DE19628705A1

DE19628705A1 - Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe

Info

Publication number: DE19628705A1
Application number: DE19628705A
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Sommermeyer; Wolfram Dr Eichner
Original assignee: Fresenius SE and Co KGaA
Current assignee: Fresenius SE and Co KGaA
Priority date: 1996-07-08
Filing date: 1996-07-08
Publication date: 1998-01-15
Also published as: DE59705678D1; ES2166551T3; EP0912197B1; WO1998001158A3; PT912197E; DK0912197T3; AU710879B2; US6083909A; ATE209931T1; WO1998001158A2; JP2000514434A; AU3541197A; EP0912197A2; BR9710865A; CA2258947A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Sauerstoff-Transport- Mittel, die Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Sauerstoff-Transport-Mittel als Blut ersatzstoff, Plasma-Expander, Perfusionsmittel, Hämodilutions mittel und/oder kardioplegische Lösung.

Die Entwicklung von stromafreien Hämoglobin-Lösungen, sogenann ten "Hämoglobin-Based-Oxygen Carriers" (HOBC′s), die als Blut ersatzstoff verwendbar sind, ist seit langem ein vordringliches Ziel der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung.

Blutverlust, beispielsweise als Folge eines Unfalls oder einer Operation, wird in den meisten Fällen mit einer allogenen Blut spende behandelt. Die damit assoziierten Probleme des unkontrol lierten Transfers von pathogenen Organismen, insbesondere von Viren wie HIV oder Hepatitis-Erregern, sowie die Notwendigkeit der Blutgruppentypisierung vor der Transfusion sind dem Fachmann seit langem bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben.

Ein als vollwertiger Blutersatz verwendbares HBOC-Produkt würde nicht nur diese Probleme lösen, sondern könnte darüber hinaus als Plasma-Expander, Perfusionsmittel, Hämodilutionsmittel und/- oder kardioplegische Lösung verwendet werden.

Obgleich der Bedarf an einem derartigen Produkt bereits frühzei tig erkannt wurde (vgl. Rabiner, J. Exp. Med. 126, (1967) 1127), hat bisher keines der bekannten HBOC-Produkte den Status eines zugelassenen Arzneimittels erreicht.

Das natürliche Sauerstoff-Transport-Mittel ist der Blutfarbstoff Hämoglobin, ein Chromoprotein mit einem Molekulargewicht (MG) von 64 Kilodalton (kDa). Das Protein besteht aus zwei α- und β- Peptidketten, die als prosthetische Gruppe jeweils ein Häm ge bunden haben. Dabei handelt es sich um einen Porphyrin-Ring mit zentralem Eisen-Atom. Isolierte Hämoglobin-Moleküle sind sehr instabil und zerfallen rasch in die stabileren α,β-Dimere (MG 32 kDa). Die biologische Halbwertszeit von isoliertem Hämoglobin im Blutkreislauf liegt bei etwa 1 Stunde, da die Dimere schnell über die Nieren ausgeschieden werden. Dabei erzeugen die Dimere nephrotoxische Nebenwirkungen (vgl. Bunn & Jandl, J. Exp. Med. 129, (1967) 925-934).

Die zunächst entwickelten HBOC-Produkte besaßen zudem ein nephrotoxisches Potential, das auf Verunreinigungen der Produkte mit zellulären Bestandteilen zurückgeführt wurde (vgl. Relihan, Ann. Surg. 176, (1972) 700).

Ferner fehlt einer isolierten Hämoglobin-Zusammensetzung das 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG), welches den natürlichen, allo sterischen Aktivator der Sauerstoffbindung darstellt. Daraus resultiert eine gesteigerte Sauerstoff-Bindungsaffinität des isolierten Hämoglobins und, damit einhergehend, ein verringertes Sauerstoff-Freisetzungsvermögen derartiger Zusammensetzungen.

Entwicklungsarbeiten an derivatisierten Hämoglobin-Molekülen waren daher in erster Linie darauf gerichtet, deren Sauerstoff übertragungseigenschaften zu verbessern, sowie die nephrotoxi schen Symptome zu umgehen. Dabei wurde Hämoglobin intramolekular vernetzt, zur Bildung von polymeren HBOC-Formen intermolekular verknüpft und/oder an Polymere gekoppelt, um konjugierte HBOC- Formen zu schaffen.

Die Vernetzung von Hämoglobin mittels bi- oder polyfunktionaler Vernetzungsmittel kann selektiv oder nicht-selektiv erfolgen. Bei einer Form der selektiven Vernetzung werden zwei Protein ketten des Hämoglobins intramolekular miteinander verbunden, wodurch die natürliche tetramere Form des isolierten Hämoglobin- Moleküls stabilisiert wird. Durch Auswahl eines geeigneten Ver netzungsmittels kann die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins ferner so eingestellt werden, daß vernetztes Hämoglobin unter physiologischen Bedingungen Sauerstoff reversibel binden kann. Beispiele für derartige Vernetzungsmittel sind Pyridoxalphosphat und Diaspirin sowie deren Derivate. Verfahren zur Vernetzung von Hämoglobin werden beispielsweise in Benesch (Meth. Enzymol., Vol. 231 (1994), 267-274), Keipert et al. (Transfusion, Vol. 29 (1989), 767-773), Snyder et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), 7280-7284) und in Rogers et al. (Biochim. et Biophys. Acta, 1248 (1995), 135-142) beschrieben.

Bei einer nicht-selektiven Vernetzung entstehen intermolekular vernetzte, polymere HBOC-Produkte. Entsprechende Vernetzungs mittel und Verfahren zu deren Verwendung werden beispielsweise in DE-26 07 706, EP-0 646 130 und Hai et al. (Art. Cells, Blood Subs. and Immob. Biotech, 22(3) (1994), 923-931) beschrieben. Einen Überblick über verschiedene Hämoglobin-Derivate und die mit dem klinischen Einsatz verbundenen Probleme geben die Veröf fentlichungen von Gould et al., Transfus. Sci. 16, (1995) 5-17, und Chang et al., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 20, (1992) 159-179.

Bekannte Hämoglobin-Konjugate werden umfassend in Xue und Wong (Meth. in Enzymol., 231 (1994), S. 308-322) und beispielsweise in DE 26 16 086 oder DE 26 46 854 beschrieben. Letztere offen bart Verfahren mittels derer Hämoglobin an Hydroxyethylstärke gebunden wird, indem Hydroxyethylstärke zunächst mit Natriumpe riodat umgesetzt wird. Dabei entstehen Dialdehyde, an die Hämo globin gebunden wird. Demgegenüber beschreibt die DE 26 16 086 die Kopplung von Hämoglobin an Hydroxyethylstärke nach einem Verfahren, bei dem zunächst ein Vernetzungsmittel (z. B. Bromcy an) an die Hydroxyethylstärke gebunden wird und anschließend Hämoglobin an das Zwischenprodukt gebunden wird.

Die Sauerstoff-Bindungsaffinität der Hämoglobin-Derivate hängt neben der Auswahl von geeigneten Vernetzungs- und/oder Polymeri sationsmitteln auch vom Liganden der Häm-Gruppe während der Vernetzung und/oder Polymerisation ab. Oxy-Hämoglobin oxidiert schnell zu Met-Hämoglobin (Fe-III), welches eine zu hohe Sauer stoff-Bindungsaffinität besitzt, um als Sauerstoff-Transport- Mittel geeignet zu sein. Daher wurden die genannten Verfahren zur Herstellung von HBOC-Derivaten auch mit Desoxy-Hämoglobin durchgeführt (vgl. Benesch, R. E. a.a.O.).

Die bisherigen Verfahren zur Herstellung von vernetzten und/oder konjugierten HBOC-Produkten ermöglichten jedoch keine selektive Bindung von Hämoglobin an das jeweilige Polymer. Es entstand in allen Verfahren ein Gemisch von Co-Polymeren, dessen Bestand teile unterschiedliche biologische Aktivitäten aufwiesen. Das Reaktionsprodukt, bzw. die Zusammensetzung der Mischung konnte bislang nur grob charakterisiert werden. Sowohl die höhermole kularen Produkte (MG < 500 kDa) als auch residuale, tetramere Formen führten zu toxischen Nebenwirkungen. Die Entfernung der jeweiligen nieder- und/oder hochmolekularen Anteile aus den HBOC-Produkten, zum Beispiel durch zusätzliche Filtra tionsschritte, bedingt beträchtliche Ausbeuteverluste, wodurch die Wirtschaftlichkeit der Herstellungsverfahren erheblich ver schlechtert wird.

Die bisher getesteten HBOC-Produkte wiesen zusätzlich vaskuläre Nebenwirkungen auf, die nach neuesten klinischen Studien auf niedermolekulare, d. h. im wesentlichen tetramere HBOC-Formen zurückzuführen sind (vgl. Gould et al., a.a.O., und Alayash & Cashon, Molecular Medicine Today, 1, (1995) 122-127). Diese niedermolekularen HBOC-Formen sind in der Lage, aus dem Blut kreislauf in die endothelialen Zellagen der Blutgefäße überzu treten. Die hohe Bindungsaffinität des Hämoglobin für das Stick oxid (NO, auch bekannt als Endothelial-Derived Relaxing Factor, EDRF) führt dazu, daß sich die frei verfügbare NO-Menge in die sem Gewebe nach Applikation von HBOC-Derivaten drastisch redu ziert. Als Folge der lokalen Verringerung der NO-Konzentration entsteht eine systemische Vasokonstriktion, die zu Hypertonie führt.

Jia et al. (Nature, 380, (1996) 221-226) schreiben dem Hämoglo bin sogar eine zentrale Rolle in der Regulation des NO-Kreis laufs zu. Demnach wird Hämoglobin in der Lunge kooperativ oxyge niert und S-nitrosiliert. Die NO-Gruppe wird während des arte rio-venösen Übergangs auf andere Proteine übertragen, welche da durch eine NO-ähnliche, gefäßerweiternde Aktivität erlangen. Vernetzte HBOC-Produkte besitzen jedoch in der Regel keine ko operativen Eigenschaften mehr.

Eine weitere toxische Aktivität der bisher getesteten HBOG-Pro dukte wurde u. a. von Alayash und Cashom beschrieben (vgl. Molec. Med. Today, (1995) a.a.O.). Demnach sind Hämoglobin-Moleküle au ßerhalb der Erythrozyten an Redoxreaktionen beteiligt, in deren Verlauf hochreaktive Hämoglobin- und Sauerstoff-Spezies entste hen, die u. a. für Lipid-Peroxidation verantwortlich gemacht werden.

Um die toxischen Nebenwirkungen der bislang getesteten HBOC- Produkte zu unterbinden, wurden Applikationsformen entwickelt, bei denen Hämoglobin in Liposomen verpackt wird, wodurch künst liche, Erythrozyten-ähnliche Transportorganellen für Hämoglobin entstehen (vgl. Rudolph et al., Crit. Care Med. 22, (1994) 142-150). Der hohe Eintrag von Phospholipiden in den Blutkreislauf ist jedoch mit einem weiteren Risiko für die Patienten verbun den.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, daß die bisher gete steten HBOC-Produkte keine Arzneimittelzulassung erhalten haben, da deren klinische Verwendung als Sauerstoff-Transport-Mittel bisher durch eine unzureichende Verträglichkeit verhindert wur de.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Sauerstoff- Transport-Mittel zur Verfügung zu stellen, welches als Bluter satzstoff klinisch verwendbar ist. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung liegt in der Bereitstellung eines geeigneten Herstel lungsverfahrens für das erfindungsgemäße Sauerstoff-Transport- Mittel.

Diese Aufgabe wird durch ein Sauerstoff-Transport-Mittel gelöst, welches ein Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat enthält, in dem Hämoglobin und die Hydroxyethylstärke selektiv über Amidbin dungen zwischen freien Aminogruppen des Hämoglobins und in oxi dierter Form vorliegenden reduzierenden Endgruppen der Hydroxy ethylstärke miteinander verknüpft sind.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß erfindungsgemäße Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate hervorragend als Sauer stoff-Transport-Mittel geeignet sind, da diese besonders gut verträglich sind. Das Mittel weist eine Sauerstoffbin dungsaffinität auf, die eine reversible Sauerstoff-Bindung unter physiologischen Bedingungen ermöglicht (P₅₀ von 20 bis 50 mm Hg). Das Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat ist zu groß, um in die endothelialen Zellagen der Blutgefäße einzudringen, und verursacht daher keine hypertonischen Nebenwirkungen. Das Sauer stoff-Transport-Mittel enthält weder antigene noch pyrogene Bestandteile und verursacht auch keine nephrotoxischen Nebenwirkungen.

Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, daß die vorteilhaften rheologischen Eigenschaften, die Hydroxyethylstär ke zu einem bevorzugten Mittel für die Hämodilution und zum Volumenersatz gemacht haben (vgl. Weidler et al., Arzneim.-For schung/Drug Res., 41, (1991) 494-498), in dem Konjugat erhalten bleiben. Die gute Verträglichkeit des Sauerstoff-Transport-Mit tels begründet sich somit auch durch eine überraschende Kombina tion der vorteilhaften Sauerstoff-Transport-Eigenschaften des Hämoglobins und der Hämodilutions-Eigenschaften der Hydroxyet hylstärke.

Das Sauerstoff-Transport-Mittel weist eine lange vaskuläre Per sistenz auf und die Moleküloberfläche des Hämoglobins wird durch Substituenten abgeschirmt. Überraschenderweise wurde festge stellt, daß das Hämoglobin im erfindungsgemäßen Hämoglobin-Hy droxyethylstärke-Konjugat durch diesen Abschirmeffekt daran gehindert wird, an toxischen Redoxreaktionen teilzunehmen.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Sauerstoff-Transport- Mittels besteht darin, daß Hydroxyethylstärke und Hämoglobin als Konjugat gleichzeitig in hohen Konzentrationen verabreicht wer den können, ohne daß dadurch der kolloid-osmotische Druck erhöht wird.

Das Sauerstoff-Transport-Mittel enthält das Hämoglobin-Hydroxy ethylstärke-Konjugat in einer Konzentration zwischen 2 und 20 g/dL, bevorzugt in einer Konzentration zwischen 5 und 15 g/dL und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 g/dL. Das Sauerstoff-Transport-Mittel kann ferner bekannte physiologisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel oder Exzipienten enthal ten.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung des Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugates bevorzugt stroma-frei es, gereinigtes und pasteurisiertes Hämoglobin verwendet, das nach im Stand der Technik umfassend beschriebenen Verfahren gewonnen werden kann. Das Hämoglobin kann vernetzt und/oder polymerisiert sein. Das Hämoglobin kann menschlichen, tierischen oder rekombinanten Ursprungs sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Ab schirmeffekte der Hydroxyethylstärke immunologische Komplika tionen verhindern, die bei der Verwendung von tierischem Hämo globin zu erwarten wären. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft daher ein Sauerstoff-Transport-Mittel, wel ches ein Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat enthält, in dem das Hämoglobin tierischen Ursprungs ist. Das Hämoglobin kann beispielsweise bovinen, porcinen oder equinen Ursprungs sein. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird für die Herstellung des Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Kon jugates bovines Hämoglobin verwendet, das in isolierter Form auch ohne Vernetzung die bevorzugte Sauerstoff-Bindungsaffinität aufweist.

Sofern humanes Hämoglobin verwendet wird, sollte dieses mittels Vernetztung und/oder Polymerisation in der tetrameren Form sta bilisiert werden. Durch Vernetzung und/oder Polymerisation wird humanes Hämoglobin gleichzeitig zur reversiblen Sauerstoff-Bin dung unter physiologischen Bedingungen befähigt. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung oder Polymerisa tion bekannt. Erfindungsgemäß kann ein beliebiges Verfahren ver wendet werden, sofern das Hämoglobin dabei stabilisiert wird und die gewünschte Sauerstoff-Affinität (P₅₀ von 20 bis 50 mm Hg) erhält. Bevorzugte Vernetzungsverfahren umfassen die intramole kulare Vernetzung mit bis-pyridoxal-Tetraphosphat (vgl. Keipert et al., Transfusion, Vol. 29 (1989), 767-773) oder Diaspirin (vgl. Snyder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), 7280-7284) oder eine Vernetzung und Polymerisation mit Raffinose (vgl. EP-0 646 130).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das Hämoglobin vor der Kopplung an die Hydroxyethylstärke in desoxygenierter oder teilweise desoxygenierter Form vor. Bei teilweise desoxygenierten Formen sind Zusammensetzungen bevor zugt, die zu 50 bis 80% aus Desoxy-Hämoglobin und zu 20 bis 50% aus Oxy-Hämoglobin bestehen.

Für die Herstellung des Konjugates wird vorzugsweise Hydroxy ethylstärke verwendet, die ein mittleres Molekulargewicht von 5 bis 40 kDa aufweist, wobei Hydroxyethylstärke mit einem mitt leren Molekulargewicht von 5 bis 20 kDa besonders bevorzugt ist. Bevorzugte Hydroxyethylstärke ist ferner durch einen molaren Substitutionsgrad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis von C₂:C₆- Substitution im Bereich von 2 bis 20 charakterisiert.

Erfindungsgemäß bevorzugte Hydroxyethylstärke kann durch Säure hydrolyse, beispielsweise mit HCl, aus einer im Handel (Sigma) erhältlichen Hydroxyethylstärke mit vergleichsweise höherem Molekulargewicht gewonnen werden. Die Hydroxyethylstärke wird anschließend mittels Acetonfällung gereinigt.

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Hämoglobin-Hydroxy ethylstärke-Konjugates hängt von dem Molekulargewicht oder der Molekulargewichtsverteilung des eingesetzten Hämoglobins, der Molekulargewichtsverteilung der eingesetzten Hydroxyethylstärke und der Auswahl der Reaktionsbedingungen ab. Erfindungsgemäß werden Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate bevorzugt, deren Molekulargewicht zwischen 100 und 700 kDa liegt, wobei ein Mole kulargewicht zwischen 200 und 300 kDa besonders bevorzugt ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß die bekanntermaßen stabilisierende Wirkung von Sacchariden auf Hämo globin (vgl. Rudolph, Cryobiology, 25, (1988) 1-8) auch von der Hydroxyethylstärke des Konjugates ausgeht, wenn kurzkettige Hy droxyethylstärke verwendet wird. Erfindungsgemäße Sauerstoff- Transport-Mittel weisen gegenüber unmodifizierten HBOC-Produkten somit eine verbesserte Lagerstabilität bei 4°C und bei Raum temperatur auf. Damit ist das Sauerstoff-Transport-Mittel über raschenderweise selbst zum Träger der vorteilhaft stabilisieren den Eigenschaften der Saccharide geworden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Verfahren zur Herstellung der Sauerstoff-Transport-Mittel, die ein Hämo globin-Hydroxyethylstärke-Konjugat enthalten. Diese Verfahren ermöglichen erstmals eine selektive Bindung von Hämoglobin an Hydroxyethylstärke, wodurch ein Sauerstoff-Transport-Mittel ent steht. Das Konjugat wird in einem mehrstufigen Verfahren herge stellt, bei dem man die reduzierenden Endgruppen von Hy droxyethylstärke zunächst oxidiert und anschließend Hämoglobin über freie Aminogruppen mittels Amidbindungen an die oxidierten Endgruppen der Hydroxyethylstärke koppelt.

Als Ausgangsmaterial für das Verfahren wird vorzugsweise Hy droxyethylstärke mit einem mittleren Molekulargewicht von 5 bis 40 kDa verwendet, besonders bevorzugt ist Hydroxyethylstärke mit einem mittleren Molekulargewicht von 5 bis 20 kDa. Bevorzugte Hydroxyethylstärke ist ferner durch einen molaren Substitutions grad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis von C₂:C₆-Substitution im Bereich von 2 bis 20 charakterisiert.

Im Rahmen der Erfindung wird für die Herstellung des Sauerstoff- Transport-Mittels bevorzugt stroma-freies, gereinigtes, pasteu risiertes, vernetztes und/oder polymerisiertes Hämoglobin ver wendet. Das Hämoglobin kann dabei menschlichen, tierischen oder rekombinanten Ursprungs sein. Im Rahmen der vorliegenden Erfin dung wird bovines Hämoglobin bevorzugt, da es in isolierter Form eine Sauerstoff-Bindungsaffinität aufweist, die eine reversible Sauerstoff-Bindung unter physiologischen Bedingungen ermöglicht.

Nach einem bevorzugten Verfahren der Erfindung werden die redu zierenden Endgruppen der Hydroxyethylstärke oxidiert, indem man die Hydroxyethylstärke zunächst mit einer Iod enthaltenden Lö sung vermischt und danach Kaliumhydroxyd-Lösung dazugibt.

Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren der Erfindung wird das Hämoglobin in einem zweiten Schritt an die oxidierten Endgruppen von Hydroxyethylstärke gebunden. Die Reaktion kann bei spielsweise durch Vermischen der Einzelkomponenten bei 40°C durchgeführt werden. Dabei kommt es zu einer nukleophilen Sub stitutionsreaktion zwischen einer freien Aminogruppe des Hämo globins und dem Lacton der Hydroxyethylstärke, wobei eine Amid bindung entsteht, durch die Hämoglobin an die oxidierte reduzie rende Endgruppe der Hydroxyethylstärke gebunden wird.

Erfindungsgemäß hat es sich demgemäß überraschenderweise ge zeigt, daß nach dem Verfahren von Hashimoto et al. (Kunststoffe, Kautschuk, Fasern, 9, (1992) 1271-1279) zur Herstellung von Block-Copolymeren aus Polysacchariden und Polyamiden, Hämoglobin so an oxidierte Hydroxyethylstärke gebunden werden kann, daß ein besonders verträgliches Sauerstoff-Transport-Mittel entsteht. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lehre läßt sich die Syn these eines Hämoglobin-Konjugates erstmals soweit kontrollieren, daß tetramere Hämoglobin-Formen an Hydroxyethylstärke gebunden werden, ohne daß ein nennenswerter Anteil an hochmolekularen Hämoglobin-Formen entsteht.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Reaktionsbedingungen so ausgewählt, daß ein Hämoglobin-Hydroxy ethylstärke-Konjugat entseht, das ein Molekulargewicht zwischen 100 und 500 kDa aufweist, wobei ein Molekulargewicht zwischen 200 und 300 kDa besonders bevorzugt ist.

Nach dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erfolgt eine annähernd quantitative Umsetzung des Hämoglobins mit der Hy droxyethylstärke. Es verbleiben somit auch kaum niedermolekulare Hämoglobin-Formen im Reaktionsansatz, wobei ein Gehalt von weni ger als 5% an nicht konjugierten Hämoglobin-Formen bevorzugt ist. Demgemäß werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungs form der Erfindung nach der Kopplung von Hämoglobin und Hydroxy ethylstärke keine aufwendigen Reinigungsverfahren benötigt, um das gewünschte Reaktionsprodukt zu isolieren.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das Hämoglobin vor der Kopplung an die Hydroxyethylstärke entweder in vollständig desoxygenierter oder teilweise desoxyge nierter Form vor. Bei einer teilweise desoxygenierten Form sind Zusammensetzungen bevorzugt, die zu 50 bis 80% aus Desoxy-Hämo globin und zu 20 bis 50% aus Oxy-Hämoglobin bestehen. Die De soxygenierung des Hämoglobins kann mittels beliebiger chemischer oder physikalischer Verfahren erfolgen. Dabei wird Hämoglobin entweder mit chemischen Reduktionsmitteln wie Na-Ascorbat, Glu tation, N-Acetyl-Cystein oder N-Acetyl-Methionin versetzt oder mittels einer Gas-durchlässigen Membran gegen inertes Gas, wie N₂, He oder Ar, zirkuliert.

In einem besonders bevorzugten Verfahren wird Cystein als Reduk tionsmittel verwendet. Die Reduktion wird durchgeführt, bis der Oxy-Hämoglobin-Gehalt weniger als 5% beträgt, wobei ein Gehalt von weniger als 1% bevorzugt ist. Der Gehalt an Met-Hämoglobin sollte weniger als 3% betragen, wobei ein Gehalt von weniger als 0,5% bevorzugt ist.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird für die Herstellung des Hämoglobin-Hydroxyethyl stärke-Konjugates eine Hämoglobin-Lösung verwendet, in der das Hämoglobin zu 50 bis 80% aus Desoxy-Hämoglobin und zu 20 bis 50% aus Oxy-Hämoglobin besteht. Zur Herstellung einer derartigen Hämoglobin-Lösung kann Oxy-Hämoglobin teilweise desoxygeniert werden oder Desoxy-Hämoglobin teilweise oxygeniert werden. Der Gas-Austausch kann dabei nach beliebigen Stand der Technik be schriebenen Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugte Verfahren umfassen die Begasung einer Desoxy-Hämoglobin-Lösung mit Sauer stoff oder mit einem Gas, das Sauerstoff enthält, oder eine chemische Teil-Reduktion des Oxy-Hämoglobins mit einem Reduk tionsmittel, wie beispielsweise Na-Dithionat, Na-Ascorbat oder Na-Bisulfith.

Nach Abschluß der Reaktion kann das Reduktionsmittel beispiels weise durch Ultrafiltration abgetrennt werden. In einer bevor zugten Ausführungsform der Erfindung wird die Ultrafiltration mittels einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von 30 bis 50 kDa durchgeführt, so daß gleichzeitig mit dem Cystein dimeri sierte Hämoglobin-Moleküle entfernt werden.

Nach einem besonders bevorzugtem Verfahren der Erfindung wird das Hämoglobin anschließend unter N₂-Begasung lyophilisiert.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Hydroxyethylstärke an den reduzierenden Endgrup pen selektiv oxidiert, indem eine wäßrige Lösung aus fraktio nierter Hydroxyethylstärke (MG 10 kDa) zunächst mit einer 0.1 N Iodlösung versetzt wird. Anschließend wird bei Raumtemperatur (RT) 0.1 N KOH Lösung zugegeben, bis die vom Jod stammende Farbe verschwindet. Dieser Schritt wird einmal wiederholt und die Mi schung anschließend für weitere 30 min gerührt. Danach wird die Lösung einer Dialyse unterworfen, wobei die Dialysemembran ein Ausschlußvolumen von etwa 9 kDa aufweist. Nach chromatographi scher Reinigung durch eine Kationen-Austauscher Säule wird die Lösung lyophilisiert.

Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bindung des Hämoglobins an die selektiv oxidierte Hydroxyethylstärke, indem Hämoglobin zunächst in DMSO aufgenommen und in eine Dreihals-Rundbodenflasche überführt wird. Dazu wird bei 40°C langsam eine in DMSO aufgenommene Lö sung zu einer nach obigen Verfahren oxidierten Hydroxyethylstär ke gegeben. Nach 25-stündigem Rühren bei 40°C wird der Rückstand über Gelpermeationschromatographie (GPC) und Ultrafiltration gereinigt und so vom Lösungsmittel befreit. Die MG-Zunahme der Hämoglobinpräparationen wurde mit Hilfe der GPC anhand von ge bräuchlichen Standards dokumentiert.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Sauerstoff-Transport-Mittel, die Hydroxyethylstärke-Hämoglobin-Konjugate und Albumin enthal ten. Das Albumin kann dabei menschlichen, tierischen oder rekom binanten Ursprungs sein und wird bevorzugt als wäßrige Lösung eingesetzt. Das Sauerstoff-Transport-Mittel enthält Albumin bevorzugt in einer Konzentration von zwischen 2 und 20 g/dL, wobei Konzentrationen zwischen 5 und 15 g/dL bevorzugt sind.

In erfindungsgemäß bevorzugten Sauerstoff-Transport-Mitteln kann das Gewichtsverhältnis von dem Hämoglobin-Hydroxyethylstärke- Konjugat zu Albumin von 1 : 10 bis 4 : 1 betragen. Da das Albumin wesentlich preiswerter ist als das Konjugat und zur Erzielung des gewünschten osmotischen Druckes in dem Sauerstoff-Transport- Mittel verwendet werden kann, sind Sauerstoff-Transport-Mittel mit einem vergleichsweise hohen Anteil an Albumin und einem geringen Anteil an Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugaten be sonders bevorzugt.

Die Erfindung betrifft ferner Sauerstoff-Transport-Mittel, die Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate und Albumin enthalten, und eine besonders gute vaskuläre Verträglichkeit aufweisen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden dafür die beschriebenen Konjugate mit Albumin, vorzugs weise mit humanem Serumalbumin vermischt, welches zuvor mit Stickstoffmonoxid gesättigt wurde. Hämoglobin und Albumin be sitzen die Eigenschaft NO in N-Nitroso-Form zu komplexieren (vgl. Keaney et al., J. Clin. Invest., 91, (1993) 1582-1589). Vernetzte HBOC-Produkte besitzen in der Regel keine kooperativen Eigenschaften mehr. Daher fehlt ihnen die Fähigkeit zur koopera tiven NO-Bindung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß dieser Mangel der Hämoglobin- Hydroxyethylstärke-Konjugate kompensiert werden kann, indem ein Sauerstoff-Transport-Mittel verwendet wird, das neben dem Kon jugat eine Albuminlösung enthält, die NO komplexiert hat. Dabei erfolgt die Sättigung von Albumin mit NO durch Begasen einer Albuminlösung mit NO unter Sauerstoff-Ausschluß. Die vaskuläre Verträglichkeit des Produkts wird dadurch weiter verbessert.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Sauerstoff-Transportmoleküle und der Zu sammensetzungen aus den Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugaten und Albumin als Blutersatzstoff, Plasma-Expander, Perfusions mittel, Hämodilutionsmittel und/oder als kardioplegische Lösung.

BEISPIEL Herstellung eines Hämoglobin-Hydroxyethylstärke Konjugates A. Oxidation der reduzierenden Endgruppen von Hydroxyethylstärke

Zu einer in weniger als 3 ml deionisiertem Wasser aufgenommenen Lösung fraktionierter Hydroxyethylstärke (MG 10 kDa; ca. 5 g) wurden zunächst tropfenweise 2 ml einer 0.1 N Iodlösung gegeben. Anschließend wurde bei Raumtemperatur (RT) 0.1 N KOH Lösung zugegeben, bis die vom Jod stammende Farbe verschwand. Durch Wiederholung des o.a. Schrittes wurden 14 ml Jodlösung und 23 ml KOH-Lösung zu dem Reaktionsansatz gegeben und die Mischung an schließend für weitere 30 min gerührt. Danach wurde die Lösung einer Dialyse mit einem Ausschlußvolumen der Dialysemembran von etwa 9 kDa unterworfen. Nach chromatographischer Reinigung an einer Kationen-Austauscher Säule (Amberlite IR-120) wurde die Lösung lyophilisiert. Die Ausbeute lag in einer Größenordnung von 85%.

B.1 Desoxygenierung von Hämoglobin durch Begasen

Bovines Hämoglobin (Biopure, Boston, USA) in einer Konzentration von 6 g/dL in 0,5 M NaCl, 0,1 M Na₂HPO₄ und 0,05 M NaHCO₃ wurde durch Begasen desoxygeniert. Das Hämoglobin lag zunächst zu 94 bis 96% in Form von Oxy-Hämoglobin vor. Die Desoxygenierung erfolgte in einem geschlossenen Behälter, in dem die Hämoglobin- Lösung über einen Gasaustauscher zirkuliert wurde, während die Membran kontinuierlich mit N₂ bei einem Druck von 10 p.s.i. begast wurden. Bei einem Gehalt von 70% Desoxy-Hämoglobin wurde die Desoxygenierung beendet. Anschließend wurde das Hämoglobin unter N₂-Begasung lyophilisiert.

B.2 Desoxygenierung von Hämoglobin mittels chemischer Reduktionsmittel

Bovines Hämoglobin (Biopure, Boston, USA) in einer Konzentration von 6 g/dL in 0,5 M NaCl, 0,1 M Na₂HPO₄ und 0,05 M NaHCO₃ wurde chemisch reduziert. Dafür wurde die Hämoglobin-Lösung mit 100 mM Na-Disulfit versetzt. Nach einer Stunde bestand die resultieren de Lösung zu 75% Desoxy-Hämoglobin. Das Na-Disulfit wurde mit tels Ultrafiltration bei einer Membran-Ausschlußgrenze von 50 kDa abgetrennt. Anschließend wurde das Hämoglobin unter N₂-Bega sung lyophilisiert.

C. Kopplung von Hämoglobin an die oxidierten Endgruppen von Hydroxyethylstärke

Jeweils etwa 1 g des in den Schritten B.1 und B.2 hergestellten Hämoglobins wurde in 15 ml DMSO aufgenommen und in eine 100 ml Dreihals-Rundbodenflasche überführt. Hierzu wurde bei 40°C lang sam eine in 0.5 ml DMSO aufgenommene Lösung von gemäß A. oxi dierter Hydroxyethylstärke gegeben. Nach 25-stündigem Rühren bei 40°C wurde der Rückstand über Gelpermeationschromatographie (GPC) und Ultrafiltration aufgereinigt und damit vom Lösungs mittel befreit. Die MG-Zunahme der Hämoglobinpräparationen wurde mit Hilfe der GPC anhand von gebräuchlichen Standards dokumen tiert.

Claims

1. Sauerstoff-Transport-Mittel enthaltend ein Hämoglobin-Hy droxyethylstärke-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin und die Hydroxyethylstärke in dem Konjugat selek tiv über Amidbindungen zwischen freien Aminogruppen des Hämoglobins und in oxidierter Form vorliegenden reduzieren den Endgruppen der Hydroxyethylstärke miteinander verknüpft sind.

2. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß das Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat im Sauerstoff-Transport-Mittel in einer Konzentration zwischen 2 und 20 g/dL vorliegt.

3. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat im Sauerstoff-Transport-Mittel in einer Konzentration zwischen 5 und 15 g/dL vorliegt.

4. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin menschlichen, tierischen oder rekombinanten Ursprungs ist.

5. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin bovinen Ur sprungs ist.

6. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopp lung an die Hydroxyethylstärke als Desoxy-Hämoglobin vor liegt.

7. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopp lung an die Hydroxyethylstärke als Mischung von Desoxy-Hämo globin und Oxy-Hämoglobin vorliegt, wobei der Anteil von Desoxy-Hämoglobin 50 bis 80% und der Anteil von Oxy-Hämoglo bin 20 bis 50% beträgt.

8. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin vernetztes und/oder polymerisiertes Hämoglobin ist.

9. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein mittleres Molekulargewicht von 5 bis 40 kDa aufweist.

10. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 10, dadurch ge kennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein mittleres Mole kulargewicht von 5 bis 20 kDa aufweist.

11. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke einen molaren Substitutionsgrad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis von C₂:C₆-Substitution im Bereich von 2 bis 20, jeweils bezogen auf die Hydroxyethylgruppen aufweist.

12. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel ferner Albumin enthält.

13. Sauerstoff-Transport-Mittel nach Anspruch 12, dadurch ge kennzeichnet, daß das Albumin Serumalbumin menschlichen, tierischen oder rekombinanten Ursprungs ist.

14. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin in einer Konzen tration zwischen 2 und 20 g/dL vorliegt.

15. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von dem Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat zu Albumin im Bereich von 1 : 10 bis 4 : 1 liegt.

16. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin vor Zugabe zu dem Konjugat in wäßriger Lösung mit Stickstoffmonoxid (NO) gesättigt vorliegt.

17. Sauerstoff-Transport-Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel als wäßrige Lösung oder als Lyophilisat vorliegt.

18. Verfahren zur Herstellung eines Sauerstoff-Transport-Mittels enthaltend ein Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugat, da durch gekennzeichnet, daß man die reduzierenden Endgruppen von Hydroxyethylstärke zunächst oxidiert und anschließend Hämoglobin über freie Aminogruppen mittels Amidbindungen an die oxidierten Endgruppen der Hydroxyethylstärke koppelt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxidation der reduzierenden Endgruppen der Hydroxyethyl stärke durchführt, indem man Hydroxyethylstärke zunächst mit einer Iod enthaltenden Lösung vermischt und danach Kaliumhy droxyd-Lösung zugibt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Verknüpfung der freien Aminogrup pen des Hämoglobins mit den in oxidierter Form vorliegenden reduzierenden Endgruppen der Hydroxyethylstärke durchführt, indem man die Einzelkomponenten bei 40°C vermischt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch ge kennzeichnet, daß das Hämoglobin menschlichen, tierischen oder rekombinanten Ursprungs ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch ge kennzeichnet, daß das Hämoglobin bovinen Ursprungs ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch ge kennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopplung an die Hydroxyethylstärke als Desoxy-Hämoglobin vorliegt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch ge kennzeichnet, daß das Hämoglobin vor der Kopplung an die Hydroxyethylstärke als Mischung von Desoxy-Hämoglobin und Oxy-Hämoglobin vorliegt, wobei der Anteil von Desoxy-Hämo globin 50 bis 80% und der Anteil von Oxy-Hämoglobin 20 bis 50% beträgt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch ge kennzeichnet, daß das Hämoglobin vernetztes und/oder poly merisiertes Hämoglobin ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch ge kennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein mittleres Mole kulargewicht von 5 bis 40 kDa, einen molaren Substitutions grad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis von C₂:C₆-Substitu tion im Bereich von 2 bis 20, jeweils bezogen auf die Hy droxyethylgruppen, aufweist.

27. Verwendung eines Sauerstoff-Transport-Mittels nach den An sprüchen 1 bis 17 oder hergestellt nach den Ansprüchen 18 bis 25 als Blutersatzstoff, Plasma-Expander, Perfusionsmit tel, Hämodilutionsmittel und/oder kardioplegische Lösung.