DE602004002834T2

DE602004002834T2 - Künstlicher Sauerstoffträger und Herstellungsverfahren dafür

Info

Publication number: DE602004002834T2
Application number: DE602004002834T
Authority: DE
Inventors: Eishun Tsuchida; Shinji Takeoka; Teruyuki Komatsu; Toshiya Kai; Naohisa Katayama; Ippei Fukutomi; Makoto Sato
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2003-08-28
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2024-08-28
Also published as: EP1538151A1; EP1538151B1; ATE342904T1; US7285379B2; DE602004002834D1; ES2270245T3; US20050085410A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen künstlichen Sauerstoffträger, der dazu fähig ist, Sauerstoff in lebenden Organismen reversibel zu adsorbieren und zu desorbieren, und ein künstliches Sauerstoff-Infusionspräparat, das einen künstlichen Sauerstoffträger umfasst. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur, der hochgradig sicher und von hoher Qualität ist und der auf dem medizinischen Gebiet zur Zuführung von Sauerstoff zu ischämischem Penumbra- oder Tumorgewebe, zur Blutinfusion bei Patienten mit einer schweren Blutung und als Organkonservierungsperfusat, eine Lösung zur extrakorporalen Zirkulation oder als Zellkulturflüssigkeit verwendet wird, und ein Verfahren zur Herstellung davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, dass Plasmaprotein oder Plasmakolloid eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Blutströmung in den Blutgefäßen lebender Organismen spielt. Um Patienten in dieser Hinsicht eine Erholung von einem hämorrhagischen Schock zu ermöglichen, wird üblicherweise ein Plasmaexpander, der fast denselben osmotischen Kolloiddruck wie das Blut von lebenden Organismen hat, als Flüssigkeitsersatz verwendet. Im Fall eines massiven Verlusts von 30 % oder mehr des zirkulierenden Blutvolumens wird die Sauerstoffzufuhr zu den peripheren Geweben aber unzureichend, und eine Verabreichung eines Sauerstoffträgers zusätzlich zur Verabreichung eines Plasmaexpanders wird erforderlich.
Als ein solcher Sauerstoffträger werden üblicherweise natürliches Blut, das natürliche rote Blutzellen und eine schwere Lösung von roten Blutkörperchen enthält, verwendet. Um eine Blutgerinnung aufgrund von Antigen-Antikörper-Reaktionen zu verhindern, müssen die Bluttypen des Spenders und des Empfängers aufeinander abgestimmt werden, und bei der Verwendung muss eine Kreuzprobe durchgeführt werden. Das natürliche Blut und die schwere Lösung von roten Blutkörperchen können durch Konservierung nur für einen kurzen Zeitraum von 3 Wochen (4 °C) wirksam bleiben. Andererseits ist gefrorenes Blut, das eine Langzeitaufbewahrung mittels Kryokonservierung ermöglicht, gegen hohe Kosten und eine Hämolyse aufgrund eines osmotischen Schocks während der Verwendung auf problematische Weise empfindlich. Darüber hinaus bestehen Befürchtungen hinsichtlich eines Auftretens von Infektionskrankheiten wie Hepatitis, AIDS und dergleichen.
Als Sauerstoffträger zur Lösung solcher Probleme sind verschiedene künstliche Sauerstoffträger untersucht worden. Ein Sauerstoffinfusionspräparat (hiernach Albumin-Häm), bei dem ein Hämderivat, 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex etc., an einer hydrophoben Tasche von humanem Albumin oder rekombinantem Albumin adsorbiert wird, ist synthetisiert worden, und seine Fähigkeit zum Transport von Sauerstoff ist bestätigt worden (E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry, Band 8, 534 – 538, 1997).
Zur Herstellung dieser künstlichen Sauerstoffträger ist üblicherweise toxisches Kohlenmonoxid (hiernach CO) verwendet worden.
Komatsu et al., Bioconjugate Chemistry, Band 10, 797 – 802, 1999 (S. 800, linke Spalte, 2. Zeile von unten – rechte Spalte, 1. Zeile) beschreiben, dass Albumin-Häm in Gegenwart von Sauerstoff bei 25 °C: 8 h oder bei 37 °C: 2 h um 50 % zersetzt wird. Auf diese Weise wird, wenn Sauerstoff in einem Herstellungsschritt vorhanden ist, ein zweiwertiger Eisenkomplex dreiwertig, und die Funktion des Sauerstoffträgers wird nicht erfüllt, wodurch ein Albumin-Häm mit einer ausreichenden Fähigkeit zum Transport von Sauerstoff nicht erhalten wird.
Für ein vollständiges Blockmischen von Sauerstoff während eines Produktionsschritts ist jedoch eine extrem hochmoderne Einrichtung erforderlich. Weil eine allgemeine Vorrichtung ein Zumischen von Sauerstoff nicht verhindern kann, besteht eine herkömmliche Praxis in der Verwendung von CO zur Herstellung eines Sauerstoffträgers, so dass der Sauerstoffträger sogar dann, wenn Sauerstoff in einem Produktionsschritt zugemischt wird, nicht zersetzt wird. Durch eine Bindung von CO an einen (hiernach als Häm abgekürzten) Porphyrineisenkomplex wird das zweiwertige Eisen von Häm in einer stabilen Konzentration gehalten, und eine oxidative Reaktion zu einem dreiwertigen Eisen kann unterdrückt werden.
Ein Beispiel für das Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Sauerstoffträgers unter Verwendung von CO umfasst zuerst die Bildung eines CO-PFP durch die Umsetzung von Lattenzaun-Porphyrin (hiernach PFP) mit CO. Dieses CO-PFP wird weiter mit Dithionit reduziert. Dann wird CO-PFP mit Humanserumalbumin (hiernach HSA) vermischt, wodurch ein Komplex mit HSA (hiernach CO-PFP-HSA) erhalten wird. Die Bildung von CO-PFP-HSA kann durch Chromatographie und Ultrafiltration bestätigt werden. CO kann entfernt werden, indem in einem Sauerstoff enthaltenden Tonometer Licht auf eine Probe einwirken gelassen wird. Durch die Entfernung von Sauerstoff aus dem resultierenden O₂-HSA-PFP durch einen Stickstoffersatz kann HSA-PFP erhalten werden (JP-T-10-503489, Seite 14, Zeilen 5 – 11).
Zur Durchführung eines solchen Herstellungsschrittes in einer CO-Atmosphäre ist jedoch eine große CO-Menge erforderlich, die in einem menschlichen Körper tödliche Schäden hervorrufen kann.
Mit Hinsicht auf das Obige ist ein Herstellungsverfahren erwünscht, das frei von CO in einem Herstellungsschritt und einer Zersetzung eines künstlichen Sauerstoffträgers ist.
Wenn ein künstlicher Sauerstoffträger, der auf diese Weise hergestellt ist, unter einer CO-Atmosphäre gekühlt aufbewahrt wird, ist eine Zersetzung durch eine Oxidationsreaktion auf ähnliche Weise wie oben unterdrückt. Wenn jedoch CO gebunden ist, wird aufgrund des Fehlens einer Fähigkeit zur Bindung von Sauerstoff ein Schritt zur Entfernung von CO vor der Verabreichung erforderlich. Auch bei dieser Stufe wird CO erzeugt und verursacht Probleme wie die Angst vor einer Beeinträchtigung des menschlichen Körpers und einer fehlenden Fähigkeit, die Verabreichung in Notfällen bewältigen zu können.
Als ein Verfahren zur Lösung solcher Probleme beschreibt JP-A-2001-72595 (Abschnitt 0028) ein Verfahren zur Aufbewahrung von Albumin-Häm durch dessen Umwandlung zu Desoxyhäm. Insbesondere werden, nachdem in Bezug auf eine physiologische Kochsalzlösung von Albumin-Häm, das nach Komatsu et al., Bioconjugate Chemistry Band 10, 797-802, 1999 (Seite 800, linke Spalte, 2. Zeile von unten – rechte Spalte, 1. Zeile) hergestellt wurde, bestätigt wurde, dass das Häm in einem zweiwertigen Zustand von Eisen vorliegt, Stickstoff oder andere Inertgase (Argon, Helium und dergleichen), die frei von Sauerstoff sind, auf die Dispersion einwirken gelassen, um Sauerstoff aus dieser Dispersion zu entfernen, wodurch der gelöste Sauerstoff entfernt wird, und Oxyhäm wird zur Aufbewahrung zu Desoxyhäm umgewandelt, dem eine Sauerstoffbindung fehlt.
Bei diesem in JP-A-2001-72595 beschriebenen Verfahren wird CO aber nicht zur Desoxidation in einer Aufbewahrungsform verwendet, sondern CO wird immer noch in den Herstellungsschritten verwendet (z.B. Beispiel 1, Beispiel 7 von JP-A-2001-72595 und Komatzsu et al., Artificial Blood, Band 6, 110 – 114, 1998 (S. 111, linke Spalte, Zeilen 16 – 19)).
Herkömmliche Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Sauerstoffträgers (z.B. das Hämoglobin-Vesikel, das Lipidhäm-Vesikel, das Lipidhäm-Triglycerid-Mikrokügelchen, Albumin-Häm und dergleichen), bei denen CO verwendet wird, weisen die oben erwähnten Probleme auf, und ein leicht handhabbares Verfahren zur Herstellung eines sicheren künstlichen Sauerstoffträgers ist erwünscht. Bisher ist jedoch nicht über ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Sauerstoffträgers berichtet worden, das in einem Herstellungsschritt frei von CO ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Albumin und einem Metallkomplex mit Porphyrinstruktur verfügbar, bei dem es sich um einen künstlichen Sauerstoffträger handelt, ohne dass CO verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung ist gemacht worden, um diese Probleme zu lösen. Als Ergebnis intensiver Untersuchungen, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, ist gefunden worden, dass ein Metallkomplex einer Desoxyform, die frei von gebundenem CO ist, die eine Porphyrinstruktur hat, extrem leicht oxidiert wird, und die Oxidationsreaktion erfolgt im beträchtlichen Umfang aufgrund einer zur Ultrafiltration verwendeten Ersatzflüssigkeit, einer zur Dialyse verwendeten Dialyseflüssigkeit und dergleichen in einem Reinigungsschritt eines Komplexes von Albumin und einem Metallkomplex mit Porphyrinstruktur. Weiterhin haben sie gefunden, dass die oben erwähnten Probleme gelöst werden können, indem ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur hergestellt wird und vorzugsweise ein Reduktionsmittel zu einer Ersatzflüssigkeit oder einer Dialyseflüssigkeit gegeben wird, die für einen Reinigungsschritt unter einer Gasatmosphäre verwendet wird, die im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid (CO) und Sauerstoff (hiernach O₂) ist, und vervollständigten die vorliegende Erfindung.
Demgemäß macht die vorliegende Erfindung Folgendes verfügbar:

(1) Ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, umfassend das Mischen von Albumin und einem Metallkomplex, der eine Porphyrinstruktur hat, unter einer Gasatmosphäre, die im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist,
(2) Herstellungsverfahren gemäß (1), das die Umwandlung einer Oxyform eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in eine Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, und das Mischen des resultierenden Komplexes mit Albumin umfasst,
(3) Herstellungsverfahren gemäß (2), wobei die Oxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in Gegenwart eines Reduktionsmittels in die Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, umgewandelt wird,
(4) Herstellungsverfahren gemäß (2), wobei die Oxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, durch Verdrängung mit Stickstoff in die Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, umgewandelt wird,
(5) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei im Schritt des Mischens von Albumin und eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, das zentrale Metallatom des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in einem reduzierten Zustand vorliegt,
(6) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei eine wässrige Albuminlösung nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff in einen verschlossenen Behälter gegeben wird, der mit einem Gas gefüllt ist, das im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist, und dann eine Lösung eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in einem organischen Lösungsmittel und ein Reduktionsmittel dazugemischt werden,
(7) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei der Metallkomplex, der eine Porphyrinstruktur hat, ein Hämderivat ist,
(8) Herstellungsverfahren gemäß (1), wobei das Gas ein Inertgas ist,
(9) Herstellungsverfahren gemäß (8), wobei es sich bei dem Inertgas um eine oder mehrere Arten von Gasen handelt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Helium, Argon, Stickstoff und Neon besteht,
(10) Herstellungsverfahren gemäß (3), wobei es sich bei dem Reduktionsmittel um eine oder mehrere Arten handelt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus dithioniger Säure, Natriumdithionit, Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit, trockenem Natriumsulfit, Natriumpyrosulfit, Natriummetabisulfit, Rongalit, L-Ascorbinsäure, Natrium-L-ascorbat, Erythorbinsäure, Natriumerythorbat, Cystein, Thioglycerin, α-Thioglycerin, Natriumedetat, Zitronensäure, Isopropylcitrat, Kaliumdichlorisocyanurat, Natriumthioglycolat, Natriumthiomalat, Natrium-1,3-butylenglycolpyrosulfit, Butylhydroxyanisol, Dibutylhydroxytoluol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat, einer mit Vitamin E verwandten Verbindung, dl-α-Tocopherol, Tocopherolacetat, natürlichem Vitamin E, d-δ-Tocopherol, gemischtem Tocopherolkonzentrat, Guajakharz, Nordihydroguajaretsäure, L-Ascorbylstearat, Sojalecithin, Palmitinascorbinsäure, Benzotriazol, Pentaerythrityltetrakis[3-(3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)propionat]-2-mercaptobenzimidazol, Calciumdinatriumethylendiamintetraacetat und Dinatriumethylendiamintetraacetat besteht,
(11) Herstellungsverfahren gemäß (6), wobei es sich bei dem organischen Lösungsmittel um Ethanol handelt,
(12) Verfahren gemäß (1) mit dem anschließenden Schritt des Reinigens des Komplexes durch Ultrafiltration unter Verwendung einer wässrigen Lösung, die ein Reduktionsmittel enthält und/oder frei von Sauerstoff ist, als Substitutionsflüssigkeit,
(13) Verfahren gemäß (1) mit dem anschließenden Schritt des Reinigens des Komplexes durch Dialyse unter Verwendung einer wässrigen Lösung, die ein Reduktionsmittel enthält und/oder frei von Sauerstoff ist, als Dialyseflüssigkeit.

Weil der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung durch CO-freie Schritte hergestellt wird, kann er als hochgradig sicherer künstlicher Sauerstoffträger verwendet werden.
Darüber hinaus kann die Produktionseinrichtung vereinfacht und miniaturisiert werden, weil das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung die Notwendigkeit für ein strenges Handhabungssystem zur Verhinderung eines Austretens von CO, das bisher für den Herstellungsschritt herkömmlicher künstlicher Sauerstoffträger erforderlich war, entfallen lässt.
Wenn CO in einem Herstellungsschritt wie in herkömmlichen Schritten verwendet wird, erfolgt ein Schritt zur Entfernung von CO notwendigerweise vor der endgültigen Verwendung des Produkts als Sauerstoffträger. Dahingehend wird ein extrem intensives Licht verwendet, und Sauerstoff wird eingeblasen, wodurch ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur zu einem Oxidationstyp werden kann, der einen Fall eintreten lassen kann, in dem die Funktion als Träger nicht erfüllt werden kann. Gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Schritt zur Entfernung von CO nicht erforderlich, weil CO in keinem Herstellungsschritt verwendet wird, wodurch eine Verschlechterung der Qualität verhindert wird, was die Verabreichung des Trägers in einem Notfall in der bestehenden Form ermöglicht.
Der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung kann als Sauerstoffträger auf einen weiten Bereich in den Gebieten der Medizin und der Pharmazeutik angewandt werden, und wie Blut zur Infusion kann er so, wie er ist, oder als Mischung, die nach Bedarf Additive enthält, als Blutersatz für klinische Behandlungen verwendet werden.
Darüber hinaus kann der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung so, wie er ist, intravenös verabreicht werden, wenn eine Behandlung zur Bindung von CO für eine Langzeitaufbewahrung nicht angewandt wird. Der verabreichte Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur verbindet sich sofort mit Sauerstoff, wenn er durch die Lunge geleitet wird, wodurch er zu einer Oxyform wird und Sauerstoff in peripheren Blutgefäßen freisetzt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht einen Porphyrinring, 2 veranschaulicht ein Beispiel für einen Porphyrinring.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur" einen Metallkomplex, bei dem ein Zentralmetall von einem Porphyrinring koordiniert ist, und er kann einen modifizierten horphyrinring oder einen mit einer Fähigkeit zur reversiblen Bindung von Sauerstoff, die hier alle eingeschlossen sind, enthalten. "Porphyrinring" bedeutet eine makrozyklische Verbindung, bei der vier Pyrrolringe gemäß der Abbildung in 1 in der α-Position wechselseitig an vier Methingruppen gebunden sind, und Derivate davon. Ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur wird durch einen veranschaulicht, bei dem die Mitte eines in 2 dargestellten Porphyrinrings, (2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetralcis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyrin), mit Eisen koordiniert ist. Das Zentralmetall eines solchen Metallkomplexes ist gewöhnlich ein Übergangselement, vorzugsweise ein Übergangselement der Gruppen 6 – 10 des Periodensystems, und Übergangselemente der 4. Periode sind noch mehr bevorzugt. Von diesen sind Eisen, Kobalt, Chrom und dergleichen bevorzugt, und Eisen(II) und Kobalt(III) sind noch mehr bevorzugt.
Darüber hinaus bedeutet eine "Desoxyform eines Metallkomplexes" einen Metallkomplex, bei dem Sauerstoff nicht an das Zentralmetall gebunden ist, wie einen Metallkomplex, bei dem Sauerstoff nicht an das Zentralmetall, Eisen(II), gebunden ist. Eine "Oxyform eines Metallkomplexes" bedeutet einen Metallkomplex, bei dem Sauerstoff an das Zentralmetall gebunden ist, wie ein Metallkomplex, bei dem Sauerstoff an das Zentralmetall, Eisen(II), gebunden ist.
In der vorliegenden Erfindung ist ein "Metallkomplex mit Porphyrinstruktur" vorzugsweise ein "Hämderivat". Ein "Hämderivat" bedeutet einen Eisenkomplex mit Porphyrinstruktur, bei dem es sich um ein Derivat mit einem verformten Porphyrinring oder einen mit einer Fähigkeit der reversiblen Bindung von Sauerstoff handeln kann, die hier alle eingeschlossen sind. Als Hämderivat können beispielsweise Tetraphenylporphyrin, Protoporphyrin, Octaalkylporphyrin und deren Derivate und dergleichen erwähnt werden. Von diesen ist Tetraphenylporphyrin bevorzugt.
In der vorliegenden Erfindung wird ein "Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur" erhalten, indem Albumin- und ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur verbunden werden, und dieser weist eine Fähigkeit zur reversiblen Adsorption und Desorption von Sauerstoff auf. Zum Beispiel können ein Komplex eines Hämderivats und von Albumin (hiernach Albumin-Häm) und dergleichen erwähnt werden.
Einem Metallkomplex mit Porphyrinstruktur, wobei das zentrale Metall vom oxidierten Typ ist, fehlt die Fähigkeit zur reversiblen Adsorption und Desorption von Sauerstoff. Daher muss ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung ein Zentralmetall vom reduzierten Typ sein. Es ist jedoch schwierig, ein Zentralmetall eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur, der ein Zentralmetall eines oxidierten Typs (z.B. Eisen(III)) enthält, nach der Bindung an Albumin in einen reduzierten Typ (z.B. Eisen(II)) umzuwandeln.
Daher ist bei der Bindung eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur an Albumin das Zentralmetall eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur vorzugsweise vom reduzierten Typ. Beispielsweise ist bei einer Bindung eines Eisenkomplexes mit Porphyrinstruktur an Albumin das Zentralmetall des Komplexes vorzugsweise Eisen(II) vom reduzierten Typ.
Es ist auch möglich, die Idee der vorliegenden Erfindung auf einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur sowie künstliche Sauerstoffträger wie eine Hämoglobin-Vesikel, eine Lipidhäm-Vesikel, ein Lipidhäm-Triglycerid-Mikrokügelchen und dergleichen oder eine Mischung eines Komplexes davon und dergleichen anzuwenden.
Obwohl das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Albumin nicht besonders eingeschränkt ist, können beispielsweise Humanserumalbumin, von einem Tier stammendes Serumalbumin, rekombinantes Humanserumalbumin (rHSA) und Multimere davon und dergleichen ebenfalls erwähnt werden. Hinsichtlich des Aspektes eines Verhinderns einer Infektion und dergleichen ist es besonders bevorzugt rHSA.
Als Beispiele für das Albumin-Häm der vorliegenden Erfindung können eines, bei dem ein Tetraphenylporphyrineisen-Derivat, 2-[8-[N-(2-methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex und dergleichen, in eine hydrophobe Tasche von Albumin eingeschlossen ist (E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry, Band 8, 534 – 538, 1997), und dergleichen erwähnt werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "eine Gasatmosphäre, die im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist" eine Gasatmosphäre, deren CO-Gehalt niedriger als eine Menge ist, die einen Einfluss auf den menschlichen Körper ausübt, und deren O₂-Gehalt niedriger als diejenige Menge ist, die einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur zersetzt. Dies bedeutet, dass das Vorhandensein einer kleinen Menge an Kohlenmonoxid, das frei von einem Einfluss auf den menschlichen Körper ist, und das Vorhandensein von Sauerstoff in demjenigen Bereich, in dem der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung stabil erhalten werden, toleriert werden. Insbesondere beträgt die Kohlenmonoxid-Konzentration in der oben erwähnten Gasatmosphäre vorzugsweise nicht mehr als 0,1 ppm, und die Sauerstoffkonzentration in der oben erwähnten Gasatmosphäre beträgt vorzugsweise nicht mehr als 1 % (ca. 10 000 ppm), noch mehr bevorzugt nicht mehr als 0,1 % (ca. 1000 ppm) und noch mehr bevorzugt nicht mehr als 100 ppm.
Ein Gas, aus dem die oben erwähnte Gasatmosphäre besteht, ist vorzugsweise ein Inertgas. Ein Inertgas bedeutet ein chemisch inaktives Gas wie ein Edelgas wie Helium, Argon, Neon und dergleichen und Stickstoff und Wasserstoff. Die Verwendung von Stickstoffgas ist industriell bevorzugt.
Als Reduktionsmittel können in der vorliegenden Erfindung beispielsweise dithionige Säure, ein Dithionitsalz (Natriumdithionit und dergleichen), ein Hydrogensulfitsalz (Natriumhydrogensulfit und dergleichen), ein Sulfitsalz (Natriumsulfit, trockenes Natriumsulfit und dergleichen), ein Pyrosulfitsalz (Natriumpyrosulfit und dergleichen), ein Metahydrogensulfitsalz (Natriummetahydrogensulfit und dergleichen), Rongalit (CH₂OHSO₂Na), Ascorbinsäure oder ein Salz davon (L-Ascorbinsäure, Natrium-L-ascorbat und dergleichen), Erythroascorbinsäure oder ein Salz davon (Natriumeryhthroascorbat und dergleichen), Cystein (vorzugsweise Cysteinhydrochlorid), Thioglycerin, α-Thioglycerin, Edetatsalz (Natriumedetat und dergleichen), Citronensäure, Isopropylcitrat, Dichlorisocyanuratsalz (Kaliumdichlorisocyanurat und dergleichen), Thioglycolatsalz (Natriumthioglycolat und dergleichen), Thiomalatsalz (Natriumthiomalat und dergleichen), Natrium-1,3-Butylenglycolpyrosulfit, Butylhydroxyanisol (BHA), Dibutylhydroxytoluol (BHT), Propylgallat, Ascorbylpalmitat, dl-α-Tocopherol, Tocopherolacetat, natürliches Vitamin E, d-δ- Tocopherol, Tocoperholgemisch-Konzentrat, Guajakharz, Nordihydroguajaretsäure (NDGA), L-Ascorbylstearat, Sojalecithin, Palmitinascorbinsäure, Benzotriazol, Pentaerythrittetrakis[3-(3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)propionat]-2-mercaptobenzimidazol, Calciumdinatriumethylendiamintetraacetat und Dinatriumethylendiamintetraacetat erwähnt werden. Von diesen sind L-Ascorbinsäure und Natrium-L-ascorbat bevorzugt. Nur eine Art eines aus einer solchen Gruppe ausgewählten Reduktionsmittels kann verwendet werden, oder zwei oder mehr Arten von Reduktionsmitteln können gleichzeitig verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "Stickstoffersatz" einen Vorgang zur Entfernung von Sauerstoff, indem ein Gegenstand in eine Stickstoffatmosphäre eingebracht wird. Zum Beispiel wird eine Oxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in eine Stickstoffatmosphäre eingebracht, um Sauerstoff zu entfernen, wodurch sie in eine Desoxyform des Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur umgewandelt wird. Als Verfahren zum Stickstoffersatz können ein Verfahren, das das Durchperlenlassen von Stickstoffgas durch eine Lösung einer Zielsubstanz (hiernach Durchperlenlassen von Stickstoff) umfasst, und ein Verfahren, das das Aufströmenlassen von Stickstoffgas auf die Oberfläche einer Lösung einer Zielsubstanz (Stickstoffstrom) umfasst, erwähnt werden.
Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise einen Schritt der Zugabe einer wässrigen Lösung von Albumin nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff zu einem verschlossenen Behälter, der mit einem Gas gefüllt ist, das im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist, und dann das Vermischen des Reduktionsmittels mit einer Lösung eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einem organischen Lösungsmittel.
Das organische Lösungsmittel zum Auflösen eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur ist nicht besonders eingeschränkt, solange es einen Metallkomplex mit Porphyrinstruktur lösen kann. Gewöhnlich wird ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel verwendet, wobei Ethanol zur Verwendung als pharmazeutisches Produkt bevorzugt ist. Obwohl die Menge des Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einer Lösung eines organischen Lösungsmittels nach dem Verwendungszweck eingestellt werden kann, beträgt sie vorzugsweise etwa 1 – 10 mol auf 1 mol Albumin. Es ist bevorzugt, das oben erwähnte Reduktionsmittel zu einem organischen Lösungsmittel für einen Metallkomplex mit Porphyrinstruktur zu geben.
Eine Lösung eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einem organischen Lösungsmittel wird im Voraus einem Stickstoffersatz wie einem Durchperlenlassen von Stickstoff und dergleichen unterzogen, wodurch vor dem Vermischen mit einer wässrigen Lösung von Albumin eine Oxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur zu einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur umgewandelt wird. Die Zeitdauer des Durchperlenlassens von Stickstoff beträgt vorzugsweise etwa 1 – 30 min.
Die Konzentration einer wässrigen Lösung von Albumin beträgt vorzugsweise weniger als etwa 25 Gew.-%. Wenn die Konzentration niedrig ist, wird die Produktionseffizienz schlecht. Sauerstoff wird aus einer wässrigen Lösung von Albumin vorzugsweise vor dem Vermischen mit einer Lösung eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einem organischen Lösungsmittel entfernt. Zum Beispiel wird sie nach der Entfernung von Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen von Stickstoff und dergleichen mit einem Lösungsmittel vermischt und bei Bedarf einem Stickstoffstrom zur Entfernung von Sauerstoff unterzogen. Das oben erwähnte Lösungsmittel ist nicht besonders eingeschränkt, sofern es zur Herstellung der Injektion verwendet werden kann, und Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung, ein Puffer und dergleichen können erwähnt werden. Ein direktes Durchperlenlassen von Stickstoff durch eine wässrige Lösung von Albumin modifiziert nicht wünschenswerterweise das Albumin. Die Zeitdauer für das Durchperlenlassen von Stickstoff beträgt vorzugsweise etwa 1 – 60 min.
Zum Vermischen eines organischen Lösungsmittels zum Lösen eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur mit einer wässrigen Lösung von Albumin wird zuerst eine wässrige Lösung von Albumin in einen verschlossenen Behälter gegeben, der mit einem Gas befüllt ist, das im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist, und dann wird ein organisches Lösungsmittel zum Auflösen eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in kleinen Portionen zugegeben, und die Mischung wird vorzugsweise durch Rühren vermischt. Das Mischen erfolgt unter Temperaturbedingungen gewöhnlich von etwa 0 – 60 °C, vorzugsweise etwa 10 – 50 °C, so dass ein Gefrieren der wässrigen Lösung und eine Denaturierung von Albumin nicht auftreten. Die Mischdauer ist der Zeitraum, der für ein gleichmäßiges Vermischen von Albumin und einem Metallkomplex mit Porphyrinstruktur erforderlich ist.
In der vorliegenden Erfindung ist ein "Reinigungsverfahren für einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur" ein Verfahren zur Abtrennung eines Lösungsmittels oder einer Verunreinigung in einer Lösung, die einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur enthält, unter Verwendung bekannter Blutreinigungsverfahren und dergleichen. Zum Beispiel können verschiedene bekannte Reinigungsverfahren wie die Blutdialyse, die Blutdialysefiltration, die Blutfiltration und dergleichen angewandt werden. Es ist bevorzugt, die Filtration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mittels eines Blutfiltrationsverfahrens durchzuführen und nach Bedarf eine Ersatzflüssigkeit als Ergänzung zu einer Lösung zu geben, die einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur enthält. Darüber hinaus kann eine Dialyse unter Verwendung einer semipermeablen Membran und einer Dialysierflüssigkeit mittels eines Blutdialyseverfahrens durchgeführt werden. Die hier zu verwendende Ersatzflüssigkeit oder Dialysierflüssigkeit ist vorzugsweise eine wässrige Lösung, die ein Reduktionsmittel enthält und/oder frei von Sauerstoff ist. Als Reduktionsmittel können diejenigen verwendet werden, die denen, die zum oben erwähnten Lösungsmittel für einen Metallkomplex mit Porphyrinstruktur gegeben werden, ähnlich sind, und als Verfahren zur Entfernung von Sauerstoff können verschiedene bekannte Verfahren wie ein Durchperlenlassen von Stickstoff und dergleichen verwendet werden. Durch die Verwendung einer solchen Ersatzflüssigkeit kann eine Oxidierung eines Komplexes von Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur verhindert werden.
Das künstliche Sauerstoff-Infusionspräparat, das mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erhalten wird, ist eine Flüssigkeit, die einen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur mit einer Fähigkeit zum Transport von Sauerstoff enthält.
Das künstliche Sauerstoff-Infusionspräparat der vorliegenden Erfindung kann bei Bedarf eine Verbindung enthalten, die zur Erzeugung eines kolloidosmotischen Drucks fähig ist. Als Verbindung, die zur Erzeugung eines kolloidosmotischen Drucks fähig ist, können verschiedene, für Pharmazeutika verwendete Polymere verwendet werden, solange sie einen kolloidosmotischen Druck haben. Beispiele dafür umfassen Dextran (z.B. Dextran mit niedriger Molekülmasse), ein Dextranderivat (z.B. Carboxymethyldextran, Carboxydextran, kationisches Dextran, Dextransulfat), Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, Gelatine (z.B. modifizierte Gelatine), Albumin (z.B. rohes humanes Plasma, Humanserumalbumin, erwärmtes Humanplasmaprotein, rekombinantes Humanserumalbumin), PEG, Polyvinylpyrrolidon, Carboxymethylcellulose, Akaziengummi, Glucose, Dextrose (z.B. D-Glucosemonohydrat), Oligosaccharide (z.B. Oligosaccharid), ein Polysaccharid-Abbauprodukt, eine Aminosäure, ein Proteinabbauprodukt und dergleichen. Von diesen sind Dextran mit einer niedrigen Molekularmasse, Hydroxyethylstärke, modifizierte Gelatine und rekombinantes Humanserumalbumin besonders bevorzugt.
Der oben erwähnte Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur bindet reversibel Sauerstoff, wenn ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur vom reduzierten Typ ist, wobei das Metall aber keine Fähigkeit zur Bindung von Sauerstoff hat, wenn es vom oxidierten Typ ist. Wenn beispielsweise das Zentralelement Eisen von Häm zweiwertiges Eisen (Fe²⁺) ist, bindet der Komplex reversibel Sauerstoff, aber wenn der Komplex vom oxidierten Typ des dreiwertigen Eisens (Fe³⁺) ist, hat er keine Fähigkeit zur Bindung von Sauerstoff. Sogar ein zweiwertiger Eisenkomplex, an dem Sauerstoff gebunden ist, setzt das Superoxid-Anion (O₂ ^–) frei und wird allmählich autooxidiert, wodurch das Eisen dreiwertig wird (Methoform) und die Fähigkeit zur Bindung von Sauerstoff verliert. Darüber hinaus gibt ein nachteiliger Einfluss auf lebende Organismen infolge einer leichten Freisetzung von Häm und des Eisenions aus der Methoform zur Besorgnis Anlass.
Daher muss die Oxidationsreaktion unterdrückt werden, wenn ein künstliches Sauerstoff-Infusionspräparat, das einen solchen Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur enthält, aufbewahrt werden soll.
Als Verfahren zur Unterdrückung der Oxidationsreaktion kann die Reaktionsgeschwindigkeit durch eine Kühlaufbewahrung einfach erniedrigt werden. Bei einer einfachen Kühlaufbewahrung nimmt das dreiwertige Eisen aber allmählich zu. Um dies zu verhindern, ist ein Verfahren, das die Zugabe eines im roten Blutkörperchen inhärent vorhandenen Methämoglobin-Reduktionsenzym-Systems umfasst, eines Enzyms, das Aktivsauerstoff-Katalase und Superoxid-Dismutase eliminiert, und dergleichen bekannt. Die Aufbewahrungstemperatur kann –20 °C bis 60 °C, vorzugsweise 4 bis 25 °C betragen, und der Komplex wird an einem kühlen, dunklen Platz aufbewahrt.
Zur sauerstofffreien Aufbewahrung wird der Komplex beispielsweise direkt in einer Glasflasche, einem Aluminium/Polyethylen-Schichtbeutel (aluminisierter Polyethylen-Beutel) verschlossen, in einen Behälter aus einem Material mit einer extrem niedrigen Sauerstoffpermeabilität wie Polyvinylidenchloriden, Ethylen-Vinylalkohol-Copolymeren und dergleichen eingebracht oder in einem Kunststoffbeutel versiegelt, der dann vorzugsweise in einen Behälter gelegt wird, der Sauerstoff nicht durchlässt.
Weiterhin können durch eine Aufbewahrung, bei der Sauerstoff nach der Sauerstoffentfernung in einem Behälter, der eine künstliche Sauerstoffinfusion enthält, blockiert wird, eine Oxidation des Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur und eine Oxidation anderer Komponenten wie eines Lipids und dergleichen unterdrückt werden. Nach einem Schritt der Entfernung von Sauerstoff kann eine geeignete Menge eines mit Sauerstoff reagierenden Reagens (Antioxidans) in einem Behälter verteilt sein, der eine künstliche Sauerstoffinfusion enthält, um eine in der Lösung verbliebene Spurenmenge an Sauerstoff weiter zu entfernen. Wenn ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur in einer Lösung dispergiert wird, kann ein Antioxidans zum Lösungsmittel gegeben werden.
Als Antioxidans können verschiedene Antioxidanzien verwendet werden, die üblicherweise für Pharmazeutika verwendet werden. Beispiele dafür umfassen dithionige Säure, Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Natriumpyrosulfit (z.B. Natriummetahydrogensulfit), Rongalit (CH₂OHSO₂Na), Ascorbinsäure, Natriumascorbat, Erythroascorbinsäure, Natriumeryhthroascorbat, Cystein, Acetylcystein, Cysteinhydrochlorid, Homocystein, Glutathion, Thioglycerin, α-Thioglycerin, Natriumedetat, Citronensäure, Isopropylcitrat, Kaliumdichlorisocyanurat, Natriumthioglycolat, Natriumthiomalat, Natrium-1,3-butylenglycolpyrosulfit, Calciumdinatriumethylendiamintetraacetat, Dinatriumethylendiamintetraacetat, Aminosäuresulfit (z.B. L-Lysinsulfit), Butylhydroxyanisol (BHA), Dibutylhydroxytoluol (BHT), Propylgallat, Ascorbylpalmitat, Vitamin E und Derivate davon (z.B. dl-α-Tocopherol, Tocoperholacetat, natürliches Vitamin E, d-δ-Tocopherol und Tocopherolgemisch-Konzentrat, Trolox), Guajakharz, Nordihydroguajaretsäure (NDGA), L-Ascorbylstearat, Sojalecithin, Palmitinascorbinsäure, Benzotriazol, Pentaerythrittetrakis[3-(3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)propionat]-2-mercaptobenzimidazol und dergleichen. Von diesen sind dithionige Säure, Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Ascorbinsäure, Cystein, Acetylcystein, dl-α-Tocopherol, Tocopherolacetat, Glutathion und Trolox bevorzugt.
Darüber hinaus kann der Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur der vorliegenden Erfindung nach einer CO-Bindung aufbewahrt werden. Wenn beispielsweise ein Metallkomplex mit Porphyrinstruktur ein Häm ist (Eisenkomplex), wird CO, das eine 200-fach höhere Affinität für Häm hat als Sauerstoff, gebunden und einer Langzeit-Aufbewahrung unterzogen.
In diesem Fall ist die Verwendungsmenge an CO vorzugsweise das Minimum, das hinsichtlich der Aspekte der Sicherheit und dergleichen erforderlich ist. Wenn beispielsweise ein Komplex aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes mit Porphyrinstruktur ein Albumin-Häm ist, ist es daher bevorzugt, nach der Inklusionsreaktion den Komplex in einen Behälter zu füllen und die Atmosphäre im Inneren des Behälters durch CO zu ersetzen, statt wie auf herkömmliche Weise von der Herstellung einer Häm-Ethanol-Lösung bis zur Inklusion in Albumin für einen langen Zeitraum in einer CO-Atmosphäre zu arbeiten. Dadurch wird die zu verwendende CO-Menge auf eine Menge verringert, die weitaus geringer als herkömmliche Mengen ist.
Insbesondere kann beispielsweise ein Verfahren erwähnt werden, das die Zugabe einer wässrigen L-Ascorbinsäurelösung zu einer Ethanollösung eines Hämderivats, das zu einer wässrigen Lösung von Albumin nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff in einem verschlossenen Behälter gegeben wird, während ein Stickstoffersatz durchgeführt wird, ein Rühren der Mischung, um die Bildung von Albumin-Häm in einer Desoxyform zu ermöglichen, dann deren Einbringen in eine CO-Atmosphäre, um eine Bindung des CO an das Albumin-Häm zu ermöglichen, und deren Aufbewahrung umfasst.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, die nicht als einschränkend aufgefasst werden dürfen.
Beispiel 1)
Ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex wurde mittels des Verfahrens von Tsuchida et al., Bioconjugate Chemistry, Band 8, 5. 534 – 538, 1997, erhalten.
Eine wässrige Lösung (4 μl) L-Ascorbinsäure (1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung (2 ml) dieses Komplexes (3,0 mM) gegeben und 10 min lang in einem verschlossenen Behälter unter Stickstoffersatz umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten wurde.
Getrennt wurde Lösung B hergestellt, indem rekombinantes Humanserumalbumin (1,5 mM, 0,5 ml) zu einer wässrigen Phosphorsäurelösung (pH-Wert 8,1, 1,0 mM, 7,5 ml) nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff mittels Durchperlenlassen von Stickstoff gegeben wurde.
Dann wurde Lösung A zu Lösung B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter, hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000) eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7,5, 1,0 mM, 50 ml), der eine wässrige Lösung (200 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2 mM) enthielt, wurde Ethanol mittels Ultrafiltration mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 2,0 ml konzentriert, und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt. Die Atmosphäre im Inneren des Behälters wurde durch Stickstoff ersetzt.
Auf diese Weise wurde ein gewünschter Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex (Albumin-Konzentration 5,38 %, Porphyrin-Konzentration 3,24 mM) erhalten.
(Experimentelles Beispiel 1)
Sauerstoff wurde in die in Beispiel 1 erhaltene Dispersion einströmen gelassen, wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im Sichtbaren wies eine λ_max von 420 nm auf. Diese Dispersion wurde verdünnt, und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum im Sichtbaren eine λ_max von 441 nm aufwies.
Mittels einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese wurde Albumin nicht denaturiert.
(Beispiel 2)
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex erhalten.
Eine wässrige Lösung (10 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung (5 ml) dieses Komplexes (1,2 mM) gegeben und 10 min lang in einem verschlossenen Behälter unter Stickstoffersatz umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten wurde.
Getrennt wurde Lösung B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (1,5 mM, 0,5 ml) zu einer wässrigen Phosphorsäurelösung (pH-Wert 8,1, 1,0 mM, 24,5 ml) gegeben wurde.
Dann wurde Lösung A zu Lösung B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter, hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000) eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), der eine wässrige Lösung (200 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2 mM) enthielt, wurde Ethanol mittels Ultrafiltration mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 2,0 ml konzentriert, und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt. Die Atmosphäre im Inneren des Behälters wurde durch Stickstoff ersetzt.
Auf diese Weise wurde ein gewünschter Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex (Albumin-Konzentration 4,344 %, Porphyrin-Konzentration 3,55 mM) erhalten.
(Experimentelles Beispiel 2)
Sauerstoff wurde in die in Beispiel 2 erhaltene Dispersion einströmen gelassen, wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im Sichtbaren wies eine λ_max von 421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde verdünnt, und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum im Sichtbaren eine λ_max von 441,5 nm aufwies.
Mittels einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese wurde Albumin nicht denaturiert.
(Beispiel 3)
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex erhalten.
Eine wässrige Lösung (20 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung (1 ml) dieses Komplexes (1,5 mM) gegeben und 10 min lang in einem verschlossenen Behälter unter Durchperlenlassen von Stickstoff umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten wurde.
Getrennt wurde Lösung B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (0,375 mM, 0,5 ml) zu einer wässrigen Phosphorsäurelösung (pH-Wert 8,1, 1,0 mM, 4,5 ml) gegeben wurde.
Dann wurde Lösung A zu Lösung B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter, hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000) eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), wurde Ethanol mittels Ultrafiltration mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 0,5 ml konzentriert, und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt. Die Atmosphäre im Inneren des Behälters wurde durch Stickstoff ersetzt.
Auf diese Weise wurde ein gewünschter Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex (Albumin-Konzentration 5,252 %, Forphyrin-Konzentration 1,74 mM) erhalten.
(Experimentelles Beispiel 3)
Sauerstoff wurde in die in Beispiel 3 erhaltene Dispersion einströmen gelassen, wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im Sichtbaren wies eine λ_max von 421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde auf 1/50 verdünnt, in eine Zelle zur Spektroskopie aus Quarz überführt, und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum im Sichtbaren eine λ_max von 440,5 nm aufwies.
Mittels einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese wurde Albumin nicht denaturiert.
(Beispiel 4)
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex erhalten.
Eine wässrige Lösung (4 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung (5 ml) dieses Komplexes (1,2 mM) gegeben und 10 min lang in einem verschlossenen Behälter unter Durchperlenlassen von Stickstoff umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten wurde.
Getrennt wurde Lösung B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (1,5 mM, 0,5 ml) zu einer wässrigen Phosphorsäurelösung (pH-Wert 8,1, 1,0 mM, 24,5 ml) gegeben wurde.
Dann wurde Lösung A zu Lösung B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter, hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000) eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), wurde Ethanol mittels Ultrafiltration mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 2,0 ml eingeengt, und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt. Die Atmosphäre im Inneren des Behälters wurde durch Stickstoff ersetzt.
Auf diese Weise wurde ein gewünschter Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex (Albumin-Konzentration 5,041 %, Porphyrin-Konzentration 2,71 mM) erhalten.
(Experimentelles Beispiel 4)
Durch eine Bestrahlung mit Licht (500 W) in einem Eisbad wurde, während Sauerstoff in die in Beispiel 4 erhaltene Dispersion fließen gelassen wurde, eine Oxyform erhalten. Das Absorptionsspektrum im Sichtbaren wies eine λ_max von 421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde verdünnt, in eine Zelle zur Spektroskopie aus Quarz überführt, und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum im Sichtbaren eine λ_max von 441,5 nm aufwies.
Mittels einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese wurde Albumin nicht denaturiert.
(Beispiel 5)
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde ein 2-[8-[N-(2-Methylimidazolyl)]-octanoyloxymethyl]-5,10,15,20-tetrakis(α,α,α,α-o-pivalamido)phenylporphyratoeisen-Komplex erhalten.
Eine wässrige Lösung (20 μl) von L-Ascorbinsäure (1,2 mM) wurde zu einer Ethanollösung (1 ml) dieses Komplexes (1,5 mM) gegeben und 10 min lang in einem verschlossenen Behälter unter Durchperlen von Stickstoff umgesetzt, wodurch Lösung A erhalten wurde.
Getrennt wurde Lösung B hergestellt, indem nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff durch ein Durchperlenlassen von Stickstoff rekombinantes Humanserumalbumin (0,375 mM, 0,5 ml) zu einer wässrigen Phosphorsäurelösung (pH-Wert 8,1, 1,0 mM, 4,5 ml) gegeben wurde.
Dann wurde Lösung A zu Lösung B gegeben, und die Mischung wurde etwa 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wurde in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (Ultrafilter, hergestellt von Advantec: Ultrafiltrations-Molekulargewicht 50 000) eingebracht und auf 5 ml konzentriert. Mittels eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7,4, 1,0 mM, 50 ml), wurde Ethanol mittels Ultrafiltration mit konstantem Volumen entfernt. Dieses wurde auf 0,5 ml konzentriert, und die erhaltene Mischung wurde in eine Glasampulle gefüllt und versiegelt. Die Atmosphäre im Inneren des Behälters wurde durch Stickstoff ersetzt.
Auf diese Weise wurde ein gewünschter Porphyrinmetallkomplex-Albumin-Komplex (Albumin-Konzentration 3,16 %, Porphyrin-Konzentration 3,90 mM) erhalten.
(Experimentelles Beispiel 5).
Sauerstoff wurde in die in Beispiel 3 erhaltene Dispersion einströmen gelassen, wodurch eine Oxyform erhalten wurde. Das Absorptionsspektrum im Sichtbaren wies eine λ_max von 421,5 nm auf. Diese Dispersion wurde verdünnt, und eine kleine Menge an dithioniger Säure wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zugegeben, wodurch eine Desoxyform erhalten wurde, deren Absorptionsspektrum im Sichtbaren eine λ_max von 442,0 nm aufwies.
Mittels einer wiederholten abwechselnden Beaufschlagung mit Sauerstoff und Stickstoff wurde eine Adsorption und Desorption von Sauerstoff durchgeführt. Als Ergebnis der Beobachtung auf der Grundlage einer Elektrophorese wurde Albumin nicht denaturiert.
Das künstliche Sauerstoff-Infusionspräparat der vorliegenden Erfindung kann auf jedem Gebiet verwendet werden, in dem ein Sauerstoffträger benötigt wird. Es wird beispielsweise an lebende Organismen, um Sauerstoff einer ischämischen Penumbra oder Tumorgewebe zuzuführen, als Blutinfusion während einer Blutung verabreicht oder es kann als Perfusat zur Aufbewahrung von Organen, als Lösung zur extrakorporalen Zirkulation oder als Zellkulturflüssigkeit verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus Albumin und einer Desoxyform eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, umfassend das Mischen von Albumin und einem Metallkomplex, der eine Porphyrinstruktur hat, unter einer Gasatmosphäre, die im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 1, das die Umwandlung einer Oxyform eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in eine Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, und das Mischen des resultierenden Komplexes mit Albumin umfasst.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Oxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in Gegenwart eines Reduktionsmittels in die Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, umgewandelt wird.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Oxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, durch Verdrängung mit Stickstoff in die Desoxyform des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, umgewandelt wird.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 1, wobei im Schritt des Mischens von Albumin und eines Metallkomplexes, der eine Porphy rinstruktur hat, das zentrale Metallatom des Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in einem reduzierten Zustand vorliegt.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 1, wobei eine wässrige Albuminlösung nach der Entfernung von gelöstem Sauerstoff in einen verschlossenen Behälter gegeben wird, der mit einem Gas gefüllt ist, das im Wesentlichen frei von Kohlenmonoxid und Sauerstoff ist, und dann eine Lösung eines Metallkomplexes, der eine Porphyrinstruktur hat, in einem organischen Lösungsmittel und ein Reduktionsmittel dazugemischt werden.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Metallkomplex, der eine Porphyrinstruktur hat, ein Hämderivat ist.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Gas ein Inertgas ist.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 8, wobei es sich bei dem Inertgas um eine oder mehrere Arten von Gasen handelt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Helium, Argon, Stickstoff und Neon besteht.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei dem Reduktionsmittel um eine oder mehrere Arten handelt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus dithioniger Säure, Natriumdithionit, Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit, trockenem Natriumsulfit, Natriumpyrosulfit, Natriummetabisulfit, Rongalit, L-Ascorbinsäure, Natrium-L-ascorbat, Erythorbinsäure, Natriumerythorbat, Cystein, Thioglycerin, α-Thioglycerin, Natriumedetat, Zitronensäure, Isopropylcitrat, Kaliumdichlorisocyanurat, Natriumthioglycolat, Natriumthiomalat, Natrium-1,3-butylenglycolpyrosulfit, Butylhydroxyanisol, Dibutylhydroxytoluol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat, einer mit Vitamin E verwandten Verbindung, dl-α-Tocopherol, Tocopherolacetat, natürlichem Vitamin E, d-δ- Tocopherol, gemischtem Tocopherolkonzentrat, Guajakharz, Nordihydroguajaretsäure, L-Ascorbylstearat, Sojalecithin, Palmitinascorbinsäure, Benzotriazol, Pentaerythrityltetrakis[3-(3,5-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)propionat]-2-mercaptobenzimidazol, Calciumdinatriumethylendiamintetraacetat und Dinatriumethylendiamintetraacetat besteht.
Herstellungsverfahren gemäß Anspruch 6, wobei es sich bei dem organischen Lösungsmittel um Ethanol handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 mit dem anschließenden Schritt des Reinigens des Komplexes durch Ultrafiltration unter Verwendung einer wässrigen Lösung, die ein Reduktionsmittel enthält und/oder frei von Sauerstoff ist, als Substitutionsflüssigkeit.
Verfahren gemäß Anspruch 1 mit dem anschließenden Schritt des Reinigens des Komplexes durch Dialyse unter Verwendung einer wässrigen Lösung, die ein Reduktionsmittel enthält und/oder frei von Sauerstoff ist, als Dialyseflüssigkeit.