DE3326900A1

DE3326900A1 - Verfahren zur verlaengerung der retention von emulsionsteilchen im blutstrom

Info

Publication number: DE3326900A1
Application number: DE19833326900
Authority: DE
Inventors: Henry A. 19106 Philadelphia Pa. Sloviter
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1982-07-27
Filing date: 1983-07-26
Publication date: 1984-02-16
Also published as: GB2124079A; FR2531857B1; SE8304144L; US4397870A; CA1201655A; GB2124079B; FR2531857A1; SE8304144D0; GB8318541D0

Description

Verfahren zur Verlängerung der Retention von Emulsionsteilchen

im Blutstrom

Natürliches, vollständiges Blut steht nur knapp zur Verfügung, und die Knappheit wird vermutlich noch zunehmen. Neue Methoden zur verlängerten Konservierung von Blut im gefrorenen Zustand und Verbesserungen bei der Lagerung im flüssigen Zustand haben zu wirksameren Nutzung verfügbaren Bluts in manchen Gebieten geführt, aber der weltweite Bedarf an Blut für Transfusion geht noch weit über den Nachschub hinaus. Da es unwahrscheinlich ist, daß der Nachschub erheblich zunehmen wird, muß der Bedarf durch andere Substanzen als natürliches Blut oder dessen Derivate befriedigt werden. Ein künstliches Blut, das in unbegrenzten Mengen zur Verfügung steht und frei ist von infektiösen Mitteln und Antigenen, wäre ein äußerst wertvolles therapeutisches Mittel.

Emulsionen von Perfluorverbindungen scheinen nun als künstliches Blut erfolgreich zu sein. Künstliches Blut auf der Grundlage einer Emulsion von Perfluorchemikalien sind frei von infektiösen Mitteln und Antigenen (nachfolgend wird der Begriff Perfluorverbindung und Perfluorchemikalie wechselseitig austauschbar verwendet). . Die Blutgruppenbestimmung des Empfängers ist unnötig. Allerdings fehlen solchem künstlichem Blut Gerinnungsfaktoren, Blutplättchen, Immunglobuline und Antikörper.

Emulsionen von Perfluorchemikalien sind erfolgreich als Ersatz für rote Blutkörperchen beim Perfundieren isolierter tierischer Organe und bei der Sauerstoffversorgung der Gewebe intakter Tiere verwendet worden. In jüngerer Zeit wurde eine Emulsion von Perfluorchemikalien bei der Behandlung von Menschen angewandt.

Obgleich Perfluorverbindungen chemisch inert sind, können sie Blutplättchen und Blutgerinnungsfaktoren in nachteiliger Weise beeinflussen, was zu Thrombozytopenie (d.h. Abnahme der absoluten Zahl roter Blutplättchen) und Störungen der Blutgerinnung

führt. Es wurde gefunden, daß die Einflüsse auf Blutplättchen sehr wahrscheinlich auf ungewöhnlichen Oberflächeneigenschaften von Perfluorverbindungen beruhen, nämlich einer sehr niedrigen Oberflächenspannung. Dieser Effekt kann durch Überziehen der Perfluorverbindungsteilchen mit einer Substanz überwunden werden, die die Oberflächenaktivität maskiert.

Unter den früheren Patenten, die sich auf künstliche Blutzusammensetzungen beziehen, sind folgende zu nennen:

Die US-PS 4 133 874 ist auf wasserlösliches, Lipid-verkapseltes Haemoglobin gerichtet.

Die US-PS 3 958 014, 3 962 439, 4 105 798 und 4 252 827 beziehen sich auf emulgierte, Sauerstoff-transportierende Teilchen aus Perfluorverbindungen.

Früheres künstliches Blut hat beschränkte Dauer im Blutstrom. Innerhalb von 2 bis 4 Tagen nach der Transfusion emulgierter Perfluorverbindungsteilchen verschwinden faktisch alle Teilchen aus dem Kreislauf. Ferner wird bei Labortieren nach der Infusion häufig Thrombopenie beobachtet. Benötigt wird ein Verfahren zur Verlängerung der effektiven Lebensdauer der künstlichen Blutzusammensetzung im Kreislauf.

Ein wichtiges, die klinische Verwendung von Emulsionen von Perfluorverbindungen betreffendes Problem ist die Retention der Perfluorverbindung in den Geweben, nämlich der Leber und der Milz. Der Hauptweg der Beseitigung der Perfluorverbindung geht durch die Lungen. Eine Erhöhung der Zeit, für die das Material im Umlauf bleibt, führt zu erhöhter Beseitigung als ausgeatmetes Gas und somit zu einer Abnahme der Retention in Leber und Milz.

Die vorliegende Erfindung sorgt für die Verlängerung wirksamer Gehalte künstlichen Bluts im Kreislauf bis zu 14 Tagen oder mehr nach Infusion. Durch Aufrechterhaltung eines relativ hohen stetigen Gehalts der Überzugssubstanz im Blutplasma wird die Entfer-

nung des Überzugs von künstlichen Blutteilchen offenbar verlangsamt. Ein hoher, stetiger Gehalt an Überzugssubstanz im Blutplasma wird durch periodische Injektion von Überzugssubstanz nach Infusion des künstlichen Bluts aufrecht erhalten.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verlängerung der in vivo-Stabilität und Retention überzogener, wasserunlöslicher Teilchen im Blutstrom von Tieren, den Menschen eingeschlossen, umfassend eine oder mehrere Injektionen der gleichen Überzugssubstanz, die die wasserunlöslichen Teilchen überzieht.

Erfindungsgemäß kann die effektive Lebensdauer einer künstlichen Blutemulsion, insbesondere von Lecithin-überzogenen Perfluorverbindungen, im Blutkreislauf von Tieren, in die das künstliche Blut infundiert worden ist, verlängert werden. Erhöhte Retention von Perfluorverbindungen im Kreislauf führt auch zu verringerter Retention in Leber und Milz.

Überzogene Teilchen werden in den Blutstrom von Tieren, den Menschen eingeschlossen, eingeführt. Die Dauer der wirksamen Teilchengehalte im Blutstrom ist kurz aufgrund der offensichtlichen Entfernung des Überzugs und der Tatsache, daß die Teilchenoberflächen im Blutstrom freiliegen. Erfindungsgemäß erhält der Patient, der zuvor eine Infusion einer Emulsion überzogener Teilchen erhalten hat, ein- oder mehrmals eine Injektion mit Überzugs-¹ substanz, d.h. der gleichen Substanz, die den die infundierten Teilchen umgebenden Überzug bildet.

Die bemerkenswerteste Anwendung der Erfindung liegt in der Verlängerung der wirksamen Gehalte an künstlichem Blut im Kreislauf. Künstliche Blutzusammensetzungen umfassen Emulsionen von Perfluorchemikalien. Diese haben das Vermögen, Sauerstoff zu transportier ren. Aufgrund der negativen Einflüsse von Perfluorchemikalien auf Blutplättchen jedoch müssen sie überzogen sein. Wenn ein Lipid oder eine andere Überzugssubstanz verwendet wird, um einen Überzug um Perfluorchemikalienteilchen herum zu bilden, wird eine Re-

tention der Teilchen im Kreislauf erfindungsgemäß durch Injektion des Lipids oder der Überzugssubstanz alleine erreicht.

Die Erfindung wird an künstlichem Blut demonstriert, wobei die Überzugssubstanz auch als Emulgator für die Perfluorchemikalienteilchen wirkt; dadurch wird ein separater Emulgator überflüssig. Künstliche Blutzusammensetzungen können auch emulgierte Perfluorchemikalienteilchen, überzogen mit einer anderen Substanz als der Emulgator, umfassen. Die Retention dieser künstlichen Blutzusammensetzungen im Kreislauf wird durch Injektion der Überzugssubstanz erreicht.

Der speziell verwendete Emulgator muß nicht-toxisch sein. Hochmolekulare, nicht-ionische Tenside sind verwendet worden, darunter verschiedene Polyoxyethylene, Polyoxypropylene und Copolymere hiervon, die im Handel unter dem Warenzeichen "PLURONIC" der BASF-Wyandotte Corp. erhältlich sind. Lipide, am ehesten Lecithin aus Eigelb-Phospholipid, sind im allgemeinen bevorzugt. Lecithin ist auch als Sojabohnen-Phospholipid verfügbar, aber wegen der Notwendigkeit der Reinigung von Sojabohnen-Phospholipid ist die Eidotter-Quelle bevorzugt.

Lecithin ist als Überzugssubstanz und Emulgator bevorzugt, da es vom Infusionsempfänger nicht abgestoßen wird. Der Lecithinüberzug erscheint dem Kreislauf als Membran eines natürlichen Erythrozyten. Lecithin ist nicht-toxisch und beeinflußt die Blutgerinnung nicht.

Künstliche Blutzusammensetzungen sind in physiologisch annehmbaren Medien enthalten. Physiologisch annehmbare Medien umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, isotonische Lösungen, wie Tyrode-Lösung, Ringer-Lösung, Lactat-haltige Ringer-Lösung oder Glucose-haltige Ringer-Lösung. Manche Zusammensetzungen enthalten zusätzlich ein Emulgatorhilfsmittel, wie Spuren von Fettsäure.

Die erfindungsgemäßen Injektionen können nach jedem Injektions-

weg verabreicht werden. Bei kleinen Labortieren, wie Ratten, ist der intraperitoneale Weg bevorzugt. Beim Menschen wird der intramuskuläre Weg bevorzugt.

Die zu injizierende Überzugssubstanz kann in einem der obigen physiologisch annehmbaren Medien suspendiert sein. Tyrode-Lösung ist bevorzugt. Die Injektion sollte eine Konzentration an Überzugssubstanz enthalten, die zum gewünschten Wert der Emulsionsretention im Kreislauf führt.

Die Erfindung wird vorzugsweise nach Infusion einer künstlichen Blutemulsion mit Perfluorchemikalienteilchen, überzogen mit anhaftendem Lecithin, in einer Menge von 50-70 pMol/ml der Perfluorchemikalie durchgeführt. Solche Emulsion enthält etwa 15-40 % (V/V) Perfluorverbindung, entsprechend etwa 30-75 % (G/V), und etwa 7-9 % (G/V) Lecithin.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verlängerung der Retention emulgierter Teilchen im Blutstrom wird, wenngleich auf einen großen Bereich von Emulsionen anwendbar, ohne Beschränkung auf eine künstliche Blutzusammensetzung mit einer Lecithinemulsion von Perfluortripropylamin demonstriert. Weitere geeignete Perfluorverbindungen sind beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, Perfluordecalin, Perfluormethyldecalin und Perfluortributylamin. Emulsionen dieses Typs sind in der anhängigen USSN 4 02 451 gleichen Datums wie die vorliegende Anmeldung und mit dem Titel "Perfluorochemical Emulsion Artificial Blood" beschrieben.

Herstellung einer Lecithin-Emulsion von Perfluortripropylamin

Zu 7 ml kalter Tyrode-Lösung (pH 7,4) in einer Rosette-Zelle wurden 960 mg gereinigtes Lecithin (aus Eidotter) gegeben. Das Gemisch wurde 15s mit 110 W beschallt. Die Beschallung wurde einmal nach einem Intervall von 1 min wiederholt. Dieses dispergierte Lecithin in einer Rosette-Zelle bei 0 ⁰C wurde mit 4 ml Perfluortripropylamin versetzt und das Gemisch wie zuvor für 8 Peri-

— O ~

oden von 15s mit einem Intervall von 1 min nach jeder Beschallung beschallt. Die anfallende milchig-weiße Emulsion wurde 60 min bei 4 C und 10Og zentrifugiert, um irgendwelche großen Teilchen zu sedimentieren. Die unteren 5 % der Emulsion wurden verworfen. Die Emulsion enthielt 35 bis 40 % (V/V) di'spergierte Perfluorverbindung und ihr pH lag zwischen 7,35 und 7,40. Die emulgierten Perfluorteilchen waren etwa 0,1 μπι im Durchmesser und enthielten 50-70 uMol Lecithin pro ml Perfluorverbindung.

Der Lecithingehalt der Perfluorteilchen wurde gemessen, indem die sedimentierten Teilchen einer Teilmenge der Emulsion mit Tyrode-Lösung zweimal gewaschen, das Lecithin mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol extrahiert und der Phosphorgehalt des Extrakts bestimmt wurde. Die Menge an vorhandenem Lecithin, gemessen in Mikromol, wird durch Dividieren des Phosphorgehalts in pg durch 31 (dem Atomgewicht des Phosphors) berechnet. Diese Berechnung liefert die μΜοΙ Lecithin, da ein Molekül Lecithin ein Phosphoratom enthält.

Die obige Perfluortripropylamin-Emulsion wurde wie folgt in Ratten infundiert.

Infusion von Perfluortripropylamin-Emulsion in Ratten

Vier Gruppen männlicher Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g), mit Pentobarbital (30 mg/kg) anästhesiert, erhielten 8-10 ml Emulsion, pro Ratte durch eine Pumpe in die Femoralvene zu 0,2 ml/min infundiert. Ein etwa gleiches Volumen Blut wurde während der Infusion abgezogen. Gruppe 1 (Tabelle I) erhielt ein Emulsionspräparat "ohne überschüssiges Lecithin", das sedimentiert, zum Entfernen überschüssigen Lecithins gewaschen und erneut in 8%igem Rinderserum-Albumin in Tyrode-Lösung suspendiert wurde. Die Gruppen 2-4 (Tabelle I) erhielten ein "Überschuß-Lecithin"-Emulsions-Präparat mit etwa 0,5 g Lecithin in der wässrigen Phase der Emulsion.

Proben wurden in Abständen nach der Infusion zur Messung von

Hämatokrit, Konzentration an Perfluortripropylamin und Plättchenzahl genommen. Die Konzentration an Perfluortripropylamin im Blut von Ratten nach Beendigung der Infusion lag im Bereich von 19-22 % (V/V). Bei der Gruppe 4, als "hoch an F-Crit" bezeichnet, lagen diese Werte im Bereich von 24-28 % (V/V). In Analogie zum Ausdruck Hämatokrit wurde der Begriff "F-Crit" zur Bezeichnung des Prozentsatzes (V/V) an emulgierter Perfluorverbindung im umlaufenden Blut verwendet.

Einfluß der Lecithin-Injektion auf die Retention von mit Lecithin emulgiertem Perfluortripropylamin im Kreislauf

Die Gruppen 1 und 2 erhielten eine tägliche intraperitoneale Injektion von Tyrode-Lösung. Die Gruppe 3 erhielt eine tägliche Injektion von 1 g Lecithin, Schall-dispergiert in Tyrode-Lösung. Die Ratten der Gruppe 4 waren die gleichen wie die bei Gruppe 3, mit der Ausnahme, daß die Anfangskonzentration an emulgiertem Perfluortripropylamin im Blut höher war. Blutproben wurden jeder Ratte jeden Tag unmittelbar vor der Injektion des Lecithins zur Messung der Menge an Perfluortripropylamin im Kreislauf entnommen. Das Vorliegen einer relativ hohen Konzentration an Lecithin im Blutplasma wurde dünnschichtchromatographisch bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt. Alle Werte in der Tabelle I sind Mittel-SEM. Die Werte in Klammern in der Tabelle I unter F-Crit-Werten für 48 und 96 h stellen den Anteil dar, den der jeweilige F-Crit-Wert zu dem F-Crit-Wert nach 10min seit Infusion beiträgt.

Die Ergebnisse in Tabelle I zeigen, daß tägliche Injektionen von Lecithin starke Zunahmen der Menge an im Kreislauf gehaltenem emulgiertem Perfluortripropylamin verursachten, z.B. 67 % nach 96 h im Vergleich zu 3 % für Ratten, die keine Lecithin-Injektionen erhielten. Die Dauer der Retention emulgierten Perfluortripropylamins im Kreislauf stieg von 4 Tagen für Ratten ohne Injektion von Lecithin (Gruppen 1 und 2) auf 10 Tage für Ratten

mit Lecithin-Injektion (Gruppe 3) und auf 14 Tage für Ratten mit einer höheren Anfangskonzentration an injiziertem Perfluortripropylamin (Gruppe 4).

Bei allen vier Gruppen von Ratten war die Plättchenzahl nach Infusion von Perfluortripropylamin nicht wesentlich verschieden von der vor der Infusion erhaltenen Zahl (siehe Tabelle I). In Kontroll-Ratten, die keine Perfluortripropylamin-Infusion, aber tägliche Lecithin-Injektionen erhielten, ergaben sich keine wesentlichen Änderungen der Plättchenzahlen. Alle Ratten, die der vier Versuchsgruppen und der Kontrolle, blieben bei guter Gesundheit und waren normal aktiv. Das Plasma aller Ratten, die täglich Lecithin-Injektionen erhielten, war opaleszierend und chromatographisch positiv auf Lecithin 24 h nach Lecithin-Injektion.

So kann eine starke Steigerung der Retention von mit Lecithin überzogener, emulgierter Perfluorverbindung im Kreislauf durch Aufrechterhaltung einer hohen Lecithin-Konzentration im Plasma erzielt werden. Diese Ergebnisse stützen den Schluß, daß Lecithin-überzogene Teilchen von Perfluorverbindungen phagozytosiert werden, nachdem viel von dem oder das gesamte Lecithin entfernt ist.

Ohne tägliche Lecithin-Injektionen verschwinden Perfluorverbindungen aus dem Kreislauf in 3 - 4 Tagen. Bei diesen Ratten ist die Halbwertzeit der Perfluorverbindung in den Geweben viel länger als in Ratten mit injiziertem Lecithin. Es wurde berichtet, daß die Halbwertzeit von emulgiertem Perfluortripropylamin in Rattengeweben 60 Tage beträgt. Verlängerte Retention der Emulsion der Perfluorverbindung im Kreislauf führt zu gesteigerter Eliminierung von Perfluorverbindung in von den Lungen ausgeatmetem Gas. Die Retention in den Geweben, insbesondere Leber und Milz, wird dadurch herabgsetzt. Ratten mit täglichen Lecithin-Injektionen zeigten eine Perfluortripropylamin-Gewebe-Halbwertzeit von etwa 10 Tagen, verglichen mit 60 Tagen ohne Lecithin-Injektion.

Tabelle I Einfluß der Lecithin-Injektion auf die Retention
von mit Lecithin emulgiertem Perfluortripropylamin im Kreislauf von Ratten

Präparat Zahl F-Crit, Zeit seit Infusion der 10 min 48 h 96 h

Ratten -3 -1 Plättchenzahl x10 μΐ

Tage seit vor der

Infusion Infusion nach Infusion

bis F-Crit=O 10 min 48 h

96 h

Gruppe 1: q kein lecitinübersehuß

Gruppe 2:

Lecithinüberschuß

Gruppe 3: Lecithininjektion 1 g/Tag

20+0.5 (100%)	5+0.9 (25%)	0 (0%)
21+0.4 (100%)	12+0.4 (57%)	3+0.4 (14%)
21+0.3 (100%)	18+0.5 (86%)	14+0.4 (67%)

10

730+40 690+60 630+70 720+50

690+20 680+20 680+20 720+30

650+20 610+20 610+20 650+20

Gruppe 4: hoher F-Crit, lecithin-injektion 1g/Tag

26+0.5 21+0.3 19+1.0 (100%) (81%) (73%) 14

680+20 640+30 600+30 640+20

CD CD O O

Die Daten zeigen an, daß die Erfindung zur Sicherheit und Wirksamkeit künstlichen Blutes beiträgt. Verlängerte Retention der Perfluorverbindung im Kreislauf erhöht die Dauer des Transports und der Abgabe von Sauerstoff an die Gewebe. Herabgesetzte Retention der Perfluorverbindung in den Körpergeweben reduziert die Gefahr karzinogener oder anderer chronisch-toxischer Einwirkung auf die Gewebe.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verlängerung der Retention emulgierter Teilchen im Kreislauf durch Aufrechterhaltung eines hohen Plasma-Gehalts der Substanz, die das Teilchen überzieht, ist vermutlich auf jede Emulsion einer Perfluorverbindung anwendbar. Beispielsweise kann die Retention künstlichen Bluts oder von Sauerstoff-Transfer-Teilchen, emulgiert mit verschiedenen Tensiden, wie den PLURONIC-Tensiden, durch Injektionen des speziellen, auf den Teilchen verwendeten Tensidüberzugs verlängert werden. Ferner hat das erfindungsgemäße Verfahren vermutlich breitere Anwendung bei der Verlängerung der Retention im Kreislauf anderer Emulsionssysteme, nicht nur künstlicher Blutzusammensetzungen.

Die Erfindung kann in anderen speziellen Formen ihren Ausdruck finden, ohne vom Erfindungsgedanken oder wesentlichen Teilen von diesem abzuweichen, und daher sollte eher auf die Ansprüche als auf die vorstehende Beschreibung als die Erfindung umfassend Bezug genommen werden.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Verlängern der Stabilität und Retention von Material im Blutstrom von Tieren und Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen des Materials, überzogen mit einer Überzugssubstanz, in den Blutstrom zusammen mit wenigstens einer Injektion der Teilchen-Überzugssubstanz infundiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die infundierten Teilchen in einer Emulsion vorliegen, in der der Emulgator eine andere Substanz als die Teilchen-Überzugssubstanz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die infundierten Teilchen künstliches Blut umfassen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das künstliche Blut eine Emulsion ist, die eine Sauerstofftransportierende Perfluorverbindung, einen Emulgator, der die Perfluorverbindung überzieht, und ein physiologisch annehmbares Medium umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die künstliche Blutzusammensetzung zusätzlich einen Fettsäure-Emulgatorhilfsstoff enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Perfluorverbindung unter Perfluordecalin, Perfluormethyl-

decalin, Perfluortripropylamin und Perfluortributylamin ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator unter Lipid und hochmolekularen nicht-ionischen Tensiden ausgewählt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator ein Polyoxyethylen-Pqlyoxypropylen-Copolymer ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator ein Phospholipid ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator Lecithin ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der Perfluorverbindung in der infundierten Emulsion bis zu etwa 75 % (Gew./Vol.) ist.

12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Emulgators in der infundierten Emulsion etwa 7-9% (Gew./Vol.) ist.

13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das physiologisch annehmbare Medium isotonische Lösung ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die isotonische Lösung unter Tyrode-Lösung, Ringer-Lösung, lactathaltiger Ringer-Lösung und Glukose-haltiger Ringer-Lösung ausgewählt wird.