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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die in der Lage
sind, Restenose (manchmal auf dem Fachgebiet als „beschleunigte
Arteriosklerose" und „postangiosplastisere
Verengung" bezeichnet)
zu verhindern, inhibieren oder zu verringern.
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Stand der
Technik
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Die
folgenden Quellen werden als einschlägig für den Zweck des Verstehens
des Hintergrunds der vorliegenden Erfindung angesehen.
- 1.
Waller, B. F., Orr, C. M, VanTassel J., et al. Clin-Cardiol. 20(2):
153–60,
(1997)
- 2. Anderson, W. D, King, S. Br., Curr-Opin-Cardiol., 11(6):
583–90,
(1996)
- 3. Moorman, D. L., Kruyer, W. B., Jackson, W. G., Aviat-Space-Environ-Med. 67(10): 990–6, (1996).
- 4. Laurent S, Vanhoutte P, Cavero I, et al., Fundam. Clin. Pharmacol.,
10(3): 243–57,
(1996)
- 5. Walsh, K., Perlman, Semin-Interv-Cardiol., 1(3): 173–9, (1996).
- 6. Schwartz, R. S., Semin-Interv-Cardiol., 2(2): 83–8, (1997).
- 7. Allaire, E, Clowes, A. W. Ann. Thorac. Surg., 63: 582.591,
(1997)
- 8. Hamon. M., Bauters, C., McFadden, E. P, et al., Eur. Heart
J., 16: 33s–48s,
(1995)
- 9. Gottsauner-Wolf, M., Moliterno, D. J, Lincoff A. M., Topol,
E. J., Clin. Cardiol., 19: 347–356,
(1996)
- 10. Herrman, J. P. R., Hermans, W. R. M., Vos, J., Serruys,
P. W., Drugs, 46: 18–52,
(1993)
- 11. Leclerc, G., Voisine, P., Bouchard, M., Fleser, A., Martel,
R. Elsevier Science, 722–7224,
(1995)
- 12. Topol, E., The NY Academy of Sciences, 225–277, (1997).
- 13. Fleisch, H., in: Bisphosphonates in bone desease. Parthenon
Publishing Group Inc., pp. 184–186
(1997).
- 14. Mönkkönnen, J.,
Taskinen, M., Auriola, S., Urtti, J. Drug Target, 2: 299–308, (1994).
- 15. Kramsche, D. M., and Chan, C. T., Circ. Res., 42: 562–572, (1978).
- 16. Braunwald, E. Heart Desease in: A textbook of cardiovascular
medicine; 5th Ed., W. B. Saunders Company: Philadelphia,
(1997)
- 17. Gennaro Alfonso, R. Remington, in: The Science and Practice
of Pharmacy, Mack Publishing, Easton PA, 19th ed.,
(1995)
- 18. Mönkkönen, J.,
and Heath, T. D., Calcif. Tissue Int., 53: 139–145, (1993)
- 19. M. Donbrow in: Microencapsulation and Nanoparticles in Medicine
and Pharmacy, CRC Press, Boca Raton, FL, p.347
-
Die
obigen Quellen werden in dem unten folgenden Text durch Angabe ihrer
Nummer (wie in Klammern gezeigt) aus der obigen Liste angegeben.
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Hintergrund
der Erfindung
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Über die
letzte Dekade sind mechanische Mittel zum Erzielen einer Revaskularisierung
von verstopften arteriosklerotischen Gefäßen stark verbessert worden.
Perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA)-Verfahren schließen eine
Ballondilatation, Exzessionsatherectomie, Einführen von Endoluminalstents, Rotablation
und Laserablation ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine
Revaskularisierung induziert Thrombose und neointimale Hyperplasie,
welches wiederum eine Restenose in einem wesentlichen Abschnitt der
Koronararterien nach einer erfolgreichen Ballonangioplastie und
bei aortakoronaren Saphena-Bypass-Transplantationen und anderen
Koronartransplantationen hervorruft. Ferner ruft eine intimale Hyperplasie
Restenose in vielen oberflächlichen
Femoralangioplastien, Karotidendarterectomien und Bypässen der
femorodistalen Vene hervor. Die Einführung von endovaskulären Stents
hat zur Reduktion des Auftretens von Restenose beigetragen, wobei
dieses Problem immer noch bedeutsam bleibt(1–9).
Trotz intensiver Forschung hinsichtlich des Auftretens, des Zeitpunkts,
der Mechanismen und pharmakologischer Interventionen in Menschen
und in Tiermodellen existiert bis heute keine Therapie, die eine
koranare Restenose durchweg verhindert(10–12).
Zusammensetzungen und Verfahren zur Verminderung oder Vermeidung
von Restenose sind heute noch sehr erwünscht.
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Bisphosphonate
(BP) (früher
Disphosphonate genannt) sind Verbindungen, die durch zwei C-P-Bindungen
charakterisiert sind. Wenn die beiden Bindungen am selben Kohlenstoffatom
(P-C-P) lokalisiert sind, werden sie geminale Bisphosphonate genannt.
Die BPe sind Analoge des endogenen, anorganischen Pyrosphosphats,
das in der Regulierung der Knochenbildung und Resorption involviert
ist. Der Ausdruck Bisphosphonate wird allgemein für geminale
und nicht-geminale Bisphosphonate verwendet. Die BPe und Pyrophosphate
können
zusammen zeitweise polymere Ketten bilden. BPe wirken wegen ihrer
Affinität
für Knochenmineral
auf Knochen und sind potente Inhibitoren der Knochenresorption und
der ektopischen Klassifizierung. BPe oder Pyrophosphate wurden klinisch
hauptsächlich
als (a) antiosteolytische Agenzien in Patienten mit erhöhter Knochendistruktion
verwendet, insbesondere Paget Syndrom, Tumorknochenerkrankungen
und Osteoporose; (b) skeletale Marker für diagnostische Zwecke (verknüpft mit 99mTc); (c) Inhibitoren der Calzifizierung in
Patienten mit ektopischer Calcifizierung und Ossifizierung und (d)
Antizahnsteinagenzien zugesetzt zu Zahnpasta(13).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein
BP (insgesamt hierin: „aktiver
Inhaltsstoff") zur
Behandlung oder Vermeidung von Gefäß verwendet. Der Ausdruck Bisphosphonat
(BP), wie er hierin verwendet wird, bezeichnet beides, geminale
und nicht-geminale Biphosphonate. Der Ausdruck „aktiver Inhaltsstoff" umfaßt in seinem
Rahmen auch polymere Ketten der BPe, insbesondere die aus bis zu
40 BP-Monomeren bestehenden Ketten. Bevorzugte aktive Inhaltsstoffe
sind Verbindungen der folgenden Formel (I):
worin R eine CR
1R
2-Gruppe darstellt;
R
1 H
ist, OH oder eine Halogengruppe; und
R
2 ein
Halogen ist, lineares oder verzweigtes C
1-C
10 Alkyl oder C
2-C
10 Alkenyl, optional substituiert mit Heteroaryl
oder Heterocyclyl, C
1-C
10 Alkylamino
oder C
3-C
8 Cykloalkylamino,
wobei die Aminofunktion eine primäre, sekundäre oder tertiäre sein
kann; -NHY, worin Y Wasserstoff ist, C
3-C
8 Cykloalkyl, Aryl oder Heteroaryl; oder R
2 -SZ ist, worin Z chlorsubstituiertes Phenyl
oder Pyrridinyl ist.
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Die
vorliegende Erfindung gibt somit die Verwendung des aktiven Inhaltsstoffs
an, eines Komplexen des aktiven Inhaltsstoffs oder eines pharmazeutisch
verträglichen
Salzes oder Esters desselben, der in einer mikronisierten, partikulären Form
mit einem Durchmesser innerhalb des Bereichs von 0,01 bis 10 μm vorliegt, für die Herstellung
eines Medikaments zur Vermeidung oder Behandlung von vaskulärer Restenose.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung
für die
Vermeidung oder Behandlung von Restenose bereit, welche als aktiven
Inhaltsstoff eine wirksame Menge des genannten aktiven Inhaltsstoffs
umfaßt,
einer pharmazeutisch verträglichen
freien Säure,
eines Komplexes oder eines Salzes desselben, welcher in einer mikronisierten,
partikulären
Form mit einem Durchmesser in den Bereich von 0,01 bis 10 μm vorliegt,
optional zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Ein besonders bevorzugter Träger
ist eine Liposomzubereitung.
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Der
Ausdruck „wirksame
Menge" bezeichnet
eine Menge des aktiven Inhaltsstoffs, die wirksam beim Erzielen
des gewünschten
therapeutischen Ergebnisses ist, nämlich der Vermeidung oder Herabsetzung
von vaskulärer
Restenose. Die wirksame Menge kann auf einer Anzahl von Faktoren
beruhen, einschließlich:
Gewicht und Geschlecht des behandelten Individuums; der Art der
medizinischen Prozedur, z. B. ob die zu inhibierende vaskuläre Restenose
auf eine Ballonangioplastie folgt, einem Einsatz eines Stents nach
einer Angioplastie, etc.; den Modus der Administration des aktiven
Inhaltsstoffs, (nämlich,
ob er systemisch oder direkt vor Ort verabreicht wird); der Art
des verwendeten Trägers
(z. B. ob es ein Träger
ist, der den aktiven Inhaltsstoff schnell freisetzt, oder ein Träger, der
ihn über
einen Zeitraum freisetzt); in therapeutischem Re gime (z. B. ob der
aktive Inhaltsstoff einmal täglich
verabreicht wird, mehrmals täglich
oder einmal alle paar Tage); chemische Faktoren, die die Rate der
Entwicklung von Restenose beeinflussen, wie Diabetes, Rauchen, Hypercholesterolemie,
Nierenerkrankungen etc.; anatomische Faktoren, wie die Frage, ob
starke Stenose vor der Angioplastie vorliegt, eine Totalocclusion,
eine linksanteriore Lokation der absteigenden Koronararterie, eine
Saphena Transplantatlesion, lange Lesionen, Multigefäß- oder
Multilesions-PTCR;
von der Dosierungsform oder -zusammensetzung; etc. Darüberhinaus
können
prozedurale Variablen auch einen Einfluß auf die Dosierung haben,
die eine größere residuelle
Stenose nach PTCA, starker Sektion, intimalen Zug, angemessener
Größe des Ballons
und die Gegenwart eines Thrombus. Der Fachmann sollte durch Routineexperimente
keine erheblichen Schwierigkeiten in der Bestimmung der wirksamen
Menge in jedem Fall haben.
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Die
Erfindung ist anwendbar für
die Vermeidung, Verringerung oder Behandlung von vaskulärer Restenose
und hauptsächlich,
aber nicht beschränkt
darauf, Koronarrestenose nach Angioplastie. Vaskuläre Restenose
resultiert aus verschiedenen Angioplastieverfahren einschließlich Ballonangioplastie,
Implantation eines intravaskulären
Stents oder anderen Verfahren der perkutanen Angioplastie (einschließlich Angioplastie
von Koronararterien, Karotidarterien und anderen der Angioplastie
zugänglichen
Gefäßen) als
auch für
Restenose, die auf einer Gefäßtransplantationsstenose
resultiert (z. B. nach Bypass-Operation)(16).
Außerdem
ist die Erfindung auch zur Vermeidung, Herabsetzung oder Behandlung
von vaskulärer
Restenose in peripheren Arterien und Venen anwendbar.
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Eine
beispielhafte Anwendung der Erfindung ist die Vermeidung und Behandlung
von In-Stentrestenose. Es ist ein sehr verträgliches medizinisches Verfahren,
einen Stent in ein Blutgefäß im Rahmen
einer Angioplastie einzusetzen, um die Wände des Blutgefäßes zu stützen. Ungeachtet
der Gegenwart des Stents innerhalb des Blutgefäßes tritt jedoch sehr häufig eine
Restenose auf. Erfindungsgemäß kann der
oben angegebene Inhaltsstoff verabreicht werden, entweder systemisch
oder direkt vor Ort, um eine solche Restenose zu vermeiden oder
zu inhibieren. Potentiell kann der aktive Inhaltsstoff auf eine
Weise formuliert werden, die sein Aufbringen auf den Stent erlaubt,
was tatsächlich
zu einer Verabreichung des aktiven Inhaltsstoffs direkt vor Ort
führt.
Der aktive Inhaltsstoff kann auf die Weise formuliert werden, daß er z.
B. in eine Beschichtung des Stents eingeschlossen wird. Beispiele
einer Beschichtung sind Polymerbeschichtungen, z. B. hergestellt
aus Polyurethan oder einem Gel.
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Der
erfindungsgemäß verwendete
aktive Inhaltsstoff kann mittels jeglicher der auf dem Fachgebiet
bekannten herkömmlichen
Verfahren in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden
(siehe zum Beispiel Alfonso et al., 1995(17)).
Die Zusammensetzungen können
in verschiedenen Formen, wie Kapseln, Tabletten, Aerosolen, Lösungen,
Suspensionen, als Coating einer medizinischen Vorrichtung, wie einem
Stent (siehe oben), etc. hergestellt werden. Außerdem können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen in einer zur topischen Verabreichung geeigneten
Form mit einem Träger
formuliert werden oder in einer Freisetzungsform, die den Durchtritt
des aktiven Inhaltsstoffs durch die Haut in den Körper erlaubt,
damit derselbe systemisch wirkt. Die bevorzugte Verabreichungsform
wird in jedem Fall von dem gewünschten Freisetzungmodus
abhängen,
welches gewöhnlich
der ist, der in Übereinstimmung
mit dem Zustand des Patienten physiologisch am verträglichsten
ist, mit anderen therapeutischen Behandlungen, die der Patient erhält, etc.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird der aktive Inhaltsstoff in partikulärer Form formuliert.
Dies kann durch Einkapseln oder Imprägnieren des aktiven Inhaltsstoffs
in Partikel, z. B. Polymerpartikel, Lipidvesikel oder Liposome erreicht
werden. Ferner können
solche Partikel aus Partikeln des polymerisierten aktiven Inhaltsstoffs
bestehen (siehe unten). Insbesondere bevorzugt sind Liposomzubereitungen
des aktiven Inhaltsstoffs. Die Liposome können durch jedes der auf dem
Gebiet bekannten Verfahren hergestellt werden (in Bezug auf Liposomzubereitungsverfahren
siehe Mönkkönen et al.,
1994(14) und Mönkkönen et al.,(18)).
Die Liposome können
positiv geladen sein, neutral oder negativ geladen (negativ geladene
Liposome sind derzeit bevorzugt; sie können Einzel- oder Multilamellar
sein. Ab und zu können
Zusammensetzungen, die eine Kombination von freiem Inhaltsstoff
(d. h. nicht eingekapselt) und des in Liposome eingekapselten aktiven
Inhaltsstoffs ebenfalls verwendet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird der aktive Inhaltsstoff bevorzugt aus der Gruppe
solcher Verbindungen ausgewählt,
die fähig
sind, einen intrazellulären
Metabolismus zu durchlaufen. Ein bevorzugter aktiver Inhaltsstoff
für diese
Gruppe ist die Verbindung ist Clodronat(13) mit
der folgenden Formel (II):
-
-
Clodronat
wurde zuvor für
die Verwendung bei der Behandlung von Hyperkalzemie beschrieben,
die aus der Bösartigkeit
der Behandlung von Tumorosteolyse(13) resultiert,
und als ein Inhibitor von Makophagen(14, 18).
Andere bevorzugte Inhaltsstoffe dieser Gruppe sind Etidronat und
Tiludronat mit der jeweils folgenden Formel (III) und (IV):
-
-
Weitere
BPe mit ähnlichen
Aktivitäten
zu der von Clodronat sind erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt. Solche
BPe können
auf der Basis ihrer Fähigkeit
zur Imitation der biologischen Aktivität von Clordronat ausgewählt werden.
Dies schließt
zum Bei spiel ein: in vitro-Aktivität des Inhibierens phagozytischer
Aktivität von
Phagozytenzellen, z. B. Makrophagen und Fibroplasten; Inhibierung
der Sekretion von IL-1 und/oder IL-6 und/oder TNF-α von Makrophagen;
in vivo Aktivität,
z. B. die Fähigkeit
des untersuchten BP zur Vermeidung oder Herabsetzung von Restenose
in einem experimentellen Tiermodell, wie zum Beispiel den Karotidkathetherverletzungsmodell
der Rate oder des Kaninchens, beschrieben in Beispiel 1 unten oder
dem Schweinemodell der Restenose, etc.
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Eine
weitere bevorzugte Gruppe aktiver Inhaltsstoffe gemäß der Erfindung
sind die Amino-BPe und jegliche anderen stickstoffhaltigen BPe mit
der folgenden allgemeinen Formel (V)
worin x C
1-C
10-Alkylamino oder C
3-C
8 Cykloaminoalkyl darstellt, wobei das Amino
primär,
sekundär
oder tertiär sein
kann; oder x stellt NHY dar, wobei Y Wasserstoff ist, C
3-C
8 Cykloalkyl, Aryl oder Heteroaryl.
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Von
den zu dieser Gruppe gehörenden
BPe wird angenommen, daß sie
nicht metabolisiert werden, und es ist gezeigt worden, daß sie in
relativ niedrigen Konzentrationen die Sekretion des Interleukin
IL-1 induzieren und, bei relativ hohen Konzentrationen, eine Apoptose
von Makrophagen hervorrufen(18). Bevorzugte, in
diese Gruppe gehörende
BPe sind zum Beispiel Pamidronat und Alendronat mit der jeweils
folgenden Formel (VI) und (VII):
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Obwohl
geminale BPe erfindungsgemäß bevorzugte
BPe sind, können
nicht-geminale BPe, Monophosphate von BPen, allgemein als Phosphate
bezeichnet, auch als aktiver Inhaltsstoff gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden.
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Die
Zusammensetzung der Erfindung kann den aktiven Inhaltsstoff entweder
in freier Säureform
umfassen, komplexiert mit Metallkationen wie Kalzium, Magnesium
oder organischen Basen oder kann in der Form von Salzen oder Estern
vorliegen oder sie können
polymerisiert sein, um Polymere von bis zu 40 Monomeren zu ergeben.
Die Salze können
Natrium, Kalium, Ammonium oder Kalziumsalze sein oder Salze, die
mit irgendeinem anderen geeigneten basischen Kation gebildet wurden
(z. B. Organo-Amino-Verbindungen).
Die Salze oder Polymere liegen in einer mikronisierten partikulären Form
mit einem Durchmesser im Bereich von ungefähr 0,01 bis 10 μm vor, bevorzugt
in einem Bereich von ungefähr
0,1 bis 5 μm.
Die aktiven Inhaltsstoffe in den Zusammensetzungen der Erfindung,
die entweder in freier Säureform
oder Salzform vorliegen, können mit
oder ohne Kristallwasser vorliegen (Hydrat oder Anhydrat). In einer
bevorzugten Ausführungsform
ist der aktive Inhaltsstoff in einem Liposom eingekapselt, welches
durch ein beliebiges der auf dem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt
ist. Erfindungsgemäß geeignete
Liposome sind bevorzugt nicht-toxische Liposome, wie zum Beispiel
solche, die aus Phosphatydil-Cholin-Phophatydilglycerol und Cholesterol
hergestellt sind, z. B. wie unten beschrieben. In vielen Fällen resultiert
die Verwendung des in einem Liposom eingekapselten aktiven Inhaltsstoffs
in einer verbesserten Auf nahme des aktiven Inhaltsstoffs durch die
Zellen via Endozytose(14, 18) (eine solche
Aufnahme kann eine Rolle bei der therapeutischen Wirkung spielen).
Der Durchmesser der in den Beispielen verwendeten Liposome betrug
zwischen 0,15 bis 300 Nm. Dies ist nicht beschränkend, sondern ausschließlich ein
Beispiel und Liposome anderer Größenbereiche
können
ebenfalls verwendet werden.
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Außerdem kann
der aktive Inhaltsstoff in inerte Polymerpartikel eingekapselt oder
eingebettet werden, wie zum Beispiel jegliche Art von Mikrokapseln,
Nonokapseln, Nanopartikeln, Nanospheren, Mikrospheren, Mirkopartikeln,
etc., die auf dem Gebiet bekannt sind(19).
Die Freisetzung des aktiven Inhaltstoffes aus solchen Partikeln
kann eine gesteuerte Freisetzung sein, die in einigen Fällen in
einer verlängerten
und verbesserten Wirkung und Aufnahme des aktiven Inhaltsstoffes
resultiert.
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Der
in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
verwendete pharmazeutische Träger
oder das Verbindungsmittel kann jedes beliebige der herkömmlicher
Weise auf dem Gebiet bekannten festen oder flüssigen Träger sein. Ein solcher Träger kann
zum Beispiel Lactose, Sucrose, Talk, Gelatine, Agar, etc. sein.
Wo der Träger
ein flüssiger
Träger
ist, kann er zum Beispiel Erdnußöl sein,
Phosphorlipide, etc. Wo der feste Träger zur oralen Verabreichung
verwendet wird, kann die Zusammensetzung in der Form einer Tablette,
in der Form einer harten Kapsel (z. B. einer Gelatinekapsel), in
der Form eines Pulvers oder in Pellettform vorliegen. Wo ein flüssiger Träger verwendet
wird, kann die Zubereitung in der Form eines Sirups, einer Emulsion,
von Liposomen, einer weichen Gelatinekapsel oder einer sterilen
injizierbaren Flüssigkeit
vorliegen, die einer Liposomenzubereitung, einer wässrigen
oder nicht-wässrigen
flüssigen
Suspension oder einer Lösung(17).
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Die
zur Injektion verwendete erfindungsgemäßee Zusammensetzung kann ausgewählt werden
aus Emulsionen, Lösungen,
Suspensionen, kolloidalen Lösungen,
welche geeignete Additive enthalten, etc.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können über jede
Route verabreicht werden, die die aktive Verbindung wirksam zur
geeigneten oder gewünschten
Wirkungsstelle transportiert. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die Formen der Verabreichung intravenös (i. v.)
und intraarteriell (i. a.) (insbesondere geeignet für die online
Verabreichung). Andere Arten der Verabreichung schließen intramuskuläre (i. m.)
oder subkutane (s. c.) Verabreichung ein. Solche Verabreichungen
können
als Bolusinjektionen oder Infusionen erfolgen. Die Zusammensetzungen
können
auch lokal an der erkrankten Stelle der Arterie verabreicht werden,
z. B. mittels eines auf dem Gebiet bekannten aussickernden/ausschwitzenden
Ballons. Ein weiterer Modus der Verabreichung kann die perivaskuläre Freisetzung
sein, Beschichten des Freisetzungssystems auf einen Ballon oder
einen Stent oder durch beliebige der anderen Verfahren der auf dem
Gebiet bekannten kardiovaskulären
Medikamentenfreisetzungssystemen. Kombinationen von beliebigen der
obigen Administrationsrouten können
erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Die
Dosierung des zu verwendenden aktiven Inhaltsstoffs hängt auch
von der spezifischen Aktivität des
verwendeten aktiven Inhaltsstoffs ab, von dem Modus der Verabreichung
(z. B. systemische Administration, oder lokale Verabreichung), der
Form des aktiven Inhaltsstoffs (z. B. ob er in der Form eines Wirkstoffs,
in der Form eines Polymers vorliegt, ob er in einen Partikel eingekapselt
ist, wie einem Liposom, etc.), und anderen per se bekannten Faktoren.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kann die Behandlung eines Individuums mit dem aktiven
Inhaltsstoff zum Zwecke der Vermeidung einer Restenose vor ihrem
Auftreten erfolgen. Zur Vorbeugung kann der aktive Inhaltsstoff
dem Individuum vor einem Angioplastieverfahren verabreicht werden, während der
Prozedur oder nach derselben, als auch einer Kombination von vor,
während
und post-prozeduraler Verabreichung.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird der aktive Inhaltsstoff einem an Restenose leidenden
Individuum zum Zwecke der Verringerung oder Be handlung von Restenose
verabreicht. In einem solchen Fall kann der aktive Inhaltsstoff
dem Individuum zu verschiedenen Zeitperioden nach der Entdeckung der
Restenose verabreicht werden, entweder alleine oder in Kombination
mit anderen Behandlungsarten.
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Außerdem kann
der aktive Inhaltsstoff verabreicht werden, bevor beliebige andere
Zustände
auftreten, die zu einer beschleunigten Arteriosklerose führen, als
auch akut nachdem der Prozeß begonnen
hat, eine weitere Entwicklung des Zustands zu inhibieren.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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1 bis 3 sind Balkendiagramme von Ergebnissen,
die die Wirkung von in Liposome eingekapseltem Clodronat auf die
Verringerung von Restenose in einem experimentellen Rattenkarotidkathetherverletzungsmodell
im Vergleich zu der Wirkung von Kontrolliposomen zeigen, die kein
Clodronat enthalten, auf dieselben Ratten. In diesen Figuren:
Karotidkathetherverletzungsmodell
im Vergleich zu der Wirkung von Kontrolliposomen auf dieselben Ratten, die
kein Clodronat enthielten. In diesen Figuren:
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1 zeigt das Ausmaß der mittleren
luminalen intimalen Bildung der mittleren Neointima zum mittleren
Verhältnis
in Ratten, die mit Clodronat enthaltenden Liposomen im Vergleich
zu Ratten, mit Kontrolliposomen behandelt wurden;
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2 zeigt die %-Stenose in
Ratten, die mit Clodronat enthaltenden Liposomen behandelt wurden,
im Vergleich zu der %-Stenose in Ratten, die mit Kontrolliposomen
behandelt wurden; und
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3 zeigt das Ausmaß der medialen
Fläche
als indirekten Index der Lebensfähigkeit
der glatten Muskelzellen, und bestimmt als Differenz zwischen der
gesamtarteri ellen Fläche
und der originalen Lumenfläche
in Ratten, die mit Clodronat enthaltenden Liposomen behandelt wurden,
im Vergleich zu Ratten, die nur mit Kontrolliposomen behandelt wurden.
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Beispiele
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Die
Erfindung wird jetzt durch ein nicht beschränkendes Beispiel mit Bezug
auf die beigefügten
Figuren erläutert:
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Beipiel 1
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Materialien
und Verfahren
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Clodronatliposome
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Lagerlösungen von
Clodronat wurden mit Auflösung
des Wirkstoffs in deionisiertem Wasser bei einer Konzentration von
0,11 Mol, pH = 7, hergestellt.
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Liposomenzubereitung
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38,9
mg Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), 118,5 mg Distearoyl-phoshphatidylcholin
(DSPC) und 38,7 mg Cholesterol wurden genau gewogen und in 20 ml
Chloroform: Methanol (9 : 1) in einem Rundkolben gelöst. Der
Kolben wurde vorsichtig erwärmt.
Das Lösungsmittel
wurde dann in einem Rotationverdampfer abgezogen. 20 ml hydratisiertem
Diisopropylether wurden dann zugegen und der Kolben wurde in ein
Wasserbad gegeben bis die Inhaltsstoffe aufgelöst waren. 8 ml der oben hergestellten
Clodronatlösung
wurden dann zugegeben und die Lösung
wurde bei 55°C
für einen
Zeitraum von 45 Minuten mit Ultraschall beschallt. Die organische
Phase wurde dann in einem Rotationsverdampfer (55°C, 100 Umdrehungen
pro Minute) abgezogen. Gleicherweise können andere wirkstoffhaltige
Liposome hergestellt werden.
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Reinigung der herbestellten
Liposome
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Ein
Sephadexgel wurde durch Auflösen
von 2,6 g Sephadex G-50 in 40 ml Wasser und Stabilisieren über Nacht
hergestellt. Die Säule
wurde mit 100 ml Puffer (50 mM Mes + 50 mM HEPES + 75 mM NaCl, pH 7,2)
gespült.
Die Liposome wurden auf die Säule
aufgebracht und die Säule
wurde mit dem Puffer gespült.
Das Liposom ist als Bande zu sehen, die durch seine Farbe in der
Säule verfolgt
werden kann. Ungefähr
20 Tropfen wurden von der Säule
in jedem Reagenzglas gesammelt.
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Tiere
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Tiere
wurden von den Tierrichtungen der Fakultät für Medizin bezogen und dort
gehalten. Die Hebräische
Universität
Jerusalem unterliegt den Standards zur Pflege und Verwendung von
Labortieren der Hebräischen
Universität
Jerusalem. Männliche
Ratten des Sabrastamms, Gewicht 350 bis 420 g wurden verwendet. Die
Tiere wurden mit Standardlaborfutter und Leitungswasser ad libitum
gefüttert.
Sämtliche
in vivo Experimente wurden unter Vollnarkose durchgeführt, die
mit 80 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin und Verabreichung i. p.
erzielt wurde.
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Rattenkarotidkatheterverletzungsmodell
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Die
distale, linke, gemeinsame und äußere Karotidarterien
wurden durch einen Mittellinieneinschnitt im Nacken freigelegt.
Die linke gemeinsame Karotidarterie wurde durch die intraluminare
Passage eines 2F Ballonkatheters, der durch die externe Karotidarterie
eingeführt
wurde, vom Endothel befreit. Der Katheter wurde dreimal hindurch
geführt,
wobei der Ballon ausreichend mit Salzlösung gedehnt wurde, um einen
leichten Widerstand zu erzeugen. Der Katheter wurde dann entfernt
und die externe Karotidarterie wurde abgebunden und die Wunde wurde
mit chirurgischen Klammern geschlossen. Sieben Ratten dienten als
Kontrollgruppe und sechs Ratten als behandelte Gruppe (willkürlich gewählt). Liposomales
Clodronat wurde i. v. der „behandelten Gruppe" einen Tag vor der
Arterienverletzung injiziert (6 mg Clodronat pro Ratte), was am
Tag 6 wie derholt wurde. In der Kontrollgruppe wurden ähnliche
Injektionen verabreicht, aber mit „leeren Liposomen" (kein Clodronat).
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Sämtliche
Tiere wurden 14 Tage nach der Verletzung durch eine Überdosis
Pentobarbital getötet.
Arterien wurden mit 150 ml 4% Formaldehydlösung pH 7,4 bei 100 ml Hg Perfusion
fixiert. Das rechte Atrium wurde seziert und ein 18G Katheter, der
mit dem Perfusionssystem verbunden ist, wurde in das linke Ventrikel eingeführt. Die
arteriellen Segmente wurden seziert, geschnitten, vorsichtig vom
Polymer entfernt und für
wenigstens 48 Stunden in derselben Fixierungslösung post-fixiert. Die arteriellen
Segmente wurden in Paraffin gebettet und an 8 bis 10 Stellen, 600 μm voneinander
entfernt geschnitten, und Schnitte von 6 μm wurden angefertigt und mit
Verhoeff's Elastinfarbe
zur histologischen Untersuchung gefärbt.
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Morphometrische
Analyse
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Die
Objektträger
wurden von einem Forscher, dem die Art der experimentellen Gruppe
unbekannt war, mikroskopisch untersucht. Sechs bis acht Schnitte
wurden auf jedem Objektträger
durch computermorphimetrische Analyse bewertet und die durchschnittlichen
Sektionsdaten wurden weiterhin als repräsentativ eines ganzen Objektträgers für den Vergleich
zwischen den Gruppen verwendet. Das residuale Lumen, die durch das
interne elastische Lamina gebundene Fläche (Originallumen) und die
durch das externe elastische Lamina begrenzte Fläche („gesamtarterielle Fläche") wurden direkt gemessen.
Der Grad der neointimalen Verdickung wurde als das Verhältnis zwischen
der Fläche
der Neointima und dem Originallumen (%-Stenose) beschrieben und
als das Verhältnis
zwischen der Neointimalfläche
zu der Fläche
des Mediums (N/M). Die mediale Fläche, ein indirekter Index der
SMC-Lebensfähigkeit,
wurde als die Differenz zwischen der gesamtarteriellen Fläche und
der Originallumenfläche
bestimmt.
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Ergebnisse
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Das
chirurgische Verfahren und die Behandlung bewirkte keine Mortalität oder offensichtliche
Morbidität
der Tiere.
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Wie
in 1 zu sehen ist das
Ausmaß der
mittleren Neointimal-Bildung und des mittleren Neointima zu Mediaverhältnis (N/M)
nachfolgend der Behandlung mit in Liposomen eingekapseltem Clodronat
signifikant reduziert. Das N/M-Verhältnis in Clodronat behandelten
Ratten betrug 0,28 bis 0,23 im Vergleich zu 1,42 ± 0,26 in
der Kontrollgruppe (mittlere ± SD,
p < 0,01). Gleicherweise
wurde, wie in 2 zu sehen,
eine signifikante Inhibierung der %-Stenose in der behandelten Gruppe
erzielt: 9,8 ± 7,76
gegen 41,53 ± 7,9,
jeweils behandelte und Kontrollgruppe (mittlere ± SD, p < 0,01). Es gab keine offensichtlichen
systemischen Nebenwirkungen, noch Wirkungen auf das somatische Wachstum
wie in 3 zu sehen.
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Folgerung:
Die Behandlung von Ratten mit Clodronat enthaltenden Liposomen reduziert
Restenose signifikant, was als Neointimalbildung nach Ballonverletzung
der Karotidarterie zu sehen ist.
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Beispiel 2
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Materialien
und Verfahren
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Die
Anti-Restenosewirkungen von liposomalen Clodronatinjektionen wurden
in den ballonverletzten Ratten und arteriosklerotischen Kaninchenkarotidarterienmodellen
untersucht. Die Ratten wurde mit Clodronat enthaltenden Liposomen,
leeren Liposomen (Kontrolle) und Clodronat in Lösung (zusätzliche Kontrolle) behandelt.
Die Dosis von injiziertem Clodronat war 1,5 und 15 mg/kg, verabreicht
einen Tag vor der Prozedur (–1) und/oder
an Tag 6 (+6) nach der Verletzung. Die Kaninchen (nach 30 Tagen
arteriosklerotischer Diät)
wurden einen Tag vor der Ballonangioplastie durch liposomales Clodronat
(10 mg/kg) behandelt. Das Lumen, Neointimal, mediale und Gefäßflächen und
Volumina wurden in den behandelten und Kontroll-Tiergruppen durch
digitale Planimetrie histologischer Schnitte an 14 und 30 Tagen
nach der Verletzung in jeweils den Ratten- und Kaninchenmodellen
gemessen.
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Ergebnisse
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Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:
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Wie
zu sehen, wurde keinen signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungen
mit leeren Liposomen und freiem Clodronat in Lösung gefunden (siehe Tabelle),
die eine deutliche Neointimabildung zeigte. Das Ausmaß der mittleren
Neointimabildung, das Neointima zu Mediaverhältnis (N/M) und %-Stenose nach Behandlung
mit Clodronat beladenen Liposomen war signifikant herabgesetzt.
Die mediale Fläche
wurde durch die verschiedenen Behandlungen nicht beeinflußt, was
auf keinen schädlichen
Effekt auf ruhende Zellen deutet. Darüber hinaus gab es weder offensichtliche
systemische Nebenwirkungen, noch irgendwelche Wirkungen auf Knochen
und somatisches Wachstum. Signifikant potentere Behandlungen, mit
keinem signifikanten Unterschied zwischen ihnen, waren die 1 × 15 mg/kg
(–1) und
2 × 15
mg/kg (–1
und +6) Injektionen. Ähnliche
Befunde von keinen nachteiligen Wirkungen wurden in den Untersuchungen
der Kaninchen beobachtet. Liposomales Clodronat war signifikant
wirksam in der Verringerung der Neointimabildung und %-Stenose.
Einer Injektion von Silicapartikeln reduziert ebenfalls Intimabildung
(Tabelle 1). Dies Wirkung konnte der bekannten inhibierenden Wirkung
von Silica auf Makrophagen zugeschrieben werden.
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Die
Ergebnisse zeigen, daß die
Behandlung durch Clodronat enthaltende Liposome die Neointimabildung
nach Ballonverletzung in beiden, Ratten- und Kaninchenmodellen,
signifikant herabsetzt. Es gab weder offensichtliche systemische
und lokale Nebenwirkungen, noch irgendwelche Wirkungen auf somatisches Wachstum.
Es ist anzumerken, daß,
obwohl BP als Auswirkungen auf Knochen zeigend bekannt ist, keine
Wirkungen auf den Knochen- oder Kalzium- oder Phosphorlevel in Knochen
und Blut nach Behandlung mit Liposomenzubereitungen von Clodronat
beobachtet wurden.
