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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen künstlichen Sauerstoffträger, der
dazu fähig
ist, Sauerstoff in lebenden Organismen reversibel zu adsorbieren
und zu desorbieren, und ein künstliches
Sauerstoff-Infusionspräparat,
das einen künstlichen
Sauerstoffträger
umfasst. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Komplex
aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur,
der hochgradig sicher und von hoher Qualität ist und der auf dem medizinischen
Gebiet zur Zuführung
von Sauerstoff zu ischämischem
Penumbra- oder Tumorgewebe, zur Blutinfusion bei Patienten mit einer
schweren Blutung und als Organkonservierungsperfusat, eine Lösung zur
extrakorporalen Zirkulation oder als Zellkulturflüssigkeit
verwendet wird, und ein Verfahren zur Herstellung davon.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es
ist bekannt, dass Plasmaprotein oder Plasmakolloid eine Schlüsselrolle
bei der Aufrechterhaltung der Blutströmung in den Blutgefäßen lebender
Organismen spielt. Um Patienten in dieser Hinsicht eine Erholung
von einem hämorrhagischen Schock
zu ermöglichen,
wird üblicherweise
ein Plasmaexpander, der fast denselben osmotischen Kolloiddruck
wie das Blut von lebenden Organismen hat, als Flüssigkeitsersatz verwendet.
Im Fall eines massiven Verlusts von 30 % oder mehr des zirkulierenden
Blutvolumens wird die Sauerstoffzufuhr zu den peripheren Geweben
aber unzureichend, und eine Verabreichung eines Sauerstoffträgers zusätzlich zur Verabreichung
eines Plasmaexpanders wird erforderlich.
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Als
ein solcher Sauerstoffträger
werden üblicherweise
natürliches
Blut, das natürliche
rote Blutzellen und eine schwere Lösung von roten Blutkörperchen
enthält,
verwendet. Um eine Blutgerinnung aufgrund von Antigen-Antikörper-Reaktionen zu verhindern,
müssen
die Bluttypen des Spenders und des Empfängers aufeinander abgestimmt
werden, und bei der Verwendung muss eine Kreuzprobe durchgeführt werden.
Das natürliche
Blut und die schwere Lösung
von roten Blutkörperchen
können
durch Konservierung nur für
einen kurzen Zeitraum von 3 Wochen (4 °C) wirksam bleiben. Andererseits
ist gefrorenes Blut, das eine Langzeitaufbewahrung mittels Kryokonservierung
ermöglicht,
gegen hohe Kosten und eine Hämolyse
aufgrund eines osmotischen Schocks während der Verwendung auf problematische
Weise empfindlich. Darüber
hinaus bestehen Befürchtungen
hinsichtlich eines Auftretens von Infektionskrankheiten wie Hepatitis,
AIDS und dergleichen.
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Als
Sauerstoffträger
zur Lösung
solcher Probleme sind verschiedene künstliche Sauerstoffträger untersucht
worden. Ein Sauerstoffinfusionspräparat (hiernach Albumin-Häm), bei
dem ein Hämderivat, 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex
etc., an einer hydrophoben Tasche von humanem Albumin oder rekombinantem
Albumin adsorbiert wird, ist synthetisiert worden, und seine Fähigkeit
zum Transport von Sauerstoff ist bestätigt worden (E. Tsuchida et
al., Bioconjugate Chemistry, Band 8, 534 – 538, 1997).
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Zur
Herstellung dieser künstlichen
Sauerstoffträger
ist üblicherweise
toxisches Kohlenmonoxid (hiernach CO) verwendet worden.
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Komatsu
et al., Bioconjugate Chemistry, Band 10, 797 – 802, 1999 (S. 800, linke
Spalte, 2. Zeile von unten – rechte
Spalte, 1. Zeile) beschreiben, dass Albumin-Häm in Gegenwart von Sauerstoff bei
25 °C: 8
h oder bei 37 °C:
2 h um 50 % zersetzt wird. Auf diese Weise wird, wenn Sauerstoff
in einem Herstellungsschritt vorhanden ist, ein zweiwertiger Eisenkomplex
dreiwertig, und die Funktion des Sauerstoffträgers wird nicht erfüllt, wodurch
ein Albumin-Häm
mit einer ausreichenden Fähigkeit
zum Transport von Sauerstoff nicht erhalten wird.
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Für ein vollständiges Blockmischen
von Sauerstoff während
eines Produktionsschritts ist jedoch eine extrem hochmoderne Einrichtung
erforderlich. Weil eine allgemeine Vorrichtung ein Zumischen von Sauerstoff
nicht verhindern kann, besteht eine herkömmliche Praxis in der Verwendung
von CO zur Herstellung eines Sauerstoffträgers, so dass der Sauerstoffträger sogar
dann, wenn Sauerstoff in einem Produktionsschritt zugemischt wird,
nicht zersetzt wird. Durch eine Bindung von CO an einen (hiernach
als Häm
abgekürzten)
Porphyrineisenkomplex wird das zweiwertige Eisen von Häm in einer stabilen
Konzentration gehalten, und eine oxidative Reaktion zu einem dreiwertigen
Eisen kann unterdrückt
werden.
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Ein
Beispiel für
das Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Sauerstoffträgers unter
Verwendung von CO umfasst zuerst die Bildung eines CO-PFP durch
die Umsetzung von Lattenzaun-Porphyrin (hiernach PFP) mit CO. Dieses
CO-PFP wird weiter mit Dithionit reduziert. Dann wird CO-PFP mit Humanserumalbumin
(hiernach HSA) vermischt, wodurch ein Komplex mit HSA (hiernach
CO-PFP-HSA) erhalten wird. Die Bildung von CO-PFP-HSA kann durch
Chromatographie und Ultrafiltration bestätigt werden. CO kann entfernt
werden, indem in einem Sauerstoff enthaltenden Tonometer Licht auf
eine Probe einwirken gelassen wird. Durch die Entfernung von Sauerstoff
aus dem resultierenden O2-HSA-PFP durch
einen Stickstoffersatz kann HSA-PFP erhalten werden (JP-T-10-503489,
Seite 14, Zeilen 5 – 11).
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Zur
Durchführung
eines solchen Herstellungsschrittes in einer CO-Atmosphäre ist jedoch eine
große
CO-Menge erforderlich, die in einem menschlichen Körper tödliche Schäden hervorrufen kann.
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Mit
Hinsicht auf das Obige ist ein Herstellungsverfahren erwünscht, das
frei von CO in einem Herstellungsschritt und einer Zersetzung eines künstlichen
Sauerstoffträgers
ist.
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Wenn
ein künstlicher
Sauerstoffträger,
der auf diese Weise hergestellt ist, unter einer CO-Atmosphäre gekühlt aufbewahrt
wird, ist eine Zersetzung durch eine Oxidationsreaktion auf ähnliche
Weise wie oben unterdrückt.
Wenn jedoch CO gebunden ist, wird aufgrund des Fehlens einer Fähigkeit
zur Bindung von Sauerstoff ein Schritt zur Entfernung von CO vor
der Verabreichung erforderlich. Auch bei dieser Stufe wird CO erzeugt
und verursacht Probleme wie die Angst vor einer Beeinträchtigung
des menschlichen Körpers
und einer fehlenden Fähigkeit,
die Verabreichung in Notfällen
bewältigen
zu können.
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Als
ein Verfahren zur Lösung
solcher Probleme beschreibt JP-A-2001-72595 (Abschnitt 0028) ein Verfahren
zur Aufbewahrung von Albumin-Häm durch
dessen Umwandlung zu Desoxyhäm.
Insbesondere werden, nachdem in Bezug auf eine physiologische Kochsalzlösung von
Albumin-Häm,
das nach Komatsu et al., Bioconjugate Chemistry Band 10, 797-802,
1999 (Seite 800, linke Spalte, 2. Zeile von unten – rechte
Spalte, 1. Zeile) hergestellt wurde, bestätigt wurde, dass das Häm in einem
zweiwertigen Zustand von Eisen vorliegt, Stickstoff oder andere
Inertgase (Argon, Helium und dergleichen), die frei von Sauerstoff
sind, auf die Dispersion einwirken gelassen, um Sauerstoff aus dieser
Dispersion zu entfernen, wodurch der gelöste Sauerstoff entfernt wird, und
Oxyhäm
wird zur Aufbewahrung zu Desoxyhäm umgewandelt,
dem eine Sauerstoffbindung fehlt.
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Bei
diesem in JP-A-2001-72595 beschriebenen Verfahren wird CO aber nicht
zur Desoxidation in einer Aufbewahrungsform verwendet, sondern CO wird
immer noch in den Herstellungsschritten verwendet (z.B. Beispiel
1, Beispiel 7 von JP-A-2001-72595 und Komatzsu et al., Artificial Blood,
Band 6, 110 – 114,
1998 (S. 111, linke Spalte, Zeilen 16 – 19)).
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Herkömmliche
Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Sauerstoffträgers (z.B.
das Hämoglobin-Vesikel,
das Lipidhäm-Vesikel,
das Lipidhäm-Triglycerid-Mikrokügelchen,
Albumin-Häm
und dergleichen), bei denen CO verwendet wird, weisen die oben erwähnten Probleme
auf, und ein leicht handhabbares Verfahren zur Herstellung eines
sicheren künstlichen
Sauerstoffträgers
ist erwünscht. Bisher
ist jedoch nicht über
ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Sauerstoffträgers berichtet worden,
das in einem Herstellungsschritt frei von CO ist.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Herstellung eines
Komplexes aus Albumin und einem Metallkomplex mit Porphyrinstruktur
verfügbar,
bei dem es sich um einen künstlichen
Sauerstoffträger
handelt, ohne dass CO verwendet wird.
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Die
vorliegende Erfindung ist gemacht worden, um diese Probleme zu lösen. Als
Ergebnis intensiver Untersuchungen, die von den Erfindern der vorliegenden
Erfindung durchgeführt
wurden, ist gefunden worden, dass ein Metallkomplex einer Desoxyform,
die frei von gebundenem CO ist, die eine Porphyrinstruktur hat,
extrem leicht oxidiert wird, und die Oxidationsreaktion erfolgt
im beträchtlichen
Umfang aufgrund einer zur Ultrafiltration verwendeten Ersatzflüssigkeit,
einer zur Dialyse verwendeten Dialyseflüssigkeit und dergleichen in
einem Reinigungsschritt eines Komplexes von Albumin und einem Metallkomplex
mit Porphyrinstruktur. Weiterhin haben sie gefunden, dass die oben
erwähnten
Probleme gelöst
werden können,
indem ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur hergestellt wird und vorzugsweise ein Reduktionsmittel
zu einer Ersatzflüssigkeit
oder einer Dialyseflüssigkeit
gegeben wird, die für
einen Reinigungsschritt unter einer Gasatmosphäre verwendet wird, die im Wesentlichen
frei von Kohlenmonoxid (CO) und Sauerstoff (hiernach O2)
ist, und vervollständigten
die vorliegende Erfindung.
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Demgemäß macht
die vorliegende Erfindung Folgendes verfügbar:
- (1)
Ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Albumin und einer
Desoxyform eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, umfassend
das Mischen von Albumin und einem Metallkomplex, der eine Porphyrinstruktur
hat, unter einer Gasatmosphäre,
die im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist,
- (2) Herstellungsverfahren gemäß (1), das die Umwandlung einer
Oxyform eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in
eine Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur
hat, und das Mischen des resultierenden Komplexes mit Albumin umfasst,
- (3) Herstellungsverfahren gemäß (2), wobei die Oxyform des
Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in Gegenwart eines
Reduktionsmittels in die Desoxyform des Metallkomplexes, der eine
Porphyrinstruktur hat, umgewandelt wird,
- (4) Herstellungsverfahren gemäß (2), wobei die Oxyform des
Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, durch Verdrängung mit
Stickstoff in die Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur
hat, umgewandelt wird,
- (5) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei im Schritt des
Mischens von Albumin und eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur
hat, das zentrale Metallatom des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur
hat, in einem reduzierten Zustand vorliegt,
- (6) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei eine wässrige Albuminlösung nach
der Entfernung von gelöstem
Sauerstoff in einen verschlossenen Behälter gegeben wird, der mit
einem Gas gefüllt
ist, das im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist,
und dann eine Lösung
eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in einem
organischen Lösungsmittel
und ein Reduktionsmittel dazugemischt werden,
- (7) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei der Metallkomplex,
der eine Porphyrinstruktur hat, ein Hämderivat ist,
- (8) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei das Gas ein Inertgas
ist,
- (9) Herstellungsverfahren gemäß (8), wobei es sich bei dem
Inertgas um eine oder mehrere Arten von Gasen handelt, die aus der
Gruppe ausgewählt
sind, die aus Wasserstoff, Helium, Argon, Stickstoff und Neon besteht,
- (10) Herstellungsverfahren gemäß (3), wobei es sich bei dem
Reduktionsmittel um eine oder mehrere Arten handelt, die aus der
Gruppe ausgewählt
sind, die aus dithioniger Säure,
Natriumdithionit, Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit, trockenem
Natriumsulfit, Natriumpyrosulfit, Natriummetabisulfit, Rongalit,
L-Ascorbinsäure,
Natrium-L-ascorbat, Erythorbinsäure,
Natriumerythorbat, Cystein, Thioglycerin, α-Thioglycerin, Natriumedetat,
Zitronensäure,
Isopropylcitrat, Kaliumdichlorisocyanurat, Natriumthioglycolat,
Natriumthiomalat, Natrium-1,3-butylenglycolpyrosulfit, Butylhydroxyanisol,
Dibutylhydroxytoluol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat, einer mit
Vitamin E verwandten Verbindung, dl-α-Tocopherol, Tocopherolacetat,
natürlichem
Vitamin E, d-δ-Tocopherol, gemischtem
Tocopherolkonzentrat, Guajakharz, Nordihydroguajaretsäure, L-Ascorbylstearat,
Sojalecithin, Palmitinascorbinsäure,
Benzotriazol, Pentaerythrityltetrakis[3-(3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)propionat]-2-mercaptobenzimidazol, Calciumdinatriumethylendiamintetraacetat
und Dinatriumethylendiamintetraacetat besteht,
- (11) Herstellungsverfahren gemäß (6), wobei es sich bei dem
organischen Lösungsmittel
um Ethanol handelt,
- (12) Verfahren gemäß (1) mit
dem anschließenden
Schritt des Reinigens des Komplexes durch Ultrafiltration unter
Verwendung einer wässrigen Lösung, die
ein Reduktionsmittel enthält
und/oder frei von Sauerstoff ist, als Substitutionsflüssigkeit,
- (13) Verfahren gemäß (1) mit
dem anschließenden
Schritt des Reinigens des Komplexes durch Dialyse unter Verwendung
einer wässrigen
Lösung,
die ein Reduktionsmittel enthält
und/oder frei von Sauerstoff ist, als Dialyseflüssigkeit.
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Weil
der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung durch CO-freie Schritte
hergestellt wird, kann er als hochgradig sicherer künstlicher
Sauerstoffträger
verwendet werden.
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Darüber hinaus
kann die Produktionseinrichtung vereinfacht und miniaturisiert werden,
weil das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung die Notwendigkeit
für ein
strenges Handhabungssystem zur Verhinderung eines Austretens von
CO, das bisher für
den Herstellungsschritt herkömmlicher künstlicher
Sauerstoffträger
erforderlich war, entfallen lässt.
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Wenn
CO in einem Herstellungsschritt wie in herkömmlichen Schritten verwendet
wird, erfolgt ein Schritt zur Entfernung von CO notwendigerweise
vor der endgültigen
Verwendung des Produkts als Sauerstoffträger. Dahingehend wird ein extrem
intensives Licht verwendet, und Sauerstoff wird eingeblasen, wodurch
ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur zu einem Oxidationstyp werden
kann, der einen Fall eintreten lassen kann, in dem die Funktion
als Träger nicht
erfüllt
werden kann. Gemäß dem Herstellungsverfahren
der vorliegenden Erfindung ist ein Schritt zur Entfernung von CO
nicht erforderlich, weil CO in keinem Herstellungsschritt verwendet
wird, wodurch eine Verschlechterung der Qualität verhindert wird, was die
Verabreichung des Trägers
in einem Notfall in der bestehenden Form ermöglicht.
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Der
Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit
Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung kann als Sauerstoffträger auf
einen weiten Bereich in den Gebieten der Medizin und der Pharmazeutik
angewandt werden, und wie Blut zur Infusion kann er so, wie er ist,
oder als Mischung, die nach Bedarf Additive enthält, als Blutersatz für klinische
Behandlungen verwendet werden.
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Darüber hinaus
kann der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung so, wie er ist,
intravenös
verabreicht werden, wenn eine Behandlung zur Bindung von CO für eine Langzeitaufbewahrung
nicht angewandt wird. Der verabreichte Komplex aus Albumin und einer
Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur verbindet
sich sofort mit Sauerstoff, wenn er durch die Lunge geleitet wird,
wodurch er zu einer Oxyform wird und Sauerstoff in peripheren Blutgefäßen freisetzt.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 veranschaulicht
einen Porphyrinring, 2 veranschaulicht ein Beispiel
für einen
Porphyrinring.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet "ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur" einen Metallkomplex,
bei dem ein Zentralmetall von einem Porphyrinring koordiniert ist,
und er kann einen modifizierten horphyrinring oder einen mit einer
Fähigkeit zur
reversiblen Bindung von Sauerstoff, die hier alle eingeschlossen
sind, enthalten. "Porphyrinring" bedeutet eine makrozyklische
Verbindung, bei der vier Pyrrolringe gemäß der Abbildung in 1 in
der α-Position
wechselseitig an vier Methingruppen gebunden sind, und Derivate
davon. Ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur wird durch einen
veranschaulicht, bei dem die Mitte eines in 2 dargestellten Porphyrinrings,
(2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetralcis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyrin),
mit Eisen koordiniert ist. Das Zentralmetall eines solchen Metallkomplexes
ist gewöhnlich
ein Übergangselement,
vorzugsweise ein Übergangselement
der Gruppen 6 – 10
des Periodensystems, und Übergangselemente
der 4. Periode sind noch mehr bevorzugt. Von diesen sind Eisen, Kobalt,
Chrom und dergleichen bevorzugt, und Eisen(II) und Kobalt(III) sind
noch mehr bevorzugt.
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Darüber hinaus
bedeutet eine "Desoxyform eines
Metallkomplexes" einen
Metallkomplex, bei dem Sauerstoff nicht an das Zentralmetall gebunden ist,
wie einen Metallkomplex, bei dem Sauerstoff nicht an das Zentralmetall,
Eisen(II), gebunden ist. Eine "Oxyform
eines Metallkomplexes" bedeutet
einen Metallkomplex, bei dem Sauerstoff an das Zentralmetall gebunden
ist, wie ein Metallkomplex, bei dem Sauerstoff an das Zentralmetall,
Eisen(II), gebunden ist.
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In
der vorliegenden Erfindung ist ein "Metallkomplex mit Porphyrinstruktur" vorzugsweise ein "Hämderivat". Ein "Hämderivat" bedeutet einen Eisenkomplex
mit Porphyrinstruktur, bei dem es sich um ein Derivat mit einem
verformten Porphyrinring oder einen mit einer Fähigkeit der reversiblen Bindung
von Sauerstoff handeln kann, die hier alle eingeschlossen sind.
Als Hämderivat
können
beispielsweise Tetraphenylporphyrin, Protoporphyrin, Octaalkylporphyrin
und deren Derivate und dergleichen erwähnt werden. Von diesen ist
Tetraphenylporphyrin bevorzugt.
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In
der vorliegenden Erfindung wird ein "Komplex aus Albumin und einer Desoxyform
eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur" erhalten, indem Albumin- und ein Metallkomplex
mit Porphyrinstruktur verbunden werden, und dieser weist eine Fähigkeit zur
reversiblen Adsorption und Desorption von Sauerstoff auf. Zum Beispiel
können
ein Komplex eines Hämderivats
und von Albumin (hiernach Albumin-Häm) und dergleichen erwähnt werden.
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Einem
Metallkomplex mit Porphyrinstruktur, wobei das zentrale Metall vom
oxidierten Typ ist, fehlt die Fähigkeit
zur reversiblen Adsorption und Desorption von Sauerstoff. Daher
muss ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit
Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung ein Zentralmetall vom
reduzierten Typ sein. Es ist jedoch schwierig, ein Zentralmetall
eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur, der ein Zentralmetall
eines oxidierten Typs (z.B. Eisen(III)) enthält, nach der Bindung an Albumin
in einen reduzierten Typ (z.B. Eisen(II)) umzuwandeln.
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Daher
ist bei der Bindung eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur
an Albumin das Zentralmetall eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur vorzugsweise
vom reduzierten Typ. Beispielsweise ist bei einer Bindung eines
Eisenkomplexes mit Porphyrinstruktur an Albumin das Zentralmetall
des Komplexes vorzugsweise Eisen(II) vom reduzierten Typ.
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Es
ist auch möglich,
die Idee der vorliegenden Erfindung auf einen Komplex aus Albumin
und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur
sowie künstliche
Sauerstoffträger
wie eine Hämoglobin-Vesikel,
eine Lipidhäm-Vesikel,
ein Lipidhäm-Triglycerid-Mikrokügelchen
und dergleichen oder eine Mischung eines Komplexes davon und dergleichen
anzuwenden.
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Obwohl
das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Albumin nicht besonders
eingeschränkt
ist, können
beispielsweise Humanserumalbumin, von einem Tier stammendes Serumalbumin, rekombinantes
Humanserumalbumin (rHSA) und Multimere davon und dergleichen ebenfalls
erwähnt werden.
Hinsichtlich des Aspektes eines Verhinderns einer Infektion und
dergleichen ist es besonders bevorzugt rHSA.
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Als
Beispiele für
das Albumin-Häm
der vorliegenden Erfindung können
eines, bei dem ein Tetraphenylporphyrineisen-Derivat, 2-[8-[N-(2-methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex
und dergleichen, in eine hydrophobe Tasche von Albumin eingeschlossen
ist (E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry, Band 8, 534 – 538, 1997),
und dergleichen erwähnt
werden.
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet "eine Gasatmosphäre, die im Wesentlichen frei
von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist" eine Gasatmosphäre, deren CO-Gehalt niedriger
als eine Menge ist, die einen Einfluss auf den menschlichen Körper ausübt, und
deren O2-Gehalt niedriger als diejenige Menge ist,
die einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur zersetzt. Dies bedeutet, dass das Vorhandensein
einer kleinen Menge an Kohlenmonoxid, das frei von einem Einfluss
auf den menschlichen Körper
ist, und das Vorhandensein von Sauerstoff in demjenigen Bereich,
in dem der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung stabil erhalten werden,
toleriert werden. Insbesondere beträgt die Kohlenmonoxid-Konzentration
in der oben erwähnten
Gasatmosphäre
vorzugsweise nicht mehr als 0,1 ppm, und die Sauerstoffkonzentration
in der oben erwähnten
Gasatmosphäre
beträgt
vorzugsweise nicht mehr als 1 % (ca. 10 000 ppm), noch mehr bevorzugt nicht
mehr als 0,1 % (ca. 1000 ppm) und noch mehr bevorzugt nicht mehr
als 100 ppm.
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Ein
Gas, aus dem die oben erwähnte
Gasatmosphäre
besteht, ist vorzugsweise ein Inertgas. Ein Inertgas bedeutet ein
chemisch inaktives Gas wie ein Edelgas wie Helium, Argon, Neon und
dergleichen und Stickstoff und Wasserstoff. Die Verwendung von Stickstoffgas
ist industriell bevorzugt.
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Als
Reduktionsmittel können
in der vorliegenden Erfindung beispielsweise dithionige Säure, ein
Dithionitsalz (Natriumdithionit und dergleichen), ein Hydrogensulfitsalz
(Natriumhydrogensulfit und dergleichen), ein Sulfitsalz (Natriumsulfit,
trockenes Natriumsulfit und dergleichen), ein Pyrosulfitsalz (Natriumpyrosulfit
und dergleichen), ein Metahydrogensulfitsalz (Natriummetahydrogensulfit
und dergleichen), Rongalit (CH2OHSO2Na), Ascorbinsäure oder ein Salz davon (L-Ascorbinsäure, Natrium-L-ascorbat
und dergleichen), Erythroascorbinsäure oder ein Salz davon (Natriumeryhthroascorbat
und dergleichen), Cystein (vorzugsweise Cysteinhydrochlorid), Thioglycerin, α-Thioglycerin, Edetatsalz
(Natriumedetat und dergleichen), Citronensäure, Isopropylcitrat, Dichlorisocyanuratsalz
(Kaliumdichlorisocyanurat und dergleichen), Thioglycolatsalz (Natriumthioglycolat
und dergleichen), Thiomalatsalz (Natriumthiomalat und dergleichen),
Natrium-1,3-Butylenglycolpyrosulfit, Butylhydroxyanisol (BHA), Dibutylhydroxytoluol
(BHT), Propylgallat, Ascorbylpalmitat, dl-α-Tocopherol, Tocopherolacetat,
natürliches
Vitamin E, d-δ- Tocopherol, Tocoperholgemisch-Konzentrat,
Guajakharz, Nordihydroguajaretsäure
(NDGA), L-Ascorbylstearat, Sojalecithin, Palmitinascorbinsäure, Benzotriazol,
Pentaerythrittetrakis[3-(3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)propionat]-2-mercaptobenzimidazol,
Calciumdinatriumethylendiamintetraacetat und Dinatriumethylendiamintetraacetat
erwähnt
werden. Von diesen sind L-Ascorbinsäure und
Natrium-L-ascorbat bevorzugt. Nur eine Art eines aus einer solchen
Gruppe ausgewählten
Reduktionsmittels kann verwendet werden, oder zwei oder mehr Arten von
Reduktionsmitteln können
gleichzeitig verwendet werden.
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet "Stickstoffersatz" einen Vorgang zur Entfernung von Sauerstoff,
indem ein Gegenstand in eine Stickstoffatmosphäre eingebracht wird. Zum Beispiel
wird eine Oxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in
eine Stickstoffatmosphäre
eingebracht, um Sauerstoff zu entfernen, wodurch sie in eine Desoxyform
des Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur umgewandelt wird. Als
Verfahren zum Stickstoffersatz können
ein Verfahren, das das Durchperlenlassen von Stickstoffgas durch
eine Lösung
einer Zielsubstanz (hiernach Durchperlenlassen von Stickstoff) umfasst,
und ein Verfahren, das das Aufströmenlassen von Stickstoffgas
auf die Oberfläche
einer Lösung
einer Zielsubstanz (Stickstoffstrom) umfasst, erwähnt werden.
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Das
Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise
einen Schritt der Zugabe einer wässrigen
Lösung
von Albumin nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff zu einem verschlossenen
Behälter,
der mit einem Gas gefüllt ist,
das im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist, und
dann das Vermischen des Reduktionsmittels mit einer Lösung eines
Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einem organischen Lösungsmittel.
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Das
organische Lösungsmittel
zum Auflösen eines
Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur ist nicht besonders eingeschränkt, solange
es einen Metallkomplex mit Porphyrinstruktur lösen kann. Gewöhnlich wird
ein wasserlösliches
organisches Lösungsmittel
verwendet, wobei Ethanol zur Verwendung als pharmazeutisches Produkt
bevorzugt ist. Obwohl die Menge des Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur
in einer Lösung
eines organischen Lösungsmittels
nach dem Verwendungszweck eingestellt werden kann, beträgt sie vorzugsweise
etwa 1 – 10
mol auf 1 mol Albumin. Es ist bevorzugt, das oben erwähnte Reduktionsmittel
zu einem organischen Lösungsmittel für einen
Metallkomplex mit Porphyrinstruktur zu geben.
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Eine
Lösung
eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einem organischen
Lösungsmittel wird
im Voraus einem Stickstoffersatz wie einem Durchperlenlassen von
Stickstoff und dergleichen unterzogen, wodurch vor dem Vermischen
mit einer wässrigen
Lösung
von Albumin eine Oxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur
zu einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur umgewandelt
wird. Die Zeitdauer des Durchperlenlassens von Stickstoff beträgt vorzugsweise
etwa 1 – 30
min.
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Die
Konzentration einer wässrigen
Lösung von
Albumin beträgt
vorzugsweise weniger als etwa 25 Gew.-%. Wenn die Konzentration
niedrig ist, wird die Produktionseffizienz schlecht. Sauerstoff
wird aus einer wässrigen
Lösung
von Albumin vorzugsweise vor dem Vermischen mit einer Lösung eines
Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einem organischen Lösungsmittel
entfernt. Zum Beispiel wird sie nach der Entfernung von Sauerstoff
durch ein Durchperlenlassen von Stickstoff und dergleichen mit einem
Lösungsmittel
vermischt und bei Bedarf einem Stickstoffstrom zur Entfernung von
Sauerstoff unterzogen. Das oben erwähnte Lösungsmittel ist nicht besonders
eingeschränkt,
sofern es zur Herstellung der Injektion verwendet werden kann, und
Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung, ein Puffer und dergleichen
können
erwähnt
werden. Ein direktes Durchperlenlassen von Stickstoff durch eine wässrige Lösung von
Albumin modifiziert nicht wünschenswerterweise
das Albumin. Die Zeitdauer für das
Durchperlenlassen von Stickstoff beträgt vorzugsweise etwa 1 – 60 min.
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Zum
Vermischen eines organischen Lösungsmittels
zum Lösen
eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur mit einer wässrigen
Lösung
von Albumin wird zuerst eine wässrige
Lösung
von Albumin in einen verschlossenen Behälter gegeben, der mit einem
Gas befüllt
ist, das im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist,
und dann wird ein organisches Lösungsmittel
zum Auflösen
eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in kleinen Portionen
zugegeben, und die Mischung wird vorzugsweise durch Rühren vermischt.
Das Mischen erfolgt unter Temperaturbedingungen gewöhnlich von
etwa 0 – 60 °C, vorzugsweise
etwa 10 – 50 °C, so dass
ein Gefrieren der wässrigen
Lösung
und eine Denaturierung von Albumin nicht auftreten. Die Mischdauer
ist der Zeitraum, der für
ein gleichmäßiges Vermischen von
Albumin und einem Metallkomplex mit Porphyrinstruktur erforderlich
ist.
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In
der vorliegenden Erfindung ist ein "Reinigungsverfahren für einen
Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit
Porphyrinstruktur" ein
Verfahren zur Abtrennung eines Lösungsmittels
oder einer Verunreinigung in einer Lösung, die einen Komplex aus
Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur
enthält,
unter Verwendung bekannter Blutreinigungsverfahren und dergleichen.
Zum Beispiel können
verschiedene bekannte Reinigungsverfahren wie die Blutdialyse, die
Blutdialysefiltration, die Blutfiltration und dergleichen angewandt
werden. Es ist bevorzugt, die Filtration unter Verwendung einer
Ultrafiltrationsmembran mittels eines Blutfiltrationsverfahrens
durchzuführen
und nach Bedarf eine Ersatzflüssigkeit
als Ergänzung
zu einer Lösung
zu geben, die einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines
Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur enthält. Darüber hinaus kann eine Dialyse
unter Verwendung einer semipermeablen Membran und einer Dialysierflüssigkeit
mittels eines Blutdialyseverfahrens durchgeführt werden. Die hier zu verwendende Ersatzflüssigkeit
oder Dialysierflüssigkeit
ist vorzugsweise eine wässrige
Lösung,
die ein Reduktionsmittel enthält
und/oder frei von Sauerstoff ist. Als Reduktionsmittel können diejenigen
verwendet werden, die denen, die zum oben erwähnten Lösungsmittel für einen
Metallkomplex mit Porphyrinstruktur gegeben werden, ähnlich sind,
und als Verfahren zur Entfernung von Sauerstoff können verschiedene
bekannte Verfahren wie ein Durchperlenlassen von Stickstoff und
dergleichen verwendet werden. Durch die Verwendung einer solchen
Ersatzflüssigkeit
kann eine Oxidierung eines Komplexes von Albumin und einer Desoxyform
eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur verhindert werden.
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Das
künstliche
Sauerstoff-Infusionspräparat, das
mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhalten wird,
ist eine Flüssigkeit,
die einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur mit einer Fähigkeit zum Transport von Sauerstoff
enthält.
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Das
künstliche
Sauerstoff-Infusionspräparat der
vorliegenden Erfindung kann bei Bedarf eine Verbindung enthalten,
die zur Erzeugung eines kolloidosmotischen Drucks fähig ist.
Als Verbindung, die zur Erzeugung eines kolloidosmotischen Drucks
fähig ist,
können
verschiedene, für
Pharmazeutika verwendete Polymere verwendet werden, solange sie einen
kolloidosmotischen Druck haben. Beispiele dafür umfassen Dextran (z.B. Dextran
mit niedriger Molekülmasse),
ein Dextranderivat (z.B. Carboxymethyldextran, Carboxydextran, kationisches
Dextran, Dextransulfat), Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, Gelatine
(z.B. modifizierte Gelatine), Albumin (z.B. rohes humanes Plasma,
Humanserumalbumin, erwärmtes
Humanplasmaprotein, rekombinantes Humanserumalbumin), PEG, Polyvinylpyrrolidon,
Carboxymethylcellulose, Akaziengummi, Glucose, Dextrose (z.B. D-Glucosemonohydrat),
Oligosaccharide (z.B. Oligosaccharid), ein Polysaccharid-Abbauprodukt,
eine Aminosäure,
ein Proteinabbauprodukt und dergleichen. Von diesen sind Dextran
mit einer niedrigen Molekularmasse, Hydroxyethylstärke, modifizierte
Gelatine und rekombinantes Humanserumalbumin besonders bevorzugt.
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Der
oben erwähnte
Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur
bindet reversibel Sauerstoff, wenn ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur
vom reduzierten Typ ist, wobei das Metall aber keine Fähigkeit zur
Bindung von Sauerstoff hat, wenn es vom oxidierten Typ ist. Wenn
beispielsweise das Zentralelement Eisen von Häm zweiwertiges Eisen (Fe2+) ist, bindet der Komplex reversibel Sauerstoff,
aber wenn der Komplex vom oxidierten Typ des dreiwertigen Eisens (Fe3+) ist, hat er keine Fähigkeit zur Bindung von Sauerstoff.
Sogar ein zweiwertiger Eisenkomplex, an dem Sauerstoff gebunden
ist, setzt das Superoxid-Anion (O2 –)
frei und wird allmählich
autooxidiert, wodurch das Eisen dreiwertig wird (Methoform) und die
Fähigkeit
zur Bindung von Sauerstoff verliert. Darüber hinaus gibt ein nachteiliger
Einfluss auf lebende Organismen infolge einer leichten Freisetzung von
Häm und
des Eisenions aus der Methoform zur Besorgnis Anlass.
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Daher
muss die Oxidationsreaktion unterdrückt werden, wenn ein künstliches
Sauerstoff-Infusionspräparat,
das einen solchen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines
Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur enthält, aufbewahrt werden soll.
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Als
Verfahren zur Unterdrückung
der Oxidationsreaktion kann die Reaktionsgeschwindigkeit durch eine
Kühlaufbewahrung
einfach erniedrigt werden. Bei einer einfachen Kühlaufbewahrung nimmt das dreiwertige
Eisen aber allmählich
zu. Um dies zu verhindern, ist ein Verfahren, das die Zugabe eines im
roten Blutkörperchen
inhärent
vorhandenen Methämoglobin-Reduktionsenzym-Systems
umfasst, eines Enzyms, das Aktivsauerstoff-Katalase und Superoxid-Dismutase
eliminiert, und dergleichen bekannt. Die Aufbewahrungstemperatur
kann –20 °C bis 60 °C, vorzugsweise
4 bis 25 °C
betragen, und der Komplex wird an einem kühlen, dunklen Platz aufbewahrt.
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Zur
sauerstofffreien Aufbewahrung wird der Komplex beispielsweise direkt
in einer Glasflasche, einem Aluminium/Polyethylen-Schichtbeutel
(aluminisierter Polyethylen-Beutel) verschlossen, in einen Behälter aus
einem Material mit einer extrem niedrigen Sauerstoffpermeabilität wie Polyvinylidenchloriden,
Ethylen-Vinylalkohol-Copolymeren und dergleichen eingebracht oder
in einem Kunststoffbeutel versiegelt, der dann vorzugsweise in einen
Behälter
gelegt wird, der Sauerstoff nicht durchlässt.
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Weiterhin
können
durch eine Aufbewahrung, bei der Sauerstoff nach der Sauerstoffentfernung
in einem Behälter,
der eine künstliche
Sauerstoffinfusion enthält,
blockiert wird, eine Oxidation des Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur
und eine Oxidation anderer Komponenten wie eines Lipids und dergleichen
unterdrückt
werden. Nach einem Schritt der Entfernung von Sauerstoff kann eine
geeignete Menge eines mit Sauerstoff reagierenden Reagens (Antioxidans)
in einem Behälter
verteilt sein, der eine künstliche
Sauerstoffinfusion enthält,
um eine in der Lösung
verbliebene Spurenmenge an Sauerstoff weiter zu entfernen. Wenn
ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur in einer Lösung
dispergiert wird, kann ein Antioxidans zum Lösungsmittel gegeben werden.
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Als
Antioxidans können
verschiedene Antioxidanzien verwendet werden, die üblicherweise
für Pharmazeutika
verwendet werden. Beispiele dafür umfassen
dithionige Säure,
Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Natriumpyrosulfit (z.B. Natriummetahydrogensulfit),
Rongalit (CH2OHSO2Na),
Ascorbinsäure,
Natriumascorbat, Erythroascorbinsäure, Natriumeryhthroascorbat,
Cystein, Acetylcystein, Cysteinhydrochlorid, Homocystein, Glutathion,
Thioglycerin, α-Thioglycerin, Natriumedetat,
Citronensäure,
Isopropylcitrat, Kaliumdichlorisocyanurat, Natriumthioglycolat,
Natriumthiomalat, Natrium-1,3-butylenglycolpyrosulfit, Calciumdinatriumethylendiamintetraacetat,
Dinatriumethylendiamintetraacetat, Aminosäuresulfit (z.B. L-Lysinsulfit),
Butylhydroxyanisol (BHA), Dibutylhydroxytoluol (BHT), Propylgallat,
Ascorbylpalmitat, Vitamin E und Derivate davon (z.B. dl-α-Tocopherol,
Tocoperholacetat, natürliches
Vitamin E, d-δ-Tocopherol
und Tocopherolgemisch-Konzentrat, Trolox), Guajakharz, Nordihydroguajaretsäure (NDGA),
L-Ascorbylstearat, Sojalecithin, Palmitinascorbinsäure, Benzotriazol,
Pentaerythrittetrakis[3-(3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)propionat]-2-mercaptobenzimidazol
und dergleichen. Von diesen sind dithionige Säure, Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit,
Ascorbinsäure,
Cystein, Acetylcystein, dl-α-Tocopherol,
Tocopherolacetat, Glutathion und Trolox bevorzugt.
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Darüber hinaus
kann der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes
mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung nach einer CO-Bindung
aufbewahrt werden. Wenn beispielsweise ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur ein
Häm ist
(Eisenkomplex), wird CO, das eine 200-fach höhere Affinität für Häm hat als
Sauerstoff, gebunden und einer Langzeit-Aufbewahrung unterzogen.
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In
diesem Fall ist die Verwendungsmenge an CO vorzugsweise das Minimum,
das hinsichtlich der Aspekte der Sicherheit und dergleichen erforderlich ist.
Wenn beispielsweise ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform
eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur ein Albumin-Häm ist, ist
es daher bevorzugt, nach der Inklusionsreaktion den Komplex in einen
Behälter
zu füllen
und die Atmosphäre
im Inneren des Behälters
durch CO zu ersetzen, statt wie auf herkömmliche Weise von der Herstellung
einer Häm-Ethanol-Lösung bis zur Inklusion in Albumin
für einen
langen Zeitraum in einer CO-Atmosphäre zu arbeiten.
Dadurch wird die zu verwendende CO-Menge auf eine Menge verringert,
die weitaus geringer als herkömmliche
Mengen ist.
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Insbesondere
kann beispielsweise ein Verfahren erwähnt werden, das die Zugabe
einer wässrigen
L-Ascorbinsäurelösung zu
einer Ethanollösung eines
Hämderivats,
das zu einer wässrigen
Lösung von
Albumin nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff in einem verschlossenen
Behälter
gegeben wird, während
ein Stickstoffersatz durchgeführt
wird, ein Rühren
der Mischung, um die Bildung von Albumin-Häm in einer Desoxyform zu ermöglichen,
dann deren Einbringen in eine CO-Atmosphäre, um eine Bindung des CO
an das Albumin-Häm
zu ermöglichen,
und deren Aufbewahrung umfasst.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird ausführlich unter
Bezugnahme auf Beispiele erläutert,
die nicht als einschränkend
aufgefasst werden dürfen.
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Beispiel 1)
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Ein
2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex
wurde mittels des Verfahrens von Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry,
Band 8, 5. 534 – 538,
1997, erhalten.
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Eine
wässrige
Lösung
(4 μl) L-Ascorbinsäure (1,2
mM) wurde zu einer Ethanollösung
(2 ml) dieses Komplexes (3,0 mM) gegeben und 10 min lang in einem
verschlossenen Behälter
unter Stickstoffersatz umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten wurde.
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Getrennt
wurde Lösung
B hergestellt, indem rekombinantes Humanserumalbumin (1,5 mM, 0,5 ml)
zu einer wässrigen
Phosphorsäurelösung (pH-Wert
8,1, 1,0 mM, 7,5 ml) nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff mittels Durchperlenlassen von
Stickstoff gegeben wurde.
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Dann
wurde Lösung
A zu Lösung
B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur
gerührt.
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Die
Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter,
hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000)
eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers
(pH-Wert 7,5, 1,0 mM, 50 ml), der eine wässrige Lösung (200 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2
mM) enthielt, wurde Ethanol mittels Ultrafiltration mit konstantem
Volumen entfernt. Dieses wurde auf 2,0 ml konzentriert, und die
erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt. Die Atmosphäre im Inneren
des Behälters
wurde durch Stickstoff ersetzt.
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Auf
diese Weise wurde ein gewünschter
Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex
(Albumin-Konzentration 5,38 %, Porphyrin-Konzentration 3,24 mM)
erhalten.
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(Experimentelles Beispiel
1)
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Sauerstoff
wurde in die in Beispiel 1 erhaltene Dispersion einströmen gelassen,
wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im
Sichtbaren wies eine λmax von 420 nm auf. Diese Dispersion wurde
verdünnt,
und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben,
wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum
im Sichtbaren eine λmax von 441 nm aufwies.
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Mittels
einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und
Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als
Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese
wurde Albumin nicht denaturiert.
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(Beispiel 2)
-
Auf
dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex
erhalten.
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Eine
wässrige
Lösung
(10 μl)
von L-Ascorbinsäure
(1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung
(5 ml) dieses Komplexes (1,2 mM) gegeben und 10 min lang in einem
verschlossenen Behälter
unter Stickstoffersatz umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten wurde.
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Getrennt
wurde Lösung
B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen
von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (1,5 mM, 0,5 ml)
zu einer wässrigen
Phosphorsäurelösung (pH-Wert
8,1, 1,0 mM, 24,5 ml) gegeben wurde.
-
Dann
wurde Lösung
A zu Lösung
B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur
gerührt.
-
Die
Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter,
hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000)
eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers
(pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), der eine wässrige Lösung (200 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2
mM) enthielt, wurde Ethanol mittels Ultrafiltration mit konstantem
Volumen entfernt. Dieses wurde auf 2,0 ml konzentriert, und die
erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt. Die Atmosphäre im Inneren
des Behälters
wurde durch Stickstoff ersetzt.
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Auf
diese Weise wurde ein gewünschter
Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex
(Albumin-Konzentration 4,344 %, Porphyrin-Konzentration 3,55 mM)
erhalten.
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(Experimentelles Beispiel
2)
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Sauerstoff
wurde in die in Beispiel 2 erhaltene Dispersion einströmen gelassen,
wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im
Sichtbaren wies eine λmax von 421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde
verdünnt,
und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben,
wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum
im Sichtbaren eine λmax von 441,5 nm aufwies.
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Mittels
einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und
Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als
Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese
wurde Albumin nicht denaturiert.
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(Beispiel 3)
-
Auf
dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex
erhalten.
-
Eine
wässrige
Lösung
(20 μl)
von L-Ascorbinsäure
(1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung
(1 ml) dieses Komplexes (1,5 mM) gegeben und 10 min lang in einem
verschlossenen Behälter
unter Durchperlenlassen von Stickstoff umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten
wurde.
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Getrennt
wurde Lösung
B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen
von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (0,375 mM, 0,5 ml)
zu einer wässrigen
Phosphorsäurelösung (pH-Wert
8,1, 1,0 mM, 4,5 ml) gegeben wurde.
-
Dann
wurde Lösung
A zu Lösung
B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur
gerührt.
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Die
Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter,
hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000)
eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers
(pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), wurde Ethanol mittels Ultrafiltration
mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 0,5 ml konzentriert,
und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt.
Die Atmosphäre
im Inneren des Behälters wurde
durch Stickstoff ersetzt.
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Auf
diese Weise wurde ein gewünschter
Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex
(Albumin-Konzentration 5,252 %, Forphyrin-Konzentration 1,74 mM)
erhalten.
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(Experimentelles Beispiel
3)
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Sauerstoff
wurde in die in Beispiel 3 erhaltene Dispersion einströmen gelassen,
wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im
Sichtbaren wies eine λmax von 421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde
auf 1/50 verdünnt,
in eine Zelle zur Spektroskopie aus Quarz überführt, und eine kleine Menge
an dithioniger Säure
wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, wodurch eine
Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum im Sichtbaren
eine λmax von 440,5 nm aufwies.
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Mittels
einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und
Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als
Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese
wurde Albumin nicht denaturiert.
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(Beispiel 4)
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Auf
dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex
erhalten.
-
Eine
wässrige
Lösung
(4 μl) von
L-Ascorbinsäure
(1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung
(5 ml) dieses Komplexes (1,2 mM) gegeben und 10 min lang in einem
verschlossenen Behälter
unter Durchperlenlassen von Stickstoff umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten
wurde.
-
Getrennt
wurde Lösung
B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen
von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (1,5 mM, 0,5 ml)
zu einer wässrigen
Phosphorsäurelösung (pH-Wert
8,1, 1,0 mM, 24,5 ml) gegeben wurde.
-
Dann
wurde Lösung
A zu Lösung
B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur
gerührt.
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Die
Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter,
hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000)
eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers
(pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), wurde Ethanol mittels Ultrafiltration
mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 2,0 ml eingeengt,
und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und
versiegelt. Die Atmosphäre
im Inneren des Behälters wurde
durch Stickstoff ersetzt.
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Auf
diese Weise wurde ein gewünschter
Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex
(Albumin-Konzentration 5,041 %, Porphyrin-Konzentration 2,71 mM)
erhalten.
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(Experimentelles Beispiel
4)
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Durch
eine Bestrahlung mit Licht (500 W) in einem Eisbad wurde, während Sauerstoff
in die in Beispiel 4 erhaltene Dispersion fließen gelassen wurde, eine Oxyform
erhalten. Das Absorptionsspektrum im Sichtbaren wies eine λmax von
421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde verdünnt, in eine Zelle zur Spektroskopie
aus Quarz überführt, und
eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben,
wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum
im Sichtbaren eine λmax von 441,5 nm aufwies.
-
Mittels
einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und
Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als
Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese
wurde Albumin nicht denaturiert.
-
(Beispiel 5)
-
Auf
dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex
erhalten.
-
Eine
wässrige
Lösung
(20 μl)
von L-Ascorbinsäure
(1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung
(1 ml) dieses Komplexes (1,5 mM) gegeben und 10 min lang in einem
verschlossenen Behälter
unter Durchperlen von Stickstoff umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten
wurde.
-
Getrennt
wurde Lösung
B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen
von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (0,375 mM, 0,5 ml)
zu einer wässrigen
Phosphorsäurelösung (pH-Wert
8,1, 1,0 mM, 4,5 ml) gegeben wurde.
-
Dann
wurde Lösung
A zu Lösung
B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur
gerührt.
-
Die
Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter,
hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000)
eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers
(pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), wurde Ethanol mittels Ultrafiltration
mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 0,5 ml konzentriert,
und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt.
Die Atmosphäre
im Inneren des Behälters wurde
durch Stickstoff ersetzt.
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Auf
diese Weise wurde ein gewünschter
Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex
(Albumin-Konzentration 3,16 %, Porphyrin-Konzentration 3,90 mM)
erhalten.
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(Experimentelles Beispiel
5).
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Sauerstoff
wurde in die in Beispiel 3 erhaltene Dispersion einströmen gelassen,
wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im
Sichtbaren wies eine λmax von 421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde
verdünnt,
und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben,
wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum
im Sichtbaren eine λmax von 442,0 nm aufwies.
-
Mittels
einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und
Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als
Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese
wurde Albumin nicht denaturiert.
-
Das
künstliche
Sauerstoff-Infusionspräparat der
vorliegenden Erfindung kann auf jedem Gebiet verwendet werden, in
dem ein Sauerstoffträger
benötigt
wird. Es wird beispielsweise an lebende Organismen, um Sauerstoff
einer ischämischen
Penumbra oder Tumorgewebe zuzuführen,
als Blutinfusion während
einer Blutung verabreicht oder es kann als Perfusat zur Aufbewahrung
von Organen, als Lösung
zur extrakorporalen Zirkulation oder als Zellkulturflüssigkeit
verwendet werden.