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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein
makromolekulares, endoplasmatisches Retikulum, dessen
Oberflächenladung negativ ist.
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Es ist möglich, das erfindungsgemäße makromolekulare,
endoplasmatische Retikulum im industriellen oder
medizinischen Bereich als Träger für Medikamente, Enzyme,
Hämoglobin usw. zu nutzen.
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Es gibt viele Berichte über Versuche zur Verbesserung
der Wirksamkeit von Nutzstoffen wie Medikamenten und
Enzymen, indem diese in kleinsten Kapseln eingekapselt
werden. Bei den anfänglichen Versuchen wurden
synthetische makromolekulare Verbindungen wie Polystyrol und
Nylon als Membranstoffe benutzt.
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Nachdem diese Stoffe jedoch toxisch waren und aufgrund
ihrer großen Korngröße Blutgerinnsel verursachten waren
sie unbrauchbar.
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Neulich ist der Gebrauch einer sehr kleinen Mikrokapsel
(endoplasmatisches Retikulum) aus natürlichem
Phospholipid als Membranstoff, insbesondere als Träger für
Mekdikamente vorgeschlagen worden, welche eine geringe
Toxizität aufweist. Die Korngröße der Mikrokapsel kann
wahlweise in dem Bereich von 0,02 um bis einigen um
eingestellt werden. Über die Bestimmung einer geeigneten
Korngröße werden dann solche Probleme wie Thrombose
vermieden. Probleme bestehen jedoch insoweit, als das
endoplasmatische Retikulum weder gestaltlich stabil ist
noch im Blut gehalten werden kann, da es im lebenden
Organismus physikalisch und chemisch unstabil ist und
leicht dazu tendiert, sich zu zersetzen.
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Sauerstoff tragendes Hämoglobin im Körper von
Säugetieren ist als Mittel zum Tragen, Speichern oder
Absorbieren von Sauerstoff benutzt worden. Es ist insbesondere
oft als Stoff in einer Sauerstoff führenden
Flüssigkeit benutzt worden. Hämoglobin ist im Körper in den
roten Blutkörperchen enthalten.
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Um dies nachzubilden, ist über einen Sauerstoffträger,
der Hämoglobin in wässriger Lösung in einem
endoplasmatischen Retikulum enthält, welches aus einer, zwei
Schichten aufweisenden Membran besteht, berichtet worden
(Arbing Frank Miller et al., japanische
Patentveröffentlichung Nr. 60-26092; C. Anthony Hunt, japanische
Patentveröffentlichung Nr. 58-183625; Suzuki et al.,
japanische Patentveröffentlichung Nr. 62-178521).
Sämtliche dieser endoplasmatischen Retikula, welche
Hämoglobin enthalten, werden als Membranstoffe benutzt, wobei
natürliche oder synthetische nichtpolymerisierbare
Lipide oder eine Lipidmischung benutzt werden. Solche
oben beschriebenen endoplasmatischen Retikula werden in
erheblichem Ausmaß nicht nur als Träger
hämoglobinhaltiger wässriger Lösungen vorgeschlagen, sondern ebenfalls
als Träger medizinischer Versorgungen. Die Sicherheit
dieser endoplasmatischen Retikula ist gegeben, da diese
aus natürlichen Verbindungen hergestellt werden. Es
können diese endoplasmatischen Retikula jedoch nicht
während einer längeren Zeitspanne aufbewahrt werden, da
sie physikalisch und chemisch instabil sind und sich
leicht zersetzen. Sie können insbesondere nicht im Blut
gehalten werden. Aus diesem Grund ist man ernsthaft
bemüht, die endoplasmatischen Retikula zu stabilisieren.
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Als Verfahren zur Stabilisierung eines endoplasmatischen
Retikulums ist beispielsweise über ein Verfahren zur
Polymerisierung einer bimolekularen Lipidmembran
berichtet worden, wobei polymerisierbare Phospholipide (es
gibt viele Derivate eines Phosphatidylcholintyps, H.
Ringsdorf et al., Angewandte Chemie International
Edition English, Vol. 20, Seite 305 (1981) und andere)
benutzt werden. Bei diesem Verfahren wird der Versuch
unternommen, der Membran durch Polymerisation
physikalische Stabilität zu verleihen. Es gibt auch einen
Bericht, gemäß welchem nach Einschließung einer
hämoglobinhaltigen wässrigen Lösung in einem endoplasmatischen
Retikulum, welches aus einem dieser polymerisierbaren
Phospholipide (ein Phosphatidylcholinderivat, welches
Dienradikale als polymerisierbare Restgruppen enthält)
und Cholesterin hergestellt worden ist, das Retikulum
polymerisiert wird, um ein makromolekulares
endoplasmatisches, Hämoglobin enthaltendes Retikulum zu erhalten.
(J. A. Hayward et al., PCT/WO 85/ 04326)
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Zur Stabilisierung von Mikrokapseln in einem lebenden
Körper, insbesondere in Blut ist es jedoch notwendig,
ein geeignetes Zetapotential der Liposomen
aufrechtzuerhalten und eine negative Oberflächenladung beizubehalten,
um die Wechselwirkung zwischen den Mikrokapseln und den
biologischen Zellen und Komponenten auf ein Minimum zu
reduzieren. Um dies zu erreichen, sind in Fällen von
gewöhnlichen, nicht polymerisierten endoplasmatischen
Retikula und dem obengenannten makromolekularen,
endoplasmatischen Retikulum nicht polymerisierte Lipide mit
negativer elektrischer Ladung, z.B. nicht
polymerisierbare Fettsäuren, phosphatidhaltige Säuren, Dicetyl
Phosphorsäuren und Phosphatidylserin benutzt worden. Im
Blut werden diese Komponenten über die Membranen jedoch
leicht extrahiert, und zwar durch eine, im lebenden
Organismus enthaltende Komponente wie High Density
Lipoprotein (HDL), so daß die Stabilität dieser
Mikrokapseln unzureichend war.
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In der EP-A-0 186 211 ist die Zubereitung von Kapseln
aus Hämoglobin mit Liposomen offenbart, wobei
Dienphosphatidylcholin, Cholesterin, Holzöl, Fettsäure und eine
9,11,13-Trien-Fettsäure zur Regelung benutzt werden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin,
ein stabiles, makromolekulares, endoplasmatisches
Retikulum bereitzustellen, welches eine negative Ladung auf
der Oberfläche der Kapselmembran trägt, insbesondere
ein makromolekulares, endoplasmatisches Retikulum, bei
welchem negative Ladungen tragende Komponenten, die an
der Polymerisation teilnehmen, über kovalente Bindungen
mit den Membranen in Verbindung stehen.
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Die vorliegende Erfindung besteht in einem
makromolekularen, endoplasmatischen Retikulum, welches aus einem
Polymer besteht, der durch Polymerisation einer Mischung
aus einem oder mehreren polymerisierbaren
2,4-Dien-Phospholipiden, Cholesterin und einem oder mehreren
polymerisierbaren 2,4-Dien-Fettsäuren hergestellt worden ist.
Als polymerisierbare Phospholipide können Phospholipide
benutzt werden, die zusätzlich zu dem herkömmlichen
im allgemeinen benutzten Phosphatidylcholin
polymerisierbare Radikale aufweisen. Wird ein negatives
polymerisierbares Phospholipid benutzt, ist es nicht nötig,
an der Polymerisation mit den polymerisierbaren
Fettsäuren teilzunehmen, da die Bestandteile negative Ladungen
tragen. Demzufolge ist im Rahmen der vorliegenden
Erfindung der Gebrauch von Phospholipiden (im allgemeinen
Phosphatidylcholinderivate) mit neutraler Ladung und
polymerisierbaren Radikalen von Bedeutung.
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Als polymerisierbare Fettsäure kann jede Verbindung
benutzt werden, die eine Polymerisierfähigkeit aufweist.
Fettsäuren mit zwölf oder mehr Kohlenstoffatomen werden
bevorzugt.
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Mit Hinblick auf die Wirksamkeit der Einkapselung von
Hämoglobin beträgt das Molverhältnis des
polymerisierbaren Phospolipids zu der polymerisierbaren Fettsäure
vorzugsweise 6:1 bis 2:1, vorzugsweise 5:1 bis 3:1. Das
Molverhältnis des polymerisierbaren Phospolipids zu
Cholesterin beträgt vorzugsweise 1:2 bis 3:2, besser 3:4
bis 4:3. Weiterhin wird mit Hinblick auf die Wirksamkeit
der Einkapselung von Hämoglobin zweckmäßigerweise die
Kombination des polymerisierbaren Phospholipids und der
polymerisierbaren Fettsäure mit Cholesterin gewählt.
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Die Kombination des durch die folgenden Formeln (I) oder
(II) dargestellten polymerisierbaren Phospholipids und
der, durch die folgende Formel (III) dargestellten
polymerisierbaren Fettsäure werden an einem Beispiel
verdeutlicht.
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wobei jedes n unabhängig von den anderen 12,10,8 oder 6
bedeuten kann.
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Die Herstellung des endoplasmatischen Retikulums,
welches aus einer Mischung eines polymerisierbaren
Phospholipids, einer polymerisierbaren Fettsäure und
Cholesterin besteht, kann nach einem herkömmlichen Verfahren
durchgeführt werden. (G. Gregoriades "Liposome
Technology" Vol. 1, C.R.C. Press (1983) usw.). Beispielsweise
werden zu dem, durch Gefriertrocknung einer Mischung aus
einem polymerisierbaren Phospholipid, einer
polymerisierbaren Fettsäure und Cholesterin in Benzol, Wasser,
ein Puffer, ein isotonisches physiologisches Salz
(pHWert
5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8) oder dergleichen
hinzugefügt. Die Mischung wird mit Ultraschallwellen
(einem Ultraschalloszillator des Sonden- oder des
Badtyps) bei einer Temperatur von unter 0º C bis 60º C in
einer Inertgasatmosphäre (Stickstoff, Argon,
Kohlenstoffmonoxyd usw.) behandelt, um eine Dispersion des
endoplasmatischen Retikulums zu erhalten. Andererseits
können der genannten Pulvermischung Wasser, ein Puffer
und ein isotonischen physiologisches Salz hinzugefügt
werden, wobei die Mischung mit einem Voltex-Mischer bei
einer Temperatur vom 5º C bis 37º C während 5 Minuten
bis 60 Minuten behandelt werden kann, um ein
vielschichtiges endoplasmatisches Retikulum (Partikelgröße
ungefähr 10um) zu erhalten. Alle Arten von Medikamenten,
Enzymen, Proteinen oder dergleichen können in dem
endoplasmatischen Retikulum eingeschlossen werden.
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Beispielsweise ist es möglich, Hämoglobin gemäß dem
folgenden Verfahren in das endoplasmatische Retikulum
einzuschließen. Bekanntermaßen kann eine
Hämoglobinlösung eine entsprechende Menge eines Reduktionsmittels
wie z.B. Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid, (reduzierte
Form), Ascorbinsäure usw. zur Verhinderung der Zunahme
des Methämoglobingehalts und eine, die
Sauerstoffbindungsaffinität des Hämoglobins regelnde Substanz wie
z.B. 2,3-Diphosphoglycerat, Inosit Hexaphosphat usw. zur
Einstellung der Sauerstoffaffinität des eingekapselten
Hämoglobins enthalten. Eine wässrige konzentrierte
Hämoglobinlösung (mit einer Hämoglobinkonzentration 10
Gew.-% bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 15 Gew.-% bis 35
Gew.-%), wird der genannten Lipidmischung zugegeben und
mit einem Voltex-Mischer bei einer Temperatur von 5º C
bis 37º C in einer Inertgasatmosphäre (Stickstoffgas,
Argongas oder Kohlenstoffmonoxydgas) während 5 bis 60
Minuten behandelt, um eine Lösung eines vielschichtigen
endoplasmatischen Retikulums (Partikelgröße ungefähr 10
um) zu erhalten, in welches Hämoglobin eingeschlossen
ist. Nachdem die, das vielschichtige endoplasmatische
Retikulum enthaltende, Hämoglobin einschließende Lösung
beispielsweise eine poröse Membran aus Polykarbonat
(Lochgröße 8 um, 5 um, 3 ym, 2 um, 1 um, 0,6 um, 0,4 um
oder dergleichen) durchlaufen hat, wird die Lösung durch
einen, für ein Gel durchlässigen Chromatographen in einer
geeigneten Ultrafiltrationssäule (z.B. Sepharose CL-4,
hergestellt durch Pharmacia Fine Chemical Company) oder
mittels einer Ultrafiltrationsmembran (z.B. des AC-1760
Hohlfasertyps, hergestellt durch Asahi Medical Company,
Japan) gereinigt, wobei isotonisches physiologisches
Salz (pH-Wert 7,4) als Medium benutzt wird, während
Hämoglobin, welches nicht in dem vielschichtigen
endoplasmatischen Retikulum eingeschlossen ist, gleichzeitig
entfernt wird, wobei die hämoglobinhaltige, das
endoplasmatische Retikulum enthaltende Lösung konzentriert
wird und wobei eine, das erwünschte endoplasmatische
Retikulum (Korngröße 0,1 um bis 0,6 um) enthaltende
Dispersion gewonnen wird.
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Es wird weiterhin ein isotonisches physiologisches Salz
der genannten gefriergetrockneten Lipidmischung
beigegeben, wobei diese Lösung mit Ultraschallwellen bei einer
Temperatur von 0º C bis 60º C in einer
Inertgasatmosphäre (Stickstoff, Argon usw.) behandelt wird und wobei
eine Dispersion hergestellt wird, welche ein, eine
einzelne Schicht aufweisendes endoplasmatisches
Retikulum enthält (Korngröße 20 nm bis 60 nm). Nachdem der
Dispersion eine konzentrierte Hämoglobinlösung beigegeben
worden ist, wird die Lösung durch Gefrieren und Abtauen
(-78º C bis Raumtemperatur) behandelt, um eine Lösung zu
erhalten, welche die wässrige Hämoglobinlösung in das
endoplasmatische Retikulum einschließt. Nachdem diese
Lösung eine Membran aus porösem Polykarbonat durchlaufen
hat (Lochgröße 8 um, 5 um, 3 um, 2 um, 1 um, 0,6 um, 0,4
um oder dergleichen) wird die Lösung mittels einer
geeigneten Ultrafiltrationsmembran gewaschen (z.B. des
AC-1760 Hohlfasertyps, hergestellt durch Asahi Medical
Company, Japan), wobei ein isotonisches physiologisches
Salz (pH-Wert 7,4) als Medium benutzt wird, wird das
Hämoglobin, welches nicht in dem endoplasmatischen
Retikulum eingeschlossen ist, gleichzeitig entfernt,
wodurch die hämoglobinhaltige Lösung, welche das
endoplasmatische Retikulum enthält, konzentriert wird und
das Ziel erreicht wird, eine Dispersion herzustellen,
welche eine Lösung aufweist, die das hämoglobinhaltige
endoplasmatische Retikulum umfaßt (Korngröße 0,1 um bis
0,6 um).
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Um ein makromolekulares, endoplasmatisches Retikulum
herzustellen, und zwar durch Polymerisation des
endoplasmatischen Retikulums, kann die Polymerisation in
einer Inertgasatmosphäre, (Stickstoffgas, Argongas oder
Kohlenstoffmonoxydgas) durch Bestrahlung mittels
Ultraviolett- oder Gammastrahlen oder durch Hinzufügung eines
geeigneten Initiators durchgeführt werden. Wenn in dem
endoplasmatischen Retikulum Materialien enthalten sind
(Medikamente, Enzyme, Proteine oder dergleichen), die
gegenüber einer Beheizung unstabil sind, wird ein bei
niedrigen Temperaturen arbeitender Initiator wirksam
eingesetzt. Beispielsweise kann ein Polymer durch
Bestrahlung mittels einer Strahlung im sichtbaren Bereich
bei einer niedrigen Temperatur (ungefähr 10º C) in
Gegenwart von Azobis (2-Amidinopropan) Dihydrochlorid
gewonnen werden. Weiterhin kann ein Polymer hergestellt
werden, indem ein NHSO&sub3; / K&sub2;S&sub2;O&sub8; Redox-Initiator bei
niedrigen Temperaturen eingesetzt wird. Im Rahmen des
Erfindungsgegenstands kann jedes
Polymerisationsverfahren
ohne Einschränkung eingesetzt werden. Es kann der
Fortschritt der Polymerisation anhand der Wertabnahme
eines Absorptionsbandes einer Eigenschaft im
Ultraviolettspektrum (z.B. bei 255 nm für die Verbindungen (I),
(II) und (III)) festgestellt werden. Die gewonnene
Polymerlösung wird nach Polymerisierung des
endoplasmatischen Retikulums wie sie ist oder unter Hinzufügung
eines geeigneten, Radikelen-Spulmittels
(Cysteinhydrochlorid, Mercaptoäthanol, Dithiothreitol oder
dergleichen) mittels einer geeigneten Ultrafiltrationssäule
(z.B. Sepharose CL-4B, hergestellt durch Pharmacia Fine
Chemical Company) oder einer Ultrafiltrationsmembran
(z.B. des AC-1760 Hohlfasertyps, hergestellt durch Asahi
Medical Company) gereinigt, woraufhin die gereinigte
Lösung konzentriert wird und eine das makromolekulare
endoplasmatische Retikulum enthaltende Dispersion oder
eine Dispersion des, Hämoglobin einschließenden
makromolekularen Retikulums erhalten werden kann.
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Die Verdienste der Erfindung bestehen im dem folgenden:
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Da das, erfindungsgemäße makromolekulare,
endoplasmatische Retikulum durch die Polymerisation einer
polymerisierbaren Fettsäure und eines polymerisierbaren
neutralen Phospholipids mit oder ohne Cholesterin zubereitet
worden ist, sind die Mikrokapseln mechanisch stabil und
es wird erwartet, daß diese nur in eine reduzierte
Wechselwirkung mit biologischen Zellen oder Komponenten
treten, und zwar aufgrund ihres gesteuerten
Zeta-Potentials, welches auf der negativen Ladung der Fettsäure
beruht, welche kovalent mit der polymerisierten, zwei
Schichten aufweisenden Membran gebunden ist. Die
Wirksamkeit zum Einschließen von Materialien (Hämoglobin
usw.) wird auch durch die Gegenwart einer
polymerisierbaren Fettsäure als Membrankomponente verbessert.
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Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung in
einer spezifischeren Weise - es werden diese jedoch
nicht immer präzise bei der praktischen Anwendung sein.
Beispiel 1
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2,05 g (2,6 mmol) 1,2 bis(octadeca-trans, 2-trans, 4-
Dienoyl)-Sn-Glycerin-3-Phosphocholin ( eine Verbindung
mit n=12 in der Formel (I)), 0,15 g (0,5 mmol)
Octadecatrans, 2-trans, 4-Diensäure (eine Verbindung mit n=12 in
der Formel (III)) und 0,81 g (2,1 mmol) Cholesterin
wurden in 40 ml Benzol aufgelöst und die erhaltene
Lösung wurde gefriergetrocknet. Dem gewonnenen Pulver
wurden 60 ml eines 5 mM Tris Puffers zugegeben (pH-Wert
7.4 einschließlich 0,9 Gew.-% Natriumchlorid), wobei die
Mischung mit Ultraschallwellen (60 W, 15 Minuten) unter
Kühlung in einer Stickstoffatmosphäre behandelt wurde.
Die gewonnene, eine einzelne Schicht eines
endoplasmatischen Retikulums aufweisende wässrige Dispersion wurde in
ein Gefäß aus Quarzglas eingegeben. Nachdem die
Atmosphäre durch Stickstoff ersetzt worden war, wurde das
Gefäß versiegelt. Der Dispersion wurde als Initiator
einer fotosensibilisierten Polymerisation 3,1 ml einer
wässrigen Lösung von 50 mM Azobis
(2-Amidinopropan)Dihydrochlorid zugegeben und es wurde die Dispersion
anschließend auf 8º C gekühlt. Die Mischung wurde mit
sichtbarer Strahlung, von der Wellenlängen unterhalb von
360 nm mittels eines Filters abgetrennt wurden,
bestrahlt, und zwar mit einer Quecksilberhochdrucklampe,
(UVL-100, hergestellt durch Riko Kagaku Sangyo, Japan)
um den Initiator zu zersetzen, so daß die
polymerisierbare Fettsäure polymerisiert wurde. Nach 12 Stunden
betrug die Polymerisationsrate 50% (sie wurde mittels
eines Shimadzu UV-2000 Spektralphotometers anhand der im
Zeitablauf eintretenden Veränderung der Absorption eines
255 nm Absorptionsbandes aufgrund von Dien-Radikalen
bestimmt). Die Polymerlösung wurde nach dem Verfahren
der Gel-Durchlässigkeits-Chromatographie mittels eines
Sepharose C1-4B (Medium : 5 mM Tris-Puffer (pH-Wert 7,4,
mit 0,9 Gew.-% Natriumchlorid)) behandelt, um
Verbindungen von niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, wodurch
die gewünschte wässrige Dispersion, die ein
makromolekulares, endoplasmatisches Retikulum enthielt, gewonnen
wurde. Die Partikelgröße des Retikulums wurde durch
Messung der Lichtstreuung unter Verwendung eines Coulter
N4D (Coulter Electronics Co.) gemessen und betrug
ungefähr 30 nm. Die Stabilität des makromolekularen,
endoplasmatischen Retikulums wurde durch Hinzufügung eines
oberflächenwirksamen Mittels (Triton X-100) mit dem
nichtpolymerisierten endoplasmatischen Retikulum
verglichen. Das nicht polymerisierte endoplasmatische
Retikulum wurde durch Hinzufügung des oberflächenaktiven
Mittels (Triton X-100) von 3 mM gründlich zerstört,
wohingegen das makromolekulare, endoplasmatische
Retikulum durch das oberflächenaktive Mittel (Triton X-100)
von 12 mM nicht zerstört wurde und stabil blieb.
Beispiel 2
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0,782 g (1,0 mmol) eines 1,2-bis(octadeca-trans, 2-
trans, 4-Dienol)-Sn-Glycerin-3-Phosphocholin (eine
Verbindung mit mit n=12 in der Formel (I)), 0,080 g (0,28
mmol) Octadeca-trans, 2-trans, 4-Diensäure (eine
Verbindung mit n=12 in der Formel (III)) und 0,386 g (1,0
mmol) Cholesterin wurden in 30 ml Benzol aufgelöst und
die erhaltene Lösung wurde gefriergetrocknet. Dem
erhaltenen Pulver wurden 20 ml eines 5 mM Tris-Puffers (pH-
Wert 7,4 mit 0,9 Gew.-% Natriumchlorid) zugefügt und es
wurde die Mischung mittels eines Voltex-Mischers bei
Raumtemperatur (20º C bis 25º C) während 10 Minuten in
einer Stickstoffatmosphäre behandelt, um eine Lösung
eines vielschichtigen endoplasmatischen Retikulums zu
gewinnen. Anschließend wurde die Lösung durch poröse
Membranen aus Polykarbonat geführt (Lochgröße 1,0 um,
0,6 um, 0,4 um, 0,2 um) und zwar mittels eines Extruders
(Lipex Biomembranes Inc) um eine wässrige Dispersion zu
erhalten, welche das endoplasmatische Retikulum mit
einer Korngröße von 180 nm enthält. 10 ml der Dispersion
wurden in ein Glasgefäß aufgegeben. Nachdem die
Atmosphäre durch Stickstoff ersetzt worden war, wurde das
Gefäß versiegelt. Nach Kühlung des Gefäßes auf 5º C
wurden 0,07 ml einer wässrigen Lösung mit 5 Gew.-%
Natriumhydrogensulfit und 0,17 ml von 5 Gew.-%
Kaliumpersulfat zugegeben. Die Mischung reagierte während 6
Stunden (Polymerisationsrate 43%) wobei eine wässrige
Dispersion erhalten wurde, welche ein makromolekulares,
endoplasmatisches Retikulum enthielt. Die Dispersion
wurde mit einem für Gele durchlässigen Chromatographen
Sepharose CL-4B (Medium: 5 mM Tris Puffer (pH-Wert 7,4
mit 0,9 Gew.-% Natriumchlorid)) behandelt, um
Verbindungen eines niedrigen Molekulargewichts zu entfernen,
wodurch die gewünschte wässrige Dispersion gewonnen
wurde, welche das makromolekulare, endoplasmatische
Retikulum enthielt (Partikelgröße 180 nm).
Beispiel 3
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1,173 g (1,50 mmol) von 1,3-bis(octadeca-trans. 2-trans,
4-Dienoyl)-rac-Glycerin-2-Phosphocholin (eine Verbindung
mit n=12 in der Formel (II)), 0,180 g (0,64
mmol)Octadeca-trans, 2-trans, 4-Diensäure (eine Verbindung mit n=12
in der Formel (III)) und 0,579 g (1,50 mmol) Cholesterin
wurden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1
behandelt, um ein makromolekulares, endoplasmatisches
Retikulum zu erhalten (Korngröße 35 nm).
Beispiel 4
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2,346 g (3,0 mmol) 1,2-bis(octadeca-trans, 2-trans, 4-
Dienoyl)-Sn-Glycerin-3-Phosphocholin (eine Verbindung mit
n=12 in der Formel (I)), 0,240 g (0,85 mmol)
Octadecatrans, 2-trans, 4-Diensäure (eine Verbindung mit n=12 in
der Formel (III)) und 1,158 g (3,0 mmol) Cholesterin
wurden in 40 ml Benzol aufgelöst und die Lösung wurde
anschließend gefriergetrocknet. Dem erhaltenen Pulver
wurden 25 ml eines 5 mM Tris Puffers (pH-Wert 7,4 mit
0,9 Gew.-% Natriumchlorid) zugegeben und es wurde die
Mischung mit Ultraschallwellen behandelt (60 W, 20
Minuten) und zwar unter Wasserkühlung in einer
Stickstoffatmosphäre. Es wurde eine wässrige, eine einzelne Schicht
aufweisendes endoplasmatisches Retikulum enthaltende
Lösung gewonnen. 20 ml der Lösung wurden 40 ml einer
wässrigen Lösung von 35 Gew.-% menschlichem Hämoglobin
zugefügt und es wurde diese gefroren (-78º C) und
anschließend zweimal (bei Raumtemperatur) geschmolzen. Die
Lösung wurde durch poröse Membrane aus Polykarbonat
geführt (Lochgröße 8 um, 5 um, 3 um, 2 um, 1 um, 0,6 um
und dergleichen). Die Lösung wurde mittels eines für
Gele durchlässigen Chromatographen Sepharose CL-4B
behandelt (Medium: 5 mM Tris Puffer (pH-Wert 7,4 mit 0,9
Gew.-% Natriumchlorid)) um nicht eingeschlossenes
Hämoglobin unter einer Stickstoffatmosphäre zu entfernen,
wodurch ein endoplasmatisches, hämoglobinhaltiges
Retikulum gewonnen wurde, (Partikelgröße 0,5 um). 10 ml
dieser das endoplasmatische Retikulum enthaltenden
Lösung wurden in ein Gefäß aus Quarzglas aufgegeben.
Nachdem die Atmosphäre durch Stickstoff ersetzt worden
war, wurde das Gefäß versiegelt und auf 8º C abgekühlt.
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Der Lösung wurden 0,3 ml einer wässrigen Lösung von 50 Mm
Azobis (2-Amidinopropan)Dihydrochlrid als Initiator
einer fotosensibilisierten Polymerisation zugegeben. Die
Lösung wurde mit sichtbarer Strahlung, von der
Wellenlängen unterhalb von 360 nm mittels eines Filters
entfernt wurden, bestrahlt, und zwar mittels einer
Quecksilberhochdrucklampe (UVL-100, hergestellt durch Riko
Kagaku Sangyo, Japan), um die polymerisierbaren Lipide
zu polymerisieren. Nach 10 Stunden betrug die
Polymerisationsrate 26% (sie wurde durch die Variation der
Absorption bei 255 nm im Zeitablauf bestimmt). Die
Polymerlösung wurde nach dem Verfahren der Gel-
Durchlässigkeits-Chromatographie mittels eines Sepharose
CL-4B behandelt, Medium: 5 mM Tris Puffer (pH-Wert 7,4,
0,9 Gew.-% Natriumchlorid) behandelt, um Verbindungen zu
entfernen, die ein niedriges Molekulargewicht aufweisen,
wodurch die gewünschte wässrige Dispersion, welche das
makromolekulare, endoplasmatische Retikulum enthielt,
gewonnen wurde (Partikelgröße 0,5 um). Die Wirksamkeit
zum Einschließen von Hämoglobin (das Verhältnis der
Menge an Hämoglobin, welche in dem endoplasmatischen
Retikulum eingeschlossen ist zu der Menge an
Roh-Hämoglobin (%)) betrug 15%. Es wurde keine Denaturierung des
Hämoglobins beobachtet, welches anhand des sichtbaren
Absorptionsspektrums beurteilt wurde. Die Stabilität des
makromolekularen, endoplasmatischen Retikulums wurde mit
dem nichtpolymerisierten endoplasmatischen Retikulum
durch Hinzufügung eines oberflächenaktiven Mittels
(Triton X-100) verglichen. Das nichtpolymerisierte
endoplasmatische Retikulum wurde durch die Hinzufügung
des oberflächenaktiven Mittels (Triton X-100) von 3 mM
gründlich zerstört, wohingegen das makromolekulare
endoplasmatische Retikulum durch die Hinzufügung des
oberflächenaktiven Mittels (Triton X-100) von 10 mM
nicht zerstört wurde und stabil blieb. Der Verlust an
Hämoglobin nach einer Lagerung bei 4º C und bei 37º C
während sechs Tagen betrug weniger als 2%.
Beispiel 5
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1,845 g (2,36 mmol) 1,2-bis(octadeca-trans, 2-trans, 4-
Dienoyl)-Sn-Glycerin-3-Phophocholin (eine Verbindung mit
n=12 in der Formel (I)), 0,135 g (0,48 mmol)
Octadecatrans, 2-trans, 4-Diensäure (eine Verbindung mit n=12 in
der Formel (III)) und 0,729 g (1,89 mmol) Cholesterin
wurden in 30 ml Benzol aufgelöst und die erhaltene
Lösung gefriergetrocknet. Dem erhaltenen Pulver wurde
eine wässrige Lösung von 50 ml mit 35% menschlichem
Hämoglobin zugefügt, wobei diese Mischung mit einem
Voltex-Mischer bei Raumtemperatur (20º C bis 25º C)
während zehn Minuten unter einer Stickstoffatmosphäre
behandelt wurde, um eine Lösung eines vielschichtigen
endoplasmatischen Retikulums zu erhalten. Anschließend
wurde die Lösung durch eine poröse Membran aus
Polykarbonat (Lochgröße: 8 um, 5 um, 3 um, 2 um, 1 um, 0,6 um
usw.) geführt, um nicht eingeschlossenes Hämoglobin zu
entfernen, so daß eine wässrige Lösung erhalten wurde,
welche ein endoplasmatisches Retikulum enthielt. 20 ml
dieser Dispersion wurden einem Glasgefäß aufgegeben.
Nachdem die Antmosphäre durch Stickstoff ersetzt worden
war, wurde das Gefäß versiegelt. Nachdem das Gefäß auf
5º C abgekühlt war, wurden 0,05 ml einer wässrigen
Lösung aus 5 Gew.-% Natriumhydrogensulfid und 0,12 ml
einer wässrigen Lösung von 5 Gew.-% Kaliumpersulfat
zugefügt. Die Mischung wurde während vier Stunden
reagiert (Ergiebigkeit der Polymerisation 30%) um eine
wässrige Dispersion zu erhalten, welche ein
makromolekulares, endoplasmatisches Retikulum enthielt. Die
Dispersion wurde mittels einer Gelfiltersäule behandelt
(Füllstoff: Sepharose CL-4B, Medium: 5 mM Tris Puffer (pH-Wert
7,4 mit 0,9 Gew.-% Natriumchlorid)) um Verbindungen zu
entfernen, die ein niedriges Molekulargewicht haben,
wodurch die gewünschte wässrige Dispersion erhalten
wurde, welche das makromolekulare, endoplasmatische
Retikulum enthielt (Partikelgröße 0,4 um). Die
Wirksamkeit zum Einschließen von Hämoglobin (das Verhältnis der
Menge an in dem endoplasmatischen Retikulum
eingeschlossenen Hämoglobin zu der Menge an Rohhämoglobin (%))
betrug 29%. Mittels einer Messung im sichtbaren
Absorptionsspektrum wurde keine Denaturierung des Hämoglobins
beobachtet. Die Stabilität des makromolekularen,
endoplasmatischen Retikulums wurde mit einem nicht
polymerisierten endoplasmatischen Retikulum unter Hinzufügung
eines oberflächenaktiven Mittels (Triton X-100)
verglichen. Das nicht polymerisierte endoplasmatische
Retikulum wurde durch Hinzufügung des oberflächenaktiven
Mittels von 3 mM (Triton X-100) gründlich zerstört,
wohingegen das makromolekulare endplasmatische Retikulum
durch Hinzufügung eines oberflächenaktiven Mittels
(Triton X-100) von 10 mM nicht zerstört wurde und stabil
blieb. Der Verlust an Hämoglobin nach Lagerung des
makromolekularen endoplasmatischen Retikulums bei 4º C
und 37º C während sechs Tagen betrug weniger als 2%.
Beispiel 6
-
1.880 g (2,40 mmol) 1,3-bis(octadeca-trans, 2-trans, 4-
Dienoyl-rac-Glycerin-2-Phosphocholin, (eine Verbindung mit
n=12 in der Formel (II)), 0,192 g (0,69 mmol) Octadeca-
trans, 2-trans, 4-Diensäure (eine Verbindung mit n=12 in
der Formel (III)) und 0,794 g (2,06 mmol) Cholesterin
wurden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 5
behandelt, um ein makromolekulares endoplasmatisches
Retikulum zu erhalten (Partikelgröße 0,6 um). Die
Wirksamkeit für die Einschließung von Hämoglobin betrug 20%.
Beispiel 7
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In eine 10 ml Erlenmeyer Flasche wurden 300 mg einer
Lipidmischung (1,2-bis octadeca-trans, 2-trans, 4-
Dienoyl)Glycerin-3-Phosphocholin / Cholesterin /
octadeca-2,4-Diensäure, Molverhältnis 7:7:2), welche durch
Gefriertrocknung in Benzol gewonnen wurde, 6 ml einer
wässrigen Lösung eines gereinigten Hämoglobins (17 g/dl,
Methämoglobingehalt betrug 2,6%, Kohlenstoffmonoxyd
wurde während drei Minuten geblasen (die Erzeugung eines
Kohlenstoffmonoxydkomplexes wurde mittels eines
charakteristischen Absorptionsbandes (λmax : 419 nm, 439 nm
und 569 nm) eines sichtbaren Absorptionsspektrums)
festgestellt), welche durch Auflösung äquimolekularer
Mengen an Hämoglobin und Inosit-Hexaphosphat und 5 mM
NADH erhalten wurde, und eine kleine Menge an Glasperlen
aufgegeben und während 15 Minuten bei 40 C hydratisiert.
Anschließend wurde das Hydrat während 15 Minuten mit
einem Voltex-Mischer behandelt. Die Lösung wurde mit
Membranen (Extrudern) aus Polykarbonat behandelt, die
Lochdurchmesser in der Größenordnung von 8 um, 5 um, 3
um, 2 um, 1 um, 0,6 um und 0,4 um aufwiesen. Eine
Fraktion eines endoplasmatischen, Hämoglobin einschließenden
Retikulums und eine Fraktion freien Hämoglobins wurden
aus einer 5 ml Probe getrennt, welche durch eine 0,4 um
Membran mit einer Sepharose CL-4B Säule (hergestellt
durch Pharmacia Chemicals, Schweden) geführt wurde,
wobei ein HCl-Tris Puffer benutzt wurde (5 mM, pH-Wert
7,4, Größe der Säule: Radius 3 cm, Höhe 5 cm). Die
Wirksamkeit des in dem endoplasmatischen Retikulum
eingekapselten Hämoglobins betrug 29%, das
Gewichtsverhältnis von Hämoglobin zu den Lipiden betrug 1,5 mg/mg,
die durchschnittliche Partikelgröße betrug 309,3 nm ±
71,5 nm und der Methämoglobingehalt betrug 3%.
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4 ml einer Lösung dieses Hämoglobin enthaltenden
endoplasmatischen Retikulums wurden in eine braune, 5 ml-
Ampulle eingefüllt und es wurde die Ampulle mit einem
Gummipfropfen versiegelt. In die Lösung wurde 20 Minuten
Argon eingeblasen und drei Minuten Kohlenstoffmonoxyd
bei Raumtemperatur. Die Gammastrahlungs-Polymerisation
des endoplasmatischen Retikulums in der Ampulle wurde in
einem Eis-Dewargefäß durchgeführt. Die Menge an
Gammastrahlung betrug 0,73 Mrad. Der Fortschritt der
Polymerisationsreaktion wurde durch Bestimmung der Abnahme der
auf Dien-Radikale zurückführbaren Absorption (244 nm bis
255 nm) im ultravioletten Absorptionsspektrum bestimmt.
Die Ergiebigkeit der Polymerisation betrug 85%.
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Die, das polymerisierte endoplasmatische Retikulum
enthaltende Lösung wurde in einem Eiswasserbad gekühlt
und einem weißen Licht mit 60 W während einer Stunde
ausgesetzt, wobei Sauerstoffgas durch die Lösung
hindurchgeblasen wurde, um einen entsprechenden
Sauerstoffkomplex herzustellen (Oxyhämoglobin; λmax :415 nm, 541
nm und 576 nm). Die Entfernung von Kohlenstoffmonoxyd
wurde durch Bestimmung eines sichtbaren
Absorptionsspektrums bestätigt. Die durchschnittliche Partikelgröße
nach der Polymerisation betrug 294,3 nm ± 59,3 nm,
welche praktisch dem Wert vor der Polymerisation
entsprach.
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Die Abhängigkeit des Sauerstoffpartialdruckes auf dem
Hämoglobin wurde durch ein sichtbares
Absorptionsspektrum gemessen und es wurde die
Sauerstoffdissoziationskurve mittels eines hemox analyzer (TCS Medical Product
Company, USA) in einem 5 mM Tris Puffer (pH-Wert 7,4)
bei 37º C nach einer herkömmlichen Methode gemessen. Im
Ergebnis betrug die Sauerstoffaffinität (P&sub5;&sub0; :
erforderlicher Sauerstoffpartialdruck zur Sauerstoffanreicherung
des Hämoglobins auf 50 %) des in dem polymerisierten
endoplasmatischen Retikulums eingeschlossenen
Hämoglobins 40 mmHg, wobei der Hill Koeffizient 1,65 betrug und
wobei die Wirksamkeit des Sauerstofftransports zwischen
den Lungen und dem peripheren Gewebe 38% betrug. Es
wurde weiterhin festgestellt, daß das genannte
Desoxyhämoglobin rasch an Sauerstoff gebunden wurde (die erneute
Bindung des Sauerstoffs war in 10 msec. beendet), und
zwar in einem 5 mM Tris Puffer (pH-Wert 7,4) bei 37º C
und bei einem Sauerstoffpartialdruck von 149 mmHg und
zwar, mittels Messung der durch Laserblitze ausgelösten
Photolyse (unter Verwendung eines durch Unisoku Company,
Japan hergestellten Apparates des Typs USP-500) nach
einem herkömmlichen Verfahren.
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Hieraus folgt, daß das Hämoglobin, welches in dem, gemäß
den vorangegangenen Ausführungsbeispielen
synthetisierten, polymerisierten, endoplasmatischen Retikulum
eingeschlossen ist, eine Tragfähigkeit für Sauerstoff
aufweist, die derjenigen des Hämoglobins der roten
Blutzellen entspricht.
Vergleichsbeispiel 1
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Die Auswirkungen der Arten von Fettsäuren auf die
Hämoglobinaufnahmefähigkeit wurde anhand des Beispiels 5
untersucht. (Hierbei wurde ein nichtpolymerisiertes
endoplasmatisches Retikulum vor der
Polymerisationsreaktion vorbereitet und untersucht).
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Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle
wiedergegeben. Bei einem Vergleich der polymerisierbaren Fettsäure
(0ctadeca-Diensäure), welche als eine, eine negative
Ladung tragende Komponente mit anderen
nichtpolymerisierbaren Fettsäuren benutzt wurde, wurde festgestellt,
daß erstere eine höhere Hämoglobinaufnahmefähigkeit und
ein höheres Verhältnis Hämoglobin (Hb)/Lipid als die
letzteren aufweist.
Tabelle
Fettsäure
Anzahl Kohlenstoffatome
Bindungszahl
Hb-Aufnahmefähigkeit
Hb/Lipid
Myristinsäure
Palmitinsäure
Stearinsäure
Ölsäure
Linolsäure
Octadeca-Diensäure (ODA) 18 2(trans)
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Das Molverhältnis polymerisierbares
Phospholipid/Cholesterin/Fettsäuren beträgt 7/7/2. Die
Hämoglobinkonzentration beträgt 17 Gew.-% und die Lipidkonzentration 5
20 Gew.-%.
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Wenn die Fettsäure nicht benutzt wurde, war die
Hämoglobinaufnahmefähigkeit gering (weniger als 10%).
Dementsprechend ist die Zugabe einer Fettsäure als
Membrankomponente offensichtlich wirksam.
Bezugsbeispiel 2
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Eine Lösung eines, Hämoglobin einschließenden
polymerisierten endoplasmatischen Retikulums, welche nach dem
gleichen Verfahren wie in Beispiel 7 gewonnen wurde,
wurde durch Ultrafiltration konzentriert (es wurde eine
Ultrafiltrationsmembran benutzt, über welche
Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 20.000 oder weniger
entfernt werden konnten), um eine konzentrierte Lösung
zu erhalten, welche eine Hämoglobinkonzentration von 10
g/dl aufwies. Es wurden die physikalischen Eigenschaften
dieser Lösung gemessen. Die Ergebnisse sind in der unten
folgenden Tabelle wiedergegeben. Die Eigenschaften der
Lösung des gemäß den erfindungsgemäßen Beispielen
erhaltenen, hömoglobinhaltigen endoplasmatischen Retikulums
sind offensichtlich gleichwertig denjenigen von
menschlichem Blut.
Tabelle
Meßergebnisse der Eigenschaften
pH-Wert
Rotationsviskosität
Osmotischer Druck
osmotischer osmotischer Druck
-
1) Werte in Klammern sind Scherwerte (s&supmin;¹).
-
2) Werte in Klammern sind durch Hinzufügung von 3 Gew.-%
Dextran (Molekulargewicht 3,9 x 10&sup4;) zu der das
endoplasmatische Retikulum enthaltenden Lösung
korrigiert.
Vergleichsbeipiel 3
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Die Stabilität eines, Hämoglobin einschließenden
polymerisierten endoplasmatischen Retikulums, welches gemäß
Beispiel 7 gewonnen wurde, wurde untersucht.
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Nachdem die Lösung an einer dunklen Stelle bei 40º C
während drei Monaten gelagert wurde, hatte sich die
durchschnittliche Partikelgröße nicht verändert. Es
wurde weiterhin kein Verlust an Hämoglobin festgestellt
(Die Verlustmenge wurde mittels eines, für Gele
durchlässigen Chromatographen mit Sepharose CL-4B) bestimmt.
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Nach Einfrieren bei -80 º C wurde die Lösung bis auf
Raumtemperatur aufgetaut, wobei kein Hämoglobinverlust
aus dem endoplasmatischen Retikulum festgestellt wurde.
Keine Veränderung der Partikelgröße wurde festgestellt.
Im Falle des nichtpolymerisierten endoplasmatischen
Retikulums andererseits waren ungefähr 30% des
eingeschlossenen Hämoglobins ausgelaufen. Bei Hinzufügung
eines oberflächenaktiven Mittels (Triton X-100) mit
einem Anteil von 20 Gew.-% zu dem endoplasmatischen
Retikulum blieb das polymerisierte endoplasmatische
Retikulum stabil und es kam zu keinem Auslaufen von
Hämoglobin aus dem endoplasmatischen Retikulum.
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Im Ergebnis wurde festgestellt, daß das nach dem
gleichen Verfahren wie in Beispiel 7 synthetisierte
polymerisierte endoplasmatische Retikulum physikalisch stabil
war und während einer langen Zeitspanne aufbewahrt
werden konnte.
Vergleichsbeispiel 4
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Zur Bestimmung der Oberflächenladung des polymerisierten
endoplasmatischen, Hämoglobin einschließenden
Retikulums,
welches gemäß Beispiel 7 gewonnen wurde, wurde das
Zetapotential bestimmt (Meßgerät: Laser Zee model 501,
hergestellt durch Pen Kem Company). Das elektrische
Potential des endoplasmatischen Retikulums betrug -17,1
mV und entsprach praktisch demjenigen roter Blutzellen.