DE68901944T2 - Makromolekulare haemoglobinkomplexe, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen. - Google Patents

Makromolekulare haemoglobinkomplexe, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen.

Info

Publication number
DE68901944T2
DE68901944T2 DE8989401076T DE68901944T DE68901944T2 DE 68901944 T2 DE68901944 T2 DE 68901944T2 DE 8989401076 T DE8989401076 T DE 8989401076T DE 68901944 T DE68901944 T DE 68901944T DE 68901944 T2 DE68901944 T2 DE 68901944T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polymer
hemoglobin
groups
site
bond
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE8989401076T
Other languages
English (en)
Other versions
DE68901944D1 (de
Inventor
Edith Dellacherie
Michele Leonard
Daniel Sacco
Claude Vigneron
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Pasteur SA
Original Assignee
Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA filed Critical Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Publication of DE68901944D1 publication Critical patent/DE68901944D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE68901944T2 publication Critical patent/DE68901944T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6445—Haemoglobin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

  • Die Erfindung betrifft neue makromolekulare Konjugate, ihr Herstellungsverfahren und ihre Anwendungen für den Sauerstofftransport, vor allem bei Transfusionen.
  • Es ist bekannt, daß man intravenös eine wäßrige Hämoglobinlösung injizieren kann, die stromafrei und mit dem Blut isotonisch gemacht worden ist.
  • Einer der Nachteile des Hämoglobins ist jedoch, daß es nicht im Blutkreislauf bleibt, sondern aus dem Gefäßsystem heraus diffundiert, vor allem aufgrund seiner geringen Größe.
  • Um diesen Nachteil zu beheben, d.h. um die intravaskuläre Beständigkeit des freien Hämoglobins im Rahmen seiner Verwendung als "Substitut" des Blutes oder als gelöstes, Sauerstoff-transportierendes Füllmedium zu erhöhen, wurden verschiedene Verfahren angewandt.
  • Man hat beispielsweise das Hämoglobin an wasserlösliche Makromoleküle, frei von Toxizität, nicht antigenisch und hämokompatibel, fixiert.
  • Es gibt daher zahlreiche Beispiele für Hämoglobine, modifiziert durch die chemische Fixierung von wasserlöslichen Polymeren, die zeigen, daß die Verweilzeit des Hämoglobins im Organismus stark erhöht werden kann.
  • Unter den verschiedenen verwendeten Polymeren sind die gebräuchlichsten die Polysaccharide und vor allem Dextran (FR-PS 2 328 478), Hydroxyethylstärke (FR-PS 2 328 478), Inulin (EP-A 43 675) und die Polyalkylenglykole, vor allem Polyethylenglykol.
  • In allen Fällen jedoch besitzt das auf diese Weise durch direkte Fixierung dieser Polymere modifizierte Hämoglobin Sauerstoff-transportierende Eigenschaften, die schlecht einem Einsatz bei Bluttransfusion angepaßt sind.
  • Es sei daran erinnert, daß ein Blutsubstitut eine dem nativen intraerythrocytären Hämoglobin äquivalente Rolle nur in dem Maße spielen bzw. übernehmen kann, in dem die Kombination, die es mit dem Sauerstoff bildet, reversibel ist, d.h. daß es in der Lage ist, Sauerstoff zu fixieren (das Hämoglobin liegt dann in oxidierter Form vor), aber ebenfalls ist der Lage ist, den Sauerstoff leicht abzugeben (das Hämoglobin liegt dann in desoxidierter Form vor).
  • Diese Eigenschaft gegenüber dem Sauerstoff wird durch die Kurve (Barcroft-Kurve genannt) charakterisiert, die der Veränderung der Menge Sauerstoff entspricht, die je Masseneinheit des Transportmediums in Abhängigkeit vom Partialdruck des Sauerstoffs in der Atmosphäre, der das Hämoglobin ausgesetzt ist, zurückgehalten wird.
  • Im Falle einer wäßrigen Lösung von nativem Hämoglobin wird diese Veränderung wiedergegeben durch die Bezugskurve in Fig.1, dargestellt bei pH-Wert 7,2 bei 25ºC.
  • Einer der mit dieser Kurve verbundenen Parameter ist der Halbsättigungsdruck (P&sub5;&sub0;); dies ist der Partialdruck des Sauerstoffs, dem die Hämoglobinlösung unterworfen werden muß, damit sie eine Masse Sauerstoff absorbiert, die äquivalent ist 50% der maximalen Menge, mit der sie sich verbinden kann. Aber im Falle von modifiziertem Hämoglobin (Hämoglobin, gekuppelt an Polymere), wie oben angegeben, erfährt die Kurve der Fig.1, die den prozentualen Anteil des mit Hämoglobin unter vorbestimmten Sauerstoff-Partialdrücken kombinierten Sauerstoffs darstellt, eine Verschiebung nach links, bezogen auf die entsprechende Kurve für natives Hämoglobin.
  • Dies bedeutet, daß der Druck P&sub5;&sub0; des modifizierten Hämoglobins niedriger ist als derjenige des nativen Hämoglobins. Anders gesagt, das modifizierte Hämoglobin besitzt eine zu starke Affinität für Sauerstoff, was den Nachteil hat, daß gespülte Gewebe nicht schnell wieder mit Sauerstoff versorgt werden können.
  • Diese Modifizierung oder Änderungen der Sauerstoff-transportierenden Eigenschaften des modifizierten Hämoglobins läßt sich vor allem aus folgenden Gründen erklären:
  • - natives Hämoglobin unterliegt im roten Blutkörperchen dem Einfluß von 2,3-Diphosphoglycerat (2,3 DPG), das der natürliche intraerythrocytäre Effektor ist, der sich mit den Aminen der allosterischen Stelle des Desoxyhämoglobins verbindet, was die Affinität von Hämoglobin gegenüber Sauerstoff vermindert.
  • Es wurden Verbesserungen vorgeschlagen, um diesen Nachteil zu beheben, indem das Kuppeln zwischen den Polymeren und dem Hämoglobin in Gegenwart von temporären Effektoren (oder Liganden), wie 2,3-Diphosphoglycerat oder Inosit-hexaphosphat, und in vollständiger Abwesenheit von Sauerstoff durchgeführt wurde (FR-PS H 25516).
  • Diese polyphosphatierten Substanzen bilden in starkem Maße Komplexbindungen mit der allosterischen Stelle des Desoxyhämoglobins aus, stabilisieren dieses und schützen auf diese Weise die aminierten Stellen, die für den Vorgang des Sauerstofftransportes wesentlich sind.
  • Diese Effektoren werden aber eliminiert, entweder während der Reinigungsstufen der polymeren Hämoglobin-Konjugate des s oder im Plasma, wenn die Reinigung nicht zur Eliminierung der Effektoren geführt hat, aufgrund der dissoziativen Bedingungen des Plasmas.
  • Um diesen Nachteil zu beheben, wurde die Verwendung von permanenten Effektoren vorgeschlagen, beispielsweise durch Fixierung von 5'-Pyridoxylphosphat (Japan Kokai Tokkyo JP Nr.59 104 323).
  • Man hat ebenfalls vorgeschlagen, Liganden mit mehreren Phosphatgruppen zu verwenden, die nach der Fixierung an das Hämoglobin dessen Sauerstoffaffinität spürbar verringern.
  • Ein Nachteil dieser Verbindungen ist jedoch, daß zu ihrem Erhalt mehrere Arbeitsgänge am Hämoglobin notwendig sind, auf jeden Fall mehr als zwei, was zur Bildung von Abbauprodukten, vor allem von Methämoglobin, führt.
  • Es wurden weiterhin, in der FR-PS Nr. 2 600 894, makromolekulare Konjugate von Hämoglobin vorgeschlagen, die so groß sind, daß ihre extravaskuläre Diffundierbarkeit begrenzt und sogar aufgehoben ist, die gegen die dissoziativen Bedingungen des Plasmas geschützt sind, deren Sauerstoff-transportierende Eigenschaften nicht verschlechtert, sondern, bezogen auf diejenigen des freien Hämoglobins, verbessert sind und deren Herstellung die Anzahl Reaktionsstufen am Hämoglobin begrenzt.
  • Diese Verbindungen werden dahingehend beschrieben, daß sie durch ein zweistufiges Verfahren erhalten werden, nämlich Fixierung von Stellen Z mit anionischen Ladungen auf dem Polymeren P, und anschließende Reaktion zwischen dem Polymeren P mit den daran fixierten Stellen Z und dem Hämoglobin in Desoxyform in Abwesenheit von Sauerstoff.
  • Dieses Verfahren ist zwar einfacher als die bis dahin bekannten Verfahren, aber bei der Durchführung im technischen Maßstab können sich Schwierigkeiten ergeben, vor allem dann, wenn beträchtliche Volumina Lösungen von Desoxyhämoglobin eingesetzt werden, wobei die Schwierigkeit noch dadurch verstärkt wird, daß in Abwesenheit von Sauerstoff gearbeitet werden muß.
  • Die Anmelderin hat nun überraschenderweise ein neues Verfahren gefunden, das einerseits ermöglicht, einige der Konjugate, die Gegenstand der FR-PS Nr. 2 600 894 H sind, herzustellen und andererseits den Zugang des Fachmanns zu neuen Konjugaten erweitert, die gute Sauerstoff-transportierende Eigenschaften besitzen, die sie für eine in vivo-Verwendung als Blutsubstitut geeignet machen.
  • Es hat sich nämlich gezeigt, daß Kupplungskonjugate des Hämoglobins erhalten werden können, wenn das Hämoglobin in sauerstoffhaltiger bzw. oxidierter Form, d.h. als Oxyhämoglobin, eingesetzt und unter Bedingungen gearbeitet wird, die nicht die Abwesenheit von Sauerstoff einschließen.
  • Die Möglichkeit, makromolekulare Hämoglobin-Konjugate unter Verwendung von Oxyhämoglobin herzustellen, ist absolut überraschend und steht allen bekannten Gegebenheiten über die Konformation des Hämoglobin und den bis heute erzielten Ergebnissen entgegen.
  • In der Tat, unter Berücksichtigung der bekannten Daten der Konformation des Hämoglobins und vor allem der Tatsache, daß in der Desoxyform bestimmte Amine des Hämoglobins an der Verriegelung bzw. der Blockierung des Hämoglobins teilnehmen, indem nachfolgend definierte Salzbrücken errichtet werden, können diese an den Salzbrücken beteiligten Amine des Hämoglobins daher nicht leicht mit dem Polymeren reagieren. Wenn Desoxyhämoglobin und Polymeres in dem erhaltenen makromolekularen Hämoglobin-Konjugat gekuppelt sind, können diese Amine daher weiterhin den Übergang der Konformation Oxy - Desoxy des Hämoglobins sicherstellen. Außerdem besitzt das Desoxyhämoglobin eine Stelle (allosterische β-Stelle), die mit Aminfunktionen ausgekleidet ist, welche in der Lage sind, sich energisch mit Strukturen zu verbinden, die anionische Gruppen einschließen bzw. enthalten. Die Polymere, die anionische Ladungen tragen, werden daher vorzugsweise auf diesem Niveau reagieren und, wenn sie reaktionsfähige Funktionen, wie Carboxyl, Aldehyd oder OH, tragen, im Innern dieser Stelle reagieren, um Konjugate zu ergeben, bei denen das Desoxyhämoglobin stabilisert ist; liegt das Hämoglobin jedoch als Oxyhämoglobin vor, so existieren die Salzbrücken nicht mehr, und die entsprechenden Amine können daher mit dem Polymeren als solchem reagieren. Das Resultat dieser Kupplung führt zu Konjugaten, in denen das Hämoglobin schwer Sauerstoff abgibt, weil die durch das Polymere modifizierten Amine nicht mehr die Salzbrücken herstellen können, die die Desoxyform des Hämoglobins stabilisieren. Außerdem ist die Stelle β stark desorganisiert, und der Orientierungseffekt durch die anionischen Gruppen des Polymeren kann sich nicht mehr auswirken. Man erhält auf diese Weise Konjugate mit einem sehr niedrigen P&sub5;&sub0;.
  • Diese Hypothesen wurden durch die Ergebnisse bestätigt, die mit Polymeren erzielt wurden, welche enthalten
  • - Stellen Z mit anionischen Ladungen, bestehend aus Phosphaten und/oder Sulfaten und/oder Carboxylaten, und
  • - Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppen, die nicht auf den genannten Stellen Z gelegen sind,
  • und in denen die ionische Bindung zwischen dem Phosphat und/oder Sulfat und/oder Carboxylat der Stellen Z des Polymeren und dem Hämoglobin ausgebildet wird, und die kovalente Bindung zwischen den Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppen auf den Polymeren und dem Hämoglobin ausgebildet werden.
  • Werden solche Polymere mit Oxyhämoglobin zur Reaktion gebracht, wird der P&sub5;&sub0; des makromolekularen Hämoglobin-Konjugats niedriger als derjenige des nativen Hämoglobins.
  • Ergebnisse, erzielt mit Polymeren, die Carboxylgruppen enthalten, welche
  • - einerseits in Carboxylatform als anionische Ladungen dienen, die die ionischen Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin herstellen,
  • - und andererseits an der Ausbilding der kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin teilnehmen, bei denen aber die Carboxylgruppen, die an den kovalenten Bindungen beteiligt sind, sich nicht auf den Stellen Z befinden, die die Carboxylate tragen, welche die ionischen Bindungen herstellen, haben bewiesen, daß die ausgehend von Oxyhämoglobin hergestellten Hämoglobin-Konjugate einen P&sub5;&sub0; aufweisen, der unter demjenigen von freiem Hämoglobin liegt, mit anderen Worten, solche Hämoglobin-Konjugate besitzen keine interessanten Sauerstoff-transportierenden Eigenschaften (vgl. Preparative Biochemistry 14(4), 313-329 (1984).
  • Die Möglichkeit, Hämoglobin-Konjugate, die interessante Sauerstofftransport-Eigenschaften aufweisen, ausgehend von Oxyhämoglobin, herzustellen, wird nun mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt.
  • Es wurden außerdem bereits makromolekulare Hämoglobin-Konjugate vorgeschlagen, bei denen
  • - die ionische Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin, zwischen den Stellen Z des Polymeren, die anionische Ladungen tragen, und dem Hämoglobin ausgebildet ist, und
  • - die kovalente Bindung ausgebildet ist
  • . entweder zwischen den Stellen Z des Polymeren und dem Hämoglobin,
  • . oder zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin, vorbehaltlich von Bedingungen zwischen der Beschaffenheit der anionischen Ladung, der Anzahl der anionischen Ladungen und der Anzahl der Monomeren.
  • Es wurde nun überraschend festgestellt, daß mindestens eine anionische Ladung je Polymer ausreicht, vorausgesetzt, daß die anionische Ladung und die Funktion, die die kovalente Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ausbilden kann, auf der gleichen Stelle Z gelegen sind.
  • Eines der Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem leicht makromolekulare Konjugate erhalten werden können, die physiologisch verträglich und in der Lage sind, Sauerstoff-reversibel zu binden.
  • Eines der Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem makromolekulare Konjugate leicht erhalten werden können, die in der Lage sind, die Sauerstoffversorgung leichter zu bewirken als freies Hämoglobin.
  • Eines der Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem leicht zu synthetisierende makromolekulare Konjugate in technischem Maßstab erhalten werden können.
  • Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem makromolekulare Hämoglobin-Konjugate in höchstens zwei Stufen und allgemein nur einer einzigen Stufe am Hämoglobin erhalten werden können.
  • Eines der weiteren Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem leicht beträchtliche Volumina von wäßrigen Lösungen erhalten werden, die makromolekulare Hämoglobin-Konjugate enthalten, die als Blutsubstitut eingesetzt werden können, vor allem bei Eingriffen, die Transfusionen oder Organperfusion erfordern.
  • Eines der anderen Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem auf einfache Weise Lösungen von Hämoglobin erhalten werden können, dessen Sauerstofftransport-Eigenschaften, angezeigt durch eine Erhöhung des P&sub5;&sub0; in vitro, bezogen auf freies Hämoglobin, in vivo beständig bzw. stabil bleiben.
  • Eines der weiteren Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, mit dem leicht makromolekulare Hämoglobin-Verbindungen erhalten werden können, die gleichzeitig eine mäßige Sauerstoffaffinität sowie ein erhöhtes hydrodynamisches Volumen aufweisen, was bei Transfusionsversuchen zur Erhöhung der intravaskulären Beständigkeit des Hämoglobins durch Unterdrückung der Hämoglobinurie führt.
  • Eines der weiteren Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens, das die leichte Herstellung von makromolekularen Hämoglobin- Konjugaten ermöglicht, die ausgezeichnete Sauerstofftransport-Eigenschaften, angezeigt durch eine Erhöhung des P&sub5;&sub0; in vitro, bezogen auf freies Hämoglobin, aufweisen, bei denen das eingesetzte Polymer in Gegenwart von Hämoglobin, jedoch nicht unter Kupplungsbedingungen mit Hämoglobin, nicht zwangsläufig eine Erhöhung des P&sub5;&sub0;, bezogen auf freies Hämoglobin, bedingt.
  • Eines der Ziele der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen makromolekularen Konjugaten, die ausgezeichnete Sauerstofftransport-Eigenschaften aufweisen, angezeigt durch eine Erhöhung des P&sub5;&sub0; in vitro, und deren P&sub5;&sub0; in Korrelation zur Anzahl ionischer Bindungen, die zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ausgebildet sind, eingestellt bzw. angepaßt werden kann.
  • Das Verfahren zur Herstellung von makromolekularen wasserlöslichen Hämoglobin-Konjugaten, die während der Zeit, in der das makromolekulare Konjugat Sauerstoff-transportierende Funktionen im Plasma sicherstellen muß, nicht oder wenig biologisch abbaubar sind, und die für Sauerstoff eine geringere Affinität besitzen als das freie Hämoglobin ist dadurch gekennzeichnet, daß man
  • - in einer ersten Stufe Stellen Z auf einem Polymeren P fixiert in einem Verhältnis von mindestens eine Stelle Z je Polymerkette, wobei das Polymer P wasserlöslich, nicht-toxisch, vorzugsweise nicht-antigenisch, hämokompatibel ist, eine Molekularmasse von etwa 1000 bis etwa 500 000, vorzugsweise von etwa 1000 bis etwa 100 000, aufweist, eine oder mehrere polare Gruppen, vorzugsweise Hydroxyl-, Carbonsäure- oder Amingruppen, besitzt und die Stellen Z einerseits mindestens eine negative Ladung, getragen von Sulfat- und/oder Phosphat- und/oder Carboxylatgruppen, und zur Erzeugung einer ionischen Bindung mit dem Hämoglobin bestimmt, und andererseits mindestens eine Carbonsäure-, Aldehyd- oder OH-Gruppe, dazu bestimmt, eine kovalente Bindung mit Hämoglobin zu erzeugen, enthalten,
  • . entweder indem man eine Verbindung Z-Y verwendet, in der Y eine aktive oder mit Hilfe eines Aktivierungsmittels aktivierbare Funktion ist, wie Aldehyd, Carbonsäure, Amin, Hydroxyl oder Halogen, oder
  • . indem man Stellen Z auf das Polymer P radikalisch aufpfropft;
  • - daß man dann in einer zweiten Stufen das Polymer P, das die Stelle(n) Z enthält, mit Hämoglobin in oxidierter Form in einem nicht von Sauerstoff befreiten Medium unter solchen Bedingungen umsetzt, daß das Hämoglobin nicht denaturiert wird und nach dem Kuppeln mit dem Polymeren reversibel von der oxidierten in die desoxidierte Form übergehen kann, in wäßrigem Medium vom pH-Wert etwa 5 bis 9,
  • um einerseits mindestens eine ionische Bindung zwischen mindestens einer der Stellen Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin und andererseits mindestens eine kovalente Bindung zwischen der gleichen genannten Stelle Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin zu bilden,
  • - wenn die hier oben angegebene Reaktion gegebenenfalls zu Imingruppen führt, diese als Aminogruppen stabilisieren kann, beispielsweise durch Reduktion mit Hilfe von NaBH&sub4;, NaCNBH&sub3;, Dimethylaminoboran oder HCOOH.
  • Zur Vereinfachung und zur Klarstellung bedeutet im folgenden Text, wenn nicht anders angegeben, der Ausdruck "Stelle Z" die Stelle Z nach Fixierung auf dem Polymeren.
  • Das Adjektiv "carboxylat" wird vorangehend und nachfolgend verwendet, um die von einer Carboxylgruppe stammende anionische Ladung zu bezeichnen, die an der ionischen Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt ist, und das Adjektiv "carboxyl" wird verwendet, um die Funktion zu bezeichnen, die ebenfalls von einer Carboxylgruppe, aber von der vorhergehenden Verschiedenen stammt, die die kovalente Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ausbildet.
  • Das Adjektiv "carboxyl" umfaßt ebenfalls das ausgehend von zwei Carboxylgruppen gebildete Anhydrid.
  • Weiterhin kann die von einem Carboxylat stammende anionische Ladung ebenfalls von einer Anhydridfunktion herrühren.
  • Es wurde festgestellt, daß es möglich ist, Hämoglobin als Oxyhämoglobin einzusetzen unter Bedingungen, die nicht die Abwesenheit von Sauerstoff einschließen. Genauer gesagt, hat man festgestellt:
  • - daß es beispielsweise nicht nötig ist, im Handschuhkasten den Sauerstoff abzuspalten bzw. zu desoxygenieren und die Lösungen zu evakuieren, die zum Auflösen des Polymeren verwendet worden sind, wenn dieses nach der Fixierung der Stellen Z lyophilisiert worden ist;
  • - daß es ebenfalls nicht nötig ist, nach der Desoxygenierung der genannten Lösungen eine Spülung mit Stickstoff durchzuführen
  • - und daß es auch nicht nötig ist, das Hämoglobin mit den oben angegebenen Stufen zu behandeln, d.h. Desoxygenierung des Hämoglobins im Handschuhkasten, Evakuieren und Spülen mit Stickstoff, und daß es auch anschließend nicht nötig ist, in Abwesenheit von Sauerstoff zu arbeiten, um die Kupplung zwischen dem Polymeren und Hämoglobin zu bewirken.
  • Es wurde ebenfalls festgestellt, daß dieses Verfahren nur dann durchführbar ist, wenn die Stelle Z gleichzeitig
  • - anionische Gruppen, ausgewählt aus Sulfaten, Phosphaten und Carboxylaten, und
  • - Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppen
  • trägt.
  • Anders gesagt, dieses Verfahren ist nur dann durchführbar, wenn eine ionische Bindung und eine kovalente Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ausgebildet werden mit Hilfe mindestens einer gleichen Stelle Z, die die geeigneten Gruppen trägt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit nur dann anwendbar, wenn:
  • - eine ionische Bindung zwischen einer Phosphat-, Sulfat- oder Carboxylatgruppe auf einer Stelle Z des Polymeren und dem Hämoglobin ausgebildet wird
  • - und die genannte Stelle Z ebenfalls eine Aldehyd-, Carboxyl- oder OH-Gruppe trägt, die eine kovalente Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ausbildet.
  • Mit anderen Worten, das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht anwendbar auf Polymere, die
  • - einerseits Stellen Z enthalten, die eine anionische Gruppe, ausgewählt aus Sulfat, Phosphat, Carboxylat tragen,
  • - und andererseits Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppen, die nicht auf den genannten Stellen Z liegen bzw. angeordnet sind.
  • Mit anderen Worten, die Stelle Z umfaßt oder trägt vor der Fixierung auf dem Polymeren mindestens drei funktionelle Gruppen, die so beschaffen sind, daß
  • - eine der Funktionen eine Funktion ist, die die Bindung oder Fixierung der Gruppe Z an das Polymer ermöglicht,
  • - eine der Funktionen eine Sulfat-, Phosphat- oder Carboxylatfunktion bzw. -gruppe ist, die eine ionische Bindung mit einem Amin der allosterischen Stelle des Hämoglobins ausbilden kann,
  • - eine der Funktionen eine Aldehyd-, Carboxyl- oder OH-Funktion ist, die eine kovalente Bindung mit einer NH&sub2;-Gruppe des Hämoglobins bilden kann.
  • Als Aktivierungsmittel, das zur Aktivierung der Funktion Y der Verbindung Z-Y, von der vorstehend die Rede ist, verwendet wird, bezeichnet man beispielsweise diejenigen, die aus der Gruppe bestehend aus den Carbodiimiden oder Carbonyldiimidazol ausgewählt werden.
  • Wenn die Stelle Z durch radikalisches Aufpfropfen auf dem Polymeren fixiert wird, wird ein radikalischer Initiator verwendet, wie beispielsweise Cerammoniumnitrat oder -sulfat oder jedes andere Mittel, das freie Radikale auf der Polymerkette erzeugen kann (Azobisisobutyronitril, Peroxide usw.).
  • Bei einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind alle Stellen Z, die an den kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt sind, die gleichen wie die Stellen Z, die an den ionischen Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt sind.
  • Wenn beim erfindungsgemäßen Verfahren die polaren Gruppen des Polymeren ionisierbar und nicht alle an den Bindungen mit den Stellen Z beteiligt sind, werden diese polaren Gruppen vorzugsweise blockiert, um nachfolgende Wechselwirkungen mit den Plasmaproteinen in vivo zu vermeiden.
  • So können, wenn die polaren Gruppen Amine sind, diejenigen, die nicht an Bindungen mit den Stellen Z beteiligt sind, beispielsweise mit Essigsäureanhydrid blockiert werden.
  • Sind die polaren Gruppen Carboxylgruppen, so können diese beispielsweise mit Ethanolamin blockiert werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise unter solchen Bedingungen ausgeführt, daß die polaren Gruppen des Polymeren alle an den Bindungen mit den Stellen Z beteiligt sind; dies hat zur Folge, daß keine Blockierung mehr an den polaren Gruppen durchgeführt werden muß.
  • Diese Bedingungen bestehen vor allem darin, daß die Menge (Anzahl) an Stellen Z, die auf dem Polymeren fixiert sind, in Abhängigkeit von den polaren Gruppen des Polymeren geregelt wird.
  • Sind die polaren Gruppen nicht von vornherein auf dem Polymeren vorhanden, sondern müssen erst auf dem Polymeren fixiert werden, so kann die Menge bzw. Anzahl der polaren Gruppen, die man fixiert, ebenfalls so geregelt oder gesteuert werden, daß die Anzahl der auf dem Polymeren fixierten Stellen Z die erwünschte Anzahl ist, ohne daß darüber hinaus (restliche) polare Gruppen vorhanden sind, die nach der Fixierung der Stellen Z blockiert werden müssen.
  • Die Kontrolle der Anzahl Stellen Z kann sehr interessant insoweit sein, als sie in die Schwankung bzw. Veränderung von P&sub5;&sub0; über die Dichte der von der Stelle Z stammenden negativen Ladung eingreift.
  • Die Kontrolle der Fixierung der polaren Gruppen auf dem Polymer kann folgendermaßen erfolgen:
  • Im Falle von aminiertem Dextran kann die Anzahl Amingruppen moduliert werden, indem die vorausgehende Reaktion, bei der Epichlorhydrin mit Dextran in Gegenwart eines Katalysators umgesetzt wird, kontrolliert wird.
  • Diese Kontrolle kann erfolgen, indem man die Reaktionszeit variiert oder die Menge des Katalysators.
  • Die Kontrolle der Fixierung der Stellen Z auf den polaren Gruppen des Polymeren, wenn die polaren Gruppen bereits vorhanden oder auf dem Polymeren bereits fixiert sind, kann auf folgende Weise vorgenommen werden:
  • - entweder, indem man das Molverhältnis zwischen den oben definierten Verbindungen Z-Y und den polaren Gruppen des Polymeren variiert,
  • - oder indem man das Molverhältnis zwischen dem oben definierten Aktivierungsmittel und den polaren Gruppen des Polymeren variiert.
  • Werden die Gruppen Z auf radikalischem Wege aufgepfropft, so erfolgt die Kontrolle ihrer Fixierung, unabhängig von den polaren Gruppen, durch Modulieren der Menge an radikalischem Initiator, die im Verlauf der Pfropfreaktion eingesetzt wird.
  • Bezüglich der anionischen Ladung wurde festgestellt, daß mindestens eine anionische Ladung (sie kann Sulfat, Phosphat oder Carboxylat sein) je Stelle Z ausreicht und daß mindestens eine derartige Stelle Z je Polymer ausreicht.
  • Anders gesagt, man hat festgestellt, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf die Herstellung von Konjugaten anwendbar ist, die mindestens eine einzige anionische Gruppe und vor allem eine einzige anionische Gruppe je Polymer (die nicht an der kovalenten Kupplung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin teilnimmt) aufweisen, um zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin eine ionische Bindung auszubilden.
  • Es wurde festgestellt, daß eine notwendige Bedingung dafür, daß die erfindungsgemäß erhaltenen makromolekularen Konjugate wasserlöslich, frei von Toxizität, vorzugsweise nicht-antigenisch und hämokompatibel sind, darin liegt, daß die Polymeren P, die geeignet sind, an dem Aufbau der genannten makromolekularen Konjugate teilzunehmen, wasserlöslich, frei von Toxizität, vorzugsweise nicht-antigenisch und hämokompatibel sind.
  • Man hat festgestellt, daß die Anwesenheit von Stellen Z auf der Polymerkette, die anionische Gruppen tragen, welche die Rolle von permanenten Effektoren spielen, der Partialdruck erhöht, für den 50% des in Lösung vorhandenen Hämoglobins als Oxyhämoglobin vorliegt, ohne daß dies dem eventuellen Vorhandensein von freien Liganden zugeschrieben werden kann.
  • Diese permanenten Effektoren sind so beschaffen, daß sie ebenfalls dem Hämoglobin ermöglichen, reversibel von der Desoxyform in die Oxyform überzugehen mit einer stärkeren Stabilisierung der Konformation des Hämoglobinmoleküls in der Desoxyform, was eine Verringerung der Sauerstoffaffinität des Hämoglobins nach sich zieht.
  • Anders gesagt, diese Effektoren ermöglichen dem Hämoglobin, reversibel Sauerstoff zu transportieren und vor allem den Sauerstoff in den Geweben, die gespült werden, leicht abzugeben.
  • Die kovalente Bindung ist so beschaffen, daß sie dem mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen makromolekularen Konjugat eine Stabilität verleiht, die es im Plasmamedium während der Zeit, während der das makromolekulare Konjugat Sauerstofftransport-Funktionen sicherstellen muß, d.h. während 2 bis 3 Tagen, nicht oder wenig biologisch abbaubar macht, wodurch die extrarenale und extravaskuläre Diffusion des Hämoglobins unterdrückt bzw. ausgeschaltet wird.
  • In den erfindungsgemäß erhaltenen makromolekularen Konjugaten ist das Hämoglobin durch mindestens eine kovalente Bindung an das Polymer gebunden, aber jenseits einer kritischen Anzahl von kovalenten Bindungen zwischen den Polymeren und dem Hämoglobin, vor allem, wenn intramolekulare Vernetzung auftreten kann, schadet dies den Eigenschaften des Hämoglobins.
  • Diese kritische Anzahl kovalenter Bindungen entspricht der Tatsache, daß die mittlere Molekularmasse, als Gewicht, der makromolekularen Konjugate nach der Erfindung nicht größer als etwa 1 000 000 sein soll.
  • Die Polymeren, die am Aufbau der erfindungsgemäß erhaltenen makromolekularen Konjugate teilnehmen und die im Plasmamedium abgebaut werden, haben eine mittlere Molekularmasse, als Gewicht, von etwa 1000 bis 500 000.
  • Die Polymeren, die am Aufbau der erfindungsgemäß erhaltenen makromolekularen Konjugate teilnehmen und die nicht im Organismus abgebaut werden, müssen eine mittlere Molekularmasse, als Gewicht, gleich oder kleiner etwa 10 000 besitzen, weil oberhalb dieses Wertes die Polymeren die renale Barriere, d.h. die Nierenbarriere, schwer passieren und sich daher im Organismus akkumulieren.
  • Dies trifft vor allem für die Polyalkylenglykole, für Polyvinylpyrrolidon, Polymethylacrylat oder bestimmte Polysaccharide zu, die, da die nicht biologisch abbaubar sind, eine mittlere Molekularmasse, als Gewicht, von gleich oder kleiner etwa 10 000 aufweisen müssen.
  • Die Polymeren, die am Aufbau der erfindungsgemäß erhaltenen makromolekularen Konjugate beteiligt sind, müssen in einem Bereich des Molekulargewichts eingesetzt werden, in dem sie vorzugsweise nicht-antigenisch sind.
  • So muß, im Falle von Dextran, dessen Molekulargewicht unterhalb etwa 70 000 liegen.
  • Die erste Stufe bei der Herstellung der erfindungsgemäßen makromolekularen Konjugate, die darin besteht, daß man Stellen Z auf dem Polymeren fixiert, kann mit Hilfe bekannter Verfahren ausgeführt werden.
  • Die erste Stufe der Herstellung der erfindungsgemäßen makromolekularen Konjugate kann auch ausgeführt werden, indem Verbindungen vom Typ Z-Y verwendet werden, bei denen Y eine Aldehyd-, Carboxyl-, Amin-, Hydroxyl- oder Halogenfunktion ist. Diese Verbindungen Z-Y können eingesetzt werden, indem man von klassischen chemischen Arbeitsweisen Gebrauch macht. Man kann beispielsweise Benzolpenta- oder Hexacarbonsäure, 2,3-Diphosphorglycerinsäure, oder 5'-Pyridoxalphosphat auf ein zuvor polyaminiertes Polymer fixieren.
  • In diesem Falle müssen alle Spuren der Verbindung Z-Y entfernt werden, beispielsweise durch Entsalzen auf einer Gelfiltrationskolonne. Es muß nämlich das Vorhandensein von gegebenenfalls nicht umgesetzter Verbindung Z-Y vermieden werden, die, selbst in geringer Konzentration mit den erfindungsgemäßen makromolekularen Konjugaten, die Schlußfolgerungen bezüglich der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Konjugate verfälschen könnte.
  • Man kann auch von jedem anderen Verfahren Gebrauch machen, mit dem polyanionische Ketten auf einem Polymeren fixiert werden können, beispielsweise einem radikalischen Pfropfverfahren.
  • Die oben erwähnte zweite Stufe ist eine Stufe der Reaktion zwischen dem Polymeren und Hämoglobin und, wenn erforderlich, kann vor ihr eine Phase der Aktivierung des Polymeren stattfinden, bevor das Polymere mit dem Hämoglobin zur Reaktion gebracht wird. Diese Aktivierung kann aber praktisch gleichzeitig mit der Reaktion zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin erfolgen.
  • Im Verlauf der zweiten Stufe reagiert das Polymer mit dem Hämoglobin, und es bilden sich einerseits die ionischen Bindungen zwischen den Stellen Z des Polymeren und dem Hämoglobin und andererseits die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin.
  • Wenn Carboxylgruppen der Stellen Z an der kovalenten Bindung mit den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins beteiligt sind, kann man zur Aktivierung der Carboxylgruppen die klassischerweise in der Peptidsynthese verwendeten Reaktionspartner einsetzen, wie die wasserlöslichen Carbodiimide, vor allem N'-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-chlorhydrat (EDCI), N-Hydroxysuccinimid oder Ethyl-2-ethoxy-1-chinolin-carboxylat (EEDQ).
  • Die erhaltene Bindung ist dann eine Amidbindung.
  • Wenn die Aldehydgruppen der Stellen Z an der kovalenten Bindung mit den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins beteiligt sind, kann man beispielsweise von einer reduzierenden Aminierung Gebrauch machen.
  • Die reduzierende Aminierung eines Aldehyds besteht in der Bildung eines Imins durch Einwirkung eines Amins unter gleichzeitiger Reduktion des Imins zu Amin mit Hilfe eines Reduktionsmittels wie NaBH&sub4;, NaCNBH&sub3;, Dimethylaminoboran oder HCOOH.
  • Die erhaltene Bindung ist dann eine Aminbindung.
  • Wenn die Aldehydgruppen der Stellen Z an der kovalenten Bindung mit den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins beteiligt sind, kann man auch unter solchen Bedingungen arbeiten, daß die erhaltene Bindung eine Iminbindung ist, die dann in Amin stabilisiert werden kann durch Reduktion mit einem milden Reduktionsmittel, wie einem der oben genannten.
  • Wenn die Gruppen Z weder Aldehydgruppen noch Carboxylgruppen enthalten, sondern Hydroxylgruppen, von denen einige an benachbarte Kohlenstoffatome gebunden sind, kann man Aldehydgruppen bilden, beispielsweise durch periodische Oxidation, vor allem mit Hilfe von NaIO&sub4;.
  • Die zwischen diesen Aldehydgruppen und den Aminogruppen des Hämoglobins erzielte Bindung ist an eine Iminbindung, die durch Reduktion, beispielsweise mit NaBH&sub4;, in/als Amin stabilisiert werden kann.
  • Wenn die Stellen Z weder Aldehydgruppen noch Carboxylgruppen enthalten, sondern eine oder mehrere OH-Gruppen, können die Stellen Z mit NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins mit Hilfe eines geeigneten Reaktionspartners, wie Carbonyldiimidazol, zur Umsetzung gebracht werden. In diesem Falle ist die erhaltene Bindung eine Carbamatbindung -O- -NH-.
  • Die makromolekularen Hämoglobin-Konjugate, bei denen die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren Iminbindungen sind, können im Organismus nicht beständig bzw. stabil sein; deshalb muß die Iminfunktion bzw. -gruppe als Amin stabilisiert werden, beispielsweise durch Reduktion mit NaBH&sub4;, NaCNBH&sub3; oder Dimethylaminoboran.
  • Wenn die kovalenten Bindungen stabilisiert werden müssen, wird das Hämoglobin in keinem Falle mehr als zwei Reaktionsstufen unterworfen, und in den anderen Fällen mit oder ohne Aktivierung des Polymeren P wird das Hämoglobin nur einer Reaktionsstufe unterworfen; dies ist besonders vorteilhaft, weil die (auf höchstens zwei) begrenzte Anzahl Reaktionsstufen des Hämoglobins eine der wesentlichen Bedingungen dafür ist, daß zusätzlich zur Ausbeute der Reaktion das Hämoglobin nicht denaturiert wird.
  • Im Verlauf der zweiten Stufe ist es in der Tat wesentlich, daß das Hämoglobin bei der Bildung der erfindungsgemäßen makromolekularen Konjugats weder in wesentlichem Ausmaß denaturiert wird, noch daß eine spürbare Verminderung der relativen Mobilität der verschiedenen Teile, aus denen es besteht, eintritt, damit zumindest teilweise seine Sauerstofftransport-Eigenschaften erhalten bleiben.
  • Die zweite Reaktionsstufe findet in wäßrigem Medium statt, gepuffert oder nicht, bei einem pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9, gegebenenfalls in Gegenwart eines Aktivators, wie oben angegeben, während einer ausreichenden Zeitspanne, die vorzugsweise kürzer ist als die Zeitspanne oder -dauer, von der an eine beträchtliche Bildung von Methämoglobin (mehr als etwa 5%) stattfindet, bei einer Temperatur, die eine korrekte Konservierung des Hämoglobins sicherstellt.
  • Das wäßrige Medium wird mit den üblicherweise verwendeten Puffern gepuffert, um den pH auf den gewünschten Wert zu stabilisieren.
  • Die Reaktionsdauer beträgt etwa 30 min bis zu etwa 20 h und vorteilhafterweise etwa 1 h bis etwa 8 h bei einer Temperatur von etwa 3 bis etwa 30ºC.
  • Die Reaktionsdauer hängt vor allem von der Temperatur ab, bei der man arbeitet.
  • Das Hämoglobin wird als Oxyhämoglobin eingesetzt, und man verwendet vorteilhafterweise eine Lösung mit 10% Hämoglobin.
  • Das Verhältnis der molaren Konzentrationen von Polymer und Hämoglobin soll im übrigen so sein, daß der überwiegende Teil der Hämoglobinmoleküle kovalent mit dem polyanionischen Polymeren gebunden ist.
  • Beispelhaft kann angegeben werden, daß, wenn man bei einer Temperatur von etwa 3 bis 30ºC, gelöst in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 6,5, ein Gemisch aus polymerem Dextran, dessen mittlere Molekularmasse, als Gewicht, etwa 10 000 bis etwa 40 000 ausmacht, und Hämoglobin miteinander umsetzt und das Verhältnis der molaren Konzentrationen zwischen Dextran und Hämoglobin etwa 0,5 bis etwa 5 beträgt, man erfindungsgemäß makromolekulare Konjugate erhält, deren chromatographische Untersuchung, beispielsweise mittels Gelpermeation, zeigt, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden ist.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren so, daß sich keine ionische Bindung und keine kovalente Bindung woanders als zwischen den jeweiligen geeigneten Gruppen der Stellen Z des Polymeren und dem Hämoglobin ausbilden können.
  • Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Stellen Z auf dem Polymeren P so fixiert, daß die Beziehung zwischen Anzahl und Beschaffenheit der negativen Ladungen, die dazu bestimmt sind, eine ionische Bindung zwischen einer Stelle und dem Hämoglobin auszubilden (die nicht an der Bindung zwischen einer Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen einer Stelle und dem Hämoglobin beteiligt sind), die folgende ist:
  • - wenn jede Stelle Z eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Sulfat oder einem Phosphat, enthält, gibt es mindestens eine solche Stelle Z alle zehn Monomeren bzw. Monomereinheiten des Polymeren,
  • - wenn es sich um eine Stelle Z handelt, die mindestens zwei anionische Gruppen, bestehend aus Sulfaten und/oder Phosphaten, enthält, gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette,
  • - wenn jede Stelle Z anionische Ladungen enthält, die von Carboxylaten stammen, müssen mindestens zwei Carboxylatgruppen - nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt - auf einer selben Stelle Z und mindestens eine solche Stelle Z alls fünf Monomeren bzw. Monomereinheiten vorhanden sein,
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die mindestens drei negative Ladungen enthält, die von Carboxylaten stammen - nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt -, gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette.
  • Die Beziehung zwischen der Anzahl Stellen Z und den Monomeren bzw. Monomereinheiten ist statistisch insoweit, wenn beispielsweise angegeben ist, daß mindestens eine Stelle Z je Polymerkette vorhanden ist; dies bedeutet, daß bestimmte Polymerketten keinerlei Stelle Z enthalten können und dafür andere Ketten zwei Stellen aufweisen können, aber es ist natürlich klar, daß, um gegenüber dem Hämoglobin aktiv zu sein, eine Polymerkette mindestens eine Stelle Z enthalten muß.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Konjugaten dadurch gekennzeichnet, daß man die Stellen Z auf dem Polymeren P so fixiert, daß die Beziehung zwischen Anzahl und Beschaffenheit der zur Erzeugung einer ionischen Bindung zwischen einer Stelle und dem Hämoglobin bestimmten negativen Ladungen (nicht beteiligt an der Bindung zwischen einer Stelle und dem Polymeren und nicht beteiligt an der kovalenten Bindung zwischen einer Stelle und dem Polymeren) die folgende ist:
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe enthält, bestehend aus einem Sulfat oder einem Phosphat, so ist mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine Stelle Z alle elf Monomeren bzw. Monomereinheiten vorhanden.
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Carboxylat, enthält - nicht beteiligt an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht beteiligt an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin -, so ist mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette vorhanden,
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die zwei anionische Ladungen, von zwei Carboxylaten stammend, enthält - nicht beteiligt an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht bteiligt an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin -, so ist mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine solche Stelle Z alle sechs Monomeren bzw. Monomereinheiten vorhanden,
  • Die gemäß dieser Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Hämoglobin-Konjugate sind neu.
  • Gemäß einer (weiteren) vorteilhaften Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren P and dem Hämoglobin zwischen mindestens einer Carboxyl- oder Aldehyd- oder OH-Gruppe auf den Stellen Z und mindestens einem Amin des Hämoglobins, gelegen in der allosterischen Stelle des Hämoglobins, vor allem dem Amin, von mindestens einem der beiden β-terminalen Valine des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Salzbrücken zwischen den inneren NH&sub3;&spplus;- und COO&supmin;-Gruppen des Hämoglobins intakt, wenn das Hämoglobin als Desoxyhämoglobin vorliegt.
  • Als Salzbrücken bezeichnet man bestimmte intramolekulare Bindungen, die sich zwischen den NH&sub3;&spplus;-Ionen und den COO&supmin;-Anionen ausbilden, wenn das Hämoglobin als Desoxyhämoglobin vorliegt.
  • Die Salzbrücken in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen makromolekularen Konjugaten sollen vorzugsweise intakt sein, denn wenn die Ionen, die an der Bildung dieser Salzbrücken teilnehmen, an anderen Bindungen beteiligt werden, erfolgt der Übergang des Hämoglobins von der Oxyform zur Desoxyform sehr schwer und unvollständig.
  • Der Ausdruck "intakte Salzbrücken" bedeutet, daß mindestens 50% der Salzbrücken nicht verändert und daß vorteilhafterweise 80 bis 90%, sogar 100% Salzbrücken nicht verändert sind.
  • Die Kriterien, mit denen überprüft werden kann, ob die Salzbrücken intakt sind, sind vor allem folgende:
  • a) Sauerstoffaffinitätskurve: Wenn die Sauerstoffaffinitätskurve (Barcroft-Kurve) nach rechts verschoben ist, bezogen auf diejenige des freien Hämoglobins, bedeutet dies, daß die Salzbrücken nicht verändert bzw. modifiziert sind.
  • b) Hill-Koeffizient (n): Dieser Parameter drückt den sigmoiden Verlauf der Barcroft-Kurve aus und spiegelt den mehr oder weniger kooperativen Charakter der Fixierung des Sauerstoffs wider. Der Wert von n erlaubt es, die Dauerhaftigkeit des allosterischen Verhaltens des Hämoglobins zu bewerten. Im Falle von nativem Hämoglobin liegt dieser Koeffizient im Bereich von 2,7 bis 3,0.
  • c) Bohr-Effekt: Er besteht darin, daß man das Sauerstoff-transportierende Verhalten von Hämoglobin bei verschiedenen pH-Werten bestimmt; dies erlaubt die auf verschiedene Manipulationen folgenden Störungen abzuschätzen bzw. zu bewerten.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen makromolekularen Konjugate so beschaffen, daß die Polymeren aus den Polysacchariden, vor allem den Hydroxyalkylstärken, deren Alkylgruppe 2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, Inulin, Dextran und seinen Derivaten, vor allem dem aminierten Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylat und seinen Derivaten, Polypeptiden, Polyalkylenglykolen, deren Alkylengruppe 2 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, vor allem Polyethylenglykol und Polypropylenglykol, ausgewählt sind.
  • Die erfindungsgemäßerhaltenen Hämoglobin-Konjugate sind so beschaffen, daß die ionischen Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin zwischen den Phosphat-, Sulfat- oder Carboxylatgruppen der Stellen Z des Polymeren und den Amingruppen des Hämoglobins ausgebildet werden bzw. sind.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind die makromolekularen Konjugate so beschaffen, daß die ionischen Bindungen zwischen den Carboxylatgruppen der Stellen Z des Polymeren und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet sind.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung enthalten die Stellen Z OSO&sub3;H oder OPO&sub3;H&sub2;.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung stammen die Stellen Z von Pyridoxalsulfat, Epinephrindisulfat, Epinephrintrisulfat, Norepinephrindisulfat, Norepinephrintrisulfat, Phenolphthaleindisulfat.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung stammen die Stellen Z von Pyridoxalphosphat, Adenosintriphosphat, Phosphotyrosin, Phosphoserin, Inosithexaphosphat und seinen Derivaten, Inosittri-, -tetra-, oder -pentaphosphat und seinen Derivaten.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfassen die Stellen Z folgende Gruppen:
  • wobei n 1 bis 4 ist.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung stammt die Stelle Z von
  • - einer Carbonsäure, die mindestens eine Carboxylatgruppe auf der Hauptkette enthält, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Stelle Z beteiligt ist und nicht an der kovalenten Bindung zwischen der Stelle Z und dem Hämoglobin beteiligt ist,
  • - einer Benzolcarbonsäure, die mindestens eine Carboxylfunktion bzw. -gruppe enthält, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Stelle Z und nicht an der kovalenten Bindung zwischen der Stelle Z und dem Hämoglobin beteiligt ist,
  • - einer 2,3-Diphosphoglyceratgruppe,
  • - Citronensäure,
  • - 1,2,3-Propantricarboxylat
  • - oder Butan-tetracarboxylat.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung stammt Z von 2-Hydroxy-5-formyl-phosphoserin-benzamid der Formel
  • oder von 4-Formyl-phosphoserin-benzamid der Formel
  • Die Beschaffenheit der Bindung zwischen Z und dem Polymeren hängt von den vorhandenen Reaktionselementen (bzw. -gruppen) und den Reaktionsbedingungen ab.
  • Die Bindungen, die Z mit dem Polymeren verbinden, sind Ether-, Ester-, Amid- oder Aminbindungen.
  • Die Etherbindung wird durch radikalisches Aufpfropfen von Acrylsäure oder durch Einwirkung von Chlorbernsteinsäure auf die OH-Gruppen der Polymeren erhalten; die Amidbindung wird durch Reaktion zwischen den Carboxylatgruppen der Gruppen Z und den NH&sub2;-Gruppen der Polymeren erhalten; die Aminbindung wird durch Reaktion zwischen den Aldehydgruppen der Gruppen Z und den NH&sub2;-Gruppen der Polymeren und anschließende Reduktion erhalten. Diese letztere Reaktion kann auch gleichzeitig mit der ersten ausgeführt werden: reduzierende Aminierung.
  • Als Beispiel sei angegeben, daß die Esterbindung erhalten wird
  • . entweder durch Einwirkung der Carboxylgruppen einer Stelle Z in Anhydridform auf die OH-Gruppen eines Polymeren,
  • . oder durch Einwirkung einer Carboxylgruppe einer Stelle Z auf die OH-Gruppen eines Polymeren in Gegenwart von Kondensationsmitteln wie Carbodiimiden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Herstellungsverfahrens können die erfindungsgemäßen Konjugate, bei denen die Stellen Z über eine Esterbindung an das Polymer gebunden sind, auf folgende Weise erhalten werden:
  • - in einer ersten Stufe läßt man die Stellen Z, in denen die Carboxylgruppen in Anhydridform vorliegen, mit einem Polymeren, das OH-Gruppen enthält, in einem Medium reagieren, in dem das Polymer löslich ist, um die Stellen Z auf dem Polymeren zu fixieren;
  • - in einer zweiten Stufe läßt man das Polymer P mit der oder den Stellen Z mit Hämoglobin in Oxyform in einem nicht von Sauerstoff befreiten Medium unter solchen Bedingungen reagieren, daß das Hämoglobin nicht denaturiert wird und nach dem Kuppeln mit dem Polymeren reversibel von der Oxyform in die Desoxyform übergehen kann, in wäßrigem Medium mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis etwa 9, um einerseits mindestens eine ionische Bindung zwischen mindestens einer der Stellen Z des Polymeren und dem Hämoglobin und andererseits mindestens eine kovalente Bindung zwischen der gleichen genannten Stelle Z des Polymeren und dem Hämoglobin auszubilden.
  • Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Herstellungsverfahrens können die erfindungsgemäßen Konjugate, bei denen die Stellen Z über eine Esterbindung an das Polymer gebunden sind, auf folgende Weise erhalten werden:
  • - in einer ersten Stufe läßt man die Stellen Z mit den Carboxylgruppen auf ein Polymer mit OH-Gruppen einwirken, in Gegenwart eines Kondensationsmittels wie Carbodiimid, um die Stellen Z auf dem Polymeren zu fixieren;
  • - in einer zweiten Stufe läßt man das Polymer P mit der oder den Stellen Z mit Hämoglobin in Oxyform in einem nicht von Sauerstoff befreiten Medium unter solchen Bedingungen reagieren, daß das Hämoglobin nicht denaturiert wird und nach dem Kuppeln mit dem Polymeren reversibel von der Oxyform in die Desoxyform übergehen kann, in wäßrigem Medium mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9, um einerseits mindestens eine ionische Bindung zwischen mindestens einer der Stellen Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin und andererseits mindestens eine kovalente Bindung zwischen der gleichen Stelle Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin auszubilden.
  • Welche Carbodiimide eingesetzt werden, hängt von dem Medium ab, in dem das Polymer löslich ist. Ist das Polymer Polyethylenglykol, so kann ein in Wasser oder in einem organischen Medium lösliches Carbodiimid verwendet werden. Ist das Polymer Dextran mit der Voraussetzung, daß das Polymer ausschließlich in Wasser löslich ist, so ist das verwendete Carbodiimid vorteilhafterweise N'-Ethyl-N(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-chlorhydrat (EDCI).
  • Als Beispiel für Polymere, die OH-Gruppen enthalten, kann man nennen: Dextran, Polyethylenglykol.
  • Unter "Stelle Z, in der die Carboxylgruppen in Anhydrid vorliegen" werden sowohl die Stellen Z verstanden, die zwei Carboxylgruppen in Anhydridform (Monoanhydride) wie auch diejenigen, die eine gerade Anzahl Carboxylgruppen enthalten, bei denen jedes Paar Carboxylgruppen als Anhydrid vorhanden ist (Polyanhydride: beispielsweise Dianhydrid oder Trianhydrid).
  • Als Beispiel für Stellen Z, bei denen die Carboxylgruppen in Anhydridform vorliegen, kann man zusätlich zu den Polycarbonsäureanhydriden, wie Benzol-1,2,4,5-tetracarboxonsäure-dianhydrid, Benzol-1,2,4-tricarbonsäure-anhydrid auch Cyclobutan-1,2,3-4-tetracarbonsäure-dianhydrid, Benzophenontetracarbonsäure-dianhydrid und Aconitsäure-anhydrid nennen.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhafterweise als Stelle Z das Dianhydrid einer Polycarbonsäure eingesetzst, bei dem/der eine der Carbonsäuregruppen einer der Anhydridfunktionen bzw. -gruppen an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin teilnimmt und die anderen Carbonsäuregruppen (darunter diejenigen, die aus den Anhydridfunktionen stammen) zur Ausbilding der ionischen Bindung und der kovalenten Bindung zwischen der Stelle Z und dem Hämoglobin dienen.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhafterweise die Verbindung der Formel
  • oder die Verbindung der Formel
  • eingesetzt.
  • Ist das Polymer Dextran, so ist das Medium, in dem die erste Stufe durchgeführt wird, von der oben die Rede ist, Wasser.
  • Ist das Polymer Polyethylenglykol, so kann das Medium Wasser sein oder ein organisches Medium wie Dimethylformamid.
  • Die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin werden zwischen den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins und den Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppen auf den Stellen Z ausgebildet.
  • Die kovalente Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ist eine Amid-, Imin-, Amin- oder Carbamatbindung.
  • Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die kovalenten Bindungen zwischen den Carboxylgruppen der Stellen Z des Polymeren und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten, ausgehend von aminiertem Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 40 000, und von 2x10&supmin;&sup4; mol Benzolhexacarbonsäure je g Dextran,
  • - wobei die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzolpentacarboxylats ausgebildet werden, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzolhexacarbonsäure teilnehmen,
  • - und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzolpentacarbonsäure - gleichzeitig nicht an der Bindung zwischen der Benzolhexacarbonsäure und dem Polymeren und nicht an den oben definierten ionischen Bindungen beteiligt - und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten, ausgehend von aminiertem Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000, und von 3,5x10&supmin;&sup4; mol Benzolhexacarbonsäure je g Dextran,
  • - wobei die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des Benzolpentacarboxylats, fixiert auf dem Polymeren, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzolhexacarbonsäure teilnehmen, ausgebildet werden,
  • - und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carbonsäuregruppen der Benzolpentacarbonsäure - gleichzeitig nicht an der Bindung zwischen der Benzolhexacarbonsäure und dem Polymeren und nicht an den oben definierten ionischen Bindungen beteiligt - und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten, ausgehend von aminiertem Dextran und einer Molekularmasse von etwa 10 000, und von 3,2x10&supmin;&sup4; mol Benzoltetracarbonsäure je g Dextran,
  • - wobei die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzoltricarboxylats ausgebildet werden, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzoltetracarbonsäure beteiligt sind,
  • - und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzoltricarbonsäure - gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Benzoltetracarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt - und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten, ausgehend von aminiertem Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000, und von 4x10&supmin;&sup4; mol Butantetracarbonsäure je g Polymer,
  • - wobei die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Butantricarboxylats ausgebildet werden, die nicht an der Bildung zwischen dem Polymeren und der Butantetracarbonsäure beteiligt sind,
  • - und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Butantricarbonsäure - gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Butantetracarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt - und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten, ausgehend von monoaminiertem Monomethoxypolyoxyethylen mit einer Molekularmasse von etwa 5000, und von 1,5x10&supmin;&sup4; mol Benzolhexacarbonsäure je g Polymer,
  • - wobei die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzolpentacarboxylats ausgebildet werden, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzolhexacarbonsäure beteiligt sind,
  • - und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzolpentacarbonsäure - gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Benzolhexacarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt - und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten, ausgehend von Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000, und von 6,3x10&supmin;&sup4; mol Benzol- 1,2,4-tricarbonsäure je g Polymer,
  • - wobei die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppe des auf dem Polymeren fixierten Benzoldicarboxylats ausgebildet werden, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzol-1,2,4-tricarbonsäure beteiligt ist,
  • - und die kovalenten Bindungen zwischen der anderen Carbonsäuregruppe der Benzoldicarbonsäure - gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Benzol-1,2,4-tricarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt - und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten, ausgehend von Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000, und von 1,15x10&supmin;³ mol Benzol- 1,2,4,5-tetracarbonsäure je g Polymer, - wobei die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzoltricarboxylats ausgebildet werden, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure beteiligt sind,
  • - und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carbonsäuregruppen der Benzoltricarbonsäure - gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt - und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet werden.
  • Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen makromolekularen Konjugate besitzen den Vorteil, daß sie leicht synthetisiert werden, ohne oder fast ohne Bildung von Methämoglobin (weniger als 5%) und daß sie nur eine begrenzte Anzahl Reaktionen auf dem Hämoglobin benötigen, was dessen Denaturierung vermeidet.
  • Außerdem enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen makromolekularen Konjugate keine nicht-gebundenen Effektoren von geringer Molekularmasse, die bei den in vitro-Versuchen eine Zunahme von P&sub5;&sub0; nach sich ziehen, die aber leicht durch extrarenale oder extravaskuläre Diffusion im Verlauf der in vivo-Versuche eliminiert werden können und deren Wirkung schnell null wird.
  • Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen makromolekularen Konjugate besitzen den Vortiel einer nur mäßigen Sauerstoffaffinität und eines hohen hydrodynamischen Volumens, was während der Transfusionsmaßnahmen bzw. -vorgänge die intravaskuläre Beständigkeit des Hämoglobins durch Unterdrückung der Hämoglobinurie erhöht.
  • Die erfindungsgemäß hergestellten irreversibel an polyanionische Polymere gebunden Hämoglobin-Konjugate können, wenn sie in wäßrigen Lösungen geeigneter Zusammensetzung gelöst werden, die Rolle von Blutsubstituten übernehmen, vor allem bei Eingriffen, bei denen Transfusionen oder Organperfusion notwendig sind.
  • Die Erfindung betrifft infolgedessen auch die wäßrigen Lösungen, die die entsprechend den oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Konjugate enthalten und vor allem die Lösungen, die mit Blut isotonisch gemacht worden sind, beispielsweise mittels längerer Dialyse gegen eine Tyrode-Lösung (der Zusammensetzung NaCl 8 g/l; KCl 0,2 g/l; CaCl&sub2; 0,2 g/l; MgCl&sub2; 0,1 g/l; NaH&sub2;PO&sub4; 0,05 g/l; NaHCO&sub3; l g/l; D.-Glucose 1 g/l) und Konzentration durch Ultrafiltration bis zu einer Hämoglobin-Konzentration von 7%.
  • Präparate von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen makromolekularen Hämoglobin-Konjugaten wurden als potentielle Sauerstofftransportmedien untersucht. Es konnkte gezeigt werden, daß sie in der Tat in der Lage sind, Sauerstoff reversibel zu binden und vor allem ihn leichter als freies Hämoglobin zur Versorgung abzugeben, wie dies durch die Sauerstoffaffinitatskurven der in den folgenden Beispielen 1, 3 und 5 beschriebenen Produkte, wiedergegeben in Fig.5, die weiter unten kommentiert wird, gezeigt wird. Es zeigt sich nämlich, daß diese Präparate durch Halbsättigungsdrucke (P&sub5;&sub0;) charakterisiert sind, die sehr hoch sein können (900 bis 5000 Pa), während unter den gleichen Bedingungen (NaCl 0,05 M, pH 7, 25ºC) der entsprechende Druck des nativen Hämoglobins 480 Pa beträgt.
  • So können diese Verbindungen dazu verwendet werden, blutleer gemachten Geweben beträchtliche Sauerstoffmengen zuzuführen. Sie können ebenfalls bei Transfusionen eingesetzt und Patienten verabreicht werden in Form einer wäßrigen, mit Blut isotonisch eingestellten Lösung, in Gegenwart oder in Abwesenheit von Exzipientien. Die Verbindungen können auch in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Kryoprotektors lyophilisiert oder zerstäubt vor dem Gebrauch in Wasser wieder aufgelöst werden.
  • Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen makromolekularen Konjugate sind an Mäusen bezüglich der akuten Toxizität, wie nachfolgend angegeben, getestet worden.
  • Die verschiedenen, in den Beispielen beschriebenen polyanionischen Polymeren wurden Mäusen vom Stamm SWISS unter folgenden Bedingungen injiziert: Die Polymeren wurde in destilliertem Wasser auf eine Konzentration im Bereich von 2,5 bis 5 g/l gelöst, und der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt. 0,5 ml jeder Lösung wurden dann intraperitoneal 5 Mäusen injiziert, deren Verhalten anschließend während 7 Tagen beobachtet wurde. In diesen Versuchen konnten keinerlei Anzeichen akuter Toxizität festgestellt werden.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls neue makromolekulare Hämoglobin-Konjugate, die nicht oder wenig biologisch abbaubar sind während der Zeitspanne, während der das makromolekulare Konjugat die Sauerstofftransport-Funktionen im Plasma sicherstellen soll, die eine geringere Sauerstoffaffinität besitzen als freies Hämoglobin und die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie bestehen aus
  • - einerseits Hämoglobin, das reversibel von der Dexoxyform in die Oxyform übergehen kann,
  • - andererseits einem Polymeren P, wasserlöslich, nicht-toxisch, vorzugsweise nicht-antigenisch, hämokompatibel, mit einer Molekularmasse von etwa 1000 bis etwa 500 000, vorzugsweise von etwa 1000 bis etwa 100 000, das eine oder mehrere polare Gruppen trägt, vorzugsweise Hydroxyl-, Carboxyl- oder Amingruppen,
  • - wobei dieses Polymere Stellen Z trägt oder aufweist, die einerseits mindestens eine negative Ladung enthalten, die von mindestens einer Gruppe, ausgewählt aus den folgenden Gruppen Sulfat, Phosphat, Carboxylat, getragen wird und dazu bestimmt ist, eine ionische Bindung mit dem Polymeren auszubilden, und die andererseits mindestens eine Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppe enthält, die dazu bestimmt ist, eine kovalente Bindung mit dem Polymeren auszubilden,
  • - wobei das Polymere P an das Hämoglobin gebunden ist,
  • . einerseits mit Hilfe mindestens einer ionischen Bindung, die zwischen mindestens einer der negativen Ladungen der von dem Polymeren P getragenen Stellen Z und dem Hämoglobin ausgebildet ist, und
  • . andererseits mit Hilfe mindestens einer kovalenten Bindung, die zwischen mindestens einer der Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppen der oben genannten Stelle Z, getragen von dem Polymeren P, und dem Hämoglobin ausgebildet ist,
  • - wobei die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin so ist, daß das makromolekulare Konjugate eine mittlere Molekularmasse von etwa 70 000 bis etwa 1 000 000, vorzugsweise von etwa 70 000 bis etwa 500 000, aufweist und die Beziehung zwischen Anzahl und Beschaffenheit der negativen Ladungen, der Anzahl der Stellen und der Anzahl der Monomeren bzw. Monomereinheiten die folgende ist:
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Sulfat oder einem Phosphat, enthält, so ist mindestens eine Stelle Z je Polymerkette vorhanden und höchstens eine solche Stelle Z alle elf Monomeren bzw. Monomereinheiten,
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Carboxylat, enthält, die nicht an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt ist, so gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette,
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die zwei anionische Ladungen, von zwei Carboxylaten stammend, enthält, so gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine solche Stelle Z alle sechs Monomeren bzw. Monomereinheiten.
  • Diese Klasse von neuen makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung ist vor allem charakterisiert durch
  • - die Tatsache, daß mindestens eine der ionischen Bindungen und mindestens eine der kovalenten Bindungen, ausgehend von entsprechenden geeigneten, auf derselben Stelle Z gelegenen oder vorhandenen Gruppen, ausgebildet sind,
  • - und durch die Tatsache, daß es mindestens eine einzige Stelle Z, wie oben definiert, je Polymerkette gibt; mit anderen Worten, daß eine einzige Stelle Z, wie oben definiert, je Kette ausreicht.
  • Es wurde festgestellt, daß diese Klasse von neuen makromolekularen Konjugaten interessante Sauerstofftransport-Eigenschaften besitzt, während die makromolekularen Hämoglobin-Konjugate, bei denen die Bedingungen zwischen Beschaffenheit, Anzahl der anionischen Ladungen auf einer Stelle Z und der Anzahl Stellen Z je Polymerkette die gleichen sind, da sie sich von den oben definierten Konjugaten durch die Tatsache unterscheiden, daß die kovalente Bindung zwischen einer Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppe ausgebildet ist, die nicht auf der Stelle Z (die die anionische Gruppe umfaßt) gelegen ist, eine weniger oder nicht interessante Sauerstofftransport-Aktivität besitzen.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind alle Stellen Z, die an den kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt sind, die gleichen wie die Stellen Z, die an den ionischen Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt sind.
  • Eine vorteilhafte Klasse von makromolekularen Hämoglobin-Konjugaten nach der Erfindung besteht aus solchen, bei denen die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren P und dem Hämoglobin zwischen mindestens einer Carboxyl- oder Aldehyd- oder OH-Gruppe der Stellen Z und mindestens einer Amingruppe des Hämoglobins, gelegen in der allosterischen Stelle des Hämoglobins, vor allem dem Amin (bzw. der Amingruppe), von mindestens einer der beiden β-terminalen Valine des Hämoglobins ausgebildet wird.
  • Eine andere vorteilhafte Klasse von makromolekularen Hämoglobin-Konjugaten nach der Erfindung besteht aus solchen, bei denen die Salzbrücken zwischen den inneren NH&sub3;&spplus;-Gruppen und COO&supmin;-Gruppen des Hämoglobins intakt sind, während das Hämoglobin in der Deoxyform vorliegt.
  • Eine andere vorteilhafte Klasse von makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung besteht aus denjenigen, bei denen das Polymer P ausgewählt ist aus den Polysacchariden, vor allem Hydroxyalkylstärken, deren Alkylgruppe 2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, Inulin, Dextran und seinen Derivaten, vor allem dem aminierten Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylat und seinen Derivaten, Polypeptiden, Polyalkylglykolen, bei denen die Alkylengruppe 2 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, vor allem Polyethylenglykol und Polypropylenglykol.
  • Eine andere vorteilhafte Klasse von makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung besteht aus denjenigen, bei denen das Polymer P eine mittlere Molekularmasse kleiner oder gleich 70 000 aufweist, wenn es aus Dextran und seinen Derivaten besteht, und eine Molekularmasse kleiner oder gleich 10 000, wenn es aus den Polyalkylenglykolen, Polyvinylpyrrolidon oder Polymethacrylat ausgewählt ist.
  • Eine andere vorteilhafte Klasse von makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung besteht aus denjenigen, bei denen die Stelle Z über eine Ester-, Ether-, Amid- oder Aminfunktion bzw. -gruppe an das Polymer gebunden ist.
  • Eine andere vorteilhafte Klasse von makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung besteht aus denjenigen, bei denen die Stelle Z Gruppen OSO&sub3;H, OPO&sub3;H&sub2;, O-CH(COOH)&sub2;, -O-CH(COOH)-CH&sub2;-COOH,
  • enthält, wobei n im Bereich von 1 bis etwa 4 liegt, oder bei denen von Pyridoxalsulfat, Pyridoxylphosphat, Adenosintriphosphat, Phosphotyrosin, Phosphoserin, Inosithexaphosphat und seinen Derivaten, einer Polycarbonsäure mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Haupt, Benzolcarbonsäure mit mindestens drei Carbonsäuregruppen und 2,3-Diphosphoglycerat stammt.
  • Eine andere vorteilhafte Klasse von Verbindungen nach der Erfindung besteht aus denjenigen, bei denen sich keine ionische Bindung und keine kovalente Bindung irgendwo anders als zwischen den entsprechenden geeigneten Gruppen der Stellen Z des Polymeren und dem Hämoglobin ausbilden können.
  • Eine andere vorteilhafte Gruppe von makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung besteht aus denjenigen, bei denen die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin, ausgehend von den Carboxylgruppen der auf dem Polymeren fixierten Stellen Z und den NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins, ausgebildet sind.
  • Eine andere vorteilhafte Klasse von makromolekularen Konjugaten nach der Erfindung besteht aus denjenigen, bei denen die ionischen Bindungen zwischen den Polymeren P und dem Hämoglobin zwischen den Carboxylatgruppen der Stellen Z und dem Hämoglobin ausgebildet sind.
  • Alles was im Hinblick auf die, ausgehend von dem oben beschriebenen neuen Verfahren, erhaltenen makromolekularen Konjugate gesagt worden ist, gilt insbesondere (auch) für die erfindungsgemäßen makromolekularen Konjugate.
  • Die neuen makromolekularen Konjugate nach der Erfindung können entweder, ausgehend von einem Verfahren, bei dem Oxyhämoglobin eingesetzt wird, oder ausgehend von einem Verfahren, bei dem Dexoxyhämoglobin eingesetzt wird, erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen Hämoglobin-Konjugate können in folgender Weise erhalten werden:
  • - man fixiert in einer ersten Stufe Stellen Z mit ionischen Gruppen, die dazu bestimmt sind, eine ionische Bindung mit dem Hämoglobin auszubilden, auf einem Polymeren P in folgendem Verhältnis:
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Sulfat oder einem Phosphat, enthält, so ist mindestens eine Stelle Z je Polymerkette vorhanden und höchstens eine solche Stelle Z alle elf Monomeren bzw. Monomereinheiten,
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Carboxylat, enthält, die nicht an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt ist, so gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette,
  • - handelt es sich um eine Stelle Z, die zwei anionische Ladungen, von zwei Carboxylaten stammend, enthält, die nicht an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin beteiligt sind, so gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine solche Stelle Z alle sechs Monomeren bzw. Monomereinheiten, wobei das Polymer P wasserlöslich, nicht-toxisch, vorzugsweise nicht-antigenisch, hämokompatibel ist, eine Molekularmasse von etwa 1000 bis etwa 500 000, vorzugsweise von etwa 1000 bis etwa 100 000, aufweist, polare Gruppen, vorzugsweise Hydroxyl-, Carboxyl- oder Amingruppen, enthält sowie die Stellen Z, die einerseits mindestens eine negative Ladung, getragen von den Sulfat- und/oder Phosphat- und/oder Carboxylatgruppen, und andererseits mindestens eine Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppe enthalten,
  • . entweder indem man eine Verbindung Z-Y einsetzt, in der Y eine aktive oder aktivierbare Funktion, wie Aldehyd, Carboxyl, Amin, Hydroxyl oder Halogen, ist, oder
  • . indem man die Stellen Z auf das Polymer P aufpfropft;
  • - und dann in einer zweiten Stufe das Polymer P, das die Stelle(n) Z enthält, mit Hämoglobin in Oxyform in einem nicht von Sauerstoff befreiten Medium unter solchen Bedingungen umsetzt, daß das Hämoglobin nicht denaturiert wird, und nach dem Kuppeln mit dem Polymeren reversibel von der Oxyform in die Desoxyform übergehen kann, in wäßrigem Medium mit einem pH-Wert von 5 bis 9,
  • um einerseits mindestens eine ionische Bindung zwischen mindestens einer der Stellen Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin und andererseits mindestens eine kovalente Bindung zwischen der gleichen genannten Stelle Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin auszubilden,
  • - wenn die hier oben angegebene Reaktion gegebenenfalls zu Iminfunktionen bzw. -gruppen führt, können diese als Amingruppen stabilisiert werden, beispielsweise durch Reduktion mit NaBH&sub4;, NaCNBH&sub3;, Dimethylaminoboran oder HCOOH.
  • Die erfindungsgemäßen Konjugate können auch gemäß dem in der FR-PS Nr.H 2 600 894 beschriebenen Verfahren erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäß hergestellten irreversibel an polyanionische Polymere gebundenen Hämoglobin-Konjugate können, wenn sie in wäßrigen Lösungen geeigneter Zusammensetzung gelöst werden, die Rolle von Blutsubstituten übernehmen, vor allem bei Eingriffen, bei denen Transfusionen oder Organperfusion notwendig sind.
  • Die Erfindung betrifft infolgedessen auch die wäßrigen Lösungen, die die entsprechend den oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Konjugate enthalten und vor allem die Lösungen, die mit Blut isotonisch gemacht worden sind, beispielsweise mittels längerer Dialyse gegen eine Tyrode-Lösung (der Zusammensetzung NaCl 8 g/l; KCl 0,2 g/l; CaCl&sub2; 0,2 g/l; MgCl&sub2; 0,1 g/l; NaH&sub2;PO&sub4; 0,05 g/l; NaHCO&sub3; 1 g/l; D.-Glucose 1 g/l) und Konzentration durch Ultrafiltration bis zu einer Hämoglobin-Konzentration von 7%.
  • Präparate von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen makromolekularen Hämoglobin-Konjugaten wurden als potentielle Sauerstofftransportmedien untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sie in der Tat in der Lage sind, Sauerstoff reversibel zu binden und vor allem ihn leichter als freies Hämoglobin zur Versorgung abzugeben. Es zeigt sich nämlich, daß diese Präparate durch Halbsättigungsdrucke (P&sub5;&sub0;) charakterisiert sind, die sehr hoch sein können (900 bis 5000 Pa), während unter den gleichen Bedingungen (NaCl 0,05 M, pH 7, 25ºC) der entsprechende Druck des nativen Hämoglobins 430 Pa beträgt.
  • So können diese Verbindungen dazu verwendet werden, blutleer gemachten Geweben beträchtliche Sauerstoffmengen zuzuführen. Sie können ebenfalls bei Transfusionen eingesetzt und Patienten verabreicht werden in Form einer wäßrigen, mit Blut isotonisch eingestellten Lösung, in Gegenwart oder in Abwesenheit von Exzipientien. Die Verbindungen können auch in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Kryoprotektors lyophilisiert oder zerstäubt und vor dem Gebrauch in Wasser wieder aufgelöst werden.
  • Die makromolekularen Konjugate nach der Erfindung wurden bezüglich der akuten Toxizität getestet.
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
    • Beispiel 1: Synthese eines kovalenten Konjugats aus Hämoglobin und Dextran-benzolpentacarboxylat (Molekularmasse des Dextrans 40 000). Kuppeln mit Oxyhämoglobin.
  • Aminiertes Dextran, das 5x10&supmin;&sup4; mol NH&sub2; je g trockenes Produkt enthält (entsprechend 8 mol NH&sub2; je 100 mol Glucopyranose) wurde gemäß P.Hubert et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, 75, 3143 hergestellt durch Einwirkung von Ammoniak auf mit Epichlorhydrin aktiviertes Dextran.
  • 1 g dieses aminierten Dextrans wurden in 20 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit 0,1 n HCl auf 6,5 eingestellt. Dann wurden 1,7 g Benzolhexacarbonsäure und darauf 1 g N'-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidchlorhydrat (EDCI) zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 6,5 zurückgeführt und die Reaktion 3 Tage bei 20ºC weitergeführt. Nach Dialyse gegen eine 0,5 M Natriumacetatlösung wurde das Gemisch mit Essigsäureanhydrid behandelt, um die nicht substituierten Aminfunktionen bzw. -gruppen des Dextrans zu blockieren. Dann wurde die Lösung von den niedrigmolekularen Begleitstoffen gereinigt durch Entsalzen auf einer Ultrogel AcA 202-Kolonne (IBF-Frankreich) mit einem Phosphatpuffer 0,2 M, pH 7,2.
  • Nach längerer Dialyse gegen Wasser wurde die Lösung, die das polyanionische Polymer enthielt, lyophilisiert. Die Verbindung wurde im Vakuum kalt aufbewahrt.
  • Das erhaltene Dextran-polycarboxylat enthielt 2x10&supmin;&sup4; mol Benzol-pentacarboxylat (B.P.C.) je g Polymer.
  • 5 g dieses Dextran-polycarboxylats wurden in 250 ml 0,05 M NaCl gelöst. Der pH-Wert wurde mit 0,1 M Natronlauge auf 7 eingestellt, dann wurden 150 ml einer 10%igen Hämoglobin-Lösung zugegeben. Darauf wurden 600 mg N'-Ethyl- N-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid-chlorhydrat (EDCI) zugegeben und die Reaktion bei 20ºC 2 h lang fortgesetzt. Mit dem Chromatogramm, erhalten auf einer Ultrogel AcA 34-Kolonne (IBF Frankreich) wurde überprüft bzw. bestätigt, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden war. Der P&sub5;&sub0; des Konjugats betrug 2660 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2; freies Hb unter gleichen Bedingungen: P&sub5;&sub0; = 430 Pa).
    • Beispiel 2: Synthese eines kovalenten Konjugats aus Hämoglobin und Dextran-benzolpentacarboxylat (Molekularmasse des Dextrans 10 000). Kuppeln mit Oxyhämoglobin.
  • Das Polymer wurde ausgehend von einem aminierten Dextran hergestellt, das 4,10&supmin;&sup4; mol NH&sub2; je g trockenes Produkt enthielt und auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war.
  • 1 g dieses aminierten Dextrans wurde in 20 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt.
  • Darauf wurden 0,7 g Benzolhexacarbonsäure (B.H.C.) zugesetzt und dann 1 g N'-Ethyl-N-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid-chlorhydrat (EDCI). Die Reaktion wurde 1 Tag bei 20ºC durchgeführt. Nach Dialyse gegen eine 0,5 M Natriumacetat-Lösung wurde das Gemisch mit Essigsäure behandelt, um die nicht substituierten Amingruppen des Dextrans zu blockieren. Dann wurde die Lösung von den Begleitstoffen mit geringer Molekularmasse gereinigt, mittels Entsalzen auf einer Ultrogel AcA 202-Kolonne (IBF Frankreich) mit einem Phosphatpuffer 0,2 M, pH = 7,2. Mittels HPLC auf einer TSK G 3000 SW-Kolonne (LKB Frenkreich) wurde bestätigt, daß das Dextran-polycarboxylat vollständig von überflüssigem Benzolhexacarboxylat befreit worden war.
  • Nach längerer Dialyse gegen Wasser wurde die Lösung, die polyanionische Polymer enthielt, lyophilisiert. Die Verbindung wurde kalt unter Vakuum aufbewahrt. Das erhaltene Dextran-polycarboxylat enthielt 3,5x10&supmin;&sup4; mol B.P.C. je g Polymer.
  • 2,5 g Dextran-polycarboxylat wurden in 150 ml wäßrigem 0,05 M NaCl gelöst. Dann wurden 100 ml einer 10%igem Hämoglobin-Lösung zugegeben. Der pH-Wert wurde mit 0,1 n Natronlauge auf 7,5 eingestellt und das Ganze mit wäßrigem 0,05 M NaCl auf 300 ml aufgefüllt.
  • Darauf wurden 350 mg FDCI zugegeben und die Reaktion bei 20ºC 2 h forgeführt. Dann wurde überprüft, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden war, und zwar auf dem auf einer Kolonne TSK G 3000 SW (LKB Frankreich) erhaltenen Chromatogramm.
  • Fig.2 zeigt die optische Dichte in Abhängigkeit vom Elutionsvolumen und ermöglicht festzustellen, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden ist bzw. war. In dieser Figur entspricht Vo dem Ausschlußvolumen der Kolonne, und der Pfeil unter Hb entspricht dem Elutionsvolumen des freien Hämoglobins, d.h. dem nicht an Polymer gekuppelten Hämoglobin.
  • P&sub5;&sub0; des Konjugats betrug 2720 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2; freies Hb unter gleichen Bedingungen: P&sub5;&sub0; = 430 Pa).
    • Beispiel 3: Synthese eines kovalenten Konjugats aus Hämoglobin und Dextran-benzoltricarboxylat (Molekularmasse des Dextrans 10 000). Kuppeln mit Oxyhämoglobin.
  • Das Polymer wurde ausgehend von einem aminierten Dextran hergestellt, das 4x10&supmin;&sup4; mol NH&sub2; je g trockenes Polymer enthielt.
  • 1 g dieses aminierten Polymeren wurde in 20 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit 0,1 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Dann wurden 0,5 g Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure (B.T.C.) zugegeben und darauf 0,6 g EDCI. Die Reaktion wurde 1 Tag bei 20ºC fortgeführt. Die Lösung wurde dann wie in Beispiel 2 weiterbehandelt.
  • Das erhaltene Dextran-polycarboxylat enthielt 3,2x10&supmin;&sup4; mol Benzoltricarboxylat je g Polymer.
  • 0,5 g dieses Dextran-polycarboxylats wurden in 25 ml wäßrigem 0,05 M NaCl gelöst. Es wurden 10 mol einer 10%igen Hämoglobin-Lösung zugegeben. Der pH-Wert wurde mit 0,1 n Natronlauge auf 7,5 eingestellt und das Ganze mit wäßrigem 0,05 M NaCl auf 40 ml aufgefüllt.
  • Darauf wurden 50 mg EDCI zugegeben und die Reaktion bei 20ºC 2 h lang fortgeführt. Auf dem Chromatogramm, erhalten auf einer Kolonne TSK G 3000 SW (LKB Frankreich), wurde bestätigt, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden war. Fig.3 zeigt die optische Dichte in Abhängigkeit vom Elutionsvolumen und ermöglicht die Feststellung, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden ist bzw. war. In dieser Figur entspricht der Pfeil unter Vo dem Ausschlußvolumen der Kolonne, und der Pfeil unter Hb entspricht dem Elutionsvolumen des freien, d.h. nicht gekuppelt Hämoglobins.
  • P&sub5;&sub0; des Konjugats betrug 710 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2; freies Hb unter den gleichen Bedingungen, P&sub5;&sub0; = 430 Pa).
    • Beispiel 4: Synthese eines kovalenten Konjugats aus Hämoglobin und Dextran-butantricarboxylat (Molekularmasse des Dextrans 10 000). Kuppeln mit Oxyhämoglobin.
  • Das Polymer wurde in gleicher Weise wie in Beispfiel 3 hergestellt unter Verwendung von n-Butan-1,2,3,4-tetracarbonsäure (Bu.T.C.). Das erhaltene Dextran-polycarboxylat enthielt 4x10&supmin;&sup4; mol Butantricarboxylat je g Polymer.
  • 0,6 g dieses Dextran-polycarboxylats wurden in 25 ml wäßrigem 0,05 NaCl gelöst. Es wurden 10 ml einer 10%igem Hämoglobin-Lösung zugegeben. Der pH-Wert wurde mit 0,1 n Natronlauge auf 7,5 eingestellt und das Ganze mit wäßrigem 0,05 M NaCl auf 40 ml aufgefüllt.
  • Darauf wurden 70 mg EDCI zugesetzt und die Reaktion bei 20ºC während 2 h fortgeführt. Auf dem Chromatogramm, erhalten auf einer TSK G 3000 SW-Kolonne (LKB Frankreich), wurde bestätigt, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden war. Der P&sub5;&sub0; des erhaltenen Konjugats betrug 540 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2; freies Hämoglobin unter den gleichen Bedingungen, P&sub5;&sub0; = 430 Pa).
    • Beispiel 5: Synthese eines kovalenten Konjugats aus Hämoglobin und Monomethoxypolyoxyethylen-benzol-pentacarboxylat (Molekularmasse des Polyoxyethylens: 5000). Kuppeln mit Oxyhämoglobin.
  • Aminiertes Monomethoxypolyoxyethylen (MPOE-NH&sub2;, 2x10&supmin;&sup4; mol NH&sub2; je g trockenes Produkt) wurde gemäß M.LEONARD et al, Tetrahedron 1984, 40, 1581 durch Einwirkung von Thionylbromid auf MPOE und anschließende Substitution durch Ammoniak hergestellt.
  • 2 g dieses MPOE-NH&sub2; wurden in 50 ml Wasser gelöst und der pH-Wert auf 8 eingestellt. Darauf wurden 1,4 g Benzol-hexacarbonsäure (B.H.C.) zugegeben und anschließend 0,8 g N'-Ethyl-N-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimidchlorhydrat (EDCI). Man ließ die Reaktion eine Nacht bei Raumtemperatur weiterlaufen. Das Gemisch wurde dann mit wäßriger 1 HCl auf pH = 1 angesäuert. Das Polymer wurde mit Methylenchlorid extrahiert und dann mit wasserfreiem Ether ausgefällt.
  • Es wurde dann mittels Chromatographie auf einer Dowex-Kolonne und anschließend auf einer Ultrogel AcA 202-Kolonne (IBF, Frankreich) gereinigt. Das Eluat wurde gegen wäßrige Natronlauge (pH = 9) dialysiert; anschließend wurde das Polymer lyophilisiert.
  • 0,2 g dieses Polymeren, das etwa 1,5x10&supmin;&sup4; mol Benzol-pentacarboxylat (B.P.C.) je g Polymer enthielt, wurden in 10 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7 eingestellt, und es wurden 10 ml einer 10%igem Hämoglobin-Lösung und anschließend 10 mg EDCI zugesetzt. Nach 1-stündiger Reaktion wurde das Gemisch auf einer Ultrogel AcA 54-Kolonne (IBF, Frankreich) chromatographiert, um das Polymer-Hämoglobin-Konjugat zu reinigen. Fig.4 entspricht der Schwankung oder Änderung der optischen Dichte in Abhängigkeit vom Elutionsvolumen und ermöglicht die Feststellung, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden ist bzw. war. Vo entspricht dem Ausschußvolumen der Kolonne; der Pfeil unter Hb entspricht dem Elutionsvolumen des freien, d.h. nicht gekuppelten Hämoglobins, und der Pfeil unter MPOE-BPC entspricht dem Elutionsvolumen des nicht an Hämoglobin gebundenen Polymeren. Der P&sub5;&sub0; dieses Konjugats betrug 2400 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2; freies Hb unter den gleichen Bedingungen: P&sub5;&sub0; = 430 Pa).
    • Beispiel 6: Synthese eines kovalenten Konjugats aus Hämoglobin und Dextran-Benzoldicarboxylat (Molekularmasse des Dextrans 10 000: Esterbindung zwischen dem Dextran und der Polycarboxylatstelle). Kuppeln mit Oxyhämoglobin.
  • Das Dextran-Benzoldicarboxylat wurde hergestellt, indem 7,5 g Benzol-1,2,4- tricarbonsäureanhydrid mit 32 g Dextran in wäßrigem Medium bei pH 9 während 15 h umgesetzt wurden. Die Lösung wurde dann von restlicher Benzol-1,2,4- tricarbonsäure befreit durch Entsalzen oder Aussalzen auf einer Ultrogel AcA 202-Kolonne (IBF-Frankreich) mit einem Phosphatpuffer 0,2 M, pH = 7,2.
  • Nach längere Dialyse gegen Wasser wurde die Lösung, die das Polymer enthielt lyophilisiert. Das Dextran-polycarboxylat enthielt 6,3x10&supmin;&sup4; mol Benzoldicarboxylat (B.D.C.) je g Polymer. Dies entspricht etwa einer Stelle Z mit zwei anionischen Gruppen, bestehend aus zwei Carboxylatgruppen alle 10 Monomeren bzw. Monomereinheiten.
  • 11 g Dextran-polycarboxylat wurden in 250 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde auf 6,5 eingestellt, und es wurden 150 ml einer 10%igen Hämoglobin- Lösung zugegeben. Darauf wurden 160 mg N'-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid-chlorhydrat (EDCI) zugesetzt, und die Reaktion wurde bei 20ºC während 2 h weitergeführt.
  • Das erhaltene Hämoglobin-Konjugat ist ein neues Konjugat.
  • Das Gemisch wurde auf Ultrogel AcA 54 (IBF Frankreich) chromatographiert, um das freie Hämoglobin und die Verunreinigungen zu entfernen. Der P&sub5;&sub0; des gereinigten Konjugats betrug 870 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2; freies Hb unter den gleichen Bedingungen: P&sub5;&sub0; = 430 Pa).
    • Beispiel 7: Synthese eines kovalenten Konjugats aus Hämoglobin und Dextran-benzoltricarboxylat (Molekularmasse des Dextrans 10 000 - Esterbindung zwischen dem Dextran und der Polycarboxylatstelle). Kuppeln mit Oxyhämoglobin.
  • Das Dextran-benzoltricarboxylat wurde hergestellt, indem man 26 g Benzol- 1,2,4,5-tetracarbonsäure-dianhydrid mit 20 g Dextran in wäßrigem Medium vom pH-Wert 9 während 15 h miteinander reagieren ließ. Die Lösung wurde dann von restlicher Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure befreit durch Entsalzen auf einer Ultrogel AcA 202-Kolonne (IBF Frankreich) mit einem Phosphatpuffer 0,2 M, pH = 7,2.
  • Nach längerer Dialyse gegen Wasser wurde die Lösung, die das Polymer enthielt, lyophilisiert. Das Dextran-polycarboxylat enthielt 1,15x10&supmin;³ mol Benzoltricarboxylat (B.T.C.) je g Polymer.
  • 5 g Dextran-polycarboxylat wurden in 250 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, und es wurden 150 ml einer 10%igen Hämoglobin-Lösung zugegeben. Darauf wurden 120 mg N'-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid-chlorhydrat (EDCI) zugesetzt und die Reaktion bei 20ºC während 2 h fortgeführt.
  • Das Gemisch wurde auf Ultrogel AcA 54 (IBF Frankreich) chromatographiert, um freies Hämoglobin und die Verunreinigungen zu entfernen. Der P&sub5;&sub0; des gereinigten Konjugats betrug 2000 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2; freies Hb unter den gleichen Bedingungen: P&sub5;&sub0; = 430 Pa).
  • Man kann das hier oben definierte Konjugat auch mit Hilfe von Dextran und Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure in Gegenwart von wasserlöslichem Carbodiimid, wie N'-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-chlorhydrat (EDCI), herstellen.
    • Beispiel 8:
  • Es wurden entsprechend dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll folgende Konjugate hergestellt:
  • . aus Hämoglobin und Polyethylenglykol-benzolpentacarbonsäure
  • . aus Hämoglobin und Polyethylenglykol-benzoltetracarbonsäure
  • . aus Hämoglobin und Polyethylenglykol-benzoltricarbonsäure
  • . aus Hämoglobin und Polyethylenglykol-benzoldicarbonsäure.
    • Beispiel 9:
  • Gemäß dem in den Beispielen 6 und 7 beschriebenen Protokoll wurde das Konjugat aus Hämoglobin und Polyethylenglykol-benzoltricarbonsäure hergestellt.
  • Zur Herstellung der Polyethylenglykol-benzoltricarbonsäure ließ man Benzoltetracarbonsäure-dianhydrid mit Polyethylenglykol in organischem Medium, wie Dimethylformamid, reagieren. Die Lösung wurde dann von restlicher Benzoltetracarbonsäure befreit durch Entsalzen auf einer Ultrogel AcA 202-Kolonne (IBF Frankreich) mit einem Phosphatpuffer 0,2 M, pH = 7,2.
  • Nach längerer Dialyse gegen Wasser wurde die Lösung, die das Polymer enthielt, lyophilisiert.
  • Das Polyethylenglykol-polycarboxylat wurde in Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, und es wurde eine Hämoglobin-Lösung, beispielsweise von 10%, zugesetzt. Dann wurde N'-Ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid-chlorhydrat (EDCI) zugesetzt, und die Reaktion wurde bei 20ºC 2 h lang fortgeführt.
  • Das Gemisch wurde auf Ultrogel AcA 54 (IBF Frankreich) chromatographiert, um das freie Hämoglobin und die Verunreinigungen zu entfernen.
  • Entsprechend dem zuvor angegebenen Protokoll wurde auch das Konjugat aus Hämoglobin und Polyethylenglykol-benzoldicarbonsäure (mit Hilfe von Polyethylenglykol und Benzol-1,2,4-tricarbonsäure-anhydrid) hergestellt.
  • Man kann die Polyethylenglykol-benzolcarboxylate auch herstellen, indem man die Benzol-polycarbonsäuren mit den OH-Gruppen des Polymeren in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid/Dimethylaminopyridin in Dimethylformamid umsetzt.
    • Vergleichsbeispiel 1:
  • Dieses Beispiel hat zum Ziel, den erhaltenen P&sub5;&sub0; zu vergleichen, indem das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten angewandt wird, bei denen die kovalente Bindung zwischen einer Aldehydgruppe, die nicht von der Stelle Z getragen wird, auf der sich die anionische Phosphatgruppe befindet, ausgebildet wird.
  • Es wurde Dextranphosphat hergestellt, ausgehend von einem Ausgangsdextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000, das in Dinatriumphosphat, enthaltend 8% Phosphor, umgewandelt wurde, entsprechend dem in Beispiel 1 der FR-PS H 2 600 894 beschriebenen Protokoll.
  • Das Dextranphosphat wurde mit Natriumperiodat aktiviert, um 13 Aldehyde bzw. Aldehydgruppen auf 100 glucosidische Einheiten zu erhalten.
  • Dieses aldehydische Dextranphosphat wurde mit Hämoglobin in einem Masseverhältnis von 1,5 (Masse Dextran/Masse Hämoglobin) bei pH = 8 umgesetzt. Die Reaktion wurde nun bei 4ºC 24 h lang fortgeführt. Dann wurde eine 10&supmin;³n-Lösung aus NaBH&sub4; in NaOH zugesetzt. Das Gemisch wurde chromatographiert, umfestzustellen, daß kein freies Hämoglobin mehr vorhanden war (HPLC auf TSK G 3000 SW Beckman-Kolonne).
  • Wenn die Reaktion mit Desoxyhämoglobin entsprechend dem in der FR-PS H 2 600 894 beschriebenen Verfahren durchgeführt wurde, betrug der P&sub5;&sub0; des Hämoglobin-Konjugats 3380 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2).
  • Unter den gleichen Bedingungen betrug der P&sub5;&sub0; des freien Hämoglobins 450 Pa.
  • Wurde die Reaktion mit Oxyhämoglobin entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt, so lag der P&sub5;&sub0; des Hämoglobin-Konjugats bei 425 Pa (25ºC, Tris 0,05 M, pH = 7,2).
  • Unter den gleichen Bedingungen betrug der P&sub5;&sub0; des freien Hämoglobins 430 Pa.
  • Dieses Vergleichsbeispiel zeigt, daß das Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin-Konjugaten mit Hilfe von Oxyhämoglobin nicht anwendbar ist, wenn die kovalente Bindung, ausgehend von einer Aldehyd-(Carbonsäure- oder OH-) Gruppe ausgebildet wird, die nicht auf der Stelle Z fixiert ist, die die anionischen Ladungen trägt.

Claims (34)

1. Verfahren zur Herstellung von makromolekularen wasserlöslichen Hämoglobin-Konjugaten, die während der Zeit, in der das makromolekulare konjugat Sauerstoff-transportierende Funktionen im Plasma sicherstellen muß, nicht oder wenig biologisch abbaubar sind, und die für Sauerstoff eine geringere Affinität besitzen als das freie Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet, daß man
- in einer ersten Stufe Stellen Z auf einem Polymeren P fixiert in einem Verhältnis von mindestens eine Stelle Z je Polymerkette, wobei das Polymer P wasserlöslich, nicht-toxisch, vorzugsweise nicht-antigenisch, hämokompatibel ist, eine Molekularmasse von etwa 1000 bis etwa 500 000, vorzugsweise von etwa 1000 bis etwa 100 000, aufweist, eine oder mehrere polare Gruppen, vorzugsweise Hydroxyl-, Carbonsäure- oder Amingruppen, besitzt und die Stellen Z einerseits mindestens eine negative Ladung, getragen von Sulfat- und/oder Phosphat- und/oder Carboxylatgruppen, und zur Erzeugung einer ionischen Bindung mit dem Hämoglobin bestimmt, und andererseits mindestens eine Carbonsäure-, Aldehyd- oder OH-Gruppe, dazu bestimmt, eine kovalente Bindung mit Hämoglobin zu erzeugen, enthalten,
. entweder indem man eine Verbindung Z-Y verwendet, in der Y eine aktive oder mit Hilfe eines Aktivierungsmittels aktivierbare Funktion ist, wie Aldehyd, Carbonsäure, Amin, Hydroxyl oder Halogen, oder
. indem man Stellen Z auf das Polymer P radikalisch aufpfropft;
- daß man dann in einer zweiten Stufe das Polymer P, das die Stelle(n) Z enthält, mit Hämoglobin in oxidierter Form in einem nicht von Sauerstoff befreiten Medium unter solchen Bedingungen umsetzt, daß das Hämoglobin nicht denaturiert wird und nach dem Kuppeln mit dem Polymeren reversibel von der oxidierten in die desoxidierte Form übergehen kann, in wäßrigem Medium vom pH-Werte etwa 5 bis 9,
um einerseits mindestens eine ionische Bindung zwischen mindestens einer der Stellen Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin und andererseits mindestens eine kovalente Bindung zwischen der gleichen genannten Stelle Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin zu bilden,
- wenn die hier oben angegebene Reaktion gegebenenfalls zu Imingruppen führt, diese als Amingruppen stabilisieren kann, beispielsweise durch Reduktion mit Hilfe von NaBH&sub4;, NaCNBH&sub3;, Dimethylaminoboran oder HCOOH.
2. Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Konjugaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stellen Z auf dem Polymeren P so fixiert, daß die Beziehung zwischen Anzahl und Beschaffenheit der negativen Ladungen, die dazu bestimmt sind, eine ionische Bindung zwischen einer Stelle und dem Hämoglobin (die nicht an der Bindung zwischen einer Stelle und dem Polymeren teilnehmen und nicht an der kovalenten Bindung zwischen einer Stelle und dem Hämoglobin teilnehmen) die folgende ist:
- wenn jede Stelle Z eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Sulfat oder eine, Phosphat, enthält, gibt es alle zehn Monomer(einheiten) des Polymeren mindestens eine solche Stelle Z,
- wenn es sich um eine Stelle Z handelt, die mindestens zwei anionische Gruppen, bestehend aus Sulfaten und/oder Phosphaten, enthält, gibt es je Polymerkette mindestens eine solche Stelle Z,
- wenn jede Stelle Z von Carboxylaten stammende anionische Ladungen enthält, müssen mindestens zwei Carboxylatgruppen auf einer selben Stelle Z und mindestens eine solche Stelle Z alle fünf Monomer(einheiten) vorhanden sein,
- wenn mindestens eine der Stellen Z mindestens drei von Carboxylaten stammende negative Ladungen enthält, ist mindestens eine solche Stelle je Polymerkette vorhanden.
3. Verfahren zur Herstellung von makromolekularen Konjugaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stellen Z auf dem Polymeren P so fixiert, daß die Beziehung zwischen Anzahl und Beschaffenheit der zur Erzeugung einer ionischen Bindung zwischen einer Stelle und dem Hämoglobin bestimmten negativen Ladungen (die nicht an der Bindung zwischen einer Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen einer Stelle und dem Hämoglobin teilnehmen) die folgende ist:
- wenn es sich um eine Stelle Z handelt, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Sulfat oder einem Phosphat, enthält, ist mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine Stelle Z alle elf Monomer(einheiten) vorhanden,
- wenn es sich um eine Stelle Z handelt, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Carboxylat, enthält, die nicht an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin teilnimmt, ist mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette vorhanden,
- wenn es sich um eine Stelle Z handelt, die zwei anionische Ladungen enthält, die von zwei Carboxylaten stammen, die nicht an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin teilnehmen, ist mindestens eine Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine solche Stelle Z alle sechs Monomer(einheiten) vorhanden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren P und dem Hämoglobin zwischen mindestens einer Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppe der Stellen Z und mindestens einem Amin des Hämoglobins, gelegen in der allosterischen Stelle des Hämoglobins, wenn dieses in desoxidierter Form vorliegt, vor allem dem Amin von mindestens einem der beiden β-terminalen Valine des Hämoglobins hergestellt werden.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzbrücken zwischen den inneren NH&spplus;&sub3;- und COO&supmin;-Gruppen des Hämoglobins intakt sind, wenn das Hämoglobin in desoxidierter Form vorliegt.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer P aus den Polysacchariden, vor allem den Hydroxyalkylstärken, deren Alkylgruppe 2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, Inulin, Dextran und seinen Derivaten, vor allem dem aminierten Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylat und seinen Derivaten, Polypeptiden, Polyalkylenglykolen, deren Alkylengruppe 2 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, vor allem Polyethylenglykol und Polypropylenglykol, ausgewählt wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer P eine mittlere Molekularmasse kleiner oder gleich 70 000 aufweist, wenn es aus Dextran und seinen Derivaten besteht, und eine Molekularmasse kleiner oder gleich 10 000, wenn es aus den Polyalkylenglykolen, Polyvinylpyrrolidon oder Polymethylacrylat ausgewählt ist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Stelle Z über eine Ester-, Ether-, Amid- oder Amingruppe an das Polymer gebunden ist.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Stelle Z die Gruppen OSO&sub3;H, OPO&sub3;H&sub2;, O-CH(COOH)&sub2;, -O-CH(COOH)-CH&sub2;-COOH,
umfaßt, wobei n 1 bis etwa 4 sein kann, oder von Pyridoxalsulfat, Pyridoxylphosphat, Adenosintriphosphat, Phosphotyrosin, Phosphoserin, Inosithexaphosphat und seinen Derivaten, einer Polycarbonsäure mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Hauptkette, Benzolcarbonsäure mit mindestens drei Carbonsäuregruppen oder 2,3-Diphosphoglycerat stammt.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ausgehend von Carboxylgruppen, die von an das Polymer gebundenen Stellen Z stammen, und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins erzeugt werden.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Bindungen zwischen dem Polymeren P und dem Hämoglobin zwischen den Carboxylatgruppen der Stellen Z und dem Hämoglobin erzeugt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgehend von aminiertem Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 40 000 und von 2x10&supmin;&sup4; mol Benzolhexacarbonsäure je g Dextran erhalten wird, wobei
- die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des an das Polymeren gebundenen Benzolpentacarboxylats, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzolhexacarbonsäure teilnehmen, hergestellt werden,
- und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzolpentacarbonsäure - die gleichzeitig nicht an der Bindung zwischen Benzolhexacarbonsäure und dem Polymeren und nicht an der hier oben definierten ionischen Bindungen teilnehmen - und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins hergestellt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgehend von aminiertem Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000 und von 3,5x10&supmin;&sup4; mol Benzolhexacarbonsäure je g Dextran erhalten wird, wobei
- die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzolpentacarboxylats, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzolhexacarbonsäure teilnehmen, erzeugt werden,
- und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzolpentacarbonsäure - die gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Benzolhexacarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt sind - und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins erzeugt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgehend von aminiertem Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000 und von etwa 3,2x10&supmin;&sup4; mol Benzoltetracarbonsäure je g Dextran erhalten wird, wobei
- die ionischen Bindungen mit Hilfe von Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzoltricarboxylats, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzoltetracarbonsäure beteiligt sind, erzeugt werden,
- und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzoltricarbonsäure - die gleichzeitig weder an der Bindung zwischen Benzoltetracarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt sind - und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins erzeugt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgehend von aminiertem Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000 und von 4x10&supmin;&sup4; mol Butantetracarbonsäure je g Polymer erhalten wird, wobei
- die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Butantricarboxylats, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Butantetracarbonsäure beteiligt sind, erzeugt werden,
- und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Butantricarbonsäure - die gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Butantetracarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt sind - und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins erzeugt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgehend von aminiertem Monomethoxypolyoxyethylen mit einer Molekularmasse von etwa 5000 und von 1,5x10&supmin;&sup4; mol Benzolhexacarbonsäure je g Polymer erhalten wird, wobei
- die ionischen Bindungen mit Hilfe von Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzolpentacarboxylats, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzolhexacarbonsäure beteiligt sind, erzeugt werden,
- und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzolpentacarbonsäure - die gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Benzolhexacarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt sind - und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins erzeugt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ausgehend von Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000 und von 1,15x10&supmin;³ mol Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure je g Polymer erhalten wird, wobei
- die ionischen Bindungen mit Hilfe von Carboxylatgruppen des auf dem Polymeren fixierten Benzoltricarboxylats, die nicht an der Bindung zwischen dem Polymeren und der Benzol-1,2,4,5- tetracarbonsäure beteiligt sind, erzeugt werden,
- und die kovalenten Bindungen zwischen den anderen Carboxylgruppen der Benzoltricarbonsäure - die gleichzeitig weder an der Bindung zwischen der Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure und dem Polymeren noch an den hier oben definierten ionischen Bindungen beteiligt sind - und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins erzeugt werden.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß am Ende der ersten Stufe das Polymer mit den Stellen Z vor der Reaktion mit dem Hämoglobin aktiviert wird.
19. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung darin besteht, daß man die OH-Gruppen in Aldehydgruppen überführt, beispielsweise durch periodische Oxidation.
20. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der Stellen Z des Polymeren und seine Reaktion mit dem Hämoglobin praktisch gleichzeitig ablaufen.
21. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Stellen Z des Polymeren
- mit beispielsweise Carbonyldiimidazol aktiviert werden, wenn die Stellen Z keine Aldehydgruppen, aber Hydroxylgruppen enthalten,
- oder mit Hilfe von in der Peptidsynthese verwendeten Reaktionspartnern aktiviert werden, wenn die Stellen Z Carboxylgruppen enthalten.
22. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin während einer Zeit, die kürzer ist als die Zeit, die zu höchstens etwa 5% Methhämoglobin führt, vorzugsweise während höchstens 10 h, und bei einer Temperatur, die eine korrekte Konservierung des Hämoglobins ermöglicht, beispielsweise zwischen 3 und 30ºC, abläuft.
23. Verfahren zur Herstellung nach einem der Ansprüche 1 bis 22 von Hämoglobinkonjugaten, bei denen die Stellen Z an das Polymer mit Hilfe einer Esterbindung gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man
- in einer ersten Stufe die Stellen Z in Anhydridform vor allem Benzol-1,2,4,5-tetracarbonsäure-dianhydrid oder Benzol- 1,2,4-tricarbonsäure-anhydrid, mit einem Polymeren, das OH-Gruppen enthält, vor allem Dextran oder Polyethylenglykol, in einem Medium, in welchem das Polymer löslich ist, umsetzt, um die Stellen Z auf dem Polymeren zu fixieren,
- in einer zweiten Stufe das Polymer P mit der Stelle/den Stellen Z mit Hämoglobin in oxidierter Form in einem nicht von Sauerstoff befreiten Medium unter solchen Bedingungen umsetzt, daß das Hämoglobin nicht denaturiert wird und nach dem Kuppeln mit dem Polymeren reversibel von der oxidierten in die desoxidierte Form übergehen kann, in wäßrigem Medium vom pH-Wert 5 bis 9,
um einerseits mindestens eine ionische Bindung zwischen mindestens einer der Stellen Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin und andererseits mindestens eine kovalente Bindung zwischen der gleichen Stelle Z auf dem Polymeren und dem Hämoglobin zu erzeugen.
24. Makromolekulares Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es durch das Verfahren nach Anspruch 3 erhalten wird.
25. Makromolekulares wasserlösliches Hämoglobin-Konjugat, das während der Zeit, in der das makromolekulare Konjugat Sauerstoff transportierende Funktionen im Plasma sicherstellen muß, nicht oder wenig biologisch abbaubar ist und das für Sauerstoff eine geringere Affinität besitzt als das freie Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
- einerseits Hämoglobin, das reversibel aus der desoxidierten Form in die oxidierte Form übergehen kann,
- andererseits einem wasserlöslichen, nichttoxischen, vorzugsweise nicht-antigenischen und hämokompatiblen Polymeren P, mit einer mittleren Molekularmasse von etwa 1000 bis etwa 500 000, vorzugsweise von etwa 1000 bis etwa 100 000, das eine oder mehrere polare Gruppen, vorzugsweise Hydroxyl-, Carboxyl- oder Amingruppen besitzt,
- wobei das Polymer eine oder mehrere Stellen Z aufweist, die mindestens eine negative Ladung getragen von mindestens einer Gruppe, ausgewählt aus den folgenden Gruppen: Sulfat, Phosphat, Carboxylat und bestimmt zur Ausbildung einer ionischen Bindung mit dem Polymeren enthält, und andererseits mindestens eine Carbonsäure-, Aldehyd- oder OH-Gruppe enthält, die zur Ausbilding einer kovalenten Bindung mit dem Hämoglobin bestimmt ist, wobei
- das Polymer P an das Hämoglobin gebunden ist,
. einerseits mit Hilfe mindestens einer ionischen Bindung, die zwischen mindestens einer der negativen Ladungen der Stellen Z auf dem Polymeren P und dem Hämoglobin ausgebildet ist, und
. andererseits mit Hilfe mindestens einer kovalenten Bindung, die zwischen mindestens einer der Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppen der genannten Stellen Z auf dem Polymeren P und dem Hämoglobin ausgebildet ist,
- die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin so ist, daß das makromolekulare Konjugat eine mittleren Molekularmasse von etwa 70 000 bis etwa 1 000 000, vorzugsweise von etwa 70 000 bis etwa 500 000, aufweist und die Beziehung zwischen Anzahl und Beschaffenheit der negativen Ladungen, der Anzahl der Stellen und der Anzahl der Monomeren folgendermaßen lautet:
- handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe, bestehend aus einem Sulfat oder einem Phosphat, enthält, so gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine Stelle alle elf Monomer(einheiten),
- handelt es sich um eine Stelle Z, die eine einzige anionische Gruppe enthält, bestehend aus einem Carboxylat, das nicht an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin teilnimmt, so gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette,
- handelt es sich um eine Stelle Z, die zwei anionische Ladungen enthält, die von zwei Carboxylaten stammen, die nicht an der Bindung zwischen der Stelle und dem Polymeren und nicht an der kovalenten Bindung zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin teilnehmen, so gibt es mindestens eine solche Stelle Z je Polymerkette und höchstens eine Stelle Z alle sechs Monomer(einheiten).
26. Makromolekulares Konjugat nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren P und dem Hämoglobin zwischen mindestens einer Carboxyl-, Aldehyd- oder OH-Gruppe der Stellen Z und mindestens einem Amin des Hämoglobins, gelegen in der allosterischen Stelle des Hämoglobins, vor allem dem Amin von mindestens einem der beiden β-terminalen Valine des Hämoglobins ausgebildet sind.
27. Makromolekulares Konjugat nach den Ansprüchen 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzbrücken zwischen den inneren NH&spplus;&sub3;- und COO&supmin;-Gruppen des Hämoglobins intakt sind, wenn das Hämoglobin in desoxidierter Form vorliegt.
28. Makromolekulares Konjugat nach den Ansprüchen 26 und 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer P aus den Polysacchariden, vor allem den Hydroxyalkylstärken, deren Alkylgruppe 2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, Inulin, Dextran und seinen Derivaten, vor allem dem aminierten Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polymethacrylat und seinen Derivaten, Polypeptiden, Polyalkylenglykolen, deren Alkylengruppe 2 bis 5 Kohlenstoffatome enthält, vor allem Polyethylenglykol und Polypropylenglykol, ausgewählt wird.
29. Makromolekulares Konjugat nach den Ansprüchen 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer P eine mittlere Molekularmasse kleiner oder gleich 70 000 aufweist, wenn es aus Dextran und seinen Derivaten besteht, und eine Molekularmasse kleiner oder gleich 10 000, wenn es aus den Polyalkylenglykolen, Polyvinylpyrrolidon oder Polymethylacrylat ausgewählt ist.
30. Makromolekulares Konjugat nach den Ansprüchen 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Stelle Z über eine Ester-, Ether-, Amid- oder Amingruppe an das Polymer gebunden ist.
31. Makromolekulares Konjugat nach den Ansprüchen 25 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Stelle Z Gruppen OSO&sub3;H, OPO&sub3;H&sub2;, O-CH(COOH)&sub2;, -O-CH(COOH)-CH&sub2;-COOH,
umfaßt, wobei n 1 bis etwa 4 sein kann, oder von Pyridoxalsulfat, Pyridoxylphosphat, Adenosintriphosphat, Phosphotyrosin, Phosphoserin, Inosithexaphosphat und seinen Derivaten, einer Polycarbonsäure mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Hauptkette, Benzolcarbonsäure mit mindestens drei Carbonsäuregruppen oder 2,3-Diphosphoglycerat stammt.
32. Makromolekulares Konjugat nach den Ansprüchen 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalenten Bindungen zwischen dem Polymeren und dem Hämoglobin ausgehend von Carboxylgruppen, die von an das Polymer gebundenen Stellen Z stammen, und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins erzeugt worden sind.
33. Makromolekulares Konjugat nach den Ansprüchen 25 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Bindungen zwischen dem Polymeren P und dem Hämoglobin zwischen den Carboxylatgruppen der Stellen Z und dem Hämoglobin erzeugt werden.
34. Makromolekulares Konjugat, bei dem das Polymer Dextran mit einer Molekularmasse von etwa 10 000 ist, die ionischen Bindungen mit Hilfe der Carboxylatgruppe des auf dem Polymeren fixierten Benzoldicarboxylats, die nicht an der Bindung zwischen dem Benzol-1,2,4-tricarbonsäureanhydrid und dem Polymeren teilnimmt, ausgebildet sind (und)
- die kovalenten Bindungen zwischen der anderen Carboxylgruppe des Benzoldicarboxylats - die gleichzeitig weder an der Bindung zwischen dem Benzol-1,2,4-tricarbonsäureanhydrid und dem Polymeren noch an der hier oben definierten ionischen Bindung beteiligt ist - und NH&sub2;-Gruppen des Hämoglobins ausgebildet sind, wobei alle zehn Monomer(einheiten) eine Benzoldicarboxylatgruppe vorhanden ist.
DE8989401076T 1988-04-20 1989-04-18 Makromolekulare haemoglobinkomplexe, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen. Expired - Lifetime DE68901944T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8805240A FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1988-04-20 Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE68901944D1 DE68901944D1 (de) 1992-08-06
DE68901944T2 true DE68901944T2 (de) 1992-12-10

Family

ID=9365495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE8989401076T Expired - Lifetime DE68901944T2 (de) 1988-04-20 1989-04-18 Makromolekulare haemoglobinkomplexe, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5110909A (de)
EP (1) EP0338916B1 (de)
JP (1) JPH0242023A (de)
AT (1) ATE77753T1 (de)
DE (1) DE68901944T2 (de)
ES (1) ES2043054T3 (de)
FR (1) FR2630329B1 (de)
GR (1) GR3005220T3 (de)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
FR2680369B1 (fr) * 1991-08-14 1993-11-05 Pasteur Merieux Serums Vaccins Derives d'hemoglobine humaine, leur procede de preparation, produits en derivant et utilisation de ces derives et produits.
EP0767675A4 (de) * 1995-04-10 1998-08-05 Baxter Int Verwendung von vernetztem hämoglobin zur behandlung von subarachnoidalblutungen
US5928916A (en) * 1996-04-25 1999-07-27 Medtronic, Inc. Ionic attachment of biomolecules with a guanidino moiety to medical device surfaces
DE19628705A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US6018035A (en) * 1997-07-21 2000-01-25 Baxter International Inc. Reagents for isotropic size enhancement of a peptide, protein, nucleotide or other substrate
US5981710A (en) * 1997-07-21 1999-11-09 Baxter International, Inc. Therapeutic hemoglobin composition having isotropically increased size
ES2245805T3 (es) * 1997-10-03 2006-01-16 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polisacaridos que forman iminas, preparacion de los mismos y el uso de los mismos como adyuvantes de inmunoestimulantes.
CA2233725A1 (en) 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
WO1999055715A2 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
EP1223942A2 (de) * 1999-08-25 2002-07-24 GMP Companies, Inc. Mittel zur verstärkten sauerstoffzufuhr bei säugern
CA2319966A1 (en) * 2000-09-19 2002-03-19 Dextro-Sang Corporation Improved dextran-hemoglobin conjugate as potential blood substitute
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
RU2329274C2 (ru) 2002-09-11 2008-07-20 Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх Способ получения производных гидроксиалкилкрахмала
ES2314238T3 (es) 2002-10-08 2009-03-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de oligosacaridos farmaceuticamente activos.
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
SG145746A1 (en) * 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
KR100580642B1 (ko) * 2004-01-12 2006-05-16 삼성전자주식회사 표면에 활성화된 카르복실기를 갖는 기판을 이용하여 생물분자를 고체 기판상에 고밀도로 고정화하는 방법 및 그에 의하여 제조되는 마이크로어레이
TWI417303B (zh) 2004-03-11 2013-12-01 Fresenius Kabi De Gmbh 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
EP1732609B1 (de) * 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Konjugate von hydroxyalkyl-stärke und einem protein
US7678888B2 (en) * 2004-04-21 2010-03-16 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Stable oxidation resistant powdered hemoglobin, methods of preparing same, and uses thereof
KR20070110902A (ko) * 2005-03-11 2007-11-20 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 비활성 출발 물질로부터 생물활성 당단백질의 생산
EP1762250A1 (de) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Konjugate welche durch chemische Ligation zwischen Hydroxyalkylstärken und aktiven Substanzen mit Bildung eines Thiazolidin-Ringes entstehen
EP2070951A1 (de) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Verfahren zur Herstellung eines Hydroxyalkylstärkederivats mit zwei Linkern
EP2070950A1 (de) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkylstärkederivate und deren Herstellungsverfahren

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1055932A (en) * 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
FR2551660B1 (fr) * 1983-09-13 1986-11-14 Centre Nat Rech Scient Hemoglobine modifiee chimiquement, sa preparation, solutions aqueuses en contenant et leur utilisation
GB8328917D0 (en) * 1983-10-28 1983-11-30 Fisons Plc Blood substitute
DE3501349A1 (de) * 1985-01-17 1986-07-17 Battelle-Institut E.V., 6000 Frankfurt Blutersatz
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications

Also Published As

Publication number Publication date
GR3005220T3 (de) 1993-05-24
DE68901944D1 (de) 1992-08-06
FR2630329A1 (fr) 1989-10-27
ES2043054T3 (es) 1993-12-16
EP0338916A1 (de) 1989-10-25
JPH0242023A (ja) 1990-02-13
EP0338916B1 (de) 1992-07-01
FR2630329B1 (fr) 1991-07-05
US5110909A (en) 1992-05-05
ATE77753T1 (de) 1992-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68901944T2 (de) Makromolekulare haemoglobinkomplexe, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen.
DE2646854C2 (de)
EP0912197B1 (de) Hämoglobin-hydroxyethylstärke-konjugate als sauerstoff-transport-mittel
DE60116137T2 (de) Derivatisierung von proteinen in wässrigem lösungsmittel
EP0265865B1 (de) Blutersatzmittel
DE69917889T2 (de) Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
DE3850002T2 (de) Stabilisierung von Deferoxamin für die Chelatbildung mit freien Ionen in physiologischem Serum.
DE69529288T2 (de) Wasserlösliche polyen-konjugate
DE69533987T2 (de) Protein oder polypeptid, verfahren zur seiner herstellung und entsprechende zwischenprodukte
EP0142125A2 (de) Konjugate makromolekularer Verbindungen an Hämoglobin, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel
DE69020276T2 (de) Amylose-Lysozym-Hybrid, ein Aktivzucker und Verfahren zur Herstellung.
DE3144705A1 (de) Verfahren zur herstellung eines lagerstabilen, vernetzten haemoglobinpraeparates mit hoher sauerstoff-transportkapazitaet, sowie das nach diesem verfahren hergestellte haemoglobinpraeparat
CH655010A5 (de) Pharmazeutischer wirkstoff mit antitumoraktivitaet.
DE2417619A1 (de) Plasmaproteinersatzmittel und verfahren zu dessen herstellung
DE102005062440A1 (de) Proteinbasiertes Trägersystem zur Resistenzüberwindung von Tumorzellen
DD209578A5 (de) Verfahren zur herstellung von immunoenzymatischen konjugaten
EP1294385B1 (de) Verfahren zur herstellung künstlicher sauerstoffträger aus kovalent vernetzten hämoglobinen mit verbesserten funktionellen eigenschaften durch vernetzung in anwesenheit chemisch nicht reagierender effektoren der sauerstoffaffinität der hämoglobine
EP1294386A1 (de) Künstliche sauerstoffträger aus vernetztem modifizierten human- oder schweinehämoglobin, verfahren zu ihrer herstellung aus gereinigtem material, sowie deren verwendung
EP0804494A1 (de) Polymerisationsfähige derivate von polyamiden
DE2059165A1 (de) Streptokinase in chemischer Bindung an eine Kohlehydratverbindung
DE69522564T2 (de) Alkalibeständiges proteinadsorbens
DE69523604T2 (de) Komplexe aus porphyrin und menschlichem serumalbumin mit der fähigkeit, sauerstoff zu binden, und deren therapeutische verwendungen
DE69130736T2 (de) Methode für die präparation von pyridoxyliertem hämoglobin
DE69621521T2 (de) Cyclodextrinderivate, ihre Herstellung und Verwendung zur Einbringung von hydrophoben Molekülen in strukturierten Tensidsystemen
DE2617895C3 (de) Dispersion zur Herstellung eines injizierbaren radiopharmazeutischen Scanning-Mittels

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee