaciador. Otros ejemplos para las moléculas de ese grupo, disponibles de Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Alemania se muestran en la tabla 2; marcado con una WA" . Además, también podría utilizarse otro grupo de agentes de reticulación que exhiben una función disulfuro activada en lugar de una función maleimida. 1.2 Derivados de Halogenacetamida de glicosilaminas de HES a) Formación de glicosilamina1 Una muestra de 1 mg de HES12 D se disolvió en 3 mi de bicarbonato de amonio saturado. El bicarbonato de amonio sólido adicional luego se agregó para mantener la saturación de la solución a lo largo de la incubación durante 120 horas a 30 °C. El amino-HES12KD C se desaló por liofilización directa de la mezcla de reacción. b) Acilación de la glicosilamina C con anhídrido de ácido cloroacético Una muestra de 1 mg de Amino-HES12KD C se disolvió en 1 mi de bicarbonato sódico 1M y se enfrió en hielo. A esto se agregó un cristal de anhídrido de ácido cloroacético sólido (~5 mg) , y la mezcla de reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente . El pH se monitoreó y se agregaría una base adicional si el pH cayera por debajo de 7.0. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se agregó una segunda alícuota de base y anhídrido. Después de seis horas el producto Cloracetamida-HES DI (X = Cl) se desaló mediante el pasaje sobre un lecho mezclado de resinas de intercambio iónico de Amberlite MB-3 (H) (OH) . c) Acilación de la glicosilamina con anhídrido bromoacét ico2 Se preparó anhídrido bromoacético como se describió por Thomas3. Una muestra de 1 mg de amino-HES12 D C se disolvió en 0.1 mi de DMF seco y se enfrió en hielo y se agregó 5 mg de anhídrido bromoacético. La mezcla de reacción se llevó lentamente a temperatura ambiente y la solución se agitó durante 3 horas. La mezcla de reacción se agregó a 1 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona con -20 °C. El precipitado se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 0.1 mi de DMF y se precipitó nuevamente como se describió. El bromoacetamida-HES D2 (X = Br) se obtuvo por centrifugación y se secó a vacío. La reacción de conjugación con Tio-EPO se describe en el Ejemplo 3, 1.2. d) El derivado correspondiente de Yodo D3 (X = 1) se sintetizó como se describió para D2. En lugar de anhídrido bromoacético se utilizó yodoacetato N-succinimidilo y se realizaron todas las etapas en la oscuridad.
Alternativas : Para la acilación de los grupos amino, se pueden utilizar otras formas activadas de ácidos alogenados , por ej emplo bromuros o cloruros ésteres, por ejemplo N-hidroxisuccinimida éster, esteres con fenoles sustituidos (p-nitrofenol , pentafluorfenol , triclorofenol , etc.) Además, se podrían utilizar todos los agentes de reticulación que tienen un grupo amino reactivo y una función halógeno acetilo, separado por un espaciador. Un ejemplo del mismo es SBAP. Esta molécula y otras están disponibles de Perbio Science Deutschland GmbH, Boon, Alemania. Estos están marcados en la tabla 2 con una "D" . Para el uso como agentes de reticulación para la unión de amino-HES con tio-EPO sin aislamiento de los derivados de halogenacetamida-HES, ver las observaciones en el ejemplo 3, 1.2. 1.3 Derivados de Amino-HES E1 de Halogenacetamida a) Reacción de 1. -diaminobutano con 0xo-HES12 D con amino-HES12 D E4 1.44 g (0.12 mmol) de Oxo-HES12KD se disolvieron en 3 mi de dimetilsulfóxido seco (DMSO) y se agregaron en gotas en nitrógeno a una mezcla de 1.51 mi (15 mmol) de 1.4-diamonobutano en 15 mi de DMSO. Después de agitar durante 19 horas a 40 °C la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona. El precipitado Amino-HES12KD E se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 4 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, valor límite de 3.5 KD. Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó. b) Cloroacetamida-HES12KD Fl se preparó como se describió para el cloroacetamida-HES12KD DI en 1.3 anterior. c) Bromoacetamida-HES12KD F2 (X = Br) se preparó como se describió para la Bromoacetamida-HES12KD D2 en 1.3 anterior. La reacción de conjugación con Tio-EPO se describe en el Ejemplo 3 , 1.2. d) El correspondiente derivado de Yodo F2 (X = I) no se aisló antes de su reacción con Tio-EPO. El experimento se describe en el Ejemplo 3, 1.1.
Alternativas : Ver 1.2 anterior 2. HES con CHO reactivo 2.1 Hidracida-HES a) Reacción de hidracida con Oxo-HES12KD 1.44 g (0.12 mmol) de Oxo-HES12KD se disolvieron en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (D SO) y se agregaron en gotas en nitrógeno a una mezcla de 0.47 mi (15 mmol) de hidrazina en 15 mi de DMSO. Después de agitar durante 19 horas a 40°C la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona. El producto precipitado J se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 2 dias contra 0.5% (v/v) de trietilamina en solución acuosa y durante 2 dias contra agua (Tubo de diálisis SnakeSkin, valor limite de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland, GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó. La reacción de conjugación con Glico-EPO oxidada se describe en el Ejemplo 4, 2.2.
Reacción de dihidracida adípica con Oxo-HES12KD 1.74 g (15 mmol) de dihidracida adípica se disolvieron en 20 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) a 65 °C y 1.44 g (0.12 mmol) de Oxo-HES12KD, disuelto en 3 mi de DMSO absoluto se agregaron en gotas en nitrógeno . Después de agitar durante 68 horas a 60 °C la mezcla de reacción se agregó a 200 mi de agua. La solución con contenido L se dializó durante 2 días contra 0.5% (v/v) de trietilamina en solución acuosa durante 2 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, valor límite 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó. La reacción de conjugación con Glico-EPO oxidado se describe en el Ejemplo 4, 2.2. Alternativas : Además, se pueden utilizar los derivados, en donde los grupos 2 de hidracida se separan por espaciador. 3. Otros Derivados de Amino-HES12KD I y H1 La ammonolísis de D o F se llevó a cabo en forma separada disolviendo 1 mg de muestra de cada halogenacetamida en 0.1 mi de carbonato de amonio saturado. El carbonato de amonio sólido adicional luego se agregó para mantener la saturación de la solución durante la incubación de 120 horas a 30 °C. La mezcla de reacción se agregó a 1 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona con -20°C. El precipitado se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 0.05 mi de agua y se precipitó nuevamente como se describió. El producto aminoHES H o I se obtuvo por centrifugación y secado a vacío. La reacción de conjugación con Glico-EPO oxidada se describe en el Ejemplo 4, 4.1. 0- [2- (2 -aminooxi-etoxi) -etil] -hidroxilamina se sintetizó como se describió por Boturyn y colaboradores en 2 etapas a partir de materiales disponibles en el mercado5. 1.44 g (0.12 mmol) de Oxo-HES12 D se disolvieron en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron en gotas en nitrógeno a una mezcla de 2.04 g (15 mmol) de 0-[2-(2-aminooxi-etoxi) -etil] -hidroxilamina en 15 mi de DMSO. Después de agitar durante 48 horas a 65 °C la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona. El producto precipitado K se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 4 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, valor límite 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó. La reacción de conjugación con glico-EPO oxidada se describe en el Ejemplo 4, 3.1. Alternativas : Además, se podrían usar derivados en donde los dos grupos hidroxilamina se separan mediante cualquier espaciador . 5. TÍO-HES12KD 5.1 Adición a Oxo-HES12KD M 1.44 g (0.12 mmol) de Oxo-HES12KD se disolvieron en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron a una mezcla de 1.16 g (15 mmol) de cisteamina en 15 mi de DMSO bajo nitrógeno en gotas. Después de agitar durante 24 horas a 40 °C la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona. El producto precipitado M se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 2 días contra una solución de trietilamina 0.5% (v/v) en agua y durante 2 días contra agua (tubos de diálisis SnakeSin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó. La reacción de conjugación con Glico-EPO oxidada se describe en el Ej emplo 4 , 2.1. Alternativas : Se podrían utilizar derivados, en donde el grupo amino y la función tio se separan mediante cualquier espaciador. Además, el grupo amino en los derivados podría reemplazarse por una hidracina, una hidracida o una hidroxilamina . La función tio podría estar protegida en la forma de por ejemplo un derivado disulfuro o un tritilo. Sin embargo, en este caso, debe realizarse otra etapa de desprotección antes de la conjugación, que liberaría un componente que es análogo a M. 5.2 Modificación de Amino-HES12KD E, H o I a) Modificación con SATA/SATP 1.44 g (0.12 mmol) de Amino-HES12KD E, H o I se disolvieron en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron a una mezcla de 139 mg (0.6 mmol) de SATA en 5 mi de DMSO bajo nitrógeno en gotas. Después de agitar durante 24 horas a temperatura ambiente la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona. El producto precipitado N se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 2 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSin, corte de 3.5 D, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó . La desprotección se llevó a cabo en un amortiguador de fosfato sódico 50 mM, que contiene EDTA 25 mM e hidroxilamina 0.5M, pH 7.5 durante 2 horas a temperatura ambiente y el producto O se purificó mediante diálisis contra un amortiguador de acetato sódico 0.1 M a pH 5.5, que contiene EDTA 1 mM. La reacción de desprotección se llevó a cabo inmediatamente antes de la reacción de conjugación que se describe en el Ejemplo 4, 2.1. b) Modificación con SPDP 1.44 g (0.12 mmol) de Amino-HES12KD E, H o I se disolvieron en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaré en gotas a una mezcla de 187 mg (0.6 mmol) de SPDP en 5 mi de DMSO bajo nitrógeno. Después de agitar durante 24 horas a temperatura ambiente la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 de etanol y acetona. El producto precipitado P se recolectó por centrifugación, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 2 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó . La desprotección se llevó a cabo en una solución de 12 mg de ditiotreitol (DTT) por 0.5 mi de amortiguador de acetato sódico 100 mM, que contiene cloruro de sodio 100 mM a pH 4.5 durante 30 minutos a temperatura ambiente y el producto Q se purificó mediante diálisis contra un amortiguador de acetato sódico 0.1M a pH 5.5, que contiene EDTA 1 mM. La reacción de desprotección se llevó a cabo inmediatamente antes de la reacción de conjugación que se describe en el Ejemplo 4, 2.1.
Alternativas : Para la conversión de los grupos amino a tiol, ya sea en forma libre o protegida, se dispone de varios reactivos. Después de la modificación, los productos se podían aislar. Alternativamente, como se acepta para el uso de los agentes de reticulación, podrían utilizarse directamente para la reacción de conjugación, preferentemente al cabo de una etapa de purificación. Para el aislamiento y almacenamiento de derivados tio-HES, puede ser útil la síntesis de los derivados tio-HES en una forma protegida. Para esto, todos los derivados que son análogos a SATA se podrían utilizar, los cuales tienen una función éster activa y una función tioéster, separada mediante cualquier espaciador. SATP, que es otro miembro de este grupo, se encuentra en la tabla 2 , marcado con una "H" . Los derivados que son análogos a SPDP podrían tener una función éster activa y una función disulfuro, separada mediante cualquier espaciador. Otros miembros de estos grupos se hallan en la tabla 2 , marcados con una "F" . Otros derivados análogos podrían tener una función éster activa y una función tiol, protegida como un derivado tritilo, separado mediante cualquier espaciador.
Ejemplo 3 Reacciones de Conjugación con Tio-EPO 1. Reacción de Tio-EPO con un HES con grupos sulfidrilo reactivo modificado con halogenacetamida 1.1 Ejemplo Protocolo 1 La conjugación de TioEPO con Amino-HES12KD (E, H o I) con un agente de reticulación que contiene un éster activado con NHS y un grupo yodoacetamida, por ejemplo SIA. 6 Materiales A. amortiguador de borato. La coMOPSición era borato sódico 50 mM, pH 8.3, EDTA 5 mM. B. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. C. Amino-HES12KD E, H o I. Preparado en 1 mg/ml en amortiguador de borato. D. Solución base del agente de reticulación: 14 mg, de SIA se disolvieron en 1 mi de DMSO. E. Columnas de Desalazón de D-Salt™ Dextran, volumen de lecho 2 x 5 mi (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) F. Reactivo de Ensayo de Proteina de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) G. Solución TioEPO : 5 mg/ml de TioEPO 1 en amortiguador de borato . H. Microconcentrador : Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Alemania) Método 100 µ? de solución de SIA se agregó a 400 µ? de la solución de aminoHES12KD E y se dejó reaccionar con agitación durante 0.5 horas a temperatura ambiente . El agente de reticulación de exceso se eliminó mediante centrifugación de la muestra a 14000 x g durante 60 minutos utilizando un microconcentrador. Después de centrifugar la muestra se llevó a su volumen original en amortiguador de borato y este proceso se repitió dos veces más. La solución residual se agregó a 1 mi de solución de TioEPO y la mezcla de reacción se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reactividad de la yodoacetamida de exceso se enfrió rápidamente al final del periodo de incubación mediante la adición de cisteína hasta una concentración final de 10 mM. La mezcla de reacción se aplicó a una columna desalinizada equilibrada con amortiguador de PBS y el contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína de Coomassie. Todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche .
Alternativas : En esta reacción, se podrían utilizar todos los agentes de reticulación, que tienen una función succinimida o sulfosuccinimida y una función yodoacetamida separada mediante un espaciador. Otros ejemplos se encuentran en la Tabla 2. Se marcaron con una "C" y están disponibles de Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania. 1.2 Ejemplo del Protocolo 2 La conjugación de TioEPO 1 a bromoacetamida D2 , F2 HES12KD con grupo sulfidrilo reactivo o yodoacetamida D3.7 Materiales A. Amortiguador de fosfato. La coMOPSición era fosfato sódico 100 mM, pH 6,1, EDTA 5 mM.
B. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4. C. bromoacetamida D2 HES12KD con grupo sulfidrilo reactivo. Preparado en 10 mg/ml en amortiguador de fosfato. D. Columnas de Desalinización de D-Salt™ Dextran, volumen de lecho 2 x 5 mi (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) E. Reactivo de Ensayo de Proteína de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) F. Solución TioEPO: 5 mg/ml de TioEPO 1 en amortiguador de fosfato .
Método Una solución de 1 mi de bromoacetamida D2 HES12KD con grupo sulfidrilo reactivo y 1 mi de solución de TioEPO se combinaron y la mezcla de reacción se incubó durante 48 horas a temperatura ambiente. La reactividad de la bromoacetamida de exceso se enfrió rápidamente al final del período de incubación mediante la adición de cisteína a una concentración final de 10 mM. La mezcla de reacción se aplicó a una columna de desalinización, equilibrada con amortiguador de PBS . El contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína de Coomassie, todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche .
Alternativas : En lugar del aislamiento de la bromoacetamida D2 HES12 D con grupo sulfidrilo reactivo, el HES12KD de amino (E, H, I) podría estar enlazado con un agente de reticulación mediante una función succinimida y bromoacetamida (ver 1.1 anterior) . SBAP es un miembro de este grupo de agentes de reticulación y se encuentra en la tabla 2, marcada con una "D" . 2. Reacción de TioEPO con un HES con grupo sulfidrilo reactivo modificado con maleimida 2.1 Ejemplo del Protocolo 3 La conjugación de TioEPO con HES12KD con un agente de reticulación que contiene un grupo funcional hidracida y maleimida, por ejemplo M2C2H.
Materiales A. Stock M2C2H: 10 mg/ml de M2C2H en DMSO, preparado fresco B. HES12KD: 10 mg/ml en amortiguador de acetato sódico 0.1 M, pH 5.5 C. Solución de TioEPO: 5 mg/ml de TioEPO en amortiguador de fosfato/NaCl D. Fosfato/NaCl : fosfato sódico 0.1 M, NaCI 50 mM, pH 7.0 E. icroconcentrador : Microcon ??-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Alemania) F. Columna de Filtración de Gel : por ejemplo, Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) G. Reactivo de Ensayo de Proteina de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) H. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4.
Método Una solución de M2C2H se agregó a 400 µ? de la solución HES12KD a una concentración final de 1 mM y se dejó reaccionar con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. El agente de reticulación de exceso se eliminó centrif gando la muestra a 14000 x g durante 60 minutos utilizando un microconcentrador. Después de centrifugar, la muestra se llevó a su volumen original en amortiguador de fosfato/NaCl y este proceso se repitió dos veces más. Al HES12KD modificado con M2C2H se agregó 0.5 mi de solución de TioEPO y la mezcla de reacción se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La reactividad de las maleimidas de exceso se enfrió rápidamente al final del periodo de incubación por la adición de cisteina a una concentración final de 10 mM. La mezcla de reacción se aplicó a Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) equilibrada con amortiguador de PBS y se recolectó 1 mi de fracciones. El contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína de Coomassie. Todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche .
Notas de Procedimiento El aducto de hidrazona es levemente menos estable en los extremos de pH. Para aplicaciones que pueden involucrar el tratamiento a pH bajo, se redujo la hidrazona mediante tratamiento con cianoborohidruro sódico 30 mM en amortiguador de PBS a una hidracina. Para la mayoría de las aplicaciones, esta etapa extra es innecesaria. 2.2 Ejemplo del Protocolo 4 Conjugación de TioEPO con Maleimido-HES12KD B. Materiales A. Maleimido-HES12KD B: 10 mg/ml en amortiguador de acetato sódico 0.1 M, pH 5.5. B. Solución TioEPO: 5 mg/ml de TioEPO en amortiguador de fosfato/NaCl C. Fosfato/NaCl: fosfato sódico 0.1 M, NaCl 50 mM, pH 7.0 D. Columna de filtración de gel : por ejemplo, Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) E. Reactivo de Ensayo de Proteína de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) F. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 m , pH 7.4.
Método 1 mi de solución de HES12KD B con grupo sulfidrilo reactivo y 1 mi de solución de TioEPO 1 se combinaron y la mezcla de reacción se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente . La reactividad de las maleimidas de exceso se enfrió rápidamente al final del período de incubación por la adición de cisteína hasta una concentración final de 10 mM. La mezcla de reacción se aplicó a Sehadex® G-200 (1.5 x 45 cm) equilibrada con amortiguador de PBS y se recolectó 1 mi de fracciones. El contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína Coomassie. Todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y se obtuvo el conjugado por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche. 2.3 Ejemplo del Protocolo 12 La conjugación de TioEPO con aminoHES12KD (E, H, I) con un agente de reticulación que contiene un áster activado con NHS y un grupo maleimida, por ejemplo SMCC Materiales A. Microconcentrador : Microcon YM-10 (amicon, Milipore, GmbH, Eschborn, Alemania) . B. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 ttiM, NaCl 150 mM, pH 7.4. C. AminoHES12KD E, H, o I. Preparado en 10 mg/ml en amortiguador de PBS . D. Solución de SMCC: 1 mg de SMCC se disolvió en 50 µ? de DMSO E. Columnas de Desalinización de D-Salt™ Dextran, volumen de lecho 2 x 5 mi (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) F. Reactivo de Ensayo de Proteína de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) G . Solución TioEPO 1: 5 mg/ml de TioEPO 1 en amortiguador de PBS.
Método A una solución de 50 µ? de SMCC se agregó 400 µ? de la solución aminoHES12KD E y la mezcla de reacción se dejó reaccionar con agitación durante 80 min a temperatura ambiente y durante 10 min a 46°C. El agente de reticulación de exceso se eliminó centrifugando la mezcla de reacción a través de un microconcentrador a 14000 x g durante 60 minutos. El volumen se llevó hasta 450 µ? con amortiguador de PBS y el proceso se repitió dos veces más. Después de la última centrifugación, la solución residual se llevó hasta 450 µ? con PBS y se agregó a 1 mi de solución de TioEPO y la mezcla de reacción se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reactividad de la maleimida de exceso se enfrió rápidamente al final del período de incubación mediante la adición de cisteína hasta una concentración final de 10 mM. La mezcla de reacción se aplicó a una columna de desalinización equilibrada con amortiguador de PBS. El contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína de Coomassie, todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche. Alternativas : En esta reacción, se podrían utilizar todos los agentes de reticulación que tienen una función succinimida o sulfosuccinimida y una función maleimida, separada mediante un espaciador. Otros ejemplos de este grupo de moléculas, disponibles de Perbio Science Deutschland GmbH, Alemania, se encuentran en la tabla 2, marcados con una ??" . Hay otro grupo de agentes de reticulación, que tienen en lugar de una función de maleimida una función disulfuro activada. Estos agentes de reticulación también se utilizan para la conjugación. Sin embargo, el enlace disulfuro del conjugado es escindible en condiciones de reducción. Los miembros de este grupo están marcados en la tabla 2 con una "F" . Un tercer grupo de agentes de reticulación utiliza en lugar de una función maleimida, una función vinilsulfon como un grupo sulfidrilo reactivo. Un miembro de este grupo "SVSB" está marcado en la tabla 2 con una "G" . Ejemplo 4 Reacciones de conjugación con EPO oxidada 1. Oxidación de Glico-EPO 1.1 Oxidación de Glico-EPO con meta-peryodato sódico: Ejemplo del Protocolo 5 Materiales A. Solución de Glico-EPO: 10 mg/ml de Glico-EPO en amortiguador de acetato B. Solución de meta-peryodato sódico: peryodato sódico 10 mM o 100 m en amortiguador de acetato, preparado fresco. Se mantiene en la oscuridad. Utilizando estas soluciones, la concentración final de peryodato sódico en la mezcla de oxidación es 1 mM o 10 mM respectivamente. C. amortiguador de acetato: amortiguador de acetato sódico 0.1 M, pH 5.5 D. Glicerol E. Microconcentrador : Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Alemania) Método Todas las etapas se llevaron a cabo en la oscuridad. A 1 mi de solución de Glico-EPO frío se agregó 0.1 Mi de meta-peryodato sódico frío y la reacción de oxidación se dejó procesar durante 1 hora en la oscuridad. Si la Glico-EPO a ser oxidada contuviese residuos de ácido siálico, entonces las condiciones de oxidación eran peryodato sódico 1 mM, 0°C. De lo contrario, se utilizaba peryodato sódico 10 mM a temperatura ambiente. Para detener la oxidación, se agregó glicerol hasta una concentración final de 15 mM y se incubó durante 5 minutos a 0°C. Los reactivos de exceso y los subproductos se eliminaron mediante centrifugación del producto a 14000 x g durante 60 minutos utilizando un microconcent rado . Después de centrifugar, la muestra se llevó hasta su volumen original en el amortiguador utilizado en la próxima etapa de modificación, por ejemplo en el amortiguador de acetato. Este proceso se repitió dos veces más. 1.2 Oxidación enzimática de Glico-EPO: Ejemplo del Protocolo 6 La oxidación enzimática de la EPO se describe en todas partes (Chamow y colaboradores, 1992, J. Biol . Chem. , 267, 15916-15922) . 2. Conjugación con Derivados de Hidracina/Hidracida 2.1 Ejemplo del Protocolo 7 La conjugación de Glico-EPO oxidada con Tio-HES12KD , 0 o Q con un agente de reticulación que contienen un grupo funcional hidracida y maleimida, por e emplo M2C2H (Perbio Science Deutschland GmbH, Alemania) .
Materiales A. Base M2C2H: 10 mg/ml de M2C2H en DMSO, preparado fresco B. Solución de Glico-EPO oxidada de 6.1.1: 5 mg/ml de Glico-EPO en amortiguador de acetato C. Tio-HES12KD M, O o Q: 10 mg/ml en amortiguador de fosfato/NaCl D. Amortiguador de fosfato: amortiguador de acetato sódico 0.1 M, pH 5.5 E. Posfato/MaCl : fosfato sódico 0.1 M, NaCl 50 mM, pH 7.0 F. Microconcentrador : Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Alemania) G. Columna de Filtración de Gel : por ejemplo, Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) H. Reactivo de Ensayo de Proteína de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) I. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4.
Método A una solución base M2C2H se agregó hasta 1 mi de Glico-EPO oxidada a una concentración final de 1 mM y se dejó reaccionar con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. El agente de reticulación de exceso se eliminó centrifugando la muestra a 14000 x g durante 60 minutos utilizando un microconcentrador . Después de centrifugar la muestra se llevó hasta su volumen original en amortiguador de fosfato/NaCl y este proceso se repitió dos veces más. A la Glico-EPO modificada con M2C2H se agregó 1 mi de solución de Tio-EHS12KD M, 0 o Q y la mezcla de reacción se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reactividad de las maleimidas de exceso se enfrió rápidamente al final del período de incubación mediante la adición de cisterna. La mezcla de reacción se aplicó a Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) equilibrado con PBS y se recolectó 1 mi de fracciones. El contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína de Coomassie, todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche. Notas de Procedimiento El aducto de hidrazona es levemente menos estable en los extremos de pH. Para aplicaciones que pueden involucrar el tratamiento a pH bajo, se redujo la hidrazona mediante tratamiento con cianoborohidru.ro sódico 30 mM en amortiguador de PBS a una hidracina. Para la mayoría de las aplicaciones, esta etapa extra es innecesaria. 2.2 Ejemplo del Protocolo 8 Conjugación directa de Glico-EPO oxidada con Hidrazido-HES12KD L o J. Materiales A. Solución de Glico-EPO oxidada de 6.1.1: 5 mg/ml de Glico-EPO en amortiguador de acetato. B. Hidrazido-HES12KD L o J: 10 mg/ml en amortiguador de acetato C. Amortiguador de acetato: amortiguador de acetato sódico 0.1 M, pH 5.5 D. Columna de filtración de gel : por ejemplo, Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) E. Reactivo de Ensayo de Proteína de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) F. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4. Método 1 mi de solución de Hidrazido-HES12KD L o J y 1 mi de Glico-EPO oxidada se combinaron y la mezcla de reacción se dejó reaccionar con agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se aplicó a Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) equilibrada con PBS y se recolectó 1 mi de fracciones. El contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína de Coomassie, todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche. El resultado de la conjugación se muestra en la Figura 24. El cambio molecular observado muestra que la conjugación fue exitosa. Los resultados grasosos de la heterogeneidad de HES. La Figura 25 muestra que HES se conjuga con un radical carbohidratado de una cadena lateral carbohidratada . Notas de Procedimiento El aducto de hidrazona es levemente menos estable en los extremos de pH. Para aplicaciones que pueden involucrar el tratamiento a pH bajo, se redujo la hidrazona mediante tratamiento con cianoborohidruro sódico 30 mM en amortiguador de PBS a una hidracina. Para la mayoría de las aplicaciones, esta etapa extra es innecesaria. 3. Conjugación con Derivados de Hidroxilamino 8 3.1 Ejemplo del Protocolo 9 Conjugación de Glico-EPO oxidada con Hidroxilamino- HES12KD K. Materiales A. Solución de Glico-EPO oxidada de 6.1.1: 5 mg/ml de Glico-EPO en amortiguador de acetato. B. Hidroxilamino-HES12KD K: 10 mg/ml en amortiguador de acetato C. Amortiguador de acetato: amortiguador de acetato sódico 0.1 M, pH 5.5 D. Columna de filtración de gel: por ejemplo, Sephadex® G-200 (1.5 X 45 cm) E. Reactivo de Ensayo de Proteína de Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) F. PBS, solución salina amortiguada con fosfato: fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4. Método 1 mi de solución de Hidroxilamino-HES12KD K y 1 mi de Glico-EPO oxidada se combinaron y la mezcla de reacción se dejó reaccionar con agitación durante 16 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se aplicó a Sephadex® G-200 (1.5 x 45 cm) equilibrada con PBS y se recolectó 1 mi de fracciones. El contenido de proteína de las fracciones se monitoreó con un reactivo de ensayo de proteína de Coomassie, todas las fracciones que contienen el conjugado de proteína se reunieron y el conjugado se obtuvo por liofilización después de la diálisis contra agua durante la noche. El resultado de la conjugación se muestra en la Figura 24. El cambio molecular observado muestra que la conjugación fue exitosa. Los resultados grasosos de la heterogeneidad de HES . La Figura 25 muestra que HES se conjuga con un radical carbohidratado de una cadena lateral carbohidratada.
Ejemplo 5 Caracterización de N-glicanos de EPO tratados con galactosa oxidasa La EPO recombinante o formas de EPO desialiladas parcialmente (generadas por hidrólisis de ácido leve limitado) se incubaron con galactosa oxidasa en presencia de catalasa a 37°C desde 30 min - 4 horas a 37°C en amortiguador de fosfato Na 0.05 H 7.0. El avance de la reacción se monitoreó mediante eliminación de 50 yg alicuotas de la EPO y subsiguiente tratamiento de la proteína con polipéptido N-glicanasa . Los oligosacáridos N-enlazados liberados (monitoreados por SDS-PAGE detección del polipéptido de-N-glicosilado) se sometieron a mapeo HPAEC-PAD como se describió (Grabenhorst y colaboradores, 1999, Nimtz y colaboradores, 1993/1994, Schelenke y colaboradores, 1999) antes y después de la eliminación de ácidos siálicos. La cuantificación de los residuos de galactosa oxidada en oligosacáridos EPO individuales se llevó a cabo mediante el cambio típico observado en HPAEC-PAD y se verificó además mediante MALDI/TOF MS de las mezclas de oligosacáridos. Ejemplo 6 Caracterización de la EPO modificada con HAS La separación de las formas de EPO modificadas con HAS de la EPO sin reaccionar y las moléculas precursoras HAS se logró medíante filtración de gel utilizando por ejemplo Ultrogel AcA 44 / 54 o un medio de filtración de gel similar. Alternativamente, el HAS sin reaccionar se eliminó mediante aislamiento por inmunoafinidad de la EPO en una columna de 4 mi que contiene un anticuerpo monoclonal acoplado a Affigel (BioRad) y la subsiguiente separación de la EPO sin modificar mediante filtración de gel (por ejemplo utilizando una matriz que permite la separación de las proteínas globulares de una masa molecular entre 20 kDa y 200 kDa) . Las EPOs modificadas con HAS se identificaron mediante análisis SDS-PAGE (utilizando 12.5 o 10% de geles de acrilamida) a través de la detección de su peso molecular más alto comparado con la EPO sin modificar al cabo de la tinción de los geles con Coomassie Azul Brillante. El peso molecular más alto de los polípéptidos de EPO modificados con HAS también se identificó mediante análisis de inmunotransferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal contra la EPO humana recombinante . La modificación de las formas EPO con N-glicano se demostró por su eliminación exitosa de la proteína EPO con el polipéptido N-glicanasa (N-glicosidasa recombinante de Roche, Alemania empleando 25 unidades / mg de proteína EPO a 37 °C durante 16 horas) ; el análisis mediante SDS-PAGE dio por resultado un cambio típico de la proteína EPO a una posición de migración de la EPO sin modificar tratada con N-glicosidasa de aproximadamente 20 K a. La modificación de la EPO tratada con galactosa oxidasa y desialilada con 0-glicano en Ser 126 se demostró mediante migración por SDS-PAGE del producto de-N-glicosilado por detección de su posición de migración comparado con la EPO de-N-glicosilada sin reaccionar. En caso necesario, la EPO modificada se fracciona mediante RP-CLAR en una fase-C8 antes del análisis SDS-PAGE. La modificación de la EPO con HAS O-glicano también se analizó mediante eliminación ß del O-glican y detección de la forma de-O-glicosilada de EPO en inmunotransf erencias Western utilizando un anticuerpo policlonal producido contra la EPO humana recombinante . Ej emplo 7 Cuantif icación de EPO y las formas EPO modificadas Las formas EPO se cuantificaron mediante mediciones UV como se describió en Ph.Eur (2000, Erythropoietin solutio concentrata, 1316, 780-785) y se comparó con la EPO de referencia BRP Internacional estándar. Alternativamente, las concentraciones EPO se determinaron mediante un ensayo de RP-CLAR utilizando una columna RP-C4 y absorción a 254 nm empleando 20, 40, 80 y 120 de la preparación de la EPO de referencia BRP estándar para calibración.
Ejemplo 8 Actividad biológica in-vitro de la EPO humana recombinante modificada con HES La EPO modificada con HES purificada se ensayó para actividad utilizando el ensayo de bioactividad de la eritropoyetina según lo descripto por Krystal [Krystal, 1984, Exp. Hematol . , 11, 649-660] . Se indujo anemia en los ratones MRI mediante el tratamiento con clorhidrato de fenilhidracina y las células del bazo se recolectaron y se utilizaron como se describe en [Fibi y colaboradores, 1991, Blood, 77, 1203 ff.]. Las diluciones de la EPO se incubaron con 3xl05 células/pozo en placas de microtítulo de 96 pozos. Al cabo de 24 horas a 37°C en una atmósfera húmeda (5% de C02) las células se marcaron durante 4 horas con 1 µ?? de 3H-timidina por pozo. La radioactividad incorporada se determinó mediante conteo de centelleo líquido. La EPO estándar de referencia Internacional (BRP-estándar) se utilizó para comparación. Alternativamente, la bioactividad de la EPO se midió mediante un ensayo in vitro utilizando la línea celular TF-1 sensible de la EPO (Kitamura y colaboradores, [J. Cell Phys . , 140. 323-334]. Las células de crecimiento exponencial se lavaron libres de factores de crecimiento y se incubaron en presencia de diluciones seriales de la EPO durante otras 48 horas. La proliferación de las células se determinó utilizando el ensayo de reducción ??? como se describe por Mosmann [Mosman, 1983, J. Immunol . Methods, 65, 55-63] . Ejemplo 9 Determinación de la actividad in-vivo de la EPO y formas EPO modificadas con HAS Las determinaciones de la actividad in vivo se llevaron a cabo en ratones normocitémicos midiendo el incremento de reticulocitos después de 4 días posteriores a que los animales recibieron la dosis prevista de la EPO o las formas de la EPO modificada. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando la BRP EPO estándar que se calibró contra la WHO EPO estándar en el ensayo de ratón policitémico . Las muestras de la EPO se diluyeron en solución salina amortiguada con fosfato que contiene 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (Sigma) . 0.5 mi de la solución de ensayo de la EPO en solución salina amortiguada de Dulbecco (correspondiente a un equivalente de proteína EPO de un 100, 80, 40 o 20 IU/ml de la BRP EPO estándar) se infestaron en forma subcutánea por animal . La muestras de sangre se tomaron después de 4 días de ser inyectados y los reticulocitos se tiñeron con naranja de acridina; la cuantificación de los reticulocitos se llevó a cabo mediante citometría de flujo contando un total de 30,000 glóbulos rojos dentro de las 5 horas de tomada la muestra de sangre (ver Ph., Eur. , 2000, Erythropoietin solutio concentrata, 1316, páginas 780-785) y European Phamacopeia (1996/2000, anexa 2002) . Ejemplo 10 Determinaciones de tiempo de vida media in vivo Los conejos se inyectaron en forma intravenosa con las cantidades específicas de las formas EPO modificadas con HAS o sin modificar. Las muestras de sangre se obtuvieron en tieMOPS específicos, y se preparó el suero. Los niveles de eritropoyetina de suero se determinaron por bioensayo in vi tro o por un ELISA comercial específico de EPO. Ejemplo 11 Farmacocinética in vivo En ratones: Cada animal recibió 300 IU de EPO/kg en forma subcutánea. Siete días después del postratamiento se determinó el hematocrito de cada animal . Se observó un incremento sustancial en el hematocrito en todos los animales tratados con EPO modificada, un resultado esperado en vista del término de vida medio relativamente corto de la EPO sin tratar. El cambio medio en el hematocrito del grupo tratado con EPO modificada fue significativamente diferente del aquél del grupo de la EPO sin tratar y el del grupo de control. En conejos: Los conejos se trataron con una sola dosis de EPO modificada con HAS o sin modificar correspondiente a 200 o hasta 800 ng/kg de peso corporal.
Después de 2, 6, 16, 24 y 48 horas, se analizaron las muestras de sangre utilizando un ELISA comercial específico de EPO para la determinación de las concentraciones de plasma. Las concentraciones medias de EPO en el plasma se determinaron y el promedio inicial de término medio de vida (fase-a) y los términos medios de vida terminales (fase-ß) se calcularon de los valores ELISA como se describe: (Zettlmissl y colaboradores, 1989, J. Biol . Chem. 264, 21153-21159) . Literatura : Sytkowski, Lunn, Risinger, and Davis, 1999, An Erythropoietin Fusión Protein Comprised of Identical Repeating Domains Exhibitis Enhanced Biological Properties, J. Biol. Chem., 274, 24773-24778. Ejemplo 12 Determinación de la actividad biológica in vítro de la IL-2 humana recombinante modificada con HES La IL2 modificada se recuperó mediante filtración de gel en Ultrogel AcA 54. Las alícuotas de la fracción correspondiente se filtraron para esterilidad y la bioactividad de la IL2 se determinó utilizando la línea celular CTLL-2 murino dependiente de IL2 [Gillis, Ferm, On, and Smith, 1978, J.Immunol., 120, 2027-2032]. La actividad se relacionó con preparación de la IL2 estándar de referencia internacional .
Ejemplo 13 Formación de derivados de almidón de idroxietilo por animación reductora del extremo de reducción no oxidado Ejemplo 13.1 Reacción del almidón de hidroxietilo con l,3-diamino-2- hidroxi propano A una solución de 200 mg de almidón de hidroxietilo (HES18/0.4 (MW = 18,000 D, DS=0.4) en 5 mi de agua, se agregaron 0.83 mmol de 1, 3-diamino-2-hidroxi propano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNBH3. La mezcla resultante se incubó a 80 °C durante 17 horas. La mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v) . El precipitado se recolectó por centrifugación y se dializó durante 4 días contra agua- (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Sciencie Deutschland GmbH, Bonn, D) , y se liofilizó. También fue posible la incubación de la mezcla resultante de la adición de 0.83 mmol de 1,3-diamino- 2-hidroxi propano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNBH3 a la solución de 200 mg del almidón de idroxietilo y se llevó a cabo a 25 °C durante 3 días. Ejemplo 13.2 Reacción del almidón de hidroxietilo con 1, 2-dihidroxi-3- amino propano a) A una solución de 200 mg de almidón de hidroxietilo (HES18/0.4 (MW = 18, 000 D, DS=0.4) en 5 mi de agua, se agregaron 0.83 mmol de 1, 2-dihidroxi-3 -amino propano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNB¾. La mezcla resultante se incubó a 80 °C durante 17 horas. La mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v) . El precipitado se recolectó por centrifugación y se dializó durante 4 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Sciencie Deutschland GmbH, Bonn, D) , y se liofilizó.
La reacción de 1, 2-dihidroxi-3-amino propano con HES se confirmó indirectamente por cuantificación del formaldehído, resultando de la división oxidativa del 1,2-diol en el producto de reacción por peryodato como se describe por G . Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983) 449-504. b) También fue posible la incubación de la mezcl resultante de la adición de 0.83 mmol de 1, 2-dihidroxi-3 amino propano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNBH3 a 1 solución de 200 mg de almidón de hidroxietilo y se llevó cabo a 25 °C durante 3 días. Ejemplo 13.3 Reacción del almidón de hidroxietilo con 1,4-diamino butano a) A una solución de 200 mg del almidón de hidroxietilo (HES18/0.4 (MW = 18, 000 D, DS=0.4) en 5 mi de agua, se agregaron 0.83 mmol de 1,4-diamino butano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNBH3. La mezcla resultante se incubó a 80 °C durante 17 horas. La mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1 : 1 fría de acetona y etanol (v/v) . El precipitado se recolectó por centrifugación y se dializó durante 4 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Sciencie Deutschland GmbH, Bonn, D) , y se liofilizó. b) También fue posible la incubación de la mezcla resultante de la adición de 0.83 mmol de 1,4-diamino butano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNBH3 a la solución de 200 mg del almidón de hidroxietilo y se llevó a cabo a 25 °C durante 3 días.
Ejemplo 13.4 Reacción del almidón de hidroxietilo con l-mercapto-2 -amino- etano a) A una solución de 200 mg del almidón de hidroxietilo (HES18/0.4 (MW = 18, 000 D, DS=0.4) en 5 mi de agua, se agregaron 0.83 mmol de l-mercapto-2-amino etano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNBH3. La mezcla resultante se incubó a 80°C durante 17 horas. La mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla 1:1 fría de acetona y etanol (v/v) . El precipitado se recolectó por centrifugación y se dializó durante 4 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Sciencie Deutschland GmbH, Bonn, D) , y se liofilizó. b) También fue posible la incubación de la mezcla resultante de la adición de 0.83 mmol de 1-mercapto- 2 -amino etano y 50 mg de cianoborohidrato sódico NaCNBH3 a la solución de 200 mg del almidón de hidroxietilo y se llevó a cabo a 25 °C durante 3 días.
Ejemplo 14: Formación de derivados del almidón de hidroxietilo por conjugación con el extremo reductor no oxidado Ejemplo 14.1: Reacción del almidón de hidroxietilo con carbohidracida Se disolvieron 0.96 g de HES18/0.4 (PM = 18,000 D, DS= 0.4) en 8 mi de amortiguador de acetato de sodio acuoso 0.1 M, pH 5.2, y se agregaron 8 mmol de carbohidracida (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) . Luego de agitar durante 18 h a 25 °C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla fría de 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó por centrifugado, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua, y se dializó durante 3 d contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Pertain Science Deutschland GmbH, Bonn, D) , y se liofilizó.
Ej emplo 14.2 : Reacción del almidón de hidroxietilo con dihidracida adépica Se disolvieron 0.96 g de HES18/0.4 (PM = 18,000 D, DS-0.4) en 8 mi de amortiguador de acetato de sodio acuoso 0.1 M, pH 5.2, y se agregaron 8 mmol de dihidracida adépica (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) . Luego de agitar durante 18 h a 25 °C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla fría de 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó por centrifugado, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua, y se dializó durante 3 d contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin. corte de 3.5 KD. Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) , y se liofilizó.
Ejemplo 14.3: Reacción del almidón de hidroxietilo con 1,4- fenilen-bis-3 - tiosemicarbacida Se disolvieron 0.96 g de HES18/0.4 (PM = 18,000 D, DS-0.4) en 8 mi de amortiguador de acetato de sodio acuoso 0.1 M, pH 5.2, y se agregaron 8 mmol de 1 , 4-fenilen-bis-3-tiosemicarbacida (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) . Luego de agitar durante 18 h a 25°C, se agregó 8 mi de agua a la mezcla de reacción, y la suspensión se centrifugó durante 15 min a 4,500 rpm. El sobrenadante limpio se decantó y posteriormente se agregó a 160 mi de una mezcla fría de 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó por centrifugado, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua, y se centrifugó durante 15 min a 4,500 rpm. El sobrenadante limpio se dializó durante 3 d contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 D, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn. D) , y se liofilizó. Ejemplo 14.4: Reacción del almidón de hidroxietilo con 0- [2- (2 -aminooxi-etoxi) -etil] -hidroxilamina La O- [2 (2-aminooxi-etoxi) -etil] -hidroxilamina se sintetizó como se describe en Boturyn y colaboradores. Tetrahedron 53 (1997) p. 5485-5492 en dos etapas a partir de materiales disponibles comercialmente . Se disolvieron 0.96 g de HES18/0.4 (PM = 18,000 D, DS= 0,4) en 8 mi de amortiguador de acetato de sodio acuoso 0.1 M, pH 5.2, y se agregaron 8 mmol de O- [2- (2-aminooxi-etoxi) etil] -hidroxilamina. Luego de agitar durante 18. h a 25 °C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla fría a 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recolectó por centrif gado, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua, y se dializó durante 3 d contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) , y se liofilizó.
Ejemplo 15 Formación de los derivados del almidón de hidroxietilo por reacción con el extremo reductor oxidado Ejemplo 15.1 Reacción del almidón de hidroxietilo con carbohidracida Se disolvieron 0.12 mmol de Oxo-HES 10/0.4 (PM = 10,000 D, DS= 0,4, preparado de acuerdo con el docummento DE 196 28 705 Al) en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron gota a gota bajo nitrógeno a una mezcla de 15 mmol de carbohidracida (Sigma Aldrich Taufkirchen, D) en 15 mi de DMSA. Luego de agitar durante 88 h a 65°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla fría de 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El precipitado se recolectó por centrifugado y se dializó durante 4 d contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo 15.2: Reacción del almidón de hidroxietilo con 1,4- fenilen-bis-3 -tiosemicarbacida Se disolvieron 0.12 mmol Oxo-HES 10/0.4 (PM = 10,000 D, DS= 0.4, preparado de acuerdo con el documento DE 19628 705 Al) en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron gota a gota bajo nitrógeno a una mezcla de 15 mmol de 1, 4-fenilen-bis-3-tiosemicarbacida (Lancaster Synthesis, Frankf rt/Main, D) en 15 mi de DMSO. Luego de agitar durante 88 h a 65 °C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla fría de 1:1 de acetona y etanol (v/v) . El precipitado se recolectó por centrifugado y se dializó durante 4 d contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó . Ejemplo 15.3 Reacción del almidón de hidroxietilo con hidracina H2N-NH2 Se disolvieron 1.44 g (12 mmol) de Oxo-HES 10/0.4 (PM = 10,000 D, DS-0.4, preparados de acuerdo con el documento DE 196 28 705 Al) en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron gota a gota bajo nitrógeno a una mezcla de 0.47 mi (15 mmol) de hidracina en 15 mi de DMSO. Luego de agitar durante 19 h a 40 °C la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla a 1:1 de etanol y acetona (v/v) . El producto precipitado se recolectó por centrifugado, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 2 días contra una solución al 0.5% (v/v) de trietilamina en agua y durante 2 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH. Bonn, Alemania) y se liofilizó. Ejemplo 15.4 Reacción del almidón de hidroxietilo con idroxi1amina O- [2- (2-aminooxi-etoxi) -etil] -hidroxilamina se sintetizó como se describe por Boturyn y colaboradores en dos etapas a partir de materiales disponibles comercialmente (Boturyn, Boudali, Constant, Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485). Se disolvieron 1.44 g (0.12 mmol) de Oxo-HES 10/0.4 (PM = 10,000 D, DS=0.4, preparados de acuerdo con el documento DE 19628 705 Al) en 3 mi de dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) y se agregaron gota a gota bajo nitrógeno a una mezcla de 2.04 g (15 mmol) O- [2- (2-aminooxi-etoxi) -etil] -hidroxilamina en 15 mi de DMSO. Luego de agitar durante 48 h a 65 °C la mezcla de reacción se agregó m 160 mi, de una mezcla a 1:1 de etanol y acetona (v/v) . El producto precipitado se recolectó por centrifugado, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 4 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó . Ejemplo 15.5 Reacción del almidón de hidroxietilo con dihidracida adépica Se disolvieron 1.74 g (15 mmol) de dihidracida adépica en 20 mi dimetilsulfóxido absoluto (DMSO) a 65 °C y se agregaron 1.44 g (0.12 mmol) de Oxo-HES 10/0.4 (PM = 10,000 D, DS= 0.4, preparado de acuerdo con el documento DE 196 28 705 Al) , disueltos en 3 mi de DMSO absoluto gota a gota ba o nitrógeno. Luego de agitar durante 68 h a 60 °C la mezcla de reacción se agregó a 200 mi de agua. La solución que contenía el producto de reacción se dializó durante 2 días contra una solución al 0.5% (v/v) de trietilamina en agua y durante 2 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Alemania) y se liofilizó.
Ejemplo 15.6 Reacción del almidón de idroxietilo con 1,4- diamino butano Se disolvieron 1.44 g (0.12 mraol) de Oxo-HES 10/0.4 (PM = 10,000 D, DS-0.4, preparados de acuerdo con el documento DE 196 28 705 Al) en 3 mi de dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro y se agregaron gota a gota bajo nitrógeno a una mezcla de 1.51 mi (15 mmol) 1, 4-diaminobutano en 15 mi de DMSO. Luego de agitar durante 19 h a 40°C la mezcla de reacción se agregó a 160 mi de una mezcla a 1:1 de etanol y acetona (v/v) . El precipitado Amino-HES10KD/0.4 se recolectó por centrifugado, se disolvió nuevamente en 40 mi de agua y se dializó durante 4 días contra agua (tubo de diálisis SnakeSkin, corte de 3.5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, (Alemania) y se liofilizó.
Ejemplo 16 Oxidación de la eritropoyetina La eritropoyetina oxidada se produjo como se describe en el Ejemplo 20. Como eritropoyetina oxidada, se usó EPO-GT-1-? como se describe en el Ejemplo 20.11(c) (EPO-GT-1 sin hidrólisis con ácido, tratada con leve oxidación con peryodato) .
Ejemplo 17: Conjugación de los derivados del almidón de hidroxietilo con la eritropoyetina oxidada del Ejemplo 4 Ejemplo 17.1 Reacción de la eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del Ejemplo 14.1 Se ajustó la EPO oxidada (1.055 g/ l) en amortiguador de PBS 20 mM hasta pH 5.3 con amortiguador de acetato de sodio 5 , pH 5.2. A 19 µ? de la solución de EPO, se agregó 18 µ? de una solución del derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 14.1 (PM = 18 kD 18.7 µ?/µ? en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con Reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe. D) durante la noche . El resultado experimental se muestra en la Fig. 3. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados . El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HER usados y el número de derivados de HES ligados a la proteína.
Ejemplo 17.2 Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del Ejemplo 14.3 La EPO oxidada (1.055 g/µ?) en amortiguador de PBS 20 mM se ajustó hasta un pH 5.3 con amortiguador de acetato de sodio 5 M, pH 5.2. A 19 µ? de la solución de EPO, se agregó 18 µ? de una solución del derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 14.3 (PM = 18 kD; 18.7 µ?/µ? en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen.
Ejemplo 17.3 Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del Ejemplo 14.4 La EPO oxidada (1.055 µ?/µ?) en amortiguador de PBS 20 mM se ajustó hasta un pH 5.3 con amortiguador de acetato de sodio 5 M, pH 5.2. A 19 µ? de la solución de EPO, se agregó 18 µ? de una solución del derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 14.4 (PM =18 kD; 18.7 µ?/µ? en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo para manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche . El resultado experimental se muestra en la Fig. 4. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteina a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES ligados a la proteína.
Ejemplo 17.4 Reacción de la eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del Ejemplo 15.1 La EPO oxidada (1.055 µ?/µ?) en amortiguador de PBS 20 mM se ajustó hasta pH 5.3 con amortiguador de acetato de sodio 5 M, pH 5.2. A 19 µ? de la solución de EPO, se agregó 18 µ? de una solución del derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 15.1 (PM =10 kD; 18.7 g/ l en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche . El resultado experimental se muestra en la Fig . 5. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 17.5 Reacción de eritropoyetina oxidada con el producto de reacción del Ejemplo 15.2 La EPO oxidada (1.055 pg/µ?) en 20 mi de amortiguador de PBS se ajustó hasta un pH 5.3 con amortiguador de acetato de sodio 5 M, pH 5.2. A 19 µ? de la solución de EPO, se agregó 18 µ? de una solución del derivado de HES producido de acuerdo con el ejemplo 15.1 (PM - 10 kD; 18.7 g/µ? en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.2), y la mezcla se incubó durante 16 h a 25°C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE, 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo para manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 5. La conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 18 Formació de Tio-EPO por reducción de la eritropoyetina Se incubaron 241.5 µg de eritropoyetina (EPO-GT-1, ver Ejemplo 20) en 500 µ? de un amortiguador de borato de sodio 0.1 M, EDTA 5 mM, DTT 10 mM (Lancaster Morcambe, Reino Unido), pH 8.3, durante 1 h a 37°C. El DTT se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de VIVASPIN 0.5 mi, 10 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13,000 rpm, luego se lavó 3 veces con el amortiguador de borato y dos veces con un amortiguador de fosfato (0.1 M, NaCl 9.15 M, EDTA 50 mM, pH 7.2) . Ejemplo 19: Conjugación de derivados del almidón de hidroxietilo con tio-eritropoyetina usando un compuesto de reticulación En cada uno de los siguientes ejemplos, se usó éster de N- (alfa-maleimidoacetoxi) succinimida (AMAS) como compuesto de reticulación.
Ejemplo 19.1 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del ejemplo 14.1 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 14.1 y disuelto en 200 µ? de un amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (0.1 M, NaCl 9.15 M, EDTA 50 iri , pH 7.2), se agregaron 10% de una solución de 2.5 pmol de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40 °C. El resto de AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13,000 rpm, se lavó 4 veces y 30 min con el amortiguador de fosfato . A la solución residual, se agregaron 15 µg de TioEPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 µ?/µ? en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen. Carlsbad, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo para manchado oti-Blue Coomassie (Roth, Karlsrhue, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 6. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 19.2 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del ejemplo 14.2 y el compuesto de reticulación ? 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 14.2 y disuelto en 200 µ? de un amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (0.1 , NaCl 9.15 M, EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregaron 10 µ? de una solución de 2.5 µa??? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40 °C. El resto de AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD M CO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13, 000 rpm, se lavó 4 veces y 30 min con el amortiguador de fosfato . A la solución residual, se agregaron 15 µg de TioEPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 µg/µl en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo para manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig. 7. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína.
Ejemplo 19.3 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 14.3 y el compuesto de reticulación A 50 nmol derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 14.3 y disuelto en 200 µ? de un amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (0.1 M, MaCl 9.15 M EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregaron 10 µ? de una solución de 2.5 umol de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40°C. El resto de AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13,000 rpm, se lavó 4 veces y 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual, se agregaron 15 µg de TioEPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 µ /µ1 en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25°C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo para manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 7. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES ligados a la proteina. Ejemplo 19.4 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 14.4 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 14.4 y disuelto en 200 µ? de un amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (0.1 M, NaCl 9.15 M, EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregaron 10 µ? de una solución de 2.5 µt??? AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40°C. El resto de AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 D MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13, 000 rpm, se lavó 4 veces y 30 min con el amortiguador de fosfato . A la solución residual, se agregaron 15 ]ig de TioEPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 µ?/µ? en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-tris Gel/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Cadsbad, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo para manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche El resultado experimental se muestra en la Fig. 6. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 19.5 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 13.1 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 13.1, en condiciones de incubación de 80 °C y 17 h como también de 25°C y 3 d, y disuelto en 200 µ? de un amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (0.1 , NaCl 9.15 M, EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregaron 10 µ? de una solución de 2.5 µp??? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución limpia se incubó durante 80 min a 25 °C y 20 min a 40 °C. El resto de AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD M CO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13,000 rpm, se lavó 4 veces y 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual, se agregaron 15 µg de TioEPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 µg/µl en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche El resultado experimental se muestra en la Fig. 7. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 19.6 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 13.3 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES producido de acuerdo con el Ejemplo 13.3, en condiciones de incubación de 80 °C y 17 h como también de 25 °C y 3 d, y disuelto en 200 µ? de amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M (0.1 M, 9.15 M NaCl, EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregaron 10 µ? de una solución de 25 µ???? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO. La solución limpia se incubó durante 80 min a 25 °C y 20 min a 40 °C. El resto de AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13,000 rpm, se lavó 4 veces y 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual , se agregaron 15 pg de TioEPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 g/µ? en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado de experimento se muestra en la Fig. 7. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados . El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES usados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 19.7 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 15.1 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES, producido de acuerdo con el Ejemplo 15.1 y disuelto en 200 µ? de amortiguador de fosfato (0.1 M, NaCl 9.15 M, EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregó 10 µ? de una solución de 2.5 µt??? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO, y la solución limpia se incubó durante 80 min a 25 °C y 20 min a 40 °C. El AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a 13,000 rpm y se lavó 4 veces durante 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual, se agregaron 15 \ig de Tio-EPO producida de acuerdo con el ejemplo 18 (1 µ?/µ? en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 8. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína.
Ejemplo 19.8 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 15.2 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES, producido de acuerdo con el Ejemplo 15.2 y disuelto en 200 µ? de amortiguador de fosfato (0.1 M, NaCl 9.15 M, EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregaron 10 µ? de una solución de 2.5 µp??? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO, y la solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40°C. El AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a 13,000 rpm y se lavó 4 veces durante 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual, se agregaron 15 µg de Tio-EPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 8. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteina. Ejemplo 19.9 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del ejemplo 15.3 y el compuesto de reticulación A 50 nmol del derivado de HES, producido de acuerdo con el Ejemplo 15.3 y disuelto en 200 µ? de amortiguador de fosfato (0.1 M, NaCl 9.15 M, EDTA 50 mM, pH 7.2), se agregó 10 µ? de una solución de 2.5 umol de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO, y la solución limpia se incubó durante 80 min a 25 °C y 20 min a 40 °C. El AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 M VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a 13,000 rpm y se lavó 4 veces durante 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual, se agregaron 15 pg de Tio-EPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 pg/µ? en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche.
El resultado experimental se muestra en la Fig. 8. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados . El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 19.10 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 15.4 y el compuesto de reticulación A 50 nmol derivado de HES, producido de acuerdo con el Ejemplo 15.4 y disuelto en 200 µ? de amortiguador de fosfato (0.1 M, NaCl 9.15 M, EDTA 50 M, pH 7.2), se agregaron 10 µ? de una solución de 2.5 µp??? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DIVISO, y la solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40°C. El AMAS se eliminó mediante filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE , Hannover, Alemania) a 13,000 rpm y se lavó 4 veces durante 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual, se agregaron 15 µg de Tio- EPO producida de acuerdo con el ejemplo 18 (1 µ?/µ? en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 8. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 19.11 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 15.5 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES, producido de acuerdo con el Ejemplo 15.5 y disuelto en 200 µ? de amortiguador de fosfato (0.1 M, NaCl 9.15 M, 50 m EDTA, pH 7.2), se agregó 10 µ? de una solución de 2.5 µp??? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO, y la solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40°C. El AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE , Hannover, Alemania) a 13,000 rpm y se lavó 4 veces durante 30 min con el amortiguador de fosfato. A la solución residual, se agregaron 15 yg de Tio-EPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 g/µ? en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25 °C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con MuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 8. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteína a pesos moleculares más elevados. El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 19.12 Reacción de la tio-eritropoyetina con el producto de reacción del Ejemplo 15.6 y el compuesto de reticulación A 50 nmol de derivado de HES, producido de acuerdo con el Ejemplo 15.6 y disuelto en 200 µ? de amortiguador de fosfato (0.1 M, NaCl 9.15 M, 50 mM EDTA, pH 7.2), se agregó 10 µ? de una solución de 2.5 µp??? de AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) en DMSO, y la solución limpia se incubó durante 80 min a 25°C y 20 min a 40°C. El AMAS se eliminó por filtración centrífuga con un concentrador de 0.5 mi VIVASPIN, 5 D M CO (VIVASCIENCE, Hannover, Alemania) a 13,000 rpm y se lavó 4 veces durante 30 min con el amortiguador de fosf to .
A la solución residual, se agregaron 15 de Tio-EPO producida de acuerdo con el Ejemplo 18 (1 /ig/zl en amortiguador de fosfato) , y la mezcla se incubó durante 16 h a 25°C. Luego de la liofilización, el producto crudo se analizó por SDS-PAGE con NuPAGE 10% de Bis-Tris Gels/amortiguador de MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) como se describe en las instrucciones provistas por Invitrogen. El gel se mancha con reactivo de manchado Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) durante la noche. El resultado experimental se muestra en la Fig. 8. Una conjugación exitosa se indica a través de la migración de la banda de la proteina a pesos moleculares más elevados . El mayor ancho de banda se debe a la distribución del peso molecular de los derivados de HES utilizados y el número de derivados de HES ligados a la proteína. Ejemplo 20 Producción preparativa de conjugados de HES- EPO Resumen Los conjugados de HES EPO se sintetizaron por acoplamiento de los derivados de HES (pm promedio de 18,000 Dalton; grado de sustitución del hidroxietilo 0.4) a los residuos de ácido siálico parcialmente oxidados (periodato leve) presentes en las cadenas de oligosacáridos de EPO recombinante humana. En base al análisis estructural del carbohidrato las modificaciones introducidas no afectaron la integridad estructural de las cadenas de oligosacáridos del núcleo dado que el MALDI/TOF-MS de los glicanos modificados con HES tratados con ácido leve revelaron cadenas de tipo N-acetillactosamina neutro intactas que no se distinguieron de las observadas en el producto de EPO no modificado. Los resultados obtenidos indican que por lo menos 3 residuos modificados con HES están unidos por cada molécula de EPO en el caso de la preparación de EPO que se sometió a modificación sin la eliminación parcial previa del ácido siálico. Una variante de EPO que carece aproximadamente del 50% de los residuos de ácido siálico de la proteína anterior mostró una movilidad aparente similar de peso molecular elevado en SDS-PAGE (60-110 KDa versus 40 KDa para el estándar BRP EPO) . La EPO modificada con HES es estable bajo condiciones de cromatografía de intercambio iónico estándar a temperatura ambiente a pH 3-10. El bioensayo de EPO en el sistema normocitémico del ratón indica que la EPO modificada con HES tiene una actividad específica 2.5-3.0 veces superior (Ul/mg) en este ensayo cuando se compara con el estándar de referencia de BRP EPO Internacional en base a la determinación de las proteínas con el uso del valor de absorción UV de la Farmacopea Europea y un método de determinación de proteínas EPO RP-CLAR EPO calibrado contra la preparación estándar BRP EPO.
Ej eunplo 20.1 Materiales y métodos (a) Liberación de los oligosacáridos ligados a N por digestión con N-glucosidasa Se incubaron muestras con 25 unidades (de acuerdo con la especificación del fabricante Roche Diagnostics, Alemania) de PNGasa F recombinante durante la noche a 37 °C. La digestión completa se monitoreó a través del cambio en la movilidad específica de la proteína en SDS-PAGE. Los N-glicanos liberados se separaron del polipéptido a través del agregado de 3 volúmenes de etanol al 100% frío e incubación a -20 °C durante por lo menos 2 horas (Schroeter S y colaboradores, 1999). La proteína precipitada se eliminó por centrifugado durante 10 minutos a 4°C a 13,000 rpm. Las pelotillas se sometieron luego a dos lavados adicionales con 500 µ? de etanol al 75% enfriado con hielo. Los oligosacáridos presentes en los sobrenadantes reunidos se secaron en un centrífugo de vacío (concentrador Speed Vac, Savant Instruments Inc., Estados Unidos). Se eliminó la sal de las muestras de glicano usando cartuchos Hypercarb (25 mg o 100 mg de HyperCarb) de la siguiente manera antes del uso: las columnas se lavaron con 3 x 500 µ? de acetonitrilo al 80% (v/v) en TFA al 0.1% seguido de lavados con 3 x 500 µ? de agua. Las muestras se diluyeron con agua a un volumen final de 300 - 600 µ? antes de cargar en el cartucho que luego se lavó en forma rigurosa con agua. Los oligosacáridos se eluyeron con 1.2 mi (cartuchos de 25 mg; 1.8 mi en el caso de los cartuchos de 100 mg) de acetonitrilo al 25% en agua que contenía 0.1% de ácido trifluoroacético (v/v) . Los oligosacáridos eluidos se neutralizaron con NH4OH 2M y se secaron en un concentrador Speed Vac . En algunos casos, la eliminación de sal de los oligosacáridos liberados por la N-glucosidasa se realizó por absorción de la mezcla de digestión de las muestras < 100 g del total de (gluco) proteína en cartuchos Hypercarb de 100 mg . (b) Análisis de los oligosacáridos por desorción de láser asistido por matriz/espectrometría de masa por tiempo de vuelo de ionización (MALDI/TOF/TOF-MS) Se usó un instrumento por tiempo de vuelo (TOF/TOF) "Broker ULTRAFLE : los oligosacáridos originales sin sililo se analizaron usando ácido 2,5-dihidrobenzoico como material absorbente de radiación UV en el modo de iones positivos como también de iones negativos, usando reflexión en ambos casos. Para el análisis por MS-MS, los iones de origen seleccionados se sometieron a disociación inducida por láser (LID) y los iones del fragmento resultante se separaron a través de una segunda etapa de TOF (LIFT) del instrumento. Las soluciones de muestra de 1 µ? y una concentración aproximada de 1-10 µp???-µ?1 se mezclaron con cantidades equivalentes de la matriz respectiva. Esta mezcla se manchó con blanco de acero inoxidable y se secó a temperatura ambiente antes del análisis. Ejemplo 20.2 Preparación y caracterización de EPO recombinante humana (EPO-GT-1) La EPO se expresó a través de células CHO recombinantes como se describió (Mueller PP y colaboradores, 1999, Domer AJ y colaboradores, 1984) y las preparaciones se caracterizaron de acuerdo con métodos descritos en la Farmacopea Europea (Ph. Eur. 4. Monography 01/2002: 1316: Erythropoietin concentrated solution) . El producto final tenía un contenido de ácido siálico de 12 nMol (+/- 1.5 nMol) por cada nMol de proteína. Las estructuras de los oligosacáridos ligados a N se determinaron por HPAEC-PAD y por MALDI/TOF-MS como se describió (Nimtz y colaboradores, 1999, Grabenhorst 1999) . Las preparaciones de EPO que se obtuvieron contenían oligosacáridos di-, tri- y tetrasililados (2-12%, 15-28% y 60-80%. respectivamente, las cadenas sulfatadas y pentasililadas estuvieron presentes en pequeñas cantidades) . Las características generales de glucosilación de las preparaciones de EPO fueron similares a la preparación estándar de BRP EPO internacional . El patrón de enfoque isoeléctrico de la EPO recombinante fue comparable al de la preparación estándar de EPO de referencia con BRP internacional que muestra las isoformas correspondientes. El 25% de la proteína EPO carecía de O-glucosilación en Seri26 de la cadena de polipéptido . Ejemplo 20.3 Preparación de las formas de EPO parcialmente desililadas La proteína EPO GT-1 (2.84 mg/ml) se calentó hasta 80°C en amortiguador de fosfato de Na 20 mM, pH 7.0 y luego se agregó 100 µ? de H2S04 1N por cada 1 mi de solución de EPO; se continuó la incubación durante 5, 10 y 60 min, respectivamente, lo que produjo como rendimiento preparaciones de EPO de diferente grado de sililación. La cuantificación de los oligosacáridos con 0-4 ácidos siálicos se realizó luego de la liberación de los oligosacáridos con N-glucosidasa del polipéptido y el aislamiento de las cadenas ligadas a N se realizó a través de la eliminación de sal usando cartuchos Hypercarb (25 mg HyperSep Hypercarb; Thermo-Hypersil-Keystone, Reino Unido) . Las preparaciones de EPO se neutralizaron a través de la adición de NaOH 1N y se congelaron en N2 líquido y se almacenaron a -20 °C hasta que se las volvió a utilizar. Ejemplo 20.4 Oxidación con periodato de las formas sialiladas de EPO A 10 mg de EPO no tratada o tratada con ácido leve disuelta en 3.5 mi de amortiguador de fosfato-Na 20 mM, pH 7.0 se agregaron 1.5 mi de amortiguador de acetato-Na 0.1 M, pH 5.5 y la mezcla se enfrió hasta 0°C en un baño de hielo; se agregó 500 µ? de peryodato de Na 10 mM y la mezcla de reacción se mantuvo en la oscuridad durante 60 min a 0°C. Luego se agregó 10 µ? de glicerol y se continuó la incubación durante 10 min adicionales en la oscuridad. Las formas de EPO parcialmente oxidada se separaron de los reactivos a través de la eliminación de sal usando concentradores VIVASPIN (10,000 MWCO, PES Vivascience AG, Han-nover, Alemania) de acuerdo con la recomendación del fabricante a 3000 rpm en un cartucho de laboratorio equipado con un rotor de ángulo fijo. Luego de congelar en nitrógeno liquido las preparaciones de EPO se almacenaron en un volumen final de 4 mi a -20°C. Se sometieron alícuotas de 100 µ? de la preparación de EPO parcialmente oxidada a tratamiento con N- glucos idasa y los ol igosacá idos se aislaron usando cartuchos Hypercarb como se describió. Los oligosacáridos se desialilaron por tratamiento . con ácido suave y se analizaron por HPAEC-PAD y sus tiempos de retención se compararon con los de los oligosacáridos estándar auténticos como se describió (Nimtz y colaboradores, 1990 y 1993) .
Ejemplo 20.5 Reducción de disulfuros de EPO con ditioeritretiol Se incubaron 5 mg de EPO-GT-1 en 5 mi de Tris 0.1 M/amortiguador de HCl, pH 8.1 en presencia de ditioeritretiol 30 mM (DTT) a 37°C durante 60 minutos; la eliminación del DTT se logró usando un concentrador Vivaspin a 4°C, 4 ciclos de intercambio de amortiguador. La preparación de EPO reducida final se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -20°C en amortiguador de acetato de Na 50 mM, pH 5.5. Ejemplo 20.6 Determinación de la proteína EPO La determinación cuantitativa de la proteína EPO se realizó a través de la medición de absorción UV a 280 nm de acuerdo con la Farmacopea Europea (European Pharmcopoeia 4, Mono-grap y 01/2002: 1316: erythropoíetin concentrated solution) en un recipiente con una longitud de trayectoria de 1 cm. Además, se cuantificó la EPO a través de la aplicación de un método de RP-CLAR elevando una columna a RP-C4 (Vydac Protein C4 , Cat . # 214TP5410, Grace Vydac, Ca, Estados Unidos) ; el método de CLAR se calibró usando el estándar de referencia de eritropoyetina BRP 1 (European Pharmacopoeia, Conseil de l'Europe B.P. 907-F67029, Stras-bourg Codex 1).
Ejemplo 20.7 Oxidación de la EPO desialilada con oxidasa galactosa Se incubaron 4.485 mg de EPO completamente desialilada en amortiguador de fosfato de Na 20 mM, pH 6.8 en presencia de 16 µ? de catalasa (6214 unidades/200 mi) y 80 µ? de oxidasa galactosa (2250 unidades/ml de Dactylium dendroides (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) ; la incubación a 37 °C se realizó toda la noche; se agregó 2 veces 20 µ? de oxidasa galactosa luego de 4 horas y luego de 8 posteriores al inicio de la incubación. Ejemplo 20.8 Preparación de muestras de EPO para los bioensayos Purificación de la EPO de incubaciones de preparaciones de proteína EPO oxidada con peryodato u oxidasa galactosa con HE3 activado La purificación de las muestras de EPO (eliminación de derivados de HES sin reaccionar) se llevó a cabo a temperatura ambiente. Las mezclas de incubación de EPO (aproximadamente 5 mg de proteina EPO) se diluyeron a 1:10 con amortiguador A (20 mM ácido N-morfolin propan sulfónico [MOPS/Na/OH] en ¾0 bidest . , pH 8.0) y se aplicaron a una columna que contenía 3 mi de Q-Sepharose HP (No. de Código de Pharmacia. 17-1014-03, Lote no. 220211) equilibrados con 10 volúmenes de columna (VC) de amortiguador A usando una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La columna se lavó con 6-8 VC de amortiguador A (velocidad de flujo = 0.8 ml/min) y la elusión se realizó usando amortiguador B (20 mM ácido morfolin etan sulfónico [MES/NaOH) , 0.5 M NaCl en H20 bidest., pH 6.5) a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La EPO se detectó por absorción UV a 280 nm y se eluyó en aproximadamente 6 mi . La columna se regeneró usando 3 VC de amortiguador C (20 mM MES, 1.5 M NaCl en H20 ajustado hasta un pH 6.5) y se re-equilibró usando 10 VC de amortiguador A (velocidad de flujo = 0.7 ml/min) . El intercambio de amortiguador de los eluatos de EPO obtenidos de la etapa de Q-Sepharose se realizó usando concentradores VIVASPIN y amortiguador de solución salina con fosfato (PBS) con cada 3 ciclos de centrifugado por cada muestra; luego se ajustaron las muestras a 2 M con PBS y se almacenaron a -20 ° 0. Sólo <25% de las formas oxidadas de EPO parcialmente desialiladas y posteriormente con peryodato leve que se sometieron a modificación con HES se obtuvieron a partir del eluato de Q-Sepharose dado que bajo las condiciones empleadas las formas de EPO básicas no se unen a la Q-Sepharose y se encontraron en el fluido junto con los derivados de HES sin reaccionar.
Ejemplo 20.9 Cromatografía de intercambio iónico con pH elevado con detección amperométrica pulsada (HPAEC- PAD) Los oligosacáridos desialilados y nativos purificados se analizaron por cromatografía de intercambio iónico con pH elevado (HPAE) usando un sistema Dienex BioLC (Dionex, Estados Unidos) equipado con una columna CarboPac PA1 (0.4 x 25 cm) en combinación con un detector amperométrico pulsado (PAD) (Schróter y colaboradores, 1999; Nimtz y colaboradores, 1999) . Los potenciales del detector (E) y las duraciones del pulso (T) fueron: El: +50 mV, TI: 480 ms; E2: +500 mV, T2 : 120 ms; E3 ; -500 mV, T3 : 60 ms . y el intervalo de salida fue de 500-1500 nA. Los oligosacáridos se inyectaron luego en la columna CarboPac PA1 que se equilibró con 100% de solvente A. Para los oligosacáridos desialilados (velocidad de flujo: 1 ml-min"1) la elusión se realizó aplicando un gradiente lineal (0-20%) de solvente B durante un período de 40 min seguido de un incremento lineal desde 20-100% de solvente B durante 5 min. El solvente A fue NaOH 0.2 M en H20 bidestilada, el solvente B estaba compuesto por NaOAc 0.6 M en solvente A. Para los oligosacáridos nativos, la columna se equilibró con 100% de solvente C (NaOH 0.1 M en H20 bidestilada) y la elución (velocidad de flujo: 1 ml-min"1) se realizó aplicando un gradiente lineal (0-35%) de solvente D durante un período de 48 min seguido de un incremento lineal de desde 35-100% de solvente D durante 10 min. El solvente D estaba formado por NaAc 0.6 M en solvente C. Ejemplo 20.10 Análisis de la composición de monosacaridos de N-glicanos, N-glicanos modificados y proteína EPO por GC-MS Los monosacáridos se analizaron como los correspondientes metil glucósidos luego de la metanólisis, N-reacetilación y trimetilsililación por GC/MS [Chaplin, M. F. (1982) . A rapid and sensitive method for the análisis of carbohydrate . Anal Bio-chem. 123, 336-341] . Los análisis se realizaron en un espectrómetro de masa con trampa iónica Finnigan GCQ (Finnigan MAT cor . , San José, CA) que corría en el modo El equipado con una columna capilar DB5 de 30 m. Programa de temperatura: isotérmico 2 min a 80 °C, luego 10 grados mm"1 m a 300°C. Los monosacáridos se identificaron por su tiempo de retención y patrón de fragmentación característico. Los resultados no corregidos de integración del pico electrónico se usaron para cuantificación . Los monosacáridos que produjeron más de un pico debido a la anomericidad y/o presencia de formas furanoides y piranoides se cuantificaron agregando todos los picos mayores. Se usaron 0.5 yg de mio-inositol como compuesto estándar interno.
Ejemplo 20.11 Resultados Ejemplo 20.11(a) Caracterización de los N-glicanos de EPO-G - 1 (parcialmente desialilada) tratada con ácido suave Las preparaciones de EPO-GT-1 sometidas a tratamiento con ácido suave durante 5, 10 ó 60 min se analizaron por SDS-PAGE antes y después de la liberación de los oligosacáridos ligados a N por incubación con N-glucosidasa como se muestra en la Figura 9. Los oligosacáridos ligados a N se sometieron a mapeo de oligosacáridos por HPAEC-PAD (Figura 10) . La EPO-GT-1 sin tratar contenía >90% de los oligosacáridos ligados a N con 3 ó 4 residuos de ácido siálico mientras que después de 5 min de incubación en presencia de ácido suave <40% de las cadenas de carbohidrato tenía 3 ó 4 residuos de ácido siálico. La HPAPC-PAD de N-glicanos desialilados reveló que la relación de oligosacáridos neutros que se detectaron para la EPO-GT-1 sin tratar y permanecieron estables en las preparaciones sometidas a tratamiento con ácido durante 5, 10 ó 60 min. La MALD/TOF-MS de los glicanos desialilados reveló que <90% de la fucosa proximal estaba presente después del tratamiento con ácido suave de la proteína. Ejemplo 20.11(b) Caracterización de la EPO-GT-1 tratada con peryodato La movilidad por SDS-PAGE de las formas de EPO tratadas con peryodato suave que se sometieron previamente a tratamiento durante 5 y 10 minutos con ácido o que no fueron tratadas se compara en la Figura 12. Las condiciones usadas para la oxidación de los ácidos siálicos con peryodato no cambió el Patrón de SDS-PAGE de las preparaciones de EPO (comparar Fig. 9). La oxidación de los ácidos siálicos produjo una desviación del análisis de los oligosacáridos en HPAEPC-PAD a tiempos de elusión anteriores (comparar Figuras 10 y 13) .
Ejemplo 20.11 (c) Caracterización de derivados de EPO modificados con HES (aa) Transcurso del tiempo de la modificación con HES de EPO-GT-1-? con el derivado de HES X modificado con hidroxilamina, producido de acuerdo con el Ejemplo 14.4 Se agregaron 400 ig de derivado X de HES modificado con hidroxílamina a 20 g de EP0-GT-1-A (EPO oxidada con peryodato suave, no hidrolizada con ácido antes de la oxidación con peryodato suave) en 20 µ? de amortiguador de NaOAc 0.5 M, pH 5.5 y la reacción se detuvo luego de 30 min, 2, 4 y 17 horas, respectivamente, congelando las muestras en nitrógeno líquido. Posteriormente, las muestras se almacenaron a -20 °C hasta análisis adicional. Se agregó amortiguador de muestra de SDS-PAGE y las muestras se calentaron hasta 90°C y se aplicaron sobre SDS-geles. Como se muestra en la Figura 14, los tiempos de incubación más altos produjeron una desviación mayor hacia pesos moleculares más elevados de la proteína. Luego de 17 horas de incubación en presencia del derivado X de HES modificado con hidroxilamina se detectó una banda de protexna manchada con Coomassie difusa que migraba en un área desde 60 hasta 11 KDa, en base a la posición de los estándares de peso molecular (ver parte izquierda de la Fig. 14) . Luego del tratamiento con N-glucosidasa la mayor parte de la proteína se desvió hacia la posición de la EPO de-N-glucosalada (ver Fig. 14. gel derecho; la flecha A indica la posición de la migración de la N-glucosidasa, la flecha B indica la posición de migración de la EPO de des-N-glucosilada; la banda difusa de proteína visible en la región de estándares de peso molecular entre 28 KDa a 36 Kda supuestamente representa formas de EPO que se modifican por HES y el sitio de O-glucosilación de la molécula. En vista de la especificidad de la N-glucosidasa llegamos a la conclusión a partir de este resultado que en realidad la modificación de HES ocurre en los residuos de ácido siálico oxidados con peryodato de los glicanos de la proteína EPO. (bb) Caracterización de los conjugados de HES-EPO Los conjugados de HES-EPO I (que se originan en EPO-GT-1 luego de la oxidación suave con peryodato, es decir, de EPO-GT-1-?) , II (que se obtienen a partir de EPO-GT-1 sometida a 5 min de hidrólisis con ácido y oxidación suave con peryodato) , III (que se obtienen a partir de EPO-GT-1 sometida a 10 min de hidrólisis con ácido y oxidación suave con peryodato) se sintetizaron como se describió con anterioridad. Se incluyó una incubación de control (K) que contenía EPO-GT-1 no modificada bajo las mismas condiciones de amortiguador a las cuales se agregó una cantidad equivalente de HES no modificado. Las mezclas de incubación se sometieron a purificación adicional para el análisis bioquímico posterior de los derivados de HES-EPO. Los conjugados de las incubaciones de HES-EPO E II y III como también la incubación de control K se sometieron a una etapa de purificación con Q-Sepharose como se describió en el titulo "Materiales y Métodos" (Ejemplo 20.8) con la finalidad de eliminar el exceso de reactivo de HES no tratado que, según se esperaba, fluye a través de la columna de intercambio de iones. Debido a las elevadas cantidades de las formas básicas de EPO incluidas en las muestras tratadas anteriormente con ácido II y III esperamos cantidades considerables de producto de EPO modificada de estas incubaciones en el flujo. Como se muestra en la Figura 15, casi la totalidad del material de EPO de las muestras I se mantuvo en la columna Q-Sepharose mientras que sólo aproximadamente un 20-30% de las muestras III y II se recuperó de la fracción que eluyó con alta concentración de sales. Todo el material de las proteínas de las incubaciones con derivado X de HES, tanto en el flujo como en las fracciones que eluyen con alto contenido de sal, tuvo un peso molecular aparente más alto en SDS-PAGE cuando se compara con la EPO de control . Para caracterizar en más detalle la EPO modificada con HES la muestra A y K (ver figura 13) se compararon con la forma de EPO-GT-1-? oxidada con peryodato. Las muestras se sometieron a tratamiento con N-glucosidasa y como se muestra en la Figuras 16a y 16b la liberación de los N-glicanos produjo dos bandas de bajo peso molecular en la posición de las formas de EPO O-glucosilada y no-glucosilada de la preparación estándar de EPO. En el caso de la muestra A se detectó una banda adicional que migra a la posición del estándar de peso molecular de 28 KDa lo que sugiere una modificación de HES en el O-glicano de esta variante de EPO (referirse al Ejemplo 20.11(c) (aa) ) . Esta banda (y también la forma con peso molecular elevado altamente modificada con HES de la EPO N-glucosilada, ver Figs. 16a y 16b) desaparecieron luego de someter las muestras a hidrólisis suave que está de acuerdo con la visión de que la modificación de HES se logró en los residuos de eritropoyetina oxidados con peryodato de ácido siálico. Se hidrolizaron mezclas de incubación de la N-glucosidasa usando condiciones que permiten la completa eliminación de residuos de ácidos siálicos (y además el ácido siálico ligado al derivado de HES) de los oligosacáridos; alteran la neutralización, las mezclas luego se absorben en pequeñas columnas Hypercarb para su eliminación de sales. Las columnas se lavaron vigorosamente con agua seguido de elución de los oligosacáridos neutros unidos con 40% de acetonitrilo en ¾0 que contenía 0.1% de ácido trifluoroacético. Los oligosacáridos resultantes se sometieron a ALDI/TOF-MS . Los espectros de las fracciones de oligosacáridos desialilados del ejemplo A, EPO-GT-l-A y la muestra K mostraron masas idénticas para los oligosacáridos de tipo complejo en m/z = 1810 Da (diantenario) , 2175 -triantenario, 2540 -- tetraantenario, 2906 = tetraantenario más repetición lN-acetillactosamina y 3271 = tetraantenario más 2 repeticiones de N-acetillactosamina; se detectaron pequeñas señales correspondientes a la falta de fucosa (-146) y galactosa (menos 162) que se atribuyen a las condiciones de hidrólisis con ácido aplicadas para la eliminación del ácido siálico (ver MALDI-Figuras 19, 20 y 21) . En un experimento paralelo se absorbió la mezcla de digestión de N-glucosidasa sobre un cartucho RP-C18 de 1 mi (sin la hidrólisis con ácido anterior de los oligosacáridos) y la elución se realizó con 5% de acetonitrilo en agua que contiene 0.1% de TFA; bajo estas condiciones la 'proteína EPO se dejó completamente sobre el material de P y los oligosacáridos se lavaron hasta eliminarlos de la columna con 5% de acetonitrilo en H20 que contenía 0.1% de TFA. La proteína EPO de-N-glucosilada se eluyó con 70% de acetonitrilo en ¾0 que contenía 0.1% de TFA. Las fracciones de oligosacáridos de la etapa en RP-C18 de la muestra A tratada con N-glucosidasa, EPO GT-l-A y la muestra K se neutralizaron y sometieron a eliminación de sales usando cartuchos Hypercarb como se describió con anterioridad. Los oligosacáridos aislados se sometieron a mapeo de HPAEC-PAD antes (ver Figuras 17) y después del tratamiento con ácido suave bajo condiciones que permitieron la eliminación cuantitativa de ácidos siálicos de los glicanos (ver Figuras 18) . El perfil de HPAEC-PAD para el material nativo obtenido de la muestra A modificada con HES mostró sólo señales insignificantes de oligosacáridos, mientras que los oligosacáridos derivados de EPO GT-l-A exhibieron el mismo perfil de glicano que el que se muestra en la Fig. 13 (muestra nombrada EPO-GT-1 luego del tratamiento suave con peryodato) . El perfil de elusión de los oligosacáridos obtenidos de la muestra de EPO de control (K) produjo como rendimiento el patrón esperado (comparar el perfil en la Figura 10) . Para comparación, el perfil de oligosacáridos nativo del estándar internacional de BRP-EPO se incluye para la comparación y como estándar de referencia.
Luego de la hidrólisis con ácido suave, todas las preparaciones de oligosacáridos mostraron un perfil de elusión idéntico de estructuras de oligosacáridos neutras (ver Figuras 18) con la composición cualitativa y cuantitativa esperada de cadenas de carbohidrato tipo complejo di-, tri- y tetraantenarios como se describe en la sección de métodos para la preparación de EPO que se usó como material inicial en el presente estudio. Este resultado demuestra que la modificación con HES de la muestra de EPO produce una ligadura covalente del derivado de HES que se desprende de la proteína EPO por N-glucosidasa y es lábil al ácido dado que se elimina de los N-glicanos usando condiciones de tratamiento suave con ácido conocidas para los carbohidratos desialilados (ver Figuras 16a + 16b) . (ce) Análisis de la composición de monosacáridos de HES-EPO y HES-EPO N-glicanos por GC-MS Para confirmar en forma adicional la modificación de EPO con HES en los N-glicanos de la molécula, se digirieron muestras de EPO con N-glucosidasa y la proteína EPO se adsorbió en cartuchos RP-C18 mientras que el material de oligosacáridos se lavó hasta desaparecer como se describió anteriormente. Como se muestra en la Tabla 3, se detectaron glucosa y derivados de glucosa hidroxietilada sólo en la proteína EPO que se sometió a modificación con HES en los residuos de cisterna y en las fracciones de oligosacáridos de la muestra A2 de EPO. Ejemplo 20.11(d) Ensayo in vivo de la actividad biológica de la EPO modificada con HES El bxoensayo de EPO en el sistema normocitémico del ratón indica que se realizó de acuerdo con los procedimientos descritos en la Farmacopea Europea; El laboratorio que realizó la valoración de EPO utilizó la preparación estándar de referencia Internacional BRP EPO. Para esta preparación ?2 de EPO modificada con HES, se determinó un valor promedio para la actividad específica de 294,600 unidades por mg de EPO de proteina, lo que indica una actividad específica aproximadamente 3 veces mayor cuando se compara con la preparación estándar de referencia Internacional BRP EPO que se incluyó en las muestras enviadas para las valoraciones de actividad. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 4.
Tabla 1 Tipo de Grupo Funcional 1 : Reacción Grupo Funcional 2 : Enlazante con polipéptido Reacción con HES especialmente EPO A Hidrazida (aldehido Maleimido (con grupos reactivo) sulfidrilo reactivo) Tabla 1 continuación Tipo de Grupo Funcional 1 : Reacción Grupo Funcional 2 : Enlazante con polipéptido Reacción con HES especialmente EPO B Hidrazida (aldehido Pidrididitio (con reactivo) grupos sulfidrilo reactivo) C Yodoalquilo (con grupos N-succinimida éster sulfidrilo reactivo) (reactivo en amina) D Bromoalquilo (con grupos N-succinimida éster sulfidrilo reactivo) (amina reactivo) E Maleimido (con grupos N-succinimida éster sulfidrilo reactivo) (amina reactivo) F Pidridilditio (con grupos N-succinimida éster sulfidrilo reactivo) (amina reactivo) G Vinilsulfona (con grupos N-succinimida éster sulfidrilo reactivo) (amina reactivo) Tabla 1 Tabla 1 continuación Tabla 1 continuación Tabla 1 continuación Abreviatura Denominación Química Tipo SIA N-Succinimidilo yodoacetato C 0 SIAB N-Succinimidilo (4-yodoacetilo) aminobenzoato C 0 ' / 1 SMCC Succinimidilo 4- (N-maleimidometilo) E ciclohexano-1-carboxilato 10 SMPB Succinimidilo 4- (p-maleimidofenilo) butirato E 0 0 SMPH Succinimidilo-6- ( -maleimidopropionamido) E hexanoato 15 Tabla 1 continuación Tabla 1 continuación Tabla 1 continuación Tabla 3 Análisis composicional monosacárido de glicanos a partir de EPO modificada con HES y muestras de control * el equivalente de la proteína EPO modificada por Cis-HES se sometió a un análisis de su composición; la proteína EPO se aisló a partir de la mezcla de incubación de HES por cromatografía en una columna de Q-Sefarosa tal como se describió con anterioridad y fue desalinizada por centrifugación utilizando un dispositivo de separación Vivaspin 5. ** Las determinaciones de monosacáridos se realizaron a partir de puestas en movimiento sencillos de los metiloglicosidos pertrimetilosilados; los valores electrónicos integrados de los picos se dan sin corrección para las pérdidas durante el procedimiento de derivación y las recuperaciones de cada compuesto.
Tabla 4 MuestaNo. Desa ciáicfelaMiKSlra Actividad e^ecíficacaJ iladadslamueslia teEPO (enbaseaA280nm y c¾emiinación mediante RP-HPLQ 850247 1. EPO A2 modificada con HES 344,000 U/mg 850248 2. EPO-GT-1-A 82,268 U/mg 850249 3. EPO K2 de Control 121,410 U/mg 850250 4. BRP EPO standard 86,702 U/mg Tabla 4 continuación Referencias para los ejemplos 13 a 20: Nimtz M, Noli G, Paques EP, Conradt HS . Carbohydrate structures of a human tissue plasminogen activator expressed in recombinant Chínese hámster ovary cells . FEBS Lett. 1990 Oct . 1; 271 (1-2) : 14-8 Dorner AJ, asley LC, Kaufman RJ. Increased synthesis of secreted proteins induces expression of glucose-regulated proteins in butyrate-treated Chínese hámster ovary cells. J Biol Chem. 1989 Dec 5; 264 (34):20602-7 Mueller PP, Schlenke P, Nimtz M, Conradt HS, Hauser H Recombinant glycoprotein quality in proliferation-controlled BHK-21 cells. Biotechnol Bioeng. 1999 Dec 5; 65(5) :529-36 Nimtz M, Martin W, Wray V, Kloppel KD, Augustin J, Conradt HS. Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recombinant BHK-21 cells. Eur J Biochem. 1993 Apr. 1; 213(l) :39-56 Hermentin P, Witzel R, Vliegenthart JF, Kamerling JP, Nimtz M, Conradt HS . A strategy for the mapping of N-glycans by high-ph anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Anal Biochem. 1992 Jun; 203(2) :281-9 Schroter S, Derr P, Conradt HS, Nimtz M, Hale G, Kirchhoff C. Male specific modification of human CD52. J Biol Chem. 1999 Oct . 15 ; 274 (42) : 29862-73 REFERENCIAS : Tánger, Wong, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10733-10740; Manger Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10724-10732 2Black, Kiss, Tull, Withers, 1993, Carbohydr. Res., 250, 195 3Thomas, 1977, Methodes Enzymol . , 46362 4S. Frie; Diplomarbeit , Fachhochschule Hamburg, 1998 5Boturyn, Boudali, Constant, Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485 6Cumber/ Forrester, Foxwell, Ross, Thorpe, 1985, Methods Enzymol . , 112, 207 7de Velasco, Merkus, Anderton, Verheul, Lizzio, Van der Zee, van Eden, Hoffmann, Verherof , Snippe, 1995, Infect. Immun. , 63, 961 8Rose, 1994, Am. Chem. Soc, 116, 30 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (85)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Conjugado (HAS-EPO) de hidroxialquilalmidón (HAS ) - eritropoyet ina (EPO), que comprende una o más moléculas HAS, caracterizado porque cada HAS se conjuga con la EPO mediante a) un radical carbohidratado ; o b) un tioéter.
2. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana.
3. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 , caracterizado porque la EPO comprende una o más cadenas carbohidratadas unidas a la EPO mediante glicosilación N- y/o 0-enlazada .
4. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las cadenas laterales carbohidratadas han sido unidas a la EPO durante la producción en células maraíferas, especialmente humanas, insectos o levadura.
5. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el HAS se conjuga con la EPO mediante una molécula enlazante .
6. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el HAS se conjuga con la EPO mediante un radical carbohidratado que es parte de las cadenas laterales carbohidratadas y que está preferentemente oxidada.
7. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el HAS se conjuga con una galactosa o residuo de ácido siálico de las cadenas laterales carbohidratadas .
8. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el átomo S en el tioéter se deriva de una cisteína que se produce en forma natural o de una cisterna agregada .
9. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana y las cisteinas que se producen en forma natural son la cisteína 29 y/o 33.
10. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el HAS se conjuga con la cisteína 29 y la cisteína 33 se reemplaza por otro aminoácido.
11. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el HAS se conjuga con la cisteína 33 y la cisteína 29 se reemplaza por otro aminoácido.
12. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la cisteína agregada ha sido agregada reemplazando un aminoácido que se produce en forma natural por una cisteína .
13. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 12, ca acterizado porque la EPO es la EPO humana y el residuo aminoácido reemplazado es serina 126.
14. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende 1-12, preferentemente 1-6 ó 1-3, más preferentemente 1-4 moléculas de HAS por molécula de EPO .
15. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 , caracterizado porque el HAS se selecciona del grupo que consiste de hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón, e hidroxibuti1almidón .
16. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el HAS es hidroxiet ilalmidón (HES) .
17. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el HES tiene un peso molecular de 1 a 300 kDa, preferentemente 5 a 100 kDa.
18. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 6 17, caracterizado porque el HES exhibe un grado molar de sustitución de 0.1 a 0.8 y un radio entre sustitución C2 : Cs en el intervalo de 2-20, con respecto a los grupos hidroxiet ilo .
19. Método para la producción de un conjugado (HAS-EPO) de hidroxialquilalmidón (HAS)-eritropoyet ina (EPO) , caracterizado porque comprende las etapas de : a) proporcionar una EPO que sea capaz de reaccionar con el HAS modificado, b) proporcionar HAS modificado que sea capaz de reaccionar con la EPO de la etapa a) , y c) hacer reaccionar la EPO de la etapa a) con el HAS de la etapa b) , por el cual se produce un HAS-EPO que comprende una o más moléculas HAS, donde cada HAS se conjuga con la EPO mediante i) un radical carbohidratado ; o ii) un tioéter .
20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porgue la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana. 21. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque la
EPO se produce en forma recombinante .
22. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la EPO comprende una o más cadenas carbohidratadas unidas a la EPO mediante gl icosilación N- y/u 0-enlazada .
23. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque las cadenas laterales carbohidratadas han sido unidas a la EPO durante la producción en células mamíferas, especialmente humanas, insectos o levadura.
24. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, caracterizado porque el HAS se conjuga con la EPO mediante un radical carbohidratado que es parte de las cadenas laterales carbohidratadas .
25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque en la etapa a) la EPO se modifica mediante oxidación de al menos un radical carbohidratado, preferentemente al menos una unidad sacárida terminal, más preferentemente galactosa, de una o más cadenas laterales carbohidratadas de la EPO.
26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la unidad sacárida terminal se oxida después de la eliminación parcial o completa (enzimática y/o química) del ácido siálico terminal .
27. Método de conformidad con las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la unidad sacárida terminal oxidada.
28. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizado porque la EPO comprende al menos un grupo sulfidrilo libre.
29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el grupo sulfidrilo libre es parte de una cisteína que se produce en forma natural o de una cisteína agregada.
30. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la EPO tiene la secuencia de aminoácidos de la EPO humana y las cisteínas que se producen en forma natural son la cisteína 29 y/o 33.
31. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cisteína 33 se reemplaza por otro aminoácido y en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la cisteína 29.
32. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cisteína 29 se reemplaza por otro aminoácido y en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la cisteína 33.
33. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado porque la cisteína agregada ha sido agregada reemplazando un aminoácido que se produce en forma natural por una cisteína .
34. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la EPO es la EPO humana y el residuo de aminoácido reemplazado es serina 126.
35. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 ó 34, caracterizado porque en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la cisteína agregada.
36. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 35, caracterizado porque el HAS se modifica de modo que comprende una función libre de hidracida, hidroxi 1 amina , tiol o semicarbacida si el HAS se conjugo con las radicales carbohidratados oxidados o una función libre de maleimida, disulfuro, o halógeno acetamida si el HAS se debe conjugar con el grupo sulfidrilo .
37. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 36, caracterizado porque la etapa c) se lleva a cabo en un medio de reacción que comprende al menos 10% en peso de H20.
38. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 37, caracterizado porque el HAS se conjuga con la EPO mediante una molécula enlazante .
39. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 38, caracterizado porque el HAS es hidroxiet ilalmidón , hidroxipropilalmidón o hidroxibutilalmidón, preferentemente hidroxiet ilalmidón (HES) .
40. Método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el HES tiene las propiedades como se definieron en cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18.
41. HAS-EPO, caracterizado porque se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 40.
42. HAS-EPO de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque tiene las características de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
43. HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, 41 ó 42, caracterizado para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal .
44. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende el HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, 41 ó 42.
45. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque adicionalmente comprende al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
46. Uso de un HAS-EPO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, 41 ó 42 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos anémicos o trastornos de disfunción hematopoyética .
47. Conjugado (HAS -polipép ido) de hidroxialquilalmidón (HAS ) -polipépt ido , que comprende una o más moléculas HAS, caracterizado porque cada HAS se conjuga con el polipéptido mediante c) un radical carbohidratado , o d) un tioéter.
48. HAS -pol ipéptido de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el polipéptido es de origen humano.
49. HAS -pol ipépt ido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 ó 48, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de eritropoyetina, interleucinas , especialmente interleucina- 2 , IFN-ß, IFN-alfa, CSF, interleucina 6 y anticuerpos terapéuticos.
50. HAS -pol ipépt ido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 49, caracterizado porque el polipéptido comprende una o más cadenas laterales carbohidratadas unidas al polipéptido mediante glicosilación N- y/u O-enlazada.
51. HAS -pol ipépt ido de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque las cadenas laterales carbohidratadas han sido unidas al polipéptido durante la producción en células mamíferas, especialmente humanas, insectos o 1 evadura .
52. HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51, caracte izado porque el HAS se conjuga con el polipéptido mediante una molécula enlazante.
53. HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, caracterizado porque el HAS se conjuga con el polipéptido mediante un radical carbo idratado que es parte de las cadenas laterales carbohidratadas y que está preferentemente oxidado.
54. HAS-polipéptido de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el HAS se conjuga con un residuo de galactosa de las cadenas laterales carbohidratadas .
55. HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 54, caracterizado porque el átomo S en el tioéter se deriva de una cisteína que se produce en forma natural o de una cisteína agregada.
56. HAS-polipéptido de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la cisteína agregada ha sido agregada reemplazando un aminoácido que se produce en forma natural por una cisteína.
57. HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 56, caracterizado porque comprende 1-12, preferentemente 1-6 ó 1-3, más preferentemente 1-4 moléculas de HAS por molécula de polipéptido.
58. HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 57, caracterizado porque el HAS se selecciona del grupo que consiste de hidroxiet ilalmidón , hidroxipropilalmidón e hidroxibut ilalmidón .
59. HAS-polipéptido de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el HAS es hidroxiet ilalmidón (HES) .
60. HAS-polipéptido de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el HES tiene un peso molecular de 1 a 300 kDa, preferentemente 5 a 100 kDa.
61. HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 59 ó 60, caracterizado porque el HES exhibe un grado molar de sustitución de 0.1 a 0.8 y un radio entre sustitución C2 : e en el intervalo de 2-20, con respecto a los grupos hidroxietilo .
62. Método para la producción de un conjugado (HAS-polipéptido) de hidroxialquilalmidón (HAS-polipéptido) , caracterizado porque comprende las etapas de : d) proporcionar un polipéptido que sea capaz de reaccionar con el HAS modificado, e) proporcionar HAS modificado que sea capaz de reaccionar con el polipéptido de la etapa a) , y f) hacer reaccionar el polipéptido de la etapa a) con el HAS de la etapa b) , por el cual se produce un HAS -polipéptido que comprende una o más moléculas HAS , en donde cada HAS se conjuga con el polipéptido mediante i) un radical carbo idratado ; o ii) un tioéter.
63. Método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el polipéptido es de origen humano.
64. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 ó 63, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de eritropoyetina , interleucinas , especialmente interleucina-2 , IFN-ß, IFN-alfa, CSF, interleucina 6 y anticuerpos terapéuticos.
65. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, caracterizado porque el polipéptido se produce en forma recombinante .
66. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, caracterizado porque el polipéptido comprende una o más cadenas laterales carbohidratadas unidas al polipéptido mediante glicosilación N- y/u O-enlazada.
67. Método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque las cadenas laterales carbohidratadas han sido unidas al polipéptido durante la producción en células mamíferas, especialmente humanas, insectos o 1evadura .
68. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 66 ó 67, caracterizado porque el HAS se conjuga con el polipéptido mediante un radial carbohidratado que es parte de las cadenas laterales carbohidratadas .
69. Método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque en la etapa a) el polipéptido se modifica mediante oxidación de al menos un radical carbohidratado , preferentemente al menos una unidad sacárida terminal, más preferentemente galactosa, de una o más cadenas laterales carbohidratadas del polipéptido.
70. Método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la unidad sacárida terminal se oxida al cabo de la eliminación parcial o completa (enzimática y/o química) del ácido siálico terminal.
71. Método de conformidad con la reivindicación 69 ó 70, caracterizado porque en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la unidad sacárida terminal oxidada.
72. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 71, caracterizado porque el polipéptido comprende al menos un grupo sulfidrilo libre .
73. Método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el grupo sulfidrilo libre es parte de una cisteína que se produce en forma natural o de una cisteína agregada.
74. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 73, caracterizado porque la cisteína agregada ha sido agregada reemplazando un aminoácido que se produce en forma natural por una cisteína .
75. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73 ó 74, caracterizado porque en la etapa c) el HAS modificado se conjuga con la cisteína agregada.
76. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 75, caracterizado porque el HAS se modifica de modo que comprende una función libre de hidracida, hidroxilamina , tiol o semicarbacida si el HAS se conjuga con los radicales carbohidratados oxidados o una función libre de maleimida, disulfuro o halógeno acetamida si el HAS debe conjugarse con el grupo sulfidrilo.
77. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 76, caracterizado porque la etapa c) se lleva a cabo en un medio de reacción que comprende al menos 10% en peso de H2O .
78. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 78, caracterizado porque el HAS se conjuga con el polipéptido mediante una molécula enlazante.
79. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 78, caracterizado porque el HAS es hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón , o hidroxibuti 1 almidón , preferentemente hidroxietilalmidón (HES) .
80. Método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el HAS tiene las propiedades como se definieron en cualquiera de las reivindicaciones 60 ó 61.
81. HAS -polipéptido , caracterizado porque es obtenible por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 80.
82. HAS-polipéptido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque tiene las características como se definieron de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 61.
83. HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 61, 81 u 82, caracterizado porque es para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal .
84. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el HAS-polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 61, 81 u 82.
85. Composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 84, caracterizada porque adicionalmente comprende al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
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