DE3850002T2

DE3850002T2 - Stabilisierung von Deferoxamin für die Chelatbildung mit freien Ionen in physiologischem Serum.

Info

Publication number: DE3850002T2
Application number: DE3850002T
Authority: DE
Inventors: John W Eaton; Philip Eric Hallaway; Bo Erik Hedlund; Samuel S Panter
Original assignee: BIOMED FRONTIERS Inc
Current assignee: BIOMED FRONTIERS Inc
Priority date: 1987-08-20
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2008-07-30
Also published as: EP0304183A1; DE3850002D1; EP0304183B1; US4863964A

Description

Deferoxamin (Deferrioxamin oder Desferrioxamin) und seine pharmazeutisch zulässigen Salze sind Chelatbildner, die hohe Bindungsaffinitäten für Metallionen wie zum Beispiel Aluminium- und Eisen(III)-ionen aufweisen. Deferoxaminmesilat ist im Handel erhältlich und wurde zur Behandlung schwerer Eisenvergiftungen, der Eisenspeicherkrankheit oder Eisenüberladung als Folge von Hämolyse aufgrund von Arzneimitteln, Thalassämie, Sichelzellenanämie häufigen Bluttransfusionen und dergleichen angewendet. McLachlan (US-Patent-Nr. 4,419,365) offenbart die Behandlung der Alzheimer-Krankheit durch die Verabreichung von Deferoxamin-Salzen zur Steigerung der Aluminiumausscheidung. Die Aluminiumdialyse-Encephalopathie kann auch durch Behandlung mit Deferoxamin rückgebildet werden (R.S. Arze et al., Lancet ii, 1116 (1981)).
Mit der klinischen Anwendung von Deferoxaminmesilat sind verschiedene Schwierigkeiten verknüpft. Da das Arzneimittel bei oraler Verabreichung nicht nennenswert resorbiert wird, muß es im allgemeinen parenteral gegeben werden. Sobald das Arzneimittel verabreicht ist, erfolgt seine Ausscheidung sehr schnell. Bei Menschen weist das Arzneimittel zum Beispiel eine vaskulare Halbwertszeit von nur circa 5-10 Minuten auf. Die Chelattherapie mit dem Arzneimittel umfaßt folglich Dauerinfusionen oder häufige intramuskuläre Injektionen, die Schmerzen und/oder Induration am Injektionsort verursachen können. Darüber hinaus ist die akute und chronische Toxizität von Deferoxamin relativ hoch, was die Substanz für therapeutische Verwendungszwecke weniger vielseitig macht.
Es besteht ein Bedarfan einem Mittel, das bei der Eisenchelattherapie nützlich ist und das gegen Abbau und/oder Ausscheidung in vitro oder in vivo widerstandsfähig ist. Darüber hinaus besteht auch Bedarf an einem Verfahren zur Verlängerung der effektiven Lebensdauer von Deferoxamin nach In-vivo-Verabreichung. Es wird außerdem auch ein bevorzugtes Deferoxamin-Mittel mit verminderter Toxizität benötigt.
Die Substanz Deferoxamin wird oft als DFO oder DES abgekürzt (und darf nicht mit Diethylstilbestrol verwechselt werden). Zwecks Konsistenz wird hierin nur die Abkürzung DFO verwendet. Termini wie zum Beispiel "Dextran- DFO" bedeuten ein Addukt des Polymers (Dextran) mit DFO. Ein solches Addukt kann mehr als eine DFO-Komponente pro Einheit Substrat einschließen.
EP-A-0214101 offenbart den Gebrauch von Eisen(III)- Chelatbildnern wie zum Beispiel Deferoxamin zur Behandlung von Malaria. Ein derartiger Chelatbildner wird zur Formulierung einer Tablette zur oralen Aufnahme mit einem Füllmittel vermischt.
EP-A-0 087 786 offenbart Agarosepolyaldehydperlen, die durch ihre Aldehydgruppen mit Verbindungen kovalent gebunden sind, die primäres Amin oder Thiolgruppen enthalten, wie zum Beispiel Proteine und "Arzneimittel". Es wird an die Agarosepolyaldehydperlen gebundenes DFO (Desferal (R)) offenbart. Die Perlen werden für verschiedene biologische Applikationen, wie zum Beispiel für die Hämoperfusion, diagnostische Zwecke oder Immobilisationszwecke, bereitgestellt.
Im Journal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition, Band 22, 1984, Seiten 145-158, John Wiley & Sons, Inc. werden Polyacrolein(PA)-Mikrosphären offenbart, die als ein Werkzeug für die kovalente Bindung verschiedener Aminoliganden, wie zum Beispiel von Proteinen, durch Bildung von Schiff-Basenbindungen zu verwenden sind. Es werden kovalent an Desferoxamin gebundene PA-Mikrosphären offenbart.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen pharmazeutisch zulässigen wasserlöslichen Komplex bereit, der ein an Deferoxamin kovalent gebundenes wasserlösliches Biopolymer umfaßt.
Das Biopolymer kann ein wasserlösliches Polysaccharid oder ein wasserlösliches Protein sein.
Es versteht sich von selbst, daß das Polysaccharid oder Protein selbst pharmazeutisch zulässig sein sollte, damit der Komplex pharmazeutisch zulässig ist.
Das Deferoxamin kann direkt an Aldehydgruppen am Polysaccharid kovalent gebunden sein.
Das Polysaccharid kann Dextran, Hyaluronsäure, Stärke, ein Stärkederivat oder Inulin umfassen. Der Komplex kann zum Beispiel ein Inulin-Deferoxamin-Addukt sein.
Das Protein kann menschliches Serumalbumin umfassen.
Der Komplex ist bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch einen chirurgischen Eingriff oder durch Therapie nützlich. Der Komplex kann zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Zusammensetzung zum Gebrauch bei einer derartigen Behandlung verwendet werden.
Der Komplex kann insbesondere bei der Herabsetzung der Konzentration von freien Eisen(III)- oder Aluminiumionen in einer physiologischen Flüssigkeit von Säugetieren zur Hemmung der Zellmaterialschädigung durch Oxidations/ Reduktions-Reaktionen oder zur Hemmung der Aktivität von Eisen als einem Katalysator für Oxidations/Reduktions- Reaktionen während der Reperfusion von geschädigtem Gewebe mit Blut bei einem Säugetier verwendet werden. Der Komplex kann zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer Zusammensetzung für eine derartige Anwendung benutzt werden.
Der Komplex kann für die parenterale Verabreichung oder zur Einführung in den Blutstrom eines Menschen formuliert werden.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein Verfahren zur Hemmung der Zellmaterialschädigung durch Oxidations/ Reduktions-Reaktionen in vitro bereit, wobei das Verfahren in Verbindung mit dem zellmaterial die Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Komplexes umfaßt.
Lösliches Polymer : Deferoxamin-Komplexe weisen eine Anzahl nützlicher und unerwarteter Charakteristika auf. Die Clearance-Geschwindigkeit eines Chelatbildners, der an ein wasserlösliches Polymer gebundenes Deferoxamin umfaßt, aus dem Blut von Versuchstieren ist im Vergleich zur Clearance von nichtkonjugiertem Deferoxaminmesilat stark verzögert. Diese erhöhte vaskuläre Retention der Chelatkomponente (Deferoxamin-Komponente) kann zu einer verstärkten Wirksamkeit führen. Darüber hinaus wird die Toxizität von Deferoxamin erheblich reduziert, wenn das Deferoxamin als ein Chelatbildner nach dem vorliegenden Verfahren eingeführt wird. Außerdem kann Polymer : Deferoxamin unter gewissen Umständen bei der Vermittlung der Ausscheidung von (isotopischem) Eisen aus Tieren mit Eisenüberladung wirksamer sein. Deshalb ermöglicht die vorliegende Erfindung, daß die In-vivo-Stabilisierung von Deferoxamin mit vorteilhaften Ergebnissen erzielt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Hemmung der Zellschädigung aufgrund von Oxidations /Reduktions- Reaktionen durch Bereitstellung eines immobilisierten Chelatbildners an einem ausgewählten Ort. Der Chelatbildner fängt freies Eisen auf, was eine katalytische Wirkung hemmt. Eine bevorzugte Applikation dieses letzteren Verfahrens ist der Gewebeschutz während der Reperfusion.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von einem Experiment, in dem die In-vivo-Clearance von Deferoxamin mit immobilisiertem Deferoxamin verglichen wird.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, in der ein Vergleich der Toxizität von Deferoxamin mit immobilisiertem Deferoxamin gezeigt wird.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, in der ein Vergleich der vaskulären Retentionszeiten von zahlreichen Deferoxamin-Polymer-Addukten zu sehen ist.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Experiments, in dem die Chelatbildungsfähigkeit von Deferoxamin mit einem Deferoxamin-Dextran-Addukt verglichen wird.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse einer kompetitiven Chelatbildungsstudie, in der Deferoxamin und ein Deferoxamin-Dextran-Addukt verglichen werden.
Fig. 6 ist eine graphische Wiedergabe der Ergebnisse von Experimenten zur Hemmung der Lipidperoxidation durch Deferoxamin und durch ein Dextran-Deferoxamin-Addukt.
Fig. 7 ist eine graphische Wiedergabe der Fähigkeit von Deferoxamin im Vergleich zu der von einem Dextran- Deferoxamin-Addukt zur Hemmung der Lipidperoxidation.
Fig. 8 ist eine graphische Wiedergabe der Ergebnisse eines Experiments zur Hemmung der Lipidperoxidation durch Chelatbildner gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Experiments, in dem die Fähigkeit von Deferoxamin mit der eines Addukts gemäß der vorliegenden Erfindung zur Hemmung der Zellschädigung unter bestimmten Umständen verglichen wird.
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, in der die relativen Clearance-Geschwindigkeiten von Dextran und eines Dextran-Deferoxamin-Addukts gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt werden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Chelatbildner werden durch kovalente Bindung von Deferoxamin an ein pharmazeutisch zulässiges organisches Polymer hergestellt. Verfahren für die Zubereitung von Deferoxamin, (N-[5-[3(5-aminopentyl)hydroxycarbamoyl]propionamido]pentyl]-3-[(5-(N-hydroxyacetamido)pentyl]carbamoyl]propionhydroxamsäure), und seine pharmazeutisch zulässigen Salze sind offenbart worden, zum Beispiel von Prelog et al., in Helv. Chim. Acta, 45, 631 (1962); Bickel et al., Helv. Chim. Acta, 46 1385 (1963); in der deutschen Patentbeschreibung 1,186,076 und im US-Patent Nr. 4,419,365. Diese Salze schließen die Säureadditionssalze von Methansulfonsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Milchsäure, Tartarsäure, Zitronensaure und dergleichen ein.
Die Bildung von Chelatbildnern gemäß dem vorliegenden Verfahren umfaßt bevorzugt eine Bindung der Deferoxamin- Komponente an das Substrat-Biopolymer dergestalt, daß:
1. die Chelatbildungsfähigkeit der Deferoxamin-Komponente in vitro erheblich bleibt, und zwar bevorzugt in der Größenordnung von nicht gebundenem Deferoxamin;
2. die Toxizität der Deferoxamin-Komponente erheblich 5 reduziert ist und
3. die vaskuläre Retentionszeit für die gebundene Deferoxamin-Komponente im Verhältnis zu nicht gebundenem Deferoxamin wesentlich erhöht ist.
Es ist bevorzugt, die endständige Aminogruppe (NH&sub2;-Gruppe) von Deferoxamin an ein Molekül eines pharmazeutisch zulässigen organischen Polymers zu binden. Die Aminogruppe kann direkt an eine Karbonsäure-Komponente am Polymer gebunden werden, zum Beispiel zur Bildung einer Amidverknüpfung. Die Deferoxamin-Aminogruppe wird bevorzugt über die folgende Reaktionsfolge direkt an eine Aldehyd- (CHO)-Komponente am Polymer gebunden:
Polymer-CHO + DFO-NH&sub2; → Polymer-CH=NDFO → Polymer-CH&sub2;NH-DFO,
worin Reaktion 1 eine Schiff-Base ergibt, die in Reaktion zur Herbeiführung einer kovalenten Verknüpfung reduziert wird. Es wird darauf hingewiesen, daß mehr als eine Deferoxamin-Komponente an ein einziges Substrat-(Polymer Molekül gebunden werden kann.
Die Anwendung des obigen Vorgangs, worin das Polymer ein lösliches Biopolymer wie zum Beispiel ein Polysaccharid oder ein Protein ist, führt zu einem löslichen Chelatbildner, der die oben umrissenen gewünschten Charakteristika besitzt. Dies bedeutet, daß der resultierende Chelatbildner hinsichtlich seiner Chelatbildungsfähigkeit sehr wirksam ist. Darüber hinaus weist der gebundene Chelatbildner wesentliche Vorteile auf, hauptsächlich in bezug auf die verminderte Toxizität, die Vermittlung der Eisenausscheidung in vivo und die erhöhte vaskuläre Retentionszeit. Aus den unten berichteten experimentellen Ergebnissen geht hervor, daß das Verhalten des gebundenen Chelatbildners nicht immer ohne weiteres ausgehend von Daten, die sich auf den nicht gebundenen oder nicht immobilisierten Chelatbildner beziehen, voraussagbar ist.
Mit Hilfe bekannter Techniken können in die Polymer- Substrate Aldehydgruppen eingeführt werden, wie zum Beispiel durch die Oxidation von Kohlenhydraten oder anderen Diolen zu Dialdehyden mit Natriummetaperiodat. Vgl. zum Beispiel M.B. Wilson, et al. in Immunofluorescence and Related Staining Techniques [Immunfluoreszenz und verwandte Farbemethoden], W. Knapp et al., Hrg., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1978) auf Seite 215', Flemming et al., Acta Biol. Med. Ger., 30, 177 (1973); und S.-C. Tam et al., in P.N.A.S. USA, 73, 2128 (1976).
In einigen Anwendungen kann die endständige Aminogruppe am Deferoxamin durch den Gebrauch eines Dialdehyd- Verknüpfungsmittels wie zum Beispiel Glutaraldehyd mit anschließender Reduktion, zum Beispiel mit Natriumborhydrid, auch indirekt an eine Aminogruppe am Polymer gebunden werden.
Die Molverhältnisse von Deferoxamin/Polymer, die durch diese Reaktionen zu erzielen sind, werden je nach Faktoren wie zum Beispiel der Zahl der reaktiven Gruppen am Polymer, der sterischen Behinderung, der Geschwindigkeit und dem Ausmaß der Bildung von Schiff-Base oder Amid und dergleichen stark variieren. So können zum Beispiel circa 0,6-0,7 g Deferoxamin an circa 2,5 g von zur Reaktion gebrachtem Dextran 40 gebunden werden, und zwar über die Reaktion von Deferoxamin mit in das Dextran eingeführten Aldehyd-Gruppen mit anschließender Reduktion.
Als Substratmaterial zur Reaktion mit Deferoxamin verwendete organische Polymere müssen wasserlöslich sein. Auf diese Weise gebildete Chelatbildner werden in verschiedenen Anwendungsbereichen von Nutzen sein, vorausgesetzt, das das Polymer und der Chelatbildner pharmazeutisch und/oder anderweitig mit den physiologischen Lösungen, mit denen sie während des Gebrauchs in Kontakt kommen werden, kompatibel sind.
Die bevorzugte Zubereitung von Chelatbildnern zum Gebrauch in vivo bringt jedoch spezielle Probleme mit sich und erfordert besondere Charakteristika. Der Chelatbildner muß zwecks leichter Einführung ausreichend löslich sein. Die Chelatkomponente des Mittels muß als ein Chelatbildner selbst in vivo wirksam bleiben. Das Mittel sollte eine verbesserte vaskuläre Retention aufweisen und bei der Herbeiführung der Eisenausscheidung bei Tieren wirksam sein. Das Mittel sollte nicht wesentlich toxisch sein, zumindest nicht bei oder in der Nähe therapeutischer Spiegel und bevorzugt nicht innerhalb circa des 5- oder 10fachen therapeutischen Spiegels. Das Polymersubstrat sollte keine signifikanten Nebenwirkungen hervorrufen und sollte folglich unter Polymeren gewählt werden, die biokompatibel sind.
Es wurde ermittelt, daß Polymere, die anscheinend für die Anwendung gemäß einer In-vivo-Applikation der vorliegenden Erfindung nützlich sind, Polysaccharide, wie zum Beispiel Dextrane und Hyaluronsäure, Stärkederivate sowie Proteine, wie zum Beispiel humanes Serumalbumin, eine Plasmaproteinfraktion (human) und dergleichen, einschließen. Polymere Ausgangsmaterialien, wie zum Beispiel Dextrane, humanes Albumin und eine Plasmaproteinfraktion, sind im Handel als wasserlösliche Zubereitungen oder als Lösungen erhältlich. Vgl. Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol., Hrg. Mack Publishing (16. Auflage 1980), Seiten 759-761.
Zum Gebrauch bei der Reduzierung von Eisen(III)- und/oder Aluminiumionen-Konzentrationen in einer physiologischen Flüssigkeit in vivo vorgesehene Chelatbildner werden bevorzugt parenteral als Lösungen verabreicht, zum Beispiel durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder Infusion bzw. auf oralem, rektalem oder vaginalem Weg. Die entsprechende Dosis wird im Einklang mit den entsprechenden klinischen Faktoren, einschließlich der zu behandelnden pathologischen Zustände; des Alters, der Große und des Gewichts des Patienten; der Verabreichungsweise; des Bindungsvermögens des Chelatbildners und dergleichen eingestellt. Vgl. zum Beispiel B. Modell et al., in The Clinical Approach to Thalassaemia [Der klinische Ansatz zur Thalassämie], Grone und Stratton, New York (1984), Kapitel 13.
Obgleich die Erfindung hierin vornehmlich in bezug auf den Gebrauch der vorliegenden Chelatbildner zur Reduzierung der Eisen(III)- oder Aluminiumionen-Konzentration im Blut beschrieben wurde, sind die erfindungsgemäßen Verfahren bei einer Vielzahl von Flüssigkeiten, einschließlich einer Vielzahl wäßriger physiologischer Flüssigkeiten anwendbar, worin der Chelatbildner zur Bildung eines Komplexes mit Eisen oder Aluminium wirken kann. Zu diesen Flüssigkeiten zählen die verschiedenen von Säugetieren stammenden Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut, Lymphe, Liquor cerebrospinalis, Samen und dergleichen. Darüber hinaus schließen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und Offenbarung die Termini "physiologische Flüssigkeit" oder "physiologische Lösung" oder Varianten davon innerhalb ihrer Bedeutung wäßrige biokompatible Lösungen, wie zum Beispiel Blut- oder Plasmaersatzstoffe, intravenöse Lösungen, wie zum Beispiel physiologische Salzlösungen, Nährlösungen und dergleichen ein.
Es versteht sich auch, daß bei einigen Anwendungen Komplexe gemäß der vorliegenden Erfindung zur Lieferung eines Metalls an einen gewünschten Ort verwendet werden können.
Die Erfindung, ihre Anwendung und ihr Umfang sowie ihre Nützlichkeit sind weitergehend unter Bezugnahme auf die folgenden näheren Erörterungen von Beispielen und Experimenten zu verstehen.

Beispiel 1 - Immobilisation von Deferoxamin an Dextran

Zwei Experimente, welche die Immobilisation von Deferoxamin (DFO) an Dextran zeigen, wurden wie folgt durchgeführt:
a. Festes Natriummetaperiodat wurde einer gerührten 10%igen Dextran-40-Lösung (Rheomacrodex®, Pharmacia, Uppsala, Schweden) (durchschnittliches Molekulargewicht von 40.000) in normaler Kochsalzlösung (500 ml) bis zu einer Endkonzentration von 0,28 M NalO&sub4; zugesetzt. Die Lösung wurde für die Dauer von 18 Stunden bei 4ºC gelagert. Der Lösung wurde unter Rühren festes Natriumbisulfit zugesetzt, bis sie klar wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Entfernung von Verunreinigungen 12 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das resultierende Dialdehyd enthaltende Dextranmaterial (aktiviertes Dextran) besaß eine Endkonzentration von 5% in destilliertem Wasser.
Das Deferoxamin-Mesilatsalz (Desferal®, Ciba-Geigy, Summit, NJ) (3,3 g) wurde 50 ml einer 5%igen Lösung des aktivierten Dextrans zugesetzt, das mit 5 ml eines 1 M Natriumkakodylatpuffers, pH 6,0, gepuffert wurde. Das Reduktionsmittel Natriumcyanborhydrid wurde zur gleichen Zeit wie Desferal® zugefügt, um die Schiff-Base kontinuierlich zu reduzieren. Die Endkonzentration von Natriumcyanborhydrid betrug 20 mM. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei 4ºC stehengelassen, dann wurde zur Reduktion aller unreagierten Aldehydgruppen Natriumborhydrid bis zu einer Konzentration von 40 mM zugefügt. Nach 2 Stunden bei 20ºC wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung von Pufferionen und unreagierten Reduktionsmitteln 18 Stunden lang gegen destilliertes Wasser dialysiert, wodurch circa 100 ml einer wäßrigen Lösung bereitgestellt wurden, die circa 0,6-0,7 g Deferoxamin enthielt, welches durch die primäre Aminogruppe kovalent an 2,5 g Dextran (20%ige Ausbeute, circa 16 Mole Deferoxamin/Mol Dextran, MG 40.000) gebunden war.
b. Es wurde wiederum Rheomacrodex® als Dextranmaterial verwendet. Das Dextran wurde anfangs wie oben mit Natriummetaperiodat zur Erzielung von Aldehydgruppen oxidiert, an die anschließend die Aminogruppe von Deferoxamin (DFO) kovalent zu binden war. Zu diesem Zweck wurde festes Natriumperiodat in 500 ml einer 10%igen wäßrigen Dextranlösung auf eine Endkonzentration von circa 0,3 M gelöst. Diese Lösung wurde 18 Stunden bei 4ºC gelagert. Die Lösung wurde dann mit 0,6 M Natriumbisulfit titriert und ergab anfangs eine dunkelbraune Farbe, gefolgt von einer gelben Lösung, die nach Zugabe von weiterem Bisulfit klar wurde. Die sich daraus ergebende Lösung wurde umfassend gegen destilliertes Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde dann lyophilisiert. Das gefriergetrocknete Material stellt ein Polyaldehydderivat von Dextran dar und wird hierin als "aktiviertes" Dextran bezeichnet. An diesem Punkt werden typischerweise circa 40 g aktiviertes Dextran gewonnen.
Um Deferoxamin kovalent an das aktivierte Dextran zu binden, wurden circa 10 g des aktivierten Dextrans in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Aktiviertes Dextranmaterial ist schwerer löslich als normales Dextran und die sich ergebende Lösung ist anfangs sehr viskös und opak. Auf Grund dessen wurde das aktivierte Dextran der Lösung schrittweise zugesetzt. Nach und nach gingen die gesamten 10 g des aktivierten Dextrans in Lösung. Ausgiebiges Rühren reduzierte die Viskosität.
Es wurde festes DFO zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,1 M (6,55 g) zu erhalten. An diesem Punkt wurden 630 mg Natriumcyanborhydrid zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,1 M zu erzielen.
Das Rühren wurde für weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, an welchem Punkt durch die Zugabe von 0,5 g Natriumborhydrid ein zweiter Reduktionsschritt eingeleitet wurde. Die gesamte Mischung 10 wurde für weitere zwei Stunden gerührt, an welchem Punkt die Dialyse eingeleitet wurde. Die Dialyse wurde mehrere Tage lang fortgesetzt, wobei fünf oder sechs Wechsel des 15 Liter fassenden Dialysegefäßes zur Anwendung kamen. Nach Abschluß der Dialyse wurde das Dextran-Deferoxanim-Addukt (Dextran-DFO-Addukt) lyophilisiert. Es wurden insgesamt 8,7 g eines leicht gelblichen, flockigen Materials erhalten.
Das Dextran-DFO-Addukt (DEx-DFO-Addukt) war hinsichtlich des Deferoxamin-Gehalts durch Herstellung einer 100 mg/ml Stammlösung in physiologischer Kochsalzlösung gekennzeichnet. Eine 50fache Verdünnung dieser Stammlösung mit 1,0 mM Eisen(II)-sulfat ergab nach Inkubation über Nacht, um die Vervollständigung der Reaktion zwischen dem Chelatbildner und dem Eisen sicherzustellen, einen Extinktionswert von 1,703 bei 429 nm. Die Deferoxamin- Konzentration in der Stammlösung betrug folglich 37,0 mM. (Der millimolare Extinktionskoeffizient von Ferrioxamin (DFO-Eisenkomplex) liegt bei 2,3 cm&supmin;¹1). Da das Molekulargewicht des eingebauten DFO als 560 erachtet werden kann (da das Methansuklfonatanion verlorengegangen ist), enthielt der Feststoff corca 20,7 mg DFO pro 100 mg Material, während es sich bei dem Rest um Dextran-Carrier handelte.
Das Desxtrran-Deferoxamin-Addukt war in Kochsalzlösung bis zu 200 mg/ml löslich und ergab eine ziemlich visköse, leicht gelbliche Lösung. Die Gesamtrückgewinnung von Deferoxamin in den 8,7 g des Endprodukts betrug 1,80 g. Das initial zugesetzte DFO (6,56 g) enthält 5,6 g Chelatbildner (bei dem Rest handelt es sich um Anion). Folglich wurden 32% des Deferoxamin-Chelatbildners in das Polymer-Addukt eingebaut.

Beispiel 2 - Immobilisation von Deferoxamin an Hyaluronsäure

Hyaluronsäure wurde von Diagnostic, Inc., Minneapolis, MN, bezogen. Es wurde eine Probe von 1,0 g Natriumhyaluronat (Chargen-Nr. VI 1686) verwendet. Das Material war mit Alkohol gefällt und getrocknet worden.
Für die Periodat-Oxidation wurden 400 mg Hyaluronsäure in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Oxidation wurde in Gegenwart von 0,2 M Natriumperchlorat auf Grundlage veröffentlichter Studien [Scott, J.E. und Harbinson, R.J. (1968), Histochemie, 14, 215-220] durchgeführt, die hierin in Form eines Literaturverweises aufgenommen werden. Die Hyaluronsaure-Stammlösung wurde mit 20 mM Natriummetaperiodat in Gegenwart von 0,2 M Natriumperchlorat zur Reaktion gebracht. Das Material wurde 18 Stunden bei 4ºC gelagert. Das unreagierte Periodat wurde dann mit 0,04 M Bisulfit titriert. Als die letzte gelbe Farbe verschwunden war, wurde die aktivierte Hyaluronsäure umfassend gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die aktivierte Hyaluronsäure wurde im Anschluß daran lyophilisiert.
Lyophilisierte aktivierte Hyaluronsäure (150 mg) wurde in 3,0 ml physiologischer Kochsalzlösung (0,15 M NaCl) gelöst. Die kovalente Bindung von Deferoxamin wurde durch Zugabe des Chelatbildners zu einer Konzentration von 100 mM (197 mg) und das Reagierenlassen des Gemischs über Nacht bei Raumtemperatur eingeleitet. Am folgenden Tag wurden 18,8 mg Natriumcyanborhydrid zugefügt. Dies wurde weitere 24 Stunden zum Reagieren stehengelassen, zu welchem Zeitpunkt 10 mg Natriumborhydrid zugesetzt wurden. Nachdem die Bläschenbildung aufgehört hatte (3 Stunden), wurde das Reaktionsgemisch ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Hyaluronsäure-DFO- Addukt lyophilisiert. Die Ausbeute belief sich auf 180 mg Feststoff.
Zur Bestimmung des Deferoxamingehalts des (Hyaluronsäure- Deferoxamin)-Derivats wurden 50 mg in 1,0 ml Kochsalzlösung gelöst. Ein aliquoter Teil von 100 ml wurde zu 3,0 ml 1,0 mM Eisen(II)-sulfat hinzugefügt, und die Farbe konnte sich über Nacht entwickeln. Für diese Zubereitung wurde eine optische Dichte von 1,800 erhalten. Dies deutet darauf hin, daß die Deferoxamin-Konzentration in der Stammlösung 24,3 mM betrug. Dieser Wert entspricht einer Gewicht-pro- Volumen-Konzentration in der Stammlösung von 13,6 mg/ml. Da die tatsächliche Konzentration der Stammlösung 50 mg/ml betrug, läßt sich folgern, daß circa 27% des Feststoffs das kovalent gebundene Deferoxamin darstellen. Da 180 mg Feststofferhalten wurden und 27,2% davon gebundenes Deferoxamin darstellen, kann daraus geschlossen werden, daß circa 25% der 197 mg des verbrauchten Deferoxamins aus dem Polymermaterial zurückgewonnen wurden.

Beispiel 3 - Immobilisation von Deferoxamin an Hydroxyethylstärke

Das Ausgangsmaterial für dieses Verfahren war Hydroxyethylstärke von klinischem Gütegrad (HespanTM, American Critical Care). Für die Periodatoxidation wurden 100 ml einer 6%igen Hydroxyethylstärke-(HES)-Lösung entnommen und festes Natriummetaperiodat auf 100 mM zugefügt. Das Material wurde 18 Stunden lang bei 25ºC reagieren gelassen. Am folgenden Tag wurde das unreagierte Periodat mit 132 ml 200 mM Natriumbisulfit titriert. Als die Lösung klar war, wurde die aktivierte HES ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte HES (50 ml), die an diesem Punkt eine Konzentration von 20 mg/ml besaß, wurde mit Deferoxamin reagieren gelassen. Der Chelatbildner wurde in der HES-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 50 mM (1,65 g) gelöst. Natriumcyanborhydrid (157 mg) wurde nach einer halben Stunde zugesetzt, während Natriumborhydrid (95 mg) am folgenden Tag zugegeben wurde. Nachdem die Bläschenbildung aufgehört hatte, erfolgte die Einleitung einer umfassenden Dialyse. Das dialysierte Material wurde lyophilisiert, und es wurden 0,97 g des genannten Materials erhalten. Das zurückgewonnene Material war in Kochsalzlösung vollständig löslich, und es wurde eine Stammlösung von 20 mg/ml angesetzt. Eine sechzehnfache Verdünnung dieses Materials mit 1 mM Eisen(II)-sulfat wies nach einer über Nacht stattgefundenen Inkubation bei 429 um eine Extinktion von 1,132 auf. Die Deferoxamin-Konzentration in der Stammlösung wurde als 7,9 mM bzw. 4,4 mg/ml errechnet. Dies deutet darauf hin, daß 22 Gew.-% des HES-Deferoxamin-(HES-DFO)- Addukts Deferoxamin war.

Beispiel 4 - Immobilisation von Deferoxamin an Methylcellulose

Die Methylcellulose wurde von Dow Chemical Co, Midland, MI, bezogen. Der Hersteller bezeichnet das Polymer als "EXPERIMENTALPOLYMER XD 8928.00". Das Material trug den Handelsnamen METHOCELTM. Als Materialquelle wurde ein 500 g Behälter mit Celluloseether, Charge MM841002221X, verwendet.
Die Löslichkeit der Methylcellulose in Wasser ist begrenzt. Lösungen des XD-Polymers bei Konzentrationen über 3% neigen dazu, höchst viskös zu sein. Die Aktivierung wurde auf die folgende Weise durchgeführt.
Eine 3%ige Lösung des XD-Polymers wurde durch Lösen von 3,0 g des Polymers in 100 ml destilliertem Wasser angesetzt. Das Material wurde über Nacht gerührt. Das Volumen verminderte sich aufgrund von Verdunstung auf 90 ml. An diesem Punkt wurden zur Erzielung einer Periodatkonzentration von 100 mM 1,92 g Natriumperiodat zugesetzt. Das Rühren wurde über Nacht fortgesetzt. Das gerührte Material wurde mit 100 mM Bisulfit titriert. Während des Titrationsverfahrens bildete sich ein schweres braunes Präzipitat. Nach Zugabe von 200 ml 100 mM Bisulfit wurde ein Gemisch aus weißem und braunem amorphem Präzipitat in einer klaren Lösung beobachtet. Im Anschluß an das ausgiebige Rühren (48 Stunden) löste sich das gesamte Präzipitat schließlich auf. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine ausgiebige Dialyse eingeleitet. Das Produkt wurde lyophilisiert und wird hierin als "aktiviertes" XD bezeichnet.
Ein Teil einer 10 mg/ml wäßrigen Lösung aus aktiviertem XD wurde mit 100 mM Deferoxamin behandelt (1,31 g in 20 ml). Nachdem sich das Deferoxamin aufgelöst hatte, wurde zu einer Konzentration von 100 mM (126 mg) festes Natriumcyanborhydrid zugefügt. Das Material wurde über Nacht reagieren gelassen, an welchem Punkt zu einer Konzentration von 100 mM festes Natriumborhydrid (76 mg) zugegeben wurde. Sobald die Bläschenbildung aus dem Borhydrid aufgehört hatte, wurde eine umfassende Dialyse eingeleitet. Das Material, das als XD-DFO bezeichnet wird, wurde nach mehreren Tagen der Dialyse gegen destilliertes Wasser mit 5- bis 6maligem Wechsel des 15 l fassenden Glasballons lyophilisiert.
Zur Bestimmung des Einbaugrades von Deferoxamin in XD-DFO wurde aus der lyophilisierten Zubereitung in physiologischer Kochsalzlösung eine Stammlösung von 50 mg/ml angesetzt. Die Stammlösung wurde dann mit frisch hergestelltem Eisen(II)-sulfat (1,0 mM in Kochsalzlösung) 31fach verdünnt, und die optische Dichte wurde nach einer verlängerten Inkubationszeit bei 429 um abgelesen. Der endgültige Extinktionswert lag bei 1,521, was darauf hindeutete, daß die Deferoxamin-Konzentration in der XD- DFO-Stammlösung 20,5 mM betrug. Der Gewichtsanteil von Deferoxamin in diesem Material betrug folglich 11,5 mg/ml, was 23,0 Gew.-% des Polymer-Chelatbildners entspricht. Da eine Methylcellulose-Lösung von 50 mg/ml einer 280 mM Lösung der methylierten Hexose-Untereinheit (ungefähres Molekulargewicht 108) entspricht, besaß das derivatisierte Polymer für je 13-17 Methylhexose-Untereinheiten ein DFO- Molekül. Dabei handelte es sich in etwa um den gleichen Inkorporationsgrad wie er für das Deferoxamin- Dextranderivat erhalten wurde.

Beispiel 5 - Immobilisation von Deferoxamin an Inulin

Es wurden zwei Inulinformen von Sigma Chemical Co. bezogen. Eine wurde aus Zichorienwurzel (Katalog-Nr. I-2255) und die andere aus Dahlienknollen (Katalog-Nr. I-3754) zubereitet. Lösungen aus beiden Inulinformen deuteten darauf hin, daß das Material aus der Zichorienwurzel etwas leichter löslich war als die andere Form. Folglich wurde als Substrat das Material aus der Zichorienwurzel gewählt.
Die Periodat-Aktivierung wurde unter Verwendung von 5,0 g in destilliertem Wasser gelöstem I-2255-Material durchgeführt. Es wurde bemerkt, daß die Löslichkeit des Inulins durch mäßiges Erwärmen auf 60-70ºC deutlich verbessert wurde. Die Inulin-Konzentration lag während der Oxidation über Nacht mit 100 mM Periodat bei 5%. Das unreagierte Periodat wurde durch 200 mM Natriumbisulfit reduziert. Die 100 ml der I-2255-Lösung erforderten 129 ml Bisulfit, bevor die gelbe Endfarbe verschwand. Das aktivierte Inulin wurde dann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach drei Dialysatwechseln wurden 350 ml verdünntes aktiviertes Inulin erhalten. Die Lösung enthielt etwas Feststoff und wurde deshalb zentrifugiert. Der klare überstand wurde zurückbehalten, und eine Fraktion der aktivierten Inulin-Lösung wurde lyophilisiert.
Zur Zubereitung des Inulin-Deferoxamin-Komplexes wurde 1,0 g des aktivierten Inulins (I-2255) in 50 ml physiologischer Kochsalzlösung unter leichtem Erhitzen gelöst. Festes Deferoxamin wurde zu einer Konzentration von 50 mM (1,64 g) hinzugefügt. Diese Lösung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. An diesem Punkt wurde Natriumcyanborhydrid zu einer Konzentration von 50 mM (0,157 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde 18 Stunden gerührt. Zur Erzielung einer Endkonzentration von 50 mM (0,095 g) wurde Natriumborhydrid zugesetzt. Dieses Gemisch wurde weitere 24 Stunden gerührt, an welchem Punkt die Dialyse unter Verwendung von Absperrmembranen für niedriges Molekulargewicht eingeleitet wurde. Nach 6maligem Wasserwechsel über 96 Stunden wurde die Dialyse abgeschlossen und ergab 90 ml des Inulin-Deferoxamin- Derivats. Dieses Material wurde lyophilisiert, um ein Produkt von 0,86 g zu erhalten.
Zur Bestimmung des Einbaugrades von Deferoxamin in den Inulin-Deferoxamin-Komplex wurde eine Lösung aus dem Material angesetzt, die 20 mg/ml enthielt. Dieses Material war bei dieser Konzentration leicht löslich. Ein kleiner aliquoter Teil (100 ml) dieses Materials wurde mit 3,9 ml 1,0 mM Eisen(II)-sulfat gemischt. Nach Abschluß der Reaktion wurde bei 429 nm eine optische Dichte von 0,656 erhalten. Wenn man den Verdünnungsfaktor und den bekannten Extinktionskoeffizienten von Ferrioxamin berücksichtigt, wurde ermittelt, daß die Konzentration von Deferoxamin in der Stammlösung bei 11,4 mM lag. Unter Zugrundelegung eines Molekulargewichts von Deferoxamin von 560 lag die Konzentration von DFO in mg/ml bei 6,4 mg/ml. Da das Gesamtgewicht von Inulin-Deferoxamin in der Stammlösung 20 mg/ml betrug, handelte es sich bei 32% des Feststoffes um gebundenen Chelatbildner. Wenn darüber hinaus angenommen wird, daß das Molekulargewicht von Inulin 5.000 beträgt, war die molare Konzentration von Inulin in der Stammlösung 4 mM, was darauf hindeutet, daß jedes Inulinmolekül circa drei Moleküle gebundenen Chelatbildner enthielt.

Beispiel 6 - Immobilisation von Deferoxamin an Serumalbumin

Glutaraldehyd wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (Gütegrad I, speziell gereinigte 25%ige wäßrige Lösung) gekauft. Das Glutaraldehyd wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um 10 ml einer 100 mM Stammlösung zu ergeben. Eine 100 mM Deferoxamin-Stammlösung wurde durch Auflösung von 656 mg Deferoxamin in 10 ml Kochsalzlösung hergestellt. Die Glutaraldehydlösung wurde der Deferoxaminlösung langsam zugesetzt, um 20 ml einer Lösung zu erhalten, die sowohl für Deferoxamin als auch Glutaraldehyd 50 mM war. Die Lösung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen.
Es wurde bovines Serumalbumin (BSA, Sigma, Fraktion V Pulver, A7906, Charge 848-0099) eingesetzt. BSA (750 mg) wurde direkt in 7,5 ml der Lösung aus Deferoxamin und Glutaraldehyd gelöst. Es wurde Natriumcyanborhydrid (40 mg) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden sorgfältig gerührt. Es wurde eine ausgiebige Dialyse eingeleitet (fünf Wechsel über 72 Stunden). Als die Dialyse beendet wurde, konnte etwas ausgefälltes Protein beobachtet werden. Das Material wurde zentrifugiert, und die kleinen Pellets wurden weggeworfen. Der klare überstand wurde auf den Gehalt an Deferoxamin analysiert. Die Lösung des Protein-Deferoxamin-Konjugats, die ein Volumen von circa 15 ml aufwies (die 2fache Verdünnung während der Dialyse verminderte die Konzentration von 100 auf 50 mg/ml), wurde 12fach mit 1,0 mM Eisen(II)-sulfat verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht in der Kälte stehengelassen und wurde gegen eine ähnlich verdünnte Albumin-Leer-Lösung gelesen. Bei 429 nm wurde eine Extinktion von 0,946 beobachtet. Dies deutet darauf hin, daß die Stammlösung des Albumin- Deferoxamin-Addukts 4,9 mM Deferoxamin aufweist. Da die Proteinkonzentration circa 0,75 mM beträgt, liegen 6,7 Mole Deferoxamin pro Mol Protein vor.

Toxizitätsstudien

Es wurde festgestellt, daß Deferoxamin eine potentiell problematische, sowohl chronische als auch akute Toxizität aufweist. In bezug auf die akute Toxizität hat eine Überdosis Deferoxamin zu Tachykardie und Hypotension geführt; vgl. zum Beispiel Witten, C.F. et al., "Studies in Acute Iron Poisoning. I. Desferrioxamine in the Treatment of Acute Iron Poisoning: Clinical Observations, Experimental Studies, and Theoretical Considerations" [Studien zur akuten Eisenvergiftung. I. Desferrioxamin in der Behandlung der akuten Eisenvergiftung: Klinische Beobachtungen, experimentelle Studien und theoretische Erwägungen], PEDIATRICS 1965, 36 : 322-335; Whitten, C.F. et al., "Studies in Acute Iron Poisoning: II. Further Observations on Desferrioxamine in the Treatment of Acute Experimental Iron Poisoning" [Studien zur akuten Eisenvergiftung: II: Weitere Beobachtungen zu Desferrioxamin in der Behandlung der akuten experimentellen Eisenvergiftung], PEDIATRICS 1966, 38 : 102-110; Westlin, W.F. et al., "Deferoxamine in the Treatment of Acute Iron Poisoning. Clinical Experience with 172 Children" [Deferoxamin in der Behandlung der akuten Eisenvergiftung. Klinische Erfahrung mit 172 Kindern], CLIN. PEDIAT. 1966, 5 : 531-535; und Brunner, H., et al, "Wirkungen von Desferrioxaminmethansulfonat auf Kreislauf und Nierenfunktion", HELV. PHYSIOL. ACTA 1963, 21:C3-C6; diese Offenbarungen werden hierin in Form eines Literaturverweises aufgenommen. Akute Toxizität von Deferoxamin wird bei oder in der Nähe therapeutischer Spiegel beobachtet. Wie aus den folgenden Experimenten zu entnehmen ist, ist erfindungsgemäßes immobilisiertes Deferoxamin bei weitem nicht so toxisch wie Deferoxamin selbst.

Beispiel 8 - Toxizität von immobilisiertem Deferoxamin Exeriment 1

Studien zur akuten Toxizität von Deferoxamin und Dextran- Deferoxamin-Addukt wurden durch intravenose (i.v.) Injektion in männliche Swiss-Webster-Mäuse durchgeführt. Stammlösungen aus Deferoxamin und Dextran-Deferoxamin- Addukt wurden in isotonischer Kochsalzlösung angesetzt. Es wurde eine Konzentration von 200 mg/ml für das Addukt gewählt, weil die Viskosität bei höheren Konzentrationen nicht zu kontrollieren war. Die Konzentration von Deferoxamin (frei oder immobilisiert) betrug in beiden Stammlösungen 74 mM. Der prozentuale Gewichtsanteil von Deferoxamin in der Dextran-Deferoxamin-Zubereitung betrug 20,7%, während der Rest aus dem Carrier-Polymer Dextran bestand. Ein aliquoter Teil der Stammlösung wurde mit isotonischer Kochsalzlösung auf 1,0 ml verdünnt, wodurch die Aufrechterhaltung eines konstanten Injektionsvolumens die ganze Toxizitätsstudie über ermöglicht wurde. Die Mäuse wurden gewogen und vor der Injektion immobilisiert. Eine geeignete Menge freien Deferoxamins bzw. Addukts wurde in 1,0 ml isotonischer Kochsalzlösung hergestellt und innerhalb von 30 Sekunden oder weniger in die Schwanzvene injiziert.
Die Ergebnisse werden in Fig. 2 aufgezeigt. Die akute Toxizität von freiem Deferoxamin war leicht zu erkennen, wobei die LD&sub5;&sub0; (die Dosis, bei der 50% der Tiere getötet werden) in der Nähe von 250 mg/kg lag.
Bei allen Tieren, die 100-250 mg/kg erhielten, trat mühsames Atmen auf, das über mehrere Minuten anhielt.
Im Fall von Dextran-Deferoxamin-(DEX-DFO)-Addukt wurde festgestellt, daß die Toxizität überraschend und dramatisch reduziert war, bis zu einem Punkt, an dem die Injektion selbst von 200 mg Dextran-Deferoxamin in eine 20 g schwere Maus nicht toxisch war. Dies entspricht 2000 mg/kg einer gebundenen Deferoxamin-Komponente bzw. nahezu das 10fache der letalen Dosis des freien Arzneimittels. Fig. 2 zeigt, daß die letale Dosis von Deferoxamin als einem Addukt mit Dextran zwischen 3,5 und 4,0 g/kg bzw. circa 15mal höher als die des freien Arzneimittels liegt.

Experiment 2

Studien, für die sowohl Inulin- als auch Hydroxyethylstärke-Derivate von Deferoxamin verwendet wurden, lassen erkennen, daß eine geringe Toxizität eine allgemeine Eigenschaft löslicher Polymer-Derivate des Chelatbildners ist. Das Inulin-DFO-Addukt wurde an Mäuse verabreicht, und die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die LD&sub5;&sub0; über 2,5 g/kg (Gewicht des gebundenen Chelatbildners, nicht das Gesamtadduktgewicht, pro Kilogramm Körpergewicht) liegt, obwohl der tatsächliche LD&sub5;&sub0;-Spiegel nicht festgestellt wurde.
Auf ähnliche Weise weist das Hydroxylethylstärke-Derivat bei einer Dosis von 1,0 g Chelatbildner-Komponente/kg Körpergewicht keine apparenten unerwünschten Wirkungen auf. Beide dieser polymeren DFO-Formen sind bei weitem nicht so toxisch wie das freie Arzneimittel.

Beispiel 9 - Vaskuläre Verweilzeit des freien Arzneimittels, des immobilisierten Arzneimittels und des Substrats

a. In-vivo-Clearance von Deferoxamin und Dextran- Deferoxamin.

Dosen von 200 ul 27,5 mM wäßrigem Deferoxamin oder einer wäßrigen Lösung, die 3,6 mg (5,5 uM) des Dextran- Deferoxamin-Addukts (immobilisiertes DFO) enthielt, wurden in die Schwanzvene von 30-40 g schweren männlichen Swiss- Webster-Mäusen injiziert. Von mit Ether betäubten Mäusen wurde 5, 15, 30 und 60 Minuten nach der Injektion durch axillare Inzision Vollblut entnommen. Es wurde pro Zeitpunkt eine Maus benutzt, während 2 nicht injizierte Mäuse als Kontrollen verwendet wurden.
Für jede Blutprobe wurden 50 ul 200 mM wäßriges Eisen(II)sulfat zu 100 ul des um das 10fache verdünnten Vollbluts gegeben, und das Gemisch wurde 5 Minuten inkubiert. Danach wurden 55,0 ul 100%ige Trichloressigsäure zugesetzt. Die Probe wurde kräftig verwirbelt und dann 5 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Der Überstand (325 ul) wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen gebracht und 150 ul 2 M Natriumacetat (pH 5,5) zugesetzt. Nach 18 Stunden bei 25ºC wurde die Probe eine Minute bei 11.000g zentrifugiert und die Extinktion von 425 ul eines aliquoten Teils des geklärten Überstandes bei 429 nm abgelesen.
Konzentrationen von Deferoxamin bzw. gebundenem Deferoxamin wurden auf der Grundlage eines Absorptionsvermogens von 2,3 cm¹ für eine 1,0 mM Lösung errechnet, und der Kontrollwert wurde vor dem Auftragen in eine Kurve subtrahiert. Fig. 1 zeigt die Konzentrationsabnahme von Deferoxamin (DFO) und von Dextran-gebundenem Deferoxamin (immobilisiertem DFO) in Abhängigkeit von der Zeit. Aus den in Fig. 1 zusammengefaßten Daten geht hervor, daß das gebundene (immobilisierte) Deferoxamin viel länger im Blutstrom zurückgehalten wurde als freies Deferoxamin.

b. Weitere Studien zur vaskulären Retention in vivo von polymeren Deferoxamin-Konjugaten.

Männliche Swiss-Webster-Mäuse wurden festgehalten und bekamen 0,5 ml des in Kochsalz aufgelösten Chelatbildners in die Schwanzvene injiziert. Die Tiere wurden in den Käfig zurückgebracht und nach einer vorher festgelegten Zeit mit Ether anästhesiert und bekamen mittels axillarer Inzision Blut entnommen.

i. Verfahren für die Messung von freiem Deferoxamin im Blut.

Das Blut von getöteten Tieren wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt. Das Vollblut (100 bis 500 ul) wurde auf 1000 ul verdünnt, mit 50 ul 200 mM Eisen(II)-sulfat (frisch hergestellt) vermischt und 15 Minuten stehengelassen. Es wurden 55 ul 100%ige Trichloressigsäure zugegeben, und das Gemisch wurde gründlich gemischt und in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Von dem Überstand wurden 352 ul entnommen und mit 150 ul 2,0 M Natriumacetat, pH 5,5, vermischt. Dieses Material wurde erneut zentrifugiert und die Extinktion des Überstandes bei 429 nm gegen ein aus Blut hergestelltes Leermaterial, das kein Deferoxamin enthielt, gemessen. Die Konzentration von freiem Deferoxamin in Vollblut wurde auf Grundlage eines molaren Extinktionskoeffizienten des Ferrioxamins von 2.300 bei pH 5,5 errechnet. Diese Methodik kann für das Messen des freien Arzneimittels in Blut oder Plasma genutzt werden und arbeitet auch zufriedenstellend für alle Deferoxamin- Derivate, die nicht mit Trichloressigsäure gefällt werden.

ii. Verfahren zum Messen Molymerer DFO-Derivate in Plasma

Das Blut von getöteten Tieren wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt und zentrifugiert. Plasma (50 ul) wurde entnommen und mit 450 ul einer 10 mM Natriumcitrat-Lösung mit 1 mM Eisen(II)-sulfat gemischt. Der pH der letzteren Lösung war neutral oder leicht alkalisch. Da die meisten Plasmaproben aufgrund der Lysis während des Blutabnahmeverfahrens etwas Hämoglobin enthalten, wurde durch Verdünnung des Plasmas in Citrat ohne Eisen(II)sulfat ein Kontrollröhrchen vorbereitet. Da das Hämoglobin bei 429 nm eine sehr hohe optische Dichte besitzt, wurden die Röhrchen bei 450 nm abgelesen, wodurch die vom Hämoglobin herrührende Störung um zwei Drittel vermindert wurde, während das Ferrioxamin-Signal um weniger als 5% reduziert wurde. Es wurde ermittelt, daß der molare Absorptionskoeffizient für Ferrioxamin bei 450 um 2.210 cm&supmin;¹ beträgt. Die Röhrchen wurden über Nacht bei 4ºC stehengelassen, um sicherzustellen, daß das gesamte Deferoxamin mit dem zugegebenen Eisen vollständig in Reaktion getreten ist. Dieses Verfahren ist für Deferoxamin-Konzentrationen im Plasma bis zu 5 mM geeignet. Wenn höhere Deferoxamin-Konzentrationen bzw. Deferoxamin- Konjugat-Konzentrationen angetroffen wurden, war eine größere Verdünnung von Plasma in der Citrat-Fe-Lösung erforderlich.
In Fig. 3 werden die vaskulären Verweilzeiten von vier makromolekularen Addukten von DFO mit dem freien Arzneimittel verglichen. Die zur Veranschaulichung der Geschwindigkeit des Verschwindens der jeweiligen Verbindung benutzten Symbole werden in der Figur aufgelistet. Die DFO- Addukte von Hydroxyethylstärke (HespanTM) und Serumalbumin wiesen nach der intravenösen Injektion ungefähr das gleiche Verhalten auf. Die Arzneimittelkonzentrationen werden als prozentualer Anteil der Konzentration ausgedrückt, die eine Minute nach der Injektion erzielt wird. Das Dextran-Derivat hatte eine offenbare Halbwertszeit von 30 Minuten. Die veränderten Formen der Kurve könnten eine breitere Verteilung der Molekulargewichte im Vergleich zu den anderen beiden polymeren DFO-Formen widerspiegeln. Das kleine Polysaccharid, Inulin, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von circa 5000 Dalton wies eine ziemlich geringe vaskuläre Halbwertszeit von 10 Minuten auf.

C. Vergleich der Clearance-Geschwindigkeit von Polymer- DFO-Addukt zu freiem Polymer.

Mit Tritium markiertes Dextran wurde im Reduktionsschritt nach der Periodat-Aktivierung des Dextrans durch Substitution von mit Tritium markiertem Natriumborhydrid hergestellt. Das mit Tritium markierte Dextran-Deferoxamin wurde im Reduktionsschritt nach Einführung des Deferoxamins unter Verwendung von mit Tritium markiertem Natriumcyanborhydrid hergestellt. In beiden Fällen wurde die Synthese wie zuvor für die Herstellung des Dextran- Deferoxamin-Addukts beschrieben durchgeführt. Nach der radioaktiven Markierung wurden die Produkte zur Entfernung von freier Markierung dialysiert und lyophilisiert. Die radioaktiv markierten Produkte wurden aufeine Konzentration von 12,5 mg/ml in isotonischer Kochsalzlösung verdünnt und die spezifischen Aktivitäten wurden durch Flüssigkeitsszintillationszählung gemessen. Das mit Tritium markierte Dextran wurde mit 12,5 mg/ml nicht radioaktivem Dextran dergestalt verdünnt, daß die gleiche spezifische Aktivität wie für das Dextran-Deferoxamin-Konjugat erreicht wurde. Die endgültige spezifische Aktivität betrug für jede Lösung 1,4 · 10&sup7; Zerfälle/min/ml.
200 ul Dextran oder Dextran-Deferoxamin wurden in die Schwanzvene von 5 30 g schweren männlichen Swiss-Webster- Mäusen injiziert. Jedes Tier erhielt in der Initialinjektion circa 2,5 · 10&sup6; Zerfälle/min. Die Tiere wurden 0, 30, 60, 120 und 240 Minuten nach der Injektion getötet. Blutproben wurden durch axillare Inzision unter Verwendung von trockenem Heparin als ein Antikoagulans gewonnen. Das Plasma wurde durch Zentrifugation bei 1000 · g abgetrennt, und ein aliquoter Teil von 100 ul wurde in 15 ml Flüssigkeitsszintillationsfluid gezählt. Alle Zählungen wurden einer Quenchkorrektur unterzogen und in Zerfälle/min/ml umgewandelt. Eine halblogarithmische Kurvendarstellung der Plasmazerfälle/min/ml gegen Minuten wird in Fig. 10 gezeigt.
Es wurde festgestellt, daß die Clearance-Geschwindigkeit des Substrats (Dextran) erheblich größer ist als die des Addukts (Dextran-Deferoxamin). Dies deutet auf einen zusammenwirkenden Effekt des Substrats und der chelatbildenden Komponente hin, die so wirken, daß sie den Chelatbildner im Blutstrom halten, wo er als 'Fänger' für Eisen oder andere Metalle aktiv ist.

Beispiel 10 - Chelatbildungsvermögen des immobilisierten Deferoxamins

Die eisenbindenden Charakteristika des konjugierten Chelatbildners wurden durch die folgenden Studien untersucht.

a. Reduzierende Verdrängung von Eisen aus konjugiertem Ferrioxamin.

Hierin wird die Bezeichnung "Ferrioxamin" benutzt, um den Chelatbildner/Metall-Komplex zu bezeichnen. Die Verdrangung von Eisen aus Ferrioxamin durch Gallium unter reduzierenden Bedingungen wurde als eine Probe für Änderungen der eisenbindenden Charakteristika des konjugierten Chelatbildners verwendet. Anhand der Literatur wurde ermittelt, daß verschiedene Siderophore in Gegenwart von Ascorbat und Gallium ihr gebundenes Eisen bei verschiedenen Raten freisetzen und daß dies wahrscheinlich auf strukturelle Unterschiede zwischen den Siderophoren zurückzuführen ist, vgl. Emery, T., "Exchange of Iron by Gallium in Siderophores" [Austausch von Eisen durch Gallium in Siderophoren", Biochemistry, Band 25, S. 4629-4633 (1986).
Die Verdrängung von Eisen aus Ferrioxamin wurde spektralphotometrisch unter Verwendung von Ferrozin[3-(2- pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4-triazin-p,p'-disulfonsäure] als Indikator verfolgt. Ferrozin bildet mit reduziertem Eisen einen blauen Komplex, welcher bei 562 um ein Absorptionsmaximum und ein molares Absorptionsvermögen von 29.000 W&supmin;¹cm&supmin;¹ besitzt. An Dextran mit einem Molekulargewicht von 40.000 gebundenes Ferrioxamin wurde mit unmodifiziertem FO wie unten beschrieben verglichen.
3 ml einer Lösung mit 2 mM Ferrozin, 20 mM Natriumascorbat, 0,05 mM Chelatbildner, 0,05 M Natriumacetat, pH 5,4, wurden in 4 ml Küvetten pipettiert und die Extinktion bei 562 nm (25ºC) überwacht. Nach fünf Minuten wurden zu dem Chelatbildner 158 ul 10 mM Galliumnitrat zugefügt, was eine Galliumendkonzentration von 0,5 mM ergab. Die Zunahme der Extinktion aufgrund der Bildung des Eisen(II)-Ferrozin- Komplexes wurde weitere fünfzehn Minuten gemessen. In Fig. 4 ist die Extinktionsänderung als eine Funktion der Zeit veranschaulicht. Die Verdrängungskurven von freiem und immobilisiertem Deferoxamin sind sehr ähnlich. Überraschenderweise tritt nach der Konjugation von Deferoxamin keine nachweisbare Änderung der Metallbindung auf.

b. Kompetitive Bindung von Eisen durch freies und immobilisiertes Deferoxamin

Die relativen Eisenbindungsaffinitäten von Deferoxamin und Dextran-Deferoxamin (DEX-DFO) wurden anhand kompetitiver Bindungsexperimente beurteilt. Das Eisenradionuklid, &sup5;&sup9;Fe, wurde einer aus den beiden Chelatbildnern bestehenden Mischung zugefügt, und die Verteilung des chelatgebundenen Eisens wurde durch die Gelfiltrations-Chromatographie bestimmt, der sich eine Flüsigkeitsszintillationszählung der Eluatfraktionen anschloß. Außerdem wurde 96 Stunden nach der ursprünglichen Bestimmung die Verteilung des chelatgebundenen Eisens analysiert, um zu prüfen, ob irgendwelche Änderungen aufgetreten waren.
Spezifischer wurde in 150 mM Natriumchlorid eine Lösung angesetzt, die 0,05 mM Deferoxamin und 0,05 mM Dextran- Deferoxamin (Konzentration auf Grundlage von Deferoxamin- Äquivalenten) enthielt. Diese Lösung wurde mit einem 0,22 u Filter durch Filtration sterilisiert, um während der 4tägigen Inkubation Bakterienwachstum zu verhindern. Insgesamt wurden 20.000 Impulse/min &sup5;&sup9;Fe (6 pMol) pro ml Chelatbildnermischung zugesetzt. 500 ul der Lösung wurden sofort auf einer feinen, mit 150 mM NaCl äquilibrierten 1 · 12 cm Sephadex® G25-Säule chromatographiert. Die Trennungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, und es wurden aus 10 Tropfen bestehende aliquote Teile des Eluats gesammelt. Jede Fraktion wurde in 5 ml Zählfluid in einem Beckman LSI800 Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt. Die ursprünglichen Chelatbildner/&sup5;&sup9;Fe-Lösungen wurden 96 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen; danach schloß sich die Chromatographie eines zweiten aliquoten Teils von 500 ul an. Das Eluat wurde gesammelt und auf die gleiche Weise gezählt wie die Initialprobe. Die resultierenden Chromatogramme für die Anfangsverteilung und für die Probe nach 4 Tagen (96 Stunden) sind in Fig. 5 zusammengefaßt.
Beide Chelatbildner scheinen das Eisen mit etwa gleicher Affinität zu binden. Es findet signifikanterweise keine offensichtliche Nettobewegung von Eisen von einem Chelatbildner zum anderen in Abhängigkeit von der Zeit statt.

c. Vergleich der In-vivo-Aktivität von freiem Deferoxamin and Dextran-Deferoxamin

Für dieses Experiment wurden drei jeweils etwa 35 g wiegende männliche Swiss-Webster-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden immobilisiert, und jede wurde dann intravenös mit 200 ul Dextran-Deferoxamin-Addukt, freiem Deferoxamin oder Dextran injiziert. Für alle drei Verbindungen wurde Wasser als Verdünnungsmittel verwendet. Fünfzehn Minuten nach der ersten Injektion wurden je 200 ul eines 40 mM Citratpuffers, pH 6,6, der 338 ug/ml &sup5;&sup9;Fe enthielt, in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Jede Maus wurde dann in einen getrennten "Stoffwechsel"-Käfig gebracht. Nach 5 Stunden wurden der Urin und die Fäzes gesammelt und die Innenseite der Käfige mit je 2 ml Wasser gespült. Das Spülwasser wurde den gesammelten Ausscheidungen zugefügt, und die Mischung wurde durch ein grobmaschiges Sieb gefiltert und auf ein Gesamtvolumen von 10 ml aufgefüllt. 500 ul der jeweiligen verdünnten Ausscheidungen wurden mit 10 ml Flüssigkeitsszintillationsfluid getrennt verdünnt und gezählt. Für jedes Beispiel waren die ausgeschiedenen Netto-Impulse/min wie folgt:
Probe Aus Ausscheidungen zurückgewonnene Netto-Impulse/min
Dextran-Kontrolle 4
Freies Deferoxamin 352
Dextran-Deferoxamin 255. 680
Zu Anfang erhielt jede Maus 1,64 · 10&sup6; Impulse/min. Folglich schied die Maus, die das Dextran-Deferoxamin-Konjugat erhielt, 16% des von ihr erhaltenen radioaktiven Eisens aus. Die anderen beiden Mäuse schieden kein Eisen aus. Wahrscheinlich ist die für das Addukt beobachtete erhöhte vaskuläre Verweilzeit ein signifikanter Faktor, der zu den unterschiedlichen Ergebnissen von freiem Deferoxamin und Dextran-Deferoxamin beitrug. Dies bedeutet, daß das freie Deferoxamin anscheinend im Gefäßsystem nicht lange genug zurückgehalten wurde, um unter den Testbedingungen wirksam zu sein. Dieser Unterschied in Kombination mit einer überraschend geringen Toxizität macht das Addukt für eine Vielzahl klinischer Anwendungszwecke wünschenswert.

Beispiel 11 - Bioloaische Aktivitäten von Deferoxamin- Addukten

In vergangenen Jahrzehnten haben Biochemiker die schädlichen Einflüsse von freiem oder reaktivem Eisen untersucht, während in Experimenten neueren Datums seine Signifikanz für Biologie und Medizin untersucht wurde. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, daß Eisen in Verbindung mit Sauerstoffradikalen bei einer Anzahl verschiedener klinischer Situationen, einschließlich beim Myokardinfarkt, Schock, Schlaganfall, chirurgischen Eingriffen und Traumen eine wichtige Rolle spielt. Die Daten implizieren, daß die Chelatbildung oder Inaktivierung von Eisen ein erhebliches therapeutisches Potential haben könnte, möglicherweise aufgrund der Bedeutung von Eisen als einem Redoxkatalysator bei vielen schädlichen biochemischen Prozessen.
Der einzige akzeptable Eisenchelatbildner in vivo, Deferoxamin, besitzt aufgrund seiner Halbwertszeit und Toxizität im Kreislauf erhebliche therapeutische Limitationen. Oben sind eine Reihe verschiedener modifizierter (immobilisierter), auf Deferoxamin basierender Chelatbildner beschrieben. Überraschenderweise besitzen die immobilisierten Deferoxaminformen eine wesentlich längere Halbwertszeit in vivo und eine relativ geringe Toxizität. Es wurde außerdem in Beispielen oben nachgewiesen, daß sie wirksame Eisenchelatbildner sind. Die unten berichteten Experimente lassen erkennen, daß die immobilisierten Deferoxamin-Verbindungen von signifikantem Nutzen sein können, wenn anhand der Ätiologie eines klinischen Zustands eine eisenabhängige Pathophysiologie vermutet wird.

A. Weiterer Hintergrund

Ischämie kann entweder global oder fokal auftreten und ist eine Komponente von Schock, Myokardinfarkt, Schlaganfall, Trauma und einer Anzahl anderer Syndrome; vgl. Freeman, B.A. et al., "Biology of Disease: Free Radicals and Oxygen Injury" [Biologie der Krankheiten: Freie Radikale und Sauerstoff-Schädigungen], Lab Invest, Band 7, S. 412-426 (1982); Bulkley, G.B., "The Role of Oxygen Free Radicals in Human Disease Processes" [Die Rolle freier Sauerstoffradikale in menschlichen Krankheitsprozessen], Surgery, Band 94, S. 407-411 (1983); Slater, T.F. "Free Radical Mechanisms in Tissue Injury" [Mechanismus freier Radikale in Gewebeverletzungen], Biochem J., Band 222, S. 1-15 (1984); Halliwell B., et al., "Oxygen Toxicity, Oxygen Radicals, Transition Metals and Disease" [Sauerstofftoxizität, Sauerstoffradikale, Übergangsmetalle und Krankheit], Biochem J., Band 219, S. 1-14 (1984); McCord, J.M., "Oxygen-Derived Free Radicals in Postischemic Tissue Injury" [Von Sauerstoff abgeleitete freie Radikale bei der postischämischen Gewebeverletzung], N. Eng. J. Med., Band 312, S. 159-163 (1985); und Graf, E. et. al., "Iron-Catalyzed Hydroxyl Radical Formation" [Eisenkatalysierte Hydroxylradikalenbildung], J. Biol. Chem., Band 259, S. 3620-3624 (1984). In der Notfallmedizin begegnet man der Ischämie möglicherweise am häufigsten. Während der Gewebeischämie ist die Durchblutung vermindert bzw. vollständig unterbrochen, was zur Hypoxie und einer Anzahl physiologischer Veränderungen führt.
Ischämie wird umgekehrt, wenn der mit Sauerstoff angereicherte Blutstrom die hypoxischen Gewebe wieder erreicht (Reperfusion) und eine Anzahl von Ereignissen stattfinden. Xanthinoxidase und Neutrophile werden zur Produktion von Superoxid und seines Dismutationsprodukts, Wasserstoffperoxid, aktiviert. Das Superoxidanion ist in der Lage, die Freisetzung von Eisen aus Ferritin herbeizuführen; vgl. Thomas, C.D., et al., "Ferritin and Superoxide-Dependent Lipid Peroxidation" [Ferritin und superoxidabhängige Lipidperoxidation], J. Biol. Chem., Band 260, S. 3275-3280 (1985); und, Biemond, P., et al., "Superoxide-Dependent and -Independent Mechanisms of iron mobilization from ferritin by xanthine oxidase" [Superoxidabhängige und -unabhängige Mechanismen der Eisenmobilisation aus Ferritin durch Xanthinoxidase], Biochem J., Band 239, S. 169-173 (1986). Diese Eisenfreisetzung kann Probleme hervorrufen, wie zum Beispiel dadurch, daß das Eisen als Katalysator für Oxidations/Reduktions-Reaktionen dient, was zu Gewebeschädigungen führen kann.

b. Hemmung der Lipidperoxidation durch immobilisiertes Deferoxamin

i. Murines Hirnhomogenat

Die Hemmung der Lipidperoxidation wurde in einem murinen Hirnhomogenatsystem unter Verwendung der Methode von Buege et al. überwacht, um Thiobarbitursaure-reaktive Stoffe (TBARS), eine allgemeine Reflektion von Gewebeschädigung, einschließlich Lipidperoxidation, zu quantifizieren; vgl. Stocks J., et al., "Assay using Brain Homogenate for Measuring the Antioxidant Activity of Biological Fluids" [Analyse unter Verwendung von Hirnhomogenat zur Messung der Antioxidans-Aktivität biologischer Flüssigkeiten], Clin. Sci. Mol. Med., Band 47, S. 215-222 (1984); und Buege, J.A., et al., "Microsomal Lipid Peroxidation" [Mikrosomale Lipidperoxidation], Meth. Enzymol., Band 52, S. 320-310 (1978).
Es wurde eine 25 g schwere männliche Swiss-Webster-Maus getötet, und das Gehirn wurde sorgfältig entfernt und in eiskaltem entionisiertem Wasser gewaschen. In einem mit Säure ausgespülten Potter-Elvehjem-Homogenisator wurde durch Zugabe von 2 ml Puffer pro 500 mg Hirn ein 20%iges (G/V) Homogenat hergestellt. Die Homogenisation wurde mittels acht Hüben bei hoher Geschwindigkeit durchgeführt. Dem Homogenat wurde Eisen(II)-sulfat zugefügt, um eine 10 u Endkonzentration zu erhalten.
Bis zu diesem Punkt wurden alle Verfahren auf Eis durchgeführt. Zu den Homogenaten wurden dann verschiedene Mengen des Chelatbildners zugesetzt, und die Röhrchen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig hin- und hergeschwenkt. Durch Zugabe einer stark sauren Thiobarbitursäurelösung (918 mM Trichloressigsäure, 25 mM Thiobarbitursäure und 0,25 M HCl) wurde ein proteinfreier Extrakt zubereitet, gefolgt von einer 10minütigen Zentrifugation bei 1.000 · g. Der klare Überstand wurde 15 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzt und daran anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Extinktion dieser Lösung wurde bei 532 nm gemessen, und die Konzentration der TBARS wurde unter Berücksichtigung eines molaren Absorptionsvermögens von 1,56 · 10&sup5; cm&supmin;¹ (das dem Extinktionsmaximum des zwischen Malonaldehyd und Thiobarbitursäure gebildeten Produkts entspricht) errechnet. In einem zweiten Experiment wurde zum Antreiben der Lipidperoxidation anstelle von Eisen(II)-sulfat menschliches Oxyhämoglobin mit einer Endkonzentration von 500 uM verwendet. In allen Fällen wurde gefunden, daß das Dextran-Deferoxamin-Addukt bei der Begrenzung der Lipidperoxidation genauso wirksam ist wie freies Deferoxamin.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6, 7 und 8 zusammengefaßt. In Fig. 6 wird die Hemmung für ein System, einschließlich Tris-Puffer, pH 8,0, mit 0,01 mM Eisen(II)-sulfat in Abhängigkeit von der Chelatbildner-Konzentration gezeigt. Für das in Fig. 7 veranschaulichte Experiment enthielt die Lösung isotonische Kochsalzlösung und 0,01 mM Eisen(II)sulfat. In Fig. 8 wird die Hemmung der Hämoglobinvermittelten TBARS-Bildung gezeigt, wobei die erste Hämoglobinkonzentration 0,5 mM ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Deferoxamin-Addukte Oxidationsreaktionen von biologischer Bedeutung unterbrechen.

ii. Hemmung der Neutrophilen-vermittelten Erythrozytenlysis durch immobilisiertes Deferoxamin

Wenn aktiviert, können menschliche Neutrophile (PMN) über eine Sauerstoffradikalen-Route Zellen zerstören. Freies Deferoxamin wirkt auf die Hämolyse von Erythrozyten durch PMN ein. Es wurde der von Deferoxamin und Dextran- Deferoxamin gewährte Schutz gegen PMN-vermittelte Erythrozytenlysis verglichen. Als experimentelles Verfahren wurde grundlegend das von Vercellotti et al., J. Clin. Invest., Band 76, Sept. 1985, S. 956-962 (1985) befolgt.
Die Hämolyse wurde unter Verwendung einer Modifikation der &sup5;¹Cr-Freisetzungsanalyse von Weiss gemessen; Weiss S.J., "The Role of Superoxide in the Destruction of Erythrocyte Targets by Human Neutrophils" [Die Rolle von Superoxid bei der Zerstörung von Erythrozyten-Targets durch menschliche Neutrophile], J. Biol. Chem., Band 255, S. 9912-9917 (1980). Die Isolierung von PMN und Erythrozyten sowie die radioaktive Markierung von Erythrozyten wurde wie von Vercellotti beschrieben durchgeführt. Die PMN (3,3 · 10&sup5;/ml) wurden mit den markierten Erythrozyten (3,3 · 10&sup6;/ml) in ausgeglichener Hank-Salzlösung mit 1% (G/V) Gelatine inkubiert. Bei den Chelatbildner-Konzentrationen handelte es sich entweder um 0,1 mM oder 1 mM in Deferoxamin- Äquivalenten. Die Assays wurden auf Mikrotestplatten unter Verwendung eines Endvolumens von 0,3 ml durchgeführt. Phorbolmyristatacetat (PMA) wurde zur Aktivierung der PMN in einer Konzentration von 10 mg/ml zugefügt, und der Zellkontakt wurde durch 3minütige Zentrifugation bei 60 · g erzielt. Die Testplatten wurden dann 60 Minuten in eine angefeuchtete Atmosphäre aus 95% Luft/5% CO&sub2; bei 37ºC gebracht. Nach der Inkubation wurden die Zellen 3 Minuten bei 175 · g zentrifugiert; 0,15 ml des Überstands wurden entfernt und die Radioaktivität durch Gammazählung bestimmt.
Der prozentuale Anteil des freigesetzten &sup5;¹Cr wurde wie folgt berechnet: (Impulse im Überstand dividiert durch die pro Vertiefung addierten Gesamtimpulse) · 100. Überraschenderweise gewährte das immobilisierte Deferoxamin bei einer Konzentration von 0,1 mM Chelatbildner (DFO- Äquivalente) besseren Schutz gegen Hämolyse als das freie Arzneimittel. Bei der höheren Konzentration von 1 mM schützten beide Verbindungen gleich gut. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 zusammengefaßt.

Beispiel 12 - In-vivo-Wirksamkeit von Deferoxamin und Konjugaten davon bei der Nierenischämie der Ratte

Das für diese Studien verwendete Modell ist in der Literatur beschrieben; Paller, H.S. et al., "Oxygen free Radicals in Ischemic Acute Renal Failure in the Rat" [Sauerstofffreie Radikale beim akuten Nierenversagen aufgrund von Ischämie bei der Ratte], J. Clin. Invest., Band 74, S. 1156-1164 (1984).
Kurz dargelegt sei, daß eine 60minütige Ischämie durch Abklemmen der linken Nierenarterie bei anästhesierten Tieren (männliche Sprague-Dawley-Ratten, 280-350 g) induziert wurde. Die rechte Niere wurde entfernt. In diesen Experimenten beinhaltete die Behandlung eine Infusion des Chelatbildners bzw. einer Kontrollösung, die 1 Minute vor Abnahme der Nierenarterienklemme eingeleitet wurde, sowie eine 59minütige Reperfusion. Sowohl für freies Deferoxamin als auch für das Inulin-Konjugat wurde eine Gesamtdosis von 50 mg/kg Chelatbildner verwendet. Die Verbindungen wurden intravenös bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min infundiert. Die Stammlösung des Inulin-Deferoxamin- Konjugats enthielt 100 mg/ml Feststoff, von dem 30 mg/ml Eisenchelatbildner war. Ein Kontrollexperiment unter Verwendung des Polymers (Inulin) wurde auch durchgeführt.
Es wurden zwei Variable beurteilt, und zwar das Serumkreatinin und die glomeruläre Filtrationsrate (GFR). Die in Tabelle I unten aufgelisteten Werte basieren auf dem Durchschnitt von vier bis sieben Tieren in jeder Gruppe. TABELLE I Experiment GFR (ml/min) Serumkreatinin Deferoxamin (DFO) DFO-Inulin Inulinkontrolle
Der nichtischämische Wert für Serumkreatinin beträgt 0,3-0,5 mg%, wohingegen die glomeruläre Filtrationsrate für eine Ratte mit einer Niere bei 1,0-1,2 ml/min liegt. Die Schlußfolgerung aus diesen Ergebnissen ist die, daß das Inulin-Addukt von DFO die ischämische Niere genauso wirksam vor einer Reperfusionsschädigung schützt wie das freie Arzneimittel. Freies Inulin besaß keine Schutzwirkung.
Durch das Experiment und die zugrundeliegende Theorie wird eine typische klinische Anwendung aufgezeigt. Blut kann während eines chirurgischen Eingriffs oder verschiedener anderer medizinischer Verfahren bzw. während einer Verletzung und dergleichen daran gehindert werden, in einen Gewebebereich zu fließen. Wenn die Durchblutung an das Gewebe wiederhergestellt wird (Reperfusion), kann dies aufgrund von Oxidationsreaktionen zur Gewebeschädigung führen. Die schädliche Oxidation kann mittels einer Hemmung der Verfügbarkeit freien Eisens als eines Redoxkatalysators am oder in der Nähe des Reperfusionsorts gehemmt werden. Das kann durch die Nutzung eines immobillsierten Chelatbildners gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Im allgemeinen wird der immobilisierte Chelatbildner auf eine solche Weise eingeführt, daß er mit dem zurückkehrenden Blutstrom an den geschädigten Ort fließen kann (Ort der Ischamie). In einigen Fallen, wie zum Beispiel während eines chirurgischen Eingriffs, kann es sich als nützlich herausstellen, den Chelatbildner sowohl vor als auch nach der Reperfusion am Ort der Ischämie bereitzustellen. Dies wird durch Verwendung der immobilisierten Chelatbildner gemäß der vorliegenden Erfindung erleichtert, die eine erhebliche vaskuläre Retention und geringe Toxizität aufweisen.
Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische und bevorzugte Ausführungsbeispiele und Techniken beschrieben.

Claims

1. Pharmazeutisch zulässiger wasserlöslicher Komplex, der ein an Deferoxamin kovalent gebundenes wasserlösliches Biopolymer umfaßt.

2. Pharmazeutisch zulässiger Komplex nach Anspruch 1, worin das Biopolymer ein wasserlösliches Polysaccharid oder ein wasserlösliches Protein ist.

3. Komplex nach Anspruch 2, worin das Deferoxamin direkt an Aldehydgruppen am Polysaccharid kovalent gebunden ist.

4. Komplex nach Anspruch 2 oder 3, worin das Polysaccharid Dextran umfaßt.

5. Komplex nach Anspruch 2 oder 3, worin das Polysaccharid Hyaluronsäure umfaßt.

6. Komplex nach Anspruch 2 oder 3, worin das Polysaccharid Stärke oder ein Derivat davon umfaßt.

7. Komplex nach Anspruch 2 oder 3, worin das Polysaccharid Inulin ist.

8. Komplex nach Anspruch 2, worin das Protein menschliches Serumalbumin umfaßt.

9. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Einsatz bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch einen chirurgischen Eingriff und/oder Therapie.

10. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Einsatz bei der Herabsetzung der Konzentration von freien Eisen(III)- oder Aluminiumionen in einer physiologischen Flüssigkeit von Säugetieren, zur Hemmung der

Zellmaterialschädigung durch Oxidations/Reduktions- Reaktionen oder zur Hemmung der Aktivität von Eisen als ein Katalysator für Oxidations/ Reduktions-Reaktionen während der Reperfusion von geschädigtem Gewebe mit Blut bei einem Säugetier.

11. Komplex nach Anspruch 9 oder 10, der für die parenterale Verabreichung formuliert ist.

12. Komplex nach Anspruch 11, der zur Einführung in den Blutstrom eines Menschen formuliert ist.

13. Gebrauch eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Herstellung eines Medikamentes oder einer Zusammensetzung zum Einsatz bei der Herabsetzung der Konzentration von freien Eisen(III)- oder Aluminiumionen in einer physiologischen Flüssigkeit von Säugetieren, zur Hemmung der Zellmaterialschädigung durch Oxidations/Reduktions-Reaktionen oder zur Hemmung der Aktivität von Eisen als ein Katalysator für Oxidations /Reduktions-Reaktionen während der Reperfusion von geschädigtem Gewebe mit Blut bei einem Säugetier.

14. Verfahren zur Hemmung der Zellmaterialschädigung durch Oxidations/Reduktions-Reaktionen in vitro, wobei dieses Verfahren in Verbindung mit diesem Zellmaterial die Bereitstellung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfaßt, wobei der Komplex in einer zur Hemmung der Oxidations/Reduktions-Reaktionen wirksamen Menge bereitgestellt wird.