DE60304640T2 - HASylierte Polypeptide, besonders HASyliertes Erythropoietin - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, vorzugsweise Erythropoietin konjugiert an Hydroxyalkylstärke (HAS), vorzugsweise an Hydroxyethylstärke.
  • Die Verabreichung von Polypeptiden, im Speziellen Enzymen oder Cytokinen, in das Kreislaufsystem, um einen besonderen physiologischen Effekt zu erhalten, ist ein gut bekanntes Hilfsmittel in der modernen Medizin.
  • Erythropoietin (EPO) ist ein Glycoproteinhormon, welches für die Reifung von erythroiden Vorläuferzellen zu Erythrocyten erforderlich ist. In menschlichen Erwachsenen wird es in der Niere produziert. EPO ist notwendig, um den Level von roten Blutkörperchen im Kreislaufsystem zu regulieren. Bedingungen, gekennzeichnet durch geringe Level von Gewebesauerstoff, bewirken eine gesteigerte Biosynthese von EPO, welche wiederum Erythropoiese stimuliert. Eine Einbuße der Nierenfunktion, wie es bei chronischem Nierenversagen auftritt, resultiert z.B. üblicherweise in verminderter EPO-Biosynthese und einer gleichzeitigen Abnahme von roten Blutkörperchen.
  • Erythropoietin ist ein saures Glycoproteinhormon von ungefähr 34.000 Da. Menschliches Erythropoietin ist ein 166-Aminosäuren-Polypeptid, welches natürlich als ein Monomer existiert (Lin et al., 1985, PNAS 82, 7580–7584, EP 148 605 B2 , EP 411 678 B2 ). Die Identifizierung, Klonierung und Expression von Genen, welche für Erythropoietin kodieren, ist z.B. in US-Patent 4,703,008 beschrieben. Die Reinigung von rekombinantem Erythropoietin aus Zellkulturmedium, welches das Wachstum von Säugerzellen, enthaltend rekombinante Erythropoietinplasmide, fördert, ist zum Beispiel in US-Patent 4,667,016 beschrieben.
  • Es wird in diesem technischen Arbeitsgebiet im Allgemeinen angenommen, dass die biologische Aktivität von EPO an vivo hauptsächlich von dem Grad der an EPO gebundenen Sialinsäuren abhängig ist (siehe z.B. EP 428 267 B1 ). Theoretisch können 14 Moleküle Sialinsäure an ein Molekül EPO gebunden sein, an den terminalen Enden der Kohlenhydratseitenketten, welche mit N- oder O-Glycosylierungsstellen verbunden sind. Sehr anspruchsvolle Reinigungsschritte sind erforderlich, um stark sialysierte EPO-Zusammensetzungen zu erhalten.
  • Für weitere ausführliche Information über Erythropoietin siehe Krantz, Erythropoietin, 1991, Blood, 77(3): 419 - 34 (Review) und Cerami, Beyond erythropoiesis: novel applications for recombinant human erythropoietin, 2001, Semin Hematol., (3 Suppl 7): 33 – 9 (Review).
  • Ein gut bekanntes Problem bei der Verabreichung von Polypeptiden und Enzymen ist, dass diese Proteine oft eine unbefriedigende Stabilität aufweisen. Insbesondere hat Erythropoietin eine relativ kurze Plasma-Halbwertszeit (Spivak und Hogans, 1989, Blood, 73, 90; McMahon et al., 1990, Blood 76, 1718). Dies bedeutet, dass therapeutische Plasmalevel rasch verschwinden und wiederholte intravenöse Verabreichungen durchgeführt werden müssen. Außerdem wird unter bestimmten Umständen eine Immunantwort gegen die Peptide beobachtet.
  • Es wird im Allgemeinen anerkannt, dass die Stabilität von Polypeptiden verbessert und die Immunantwort gegen diese Peptide reduziert werden kann, wenn die Polypeptide an polymere Moleküle gekoppelt sind. WO 94/28024 offenbart, dass physiologisch aktive Polypeptide, welche mit Polyethylenglycol (PEG) modifiziert wurden, reduzierte Immunogenität und Antigenität aufweisen und im Blutstrom wesentlich länger zirkulieren als unkonjugierte Proteine, d.h. eine längere Abbaugeschwindigkeit (clearance rate) haben.
  • Allerdings weisen PEG-Arzneikonjugate einige Nachteile auf, z.B. weisen sie keine natürliche Struktur auf, die von Elementen von In-vivo-Abbauwegen erkannt werden kann. Daher wurden, abgesehen von PEG-Konjugaten, andere Konjugate und Protein-Polymerate produziert. Eine Vielzahl von Methoden für die Quervernetzung von unterschiedlichen Proteinen und Makromolekülen wie Polymerase wurden in der Literatur beschrieben (siehe z.B. Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, 1993, CRCS, Inc.).
  • Hydroxyethylstärke (HES) ist ein Derivat von natürlich vorkommendem Amylopektin und wird im Körper durch α-Amylase abgebaut. Die Herstellung von HES-Proteinkonjugaten ist im Stand der Technik beschrieben (siehe z.B. HES-Hämoglobinkonjugate in DE 26 16 086 oder DE 226 46 854 ).
  • DE 26 46 854 offenbart Verfahren für die Konjugation von Hämoglobin an HES. In diesen Verfahren wird HES mit Natriumperiodat umgesetzt, was zu der Produktion von Dialdehyden führt, die an Hämoglobin gebunden sind. Im Gegensatz dazu offenbart DE 26 16 086 die Konjugation von Hämoglobin an HES nach einem Arbeitsverfahren, wobei zunächst ein Quervernetzungsmittel (z.B. Bromcyan) an HES gebunden wird und später Hämoglobin an das Zwischenprodukt gebunden wird.
  • HES ist ein substituiertes Derivat des Kohlenhydratpolymers Amylopektin, welches in Maisstärke in einer Konzentration von bis zu 95 Gew.-% vorhanden ist. HES weist vorteil hafte biologische Eigenschaften auf und wird als Blutvolumenaustauschmittel und zur Blutverdünnungstherapie in den Kliniken benutzt (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271–278; und Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494–498).
  • Amylopektin besteht aus Glucose-Anteilen, wobei in der Hauptkette α-1,4-glykosidische Bindungen vorhanden sind und an den Verzweigungsseiten α-1,6-glykosidische Bindungen gefunden werden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von diesem Molekül werden hauptsächlich durch den Typ der glykosidischen Bindungen bestimmt. Aufgrund der gewinkelte α-1,4-glykosidischen Bindung werden helikale Strukturen mit ungefähr sechs Glucose-Monomeren pro Windung erzeugt.
  • Die physikalisch-chemischen sowie die biochemischen Eigenschaften des Polymers können durch Substitution modifiziert werden. Die Einführung einer Hydroxyethylgruppe kann durch alkalische Hydroxyethylierung erreicht werden. Durch Anpassen der Reaktionsbedingungen ist es möglich, die unterschiedliche Reaktivität der jeweiligen Hydroxygruppen im unsubstituierten Glucose-Monomer in Bezug auf einer Hydroxyethylierung auszunutzen. In Folge dieser Tatsache ist der Fachmann in der Lage, das Substitutionsmuster bis zu einem gewissen Ausmaß zu beeinflussen.
  • Folglich wird HES hauptsächlich charakterisiert durch die Molekulargewichtsverteilung und den Substitutionsgrad. Es gibt zwei Möglichkeiten, diesen Substitutionsgrad zu beschreiben:
    • 1. Der Substitutionsgrad kann beschrieben werden bezüglich des Anteils von substituierten Glucose-Monomeren in Bezug auf alle Glucoseanteile (DS).
    • 2. Der Substitutionsgrad kann beschrieben werden als die „molare Substitution" (MS), wobei die Anzahl von Hydroxyethylgruppen per Glucoseateil beschrieben wird.
  • HES-Lösungen sind dabei als polydisperse Mischungen vorhanden, wobei jedes Molekül sich von den anderen in Bezug auf den Polymerisationsgrad, die Anzahl und das Muster von Verzweigungsseiten und das Substitutionsmuster unterscheidet. HES ist daher eine Mischung von Verbindungen mit unterschiedlichem Molekulargewicht. Folglich wird eine bestimmte HES-Lösung mit Hilfe von statistischen Mitteln durch das durchschnittliche Molekulargewicht bestimmt. In diesem Zusammenhang wird Mn berechnet als das arithmetische Mittel abhängig von der Anzahl der Moleküle. Alternativ stellt Mw, das Gewichtsmittel dar, eine Einheit, welche abhängig ist von der Masse der HES.
  • Die HES-Arzneikonjugate, welche im Stand der Technik offenbart sind, leiden unter dem Nachteil, dass HES nicht ortsspezifisch an die Arznei konjugiert ist. Folglich führt die Konjugation zu einem sehr heterogenen Produkt, welches viele Komponenten besitzt, die auf Grund der Zerstörung der dreidimensionalen Struktur während des Konjugationsschrittes inaktiv sein können.
  • In Kurzfassung, es gibt immer noch Bedarf an weiter verbesserten Polypeptiden mit verbesserter Stabilität und/oder Bioaktivität. Dies betrifft insbesondere Erythropoietin, bei dem Isoformen mit einem hohen Gehalt an Sialinsäuren und daher hoher Aktivität von Isoformen mit einem geringen Sialinsäuregrad gereinigt werden müssen (siehe EP 428 267 B1 ). Daher wäre es sehr vorteilhaft, wenn Herstellungsverfahren verfügbar wären, welche sehr aktive Polypeptide bereitstellen ohne ausführlicher Reinigung zu bedürfen. Bedauerlicherweise ist die Herstellung von Polypeptiden in Bakterien oder Insektenzellen oft schwierig, weil die Polypeptide oft nicht in einer richtig gefalteten, natürlichen Konformation hergestellt werden und eine korrekte Glykosylierung fehlt.
  • Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Polypeptidderivate bereitzustellen, vorzugsweise Erythropoietinderivate, welche eine starke biologische Aktivität in vivo besitzen und welche einfach bei reduzierten Kosten hergestellt werden können. Außerdem ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung von Polypeptidderivaten bereitzustellen, welches einfach durchzuführen ist und zu Produkten mit hoher biologischer Aktivität führt. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, welche Polypeptidderivate mit hoher biologischer Aktivität umfassen.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Problem durch ein Hydroxyalkylstärke-(HAS)-Erythropoietin-(EPO)-Konjugat (HAS-EPO) umfassend ein oder mehrere HAS-Moleküle gelöst, wobei jede HAS mit EPO durch einen Kohlenhydratanteil konjugiert ist.
  • Das HAS-EPO der Erfindung hat den Vorteil, dass es eine erhöhte biologische Stabilität aufweist, wenn man es mit dem Erythropoietin vor der Konjugation vergleicht. Außerdem weist es eine höhere biologische Aktivität auf als Standard-BRP-EPO. Dies ist hauptsächlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass HAS-EPO weniger oder fast nicht durch die Abbausysteme der Leber und Niere erkannt wird und daher im Kreislaufsystem für einen längeren Zeitraum fortbesteht. Außerdem ist das Risiko, die biologische In-vivo-Aktivität von EPO durch Konjugation von HAS an EPO zu zerstören, minimiert, da die HAS ortspezifisch angefügt wird.
  • Das HAS-EPO der Erfindung besteht hauptsächlich aus zwei Komponenten, nämlich dem Erythropoietin (EPO)-Polypeptid und der Hydroxyalkylstärke (HAS), welche daran gebunden ist.
  • Das EPO kann aus jeder menschlichen (siehe z.B. Inoue, Wada, Takeuchi, 1994, An improved method for the purification of human erythropoietin with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol. Pharm. Bull. 17(2), 180 - 4; Miyake Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythropoietin, J. Biol. Chem., 252(15), 5558 – 64) oder anderen Säugerquelle stammen, und kann durch Reinigung aus natürlich vorkommenden Quellen wie menschlichen Nieren, embryonaler menschlicher Leber oder tierischen, bevorzugt Affennieren, erhalten werden. Außerdem umfasst die Bezeichnung „Erythropoietin" oder „EPO" auch eine EPO-Variante, wobei eine oder mehrere Aminosäuren (z.B. 1 bis 25, bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 bis 5, am stärksten bevorzugt 1 bis 2) durch andere Aminosäuren ausgetauscht wurden, und welches erythropoietische-Aktivität aufweist (siehe z.B. EP 640 619 B1 ). Die Messung der erythropoietischen-Aktivität ist im Stand der Technik beschrieben (für Aktivitätsmessung in vitro siehe z.B. Fibi et al., 1991, Blood 77, 1203 ff; Kitamura et al., 1989, J. Cell Phys., 140, 323–334; für Messung von EPO-Aktivität in vivo siehe Ph. Eur. 2001, 911–917; Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata, 780–785; European Pharmacopoeia (1996/2000); European Pharmaceopoeia, 1996, Erythropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa, 8, 371–377; Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl, 1995, N- and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85(5), 1229–36; (EPO und modifizierte EPO-Formen wurden an Tag 1, 2 und 3 in weibliche NMRI-Mäuse injiziert (gleiche Mengen an Protein 50 ng/Maus), an Tag 4 wurden Blutproben genommen und Retikulocyten wurden bestimmt). Weitere Publikationen, für Tests für die Messung der EPO-Aktivität sind Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4), 515–22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferring receptor and erythropoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(1), 151-5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin, Biochemistry, 31(41), 9871-6; Higuchi, Oh-eda, Kuboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992, Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol. Chem., 267(11), 7703-9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties, J. Biol. Chem., 266(30), 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(20), 7819-22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythropoietin Nephron, 51(1), 11-4 (Deutsch); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinary erythropoietin on controlled-pore glass and silicic acid, Exp. Hematol., 13(3), 833-7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoetic stimulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol., 11(1), 18-31.
  • Bevorzugt wird das EPO rekombinant hergestellt. Dies schließt die Herstellung in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen ein, bevorzugt Säuger-, Insekten-, Hefe-, bakterielle Zellen oder in jedem anderen Zelltyp, welcher für die Herstellung von rekombinantem EPO geeignet ist. Außerdem kann das EPO in transgenen Tieren exprimiert werden (z.B. in Körperflüssigkeiten wie Milch, Blut, etc.), in Eiern von transgenen Vögeln, insbesondere Geflügel, bevorzugt Hühner, oder in transgenen Pflanzen.
  • Die rekombinante Herstellung eines Polypeptides ist aus dem Stand der Technik bekannt. Generell schließt dies die Transfektion von Wirtszellen mit einem geeigneten Expressionsvektor ein, die Kultivierung von Wirtszellen unter Bedingungen, die die Produktion des Polypeptides ermöglichen und die Reinigung des Polypeptides von den Wirtszellen. Für ausführlichere Information siehe z.B. Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 B1 und EP 668 351 B1 .
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hat das EPO die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO (siehe EP 148 605 B2 ).
  • Das EPO kann eine oder mehrere Kohlenhydratseitenketten umfassen (bevorzugt 1–4, bevorzugt 4) angefügt an das EPO durch N- und/oder O-verknüpfte Glykosylierung, d.h. das EPO ist glykosyliert. Üblicherweise, wenn EPO in eukaryontischen Zellen produziert wird, ist das Polypeptid posttranslational glykosyliert. Folglich können die Kohlenhydratseitenketten an das EPO während der Biosynthese in Säuger-, insbesondere menschlichen, Insekten- oder Hefezellen angefügt worden sein. Die Struktur und Eigenschaften von glykosyliertem EPO wurden ausführlich im Stand der Technik studiert (siehe EP 428 267 B1 ; EP 640 619 B1 ; Rush, Derby, Smith, Merry, Rogers, Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure, Anal. Chem., 67(8), 1442-52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins, Glycobiology, 1(4), 337-46 (Review).
  • Die HAS kann direkt mit dem EPO konjugiert sein oder alternativ durch ein Linkermolekül. Die Beschaffenheit des Linkermoleküls hängt von der Art ab, wie die HAS an das EPO gebunden ist. Mögliche funktionale Gruppen von Linkern sind in Tabelle 1 und unten beschrieben. Etliche Linker sind kommerziell erhältlich (z.B. von Pierce, erhältlich über Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland). Einige geeignete Linker werden in Tabelle 2 beschrieben. Die Beschaffenheit des Linkers und seine Bestimmung sind ausführlich unten, in dem Abschnitt betreffend das Verfahren für die Produktion von HES-EPO, beschrieben.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen HAS-EPO-Konjugats ist die HAS über einen Kohlenhydratanteil mit dem EPO konjugiert.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „Kohlenhydratanteil" Hydroxyaldehyde oder Hydroxyketone genauso wie chemische Modifikationen davon (siehe Römpp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Deutschland, 9. Auflage 1990, Band 9, S. 2281–2285 und die Literatur, welche hierin zitiert wird). Außerdem bezeichnet er auch Derivate von natürlich vorkommenden Kohlenhyratanteilen wie Glucose, Galactose, Mannose, Sialinsäure und dergleichen. Der Ausdruck beinhaltet auch chemisch oxidierte natürlich vorkommende Kohlenhydratanteile, wobei die Ringstruktur geöffnet wurde.
  • Der Kohlenhydratanteil kann direkt an das EPO-Polypeptidrückgrat gebunden sein. Bevorzugt ist der Kohlenhydratanteil ein Teil der Kohlenhydratseitenkette. In diesem Fall können weitere Kohlenhydratanteile zwischen dem Kohlenhydratanteil, an dem HAS gebunden ist, und dem EPO-Polypeptidrückgrat vorhanden sein. Stärker bevorzugt ist der Kohlenhydratanteil der terminate Anteil der Kohlenhydratseitenkette.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die HAS konjugiert an einen Galactoserest der Kohlenhydratseitenketten, bevorzugt der terminale Galactoserest der Kohlenhydratseitenkette. Dieser Galactoserest kann für die Konjugation verfügbar gemacht werden durch Entfernen der terminalen Sialinsäuren, gefolgt von Oxidation (siehe unten).
  • In einer weiteren stärker bevorzugten Ausführungsform ist die HAS an einen Sialinsäurerest der Kohlenhydratseitenkette konjugiert, bevorzugt an den terminalen Sialinsäurerest der Kohlenhydratseitenkette.
  • Die zweite Komponente des HAS-EPO ist Hydroxyalkylstärke (HAS).
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck „Hydroxyalkylstärke" benutzt, um Stärkederivate zu bezeichnen, die durch Hydroxyalkylgruppen substituiert wurden. In diesem Zusammenhang kann die Alkylgruppe substituiert sein. Bevorzugt enthält das Hydroxyalkyl 2–10 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt 2–4 Kohlenstoffatome. „Hydroxyalkylstärke" umfasst daher bevorzugt Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke und Hydroxybutylstärke, wobei Hydroxyethylstärke und Hydroxypropylstärke bevorzugt sind.
  • Die Hydroxyalkylgruppe(n) des HAS enthalten mindestens eine OH-Gruppe.
  • Der Begriff „Hydroxyalkylstärke" beinhaltet außerdem Derivate bei denen die Alkylgruppe mono- oder polysubstituiert ist. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass die Alkylgruppe mit einem Halogen substituiert ist, insbesondere Fluor, oder mit einer Arylgruppe, vorausgesetzt dass die HAS wasserlöslich bleibt. Außerdem kann die terminale Hydroxygruppe des Hydroxyalkyls verestert oder verethert sein. Zudem kann die Alkylgruppe der Hydroxyalkylstärke linear oder verzweigt sein.
  • Außerdem können anstelle des Alkyls ebenfalls linear oder verzweigt substituierte oder unsubstituierte Alkengruppen verwendet werden.
  • Hydroxyethylstärke (HES) ist am meisten bevorzugt für alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann Hydroxyethylstärke ein durchschnittliches Molekulargewicht (Durchschnittsgewicht) von 1–300 kDa haben, wobei ein Durchschnittsmolekulargewicht von 5–100 kDa stärker bevorzugt ist. Hydroxyethylstärke kann weiterhin einen molekularen Grad der Substituierung von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis zwischen C2:C6-Substitution im Bereich von 2–20, in Bezug auf die Hydroxyethylgruppen aufweisen.
  • Das HAS-EPO kann 1–12, bevorzugt 1–9, 1–6 oder 1–3, am meisten bevorzugt 1–4 HAS-Moleküle per EPO-Molekül umfassen. Die Anzahl von HAS-Molekülen per EPO-Molekülen kann bestimmt werden durch quantitative Kohlenhydratkompositionsanalyse unter Verwendung von GC-MS nach Hydrolyse des Produktes und Derivatisierung der resultierenden Monosaccharide (siehe Chaplin und Kennedy (eds.), 1986, Carbohydrate Analysis: a practical approach, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3), especially Chapter 1, Monosaccharides, Seiten 1–36; Chapter 2, Oligosaccharides, Seiten 37–53, Kapitel 3, Neutral Polysaccharides, page 55–96).
  • Das erfindungsgemäße HAS-EPO-Konjugat kann hauptsächlich dieselbe in-vitro-biologische Aktivität wie rekombinantes, natives EPO aufweisen, da die in-vitro-biologische Aktivität nur die Bindungsaffinität an den EPO-Rezeptor misst. Verfahren für die Bestimmung der in-vitro-biologischen Aktivität sind im Fachgebiet bekannt (siehe oben).
  • Außerdem weist das HAS-EPO eine größere in vivo Aktivität auf als das als Startmaterial für die Konjugation benutzte EPO (unkonjugiertes EPO). Verfahren für die Bestimmung der in-vivo-biologischen Aktivität sind im Fachgebiet bekannt (siehe oben). Außerdem sind Assays für die Bestimmung der in-vivo- und in-vitro-EPO-Aktivität in den Beispielen 9 und 10 aufgeführt.
  • Das HAS-EPO-Konjugat kann eine in-vivo-Aktivität von 110 bis 500% aufweisen, bevorzugt 300 bis 400%, oder 110%–300%, bevorzugt 110% bis 200%, stärker bevorzugt 110% bis 180% oder 110 bis 150%, am stärksten bevorzugt 110% bis 140%, wenn die in vivo Aktivität von unkonjugiertem EPO als 100% festgelegt wird.
  • Verglichen mit dem stark sialysierten EPO von Amgen (siehe EP 428 267 B1 ) weist das HAS-EPO bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 70%, noch stärker bevorzugt mindestens 85% oder mindestens 95%, mindestens 150%, mindestens 200% oder mindestens 300% der in-vivo-Aktivität des stark sialysierten EPO auf, wenn die in-vivo-Aktivität von stark sialysiertem EPO als 100% festgelegt wird. Am stärksten bevorzugt weist es mindestens 95% der in-vivo-Aktivität des stark sialysierten EPO auf.
  • Die hohe biologische in-vivo-Aktivität des erfindungsgemäßen HAS-EPO-Konjugates resultiert hauptsächlich aus der Tatsache, dass das HAS-EPO-Konjugat länger im Kreislaufsystem verbleibt als unkonjugiertes EPO, da es von den Abbausystemen der Leber weniger erkannt wird und da die Ausscheidung durch die Niere (renal clearance) aufgrund des höheren Molekulargewichtes reduziert ist. Verfahren für die Bestimmung der in-vivo-Halbwertszeit von EPO im Kreislaufsystem sind im Fachgebiet bekannt (Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo acticity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(3), 1184-8).
  • Folglich ist es ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass ein HAS-EPO bereitgestellt wird, das weniger häufig verabreicht werden kann, als die EPO-Präparate, die derzeit kommerziell verfügbar sind. Während Standard-EPO-Präparate zumindest alle 3 Tage verabreicht werden müssen, wird das erfindungsgemäße HAS-EPO-Konjugat bevorzugt zweimal die Woche verabreicht, stärker bevorzugt einmal die Woche.
  • Alle unten in Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren, ein HAS-EPO zu produzieren, offenbarten Ausführungsformen, sind bezüglich der Eigenschaften von EPO oder HAS auch auf das erfindungsgemäße HAS-EPO-Konjugat anzuwenden.
  • Hydroxyalkylstärke ist ein Etherderivat von Stärke. Neben den besagten Etherderivaten können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch andere Stärkederivate benutzt werden. Zum Beispiel sind Derivate verwendbar, welche verestherte Hydroxygruppen umfassen. Diese Derivate können z.B. Derivate von unsubstituierten Mono- oder Dicarbonsäuren mit 2–12 Kohlenstoffatomen oder von substituierten Derivaten davon sein. Insbesondere sind Derivate von unsubstituierten Monocarbonsäuren mit 2–6 Kohlenstoffatomen verwendbar, insbesondere von Essigsäure, In diesem Zusammenhang sind Acetylstärke, Butylstärke oder Propylstärke bevorzugt.
  • Außerdem sind unsubstituierte Dicarbonsäuren mit 2–6 Kohlenstoffatomen bevorzugt.
  • Im Fall von Derivaten von Dicarbonsäuren ist es nützlich, dass die zweite Carbonsäuregruppe der Dicarbonsäure auch veresthert ist. Außerdem sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch Derivate von Monoalkylesthern von Dicarbonsäuren geeignet. Für die substituierten Mono- oder Dicarbonsäuren können die Substitutionsgruppen bevorzugt die gleichen sein wie oben für die substituierten Alkylreste genannt.
  • Techniken für die Verestherung von Stärke sind im Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Klemm D. et al., Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especially chapter 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).
  • Das HAS-EPO der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch ein Verfahren zur Herstellung von einem Hydroxyalkylstärke (HAS)-Erythropoietin (EPO)-Konjugat (HAS-EPO), umfassend die Schritte:
    • a) Bereitstellen von EPO, welches im Stande ist, mit modifizierter HAS zu reagieren,
    • b) Bereitstellen von modifizierter HAS, welche im Stande ist, mit dem EPO aus Schritt a) zu reagieren, und
    • c) Reagieren des EPO aus Schritt a) mit der HAS aus Schritt b), wodurch ein HAS-EPO hergestellt wird, umfassend ein oder mehrere HAS-Moleküle, wobei jede HAS mit dem EPO durch einen Kohlenhydratanteil konjugiert ist.
  • Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass ein HAS-EPO-Konjugat hergestellt wird, welches eine hohe biologische Aktivität aufweist. Außerdem hat das Verfahren den Vorteil, dass ein effektives EPO-Derivat zu reduzierten Kosten hergestellt werden kann, da das Verfahren keine ausführlichen und zeitintensiven Reinigungsschritte, resultierend in einer geringen Endausbeute, umfasst, z.B. ist es nicht notwendig untersialysierte EPO-Formen abzureinigen, welche dafür bekannt sind, geringe oder keine in-vivo-biologische Aktivität aufzuweisen. Insbesondere Beispiel 20 zeigt, dass ein HES-EPO, welches mit wenigen Modifizierungsschritten hergestellt wurde, eine 3-fache Aktivität über Standard-BRP-EPO aufweist.
  • Dementsprechend wird in dem ersten Schritt des Verfahrens ein EPO bereitgestellt, welches geeignet ist, mit modifizierter HAS zu reagieren.
  • Wie hierin benutzt, muss der Ausdruck „Bereitstellen" so ausgelegt werden, dass nach dem betreffenden Schritt ein Molekül (in Schritt a) EPO, in Schritt b) HAS) mit den gewünschten Eigenschaften verfügbar ist.
  • In Fall von Schritt a) beinhaltet dies die Reinigung von EPO aus natürlichen Quellen genauso wie die rekombinante Herstellung in Wirtszellen oder Organismen und, wenn notwendig, die Modifizierung des so erhaltenen EPO.
  • In Bezug auf das EPO, welches das Startmaterial des Verfahrens ist, ist das Gleiche anzuwenden wie für das Erythropoietin, welches Teil des erfindungsgemäßen HAS-EPO-Konjugates ist. In diesem Zusammenhang sind die bevorzugten Ausführungsformen, welche oben offenbart wurden, auch für dieses Verfahren anzuwenden.
  • Folglich kann das EPO die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO besitzen.
  • Vorzugsweise wird das EPO rekombinant hergestellt. Dies schließt die Herstellung in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen ein, bevorzugt Säuger-, Insekten-, Hefe-, Bakterienzellen oder in jedem anderen Zelltyp, welcher für die rekombinante Herstellung von EPO geeignet ist. Außerdem kann das EPO in transgenen Tieren exprimiert werden (z.B. in Körperflüssigkeiten wie Milch, Blut, etc.), in Eiern von transgenen Vögeln, insbesondere Geflügel, bevorzugt Hühnern, oder in transgenen Pflanzen.
  • Die rekombinante Herstellung eines Polypeptides ist in dem Fachgebiet bekannt. Im Allgemeinen beinhaltet dies die Transfektion von Wirtszellen mit einem geeigneten Expressionsvektor, die Kultivierung von Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Produk tion des Polypeptides ermöglichen und die Reinigung des Polypeptides aus der Wirtszelle (Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogenity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71–9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652–7; EP 640 619 B1 und EP 668 351 B1 ).
  • Das EPO kann eine oder mehrere Kohlenhydratseitenketten angefügt an das EPO durch N- und/oder O-gebundene Glycosylierung umfassen, d.h. das EPO ist glycosyliert. Gewöhnlich wird, wenn EPO in eukaryotischen Zellen produziert wird, das Polypeptid posttranslational glycosyliert. Folglich können die Kohlenhydratseitenketten an das EPO angefügt worden sein, während der Herstellung in Säuger-, insbesondere menschlichen-, Insekten- oder Hefezellen, welche Zellen eines transgenen Tieres sein können (siehe oben), entweder entnommen aus dem Tier oder immer noch in dem Tier.
  • Diese Kohlenhydratseitenketten können nach der Expression in geeigneten Zellen chemisch oder enzymatisch modifiziert worden sein, z.B. durch Entfernen oder Hinzufügen eines oder mehrerer Kohlenhydratanteile (siehe z.B. Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt and Schomburg eds., GBF-Monographs, 12, 231–246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge).
  • Das Verfahren kann ein HAS-EPO bereitstellen, umfassend eines oder mehrere HAS-Moleküle, wo die HAS über einen Kohlenhydratanteil an das EPO konjugiert ist. Folglich sollte das EPO, bereitgestellt in Schritt a) die Eigenschaften besitzen, dass eine Konjugation durch einen Kohlenhydratanteil möglich ist. Daher kann das EPO nach Schritt a) bevorzugt enthalten entweder
    • (1) mindestens eine reaktive Gruppe gebunden, entweder direkt oder durch ein Linkermolekül, an Kohlenhydratanteile, welche geeignet ist mit HES oder modifizierter HES zu reagieren, und/oder
    • (2) mindestens ein Kohlenhydratanteil, an den modifizierte HAS konjugiert werden kann.
  • In Bezug auf die obige Möglichkeit (1) kann das EPO aus Schritt a) erhältlich sein durch Konjugieren eines geeigneten Linkermoleküls an die SH-Gruppe(n) oder Kohlenhydratanteile des EPO. Ein Beispiel für solch ein modifiziertes EPO ist in Beispiel 4, 2.1., bereitgestellt. Es ist wichtig zu gewährleisten, dass das Hinzufügen des Linkermoleküls nicht das EPO beschädigt. Allerdings ist dies dem Fachmann bekannt.
  • In Bezug auf obige Möglichkeit (2) kann die modifizierte HAS an das EPO über einen Kohlenhydratanteil konjugiert sein.
  • Der Kohlenhydratanteil kann direkt an das EPO-Polypeptidrückgrad gebunden sein. Bevorzugt ist der Kohlenhydratanteil Teil einer Kohlenhydratseitenkette. In diesem Fall können weitere Kohlenhydratanteile zwischen dem Kohlenhydratanteil an den HAS gebunden ist und dem EPO-Polypeptidrückgrad vorhanden sein. Stärker bevorzugt ist der Kohlenhydratanteil der terminale Anteil der Kohlenhydratseitenkette.
  • Folglich kann die modifizierte HAS an Kohlenhydratketten gebunden sein (durch einen Linker oder nicht, siehe unten), welche an N- und/oder O-Glycosylierungsstellen des EPO gebunden sind.
  • Allerdings ist auch eingeschlossen, dass das EPO (einen) weitere(n) Kohlenhydratanteil(e) einschließt, an den die modifizierte HAS konjugiert ist. Techniken für das Anfügen von Kohlenhydratanteilen an Polypeptide, entweder enzymatisch oder durch Gentechnik, gefolgt durch Expression in geeigneten Zellen, sind im Fachgebiet bekannt (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complexand endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett., 203(1), 64-8; Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt and Schomburg eds., GBF-Monographs, 12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge).
  • Der Kohlenhydratanteil kann oxidiert sein, um in der Lage zu sein, mit der modifizierten HAS zu reagieren. Diese Oxidation kann entweder chemisch oder enzymatisch durchgeführt werden.
  • Verfahren für die chemische Oxidation von Kohlenhydratanteilen von Polypeptiden sind im Fachgebiet bekannt und schließen die Behandlung mit Perjodat ein (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916–15922).
  • Durch chemisches Oxidieren ist es prinzipiell möglich, jeden Kohlenhydratanteil zu oxidieren, ob terminal positioniert oder nicht. Allerdings ist es möglich durch Auswählen milder Bedingungen (1 mM Perjodat, 0 °C im Gegensatz zu rauen Bedingungen: 10 mM Perjodat 1 Std. bei Raumtemperatur), bevorzugt den terminalen Kohlenhydratanteil einer Kohlenhydratseitenkette, zu oxidieren, z.B. Sialinsäure oder Galactose.
  • Alternativ kann der Kohlenhydratanteil enzymatisch oxidiert werden. Enzyme für die Oxidation der individuellen Kohlenhydratanteile sind im Fachgebie btekannt, z.B. im Fall von Galactose ist das Enzym Galactoseoxidase.
  • Wenn es beabsichtigt ist, die terminalen Galactoseanteile zu oxidieren, wird es eventuell notwendig sein, terminale Sialinsäuren zu entfernen (teilweise oder komplett) falls das EPO in Zellen hergestellt wurde, welche in der Lage sind Sialinsäuren an Kohlenhydratketten anzufügen, z.B. in Säugerzellen oder in Zellen welche genetisch modifiziert wurden, um in der Lage zu sein, Sialinsäuren an Kohlenhydratketten anzufügen. Chemische oder enzymatische Methoden für das Entfernen von Sialinsäuren sind im Fachgebiet bekannt (Champlin und Kennedy (eds.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, especially chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, pages 175–177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)).
  • Allerdings ist es auch eingeschlossen, dass der Kohlenhydratanteil, an den die modifizierte HAS angefügt ist, an das EPO in Schritt a) angefügt ist. Falls es gewünscht ist, Galactose anzufügen, kann dies erreicht werden mittels Galactosyltransferase. Die Verfahren sind im Fachgebiet bekannt (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett., 203(1), 64-8).
  • In Schritt a) kann das EPO modifiziert sein durch Oxidieren an mindestens einer terminalen Sacharideinheit, bevorzugt Galactose, einer oder mehrerer Kohlenhydratseitenketten des EPO, bevorzugt nach teilweisem oder vollständigen (enzymatischen und/oder chemischen) Entfernen der terminalen Sialinsäure, falls notwendig (siehe oben).
  • Folglich kann die modifizierte HAS an die oxidierte terminale Sacharideinheit der Kohlenhydratkette konjugiert sein, bevorzugt an Galactose.
  • Außerdem kann die modifizierte HAS an eine terminale Sialinsäure konjugiert sein, welche bevorzugt in Schritt a) des Verfahrens oxidiert wurde.
  • Es wird weiterhin beschrieben, dass das EPO mindestens eine freie SH-Gruppe umfasst, welche an einen bevorzugt oxidierten Kohlenhydratanteil gebunden sein kann, z.B. durch Benutzen eines Hydroxylaminderivates, z.B. 2-(Aminooxy)Ethylmercaptan-Hydrochlorid (Bauer L. et al., 1965, J. Org. Chem., 30, 949) oder durch Benutzen eines Hydrazidderivates, z.B. Thioglycolsäure-Hydrazid (Whitesides et al., 1977, J. Org. Chem., 42, 332.) Die Verfahren für die Konjugierung dieser Moleküle an den oxidierten Kohlehydratanteil des EPO können analog sein zu denen, beschrieben in Beispielprotokollen 8 und 9.
  • In Schritt b) des obigen Verfahrens wird modifizierte HAS bereitgestellt, welche in der Lage ist, mit dem EPO von Schritt a) zu reagieren.
  • In diesem Zusammenhang kann die HAS an ihrem reduzierenden Ende modifiziert sein. Dies hat den Vorteil, dass die chemische Reaktion leicht kontrolliert werden kann und dass der Fachmann sicher sein kann, welche Gruppe der HAS während der Reaktion modifiziert wird. Da nur eine Gruppe in die HAS eingeführt wird, kann eine Quervernetzung zwischen unterschiedlichen EPO-Molekülen durch multifunktionale HAS-Moleküle und andere Nebenreaktionen verhindert werden.
  • Dementsprechend kann die modifizierte HAS geeignet sein zu reagieren entweder mit
    • (1) mindestens einer Gruppe gebunden, entweder direkt oder über ein Linkermolekül, an Kohlenhydratanteile des EPO, und/oder
    • (2) mindestens einem Kohlenhydratanteil, welcher bevorzugt oxidiert ist.
  • In Bezug auf obigen Punkt (1) wird die Modifizierung der HAS von der an EPO gebundenen Gruppe abhängen. Die grundlegenden Mechanismen sind im Fachgebiet bekannt. Ein Beispiel wird in Beispiel 4, 2.1., gegeben.
  • In Bezug auf Punkt (2) sind viele Verfahren im Fachgebiet bekannt, um HAS zu modifizieren. Das elementare Prinzip, welches diesen Verfahren zugrunde liegt ist, dass entweder eine reaktive Gruppe der HAS modifiziert wird, um in der Lage zu sein, mit dem Kohlenhydratanteil zu reagieren, oder ein Linkermolekül ist an die HAS konjugiert, das eine reaktive Gruppe beinhaltet, welche in der Lage ist, mit dem Kohlenhydratanteil zu reagieren.
  • Im Fall von Punkt (2) kann die modifizierte HAS in der Lage sein, mit oxidierten Kohlenhydratanteilen zu reagieren, bevorzugt mit einem terminalen Saccharidrest, stärker bevorzugt Galactose oder einer terminalen Sialinsäure.
  • Viele Arten und Weisen sind bekannt, um HAS zu modifizieren, so dass sie in der Lage ist, mit einem oxidierten, bevorzugt terminalen Sacharidrest zu reagieren. Wie oben erwähnt, kann diese Modifizierung regionsselektiv am reduzierenden Ende der HES-Kette eingeführt worden sein. In diesem Fall wird in einem ersten Schritt die Aldehydgruppe zu einem Lacton oxidiert. Die Modifizierungen schließen das Hinzufügen von Hydrazid-, Amino- (auch Hydroxylamino-), Semicarbazid- oder Thiol-Funktionen an HAS, entweder direkt oder durch einen Linker, ein, sind aber nicht auf diese begrenzt. Diese Techniken werden in weiteren Einzelheiten in Beispielen 2–4 erklärt. Außerdem sind die Mechanis men per se im Fachgebiet bekannt (siehe z.B. DE 196 28 705 A1 ; Hpoe et al., 1981, Carbohydrate Res., 91, 39; Fissekis et al., 1960, Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, 2, 47; Frie, 1998, Diplomarbeit, Fachhochschule Hamburg, DE).
  • Das Hinzufügen einer Hydrazid- oder Hydroxylaminofunktion ist bevorzugt. In diesem Fall, bei bevorzugtem Durchführen der Reaktion von Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens bei einem pH von 5,5, wird sichergestellt, dass die modifizierte HAS selektiv mit dem oxidierten Kohlenhydratanteil des EPO reagiert, ohne inter- oder intramolekulare EPO-Quervernetzung durch Iminbildung von Lysinseitenketten mit dem oxidierten Sacharidrest.
  • Weitere Einzelheiten über diese Techniken können erhalten werden aus Chamov et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916; Thorpe et al., 1984, Eur. J. Biochem., 140, 63; Greenfield et al., 1990, Cancer Research, 50, 6600 sowie aus der Literatur zitiert in Beispiel 2, 1.3..
  • Weitere mögliche Funktionen sind in Tabelle 1 aufgelistet, so wird ein systematischer Überblick über mögliche Linkermoleküle bereitgestellt. Außerdem sind diese Mechanismen per se im Fachgebiet bekannt.
  • Etliche Linkermoleküle, welche im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren verwendbar sind, sind im Fachgebiet bekannt oder handelsüblich (z.B. von Pierce, erhältlich von Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland). Beispiele sind in Tabelle 2 gegeben.
  • In Schritt c) des Verfahrens wird das EPO aus Schritt a) mit der HAS aus Schritt b) umgesetzt, wobei ein HAS-EPO hergestellt wird, welches ein oder mehrere HAS-Moleküle umfasst, wobei die HAS an das EPO durch einen Kohlenhydratanteil konjugiert ist.
  • Grundsätzlich sind die ausführlichen Verfahren, wie man das EPO mit der modifizierten HAS reagieren lässt, abhängig von der individuellen Modifizierung des EPO und/oder der HAS und sind im Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Rose, 1994, J. Am. Chem. Soc., 116, 30, O'Shannessay and Wichek, 1990, Analytical Biochemistry, 191, 1; Thorpe et al., 1984, Eur. J. Biochem., 140, 63; Chamov et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 15916).
  • Für die hier veranschaulichten Verfahren werden die Einzelheiten in Beispielen 2–4, vorzugsweise 4 gegeben.
  • Schritt c) kann in einem Reaktionsmedium umfassend mindestens 10 Gew.-% Wasser durchgeführt werden.
  • Das Reaktionsmedium in dieser bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst mindestens 10 Gew.-% Wasser, bevorzugt mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 80%, z.B. 90% oder bis zu 100%. Der Grad an organischen Lösungsmitteln wird entsprechend berechnet. Folglich läuft die Reaktion in einer wässrigen Phase ab. Das bevorzugte Reaktionsmedium ist Wasser.
  • Ein Vorteil dieser Ausführungsform des Verfahrens ist, dass es nicht erforderlich ist, toxikologisch bedenkliche Lösungsmittel zu benutzen und dass es deshalb nicht erforderlich ist, diese Lösungsmittel nach dem Herstellungsprozess zu entfernen, um die Verunreinigung mit dem Lösungsmittel zu verhindern. Außerdem ist es nicht erforderlich, zusätzliche Qualitätskontrollen durchzuführen in Bezug auf verbleibende toxikologisch bedenkliche Lösungsmittel. Es ist bevorzugt, als organische Lösungsmittel toxikologisch nicht bedenkliche Lösungsmittel wie Ethanol oder Propylenglycol zu benutzen.
  • Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist, dass irreversible oder reversible strukturelle Veränderungen vermieden werden, welche durch organische Lösungsmittel verursacht werden. Folglich sind Polypeptide erhalten nach dem Verfahren unterschiedlich von denen, welche in organischen Lösungsmitteln wie DMSO hergestellt wurden.
  • Außerdem ist überraschenderweise beobachtet worden, dass die Konjugation von HAS an Arzneien in wässriger Lösung Nebenreaktionen minimiert oder verhindert. Folglich führt diese Ausführungsform des Verfahrens zu verbesserten Produkten mit großer Reinheit.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck „Hydroxyalkylstärke" benutzt, um Stärkederivate zu bezeichnen, welche durch Hydroxyalkylgruppen substituiert wurden. In diesem Zusammenhang kann die Alkylgruppe substituiert sein. Bevorzugt beinhaltet das Hydroxyalkyl 2–10 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt 2-4 Kohlenstoffatome. „Hydroxyalkylstärke" umfasst daher bevorzugt Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke und Hydroxybutylstärke, wobei Hydroxyethylstärke und Hydroxypropylstärke bevorzugt sind.
  • Die Hydroxyalkylgruppe(n) von HAS beinhalten mindestens eine OH-Gruppe.
  • Hydroxyethylstärke (HES) ist am stärksten bevorzugt für alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff „Hydroxyalkylstärke" beinhaltet auch Derivate, bei denen die Alkylgruppe mono- oder polysubstituiert ist. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass die Alkylgruppe mit einem Halogen substituiert ist, bevorzugt Fluor, oder mit einer Arylgruppe, vorausgesetzt die HAS bleibt wasserlöslich. Außerdem kann die terminale Hydroxygruppe des Hydroxyalkyls verestert oder verethert sein. Zudem kann die Alkylgruppe der Hydroxyalkylstärke linear oder verzweigt sein.
  • Außerdem können, an Stelle des Alkyls, auch lineare oder verzweigte, substituierte oder unsubstituierte Alkylengruppen benutzt werden.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann Hydroxyethylstärke ein durchschnittliches Molekulargewicht (Durchschnittsgewicht) von 1–300 kDa haben, wobei ein Durchschnittsmolekulargewicht von 5-100 kDa stärker bevorzugt ist. Hydroxyethylstärke kann weiterhin einen molekularen Grad der Substituierung von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis zwischen C2:C6-Substitution im Bereich von 2–20, in Bezug auf die Hydroxyethylgruppen aufweisen.
  • Das HAS-EPO, hergestellt durch das obige Verfahren, kann wie folgt gereinigt und charakterisiert werden:
    Die Isolierung des HAS-EPO kann durchgeführt werden durch Benutzen von bekannten Vorgängen für die Reinigung von natürlichem und rekombinanten EPO (z.B. Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, RP-HPLC, Hydroxyapatitchromatographie, Hydrophobe Interaktionschromatographie, der Vorgang beschrieben in Beispiel 20.8 oder Kombinationen davon).
  • Das kovalente Anfügen von HAS an das EPO-Polypeptid kann durch Kohlenhydratzusammensetzungsanalyse nach Hydrolyse des modifizierten Proteins (Anteil der vorliegenden Hydroxyethylglucose und Mannose an den drei N-Glycosylierungsstellen des EPO) bestätigt werden.
  • Der Beweis der HAS-Modifizierung an N-gebundenen Oligosacchariden des EPO kann durchgeführt werden durch Entfernen des HAS-modifizierten N-Glycans und Beobachtung der vorhergesagten Verlagerung zu stärkerer Mobilität im SDS-PAGE +/- Western Blot Analyse.
  • HAS-Modifikation von EPO an Cysteinresten kann gezeigt werden durch das Misslingen in den proteolytischen Fragmenten des HAS-modifizierten Produktes, die entsprechenden proteolytischen Cys-Peptide in RP-HPLC und MALDI/TOF-MS zu detektieren. (Zhou et al., 1998, Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospraymass spectrometry and matrix-assisted laserdesorption/ionization – time of flight – mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin. Electrophoresis, 19(13), 2348-55). Die Isolierung der HAS-beinhaltenden Fraktion nach proteolytischem Verdau des Cys-modifizierten EPO ermöglicht die Bestätigung des entsprechenden Peptids in dieser Fraktion durch übliche Aminosäurezusammensetzungsanalyse.
  • Alle oben offenbarten Ausführungsformen in Bezug auf das erfindungsgemäße HAS-EPO bezüglich Eigenschaften von EPO oder HAS sind auch auf das oben Verfahren zur Herstellung von HAS-EPO anzuwenden.
  • Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein erfindungsgemäßes HAS-EPO zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
  • Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das erfindungsgemäße HAS-EPO. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung weiterhin mindestens ein(en) pharmazeutisch geeignetes Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und/oder Trägerstoff, verwendbar bei der Erythropoietintherapie.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung wird bevorzugt benutzt für die Behandlung von anämischen Störungen oder hematopoietischen Funktionsstörungen oder damit zusammenhängenden Krankheiten.
  • Eine „therapeutisch effektive Menge" wie hierin verwendet, bezeichnet die Menge, die einen therapeutischen Effekt für einen bestimmten Zustand und Verabreichungsweise bereitstellt. Die Verabreichung von Erythropoietin-Isoformen ist auf parenteralem Weg bevorzugt. Der spezifische gewählte Weg wird von dem Zustand, der behandelt wird, abhängen. Die Verabreichung von Erythropoietin-Isoformen wird bevorzugt als Teil einer Formulierung getätigt, welcher einen geeigneten Trägerstoff enthält, wie menschliches Serumalbumin, ein geeignetes Verdünnungsmittel, wie eine gepufferte Salz-Lösung und/oder einen geeigneten Hilfsstoff. Die benötigte Dosierung soll in Mengen, ausreichend um den Hämatokrit der Patienten zu erhöhen, vorliegen und soll variieren, abhängig von der Ernsthaftigkeit des behandelten Zustandes, des benutzten Verabreichungsverfahrens und Ähnlichem.
  • Die Aufgabe der Behandlung mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist bevorzugt ein Anstieg des Hämoglobinwertes auf mehr als 6,8 mmol/l im Blut. Dazu kann die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Weise verabreicht werden, dass der Hämoglobinwert zwischen 0,6 mmol/l und 1,6 mmol/l pro Woche ansteigt. Wenn der Hämoglobinwert 8,7 mmol/l überschreitet, sollte die Therapie bevorzugt unterbrochen werden, bis der Hämoglobinwert unter 8,1 mmol/l ist.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird bevorzugt in einer Formulierung, geeignet für subkutane oder intravenöse oder parenterale Injektion benutzt. Dazu sind geeignete Hilfsstoffe und Trägerstoffe z.B. Natrium-Dihydrogenphosphat, Dinatrium-Hydrogenphosphat, Natriumchlorat, Polysorbat 80, HSA und Wasser für die Injektion. Die Zusammensetzung kann dreimal die Woche verabreicht werden, bevorzugt zweimal die Woche, stärker bevorzugt einmal die Woche und am stärksten bevorzugt alle zwei Wochen.
  • Bevorzugt wird die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Menge von 0,01–10 μg/kg Körpergewicht des Patienten, stärker bevorzugt 0,1 bis 5 μg/kg, 0,1 bis 1 μg/kg oder 0,2–0,9 μg/kg, am stärksten bevorzugt 0,3–0,7 μg/kg und am meisten bevorzugt 0,4–0,6 μg/kg Körpergewicht verabreicht.
  • Im Allgemeinen wird bevorzugt zwischen 10 μg und 200 μg, bevorzugt zwischen 15 μg und 100 μg pro Dosis verabreicht.
  • Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung von erfindungsgemäßem HAS-EPO zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von anämischen Störungen oder hematopoietischen Funktionsstörungen oder dazu verwandten Krankheiten.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die benutzte HAS die folgende Formel (I)
    Figure 00200001
    wobei R1, R2 und R3 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine lineare oder verzweigte Hydroxyalkylgruppe sind. Der Ausdruck „Hydroxyalkylstärke" wie er in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, ist nicht beschränkt auf Verbindungen, wobei der terminale Kohlenhydratanteil Hydroxyalkylgruppen R1, R2 und/oder R3 umfasst, wie der Kürze willen in Formel (I) dargestellt, sondern bezieht sich auch auf Verbindungen, in denen mindestens eine Hydroxygruppe irgendwo vorhanden ist, entweder im terminalen Kohlenhydratanteil und/oder in dem übrigen Teil des Stärkemoleküls, HAS' ist substituiert durch eine Hydroxyalkylgruppe R1, R2 oder R3. In diesem Zusammenhang können die Alkylgruppen lineare oder verzweigte Alkylgruppen sein, welche geeignet substituiert sein können. Bevorzugt enthält die Hydroxyalkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt von 1 bis 6 Kohlenstoffatome, noch stärker bevorzugt von 1 bis 4 Kohlenstoffatome und noch mehr bevorzugt 2-4 Kohlenstoffatome. „Hydroxyalkylstärke" umfasst daher bevorzugt Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke und Hydroxybutylstärke, wobei Hydroxyethylstärke und Hydroxypropylstärke besonders bevorzugt sind, Hydroxyethylstärke ist ganz besonders bevorzugt.
  • HAS und bevorzugt HES können mit einer Quervernetzungsverbindung umgesetzt werden, welche mit HAS reagiert, bevorzugt mit HES und den Polypeptiden wie den oben beschriebenen Polypeptiden.
  • Die Reaktion zwischen HAS und der Quervernetzungsverbindung kann an dem reduzierenden Ende der HAS oder an dem oxidierten reduzierenden Ende der HAS stattfinden. Daher kann HAS umgesetzt werden, aufweisend eine Struktur nach Formel (I)
    Figure 00210001
    und/oder, im Fall dass das reduzierende Ende oxidiert ist, nach der Formel (IIa)
    Figure 00210002
    und/oder nach der Formel (IIb)
    Figure 00220001
  • Wenn HAS nach Formel (I) mit einer Quervernetzungsverbindung umgesetzt wird, findet die Reaktion bevorzugt in einem wässrigen Medium statt. Wenn HAS nach Formel (IIa) und/oder (IIb) mit einer Quervernetzungsverbindung umgesetzt wird, findet die Reaktion bevorzugt in einem nichtwässrigen Medium wie in einem polaren aprotischen Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung so wie DMSO und/oder DMF statt.
  • Wenn das HAS-Polypeptidkonjugat der vorliegenden Erfindung hergestellt wird durch Reaktion eines HAS-Derivates, umfassend HAS und eine Quervernetzungsverbindung, mit dem oxidierten Kohlenhydratanteil des Polypeptides, ist die Quervernetzungsverbindung bevorzugt eine Verbindung
    Figure 00220002
    Figure 00230001
  • Wenn das HAS-Polypeptidkonjugat der vorliegenden Erfindung hergestellt wird durch Reaktion eines HAS-Derivates, umfassend HAS und mindestens eine Quervernetzungsverbindung, mit der Thio-Gruppe des Polypeptides, ist es bevorzugt HAS an seinem gegebenenfalls oxidierten reduzierten Ende umzusetzen mit einer ersten Quervernetzungsverbindung, welche bevorzugt eine Verbindung ist
    Figure 00230002
    Figure 00240001
    und das resultierende HAS-Derivat mit einer zweiten Quervernetzungsverbindung umzusetzen, welche in der Lage ist, mit dem HAS-Derivat und der Thio-Gruppe des Polypeptides zu reagieren. Wenn z.B. das HAS-Derivat als eine funktionale Gruppe, welche mit der zweiten Quervernetzungsverbindung umgesetzt wird, die Struktur -NH- umfasst, wie oben ausführlich beschrieben, sind die folgenden Arten von zweiten Quervernetzungsverbindungen mit funktionalen Gruppen F1 und F2 unter Anderen bevorzugt.
  • Figure 00250001
  • Besonders bevorzugte Beispiele der ersten Quervernetzungsverbindung sind
    Figure 00250002
    welche besonders bevorzugt sind und die folgenden zweiten Quervernetzungsverbindungen
    Figure 00250003
  • Abhängig von den jeweiligen Reaktionsbedingungen, dem benutzten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch und/oder den Resten R' und/oder R'' einer Verbindung R'-NH-R'' mit der die HAS in wässrigem Medium umgesetzt wird, ist es möglich, dass das Hydroxyalkylstärkederivat erhältlich durch das/die oben beschriebene(n) Verfahren die folgenden Strukturen hat (IIIa)
    Figure 00260001
  • Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Hydroxyalkylstärkederivat wie oben beschrieben mit einer Struktur nach Formel (IIIa).
  • Es ist außerdem möglich dass, z.B. in dem Fall wo R' Wasserstoff ist, dass das Hydroxyalkylstärkederivat, erhältlich durch das/die oben beschriebene(n) Verfahren, die folgenden Strukturen (IIIa) oder (IIIb) hat, wobei (IIIa) und (IIIb) beide in dem Reaktionsgemisch vorhanden sein können, welches eine bestimmte Gleichgewichtsverteilung hat:
    Figure 00260002
  • Daher bezieht sich die vorliegende Verbindung auch auf ein Hydroxyalkylstärkederivat wie oben beschrieben, welches eine Struktur nach Formel (IIIb) hat.
  • Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Hydroxyalkylstärkederivat wie oben beschrieben, welches in einer Mischung von Strukturen nach den Formeln (IIIa) und (IIIb) vorliegt.
  • Abhängig von den Reaktionsbedingungen und/oder der chemischen Beschaffenheit der Verbindung R'-NH-R'', welche für die Reaktion benutzt wird, können die Verbindungen nach Formel (IIIa) mit den N-Atom in equatorialer oder axialer Position vorhanden sein, wobei auch eine Mischung beider Formen vorhliegen kann, welche eine bestimmte Gleichgewichtsverteilung hat.
  • Abhängig von den Reaktionsbedingungen und/oder der chemischen Beschaffenheit der Verbindung R'-NH-R'', welche für die Reaktion benutzt wird, können die Verbindungen nach Formel (IIIb) mit der C-N-Doppelbindung in E- oder Z-Konformation vorhanden sein, wobei auch eine Mischung von beiden Formen vorliegen kann, welche eine bestimmte Gleichgewichtsverteilung hat.
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindung nach Formel (IIIa) zu stabilisieren. Dies ist vorzugsweise der Fall, wenn die Verbindung nach Formel (IIIa) in einer wässrigen Lösung hergestellt und/oder verwendet wird. Als stabilisierendes Verfahren ist die Acylierung der Verbindung. nach Formel (IIIa) besonders bevorzugt, vorzugsweise in dem Fall, wo R' Wasserstoff ist. Als Acylierungsreagenz können alle geeigneten Reagenzien verwendet werden, welche zu dem gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat nach Formel (IVa) führen
    Figure 00270001
  • Nach besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Rest Ra, welcher Teil der Acylierungsreagenz ist, Methyl. Als Acylierungsreagenzien werden bevorzugt Carbonsäureanhydride, Carbonsäurehalogenide und durch Carbonsäure aktivierte Esther verwendet.
  • Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Hydroxyalkylstärkederivat erhältlich nach einem oben beschriebenen Verfahren, wobei das Derivat eine Struktur nach Formel (IVa) hat.
  • Die Acylierung wird durchgeführt bei einer Temperatur in dem Bereich von 0 bis 30 °C, bevorzugt in dem Bereich von 2 bis 20 °C und besonders bevorzugt in dem Bereich von 4 bis 10 °C.
  • In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindung nach Formel (IIIb) zu stabilisieren. Dies ist vorzugsweise der Fall, wenn die Verbindung nach Formel (IIIb) in wässriger Lösung produziert und/oder benutzt wird. Als stabilisierendes Verfahren wird die Reduktion der Verbindung nach Formel (IIIb) besonders bevorzugt, vorzugsweise in dem Fall wo R' Wasserstoff ist. Als Reduktionsreagenz können alle geeigneten Reagenzien benutzt werden, welche zu dem gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat nach Formel (IVb) führen
    Figure 00280001
  • Nach besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden als Reduktionsreagenzien Borhydride wie NaCNBH3 oder NaBH4 benutzt.
  • Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Hydroxyalkylstärkederivat, erhältlich durch ein oben beschriebenes Verfahren, wobei das Derivat eine Struktur nach Formel (IVb) hat.
  • Die Reduktion wird durchgeführt bei einer Temperatur in dem Bereich von 4 bis 100 °C, bevorzugt in dem Bereich von 10 bis 90 °C und besonders bevorzugt in dem Bereich von 25 bis 80 °C.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Gemische der Verbindungen (IIIa) und (IIIb), (IVa) und (IVb), (IIIa) und (IVa), (IIIa) und (IVb), (IIIb) und (IVa), (IIIb) und (IVb), (IIIa) und (IIIb) und (IVa), (IIIa) und (IIIb) und (IVb), (IVa) und (IVb) und (IIIa), und (IVa) und (IVb) und (IIIb), wobei (IIIa) und/oder (IVa) unabhängig in einer Konformation vorkommen können, wobei das N-Atom in equatorialer oder axialer Position und/oder wobei (IIIb) mit der C-N-Doppelbindung in E- oder Z-Konformation vorhanden sein kann.
  • Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die folgenden Abbildungen, Tabellen und Beispiele, die in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken sollen.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1
  • 1 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von zwei HES-EPO-Konjugaten
    • mw:
    Marker
    Spur 1:
    HES-EPO hergestellt nach Beispielprotokoll 8: EPO ist konjugiert an Hydrazido-HES 12KD L
    Spur 2:
    HES-EPO hergestellt nach Beispielprotokoll 9: EPO ist konjugiert an Hydroxylamino-HES 12KD K
    C:
    Kontrolle (unkonjugiertes EPO); die obere Bande bildet das EPO-Dimer
  • 2
  • 2 veranschaulicht, dass die HES an einen Kohlenhydratanteil einer Kohlenhydratseitenkette konjugiert ist, indem ein Verdau von HAS-modifizierten EPO-Formen mit Polypeptid N-Glykosidase gezeigt wird.
    • Spur 1:
    HES-EPO hergestellt nach Beispielprotokoll 8 nach Verdau mit N-Glykosidase
    Spur 2:
    HES-EPO hergestellt nach Beispielprotokoll 9 nach Verdau mit N-Glykosidase
    Spur 3:
    BRP EPO-Standard
    Spur 4:
    BRP EPO-Standard nach Verdau mit N-Glykosidase
    mw:
    Marker (Bio-Rad SDS-PAGE Standards low range Katalog Nr. 161-0305, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)
  • 3
  • 3 zeigt eine SDS-Page-Analyse des nach Beispiel 17.1 hergestellten HES-EPO-Konjugates.
    • Spur A:
    Proteinmarker Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 und 17.
    Spur B:
    Rohprodukt nach Konjugierung nach Beispiel 17.1.
    Spur C:
    EPO-Startmaterial
  • 4
  • 4 zeigt eine SDS-Page-Analyse des nach Beispiel 17.3 hergestellten HES-EPO-Konjugates.
    • Spur A:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 17.3.
    Spur B:
    EPO-Startmaterial
    Spur C:
    Proteinmarker Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 und 17.
  • 5
  • 5 zeigt eine SDS-Page-Analyse von nach Beispielen 17.4 und 17.5 hergestellten HES-EPO-Konjugaten.
    • Spur A:
    Proteinmarker Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 und 17.
    Spur B:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 17.4.
    Spur C:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 17.5.
    Spur D:
    EPO-Startmaterial.
  • 6
  • 6 zeigt eine SDS-Page-Analyse von nach Beispielen 19.1 und 19.4 hergestellten HES-EPO-Konjugaten.
    • Spur A:
    Proteinmarker Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 und 17.
    Spur B:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.4.
    Spur C:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.1.
    Spur D:
    EPO-Startmaterial.
  • 7
  • 7 zeigt eine SDS-Page-Analyse von nach Beispielen 19.2, 1.3, 19.5 und 19.6. hergestellten HES-EPO-Konjugaten.
    • Spur A:
    Proteinmarker Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 und 17.
    Spur B:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.6, basierend auf Beispiel 13.3 b).
    Spur C:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.5, basierend auf Beispiel 13.1 b).
    Spur D:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.6, basierend auf Beispiel 13.3 a).
    Spur E:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.5, basierend auf Beispiel 13.1 a).
    Spur F:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.2.
    Spur G:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.3.
    Spur K:
    EPO-Startmaterial.
  • 8
  • 8 zeigt eine SDS-Page-Analyse von nach Beispielen 19.7, 19.8, 19.9, 19.10, 19.11 und 19.12 hergestellten HES-EPO-Konjugaten.
    • Spur A:
    Proteinmarker Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25.4 und 17.
    Spur B:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.11.
    Spur C:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.10.
    Spur D:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.7.
    Spur E:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.8.
    Spur F:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.12.
    Spur G:
    EPO-Startmaterial.
    Spur K:
    Rohprodukt nach Konjugation nach Beispiel 19.9.
  • 9
  • SDS-PAGE-Analyse von EPO-GT-1 welches für 5 min einer milden Säurebehandlung ausgesetzt war = Spur 2; 10 min = Spur 3; 60 min = Spur 4 und unbehandeltes EPO = Spur 1; die Mobilitätsveränderung von EPO nach der Entfernung des N-Glycans ist gezeigt (+PNGASE).
  • 10
  • HPAEC-PAD-Muster von Oligosacchariden isoliert aus unbehandeltem EPO und aus EPO inkubiert für 5 min, 10 min und 60 min unter milden Säurehydrolysebedingungen. Römische Ziffern I-V bezeichnen die Elutionspositionen von I = desialysierte antennenartige Struktur, II = trisialysierte triantennenartige Strukturen (zwei Isomere), III = tetrasialysierte tetraantennenartige Struktur + 2 N-Acetyllactosamin-Wiederholungen, IV = tetrasialysierte tetraantennenartige Struktur + 1 N-Acetyllactosamin-Wiederholung; V = tetrasialysierte tetraantennenartige Struktur + ohne N-Acetyllactosamin-Wiederholung. Der Elutionsbereich von Oligosaccharidstrukturen ohne, mit 1-4 Sialinsäuren wird durch Klammern gezeigt.
  • 11
  • HPAEC-PAD von N-gebundenen Oligosacchariden nach Desialysierung; die Elutionsposition von N-Acetylneuraminsäure ist gezeigt; Ziffern 1-9 zeigen die Elutionsposition von Standardoligosacchariden: 1 = diantennenartig; 2 = triantennenartig (2–4 Isomer), 3 = triantennenartig (2–6 Isomer); 4 = tetraantennenartig; 5 = triantennenartig plus 1 Wiederholung; 6 = tetraantennenartig plus 1 Wiederholung; 7 = triantennenartig plus 2 Wiederholungen; 8 = tetraantennenartig plus 2 Wiederholungen und 9 = tetraantennenartig plus 3 Wiederholungen.
  • 12
  • SDS-PAGE-Analyse von mild behandeltem und unbehandelten EPO, welche einer Perjodatoxidation von Sialinsäureresten unterworfen worden waren. 1 = perjodatoxidiert ohne Säurebehandlung; 2 = perjodatoxidiert 5 min Säurebehandlung; 3 = perjodatoxidiert und Säurebehandlung 10 min; 4 = perjodatoxidiert ohne Säurebehandlung; 5 = BRP EPO-Standard ohne Perjodat und ohne Säurebehandlung.
  • 13
  • HPAEC-PAD-Muster von natürlichen Oligosacchariden isoliert aus unbehandeltem EPO und aus EPO, welches für 5 min und 10 min unter milden Säurehydrolysebedingungen und anschließender Perjodatbehandlung inkubiert wurde. Der Elutionsbereich von Oligosaccharidstrukturen ohne und mit 1–4 Sialinsäure ist gezeigt durch die Klammern 1–5.
  • 14
  • SDS-PAGE-Analyse des Zeitverlaufs der HES-Modifizierung von EPO-GT-1-A: 20 μg Aliquots von EPO-GT-1-A wurden umgesetzt mit hydroxylaminmodifiziertem HES-Derivat X für 30 min, 2, 4 und 17 Stunden. Spur 1 = 30 min Reaktionsszeit; Spur 2 = 2 Stunden Reaktionszeit; Spur 3 = 4 Stunden Reaktionszeit; Spur 4 = 17 h Reaktionszeit; Spur 5 = EPO-GT-1-A ohne HES-Modifizierung. Linke Abbildung zeigt die Mobilitätsveränderung von EPO-GT-1-A bei zunehmender Inkubationszeit in der Anwesenheit des mit Hydroxylamin modifizierten HES-Derivates (Flussrate: 1 ml·min–1) X: Spur 1 = 30 min Reaktionszeit; Spur 2 = 2 Stunden Reaktionszeit; Spur 3 = 4 Stunden Reaktionszeit, Spur 4 = 17 Stunden Reaktionszeit; Spur 5 = EPO-GT-1-A mit HES-Modifizierung. Die Abbildung auf der rechten Seite zeigt die Analyse derselben Proben nach ihrer Behandlung mit N-Glycosidase.
  • 15
  • SDS-Page-Analyse von Q-Sepharosefraktionen von HES-EPO-Konjugaten. Jeweils 1 des Durchlaufs und 1% der Fraktion, welche bei hohen Salzkonzentrationen eluiert, wurden in einem Speed Vac concentrator konzentriert und wurden in Probenpuffer auf die Gele geladen. EPO-Protein wurde mit Coomassie Blue gefärbt. A = Probe I; B = Probe II; C = Probe III; K = Kontrolle EPO-GT-1; A1, B1, C1 und K1 bezeichneten die Durchlauffraktionen; A2, B2, C2 und K2 bezeichnet die Fraktion, die bei hoher Salzkonzentration eluiert wurde.
  • 16a
  • SDS-PAGE-Analyse der HES-modifizierten EPO-Probe. A2 (siehe 15), Kontroll-EPO-Probe K2 und EPO-GT-1-A EPO-Ansätze wurden in Anwesenheit von N-Glyko sidase verdaut, um N-gebundene Oligosaccharide zu entfernen. Alle EPO-Proben zeigten die Mobilitätsveränderung in Richtung der Formen mit geringem Molekulargewicht, welchen O-Glycan fehlt oder welche O-Glycan enthalten. Ein geringerer Anteil der O-glycosylierten und nicht glycosylierten Proteinbande wurde für die HES-modifizierte EPO-Probe A2 nach de-N-Glycosylierung beobachtet und eine diffuse Proteinbande um 30 KDa erkannt, welche vermutlich die HES-Modifikation an der Sialinsäure des O-Glycanrestes darstellt (siehe Pfeil markiert durch ein Sternchen).
  • 16b
  • SDS-PAGE-Analyse nach milder Hydrolyse von HES-modifizierter EPO-Probe A2 (siehe 15), Kontroll-EPO-Probe K2 und EPO-GT-1A, welche unbehandelt waren oder in Anwesenheit von N-Glykosidase verdaut worden waren, um N-gebundene Oligosaccharide zu entfernen (Siehe 16a). Beide Formen mit hohem Molekulargewicht von A2 vor und A nach N-Glykosidasebehandlung (siehe Klammern mit und ohne Pfeil) verschwanden nach Säurebehandlung der Proben. Der BRP EPO-Standard, der zum Vergleich lief, wurde keiner milden Säurebehandlung unterworfen.
  • 17
  • HPAEC-PAD-Analyse von N-gebundenem Oligosaccharidmaterial freigesetzt von HES-modifizierter Probe A, von EPO-GT-1-A und von einer Kontroll-EPO-Probe inkubiert mit unmodifizierter HES (K). Römische Ziffern I-V bezeichnen die Elutionsposition von I = disialysierter diantennenartiger Struktur, II = trisialysierten triantennenartigen Strukturen (zwei Isomere), III = tetrasialysierter tetraantennenartiger Struktur + 2 N-acetyllactosamin-Wiederholungen, IV = tetrasialysierter tetraantennenartiger Struktur + 1 N-acetyllactosamin-Wiederholung, V = tetrasialysierter tetraantennenartiger Struktur + ohne N-acetyllactosamin Wiederholung; eckige Klammern bezeichnen den Elutionsbereich von di-, tri- und tetrasialyisierten N-Glycanen wie in den Bildunterschriften von 10 und 13 berichtet.
  • 18
  • HPAEC-PAD-Analyse von N-gebundenem Oligosaccharid-Material freigesetzt von HES-modifizierter Probe A, von EPO-GT-1A und von einer Kontroll-EPO-Probe (K) inkubiert mit unmodifizierter HES. Die Retentionszeiten einer Mischung von Standard-Oligosacchariden sind dargestellt: Ziffern 1-9 bezeichnen die Elutionsposition von Standard-Oligosacchariden: 1 = diantennenartig; 2 = triantennenartig (2–4-Isomer); 3 = triantennenartig (2–6-Isomer); 4 = tetraantennenartig; 5 = triantennenartig plus 1 Wiederholung; 6 = tetraantennenartig plus 1 Wiederholung; 7 = triantennenartig plus 2 Wiederholungen; 8 = tetraantennenartig plus 2 Wiederholungen und 9 = tetraantennenartig plus 3 Wiederholungen.
  • 19 bis 25
  • 19 bis 25 stellen MALDI/TOF-Massenspektren von den enzymatisch freigesetzten und chemisch desialysierten N-Glycanen isoliert von HES-modifiziertem EPO und Kontroll-EPO-Ansätzen dar. Größere Signale bei m/z 1809.7, 2174.8, 2539.9, 2905.0 und 3270.1 ([M+Na]+) entsprechen den di- bis tetraantennenartigen komplexartigen N-Glycanstrukturen mit keiner, einer oder zwei N-acetyllactosamin-Wiederholungen begleitet durch schwache Signale durch einen Verlust von Fucose oder Galactose auf Grund von Säurehydrolysebedingungen angewandt für die Disialysierung von Proben für die MS-Analyse.
  • 19
    • MALDI/TOF-Spektrum: desialyisierte Oligosaccharide von HES-modifiziertem EPO A2.
  • 20
    • MALDI/TOF-Spektrum: desialyisierte Oligosaccharide von EPO GT-1-A.
  • 21
    • MALDI/TOF-Spektrum: desialyisierte Oligosaccharide von EPO K2.
  • 22
    • MALDI/TOF-Spektrum: desialyisierte Oligosaccharide von EPO-GT-1.
  • 23
    • MALDI/TOF-Spektrum: desialyisierte Oligosaccharide von EPO-GT-1, welche für 5 min. einer Säurehydrolyse unterzogen worden waren.
  • 24
    • MALDI/TOF-Spektrum: desialyisierte Oligosaccharide von EPO-GT-1, welche für 10 min. einer Säurehydrolyse unterzogen worden waren.
  • 25
    • MALDI/TOF-Spektrum: desialyisierte Oligosaccharide von EPO-GT-1, welche für 60 min. einer Säurehydrolyse unterzogen worden waren.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Herstellung von rekombinantem EPO
  • A) Herstellung in Säugerzellen
  • Rekombinantes EPO wurde in CHO-Zellen wie folgt hergestellt
  • Ein Plasmid, beinhaltend die menschliche EPO cDNA wurde in den eukaryotischen Expressionsvektor (pCR3 und später als pCREPO bezeichnet) kloniert. „Site directed mutagenesis" wurde durchgeführt durch Benutzen von Standardverfahren wie beschrieben (Grabenhorst, Nimtz, Costa et al., 1998, In vivo specificity of human alpha 1,3/4-fucosyltransferases III-VII in the biosynthesis of Lewis(x) and sialyl Lewis(x) motifs on complextype N-glycans -Coexpression studies from BHK-21 cells together with human beta-trace protein, J. Biol. Chem., 273(47), 30985-30994).
  • CHO-Zellen, welche dauerhaft menschliches EPO oder Aminosäurevarianten (z.B. Cys-29→Ser/Ala, oder Cys-33→Ser/Ala, Ser-126→Ala usw.) davon exprimieren, wurden generiert durch die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode und mit G418-Sulfat wie beschrieben selektiert (Grabenhorst et al.). Drei Tage nach Transfektion wurden die Zellen 1:5 subkultiviert und in DMEM selektiert, enthaltend 10% FBS und 1,5 g/Liter G418-Sulfat.
  • Bei Benutzen dieses Selektionsverfahrens überlebten üblicherweise 100–500 Klone, und wurden für einen weiteren Zeitraum von 2–3 Wochen in Selektionsmedium vermehrt. Zellkulturüberstände von konfluent wachsenden Einzelschichten wurden dann auf EPO-Expressionslevel durch Western-Blot-Analyse oder durch IEF/Western-Blot-Analyse analysiert. EPO wurde durch stabile Subklone in Spinner-Flaschen oder in 21 Perfusionsreaktoren hergestellt. Unterschiedliche Glycoformen von EPO mit unterschiedlichen Mengen an NeuAc (z.B. 2–8, 4–10, 8–12 NeuAc-Reste) wurden nach veröffentlichten Protokollen isoliert, indem verschiedene Kombinationen von Chromatographieverfahren, wie unten beschrieben benutzt wurden.
  • Literatur:
    • Grabenhorst, Conradt, 1999, The cytoplasmic, transmembrane, and stem regions of glycosyltransferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi., J Biol Chem., 274(51), 36107–16; Grabenhorst, Schlenke, Pohl, Nimtz, Conradt, 1999, Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells, Glycoconj J., 16(2), 81–97; Mueller, Schlenke, Nimtz, Conradt, Hauser, 1999, Recombinant glycoprotein product quality in proliferation-controlled BHK-21 cells, Biotechnology and bioengineering, 65(5), 529–536; Schlenke, Grabenhorst, Nimtz, Conradt, 1999, Construction and characterization of stably transfected BHK-21 cells with human-type sialylation characteristic, Cytotechnology, 30(1–3), 17–25.
  • B) Herstellung in Insektenzellen
  • Rekombinantes menschliches EPO wurde von Insektenzelllinien SF 9 und SF 21 nach Infektion der Zellen mit rekombinantem Baculovirus-Vektor, enthaltend die menschliche EPO cDNA unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promoters, wie in der Literatur beschrieben hergestellt.
  • Zellen, welche in serumfreiem Kulturmedium wuchsen, wurden bei einer Zelldichte von 2 × 106 oder × 107-Zellen pro ml infiziert, und EPO-Titer wurden jeden Tag in den Zellkulturüberständen bestimmt. EPO wurde durch Blue-Sepharose-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie auf Q-Sepharose und zum Abschluss RP-HPLC mit C4-Phase gereinigt.
  • Die Reinheit des Produktes wurde durch SDS-PAGE und N-terminale Sequenzierung geprüft. Eine ausführliche Kohlenhydratstrukturanalyse (N- und O-Glycosylierung) wurde nach veröffentlichten Verfahren durchgeführt.
  • Literatur:
    • Grabenhorst, Hofer, Nimtz, Jager, Conradt, 1993, Biosynthesis and secretion of human interleukin 2 glycoprotein variants from baculovirus-infected Sf21 cells. Characterization of polypeptides and posttranslational modifications, Eur J Bio-chem., 215(1), 189-97; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7
  • Beispiel 2
  • Bildung von reaktiven HES-Derivaten 1. SH-reaktive HES 1.1 Reaktion von EMCH mit Oxo-HES12KD um SH-reaktive HES12KDB zu bilden
    Figure 00380001
  • 0,144 g (0,012 mmol) von Oxo-HES12KD (Fresenius Deutsches Patent DE 196 28 705 A1 ) wurden in 0,3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und wurden tropfenweise unter Stickstoff zu einer Mischung von 34 mg (0,15 mmol) EMCH (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) in 1,5 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 19 h bei 60 °C wurde die Reaktionsmischung zu 16 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton gegeben. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 3 ml DMSO gelöst und noch einmal wie beschrieben präzipitiert. Die SH-reaktive-HES12KD B wurde durch Zentrifugation und Trocknen im Vakuum erhalten. Die Konjugationsreaktion mit Thio-EPO ist in Beispiel 3, 2.2 beschrieben.
  • Alternativen:
  • In dieser Reaktion können alle Quervernetzer verwendet werden, welche eine Hydrazid- und eine Maleimidfunktion aufweisen, welche durch ein Abstandsstück getrennt sind. Weitere Beispiele für Moleküle dieser Gruppe, erhältlich von Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland, sind in Tabelle 2 gezeigt; markiert mit einem "A". Außerdem könnte ebenso eine andere Gruppe von Quervernetzern, welche eine aktivierte Disulfidfunktion anstelle einer Maleimidfunktion aufweist, benutzt werden.
  • 1.2 Halogenacetamid-Derivate von HES-Glycosylaminen
    • a) Glycosylaminbildung
    • Eine 1-mg-Probe von HES12KD wurde in 3 ml gesättigtem Ammoniumbicarbonat gelöst. Weiteres festes Ammoniumbicarbonat wurde dann hinzugefügt um die Sättigung der Lösung während der Inkubation für 120 h bei 30 °C aufrecht zu erhalten. Die Amino-HES12KD C wurde entsalzen durch direkte Lyophilisierung der Reaktionsmischung.
    • b) Acylierung des Glycoslyamins C mit Chloressigsäure-Anhydrid
    • Eine 1-mg-Probe von Amino-HES12KD C wurde in einem ml an 1 M Natriumbicarbonat gelöst und auf Eis gekühlt. Dazu wurde ein Kristall festes Chloressigsäureanhydrid (~5 mg) hinzugefügt und der Reaktionsmischung wurde ermöglicht, auf Raumtemperatur zu erwärmen. Der pH wurde überwacht und zusätzliche Base wurde hinzugefügt, wenn der pH unter 7,0 fiel. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurde ein zweites Basen- und Anhydridaliquot hinzugefügt. Nach sechs Stunden wurde das Produkt Chloroacetamid-HES D1 (X = Cl) durch Durchlauf über ein mixed bed Amberlite MB-3(H)(OH) Ionenaustauschharz entsalzen.
    • c) Acylierung des Glycosylamins mit Bromessigsäure-Anhydrid
    • Bromessigsäure-Anydrid wurde hergestellt wie durch Thomas beschrieben. Eine 1-mg-Probe von Amino-HES12KD C wurde in 0,1 ml trockenem DMF gelöst und auf Eis gekühlt und 5 mg Bromessigsäure-Anydrid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf Raumtemperatur gebracht und die Lösung wurde für 3 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zu 1 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton mit –20 °C hinzugefügt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 0,1 ml DMF gelöst und wiederum wie beschrieben präzipitiert. Die Bromacetamid-HES D2 (X = Br) wurde durch Zentrifugation und Trocknen im Vakuum erhalten. Die Konjugationsreaktion mit Thio-EPO ist in Beispiel 3, 1.2 beschrieben.
    • d) Das entsprechende Jodderivat D3 (X = I) wurde synthetisiert wie für D2 beschrieben. An Stelle von Bromessigsäure-Anydrid wurde N-Succinimidyl-Jodacetat benutzt und alle Schritte wurden im Dunkeln durchgeführt.
      Figure 00400001
  • Alternativen:
  • Für die Acylierung von Aminogruppen können andere aktivierte Formen von Halogensauren Säuren verwendet werden, z.B.
    • – -Bromide oder -Chloride
    • – Ester, z.B. N-Hydroxysuccinimidester, Ester mit substituierten Phenolen (p-Nitrophenol, Pentafluorphenol, Trichlorophenol usw.)
  • Außerdem können alle Quervernetzer mit einer aminoreaktiven Gruppe und einer Halogenacetylfunktion, welche durch ein Abstandsstück getrennt sind, verwendet werden. Ein Beispiel dafür ist SBAP. Dieses Molekül und andere sind erhältlich durch Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland. Sie sind in Tabelle 2 mit einem "D" markiert. Für die Verwendung als Quververnetzer zur Ligierung von Amino-HES mit Thio-EPO ohne Isolierung der Halogenacetamid-HES-Derivate siehe Anmerkungen in Beispiel 3, 1.2.
  • 1.3 Halogenacetamidderivate von Amino-HES E1
    • a) Reaktion von 1,4-Diaminobutan mit Oxo-HES12KD zu Amino-HES12KD E
    • 1,44 g (0,12 mmol) von Oxo-HES12KD wurde in 3 ml trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und wurde tropfenweise unter Stickstoff zu einer Mischung von 1,51 ml (15 mmol) 1,4-Diaminobutan in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 19 h bei 40 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton hinzugefügt. Das Präzipitat Amino-HES12KD E wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5 KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert.
      Figure 00410001
    • b) Chloroacetamid-HES12KD F1 wurde hergestellt wie oben beschrieben für Chloractamid-HES12KD D1 in 1.3.
    • c) Bromacetamid-HES12KD F2 (X = Br) wurde hergestellt wie oben für Bromacetamid-HES12KD D2 in 1.3 beschrieben. Die Konjugationsreaktion mit Thio-EPO ist in Beispiel 3, 1.2 beschrieben.
    • d) Das entsprechende Jodderivat F3 (X = I) wurde nicht vor seiner Reaktion mit Thio-EPO isoliert. Das Experiment ist in Beispiel 3, 1.1 beschrieben.
  • Alternativen:
  • Siehe oben 1.2
  • 2. CHO-reaktive HES 2.1 Hydrazid-HES a) Reaktion von Hydrazin mit Oxo-HES12KD
    Figure 00410002
  • 1,44 g (0,12 mmol) von Oxo-HES12KD wurden in 3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und wurden tropfenweise unter Stickstoff zu einer Mischung von 0,47 ml (15 mmol) Hydrazin in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 19 h bei 40 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt J wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 2 Tage gegen 0,5% (v/v) Triethylamin in wässriger Lösung und für 2 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5 KD Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert. Die Konjugationsreaktion mit oxidiertem Glyco-EPO ist in Beispiel 4, 2.2 beschrieben. b) Reaktion von Adepinsäure-Dihydrazid mit Oxo-HES12KD
    Figure 00420001
  • 1,74 g (15 mmol) Adepinsäure-Dihydrazid wurden in 20 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 65 °C gelöst, und 1,44 g (0,12 mmol) Oxo-HES12KD gelöst in 3 ml absolutem DMSO wurde tropfenweise unter Stickstoff hinzugefügt. Nach Rühren für 68 h bei 60 °C wurde die Reaktionsmischung zu 200 ml Wasser hinzugefügt. Die Lösung enthaltend L wurde für 2 Tage gegen 0,5% (v/v) Triethylamin in wässriger Lösung und für 2 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5 KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert. Die Konjugationsreaktion mit oxidiertem Glyco-EPO ist in Beispiel 4, 2.2 beschrieben.
  • Alternativen:
  • Außerdem können Derivate benutzt werden, bei denen 2 Hydrazidgruppen durch irgendein Abstandsstück getrennt sind.
  • 3. Weitere Amino-HES12KD-Derivate I und H1
  • Ammonolyse von D oder F wurde einzeln durchgeführt durch Lösen einer 1-mg-Probe jedes Halogenacetamids in 0,1 ml gesättigtem Ammoniumcarbonat. Zusätzliches festes Ammoniumcarbonat wurde dann hinzugefügt um die Sättigung der Lösung während der Inkubation von 120 h bei 30 °C beizubehalten. Die Reaktionsmischung wurde dann zu 1 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton mit –20 °C hinzugefügt. Das Präzipitat wurde gesammelt durch Zentrifugation, wieder in 0,05 ml Wasser gelöst und wiederum wie beschrieben präzipitiert. Das Produkt AminoHES H oder I wurde durch Zentrifugation und Trocknen in Vakuum erhalten. Die Konjugationsreaktion mit oxidiertem Glyco-EPO ist in Beispiel 4, 4.1 beschrieben.
    Figure 00430001
    4. Hydroxylaminmodifizierte HES12KD K
    Figure 00430002
  • O-[2-(2-aminooxy-ethoxy)-ethyl]-hydroxylamin wurde wie beschrieben bei Boturyn et al in 2 Schritten aus kommerziell erhältlichen Materialien synthetisiert. 1,44 g (0,12 mmol) von Oxo-HES12KD wurden in 3 ml absolutem Dimethylsufloxid (DMSO) gelöst und wurden unter Stickstoff tropfenweise zu einer Mischung von 2,04 g (15 mmol) O-[2-(2-aminooxy-ethoxy)-ethyl]-hydroxylamin in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 48 h bei 65 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt K wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5 KD Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert. Die Konjugationsreaktion mit oxidiertem Glyco-EPO ist in Beispiel 4, 3.1 beschrieben.
  • Alternativen:
  • Außerdem können Derivate benutzt werden, wo zwei Hydroxylamingruppen durch irgendein Abstandsstück getrennt sind. 5. Thio-HES12KD 5.1 Hinzufügen zu Oxo-HES12KD
    Figure 00440001
  • 1,44 g (0,12 mmol) von Oxo-HES12KD wurden in 3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und wurden zu einer Mischung von 1,16 g (15 mmol) Cysteamin in 15 ml DMSO unter Stickstoff tropfenweise hinzugefügt. Nach Rühren für 24 h bei 40 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt M wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 2 Tage gegen eine 0,5% (v/v) Triethylamin-in-Wasser-Lösung und für 2 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5 KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert. Die Konjugationsreaktion mit oxidiertem Glyco-EPO ist in Beispiel 4, 2.1 beschrieben.
  • Alternativen:
  • Es können Derivate benutzt werden, bei denen die Aminogruppe und die Thio-Funktion durch irgendein Abstandsstück getrennt sind. Außerdem kann die Aminogruppe in den Derivaten durch ein Hydrazin, ein Hydrazid oder ein Hydroxylamin ersetzt werden. Die Thio-Funktion könnte in Form von z.B. einem Disulfid oder einem Tritylderivat geschützt sein. Allerdings muss in diesem Fall vor der Konjugation ein weiterer schutzentfernender Schritt durchgeführt werden, was eine Verbindung freisetzen würde, welche analog zu M ist.
  • 5.2 Modifikation von Amino-HES12KD E, H oder I
  • a) Modifikation mit SATA/SATP
  • 1,44 g (0,12 mmol) von Amino-HES12KD E, H oder I wurden in 3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und wurden zu einer Mischung von 139 mg (0,6 mmol) SATA in 5 ml DMSO unter Stickstoff tropfenweise hinzugefügt. Nach Rühren für 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt N wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 2 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5 KD- Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert.
  • Der schutzentfernende Schritt wurde in einem 50 mM Natriumphosphatpuffer, welcher 25 mM EDTA und 0,5 M Hydroxylamin enthielt, bei pH 7,5 für 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt, und das Produkt 0 wurde durch Dialyse gegen einen 0,1-molaren Natriumacetatpuffer, pH 5,5, enthaltend 1 mM EDTA, gereinigt. Die schutzentfernende Reaktion wurde unmittelbar vor der Konjugationsreaktion, welche in Beispiel 4, 2.1. beschrieben ist, durchgeführt.
  • Figure 00450001
  • b) Modifikation mit SPDP
  • 1,44 g (0,12 mmol) Amino-HES12KD E, H oder I wurden in 3 mL absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und tropfenweise zu einer Mischung aus 187 mg (0,6 mmol) SPDP in 5 mL DMSO unter Stickstoff hinzugefügt. Nach Rühren für 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung zu 160 mL einer 1:1-Mischung aus Ethanol und Aceton hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt P wurde durch Zentrifugieren gesammelt, wieder in 40 mL Wasser gelöst und 2 Tage lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5 KD Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert.
  • Der schutzentfernende Schritt wurde in einer 12 mg-Dithiothreitol-Lösung (DTT) pro 0,5 mL 100-millimolaren Nariumacetatpuffers, der 100 mM Natriumchlorid enthielt, bei einem pH von 4,5, 30 min. lang bei Raumtemperatur durchgeführt und das Produkt Q wurde durch Dialyse bei einem pH-Wert von 5,5 gegen einen 0,1-molaren Natriumacetatpuffer, der 1 mM EDTA enthielt, gereinigt. Die schutzentfernende Reaktion wurde unmittelbar vor der Konjugationsreaktion, die in Beispiel 4, 2.1.beschrieben ist, durchgeführt.
  • Alternativen:
  • Für die Umsetzung von Amino- und Thiolgruppen, sowohl in freier, als auch in geschützter Form, stehen verschiedene Reagenzien zur Verfügung. Nach ihrer Modifikation können die Produkte isoliert werden. Alternativ dazu können sie, wie es beim Gebrauch von Quervernetzern akzeptiert ist, vorzugsweise nach dem Reinigungsschritt, direkt für die Konjugationsreaktion benutzt werden. Zur Isolation und Aufbewahrung der Thio-HES-Derivate mag eine Synthese von Thio-HES-Derivaten in geschützter Form nützlich sein. Dazu können alle zu SATA analogen Derivate benutzt werden, die eine durch irgendeinen Abstandshalter voneinander getrennte aktive Esterfunktion und Thioesterfunktion haben. SATP, als weiteres Mitglied dieser Gruppe, findet sich in Tabelle 2, markiert mit "H". Die zu SPDP analogen Derivate könnten eine aktive Esterfunktion und eine Disulfidfunktion haben, die durch irgendeinen Abstandshalter getrennt sind.
  • Weitere Mitglieder dieser Gruppen werden in Tabelle 2 gefunden, markiert mit einem "F". Weitere analoge Derivate könnten eine aktive Esterfunktion und eine Thiolfunktion haben, geschützt als ein Tritylderivat, getrennt durch ein Abstandsstück.
  • Beispiel 3
  • Konjugationsreaktionen mit Thio-EPO
  • 1. Reaktion von Thio-EPO mit einer Halogenacetamid-modifizierten SH-reaktiven HES
  • 1.1 Beispielprotokoll 1
  • Konjugation von ThioEPO an Amino-HES12KD (E, H oder I) mit einem Quervernetzer, enthaltend einen NHS-aktiven Ester und eine Jodacetamidgruppe, z.B. SIA.
  • Materialien
    • A. Boratpuffer. Zusammensetzung war 50 mM Natriumborat, pH 8,3, 5 mM EDTA,
    • B. PBS, phosphatgepufferte Salzlösung: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4.
    • C. Amino-Hes12KD E, H oder I. Hergestellt bei 1 mg/mL in Boratpuffer.
    • D. Quervernetzer-Stammlösung: 14 mg SIA wurden in 1 mL DMSO gelöst
    • E. D-SaltTM Dextran Desalting Columns, 2 × 5 mL Bettvolumen (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • F. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • G. ThioEPO-Lösung: 5 mg/mL von ThioEPO 1 in Boratpuffer.
    • H. Mikrokonzentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Deutschland)
  • Verfahren
  • 100 μL SIA-Lösung wurde zu 400 μL der Amino-HES12KD-E-Lösung hinzugefügt und es wurde ihr für 0,5 Stunden bei Raumtemperatur ermöglicht, unter Bewegung zu reagieren. Der überschüssige Quervernetzer wurde durch Zentrifugieren der Probe bei 14.000 × g für 60 Minuten durch Benutzen eines Mikrokonzentrators entfernt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Probe in Boratpuffer auf ihr Originalvolumen gebracht und dieser Prozess wurde weitere zwei Mal wiederholt. Die zurückbleibende Lösung wurde zu 1 mL ThioEPO-Lösung hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktivität des überschüssigen Jodacetamids wurde am Ende der Inkubationszeit durch Hinzufügen von Cystein bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine mit PBS-Puffer equilibrierte Entsalzungssäule aufgetragen und der Proteingehalt der Fraktionen wurde mit einem Commassie Proteinassay-Reagenz beobachtet. Alle Fraktionen, enthaltend das Proteinkonjugat, wurden vereinigt und das Konjugat wurde durch Lyophilisation nach Dialyse gegen Wasser über Nacht erhalten.
  • Alternativen:
  • In dieser Reaktion können alle Quervernetzer verwendet werden, welche eine Succinimid- oder Sulfosuccinimidfunktion haben und eine Jodacetamidfunktion, getrennt durch ein Abstandsstück. Weitere Beispiele werden in Tabelle 2 gefunden. Sie sind markiert mit einem "C" und sind erhältlich von Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland.
  • 1.2 Beispielprotokoll 2
  • Konjugation von ThioEPO 1 an SH-reaktiver HES12KD-Bromessigsäureamid D2, F2 oder Jodacetamid D3.
  • Materialien
    • A. Phosphatpuffer. Verbindung war 100 mM Natriumphosphat, pH 6,1, 5 mM EDTA.
    • B. PBS, phosphatgepufferte Saline: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4.
    • C. SH-reaktives HES12KD-Bromacetamid D2. Hergestellt bei 10 mg/mL in Phosphatpuffer.
    • D. D-SaltTM Dextran Desalting Columns, 2 × 5 mL Bettvolumen (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • E. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • F. ThioEPO-Lösung: 5 mg/mL von ThioEPO 1 in Phosphatpuffer.
  • Verfahren
  • 1 mL SH-reaktive HES12KD-Bromessigsäureamid-D2-Lösung und 1 mL Thio-EPO-Lösung wurden vereinigt und die Reaktionsmischung wurde für 48 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktivität des überschüssigen Bromessigsäureamids wurde am Ende der Inkubationsperiode durch das Hinzufügen von Cystein in einer Endkonzentration von 10 mM gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Entsalzungssäule aufgetragen, equilibriert mit PBS-Puffer. Der Proteingehalt der Fraktionen wurde mit einem Coomassie Proteinassay-Reagenz überwacht, alle Fraktionen, welche das Proteinkonjugat enthielten, wurden vereinigt und das Konjugat wurde durch Lyophilisation nach Über-Nacht-Dialyse gegen Wasser erhalten.
  • Alternativen
  • An Stelle der Isolierung des SH-reaktiven HES12KD-Bromessigsäureamids D2, könnte Amino-HES12KD (E, H, I) mit einem Quervernetzer durch eine Succinimid- und eine Bromacetamidfunktion verbunden werden (siehe 1.1 oben). SBAP ist ein Mitglied dieser Gruppe von Quervernetzern und wird in Tabelle 2 gefunden, markiert mit einem "D".
  • 2. Reaktion von Thio-EPO mit einer maleimidmodifizierten SH-reaktiven HES
  • 2.1 Beispielprotokoll 3
  • Konjugation von ThioEPO mit einem Quervernetzer, enthaltend eine hydrazid- und eine maleimidfunktionelle Gruppe, z.B. M2C2H.
  • Materialien
    • A. M2C2H-Stammlösung: 10 mg/mL M2C2H in DMSO, frisch hergestellt
    • B. HES12KD: 10 mg/mL in 0,1 M Natriumessigsäurepuffer, pH 5,5
    • C. ThioEPO-Lösung: 5 mg/mL von ThioEPO in Phosphat/NaCl-Puffer
    • D. Phosphat/NaCl: 0,1 M Natriumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,0
    • E. Mikrokonzentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Deutschland)
    • F. Gelfiltrationssäule: Z.B. Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm)
    • G. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • H. PBS, phosphatgepufferte Salzlösung: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4.
  • Verfahren
  • M2C2H-Lösung wurde zu 400 μL der HES12KD-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt und es wurde ihr erlaubt, unter Bewegung für 2 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Der überschüssige Quervernetzer wurde entfernt durch Zentrifugieren der Probe bei 14.000 × g für 60 Minuten durch Benutzen eines Mikrokonzentrators. Nach Zentrifugation wurde die Probe in Phosphat/NaCl-Puffer auf ihr Originalvolumen gebracht und dieser Prozess wurde weitere zweimal wiederholt. Zu der M2C2H-modifizierten HES12KD wurden 0,5 mL ThioEPO-Lösung zugefügt und die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktivität des überschüssigen Maleimids wurde am Ende der Inkubationszeit durch das Hinzufügen von Cystein bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm), equilibriert mit PBS-Puffer, aufgetragen und 1 mL Fraktionen wurden gesammelt. Der Proteingehalt der Fraktionen wurde mit einem Coomassie Proteinassay-Reagenz beobachtet. Alle Fraktionen, welche das Proteinkonjugat enthielten, wurden vereinigt und das Konjugat wurde durch Lyophilisierung nach Dialyse über Nacht gegen Wasser erhalten.
  • Verfahrenstechnische Anmerkungen
  • Das Hydrazonaddukt ist etwas weniger stabil bei extremen pH-Werten. Im Anwendungsfall kann das Behandlung bei geringem pH einschließen, wir reduzierten das Hydrazon durch Behandlung mit 30 mM Natriumcyanoborhydrid in PBS-Puffer zu einem Hydrazin. Für die meisten Anwendungsfälle ist dieser Extraschritt unnötig.
  • 2.2 Beispielprotokoll 4
    • Konjugation von ThioEPO an Maleimido-HES12KD B.
  • Materialien
    • A. Maleimido-HES12KD B: 10 mg/mL in 0,1 M Natriumessigsäurepuffer, pH 5,5
    • B. ThioEPO-Lösung: 5 mg/mL von ThioEPO in Phosphat/NaCl-Puffer
    • C. Phosphat/NaCl: 0,1 M Natriumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,0
    • D. Gelfiltrationssäule: z.B. Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm)
    • E. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • F. PBS, phosphatgepufferte Salzlösung: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4.
  • Verfahren
  • 1 mL SH-reaktive HES12KD B-Lösung und 1 mL ThioEPO-1-Lösung wurden vereinigt und die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Reaktivität des überschüssigen Maleimides wurde am Ende der Inkubationszeit durch Hinzufügen von Cystein bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm) gegeben, welche mit PBS-Puffer equilibriert worden war und 1 mL Fraktionen wurden gesammelt. Der Proteingehalt aller Fraktionen wurde mit einem Coomassie Proteinassay-Reagenz überprüft. Alle Fraktionen, welche das Proteinkonjugat enthielten, wurden zusammengefügt und das Konjugat wurde durch Lyophilisierung nach Über-Nacht-Dialyse gegen Wasser erhalten.
  • 2.3 Beispielprotokoll 12
  • Konjugation von ThioEPO an Amino-HES12KD (E, H, I) mit einem Quervernetzer, enthaltend einen NHS-aktiven Ester und eine Maleimidgruppe, z.B. SMCC.
  • Materialien
    • A. Mikrokonzentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Deutschland)
    • B. PBS, phosphatgepufferte Salzlösung: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4.
    • C. Amino-HES12KD E, H oder I. Hergestellt bei 10 mg/mL in PBS-Puffer.
    • D. SMCC-Lösung: 1 mg SMCC wurde in 50 μL DMSO gelöst
    • E. D-SaltTM Dextran Desalting Columns, 2 × 5 mL Bettvolumen (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • F. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • G. ThioEPO-1-Lösung: 5 mg/mL von ThioEPO 1 in PBS-Puffer.
  • Verfahren
  • Zu 50 μL SMCC-Lösung wurden 400 μL der Amino-HES12KD-E-Lösung hinzugefügt und der Reaktionsmischung wurde erlaubt, unter Bewegung für 80 Minuten bei Raumtemperatur und für 10 Minuten bei 46 °C zu reagieren. Der überschüssige Quervernetzer wurde durch Zentrifugation der Reaktionsmischung durch einen Mikrokonzentrator bei 14.000 × g für 60 Minuten entfernt. Das Volumen wurde mit PBS-Puffer auf 450 μL gebracht und dieser Prozess wurde weitere zweimal wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wurde die restliche Lösung mit PBS auf 450 μL gebracht und zu 1 mL von ThioEPO-Lösung hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktivität des überschüssigen Maleimids wurde am Ende der Inkubationszeit durch Hinzufügen von Cystein bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Entsalzungssäule aufgebracht, equilibriert mit PBS-Puffer. Der Proteingehalt der Fraktionen wurde mit einem Coomassie Proteinassay-Reagenz bestimmt, alle Fraktionen, welche das Proteinkonjugat enthielten, wurden zusammengefügt und das Konjugat wurde durch Lyophilisierung nach Über-Nacht-Dialyse gegen Wasser erhalten.
  • Alternativen:
  • Bei dieser Reaktion können alle Quervernetzer verwendet werden, welche eine Succinimid- oder eine Sulfosuccinimidfunktion haben, und eine Maleimidfunktion, getrennt durch ein Abstandsstück. Weitere Beispiele für diese Gruppe von Molekülen, erhältlich von Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland, werden in Tabelle 2 gefunden, markiert mit einem "E". Es gibt eine weitere Gruppe von Quervernetzern, welche an Stelle von Maleimidfunktionen eine aktivierte Disulfidfunktion haben. Diese Quervernetzer könnten auch für die Konjugation benutzt werden. Allerdings ist die Disulfidbrücke des Konjugats unter reduktiven Bedingungen spaltbar. Mitglieder dieser Gruppe sind in Tabelle 2 mit einem "F" markiert. Eine dritte Gruppe von Quervernetzern verwendet an Stelle von einer Maleimidfunktion eine Vinylsulfonfunktion als SH-reaktive Gruppe. Ein Mitglied dieser Gruppe "SVSB" ist in Tabelle 2 mit einem "G" markiert.
  • Beispiel 4
  • Konjugationsreaktionen mit oxidiertem EPO
  • 1. Oxidation von Glyco-EPO
  • 1.1 Oxidation von Glyco-EPO mit Natrium-Metaperjodat: Beispielprotokoll 5
  • Materialien
    • A. Glyco-EPO-Lösung: 10 mg/mL Glyco-EPO in Acetatpuffer
    • B. Natrium-Metaperjodatlösung: 10 mM oder 100 mM Natriumperjodat in Acetatpuffer, frisch hergestellt. Im Dunkeln aufbewahren. Bei Benutzen dieser Lösung ist die Endkonzentration von Natriumperjodat in der Oxidationsmischung 1 mM beziehungsweise 10 mM.
    • C. Acetatpuffer: 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5
    • D. Glycerol
    • E. Mikrokonzentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Deutschland)
  • Verfahren
  • Alle Schritte wurden im Dunkeln ausgeführt.
  • Zu 1 mL kalter Glyco-EPO-Lösung wurde 0,1 mL der kalten Natrium-Metaperjodatlösung hinzugefügt und der Oxidationsreaktion wurde gestattet, für eine Stunde im Dunkeln vorzuschreiten. Wenn das zu oxidierende Glyco-EPO Sialinsäurereste enthielt, dann waren die Oxidationsbedingungen 1 mM Natriumperjodat, 0 °C. Andernfalls wurden 10 mM Natriumperjodat bei Raumtemperatur benutzt. Um die Oxidation zu stoppen, wurde Glycerol bis zu einer Endkonzentration von 15 mM hinzugefügt und für 5 Minuten bei 0 °C inkubiert. Die überschüssigen Reagenzien und Nebenprodukte wurden durch Zentrifugieren des Produktes bei 14.000 × g für 60 Minuten unter Verwendung eines Mikrokonzentrators entfernt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Probe in dem Puffer, welcher für den nächsten Modifizierungsschritt verwendet wurde, z.B. in dem Acetatpuffer, auf ihr Originalvolumen gebracht. Dieser Prozess wurde zwei weitere Male wiederholt.
  • 1.2 Enzymatische Oxidation von Glyco-EPO: Beispielprotokoll 6
  • Die enzymatische Oxidation von EPO ist anderweitig beschrieben (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922).
  • 2. Konjugation mit Hydrazin-/Hydrazid-Derivaten
  • 2.1 Beispielprotokoll 7
    • Konjugation von oxidiertem Glyco-EPO an Thio-HES12KD M, O oder Q mit einem Quervernetzer, enthaltend eine Hydrazid- und eine Maleimid-funktionale Gruppe, z.B. M2C2H (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
  • Materialien
    • A. M2C2H-Stammlösung: 10 mg/mL M2C2H in DMSO, frisch hergestellt
    • B. Oxidierte Glyco-EPO-Lösung aus 6.1.1:5 mg/mL G1yco-EPO in Acetatpuffer
    • C. Thio-HES12KD M, O oder Q: 10 mg/mL in Phosphat/NaCl-Puffer
    • D. Acetatpuffer: 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5
    • E. Phosphat/NaCl: 0,1 M Natriumphosphat, 50 mM NaCl, pH 7,0
    • F. Mikrokonzentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Deutschland)
    • G. Gelfiltrationssäule: z.B. Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm)
    • H. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • I. PBS, phosphatgepufferte Salzlösung: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4
  • Verfahren
  • M2C2H-Stammlösung wurde zu 1 mL oxidiertem Glyco-EPO bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt und es wurde ihr erlaubt, unter Bewegung für 2 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Der überschüssige Quervernetzer wurde für 60 Minuten durch Zentrifugieren der Probe bei 14.000 × g entfernt. Dabei wurde ein Mikrokonzentrator benutzt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Probe mit Phosphat/NaCl-Puffer auf ihr Originalvolumen gebracht und dieser Prozess wurde zwei weitere Male wiederholt. Zu dem M2C2H-modifizierten Glyco-EPO wurde 1 mL Thio-HES12KD M-, O- oder Q-Lösung hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktivität der überschüssigen Maleimide wurde am Ende der Inkubationszeit durch das Hinzufügen von Cystein gequencht. Die Reaktionsmischung wurde auf Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm) gegeben, mit PBS equilibriert, und 1 mL Fraktionen wurden gesammelt. Der Proteingehalt der Fraktionen wurde überwacht durch ein Coomassie Proteinassay-Reagenz, alle Fraktionen, welche das Proteinkonjugat enthielten, wurden zusammengefügt und das Konjugat wurde durch Lyophilisation nach Dialyse über Nacht gegen Wasser erhalten.
  • Verfahrensanmerkungen
  • Das Hydrazonaddukt ist etwas weniger stabil bei extremen pH-Werten. Für Anwendungen, die Behandlung bei geringem pH einschließen können, reduzierten wir das Hydrazon durch Behandlung mit 30 mM Natriumcyanoborhydrid in PBS-Puffer zu einem Hydrazin. Für die meisten Anwendungen war dieser Extraschritt unnötig.
  • 2.2 Beispielprotokoll 8
    • Direkte Konjugation von oxidiertem Glyco-EPO an Hydrazido-HES12KD L oder J
  • Materialien
    • A. Oxidierte Glyco-EPO-Lösung aus 6.1.1:5 mg/mL Glyco-EPO in Acetatpuffer
    • B. Hydrazido-HES12KD L, oder J: 10 mg/mL in Acetatpuffer
    • C. Acetatpuffer: 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5
    • D. Gelfiltrationssäule: Z.B. Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm)
    • E. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • F. PBS, phosphatgepufferte Salzlösung: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4
  • Verfahren
  • 1 mL Hydrazido-HES12KD L- oder J-Lösung und 1 mL oxidierte Glyco-EPO-Lösung wurden vereinigt, und der Reaktionsmischung wurde erlaubt, unter Bewegung für 16 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde auf Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm), equilibriert mit PBS, aufgetragen, und 1 mL Fraktionen wurde gesammelt. Der Proteingehalt der Fraktionen wurde mit einem Coomassie sie Proteinassay-Reagenz beobachtet, alle Fraktionen, enthaltend das Proteinkonjugat wurden zusammengefügt und das Konjugat wurde durch Lyophilisierung nach Über-Nacht-Dialyse gegen Wasser erhalten. Das Resultat der Konjugation ist in 24 gezeigt. Die beobachtete molekulare Veränderung zeigt, dass die Konjugation erfolgreich war. Der Schmier ergibt sich aus der Heterogenität von HES. 25 zeigt, dass HES an einen Kohlenhydratanteil einer Kuhlenhydratseitenkette konjugiert ist.
  • Verfahrensanmerkungen
  • Das Hydrazonaddukt ist etwas weniger stabil bei extremen pH-Werten. Für Anwendungen, die die Behandlung bei geringem pH einschließen können, reduzierten wir das Hydrazon durch Behandlung mit 30 mM Natriumcyanoborohydrid in PBS-Puffer zu einem Hydrazin. Für die meisten Anwendungen war dieser Extraschritt unnötig.
  • 3. Konjugation mit Hydroxylamin-Derivaten
  • 3.1 Beispielprotokoll 9
    • Konjugation von oxidiertem Glyco-EPO an Hydroxylamino-HES12KD K
  • Materialien
    • A. Oxidierte Glyco-EPO-Lösung aus 6.1.1:5 mg/mL Glyco-EPO in Acetatpuffer
    • B. Hydroxylamino-HES12KD K: 10 mg/mL in Acetatpuffer
    • C. Acetatpuffer: 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5
    • D. Gelfiltrationssäule: z.B. Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm)
    • E. Coomassie® Protein Assay Reagent (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland)
    • F. PBS, phosphatgepufferte Salzlösung: 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4
  • Verfahren
  • 1 mL Hydroxylamino-HES12KD K-Lösung und 1 mL oxidierte Glyco-EPO-Lösung wurden vereinigt, und der Reaktionsmischung wurde erlaubt, unter Bewegung für 16 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde auf Sephadex® G-200 (1,5 × 45 cm), equilibriert mit PBS, aufgetragen, und 1 mL Fraktionen wurde gesammelt. Der Proteingehalt der Fraktionen wurde mit einem Coomassie Proteinassay-Reagenz überwacht, alle Fraktionen, enthaltend das Proteinkonjugat wurden zusammengefügt und das Konjugat wurde durch Lyophilisierung nach Dialyse über Nacht gegen Wasser erhalten. Das Resultat der Konjugation ist in 24 gezeigt. Die beobachtete molekulare Veränderung in Spur 2 zeigt, dass die Konjugation erfolgreich war. Der Schmier ergibt sich aus der Heterogenität von HES. 25 zeigt, dass HES an einen Kohlenhydratanteil einer Kohlenhydratseitenkette konjugiert ist.
  • Beispiel 5
  • Charakterisierung von Galactoseoxidase-behandelten EPO-N-Glycanen
  • Rekombinantes EPO oder teilweise desialysierte EPO-Formen (erzeugt durch eingeschränkte milde Säurehydrolyse) wurden mit Galaktoseoxidase in Anwesenheit von Catalase bei 37 °C von 30 min. – 4 Stunden in 0,05 M Na-Phosphatpuffer, pH 7,0, inkubiert. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Entfernen von 50 μg Aliquots des EPO und anschließender Behandlung des Proteins mit Polypeptid-N-Glycanase überwacht.
  • Freigesetzte N-gebundene Oligosaccharide (überwacht durch SDS-PAGE-Detektion der de-N-glycosylierten Polypeptide) wurden vor und nach Entfernen der Sialinsäuren, wie beschrieben, einer HPAEC-PAD-Kartierung unterzogen (Grabenhorst et al., 1999; Nimtz et al., 1993/1994; Schlenke et al., 1999). Quantifizierung von oxidierten Galactoseresten in einzelnen EPO-Oligosacchariden wurde durch die typische Veränderung, beobachtet im HPAEC-PAD, durchgeführt, und ebenso durch MALDI/TOF MS der Oligosaccharid-Mischungen bestätigt.
  • Beispiel 6
  • Charakterisierung von HAS-modifiziertem EPO
  • Abtrennung von HAS-modifizierten EPO-Formen von nicht reagiertem EPO und HAS-Vorläufermolekülen wurde durch Gelfiltration erreicht, indem z.B. Ultrogel AcA 44/54 oder ähnliche Gelfiltrationsmedien benutzt wurden. Alternativ wurde nicht reagierte HAS durch Immunoaffinitätsisolierung auf einer 4 mL-Säule, enthaltend einen monoklonalen Antikörper, gekoppelt an Affigel (BioRad) und anschließende Abtrennung von unmodifiziertem EPO durch Gelfiltration (z.B. indem eine Matrix, welche die Abtrennung von globulären Proteinen einer relativen molekularen Masse zwischen 20 kDa und 200 kDa ermöglicht, benutzt wurde) von EPO entfernt.
  • HAS-modifizierte EPOs wurden durch SDS-PAGE-Analyse (indem 12,5 oder 10%ige Acrylamidgele benutzt wurden) durch Detektion ihres höheren Molekulargewichs im Vergleich mit unmodifiziertem EPO beim Färben von Gelen mit Coomassie Brilliant Blue identifiziert. Das höhere Molekulargewicht von HAS-modifizierten EPO-Polypeptiden wurde ebenso durch Western-Blot-Analyse von Proben identifiziert, indem ein polyklonaler Antikörper, erzeugt gegen rekombinantes menschliches EPO, benutzt wurde.
  • N-Glycanmodifikation von EPO-Formen wurde durch ihre erfolgreiche Entfernung vom EPO-Protein mit Polypeptid-N-Glycanase gezeigt (rekombinante N-Glycosidase von Roche, Deutschland, indem 25 Einheiten/mg EPO-Protein bei 37 °C für 16 Stunden angewandt wurden); Analyse durch SDS-PAGE ergab eine typische Veränderung des EPO-Proteins zu einer Änderungsposition des N-Glycosidase-behandelten unmodifizierten EPO von ungefähr 20 kDa.
  • Modifizierung des einzelnen desialysierten und Galaktoseoxidase-behandelten EPO-O-Glycans bei Ser 126 wurde durch SDS-PAGE-Wanderung des de-N-glycosylierten Produktes durch Detektion seiner Wanderungsposition, verglichen mit dem nicht reagierten de-N-glycosylierten EPO gezeigt. Bei Bedarf wurde modifiziertes EPO vor der SDS-PAGE-Analyse durch RP-HPLC auf eine C8-Phase fraktioniert.HAS-O-Glycanmodifikation von EPO wurde ebenso durch β-Elimination des O-Glycans und Detektion des de-O-glycosylierten der de-O-glycosylierten Form von EPO im Western Blot analysiert, indem ein polyklonaler Antikörper, erzeugt gegen rekombinantes menschliches EPO, benutzt wurde.
  • Beispiel 7
  • Quantifizierung von EPO und modifizierten EPO-Formen
  • EPO-Formen wurden durch UV-Messungen, wie beschrieben in Ph.Eur (2000, Erythropoietini solutio concentrata, 1316, 708-785) quantifiziert und mit dem internationalen BRP-Referenz-EPO-Standard verglichen. Alternativ wurden EPO-Konzentrationen durch einen RP-HPLC-Assay bestimmt, indem eine RP-C4-Säule und Absorption bei 254 nm verwendet wurde. Für die Kalibrierung wurden 20, 40, 80 und 120 μg des BRP-Standard-EPO-Referenzansatzes verwendet.
  • Beispiel 8
  • In-vitro-biologische Aktivität von HES-modifiziertem rekombinantem menschlichem EPO:
  • Gereinigtes HES-modifiziertes EPO wurde auf Aktivität getestet, indem der Erythropoietin-Bioaktivitätsassay, wie bei Krystal beschrieben [Krystal, 1984, Exp. Heamatol., 649-660], benutzt wurde. Anämie wurde in NMRI-Mäusen durch Behandlung mit Phenylhydrazin-Hydrochlorid induziert und Milzzellen wurden gesammelt und benutzt, wie beschrieben in [Fibi et al., 1991, Blood, 77, 1203 ff.]. Verdünnungen von EPO wurden inkubiert mit 3 × 105 Zellen/Vertiefung (Well) in 96-Well-Mikrotiterplatten. Nach 24 Stunden bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre (5% CO2) wurden die Zellen für 4 Stunden mit 1 μCi auf 3H-Thymidin pro Well markiert. Inkorporierte Radioaktivität wurde durch Flüssig-Scintillationsmessung bestimmt. Der internationale Referenz-EPO-Standard (BRP-Standard) wurde zum Vergleich benützt.
  • Alternativ wurde die EPO-Bioaktivität durch einen In-vitro-Assay gemessen, welcher die EPO-sensitive Zelllinie TF-1 benützt (Kitamura et al., [J. cell Phys., 140. 323-334]. Exponentiell wachsende Zellen wurden von Wachstumsfaktoren freigewaschen und in der Anwesenheit von Verdünnungsreihen des EPO für weitere 48 Stunden inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde, wie bei Mosmann [Mosman, 1983, J. Immunol. Methods, 65, 55-63] beschrieben, durch Benutzen des MTT-Reduktionsassays berechnet.
  • Beispiel 9
  • In-vivo-Aktivitätsbestimmung von EPO- und HAS-modifizierten EPO-Formen:
  • In-vivo-Aktivitätsbestimmungen wurden an normocythemischen Mäusen durch Messung des Anstiegs von Reticulozyten nach 4 Tagen, nachdem die Tiere die vorgesehene Dosis EPO oder modifizierte EPO-Formen erhalten hatten, durchgeführt. Die Assays wurden durchgeführt, indem der BRP-EPO-Standard benutzt wurde, welcher im polycythemischen Mausassay gegen den WHO-EPO-Standard kalibriert wurde. EPO-Proben wurden in phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin (Sigma), verdünnt.
  • 0,5 ml der EPO-Testlösung in Dulbeccos gepufferter Salzlösung (übereinstimmend mit einem EPO-Proteinäquivalent von 100, 80, 40 oder 20 IU/ml des BRP-Standard-EPO) wurden pro Tier subkutan infiziert. Blutproben wurden 4 Tage nach der Injektion genommen und Reticulocyten wurden mit Acridin-Orange gefärbt; Quantifizierung von Reticulocyten wurde durch Durchflusscytometrie durchgeführt, indem insgesamt 30.000 Blutzellen innerhalb von 5 Stunden nachdem die Blutprobe entnommen wurde, gezählt wurden (siehe Ph. Eur, 2000, Eurythropoietini solutio concentrata, 1316, Seiten 780-785) und European Pharmacopoeia (1996/2000, attachment 2002).
  • Beispiel 10
  • In-vivo-Halbwertszeitbestimmungen
  • Kaninchen wurden vorgegebene Mengen unmodifizierte oder HAS-modifizierte EPO-Formen intravenös injiziert. Blutproben wurden zu vorgegebenen Zeiten genommen und Serum wurde hergestellt. Serum-Erythropoietin-Level wurden durch einen In-vitro-Bioassay oder durch einen EPO-spezifischen gewerblichen ELISA bestimmt.
  • Beispiel 11
  • In-vivo-Pharmakokinetiken
  • In Mäusen: Jedes Tier bekam 300 IU EPO/kg subkutan. Sieben Tage nach der Nachbehandlung wurde der Hämatokrit von jedem Tier bestimmt. Ein erheblicher Anstieg des Hämatokrits wurde in allen mit modifiziertem EPO behandelten Tieren beobachtet, ein erwartetes Ergebnis im Hinblick auf die relativ kurze Halbwertszeit von unbehandeltem EPO. Die mittlere Veränderung des Hämatokrits der mit modifiziertem EPO behandelten Gruppe war signifikant unterschiedlich von dem der mit unbehandelten EPO behandelten Gruppe und dem der Kontrollgruppe.
  • In Kaninchen: Kaninchen wurden behandelt mit einer einzigen Dosis unmodifiziertem oder HAS-modifiziertem EPO, entsprechend 200 oder bis zu 800 ng/kg Körpergewicht. Nach 2, 6, 16, 24 und 48 Stunden wurden Blutproben analysiert, indem ein handelsüblicher EPO-spezifischer ELISA zur Bestimmung von Plasmakonzentrationen benutzt wurde. Mittlere Plasma-EPO-Konzentrationen wurden bestimmt und die durchschnittlichen anfänglichen Halbwertszeiten (α-Phase) und die terminalen Halbwertszeiten (β-Phase) wurden aus den ELISA-Werten berechnet, wie beschrieben: (Zettlmissl et al., 1989, J. Biol. Chem., 264, 21153-21159).
  • Literatur:
    • Sytkowski, Lunn, Risinger, and Davis, 1999, An Erythropoietin Fusion Protein Comprised of Identical Repeating Domains Exhibitis Enhanced Biological Properites, J. Biol. Chem., 274, 24773-24778.
  • Beispiel 12
  • Abschätzung von in-vitro-biologischer Aktivität von HES-modifizierem rekombinantem menschlichen IL2
  • Modifiziertes IL2 wurde durch Gelfiltration auf Ultrogel AcA 54 zurückgewonnen. Aliquots entsprechender Fraktionen wurden sterilfiltriert und die IL2-Bioaktivität wurde bestimmt, indem die IL2-abhängige Maus-CTLL-2-Zelllinie benutzt wurde [Gillis, Ferm, On, and Smith, 1978, J. Immunol., 120, 2027-2032]. Die Aktivität war ähnlich/wurde in Bezug gesetzt (was related to) zu dem internationalen Referenz-IL2-Standardansatz. Beispiel 13 Bildung von Hydroxyethylstärkederivaten durch reduktive Aminierung des nicht-oxidierten reduzierenden Endes Beispiel 13.1 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,3-Diamino-2-hydroxypropan
    Figure 00600001
    • a) Zu einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1,3-Diamino-2-hydroxypropan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 hinzugefügt. Die entstehende Mischung wurde bei 80 °C über 17 h inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
    • b) Die Inkubation der Mischung, welche durch Hinzufügen von 0,83 mmol 1,3-Diamino-2-hydroxypropan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 zu der Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke entstand, war ebenso möglich und wurde bei 25 °C für 3 Tage durchgeführt.
    Beispiel 13.2 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan
    Figure 00610001
    • a) Zu einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 hinzugefügt. Die entstehende Mischung wurde für 17 h bei 80 °C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das Präzipitat wurde gesammelt durch Zentrifugation und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Die Reaktion von 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan mit HES wurde indirekt durch Quantifikation von Formaldehyd, entstehend aus der oxidativen Spaltung von dem 1,2-Diol in dem Reaktionsprodukt durch Periodat, wie beschrieben in G. Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983) 449-504, bestätigt.
    • b) Die Inkubation der Mischung, entstehend aus dem Hinzufügen von 0,83 mmol 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 zu der Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke, war ebenso möglich und wurde bei 25 °C für 3 Tage durchgeführt.
    Beispiel 13.3 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,4-Diaminobutan
    Figure 00620001
    • a) Zu einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1,4-Diaminobutan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 hinzugefügt. Die entstehende Mischung wurde für 17 h bei 80 °C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
    • b) Die Inkubation der Mischung, entstehend aus dem Hinzufügen von 0,83 mmol 1,4-Diaminobutan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 zu der Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke, war auch möglich und wurde bei 25 °C für 3 Tage durchgeführt.
    Beispiel 13.4 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1-Mercapto-2-aminoethan
    Figure 00620002
    • a) Zu einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1-Mercapto-2-aminoethan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 hinzugefügt. Die entstehende Mischung wurde für 17 h bei 80 °C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
    • b) Die Inkubation der Mischung, entstehend durch Hinzufügen von 0,83 mmol 1-Mercapto-2-aminoethan und 50 mg Natriumcyanborhydrat NaCNBH3 zu der Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke, war ebenso möglich und wurde bei 25 °C für 3 Tage durchgeführt.
    Beispiel 14 Bildung von Hydroxyethylstärkederivaten durch Konjugation mit dem nicht-oxidierten reduzierenden Ende Beispiel 14.1 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit Carbohydrazid
    Figure 00630001
  • 0,96 g von HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1-M-Natriumacetatpuffer, pH 5,2, gelöst und 8 mmol Carbohydrazid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) wurden hinzugefügt. Nach Rühren für 18 h bei 25 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 3 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Beispiel 14.2 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit adepischen Dihydrazid
    Figure 00630002
  • 0,96 g von HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1-M-Natriumacetatpuffer, pH 5,2, gelöst und 8 mmol adepisches Dihydrazid (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) wurde hinzugefügt. Nach Rühren für 18 h bei 25 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 3 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Beispiel 14.3 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,4-Phenylen-bis-3-thiosemicarbazid
    Figure 00630003
  • 0,96 g von HES 18/0,4 (Molekulargewicht = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1-M-Natriumacetatpuffer, pH 5,2, gelöst und 8 mmol 1,4-Phenylen-bis-3-thiosemicarbazid (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) wurden hinzugefügt. Nach Rühren für 18 h bei 25 °C wurden 8 ml Wasser zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und die Suspension wurde für 15 Minuten bei 4.500 rpm zentrifugiert. Der klare Überstand wurde dekanntiert und anschließend zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 40 ml Wasser wieder gelöst und für 15 Minuten bei 4.500 rpm zentrifugiert. Der klare Überstand wurde für 3 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Beispiel 14.4: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin
    Figure 00640001
  • O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin wurde, wie in Botyrin et al. Tetrahedon 53 (1997), S. 5485-5492 beschrieben, in 2 Schritten aus handelsüblichen Materialien synthetisiert.
  • 0,96 g von HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1-M-Natriumacetatpuffer, pH 5,2, gelöst und 8 mmol O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin wurden hinzugefügt. Nach Rühren für 18 h bei 25 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wassser gelöst und für 3 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D). Beispiel 15 Bildung von Hydroxyethylstärkederivaten durch Reaktion mit dem oxidierten reduzierenden Ende Beispiel 15.1 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit Carbohydrazid
    Figure 00640002
  • 0,12 mmol Oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS = 0,4, hergestellt nach DE 196 28 705 A1 ), wurden in 3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und unter Stickstoff tropfenweise zu einer Mischung von 15 mmol Carbohydrazid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 88 h bei 65 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Beispiel 15.2 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,4-Phenylen-bis-3-thiosemicarbazid
    Figure 00650001
  • 0,12 mmol Oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS = 0,4, hergestellt nach DE 196 28 705 A1 ) wurden in 3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und unter Stickstoff tropfenweise zu einer Mischung von 15 mmol 1,4-Phenylen-bis-3-thiosemicarbazid (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 88 h bei 65 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer kalten 1:1-Mischung von Aceton und Ethanol (v/v) hinzugefügt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
  • Beispiel 15.3 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit Hydrazin
    • H2N-NH2
  • 1,44 g (0,12 mmol) von Oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS = 0,4, hergestellt nach DE 196 28 705 A1 ), wurden in 3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und tropfenweise unter Stickstoff zu einer Mischung von 0,47 ml (15 mmol) Hydrazin in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 19 h bei 40 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton (v/v) hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 2 Tage gegen eine 0,5%ige (v/v) Triethylamin-in-Wasser-Lösung und für 2 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert. Beispiel 15.4 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit Hydroxylamin
    Figure 00660001
  • O-[2-(2-Aminooxy-ethoxy)-ethyl]-hydroxylamin wurde, wie beschrieben durch Boturyn et al in 2 Schritten aus handelsüblichen Materialien synthetisiert (Boturyn, Boudali, Constant, Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485).
  • 1,44 g (0,12 mmol) Oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS = 0,4, hergestellt nach DE 196 28 705 A1 ) wurden in 3 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und unter Stickstoff tropfenweise zu einer Mischung von 2,04 g (15 mmol) O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 48 h bei 65 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton (v/v) hinzugefügt. Das präzipitierte Produkt wurde gesammelt durch Zentrifugation, wieder in 40 ml Wasser gelöst und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert. Beispiel 15.5 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit adepischen Dihydraziden
    Figure 00660002
  • 1,74 g (15 mmol) adepisches Dihydrazid wurden in 20 ml absolutem Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 65 °C gelöst und 1,44 g (0,12 mmol) Oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS = 0,4, hergestellt nach DE 196 28 705 A1 ), gelöst in 3 ml absolutem DMSO, wurden tropfenweise unter Stickstoff hinzugefügt. Nach Rühren für 68 h bei 60 °C wurde die Reaktionsmischung zu 200 ml Wasser hinzugefügt. Die Lösung, enthaltend das Reaktionsprodukt, wurde für 2 Tage gegen eine 0,5%ige (v/v) Triethylamin-in-Wasser-Lösung und für 2 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5 KD Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutscland) und lyophilisiert. Beispiel 15.6 Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,4-Diaminobutan
    Figure 00670001
  • 1,44 g (0,12 mmol) Oxo-HES 10/0,4 (MW = 10.000 D, DS = 0,4, hergestellt nach DE 196 28 705 A1 ) wurden in 3 ml trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und unter Stickstoff tropfenweise zu einer Mischung von 1,51 ml (15 mmol) 1,4-Diaminobutan in 15 ml DMSO hinzugefügt. Nach Rühren für 19 h bei 40 °C wurde die Reaktionsmischung zu 160 ml einer 1:1-Mischung von Ethanol und Aceton (v/v) hinzugefügt. Das präzipitierte Amino-HES10KD/0,4 wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 40 ml Wasser wieder gelöst und für 4 Tage gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Deutschland) und lyophilisiert.
  • Beispiel 16 Oxidation von Erythropoietin
  • Oxidiertes Erythropoietin wurde, wie in Beispiel 20 beschrieben, hergestellt. Als oxidiertes Erythropoietin wurde EPO-GT-1-A, wie in Beispiel 20.11(c) beschrieben, verwendet (EPO-GT-1 ohne Säurehydrolyse, behandelt mit milder Perjodatoxidation).
  • Beispiel 17 Konjugation von Hydroxyethylstärkederivaten mit oxidiertem Erythropoietin aus Beispiel 4
  • Beispiel 17.1 Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 14.1
  • Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde mit 5 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2, auf einen pH-Wert von 5,3 eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung des HES-Derivats, wie nach Beispiel 14.1 hergestellt (MW 18 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2), hinzugefügt und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) analysiert, wie in den Anweisungen welche durch Invitrogen gegeben wurden, beschrieben. Das Gel ist mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) über Nacht gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 3 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation wird angezeigt durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die anwachsende Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 17.2 Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 14.3
  • Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde mit 5 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2, auf pH 5,3 eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung des HES-Derivates, wie nach Beispiel 14.3 hergestellt (MW 18 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2), hinzugefügt und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den Instruktionen durch Invitrogen beschrieben, analysiert.
  • Beispiel 17.3 Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 14.4
  • Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde mit 5 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2, auf pH 5,3 eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung der HES-Derivate, wie nach Beispiel 14.4 hergestellt (MW 18 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2), hinzugefügt und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10 Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den Instruktionen durch Invitrogen beschrieben, analysiert. Das Gel ist mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) über Nacht gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 4 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist angezeigt durch die Wanderung der Proteinbanden zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl von an das Protein gebundenen HES-Derivaten.
  • Beispiel 17.4 Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.1
  • Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde auf pH 5,3 mit 5 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2, eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung der HES-Derivate, wie nach Beispiel 15.1 hergestellt (MW 10 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2), hinzugefügt und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den Instruktionen durch Invitrogen beschrieben, analysiert. Das Gel wird mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) über Nacht gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 5 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 17.5 Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.2
  • Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde mit 5 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2, auf pH 5,3 eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung des HES-Derivates, wie nach Beispiel 15.1 hergestellt (MW 10 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,2), hinzugefügt und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wird mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) über Nacht gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 5 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 18 Bildung von Thio-EPO durch Reduktion von Erythropoietin
  • 241,5 μg Erythropoietin (EPO-GT-1, siehe Beispiel 20) in 500 μl eines 0,1-molaren Natriumboratpuffers, 5 mM EDTA, 10 mM DTT (Lancaster, Morcambe, UK), pH 8,3, wurden für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Das DTT wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 10 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), bei 13.000 rpm entfernt, anschließend 3 Mal Waschen mit dem Boratpuffer und 2 Mal mit einem Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2)
  • Beispiel 19 Konjugation von Hydroxyethylstärkederivaten mit Thioerythropoietin, bei der eine Quervernetzungsverbindung verwendet wird
  • In den folgenden Beispielen wurde N-(alpha-Maleimidoacetoxy)succinimidester (AMAS)
    Figure 00700001
    als Quervernetzungsverbindung verwendet.
  • Beispiel 19.1 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 14.1 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, wie nach Beispiel 14.1 hergestellt, und in 200 μl eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt. Die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und für 20 min. bei 40 °C inkubiert. Verbleibende AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) bei 13.000 rpm entfernt, 4 Mal und 30 min. mit dem Phosphatpuffer waschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA), wie in den von Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wird über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 6 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.2 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 14.2 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, wie nach Beispiel 14.2 produziert, und in 200 μl eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt. Die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und für 20 min. bei 40 °C inkubiert. Verbleibende AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN- 0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) bei 13.000 rpm entfernt, 4 Mal und 30 min. mit dem Phosphatpuffer waschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 7 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten gekennzeichnet. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.3 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 14.3 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, wie nach Beispiel 14.3 hergestellt, und in 200 μl eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt. Die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Verbleibende AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) bei 13.000 rpm entfernt, 4 Mal und 30 min. mit dem Phosphatpuffer waschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Instruktionen beschrieben, analysiert. Das Gel wird über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 7 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten gekennzeichnet. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.4 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 14.4 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, wie nach Beispiel 14.4 hergestellt, und in 200 μl eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt. Die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und für 20 min. bei 40 °C inkubiert. Verbleibende AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) bei 13.000 rpm entfernt, 4 Mal und 30 min. mit dem Phosphatpuffer waschen.
  • Zu der restlichen Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 6 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.5 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 13.1 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, wie nach Beispiel 13.1 hergestellt, und in 200 μl eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden unter Inkubationsbedingungen von 80 °C und 17 h sowie von 25 °C und 3 Tagen 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt. Die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Verbleibende AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) bei 13.000 rpm entfernt, 4 Mal und 30 min. mit dem Phosphatpuffer waschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA), wie in den durch Invitro gen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 7 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.6 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 13.3 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, wie nach Beispiel 13.3 hergestellt, bei Inkubationsbedingungen von 80 °C und 17 h sowie von 25 °C und 3 Tagen, und gelöst in 200 μl eines 0,1-molaren Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), wurden 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt. Die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Verbleibende AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) bei 13.000 rpm entfernt, 4 Mal und 30 min. mit dem Phosphatpuffer waschen.
  • Zu der restlichen Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wird über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 7 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.7 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.1 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, wie nach Beispiel 15.1 hergestellt, und in 200 μl Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt, und die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Die AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Deutschland) bei 13.000 rpm entfernt und 4 Mal für 30 min. mit dem Phosphatpuffer gewaschen
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 8 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.8 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.2 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, hergestellt wie nach Beispiel 15.2, und in 200 μl Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt, und die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und für 20 min. bei 40 °C inkubiert. Die AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Deutschland) bei 13.000 rpm entfernt und 4 Mal für 30 min. mit dem Phosphatpuffer gewaschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 8 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.9 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.3 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, hergestellt nach Beispiel 15.3, und in 200 μl Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt, und die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Die AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Deutschland) bei 13.000 rpm abgetrennt und 4 Mal für 30 min. mit dem Phosphatpuffer gewaschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 8 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.10 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.4 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, hergestellt nach Beispiel 15.4, und in 200 μl Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt, und die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Die AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Deutschland) bei 13.000 rpm entfernt und 4 Mal für 30 min. mit dem Phosphatpuffer gewaschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 8 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.11 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.5 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, hergestellt nach Beispiel 15.5, und in 200 μl Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt, und die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Die AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Deutschland) bei 13.000 rpm entfernt und 4 Mal für 30 min. mit dem Phosphatpuffer gewaschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wurde über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 8 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 19.12 Reaktion von Thioerythropoietin mit dem Reaktionsprodukt von Beispiel 15.6 und der Quervernetzungsverbindung
  • Zu 50 nmol HES-Derivat, hergestellt nach Beispiel 15.6, und in 200 μl Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) gelöst, wurden 10 μl einer 2,5 μmol AMAS-Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO hinzugefügt, und die klare Lösung wurde für 80 min. bei 25 °C und 20 min. bei 40 °C inkubiert. Die AMAS wurde durch zentrifugale Filtration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Deutschland) bei 13.000 rpm entfernt und 4 Mal für 30 min. mit dem Phosphatpuffer gewaschen.
  • Zu der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, wie nach Beispiel 18 hergestellt (1 μg/μl in Phosphatpuffer), hinzugefügt, und die Mischung wurde für 16 h bei 25 °C inkubiert. Nach Lyophilisierung wurde das Rohprodukt durch SDS-Page mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), wie in den durch Invitrogen gegebenen Anweisungen beschrieben, analysiert. Das Gel wird über Nacht mit Roti-Blue Coomassie Färberegenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
  • Das experimentelle Ergebnis ist in 8 gezeigt. Eine erfolgreiche Konjugation ist gekennzeichnet durch die Wanderung der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten. Die vergrößerte Bandenbreite beruht auf der Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate und der Anzahl der an das Protein gebundenen HES-Derivate.
  • Beispiel 20 Präparative Herstellung von HES-EPO-Konjugaten
  • Zusammenfassung
  • HES-EPO-Konjugate wurden synthetisiert durch Koppeln von HES-Derivaten (durchschnittliches MW von 18.000 Dalton; Hydroxyethyl-Substitutionsgrad von 0,4) an die teilweise (mildes Perjodat) oxidierten Sialinsäurereste an den Oligosaccharidketten des rekombinanten menschlichen EPO. Basierend auf Kohlenhydrat-Strukturanalyse beeinflussten die eingefügten Modifikationen die strukturelle Integrität der Kernoligosaccharidketten nicht, da MALDI/TOF-MS der mild säurebehandelten HES-modifizierten Glycane intakte neutrale N-acetyllactosaminartige Ketten zeigte, welche von denen im unmodifizierten EPO-Produkt beobachteten nicht zu unterscheiden waren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass zumindest 3 modifizierte HES-Reste pro EPO-Molekül angefügt sind, im Fall des EPO-Ansatzes, welcher der Modifizierung unterzogen wurde, ohne vorherige partielle Sialinsäureentfernung. Eine EPO-Variante, der ungefähr 50% der Sialinsäurereste des früheren Proteins fehlten, zeigte eine offenbar ähnlich hohe Molekulargewichtsmobilität im SDS-PAGE (60-110 KDa gegen 40 KDa für den BRP-EPO-Standard). Das HES-modifizierte EPO ist stabil unter Standard-Ionenaustauschchromatographie-Bedingungen bei Raumtemperatur bei pH 3–10.
  • Der EPO-Bioassay in dem normocythaemischen Maussystem zeigt, dass das HES-modifizierte EPO eine 2,5–3,0-fach höhere spezifische Aktivität (IU/mg) in diesem Assay hat im Vergleich zum internationalen BRP-EPO-Referenzstandard, basierend auf Proteinbestimmung, welche den UV-Absorptionswert des Europäischen Arzneibuchs (European Pharmacopeia) und eine RP-HPLC-EPO-Proteinbestimmungsmethode, kalibriert gegen den BRP-Standardansatz, benutzt.
  • Beispiel 20.1 Materialien und Methoden
  • (a) Freisetzung von N-gebundenen Oligosacchariden durch Verdau mit N-Glycosidase
  • Die Proben wurden mit 25 Units (Einheiten) (nach Angebe des Herstellers, Roche Diagnostics, Deutschland) rekombinanter PNGase F über Nacht bei 37 °C inkubiert. Der vollständige Verdau wurde durch die spezifische Mobilitätsveränderung des Proteins im SDS-PAGE überwacht. Die freigesetzten N-Glycane wurden von dem Polypeptid durch Hinzufügen von 3 Volumen kaltem 100%igem Ethanol und Inkubation bei –20 °C für mindestens 2 Stunden abgetrennt (Schroeter S et al., 1999). Das präzipititerte Protein wurde durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 4 °C und 13.000 rpm entfernt. Das Pellet wurde dann zwei weiteren Waschschritten mit 500 μl eiskaltem 75%igem Ethanol unterzogen. Die Oligosaccharide in den vereinigten Überständen wurden in einer Vakuumzentrifuge (Speed Vac concentrator, Savant Instruments Inc., USA) getrocknet. Die Glycanproben wurden entsalzen durch Benutzen von Hypercarb Cartridges (25 mg oder 100 mg HyperCarb) vor Gebrauch wie folgt: Die Säulen wurden mit 3 × 500 μl 80%igem Acetonitril (v/v) in 0,1% TFA gewaschen, gefolgt durch Waschschritte mit 3 × 500 μl Wasser. Die Proben wurden mit Wasser zu einem Endvolumen von 300 μl-600μl verdünnt, bevor sie auf die Cartridge geladen wurden, welche dann drastisch mit Wasser gewaschen wurde. Die Oligosaccharide wurden mit 1,2 ml (25 mg Cartridges; 1,8 ml im Fall von 100 mg Cartridges) 25%igem Acetonitril in Wasser, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure (v/v) eluiert. Die eluierten Oligosaccharide wurden mit 2 M NH4OH neutralisiert und in einem Speed Vac concentrator getrocknet. In einigen Fällen wurde das Entsalzen der N-Glycosidase-freigesetzten Oligosaccharide durch Absorption der Verdaumischung aus Proben < 100 μg Gesamt-(Glyco)Protein auf 100 mg Hypercarb Cartridges durchgeführt.
  • (b) Analyse von Oligosacchariden durch „matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI/TOF/TOF-MS)
  • Ein Bruker ULTRAFLEX-time-of-flight-(TOF/TOF)-Instrument wurde verwendet: Natürliche desialysierte Oligosaccharide wurden analysiert, indem 2,5-Dihydroxybenzoesäure als UV-absorbierendes Material, sowohl im positiven, als auch im negativen Ionenmodus verwendet wurde wobei in beiden Fällen das Reflektron benutzt wurde. Für die MS-MS-Analysen wurden ausgewählte Elternionen Laser Induced Dissociation (LID) unterzogen und die resultierenden Fragmentationen wurden durch die zweite TOF-Stufe (LIFT) des Instrumentes getrennt. Probenlösungen von 1 μl und einer ungefähren Konzentration von 1–10·pmol μl–1 wurden mit gleichen Mengen der entsprechenden Matrix gemischt. Diese Mischung wurde auf ein Edelstahltarget platziert und vor der Analsye bei Raumtemperatur getrocknet.
  • Beispiel 20.2 Herstellung und Charakterisierung von rekombinantem menschlichen EPO (EPO-GT-1)
  • EPO wurde, wie beschrieben, von rekombinanten CHO-Zellen exprimiert (Mueller PP et al., 1999, Dorner AJ et al., 1984) und die Ansätze wurden nach Verfahren, beschrieben in der Eur. Phar. (Ph. Eur. 4, Monography 01/2002:1316: Erythropoietin concentrated solution), charakterisiert. Das Endprodukt hatte einen Sialinsäuregehalt von 12 nMol (+/– 1,5 nMol) per nMol Protein. Die Strukturen von N-gebundenen Oligisacchariden wurden durch HPAEC-PAD und MALDI/TOF-MS bestimmt, wie beschrieben (Nimtz et al., 1999, Grabenhorst, 1999). Die erhaltenen EPO-Ansätze enthielten di-, tri- und tetrasialysierte Oligosaccharide (jeweils 2–12%, 15–28% und 60–80%, sulfatisierte und pentasialysierte Ketten waren in geringen Mengen vorhanden). Die allgemeinen Glycosylierungscharakteristika der EPO-Ansätze waren ähnlich zu denen der internationalen BRP-Standardansätze.
  • Das isoelektrische Fokussierungsmuster des rekombinanten EPO war vergleichbar zu dem des internationalen BRP-Referenz-EPO-Standardansatzes, welcher die entsprechenden Isoformen zeigt. 25% des EPO-Proteins mangelte es an der O-Glycosylierung des Ser126 der Polypeptidkette.
  • Beispiel 8.3 Herstellung von teildesialysierten EPO-Formen
  • EPO-GT-1-Protein (2,84 mg/ml) wurde auf 80 °C in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,0, erhitzt und dann 100 μl 1 N H2SO4 pro 1 ml der EPO-Lösung hinzugefügt; die Inkubation wurde für jeweils 5 min., 10 min. und 60 min. fortgesetzt, was EPO-Ansätze mit unterschiedlichem Grad der Sialysierung ergab. Die Quantifizierung von Oligosacchariden mit 0–4 Sialinsäuren wurde nach Freisetzung von Oligosacchariden mit Polypeptid N-Glycosidase durchgeführt und die Isolierung von N-gebundenen Ketten wurde durchgeführt durch Entsalzen unter Verwendung von Hypercarb Cartridges (25 mg HyperSep Hypercarb; Thermo-Hypersil-Keystone, UK). Die EPO-Ansätze wurden neutralisiert durch Hinzufügen von 1 N NaOH und wurden in flüssigem N2 gefroren und wurden bei –20 °C bis zum weiteren Gebrauch gelagert.
  • Beispiel 20.4 Perjodatoxidation von sialysierten EPO-Formen
  • Zu 10 mg unbehandeltem oder mit milder Säure behandeltem EPO, gelöst in 3,5 ml 20-millimolarem Na-Phosphatpuffer, pH 7,0, wurden 1,5 ml 0,1-molarer Na-Acetatpuffer, pH 5,5, hinzugefügt und die Mischung wurde auf 0 °C in einem Eisbad abgekühlt; 500 μl 10-millimolares Na-Perjodat wurden hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde für 60 min. bei 0 °C im Dunkeln gehalten. Dann wurden 10 μl Glycerol hinzugefügt und die Inkubation wurde für weitere 10 min. im Dunkeln fortgesetzt. Die teilweise oxidierten EPO-Formen wurden von den Reagenzien durch Entsalzen getrennt, indem VIVASPIN Konzentratoren (10.000 MWCO, PES Viviscience AG, Hannover, Deutschland), nach den Empfehlungen des Herstellers bei 3.000 rpm in einer Laborzentrifuge, ausgerüstet mit einem Fixed Angel Rotor benutzt wurden. Nach Erstarren in flüssigem Stickstoff wurden die EPO-Ansätze in einem Endvolumen von 4 ml bei –20 °C aufbewahrt.
  • 100 μg Aliquots der teilweise oxidierten EPO-Ansätze wurden einer N-Glycosidasebehandlung unterzogen und die Oligosaccharide wurden isoliert, indem Hypercarb Cartridges, wie beschrieben, benutzt wurden. Oligosaccharide wurden durch milde Säurebehandlung desialysiert und durch HPAEC-PAD analysiert und ihre Retentionszeiten wurden mit denen von authentischen Standardoligosacchariden, wie beschrieben, verglichen (Nimtz et al., 1990 und 1993).
  • Beispiel 20.5 Reduktion von EPO-Disulfiden mit Dithiothreitol
  • 5 mg EPO-GT-1 wurden in 5 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 8,1, in Anwesenheit von 30 mM Dithiotreitol (DTT) bei 37 °C für 60 Minuten inkubiert; Entfernen von DTT wurde durch Benutzen eines Vivaspin Konzentrators bei 4 °C, mit 4 Zyklen pro Pufferwechsel erreicht. Der endgültig reduzierte EPO-Ansatz wurde in flüssigem Stickstoff gef roren und bei –20 °C in 50 mM Na-Acetatpuffer, pH 5,5, aufbewahrt.
  • Beispiel 20.6 EPO-Proteinbestimmung
  • Quantitative Bestimmung von EPO-Proteinen wurde durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm nach der Eur. Phar. (European Pharmacoeia 4, Monography 01/2002: 1316: erythropoietin concentrated solution) in einer Küvette mit 1 cm Weglänge durchgeführt. Zudem wurde EPO durch Anwenden eines RP-HPLC-Verfahrens unter Benutzung einer RP-C4-Säule (Vydac Protein C4, Cat.# 214TP5410, Grace Vydac, CA, US) quantifiziert; das HPLC-Verfahren wurde kalibriert, indem der Erythropoietin-BRP-1-Referenzstandard verwendet wurde (European Pharmacopeia, Conseil de I'Europe B.P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1).
  • Beispiel 20.7 Oxidation von desialysiertem EPO mit Galaktoseoxidase
  • 4,485 mg vollständig desialysiertes EPO wurde in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, in Anwesenheit von 16 μl Catalase (6214 Units/200 ml) und 80 μl Galaktoseoxidase (2250 Units/ml aus Dacrylium dendroides (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) inkubiert; Die Inkubation erfolgte bei 37 °C über Nacht; 2 Mal 20 μl Galaktoseoxidase wurden nach 4 Stunden und nach 8 Stunden nach dem Start der Inkubation hinzugefügt.
  • Beispiel 20.8 Herstellung von EPO-Proben für Bioassays
  • Reinigung von EPO aus Inkubationen von Perjodat- oder Galaktoseoxidase-oxidierten EPO-Proteinansätzen mit aktivierter HES
  • Reinigung von EPO-Proben (Entfernen von unbehandelten HES-Derivaten) wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die EPO-Inkubationsmischungen (ungefähr 5 mg EPO-Protein) wurden 1:10 mit Puffer A (20 mM N-Morpholinpropansulfonsäure [MOPS/NaOH] in H2O-Bidest, pH 8,0) verdünnt und wurden auf eine Säule, enthaltend 3 ml Q-Sepharose HP (Pharmacia Code Nr. 17-1014-03, Lot-Nr. 220211) equilibriert mit 10 Säulenvolumen (CV) A durch Benutzen einer Flussrate von 0,5 ml/min. Die EPO-Inkubationsmischungen (ungefähr 5 mg EPO-Protein) wurden 1:10 mit Puffer A (20 mM N-Morpholinpropansulfonsäure [MOPS/NaOH] in H2O-Bidest, pH 8,0) verdünnt und unter Verwendung einer Flussrate von 0,5 ml/min auf eine Säule aufgetragen, die 3 ml Q-Sepharose HP (Pharmacia Code Nr. 17-1014-03, Lot-Nr. 220211), equilibriert mit 10 Säulenvolumen (CV) A, enthielt. Die Säule wurde mit 6–8 CV Puffer A (Flussrate = 0,8 ml/min.) gewaschen und die Elution wurde durchgeführt, indem Puffer B (20 mM Morpholinoethansulfonsäure [MES/NaOH], 0,5 M NaCl in H2O-Bidest, pH 6,5) bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. verwendet wurde. EPO wurde durch UV-Absorption bei 280 nm erfasst und in ungefähr 6 ml eluiert. Die Säule wurde regeneriert, indem 3 CV Puffer C (20 mM MES, 1,5 M NaCl in H2O, eingestellt auf pH 6,5) benutzt wurden und sie wurde re-equilibriert, indem 10 CV Puffer A (Flussrate = 0,7 ml/min.) verwendet wurden.
  • Pufferwechsel der EPO-Eluate, erhalten aus dem Q-Sepharoseschritt, wurde durchgeführt, indem Vivaspin Konzentrators und phosphatgepufferte Saline (PBS) mit je 3 Zentrifugationszyklen pro Probe verwendet wurden; die Proben wurden auf 2 ml mit PBS eingestellt und bei –20 °C gelagert.
  • Nur < 25% der partiell desialysierten und anschließend mild mit Perjodat oxidierten EPO-Formen, welche einer HES-Modifizierung unterzogen worden waren, wurden aus dem Q Sepharose-Eluat gewonnen, da unter den verwendeten Bedingungen die basischen EPO-Formen nicht an Q-Sepharose binden und zusammen mit den nicht reagierten HES-Derivaten im Durchfluss gefunden wurden.
  • Beispiel 20.9 „High-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection" (HPAEC-PAD)
  • Gereinigte natürliche und desialysierte Oligosaccharide wurden durch High-pH Anion-Exchange (HPAE)-Chromatographie analysiert, indem ein Dionex BioLC System (Dionex, USA), ausgerüstet mit einer CarboPac PA1-Säule (0,4 × 25 cm) in Kombinaton mit einem pulsamperometrischen Detektor (PAD) verwendet wurde (Schröter et al., 1999; Nimtz et al., 1999). Detektorpotentiale (E) und Pulsdauern (T) waren: E1: +50 mV, T1: 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms; E3: -500 mV, T3: 60 ms und der Ausgangssbereich war 500–1500 nA. Die Oligosaccharide wurden dann in die CarboPac PA1-Säule injiziert, welche mit 100% Lösungsmittel A equilibriert worden war. Für desialysierte Oligosaccharide wurde die Elution (Flussrate: 1 ml·min–1) durchgeführt) durch Anwendung eines linearen Gradienten (0–20%) des Lösungsmittels B über eine Dauer von 40 min., gefolgt durch eine lineare Zunahme von 20–100% Lösungsmittel B über 5 min. Lösungsmittel A war 0,2 M NaOH in bidistilliertem H2O, Lösungsmittel B war aus 0,6 M NaOAc in Lösungsmittel A zusammengesetzt. Für natürliche Oligosaccharide wurde die Säule mit 100% Lösungsmittel C (0,1 M NaOH in bidistilliertem H2O) equilibriert und die Elution (Flussrate: 1 ml·min–1) wurde durchgeführt durch Anwendung von einem linearen Gradienten (0–35%) des Lösungsmittels D über eine Dauer von 48 min., gefolgt von einem linearen Anstieg von 35–100% Lösungsmittel D über 10 min. Lösungsmittel D war aus 0,6 M NaAc in Lösungsmittel C zusammengesetzt.
  • Beispiel 20.10 Analyse der Monosacharidzusammensetzung von N-Glycanen, HES-modifizierten N-Glycanen und EPO-Protein durch GC-MS
  • Monosaccharide wurden analysiert, wie die entsprechenden Methylglycoside nach Methanolyse, N-Reacetylierung und Trimethylsialysierung durch GC/MS [Chaplin, M.F. (1982) A rapid and sensitiv method fort the analysis of cabohydrate. Anal. Biochem. 123, 336-341]. Die Analysen wurden durchgeführt auf einem Finnigan GCQ Ion Trap Massenspektrometer (Finnigan MAT corp., San Jose, CA), welches im positiven Ionen-EI-Modus lief, ausgerüstet mit einer 30 m-DBS-Kapillarsäule. Temperaturprogramm: 2 min. isotherm bei 80 °C, dann 10 Grad min–1 bis 300 °C.
  • Monosacharide wurden identifiziert durch ihre Retentionszeit und ihr charakteristisches Fragmentierungsmuster. Die unkorrigierten Ergebnisse der elektronischen Peak-Integration wurden für die Quantifizierung benutzt. Monosaccharide, welche auf Grund von Anomerie und/oder der Anwesenheit von furanoiden und pyranoiden Formen mehr als einen Peak ergaben, wurden durch Hinzufügung aller größeren Peaks quantifiziert. 0,5 μg Myo-Inositol wurde als Verbindung für einen internen Standard benutzt.
  • Beispiel 20.11 Ergebnisse
  • Beispiel 20.11(a) Charakterisierung von N-Glycanen von mild säurebehandletem (teilweise desialysiertem) EPO-GT-1
  • EPO-GT-1-Ansätze, welche für 5, 10 oder 60 min. einer milden Säurebehandlung unterzogen worden waren, wurden durch SDS-PAGE vor und nach Freisetzung von N-gebundenen Oligosacchariden durch Inkubation mit N-Glycosidase analysiert, wie in 9 gezeigt. N-gebundene Oligosaccharide wurden einer HPAEC-PAD-Oligosaccharid-Kartierung unterzogen (10). Das unbehandelte EPO-GT-1 enthielt > 90% N-gebundene Oligosaccharide mit 3 oder 4 Sialinsäureresten, während nach 5 min. Inkubation in Anwesenheit von milder Säure < 40% der Kohlenhydratketten 3 oder 4 Sialinsäurereste hatten. HPAEC-PAD der desialysierten N-Glycane zeigte, dass das Verhältnis von neutralen Oligosacchariden, welche für das unbehandelte EPO-GT-1 detektiert wurden, und in den Ansätzen, welche einer Säurebehandlung für 5, 10 oder 60 min. unterzogen wurden, stabil blieb. MALDI/TOF der desialysierten Glycane zeigte, dass < 90% der proximalen Fucose nach milder Säurebehandlung des Proteins vorhanden war.
  • Beispiel 20.11(b) Charakerisierung von perjodatbehandeltem EPO-GT-1
  • SDS-PAGE-Mobilität von mild perjodatbehandelten EPO-Formen, welche zuvor einer S- und 10-Minutenbehandlung mit Säure ausgesetzt waren oder welche nicht behandelt worden waren, sind in 12 verglichen. Die Bedingungen, die für die Perjodatoxidation von Sialinsäuren verwendet wurden, änderten das SDS-PAGE-Muster der EPO-Ansätze nicht (vergleiche 9). Oxidation von Sialinsäureresten ergab eine Veränderung der Oligosaccharide in der HPAEC-PAD-Analyse zu früheren Elutionszeiten (vergleiche 10 und 13).
  • Beispiel 20.11(c) Charakterisierung von HES-modifizierten EPO-Derivaten
  • (aa) Zeitverlauf der HES-Modifikation von EPO-GT-1-A mit hydroxylaminmodifiziertem HES-Derivat X, hergestellt nach Beispiel 14.4
  • 400 μg hydroxylaminmodifiziertes HES-Derivat X wurde zu 20 μg EPO-GT-1-A (mild perjodatoxidiertes EPO, nicht säurehydrolysiert vor der milden Perjodatoxidation) in 20 μL in 0,5 M NAOAc-Puffer, pH 5,5, hinzugefügt und die Reaktion wurde jeweils nach 30 min., 2, 4 und 17 Stunden durch Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff gestoppt. Anschließend wurden die Proben bei –20 °C bis zur weiteren Analyse gelagert.
  • SDS-PAGE-Probenpuffer wurde hinzugefügt und die Proben wurden auf 90 °C erhitzt und auf SDS-Gele aufgetragen. Wie in 14 gezeigt, ergaben steigende Inkubationszeiten eine größere Veränderung zu höheren Molkulargewichten des Proteins. Nach 17 Stunden Inkubation in Anwesenheit des hydroxylaminmodifizierten HES-Derivates X wurde eine diffuse Commassie-gefärbte Proteinbande detektiert, welche in einem Bereich zwischen 60 und 11 KDa wanderte, bezogen auf die Position des Molekulargewichtsstandards (siehe linken Teil der 14). Nach Behandlung mit N-Glycosidase wurde das meiste Protein zu der Position des de-N-glycosylierten EPO verändert (siehe 14, rechtes Gel; Pfeil A zeigt die Wanderungsposition der N-Glycosidase, Pfeil B zeigt die Wanderungsposition des de-N-glycosylierten EPO; die diffuse Proteinbande, sichtbar in der Region zwischen den 28 KDa- und 36 KDa-Molekulargewichtsstandards stellt vermutlich EPO-Formen dar, welche durch HES- und die O-Glycosylierungsstellen des Moleküls modifiziert sind. Im Hinblick auf die Spezifität der N-Glycosidase schließen wir aus diesem Ergebnis, dass in der Tat HES-Modifikation an den perjodatoxidierten Sialinsäureresten des Glycans des EPO-Proteins erfolgt.
  • (bb) Charakterisierung von HES-EPO-Konjugaten
  • HES-EPO-Konjugate I (stammend von EPO-GT-1 nach milder Perjodatoxidation, z.B. aus EPO-GT-1-A), II (entstanden aus EPO-GT-1, welches für 5 min. einer Säurehydrolyse und milden Perjodatoxidation unterzogen wurde), III (entstanden aus EPO-GT-1, welches für 10 min. einer Säurehydrolyse und milden Perjodatoxidation unterzogen wurde) wurden synthetisiert, wie zuvor beschrieben. Eine Kontrollinkubation (K) wurde einbezogen, enthaltend unmodifiziertes EPO-GT-1 unter den gleichen Pufferbedingungen, zu denen eine gleiche Menge unmodifizierte HES hinzugefügt wurde. Die Inkubationsmischungen wurden weiterer Reinigung für nachfolgende biochemische Analysen der HES-EPO-Derivate unterzogen.
  • Die Inkubationen der HES-EPO-Konjugate I, II und III sowie der Kontrollinkubation K wurden einem Q-Sepharose-Reinigungsschritt unterzogen, wie unter „Material und Methoden" (Beispiel 20.8) beschrieben, um den Überschuss nicht reagierten HES-Reagenz' zu entfernen, welcher im Durchlauf der Ionenaustauschsäule erwartet wurde. Auf Grund der großen Menge basischer EPO-Formen, enthalten in zuvor säurebehandelten Proben II und III, erwarteten wir ansehnliche Mengen modifizierten EPO-Produkts von diesen Inkubationen im Durchlauf. Wie in 15 gezeigt ist, wurde fast alles EPO-Material von Proben I durch die Q-Sepharosesäule zurückgehalten, während nur ungefähr 20–30% der Proben III und II in der Fraktion, welche mit hoher Salzkonzentration eluierte, zurückgewonnen wurde. Sämtliches Proteinmaterial aus der Inkubation mit HES-Derivat X, sowohl im Durchlauf, als auch in den Fraktionen, welche mit hoher Salzkonzentration eluierten, hatte offenbar höheres Molekulargewicht im SDS-PAGE verglichen mit dem Kontroll-EPO.
  • Um ausführlicher zu charakterisieren, wurden die HES-modifizierten EPO-Proben A und K (siehe 13) mit der perjodatoxidierten Form EPO-GT-1-A verglichen. Die Proben wurden N-Glycosidasebehandlung unterzogen und, wie in 16a und 16b dargestellt, ergab die Freisetzung von N-Glycanen zwei Banden von geringem Molekulargewicht an der Position der O-glycosylierten und nicht glycosylierten EPO-Formen des Standard-EPO-Ansatzes. Im Fall der Probe A wurde eine weitere Bande detektiert, welche an der Position des 28 KDa MW-Standards wanderte, was auf eine HES-Modifikation am O-Glycan dieser EPO-Variante hinweist (vgl. Beispiel 20.11(c)(aa)). Diese Bande (und auch die stark HES-modifizierte hohe MW-Form des N-glycosylierten EPO, siehe 16a und 16b) verschwanden, nachdem die Proben einer milden Hydrolyse unterzogen wurden, was übereinstimmt mit der Auffassung, dass eine HES-Modifikation am perjodatoxidierten Sialinsäurerest des Erythropoietins erreicht wurde.
  • Aliquots der N-Glycosidase-Inkubationsmischung wurden hydrolysiert, indem Bedingungen verwendet wurden, welche das vollständige Entfernen von Sialinsäureresten (und auch von sialinsäuregebundenen HES-Derivaten) von Oligosacchariden ermöglichen; nach Neutralisierung wurden die Mischungen dann zu ihrer Entsalzung auf kleine Hypercarb-Säulen absorbiert. Die Säulen wurden drastisch mit Wasser gewaschen, gefolgt durch Elution von gebundenen neutralen Oligosacchariden mit 40% Acetonitril in H2O, enthaltend 0,1% Trifuloessigsäure. Die entstehenden Oligosaccharide wurden MALDI/TOF-MS unterzogen. Die Spektren der desialysierten Oligosaccharidfraktionen von Probe A, EPO-GT-1-A und Probe K zeigten identische Massen für komplexartige Oligosaccharide bei m/z = 1810 Da (di-antennenartig), 2174 = tri-antennenartig, 2540 = tetra-antennenartig, 2906 = tetra-antennenartig plus 1 N-Acetyllactosamin-Wiederholung und 3271 = tetraantennenartig plus 2 N-Acetyllactosamin-Wiederholung; Kleine Signale, übereinstimmend mit einem Mangel an Fucose (–146) und Galaktose (minus 162) wurden detektiert, welche den Säurehydrolyse-Bedingungen, angewandt für die Sialinsäureentfernung (siehe MALDI-Abbildungen 19, 20 und 21) zugeordnet werden können.
  • In einem Parallelexperiment wurde die N-Glycosidase-Verdaumischung auf eine 1-ml-RP-C18-Cartridge (ohne vorherige Säurehydrolyse der Oligosaccharide) absorbiert, und die Elution wurde mit 5% Acetonitril in Wasser, enthaltend 0,1% TFA durchgeführt; unter diesen Bedingungen wurde das EPO-Protein vollständig auf dem RP-Material festgehalten, und Oligosaccharide wurden mit 5% Acetonitril in H2O, enthaltend 0,1% TFA, von der Säule gewaschen. Das de-N-glycosylierte EPO-Protein wurde mit 70% Acetonitril in Wasser, enthaltend 0,1% TFA eluiert. Die Oligosaccharidfraktionen aus dem RP-C18-Schritt der N-glycosidasebehandelten Probe A, EPO GT-1-A und Probe K wurden neutralisiert und einer Entsalzung unterworfen, indem Hypercarb Cartridges, wie zuvor beschrieben, verwendet wurden. Die isolierten Oligosaccharide wurden einer HPAEC-PAD-Kartierung vor (siehe 17) und nach milder Säurebehandlung unter Bedingungen, welche quantitatives Entfernen von Sialinsäure von Glycanen ermöglichten (siehe 18), unterzogen.
  • Das HPAEC-PAD-Profil für das natürliche Material, erhalten von der HES-modifizierten Probe A, zeigte nur vernachlässigbare Signale für Oligosaccharide, während EPO-GT-1-A-abgeleitete Oligosaccharide das gleiche Glycanprofil aufwiesen, wie das in 13 gezeigte (Probe, genannt EPO-GT-1 nach milder Perjodatbehandlung). Das Elutionsprofil von Oligosacchariden, erhalten aus der Kontroll-EPO-Probe (K), ergab das erwartete Muster (vergleiche Profil in 10). Zum Vergleich ist das natürliche Oligosaccharidprofil des internationalen BRP-EPO-Standards zum Vergleich und als Referenzstandard eingeschlossen.
  • Nach milder Säurehydrolyse zeigten alle Oligosaccharidansätze ein identisches Elutionsprofil von neutralen Oligosaccharidstrukturen (siehe 18) mit der erwarteten qulitativen und quantitativen Zusammensetzung von di-, tri- und tetraantennenartigen komplexartigen Kohlenhydratketten, wie beschrieben in dem Methodenabsatz für die EPO-Herstellung, welcher als Startmaterial in der vorliegenden Studie benutzt wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass die HES-Modifikation der EPO-Probe eine kovalente Bindung des HES-Derivates ergibt, welche losgelöst ist von dem EPO-Protein durch N-Glycosidase, und welche säurelabil ist, da sie vom N-Glycan durch Benutzen milder Säurebehandlungsbedingunen, welche bekannt dafür sind, Kohlenhydrate zu desialysieren, entfernt werden kann (siehe Abbildungen 16a+b).
  • (cc) Analyse der Monosaccharid-Zusammensetzung von HES-EPO- und HES-EPO-N-Glycanen durch GC-MS
  • Um weiter die HES-Modifizierung von EPO an den N-Glycanen des Moleküls zu bestätigen, wurden EPO-Proben mit N-Glycosidase verdaut, und das EPO-Protein wurde auf RP-C18-Cartridges adsorbiert, wobei Oligosaccharidmaterial, wie oben beschrieben, abgewaschen wurde. Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurden Glucose und hydroxyethylierte Glucosederivate nur in dem EPO-Protein detektiert, welches einer HES-Modifizierung an Cysteinresten unterzogen worden war, und in Oligosaccharidfraktionen von EPO-Probe A2.
  • Beispiel 20.11(d) In-vivo-Assay der biologischen Aktivität von HES-modifiziertem EPO
  • Der EPO-Bioassay in dem normocythaemischen Maussystem zeigt wurde durchgeführt nach den Verfahren, beschrieben in dem Europäischen Arzneimittelbuch (European Pharmacopeia); das Labor, das den EPO-Assay durchführte, benutzte den internationalen BRP-EPO-Referenz-Standardansatz. Für den HES-modifizierten EPO-A2-Ansatz wurde ein Mittelwert für die spezifische Aktivität von 294 600 Units per mg EPO-Protein bestimmt, was auf eine ungefähr 3-fach höhere spezifische Aktivität hinweist, verglichen mit dem internationalen BRP-Referenz-Standardansatz, welcher in den Proben für die Aktivitätstests eingeschlossen war.
  • Die Ergebnisse der Studie sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
  • Literaturnachweise für Beispiele 13 bis 20:
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    • Hermentin P, Witzel R, Vliegenhart JF, Kamerling JP, Nimtz M, Conradt HS. A strategy for the mapping of N-glycans by high-ph anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Anal Biochem. 1992 Jun; 203(2):281-9
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  • Tabelle 1
    Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Tabelle 3 Analyse der Monosaccharid-Zusammensetzungen von Glykanen aus HES-modifiziertem EPO und Kontrollproben
    Figure 00960001
  • Tabelle 4
    Figure 00960002

Claims (23)

  1. Hydroxyalkylstärke (HAS)-Erythropoietin (EPO)-Konjugat (HAS-EPO), umfassend eines oder mehrere HAS-Moleküle, wobei jedes HAS an das EPO über einen Kohlehydratanteil konjugiert ist.
  2. HAS-EPO nach Anspruch 1, wobei das EPO die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO hat.
  3. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2, wobei das EPO eine oder mehrere Kohlehydratseitenketten umfasst, gebunden an das EPO über N- und/oder O-verknüpfte Glykosylierung.
  4. HAS-EPO nach Anspruch 3, wobei die Kohlehydratseitenketten an das EPO während der Herstellung in Säuger-, Insekten- oder Hefezellen gebunden wurden.
  5. HAS-EPO nach Anspruch 4, wobei die Säugerzellen menschliche Zellen sind.
  6. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei HAS an das EPO über ein Linkermolekül konjugiert ist.
  7. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei HAS an das EPO über sein reduzierendes Ende konjugiert ist.
  8. HAS-EPO nach Anspruch 7, wobei HAS an das EPO ausschließlich über sein reduzierendes Ende konjugiert ist.
  9. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, wobei HAS an das EPO über eine freie Hydrazid-, Hydroxylamin-, Thiol- oder Semicarbazid-Funktion konjugiert wurde, die vor dem Konjugieren in das HAS eingeführt worden war.
  10. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 9, wobei HAS an das EPO über einen Kohlehydratanteil konjugiert wurde, der Teil der Kohlehydratseitenketten ist.
  11. HAS-EPO nach Anspruch 10, wobei der Kohlehydratanteil oxidiert ist.
  12. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 10 oder 11, wobei HAS an einen Galaktose- oder Sialinsäurerest der Kohlehydratseitenketten konjugiert ist.
  13. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 12, umfassend 1–12 HAS-Moleküle pro EPO-Molekül.
  14. HAS-EPO nach Anspruch 13, umfassend 1–6 oder 1–3 HAS-Moleküle pro EPO-Molekül.
  15. HAS-EPO nach Anspruch 14, umfassend 1–4 HAS-Moleküle pro EPO-Molekül.
  16. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, wobei das HAS aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke und Hydroxybutylstärke ausgewählt ist.
  17. HAS-EPO nach Anspruch 16, wobei das HAS Hydroxyethylstärke (HES) ist.
  18. HAS-EPO nach Anspruch 17, wobei das HES ein Molekulargewicht von 1 bis 300 kDa, bevorzugt 5 bis 100 kDa besitzt.
  19. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 17 oder 18, wobei das HES einen molaren Substitutionsgrad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis zwischen C2:C6-Substitution im Bereich von 2-20 aufweist, bezüglich der Hydroxyethylgruppen.
  20. HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, weiterhin umfassend mindestens einen pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff
  23. Verwendung eines HAS-EPO nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 19 zur Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von anämischen Störungen oder hämatopoetischen Funktionsstörungen.
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