JPH03291216A

JPH03291216A - 高分子小胞体

Info

Publication number: JPH03291216A
Application number: JP2033256A
Authority: JP
Inventors: Etsuo Hasegawa; 悦雄長谷川; Shinji Takeoka; 真司武岡; Hiroyuki Ono; 弘幸大野; Hiroyuki Nishide; 宏之西出; Hidetoshi Tsuchida; 英俊土田
Original assignee: Research Institute for Production Development; Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp; Research Institute for Production Development
Priority date: 1989-04-27
Filing date: 1990-02-14
Publication date: 1991-12-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、表面電荷を負に固定した高分子小胞体に関す
るものである。

本発明の高分子小胞体は医薬品、酵素、ヘモグロビンな
どの担体として、工業分野あるいは医用分野で利用され
る。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕医薬品や
酵素などの有用物質を微小なカプセルに封入して、それ
らの有効性を高めようとする報告は多い。初期の試みで
はポリスチレン、ナイロンなどの合成高分子化合物が膜
材料として利用されていたが、材料自体の毒性や、粒径
が大きく血栓を引き起こすなどの理由で実用的でなかっ
た。

最近、毒性の少ない膜材料として、天然リン脂質を用い
た微小マイクロカプセル（小胞体）を、特に、医薬品の
担体として利用することが注目されている。粒径を０．
０２〜数〃ｍの範囲で任意に制御出来るので、適切な大
きさに設定すれば、血栓等の問題も避けられる。しかし
、これらの小胞体に、保存性が欠如しているのみでなく
、生体内で物理的及び化学的に不安定であり、容易に分
解され、特に、血中での持続性がないという欠点がある
。

ところで、哺乳動物の体内に存在し、酸素運搬の役割を
果たすヘモグロビンを酸素の運搬４貯藏。

吸収剤として利用する試みは古くからあり、特に酸素運
搬輸液の素材としての利用例も多い。ヘモグロビンは体
内では赤血球内に存在し、これを模倣して、二分子膜か
らなる小胞体にヘモグロビン水溶液を内包した酸素運搬
体が報告されている（アービング・フランク・ミラーは
か、特公昭６０−２６０９２号公報；シー−アンソニー
・ハント、特公昭５８−１８３６２５号公報；鉛末はか
、特公昭６２−１７８５２１号公報）。これらのヘモグ
ロビン含有小胞体にいずれも天然あるいは合成の非重合
性脂質あるいは脂質混合物を膜材料として用いたもので
ある。このような小胞体については、先に述べたように
、ヘモグロビン水溶液の担体に限らず各種の医薬品の単
体としての利用が広く検討されている。天然化合物を材
料として用いているので、安全性は高いと期待される。

しかし、これらの小胞体は、保存性が欠如しているのみ
でなく、生体内で物理的及び化学的に不安定であり、容
易に分解され、特に、血中での持続性がないという欠点
がある。このため、小胞体を安定化１−る拭みが鋭意行
われている。

例えば、小胞体の安定性を確保する方法の一つとして、
重合性のリン脂質（ホスファナジルコリン型の誘導体が
多い）を用い、脂質二分子膜を高分子化ノる方法が報告
されでいる（Ｈ，リングストルフら、アンゲハンテへミ
イインターナシゴナルエヂションイングリノシュ、２０
Ｌ　　３０５頁（１９８１年）はか）。この方法は、膜
を重合することにより、膜に物理的安定性を付与しよう
とする試みである。これらの重合性リン脂質の一つ（重
合性残基としてジイン基を有するホスファチジルコリン
誘導体）とコレステロールから成る小胞体にヘモグ［：
］ビン水溶液を内包した後、重合してヘモグロビン含有
高分子小胞体を得るという報告もある（Ｊ、Ａ、Ｈａｙ
ｗａｒｄ　ｅＬ　ａｌ、、　　ＰＣＴ　　ＷＯ３５１０
４３２６）。

しかし、生体中、とりわけ、血液中での安定性をさらに
確保する為には、マイクロカプセルの表面荷電を負に保
ち、生体成分との相互作用を減するため、適切なゼータ
電位に保−）工夫が必要である。これらの工夫のために
、通常（非重合）の小胞体や上記の高分子小胞体では、
非重合性の負電荷脂質、例え番よ′、非重合性の脂肪酸
、ホスファチジン酸、ジセチルリン酸、ホスファチジル
セリンが利用されていた。しかし、血液中では、これら
の成分は、例えば高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）などの生
体成分により容易に膜から引き抜かれるＺ）、十分な安
定性の確保ができていなかった。

本発明は、以上の現況に鑑みカプセル股表面に負電荷を
持つ安定な高分子小胞体、とりわけ、負電荷成分が重合
に関与し、膜に共有結合で固定された高分子小胞体を提
供せんと研究の結果到達したものである。

〔課題を解決するための手段と作用〕

即ち、本発明は、重合性リン脂質、コレステロール１重
合性脂肪酸からなる小胞体の重合物である高分子小胞体
に係るものである。

重合性リン脂質としては、従来から一般的に使用されて
いるホスファチジルコリン誘導体の外、重合性基を持つ
ものであればどんなものでも良い。

しかし、電荷的に負の重合性リン脂質の場合は負電荷酸
分としての重合性脂肪酸を重合に関与せしめる必要がな
い為、本発明の意義は重合性リン脂質として、重合性基
を持ち電荷的に中性のリン脂質（−船釣にはホスファチ
ジルコリン誘導体）を用いる場合に特に有効なものとい
える。

重合性脂肪酸としては、重合性を持つ脂肪酸であればど
んな化合物でも構わないが、炭素数がＩ２以上であるこ
とが好ましい。

また、ヘモグロビンのカプセル化効率からすると、重合
性リン脂質と重合性脂肪酸のモル比は、６：１乃至２：
１が好ましく、更に好ましい比は５：１乃至３：１であ
る。同様に重合性リン脂質とコレステロールのモル比は
、１：２乃至３：２が好ましく、更に好ましい比は３：
４乃至４：３である。同様にヘモグロビンのカプセル化
効率の点からは、重合性リン脂質と重合性脂肪酸との組
合せにあたっても構造的に共通ずるものを選ぶ方が得策
である。

例えば下記一般式（１）又は一般式（ＩＩ）で表される
重合性リン脂質とに下記一般式（Ｉｌｌ）で表される重
合性脂肪酸との組合せである（但し、式中ｎは１２．１
０．８又は６の整数を表す）。

ＣＨ−ＯＣ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨｚ）ｎ　
　ＣＨ３（Ｉ　）ＣＨｚ　　ＯＰ−０”ＣＨｚＣＦＩｚ
　　Ｎ　’　　（ＣＨｉ）ｉ　− １ＣＨｚ　　ＯＣ−ＣＨ＝ＣＨＣＩ（＝ＣＨ−ＣＣｔｂ）
ｎ−Ｃ８：１ＣＨ２−ＯＣＣＨ：ＣＨ−ＣＨ：ＣＨ−（
ＣＨ２）。−ＣＨ。

１ＨＯＣＣｔ（＝Ｃ）ｌ　　ＣＨ＝Ｃ１ｌ　　（ＣＨｚ）
ｎ−ＣＨ３（ｌＩ［）重合性リン脂質２重合性脂肪酸及
びコレステロール混合物から成る小胞体の製造は、常法
（Ｇ。

ブレボリアデス、　「リポソームテクノロジー」。

１巻、シーアールシーブレス（１９８３年）はか）に従
い可能である。例えば重合性リン脂質。

重合性脂肪酸及びコレステロールをベンゼンから凍結乾
燥して得られる粉末に、水、緩衝水２等張生理塩水（ｐ
）１５ないし９、好ましくは６ないし「）などを加え、
不活性ガス（窒素、アルゴンはか）雰囲気下、水冷ない
し６０°Ｃで超音波処理（プローブ型またはバス型超音
波発信ａ）することで、小胞体分散液が得られる。また
、上記混合粉末に、水、緩衝水２等張生理塩水を加え、
不活性ガス雰囲気下、５ないし３７°Ｃでポルテックス
ミキサーで処理（５ないし６０分）することで多重層小
胞体（粒径：〜１０ｎｍ）を得ることもできる。この小
胞体には、各種の医薬品、酵素５蛋白質などを封入でき
る。

例えば、ヘモグロビンを内包するには次のようにして可
能である。濃厚ヘモグロビン水溶液（ヘモグロビン濃度
１０ないし５０重量％、好ましくは１５ないし３５重量
％）を、上記の脂質混合物に加え、不活性ガス雰囲気下
、５ないし３７°Ｃでポルテックスミキサーで処理（５
ないし６０分）することでヘモグロビンを内包した多重
層小胞体（粒径：〜Ｉｏｎｓ）を得る。この溶液を例え
ば、多孔性のポリカーボネート膜（孔径：　８，５，３
，２，１゜０．６，０．４μｍなど）を通した後、適当
な限外濾過カラム（ファルマシアファインケミカル社、
セファローズ　ＣＬ−４Ｂなど）、あるいは、限外濾過
膜（例えば、旭メディカル社製、　ＡＣ−１７６０型ホ
ローフアイバーなど）を用いて精製（洗浄水は、等張生
理塩水（ｐＨ７，４）　）　、未内包のヘモグロビンを
除去し、同時にヘモグロビン小胞体を濃縮して、目的と
するヘモグロビン小胞体（粒径：０．１ないし０．６μ
ｍ）分散液が得られる。

また、上記の凍結乾燥済み脂質混合物に等張生理塩水を
加え、不活性ガス雰囲気下、氷冷ないし６０℃で超音波
処理して単層の小胞体（粒径：２０ないし６０ｎｍ）分
Ｐ１１溶液を調製する。これに、ヘモグロビン濃厚溶液
を加えた後、凍結融解（−７８℃〜室温）処理を行い、
ヘモグロビン水溶液を内包する。この溶液を例えば、多
孔性のポリカーボネートＭ（孔径：　８，５，３，２．
１，０．６，０．４　ｐ　ｍなど）を通した後、適当な
限外濾過膜（例えば、旭メディカル社製、　ＡＣ−１７
６０型ホローフアイバーなど）を用いて洗浄（洗浄水は
、等張生理塩水（ｐＨ７，４）　）　、未内包のヘモグ
ロビンを除去し、同時にヘモグロビン小胞体を濃縮して
も、目的とするヘモグロビン小胞体（粒径：０．工ない
し０．６μｍ）分散液が得られる。

このようにして調製される小胞体を重合し安定な高分子
小胞体を得るには、不活性ガス下で、紫外線あるいはガ
ンマ線を照射するか、適当な開始剤を添加することによ
り可能である。内包物（医薬品、酵素、蛋白質など）が
熱的に不安定である場合には、低温用開始剤の利用が有
効である。例えば、アゾビス（２−アミジノプロパン）
二塩酸塩では、低温（〜１０℃）で可視光線の照射によ
り重合を行うことが出来る。また、ＮａＨＳＯｚ／Ｋｚ
ＳｚＯｇレドックス開始剤などでも低温での重合が可能
である。このような目的に合致するものであれば上記の
方法に限らず、どんな重合方法でも構わない。

重合の進行は重合基の特性吸収帯（−船蔵（Ｉ）乃至（
ＩＩＩ）の重合性脂質の場合には、紫外スペクトルの特
性吸収帯（２５５ｎｉ＋）　）の強度の減少により確認
出来る。重合後、そのまま、あるいは適当なラジカルス
カベンジャー（システィン（塩酸塩）。

メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなど）を加
えた後、適当な限外濾過カラム（ファルマシアファイン
ヶ兆カル社、セファローズ　ＣＩ。

−４Ｂなど）、あるいは、限外濾過膜（例えば、旭メデ
ィカル社製、　ＡＣ−１７６０型ホローフアイバーなど
）を用いて精製（洗浄水は、等張生理塩水（ｐＨ７，４
）　）　Ｌ、不用物を除去すると共に、濃縮し、高分子
小胞体分散液あるいはヘモグロビン含有高分子小胞体分
散液を調製出来る。

次に、実施例及び参考例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明する。

［実施例〕実施例１１．２−ビス（オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−ｔｒａ
ｎｓ、　４ジエノイル）グリセロ−３−ホスホコリン（
−般Ｒ（１）　（１）ｒ＋　＝１２ｃ７）化合物）　２
．０５ｇ　（２，６ｍｍｏｌ）オクタデカ−ｔｒａｎｓ
、　２−　ｔｒａｎｓ、　４−ジエン酸（−船蔵（ｍ　
）　０）　ｎ　＝１２（７）化合物）　０．１５　ｇ　
（０，５問ｏ１　）及びコレステロール０．８１　ｇ　
（２，１ａｍｏｌ　）をベンゼン４０ｍ１に溶解後、凍
結乾燥した。得られた粉末に５　ｄＴｒｉｓ緩衝液（ｐ
）Ｉ　７．４．０．９重量％塩化ナトリウム含有）６０
ｍｌを加え、窒素ガス雰囲気下で水冷しながら超音波処
理（６０ｗ、１５分）を行った。得られた単層の小胞体
分散水溶液を石英ガラス容器に採り、窒素ガスで置換後
密封した。これに、光増感重合開始剤として５０ｒａＭ
アゾビス（２ジアミノプロパン）二塩酸塩水溶液３．１
１１を加えた後、８　’Ｃに冷却した。高圧水銀ランプ
（理工科学産業、ＵνＩ−１００）を用い、フィルター
で３６０ｎ履以下の短波長光をカットした可視光線を照
射して開始剤を分解し、重合性脂質の重合を行った。１
２時間後の重合率は５０％（ジエン基に由来する２５５
ｎｍＷ＆収体の吸光度の計時変化より決定）であった。

窒素ガス雰囲気下でゲル濾過カラム（充填剤：セファロ
ースＣＬ　−４Ｂ、媒体：　５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐ
Ｈ１，４，０，９重量％塩化ナトリウム含有））処理を
行い、低分子量体を除去し、目的とする高分子小胞体分
散水溶液を得た。粒径は約３０ｎｍであった。界面活性
剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）添加時における高分子
小胞体の安定性を未重合の小胞体と比較した。未重合体
では、３ｍＨの界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）
添加で完全に小胞体が破壊されるが、高分子小胞体では
、１２ｄの界面活性剤（ＴｒｉＬｏｎ　Ｘ１００）添加
でも破壊されず安定であった。

実施例２１．２−ビス（オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−ｔｒａ
ｎｓ、　４−ジェノイル）グリセロ−３−ホスホコリン
（−船蔵（１）のｎ−１２の化合物）０．７８２ｇ　（
１，０ｍｍｏｌ）　。

オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−ｔｒａｎｓ、　４−　
ジエン酸（−船蔵（ｌ［）のｎ−１２の化合物）０．０
８０　ｇ　（０，２８＋ｎｏｌ）及びコレステロール０
．３８６ｇ　（１，０■■ｏｆ）をベンゼン３０■１に
溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末に５１ＭＴｒｉｓ
緩衝液（ｐＨ７，４，０，９重量％塩化ナトリウム含有
）２０■ｌを加え、窒素ガス雰囲気下、室温（２０〜２
５℃）でポルテックスミキサー処理（１０分）し、多重
層小胞体を得た。更に、この溶液を多孔性ポリカーボネ
ート膜（孔径：　ｉ、ｏ。

０．６，０．４，０．２　ａ　ｍ　）を通し粒径１８０
ｎｍの小胞体分散水溶液を得た。得られた小胞体分散水
溶液１０ｍ１をガラス容器に採り、窒素ガスで置換後密
封した。

これを５℃冷却後、５重量％亜硫酸水素ナトリウム水溶
液０．０７ｍ１　、次に５重量％過硫酸カリウム０゜１
７ｍ１を加え６時間反応（重合率＝４３％）して高分子
小胞体分散水溶液を得た。窒素ガス雰囲気下でゲル濾過
カラム（充填剤：セファロースＣＬ−４Ｂ。

媒体：　５１１ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，４，０，９
重蓋％塩化ナトリウム含有））処理を行い、低分子量体
を除去し、目的とする高分子小胞体（粒径：　１８０ｎ
ｗ）分散水溶液を得た。

実施例３１．３−ビス（オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−　ｔｒ
ａｎｓ、　４−ジェノイル）グリセロ−２−ホスホコリ
ン（−船蔵（ＩＩ）のｎ＝１２の化合物）１．１７３ｇ
　（１，５０％ｍｏｌ）。

オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−　Ｌｒａｎｓ、　４−
ジエン酸（−船蔵（Ｉ［［）のｎ＝１２の化合物）０．
１８０　ｇ　（０，６４ｍｍｏｌ）及びコレステロール
０．５７９　ｇ　（１，５０量鳳ｏ１）を実施例１と同
様に処理して高分子小胞体（粒径：３５ｎ■）を得た。

実施例４１．２−ビス（オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−　ｔｒ
ａｎｓ、　４−ジェノイル）グリセロ−３−ホスホコリ
ン（−船蔵（１）のｎ＝１２の化合物）２．３４６ｇ　
（３，０ｍｍｏｌ）　。

オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−ｔｒａｎｓ、　４−ジ
エン＃（−船蔵（ＩＩＩ）のｎ＝１２の化合物）０．２
４０　ｇ　（０，８５ｍｍｏｌ　）及びコレステロール
１．１５８　ｇ　（３，０＋＋＋ｍｏｌ）をベンゼン４
０ｍ１に溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末に５　ｍ
ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，４，０，９重量％塩化ナト
リウム含有）２５■Ｉを加え、窒素ガス雰囲気下で水冷
しながら超音波処理（６０ｗ、２０分）を行い、単層の
小胞体分散水溶液を得た。この溶液２０　Ｉｌｉｌミニ
５　重１％ヒトヘモグロビン水？８ｆｉ４０曽Ｉを加え
、凍結（−ｊ８°Ｃ）−融解（室温）処理を２回行った
。この溶液を多孔性ポリカーボネートＩＩＩ（孔径：８
．５．３，２，１．０．６　ｐｍ等）に通した。窒素ガ
ス雰囲気下でゲル濾過カラム（充填剤：セファロースＣ
Ｌ−４８．媒体：５Ｉｌ阿Ｔｒｉｓｉ衝液（ｐＨ７，４
゜０．９重量％塩化ナトリウム含有））処理を行い、未
内包ヘモグロビンを除去し、ヘモグロビン小胞体（粒径
：０．５μｍ）を得た。この溶液１０■ｌを石英ガラス
容器に採り、窒素ガスで置換後密封し、・８℃に冷却し
た。これに、光増感重合開始剤として５０ｍＭアゾビス
（２−ジアミノプロパン）二塩酸塩水溶液０．３ｍｌを
加えた後、高圧水銀ランプ（理工科学産業、　ＬＩＶＬ
−１００）を用い、フィルターで３６０ｎｍ以下の短波
長光をカットした可視光線を照射して重合性脂質の重合
を行った。１０時間後の重合率２６％（ジエン基に由来
する２５５ｎ−吸収体の吸光度の計時変化より決定した
）、窒素ガス雰囲気下、５°Ｃでゲル濾過カラム（充填
剤：セファ０−７１．ＣＬ−４Ｂ、媒体：　５ｍＭＴｒ
ｉｓｔｌ衝液（ｐＨ７，４゜０．９重量％塩化ナトリウ
ム含有））処理を行い、低分子量体を除去し、目的とす
る高分子小胞体（粒径：０．５μｍ）分散水溶液を得た
。ヘモグロビン内包効率（小胞体中に内包されたヘモグ
ロビンＭ／仕込ヘモグロビンＩ比（％））ハ、１５％で
あった。可視吸収スペクトル測定ではヘモグロビンの変
性は殆ど観測されなかった。界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００）添加時における高分子小胞体の安定性を
未重合の小胞体と比較した。未重合体では、３１Ｍの界
面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）添加で完全に小
胞体が破壊されるが、高分子小胞体では、１０ｍＭの界
面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）添加でも破壊さ
れず安定であった。４　’Ｃ１３７℃保存条件で６０後
、ヘモグロビン漏出は２％以下であった。

実施例５１．２−ビス（オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−　ｔｒ
ａｎｓ、　４ジェノイル）グリセロ−３−ホスホコリン
（−船蔵（１）のｎ＝１２の化合物）１．８４５　ｇ　
（２，３６ｍ５ｏｌ）。

オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−　ｔｒａｎｓ、　４−
ジエン酸（−船蔵（ＩＩＩ）のｎ＝１２の化合物）０．
１３５ｇ　（０，４８−−ｏｆ）及びコレステロ−１し
０．７２９　ｇ　（１，８９ｍｍｏｌ）をベンゼン３０
創に溶解後、凍結乾燥した。得られた粉末に３５重量％
ヒトヘモグロビン水溶液５０釧を加え、窒素ガス雰囲気
下、室温（２０〜２５℃）でボルテフクスミキサー処理
（１０分）し、ヘモグロビンを内包した多重層小胞体を
得た。更に、この溶液を多孔性ポリカーボネート膜（孔
径：　８，５゜３．２．１，０．６μｍなど）を通し小
胞体分散水溶液を得た１Ｍ素ガス雰囲気下、５℃でゲル
濾過カラム（充填剤：セファロースＣＬ　−４Ｂ、媒体
：　５＠ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，４，０，９重量％
塩化ナトリウム含有））処理を行い、未内包ヘモグロビ
ンを除去してヘモグロビン小胞体分散水溶液を得た。得
られた小胞体分散水溶液２０ｍ１をガラス容器に採り、
窒素ガスで置換後密封した。これを５℃冷却後、５を量
％亜硫酸水素ナトリウム水溶液０．０５＊Ｉ、次に５重
量％過硫酸カリウム０．１２ｍ１を加え４時間反応（重
合率＝３０％）し、高分子小胞体分散水溶液を得た。窒
素ガス雰囲気下、５℃でゲル濾過カラム（充填剤：セフ
ァロースＣＬ　−４Ｂ、媒体：５ｗＭＴｒｉｓｉｌ衝液
（ｐ）ｆ　７．４．０．９重量％塩化ナトリウム含有）
）処理を行い、低分子量体を除去し、目的とする高分子
小胞体（粒径：０，４μｍ）分散水溶液を得た。ヘモグ
ロビン内包効率（小胞体中に内包されたヘモグロビン量
／仕込ヘモグロビンＩ比（％））は、２９％であった。

可視吸収スペクトル測定ではヘモグロビンの変性は殆ど
観測されなかった。界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００）添加時における高分子小胞体の安定性を未重合の
小胞体と比較した。未重合体では、３ｔａＭの界面活性
剤（丁ｒｉ　ｔｏｎＸ−１００）添加で完全に小胞体が
破壊されるが、高分子小胞体では、１０ｍＭの界面活性
剤（Ｔｒｉ　ｔｏｎＸ−１００）添加でも破壊されず安
定であった。４℃、３７℃保存条件で６日後、ヘモグロ
ビン漏出は２％以下であった。

実施例６１．３−ビス（オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−ｔｒａ
ｎｓ、　４ジエノイル）グリセロ−２−ホスホコリン（
−般弐（ＩＩ）のｎ−１２の化合物０．８８０ｇ　（２
，４０ｗｍｏｌ）オクタデカ−ｔｒａｎｓ、　２−ｔｒ
ａｎｓ、　４−ジエン酸（−形式（ＩＩＩ）のｎ＝１２
の化合物）０．１９２　ｇ　（０，６９＋ｕｏｌ　）及
びＩＬ／ステｏ　−ル０．１９４　ｇ　（２，０６＋ｏ
＋ｏｌ　）を用い実施例５と同様に処理して、ヘモグロ
ビン含有高分子小胞体（粒径：０，６μｍ）を得た。ヘ
モグロビン内包効率は２０％であった。

実施例７１０ｄ用ナスフラスコの中に、ベンゼンより凍結乾燥を
行うことで得た混合脂質（１，２−ビスＣオクタデカ−
ｔｒａｎｓ、　２−　ｔｒａｎｓ、　４−ジェノイル）
グリセロ−３−ホスホコリン／コレステロル／オクタデ
カ−２，４−ジエン酸　モル比。

７：７：２）３００ＩＩｇ、ヘモグロビンと等モルのイ
ノシトール６リン酸（ＩＨＰ）とＮＡＤＨ５■阿を溶解
した精製ヘモグロビン水溶液（１７ｇ／！ｊ！、メト化
率２．６％、−酸化炭素ガスを３分間吹き込み済み（−
酸化炭素錯体の生成は、可視吸収スペクトルの特性吸収
帯（λ■ａｘ：４１９ｎｓ）で確認した。））６−１及
びガラスピーズを少々入れ、４°Ｃで１５分間水和させ
た。その後ポルテックスミキサーで１５分間処理した。

４℃で穴径８μ■、５μ鴎、３μ■２μ厘、１μ麿、０
．６９履、０．４μ麿の順でポリカーボ２−ト＠　（Ｅ
ｘｔｒｕｄｅｒ）処理を行った。０．４ａｍ膜を通した
サンプル５Ｉｌｌを、ＨＣｒ−Ｔｒｉｓｉ衝水（５ｍＭ
、ｐＨ７゜４）で置換したセファロースＣＬ−４Ｂ（フ
ァルマシアファインケミカルス、スウェーデン）カラム
を用い、ヘモグロビンを内胞した小胞体分画と遊ｆｉｔ
（ｂ分画に分離した（充填層の大きさ二半径３ｃｍ、高
さ１５Ｃ１１）。また、得られた小胞体のヘモグロビン
カプセル化効率、　［Ｈｂｉ　／　［脂質１重量比、平
均粒径、メト化率ハソれぞれ、２９Ｚ、　１．５１ｍｇ
／ｍｇ］、３０９．３＋ｙ７１゜５１ｎｍｌ、　３．Ｏ
Ｚであった。

５１１１用褐色バイアル瓶に上記ヘモグロビン小胞体格
？＆４ｄ！を入れ、ゴム栓で密封した。これにアルゴン
ガスを２０分間室温下で吹き込んだ後、−酸化炭素ガス
を３分間吹き込んだ。

上記バイアル瓶中の小胞体のＴ線重合は、ジュワ氷冷中
氷冷下で行った。Ｔ線照射量は０．７３［Ｍｒａｄｌで
あり、重合反応の進行は、紫外吸収スペクトルのジエン
基に起因する吸収（２４５〜ｂを測定して確認した。重
合率は８５Ｚであった。

上記で得られた重合化小胞体溶液を氷冷しながら６０ｗ
白色光を照射し、酸素ガスを１時間吹き込み、相当する
酸素錯体（オキシヘモグロビン）に転換した。−酸化炭
素の除去は、可視吸収スペクトルを測定し確認した。ま
た、重合後の粒径は、２９４．３±５９．３　［ｎｓ＋
］であり、重合前とほとんど変わらなかった。

常法に従いヘモックスアナライザー（ＴＣＳメジカルプ
ロダクト社（米国））を用い、ヘモグロビンに基づく可
視吸収スペクトルの酸素分圧依存性の測定から酸素結合
解離曲線を３７℃、５ｍＭＴｒｉｓ　１１衝水（ｐＨ７
，４）中で測定した。その結果、重合化小胞体に内包さ
れたヘモグロビンの酸素親和性（Ｐｓ。：ヘモグロビン
の５０ｚが酸素化するのに必要な酸素分圧）は４０■Ｈ
ｇ、ヒル係数は１．６５、肺−末梢組織間での酸素運搬
効率は３８Ｚであった。

また、常法に従いレーザーフラッシュホトリシス測定（
■υｎｊｓｏｋｕ製測定装置）を行い、３７℃、酸素分
圧１４９　ｗａＨｇ、５ｍＭＴｒｉｓ緩衝水（ｐＨ７，
４）中において、該デオキシヘモグロビンは迅速に酸素
を結合（１０璽ｓｅｃ以内に酸素の結合を完了）するこ
とが分かった。

以上の結果より、本実施例で合成された重合化小胞体に
内包されたヘモグロビンが赤血球内ヘモグロビンと同等
に酸素を運搬する機能を持つことが明らかにされた。

参考例１ヘモグロビン内包効率に及ぼす脂肪酸の種類の影響を、
実施例５に従って検討した（但し、重合反応前の未重合
小胞体を調整し、分析）。

結果を次表に示す、他の非重合性脂肪酸に比較して、重
合性脂肪酸（オクタデカジエン＃）を負電荷成分として
用いた場合が高い内包効率及び［Ｈｂ１／［脂Ｉｔ］　
比（［ＨｂＪはヘモグロビン）を与えることが分かった
。

エン酸（ＯＤＡ）　　　　１８　　　２（ｔｒａｎｓ）
　　　２０　　　１．９尚、脂肪酸を用いない場合、ヘ
モグロビンの内包効率は低く（１０％以下）、膜成分と
しての脂肪酸添加の有効性は明らかであった。

参考例２実施例７と同様な方法で得られたヘモグロビンを内胞し
た重合化小胞体溶液を、４℃で限外濾過（排除限界分子
量２万の限外濾過膜を使用）濃縮し、ヘモグロビン濃度
１０ｇ／　ａの濃厚溶液を得た。

この溶液の各種物性を測定し、結果を下表に示す。

本実施例で得られたヘモグロビン小胞体溶液の溶液物性
は人血液と同等であることが明らかにされた。

表　各種溶液物性測定結果ｐＨ回転粘度　　　　　浸透圧　膠質浸透圧（ｍＰａ　
−ｓ　、　３７°Ｃ）”　　（ｍＯｓｍ）　　（ｓ＋＋
Ｈｇ）”７．４　　８．４（７，５）　　　　　　３２
０　　１．０（３５）７．５（１８，７５）６．８（３７，５）６、１　（７５）５．６　（１５０） ■）括弧内の値はせん断速度（ｓｈａｒｅ　ｒａｔｅ）
（ｓ”）を表す。

２）括弧内の値は小胞体溶液に３重１２のデキスランを
添加し膠質浸透圧を補正した場合の値を示す。

参考例３実施例７で得られたヘモグロビンを内胞した重合化小胞
体の安定性を評価した。

該溶液を、４°Ｃの暗所で３ケ月保存後、該小胞体粒子
の平均粒径は全く変化しなかった。また、ヘモグロビン
の漏出も全くなかった（ヘモグロビンの漏出量の測定は
、セファロースＣＬ−４Ｂカラムを用いて行った。）。

該溶液を一８０℃で凍結後、室温で溶解してもヘモグロ
ビンの小胞体からの漏出は全く認められなかった、また
、粒径の変化も全くなかった。これに対し、未重合小胞
体では内胞されたヘモグロビンの約３０ｚが小胞体外へ
漏出した。

該溶液に界面活性剤（トリトンＸ−１００）を２０重量
２添加しても重合化小胞体は安定であり、ヘモグロビン
の小胞体からの漏出もない。

以上の結果から、実施例７で合成した重合化小胞体は物
理的に極めて安定であること、また長期間保存可能であ
ることが明らかにされた。

参考例４実施例７で得られたヘモグロビンを内胞した重合化小胞
体の表面電荷の測定の一つの方法として、ゼータ電位を
測定した（装置ｉ：Ｐｅｎ　Ｋｅ１１社、Ｌａ５ｅｒＺ
ｅｅ　％デル５０１）　、該小胞体の電位は、−１７，
１ｍＶであり、赤血球のゼータ電位にほぼ等しい。

〔発明の効果〕

本発明の高分子小胞体は、負電荷成分である重合性脂肪
酸が重合に関与して形成されたものである為、生体成分
との間の相互作用を最小限に止めることができ、しかも
ヘモグロビンの内包効率を高めることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）重合性リン脂質、コレステロール、重合性脂肪酸
からなる小胞体の重合物である高分子小胞体。
（２）ヘモグロビン水溶液を内包した請求項１記載の高
分子小胞体。
（３）重合性リン脂質とコレステロールのモル比が１：
２乃至３：２であるところの請求項１又は請求項２のい
ずれかに記載の高分子小胞体。
（４）重合性リン脂質と重合性脂肪酸のモル比が５：１
乃至３：１であるところの請求項１乃至請求項３のいず
れかに記載の高分子小胞体。
（５）重合性リン脂質として下記一般式（ I ）又は一
般式（II）で表される化合物を用いると共に重合性脂肪
酸として下記一般式（III）で表される化合物を用いた
ことを特徴とする請求項１乃至請求項４に記載の高分子
小胞体（但し、式中ｎは１２，１０，８又は６の整数を
表す）。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（III）