DE3525272A1

DE3525272A1 - Verfahren zur herstellung vernetzter haemoglobin-praeparate mit enger molekulargewichtsverteilung

Info

Publication number: DE3525272A1
Application number: DE19853525272
Authority: DE
Inventors: Norbert Dr Kothe; Hans Dr Baeumert; Bertram Dr Eichentopf
Original assignee: Biotest Pharma GmbH
Current assignee: Biotest Pharma GmbH
Priority date: 1985-07-16
Filing date: 1985-07-16
Publication date: 1987-01-29

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hämoglobin-Präparationen, in denen das Hämoglobin als Oligomeres vorliegt, wobei jedoch die Molekulargewichtsverteilung außerordentlich eng ist.

Seit einigen Jahrzehnten wird versucht, Hämoglobinlösungen als Sauerstoff-transportierenden Volumenersatz für den klinischen Einsatz zu entwickeln J. Appl. Physiology 1949, S. 469-489. Die zunächst verwendeten Erythrozytenhämolysate verursachten schwere Gerinnungsstörungen und Nierenschäden, die auf den Gehalt an Erythrozytenmembran-Bestandteilen (Stroma) zurückgeführt wurden.

Sogenannte stromafreie Hämoglobinlösungen, wie sie von Rabiner J. Exp. Medicine, 1967, S. 1127-1142, Bonhard DE-PS 22 48 475 und De Venuto J. Lab. Clin. Med. 1977, S. 509-516 beschrieben wurden, waren ebenfalls zur Infusion nicht geeignet. Das Hämoglobinmolekül mit einem Molekulargewicht von 64 500 D wird rasch durch die Niere ausgeschieden. Die im Tierexperiment bestimmte intravasale Halbwertszeit beträgt ca. 90 Minuten. In der Folge wurde deshalb versucht, das Hämoglobinmolekül zu vergrößern, um eine Filtration durch die Niere zu verhindern. Verschiedene Wege wurden eingeschlagen, um dieses Ziel zu erreichen:

1. Verknüpfung von Hämoglobin mit anderen makromolekularen Polymeren wie Dextran (Chang, J.E., et al., Can, J. Biochem. 55, 398 (1977)), Hydroxyäthylstärke (DE-OS 26 16 086), Gelatine (DE-PS 24 49 885), Albumin (DE-AS 24 49 885) und Polyethylenglykol (DE-OS 30 26 398).

2. Verknüpfung der Hämoglobinmoleküle untereinander durch bifunktionelle Regenzien, wie z. B. Glutardialdehyd, Divinylsulfon, Hexamethylendiisocycanat, Dimethylsuberimidat, die sämtlich Aminogruppen-spezifisch sind (US-PS 40 01 401; DE-PS 24 49 885).

Alle dieses vernetzten Präparate weisen zwar eine verlängerte Halbwertszeit auf, sind jedoch mit verschiedenen anderen Nachteilen behaftet.

Bei der Verknüpfung der Hämoglobinmoleküle untereinander oder mit anderen Makromolekülen durch bifunktionelle, Aminogruppen- spezifische Reagenzien entstehen wegen der Vielzahl der möglichen Bindungsstellen (Aminogruppen) am Hämoglobin keine einheitlichen Molekulargewichte, sondern polydisperse Systeme mit breiten Molekulargewichtsverteilungen. Neben intramolekular modifizierten, unvernetzten Molekülen entstehen nebeneinander sämtliche Verknüpfungsformen von Dimer- bis zu Polymer-vernetzten Molekülen. Die einzelnen Fraktionen eines solchen Präparats weisen unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der intravasalen Verweildauer, der O₂-Transportkapazität, der Viskosität und der Verträglichkeit auf.

Außerdem haben diese Hämoglobinlösungen durchweg eine zu hohe O₂-Affinität, was sich negativ auf die Sauerstoffversorgung der Gewebe auswirkt. Wünschenswert wäre eine Lösung mit möglichst enger Molekulargewichtsverteilung und einem möglichst physiologischen Sauerstofftransport (Halbsättigungsdruck: P50 = 25-30 Torr).

Eine Lösung, die dieser Forderung nahe kommt und den letzten Stand in der Entwicklungsreihe von Hämoglobinlösungen darstellt, ist in der DE-PS 31 44 705 beschrieben. Obwohl es sich auch hierbei um eine mit Glutardialdehyd vernetzte Hb-Lösung handelt, ist es gelungen, den P50-Wert deutlich zu erhöhen und die Molekulargewichtsverteilung durch einen Fraktionierschritt einzuengen.

Dennoch hat auch diese Lösung noch gewisse Nachteile. So ist die Molekulargewichtsverteilung immer noch nicht so eng, wie es wünschenswert wäre. Dies hat zur Folge, daß durch die höher vernetzten Anteile der Lösung die Viskosität überproportional gesteigert wird, so daß die Gesamt-Hb-Konzentration auf ca. 8,5% beschränkt werden muß, damit die Gesamtviskosität der Lösung im physiologischen Bereich bleibt. Diese geringere Hb-Konzentration geht zu Lasten der Sauerstofftransportkapazität. Außerdem ist eine solche Lösung hyponkotisch, so daß zur Erreichung des physiologischen kolloidosmotischen Druckes ein anderes Kolloid zugesetzt werden muß. Die zur Einengung des Molekulargewichts notwendige Fraktionierung hat den Nachteil, daß ein großer Teil des kostbaren Rohstoffs "Hämoglobin" verloren geht und so die Herstellung unwirtschaftlich wird.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Hämoglobinpräparat herzustellen, das aus vernetzten Hämoglobinmolekülen mit extrem enger Molekulargewichtsverteilung besteht, einen physiologischen Sauerstoffhalbsättigungsdruck (P50) aufweist, physiologische O₂-Transportkapazität bei gleichzeitig physiologischem onkotischem Druck und geringer Viskosität hat und in hoher Ausbeute wirtschaftlich herstellbar ist.

Dieses Ziel wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren gemäß Patentanspruch 1 erreicht. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Vernetzung erfolgt demnach so, daß Hämoglobinmoleküle gezielt (selektiv) miteinander vernetzt werden. Dies gelingt durch Einführung bestimmter Aminogruppen - spezifischer, reaktiver Gruppen in das Hämoglobin-Molekül, die entweder durch polyfunktionelle, gruppenspezifische Reagenzien miteinander verknüpft werden oder bei unterschiedlicher Modifizierung des Hämoglobins direkt miteinander reagieren und so zur Vernetzung führen.

Eine andere Möglichkeit der selektiven Verknüpfung zweier Hb- Moleküle besteht darin, bereits vorhandene, bevorzugte Bindungsstellen, wie z. B. die Effektorbindungsstellen, zu benutzen. Durch Kopplung von zwei Effektormolekülen und Umsetzung dieses bifunktionellen Moleküls mit Hämoglobin kommt es ebenfalls zur gezielten Vernetzung.

Als zur Vernetzung befähigte reaktive Gruppen, die nach der Modifizierung der Aminogruppen des Hämoglobin-Moleküls entstehen, kommen z. B. folgende in Frage: SH-Gruppen können beispielsweise mit Hilfe folgender Verbindungen in ein Hämoglobinmolekül eingeführt werden:

Aus den nachstehenden Verbindungen werden SH-Gruppen durch reduktive Spaltung freigesetzt:

Die Einführung der Halogenacetylgruppe kann durch aktivierte Halogenessigsäure erfolgen; zum Beispiel durch:

Als polyfunktionelles Vernetzungsmittel im Falle von gleichartig SH-modifiziertem Hämoglobin finden z. B. die folgenden Verbindungen Verwendung: R : aliphatische Ketten mit und ohne Heteroatome, und Aromaten.

Im Falle der Nutzbarmachung der im Hämoglobin-Molekül bereits vorhandenen, bevorzugten Bindungsstellen für ein Effektormolekül kann die Vernetzung z. B. über ein bifunktionelles Pyridoxalphosphat bewirkt werden:

Die Vernetzung von Hämoglobin, das mit halogenierten Acetylresten modifiziert ist, erfolgt z. B. über bifunktionelle SH- Gruppen-Reagenzien:

HS - R - SH

R: aliphatische Ketten mit und ohne Heteroatome, und Aromaten.

Andererseits kann das mit halogenierten Acetylresten modifizierte Hämoglobin direkt mit einem SH-Gruppen-modifizierten Hämoglobin verknüpft werden.

Ein entscheidendes Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die chemische Modifizierung des Hämoglobinmoleküls an seinen Aminogruppen in quantitativer Hinsicht gezielt vorgenommen wird, d. h, daß nur so viel Aminogruppen modifiziert werden, daß die Vernetzung zwischen den Hämoglobinmolekülen weder zu schwach noch zu stark ausfällt, sondern statistisch auf Hämoglobin-Dimere hinausläuft. Erreicht wird diese enge Molekulargewichtsverteilung durch geeignete Wahl der Mengen der Reaktionspartner und der Reaktionsbedingungen.

Für die Durchführung der Erfindung wird vorzugsweise eine gemäß DE-OS 31 30 770 oder gemäß DE-OS 34 12 144 hergestellte Hämoglobin-Lösung verwendet.

Für die Verwendung des erfindungsgemäß vernetzten Hämoglobins als Blutersatz ist es zweckmäßig, die (stromafreie) Hämoglobin- Lösung chemisch zu desoxygenieren, zur Verringerung der Sauerstoffaffinität mit einem Effektor zu versetzen, gegebenenfalls zur Fixierung des Effektors zu reduzieren und anschliessend gemäß der Erfindung zu vernetzen. Als Effektor wird vorzugsweise Pyridoxalphosphat und als Reduktionsmittel vorzugsweise Natriumborhydrid verwendet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Präparationen aus oligomerem Hämoglobin mit enger Molekulargewichtsverteilung, dadurch gekennzeichnet, daß man

A- eine Hämoglobin-Lösung mit einem Aminogruppen- spezifischen Reagenz umsetzt, welches die Aminogruppen des Hämoglobin-Moleküls chemisch derart modifiziert, daß das derart modifizierte Hämoglobin-Molekül zu intermolekularer Vernetzung befähigt ist, wobei man dieses Aminogruppen-spezifische Reagens in einer solchen Menge anwendet, daß nur eine definierte, beschränkte Anzahl der Aminogruppen des Hämoglobin-Moleküls modifiziert wird, worauf man das derart modifizierte Hämoglobin entweder
a- bei unterschiedlicher Modifizierung des Hämoglobin- Moleküls direkt vernetzt oder
b- bei gleichartiger oder unterschiedlicher Modifizierung des Hämoglobin-Moleküls mittels
eines polyfunktionellen Vernetzungsmittels vernetzt, oder
B- eine Hämoglobin-Lösung mit einem polyfunktionellen Reagenz umsetzt, welches bevorzugt nur mit bestimmten Aminogruppen des Hämoglobin-Moleküls reagiert, wobei dieses derart modifizierte Hämoglobin vernetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein die Aminogruppen des Hämoglobin-Moleküls modifizierendes Reagenz eine Verbindung verwendet, die eine SH-Gruppe in das Hämoglobin-Molekül einführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als ein anderes, die Aminogruppen des Hämoglobin- Moleküls modifizierendes Reagens eine Verbindung verwendet, die eine Gruppe in das Hämoglobin-Molekül einführt, welche befähigt ist, mit einer SH-Gruppe zu reagieren.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im Falle der Verwendung eines polyfunktionellen Vernetzungsmittels gemäß A-b) als das die Aminogruppen des Hämoglobin-Moleküls modifizierende Reagens eine Verbindung verwendet, die eine SH-Gruppe in das Hämoglobin- Molekül einführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als dieses polyfunktionelle Reagenz gemäß B), welches bevorzugt nur mit bestimmten Aminogruppen reagiert, ein dimeres Pyridoxalphosphatderivat verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man im Falle einer gleichartigen, zur Einführung von SH-Gruppen in das Hämoglobin-Molekül führenden Modifizierung als dieses polyfunktionelle Vernetzungsmittel ein bis-Maleinimid-Derivat verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im Falle gleichartiger Modifizierung gemäß A-b) als dieses Aminogruppen modifizierende Reagens ein aktiviertes Halogenacetyl-Derivat und als dieses polyfunktionelle Vernetzungsmittel eine bis-Merkaptoverbindung verwendet.