DE69420876T2

DE69420876T2 - Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin sowie Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE69420876T2
Application number: DE69420876T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Goto; Takeshi Okamoto
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-03-18
Publication date: 2000-04-20
Anticipated expiration: 2014-03-19
Also published as: EP0615747A1; US5688526A; DE69420876D1; EP0615747B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet industrieller Nutzbarkeit

Die Erfindung bezieht sich auf ein Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin, das für die Verabreichung an einen Organismus geeignet ist. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin, in dem das eingekapselte Hämoglobin nach der Verabreichung an einen Organismus im Laufe der Zeit eine auf ein Mindestmaß herabgesetzte Oxidation erfährt.

Stand der Technik

Typische Blutsubstitute schließen im gegenwärtigen Gebrauch Plasmaexpander bzw. Plasmaersatzstoffe, wie Gelatinelysatlösungen, Dextranlösungen und Hydroxyethylstärkelösungen (HES) ein. Solche Blutsubstitute stellen jedoch Zubereitungen dar, die entwickelt wurden, um das Plasma in Blutgefäßen zu ergänzen, und die Dynamik der Blutzirkulation bei großen Blutungen oder anderen Notfällen aufrecht zu erhalten. Deshalb sind solche Blutsubstitute ungeeignet, natürliche Erythrozyten mit der ihnen innewohnenden Fähigkeit zum Sauerstofftransport zu ersetzen. Abgesehen von solchen Plasmaexpandern, schreitet die Entwicklung künstlicher Sauerstoffträger für die Verwendung als Blutsubstitute, die mit der Fähigkeit zum Sauerstofftransport versehen sind, die derjenigen natürlicher Erythrozyten entspricht, voran.
Auf der Anfangsstufe dieser Entwicklung wurden chemisch synthetisierte Produkte, die von einer Fluorkohlenstoff- Emulsion (Perfluor-Chemikalie, PFC, oft wird darauf als Fluorkohlenstoff Bezug genommen) mit einer großen Fähigkeit zum Lösen von Sauerstoff (das 20fache derjenigen von Wasser) Gebrauch machten, untersucht. Es wurde jedoch gefunden, das solche chemisch synthetisierten Produkte Unzulänglichkeiten, wie eine unzureichende Fähigkeit für den Sauerstofftransport als auch eine Anhäufung im Organismus, aufwiesen.
Andererseits wurden Versuche unternommen, Hämoglobin aus natürlichen Erythrozyten für den Sauerstoffträger zu verwenden. Die Verwendung solch eines freien Hämoglobins unter freien Bedingungen gestaltet sich jedoch in der Praxis schwierig, da es nicht nur eine äußerst kurze Halbwertszeit (nicht mehr als 4 Stunden) im lebenden Körper, sondern auch eine geringe Fähigkeit zum Sauerstofftransport nach Außen und Giftigkeit für die Nieren aufweist. Dementsprechend verschoben sich die Interessen an der Entwicklung hin zu modifizierten Hämoglobinen (stabilisiertes Hämoglobin, polymerisiertes Hämoglobin u. ä.) und zu in Liposomen eingelagerten Hämoglobinen, in denen die mit dem freien Hämoglobin verbundenen Probleme beseitigt worden waren.
Ein typisches Hämoglobin einschließendes beziehungsweise Hämoglobin einkapselndes Liposom, das mittels eines Dünnfilmverfahrens erzeugt wurde, wird von Miller (US-Patent Nr. 4,133,874) beschrieben. In diesem Verfahren werden die Hämoglobin einschließenden Liposome durch Lösen eines liposom-bildenden Lipids in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, das Abdestillieren des organischen Lösungsmittels von der resultierenden Lösung, um einen Dünnfilm des Lipids zu bilden, die Zugabe einer Hämoglobinlösung, die durch Hämolyse erhalten wurde, zu dem so gebildeten Dünnfilm, das kräftige Rühren der Lösung, um Mehrschichten-Liposomen zu bilden, und die Ultraschallbehandlung der so gebildeten Mehrschichten-Liposomen, erzeugt. Der Vorteil eines solchen Verfahrens besteht darin, daß es aufgrund der verringerten Zeitdauer des Kontakts mit dem Sauerstoff nur zu einer relativ geringen Denaturierung des Hämoglobins kommt.
Ein Verfahren zur Haltbarmachung eines Materials mit einer wasserabhängigen Struktur, das das In-Kontakt-Bringen des Materials mit einer wässrigen Lösung einer Polyhydroxy- Verbindung und das anschließende Entfernen des Wassers aus dem Material umfaßt, ist in der Patentschrift WO87/05300 offenbart.
Die Patentschrift EPO 158 684 bezieht sich auf eine Kontrollflüssigkeit für eine Blut-Gas-Analysiervorrichtung, die Hämoglobin, ein Mittel zur Pufferung des pH-Wertes und ein reduziertes Pyridinnucleotid umfaßt, die geeignet ist, an einer Umsetzung teilzunehmen, die Methämoglobin zu normalem Hämoglobin reduziert.
Es ist die reversible Bindung eines Sauerstoffmoleküls an das Hämoglobin, die für die Fähigkeit zum Sauerstofftransport der künstlichen Erythrozyten, die aus Hämoglobin hergestellt wurden, verantwortlich ist, und solch eine Fähigkeit zum Sauerstofftransport tritt nur dann auf, wenn das Eisen des Hämoglobins (Eisenporphyrin IX) in einem zweiwertigen Zustand vorliegt (d. h. Fe²&spplus;). Hämoglobin unterliegt jedoch im Verlauf seiner reversiblen Oxygenierung einer Oxidation und geht in den dreiwertigen Zustand (Fe³&spplus;) über, das sogenannte Hämiglobin oder Methämoglobin, das kein Sauerstofftransportvermögen mehr besitzt. Normale Erythrozyten weisen einen Mechanismus auf, der es ihnen ermöglicht, die vorstehend erwähnte Hämoglobinoxidation zu unterdrücken. Die als künstlicher Sauerstoffträger hergestellte Hämoglobinlösung weist jedoch keinen solchen Oxidations-Unterdrückungsmechanismus auf, wie er in natürlichen Erythrozyten angetroffen wird. Dementsprechend nimmt der Anteil des oxidierten Hämoglobins im Laufe der Zeit zu. Angesichts dieser Situation wurde es bei der Verwendung von natürlichem Hämoglobin oder seinen Derivaten für ein medizinisches Produkt oder Reagenz erforderlich, dem Produkt oder dem Reagenz ein Antioxidans oder ein Reduktionsmittel hinzuzufügen, wie Natriumsulfit, Natriumhydrogensulfit, Eisen(II)-sulfat oder Natriumethylendiamintetraacetat, die für einen Organismus giftig sind. Es war ebenfalls üblich, die reduzierte Form des Glutathions, Ascorbinsäure, ein Tocopherol, einen Zucker, eine Aminosäure oder ähnliches hinzuzufügen. Diese Additive erwiesen sich jedoch in bezug auf eine Verhinderung der Hämoglobinoxidation als unzureichend, und insbesondere erwiesen sie sich in bezug auf eine Verhinderung der Hämoglobinoxidation nach der Verabreichung an einen Organismus als unzureichend.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht, die den Oxidations/Reduktions-Zyklus des Hämoglobins in einem natürlichen Erythrozyten zeigt.
Fig. 2 ist eine schematische Ansicht, die den Oxidations/Reduktions-Zyklus des Hämoglobins in dem Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin der Erfindung zeigt.
Fig. 3 zeigt die Wirkungen der Methämoglobinreduktion der Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin der Erfindung und des Vergleichsbeispiels.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Angesichts der vorstehend beschriebenen Situation ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin zur Verfügung zu stellen, in dem die Hämoglobinoxidation im Laufe der Zeit, insbesondere die Hämoglobinoxidation nach der Verabreichung an einen Organismus, unterdrückt wird.
Die vorstehend beschriebenen Probleme werden durch das Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin gelöst, das wie nachstehend beschrieben aufgebaut ist.
(1) Eine Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin, die ein Liposom, das ein Lipid umfaßt, und eine in dem Liposom eingeschlossene Hämoglobinlösung umfaßt, wobei die Hämoglobinlösung enzymatische Aktivitäten aufweist, die von natürlichen Erythrozyt- und/oder Oxidations-Reduktions- Enzymaktivitäten herrühren, und der Hämoglobinlösung mindestens ein Substrat für eine enzymatische Reaktion hinzugefügt wurde, die die reduzierte Form des Nicotinamid-adenindinucleotids (NADH) und/oder die reduzierte Form des Nicotinamid-adeninphosphats (NADPH) erzeugt, wobei das Substrat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Äpfelsäure, Oxalessig säure, Citronensäure, Isocitronensäure, α-Ketoglutarsäure, Succinyl-CoA, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Phosphoenolbrenztraubensäure, Acetyl-CoA und Glutaminsäure besteht.
(2) Eine Suspension eines Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach (I), in der die Hämoglobinlösung desweiteren eine Organophosphatverbindung umfaßt.
Die Organophosphatverbindung kann bevorzugt in einer Menge von 0,05 bis 4 Mol pro Mol des Hämoglobins zugegeben sein.
Die Organophosphorverbindung kann bevorzugt Inositolhexaphosphat sein.
(3) Eine Suspension eines Liposoms mit eingekapselten Hämoglobin nach (1) oder (2), in der dem Lipid ein Tocopherolanaloges oder ein Derivat davon hinzugefügt worden ist.
Das Tocopherolanaloge oder ein Derivat davon kann bevorzugt in einer Menge von 0,5 bis 4,5 Mol-% des gesamten Lipidgehaltes der Liposommembran hinzugefügt sein.
(4) Eine Suspension eines Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach einem der Punkte (1) bis (3), wobei der Hämoglobinlösung desweiteren mindestens ein Enzym hinzugefügt wurde, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH), der oxidierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NAD), der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) und der oxidierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADP+) besteht.
Das Enzym kann bevorzugt in einer Menge von 0,1 bis 25 Mol pro einem Mol Hämoglobin hinzugefügt sein.
(5) Ein Verfahren zur Herstellung einer Suspension eines Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach einem der Punkte (1) bis (4), das die nachstehenden Schritte umfaßt:
(a) Die Herstellung einer konzentrierten Hämoglobinlösung mit einer Hämoglobinkonzentration von 30 bis 60 Gewichts-% mittels der Hämolyse gespülter Erythrozyten, der Entfernung des Stroma-Bestandteils und der Konzentrierung der stromafreien Hämoglobinlösung;
(b) die Zugabe eines Substrats für eine enzymatische Reaktion, die mindestens ein Element erzeugt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH) und der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) besteht, zu der konzentrierten Hämoglobinlösung, und Rühren der resultierenden Hämoglobinlösung; und
(c) die Liposomerisierung der Hämoglobinlösung unter gemäßigten Bedingungen, um zu verhindern, daß die Enzyme in der Hämoglobinlösung ihre Aktivität verlieren.
Die Liposomerisation kann bevorzugt unter gemäßigten Bedingungen durch die ein- bis mehrmalige Injizierung der Hämoglobinlösung aus einer Düse bei einer Temperatur von bis zu 40ºC und einem Druck in einem Bereich von 50 bis 1.800 kg/cm² erfolgen.
Mit den Begriffen "Lipomerisierung" und "Lipomerisation", die in der Beschreibung verwendet werden, sind "das Bilden von Liposomen" und "die Bildung von Liposomen" gemeint.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In der Erfindung wird der Verlust der Fähigkeit zum Sauerstoff-Transport des Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin auf Grund einer Oxidation des Hämoglobins im Laufe der Zeit durch die Zugabe eines Substrates für eine enzymatische Reaktion, durch die reduzierte Form des Nicotinamid-adenindinucleotids (NADH) und/oder die reduzierte Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) erzeugt wird, zu der Hämoglobinlösung verhindert, wodurch das oxidierte Hämoglobin reduziert wird, das im Laufe der Zeit erzeugt wurde.
Das Substrat für eine enzymatische Reaktion, durch die reduzierte Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH) und/oder die reduzierte Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) erzeugt wird, das in der Erfindung verwendet werden kann, erzeugt NADH oder NADPH als Ergebnis von mindestens einer enzymatischen Reaktion, die durch ein einzelnes Enzym oder durch eine Kombination von Enzymen, die in dem Organismus vorhanden sind, gefördert wird. Ein bevorzugtes Substrat ist Äpfelsäure, da es NADH durch eine einzige enzymatische Reaktion erzeugt. Andere organische Säuren, die Äpfelsäure mittels des Citronensäure-Zyklus (Tricarbonsäure- Zyklus (TCA-Zyklus), Krebs-Zyklus) erzeugen, können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel Oxalessigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, α-Ketoglutarsäure, Succinyl-Co-A, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Phosphoenolbrenztraubensäure, Acetyl-Co-A und Glutaminsäure. Es sei darauf hingewiesen, daß die Verwendung von Substraten in einer Kombination aus zwei oder mehreren in einigen Fällen ebenfalls geeignet ist.
In der Erfindung kann das Substrat für eine enzymatische Reaktion, die NADH und/oder NADPH erzeugt, in einer Menge von 0,1 bis 25 Mol, bevorzugt in einer Menge von 1 bis 20 Mol und bevorzugter in einer Menge von 4 bis 12 Mol pro 1 Mol Hämoglobin hinzugefügt sein. Die Zugabe des Substrates in einer Menge von weniger als 0,1 Mol pro 1 Mol Hämoglobin ist zur Verhinderung der Bildung von Methämoglobin unzureichend. Eine Zugabe des Substrats in einer Menge von größer 25 Mol pro 1 Mol Hämoglobin würde die Fließfähigkeit der Hämoglobinlösung verändern und zu einer verringerten Menge an in dem Liposom eingekapselter Hämoglobinlösung führen, und somit zu einer verringerten Liposomerisationswirkung.
Das für die Bildung des Liposoms verwendete Lipid ist nicht auf einen bestimmten Typ beschränkt, solange es in der Lage ist, das Liposom zu bilden, und es können für diesen Zweck sowohl natürliche als auch synthetische Lipide verwendet werden. Beispiele für Lipide schließen Lezithin (Phosphatidylcholin), Phosphatidylethanolamin, Phosphatidinsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Sphingomyelin, Cardiolipin und hydrierte Derivate davon ein, die entweder alleine oder als Kombination aus zwei oder mehreren verwendet werden können.
Bei der Herstellung der Hämoglobinlösung, die in der Erfindung verwendet wird, werden Erythrozyten zunächst gemäß dem üblichen Verfahren in einer Pufferlösung hämolysiert und das Stroma (Erythrozyten-Membran) wird daraus entfernt. Die resultierende stromafreie wäßrige Hämoglobinlösung wird dann unter Verwendung einer Membran, die für eine Fraktionierung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von 10.000 geeignet ist, mittels Ultrafiltration auf eine Konzentration von mindestens 30% (w/v = weight to volume, Gewicht zu Volumen), bevorzugt auf eine Konzentration von 30 bis 60% (w/v), und bevorzugter auf eine Konzentration von 40 bis 50% (w/v) eingestellt. Die Hämoglobinlösung wird so konzentriert, daß sie innerhalb dieses Bereiches liegt, um die Menge an dem in dem Liposom eingeschlossenen Hämoglobin in dem liposomerisierbaren Konzentrationsbereiches möglichst groß werden zu lassen, da die Menge des nach außen transportierten Sauerstoffs mit der Zunahme des in dem Liposom eingeschlossenen Hämoglobins zunimmt.
In der Erfindung ist es ebenfalls bevorzugt, der Hämoglobinlösung eine Organophosphatverbindung hinzuzufügen, wie Inositolhexaphosphat, Tetrapolyphosphat, Pyridoxal-5'-phosphat oder ATP, um die Menge des nach außen transportierten Sauerstoffs einzustellen. Bevorzugt wird die Organophosphatverbindung der Hämoglobinlösung in einer Menge von 0,5 Mol bis 1,5 Mol pro einem Mol Hämoglobin hinzugefügt. Die Menge kann in Übereinstimmung mit dem Typ der verwendeten Verbindung differieren.
Für die in der Erfindung verwendeten Erythrozyten gibt es, wenn das Liposom mit dem eingekapselten Hämoglobin der Erfindung an Menschen verabreicht wird, keine Einschränkung auf einen bestimmten Typ, solange sie menschlichen Ursprungs sind. Obwohl die Verwendung frischer Erythrozyten bevorzugt ist, sind auch Erythrozyten geeignet, die länger als 50 Tage bei 4ºC gelagert wurden.
Zusätzlich zu dem Substrat für eine enzymatische Reaktion kann der Hämoglobinlösung der Erfindung desweiteren mindestens 1 Enzym zugefügt worden sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der reduzierten Form des Nicotinamidadenin-dinucleotids (NADH), der oxydierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NAD), der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) und der oxidierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphophats (NADP) besteht. Das Enzym kann in einer Menge von 0,1 bis 25 Mol pro 1 Mol Hämoglobin zugefügt sein.
Dem Liposom der Erfindung kann ein Tocopherolanaloges hinzugefügt worden sein, namentlich Vitamin E, um eine Oxidation zu verhindern. Tocopherol besitzt vier Isomere, α, β, γ und 5, und jedes dieser Isomere kann in der Erfindung verwendet werden. Das Tocopherol kann in einer Menge von 0,5 bis 4,5 Mol-%, und bevorzugt von 1,0 bis 2,0 Mol-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Lipides, hinzugefügt sein.
In der Erfindung kann ein Ladungsdonator (charge donor), zum Beispiel ein Sterol oder eine Fettsäure, als Bestandteil der Liposommembran hinzugefügt sein, um die Filmstruktur zu festigen und die Verdauungszeit nach ihrer Verabreichung einzustellen.
Das Liposom mit dem eingekapselten Hämoglobin der Erfindung kann dadurch hergestellt werden, daß gespülte Erythrozyten einer Hämolyse unterzogen werden, der Stroma-Bestandteil (Erythrozytmembran) entfernt wird, die Hämoglobinlösung auf eine Konzentration von 30 bis 60% (w/v) eingestellt, wird; Äpfelsäure zu der konzentrierten Hämoglobinlösung gegeben und die gemischte Lösung gerührt wird, und die Lösung unter gemäßigten Bedingungen liposomerisiert wird, um zu verhindern, daß die Enzyme in der Hämoglobinlösung ihre enzymatische Aktivität verlieren. Die gemäßigten Bedingungen zur Verhinderung eines Verlusts der enzymatischen Aktivität schließen eine ein- bis mehrmalige Injizierung aus einer Düse bei hohem Druck, 50 bis 1.800 kg/cm², und bevorzugt 80 bis 1.200 kg/cm² ein. Die Liposomerisation sollte bei einer Temperatur von bis zu 40ºC durchgeführt werden. Die Temperatur wird während der Liposomerisation bei 40ºC oder weniger, bevorzugt bei 0ºC, gehalten. Beispielsweise kann die Liposomerisation bei einem Druck von 480 bis 1.450 kg/cm² durchgeführt werden, wenn die Hochdruck-Injektionsemulgiervorrichtung, die verwendet wird, ein Microfluidizer 110Y (Microfluidizer Co.) ist, oder bei einem Druck von 80 bis 200 kg/cm², wenn ein Parr-Zellzerteiler (Parr Co.) verwendet wird. Es sei darauf hingewiesen, daß in jedem Fall die Liposomerisation bei einer Temperatur von bis zu 40ºC durchzuführen ist, und bevorzugt bei einer Temperatur von bis zu 4ºC, bevorzugter bei einer Temperatur von 0ºC.
In natürlichen Erythrozyten unterliegt das Hämoglobin einer reversiblen Hämoglobin-Methämoglobin-Reaktion. Genauer gesagt wird das Hämoglobin im Laufe der Zeit zu Methämoglobin oxidiert, wobei das Methämoglobin jedoch gleichzeitig durch die Wirkung von Enzymen in den Erythrozyten zu Hämoglobin reduziert wird, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Sobald das Hämoglobin jedoch aus den natürlichen Erythrozyten entfernt wird, wie dies in der Erfindung der Fall ist, um in ein Liposom eingekapselt zu werden, ist der Methämoglobin-Reduktionsmechanismus nicht länger aktiv und das Hämoglobin, das in Methämoglobin umgewandelt wurde, wird nicht mehr reduziert. Die Fähigkeit zum Sauerstofftransport geht dabei verloren. Unter der Annahme, daß dieser Verlust des Methämoglobin-Reduktionsmechanismus durch einen Verlust der enzymatischen Aktivitäten auf Grund während der Liposomerisation angewandter übermäßiger physikalischer Energie oder Wärme verursacht wird, wurden die Liposomerisationsbedingungen untersucht und Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin unter gemäßigteren Bedingungen erzeugt, um die enzymatische Aktivität der Hämoglobinlösung aufrecht zu erhalten. Genauer gesagt wurden Liposomen mit eingekapselten Hämoglobin durch das Injizieren der Lösung durch eine Düse, ein- oder mehrmals, bei einem Druck von 50 bis 1.600 kg/cm², und bevorzugter von 80 bis 1.200 kg/cm² hergestellt. Bei der Verabreichung des so her gestellten Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin erfuhr das Hämoglobin jedoch noch eine Oxidation.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung unternahmen weitere intensive Studien und fanden heraus, daß solche eine Hämoglobinoxidation im Laufe der Zeit nach der Verabreichung an einen Organismus durch die Herstellung von Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin unter gemäßigten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, und die Zugabe eines Substrats für eine enzymatische Reaktion, bei der NADH und/oder NADPH erzeugt wird, zu der Hämoglobinlösung merklich unterdrückt werden kann.
Es wurde der Schluß gezogen, daß der Mechanismus für solch eine Unterdrückung der Hämoglobinoxidation ein wie nachstehend beschriebener Mechanismus ist, wobei die Erklärung anhand des Beispiels der Äpfelsäure gegeben wird. Wenn die Liposomerisation unter gemäßigten Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt wird, erfahren die Enzyme in der Hämoglobinlösung keinen Verlust ihrer enzymatischen Aktivitäten. Auf den Stufen der Hämoglobin-Isolierung mittels der Entfernung von Membranbestandteilen natürlicher Erythrozyten, oder der Reinigung und Konzentrierung des so isolierten Hämoglobins, gehen jedoch Substanzen verloren, die für die anschließenden enzymatischen Reaktionen erforderlich sind, wie Substrate für enzymatische Reaktionen oder Coenzyme mit einem Molekulargewicht von bis zu 10.000, was anschließend dazu führt, daß die enzymatische Methämoglobin-Reduktionsreaktion nicht stattfindet. Wenn Äpfelsäure zu der Hämoglobinlösung gegeben wird, dient die Äpfelsäure als Substrat für die enzymatische Reaktion zur Regenerierung des NADH, das für die Methämoglobin-Reduktionsreaktion erforderlich ist. Genauer gesagt wird NADH gleichzeitig mit der Umwandlung der Äpfelsäure in Oxalessigsäure mittels der Äpfelsäure-Dehydrogenase regeneriert, und dadurch eine Methämoglobin-Reduktionsreaktion induziert, die derjenigen in natürlichen Erythrozyten entspricht, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Es wurde der Schluß gezogen, daß die Hämoglobin-Oxidation im Laufe der Zeit dadurch verhindert wird.
Natürliche, reife Erythrozyten sind frei von Kernen und Organellen, wie Mitochondrien oder Ribosomen, und dementsprechend nicht in der Lage irgendein Protein oder Lipid zu synthetisieren. Da die reifen Erythrozyten von Mitochondrien frei sind, weisen sie keinen TCA-Zyklus (Citronensäure- Zyklus) auf, und das ATP (Adenosintriphosphat), das zur Beibehaltung ihrer Gestalt und Funktion erforderlich ist, wird hauptsächlich durch den Embden-Meyerhof-Weg (EMP, anaerober Glykolyse-Weg) erzeugt. Unter physiologischen Bedingungen wird Glucose mittels Hexokinase zu Glucose-6-phosphat phosphoryliert, und unter normalen Bedingungen werden 90% der Glucose durch den Embden-Meyerhof-Weg metabolisiert und die verbleibenden 5 bis 10% Glucose werden durch den Hexosemonophosphat-Nebenweg (shunt) (HMS oder HMP) metabolisiert.
Wie in den Beispielen gezeigt wird, bestätigten die Erfinder jedoch, daß einige in dem TCA-Zyklus eingeschlossene Enzyme in der stromafreien Hämoglobinlösung, die in der Erfindung hergestellt wird, vorhanden sind und ihre enzymatischen Aktivitäten nicht verloren gehen, obwohl im allgemeinen nicht zu erwarten ist, daß diese Enzyme in solch einer stromafreien Hömoglobinlösung auftreten.
Anders ausgedrückt, machten die Erfinder der Erfindung wirkungsvollen Gebrauch von dieser verbliebenen enzymatischen Aktivität, die von den natürlichen Erythrozyten herstammt, und ergänzten die Hämoglobinlösung mit notwendigen Substraten, gegebenenfalls mit Enzymen, um ein künstliches Mittel zum Sauerstofftransport vom Liposom-Typ, nämlich das Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin, herzustellen, das einen enzymatischen Methämoglobin-Reduktionsmechanismus aufweist, der dem natürlicher Eryhtrozyten analog ist.
Die Erfindung wird desweiteren unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele beschrieben.

BEISPIELE

Es sei darauf hingewiesen, daß verschiedene Stufen der Herstellung, solange nichts anderes angegeben ist, aseptisch unter gekühlten Bedingungen von 4ºC durchgeführt wurden. Die verwendeten Reagenzien und Instrumente waren sterilisiert worden und aseptisches, hochreines Wasser (mindestens 15 megΩ · C · cm bei 25ºC, pyrogenfrei), das keine verbliebenen Schwermetallionen oder anorganische Ionen enthielt, wurde für die Herstellung verwendet.

Beispiel 1

(1) Herstellung der konzentrierten, stromafreien Hämoalobinlösung (SFH-Lösung)

15 l (75 200 ml Beutel) eingedickter Erythrozyten wurden mit physiologischer Salzlösung unter Verwendung einer kontinuierlich arbeitenden Strömungszentrifuge gespült, um Plättchen, Leukozyten und andere Plasmabestandteile, die in den Erythrozyten enthalten waren, zu entfernen und grob gespülte Erythrozyten zu erhalten. Die grob gespülten Erythrozyten wurden desweiteren mit physiologischer Salzlösung unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,45 um gespült, und zu 5 l der so gespülten Erythrozyten wurden 10 l hypotonischer Phosphatpufferlösung (10 mM, pH-Wert 7,4) für die Hämolyse gegeben. Das resultierende Produkt wurde mit einer Plasma-Trennvorrichtung mit einer Porengröße von 0,45 um behandelt, um die Erythrozytenmembran (Stroma) zu entfernen, und durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,1 um für eine bakterielle Filtration gefiltert, um ungefähr 12 l einer stromafreien Hämoglobinlösung (SFH-Lösung) mit einer Hämoglobinkonzentration von 8% (w/v) zu erhalten. Die resultierende Lösung wurde mit einem Dialysiergerät vom Hohlfaser-Typ (TAF-10SS, Terumo Corporation) gegen einen 10 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl-piperazinyl)]ethansulfonsäure- Puffer (HEPES-Puffer) (pH-Wert 7,4) dialysiert, und anschließend mittels Ultrafiltration konzentriert, um ungefähr 1,8 l einer SFH-Lösung mit einer Hämoglobinkonzentration von 50% (w/v) zu erhalten.

(2) Zugabe von Reagenzien zu der konzentrierten SFH-Lösung

Zu 4 ml einer HEPES-Pufferlösung (50 mM, pH-Wert: 7,4) wurde Mononatriummalat (L-Äpfelsäure, Mononatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die der 4fachen molaren Menge des Hämoglobins in 100 ml der konzentrierten SFH-Lösung, die in dem vorstehend beschriebenen Schritt (1) hergestellt worden war, entsprach, und Natriumphytat (Inositolhexaphosphorsäure-dodecanatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die dem 0,8fachen der molaren Menge des Hämoglobins in der konzentrierten SFH-Lösung entsprach, gegeben. Die resultierende Lösung wurde zu 100 ml der konzentrierten SFH-Lösung gegeben und die resultierende Mischung wurde gerührt, bis die zugegebenen Reagenzien homogen in der Hämoglobinlösung eingearbeitet waren.

(3) Liposomerisation der mit Reagenzien gemischten Lösung

Zu 18 Gramm eines einheitlich gemischten Pulvers (Presome, Nippon Seika), das gereingtes, gesättigtes Phosphatidylcholin (HSPC) mit einem Hydrierungsgrad von 90%, Cholesterol (Chol), Myristinsäure (MA) und Tocopherol (TOC) in einem HSPC : Chol : MA : TOC-Molverhältnis von 7 : 7 : 2 : 0,28 umfaßte, wurde die gleiche Menge aseptisches, gereinigtes Wasser gegeben und die Mischung wurde auf eine Temperatur von 60 bis 70ºC erwärmt, um ein Aufquellen zu ermöglichen. Zu diesem so aufgequollenem Ausgangslipidmaterial wurden 100 ml der reagenzien-gemischten Lösung gegeben, die in dem vorstehenden Beispiel 1 (2) hergestellt worden war, und die Mischung wurde 30 Sekunden lang gerührt. Die so hergestellte lipidkonzentrierte SFH-Mischlösung wurde einem Microfluidizer 110Y (Microfluidics Co.) zugeführt, in dem die Liposomerisation in einem Eisbad und bei einem Druck von 12.000 psi (ungefähr 844 kg/cm²) erfolgte.

(4) Reinigung des Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin

Das Produkt von Beispiel 1(3) wurde mit und in einer gleichen Menge einer physiologischen Salzlösung und Dextran 40-Injektion verdünnt und suspendiert, und die resultierende Suspension wurde 30 Minuten lang bei 4ºC einer Zentrifugation mit 10.000 Upm (13.000 g) unterzogen. Die Liposomen mit der darin mit hoher Ausbeute eingekapselten Hämoglobinlösung wurden als das Zentrifugat gewonnen. Die überstehende Flüssigkeit, die das restliche freie Hämoglobin, das nicht liposomerisiert werden konnte, als auch die Ausgangslipidbestandteile enthielt, wurde durch Dekantieren oder Absaugen entfernt. Das vorstehend beschriebene Waschverfahren wurde solange wiederholt, bis mit dem bloßen Auge kein freies Hämoglobin mehr in der überstehenden Flüssigkeit erkannt werden konnte. Das resultierende Produkt wurde durch ein Durapore-Membranfilter (Polyvinylidendifluorid) (Minitan System, eine Plasma-Trennvorrichtung, die von Millipore Ltd. hergestellt wurde) mit einer Porengröße von 0,45 um filtriert, um die groben Teilchen in der Suspension zu entfernen. Das Filtrat wurde schließlich mit einem Dialysator vom Hohlfasertyp (TAF-10SS, Terumo K.K.) konzentriert und das Konzentrat wurde mit physiologischer Salzlösung auf eine Hämoglobinkonzentration von 10% (w/v) eingestellt, um ungefähr 80 ml einer gereinigten Suspension eines Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin herzustellen.

Beispiel 2

(1) Herstellung einer konzentrierten SFH-Lösung

Das Verfahren von Beispiel 1(1) wurde wiederholt, um eine konzentrierte SFH-Lösung herzustellen.

(2) Zugabe von Reagenzien zu der konzentrierten SFH-Lösung

Zu 8 ml einer HEPES-Pufferlösung (50 mM, pH-Wert: 7,4) wurde Mononatriummalat (L-Äpfelsäure, Mononatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die der 2fachen molaren Menge des Hämoglobins in 100 ml der konzentrierten SFH-Lösung, die in dem vorstehend beschriebenen Schritt (I) hergestellt worden war, entsprach, Natriumphytat (Inositolhexaphosphorsäure-dodecanatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die dem 0,8fachen der molaren Menge des Hämoglobins entsprach, und die oxidierte Form des β-NAD + (BMY., Qualität II, 98%) in einer molaren Menge, die dem 0,2fachen der molaren Menge des Hämoglobins entsprach, gegeben. Die resultierende Lösung wurde zu 100 ml der konzentrierten SFH-Lösung gegeben und die resultierende Mischung wurde solange gerührt, bis die zugegebenen Reagenzien homogen in der Hämoglobinlösung eingearbeitet worden waren.

(3) Liposomerisation der mit Reagenzien gemischten Lösung

Zu 18 Gramm eines einheitlich gemischten Pulvers (Presome, Nippon Seika), das gereingtes, gesättigtes Phosphatidylcholin (HSPC) mit einem Hydrierungsgrad von 90%, Cholesterol (Chol), Myristinsäure (MA) und Tocopherol (TOC) in einem HSPC : Chol : MA : TOC-Molverhältnis von 7 : 7 : 2 : 0,28 umfaßte, wurde die gleiche Menge aseptisches, gereinigtes Wasser gegeben und die Mischung wurde auf eine Temperatur von 60 bis 70ºC erwärmt, um ein Aufquellen zu ermöglichen. Zu diesem so aufgequollenem Ausgangslipidmaterial wurden 100 ml der reagenzien-gemischten Lösung gegeben, die in dem vorstehenden Beispiel 2 (2) hergestellt worden war, und die Mischung wurde 30 Sekunden lang gerührt. Die so hergestellte lipid-konzentrierte SFH-Mischlösung wurde einem Microfluidizer 110Y (Microfluidics Co.) zugeführt, in dem die Liposomerisation in einem Eisbad und bei einem Druck von 12.000 psi (ungefähr 844 kg/cm²) erfolgte.

(4) Reinigung des Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin

Das Produkt von Beispiel 2(3) wurde mit und in einer gleichen Menge einer physiologischen Salzlösung und Dextran 40-Injektion verdünnt und suspendiert, und die resultierende Suspension wurde 30 Minuten lang bei 4ºC einer Zentrifugation mit 10.000 Upm (13.000 g) unterzogen. Die Liposomen mit der darin mit hoher Ausbeute eingekapselten Hämoglobinlösung wurden als das Zentrifugat gewonnen. Die überstehende Flüssigkeit, die das restliche freie Hämoglobin, das nicht liposomerisiert werden konnte, als auch die Ausgangslipidbestandteile enthielt, wurde durch Dekantieren oder Absaugen entfernt. Das vorstehend beschriebene Waschverfahren wurde solange wiederholt, bis mit dem bloßen Auge kein freies Hämoglobin mehr in der überstehenden Flüssigkeit erkannt werden konnte. Das resultierende Produkt wurde durch ein Durapore-Membranfilter (Polyvinylidendifluorid) (Minitan System, Millipore Ltd.) mit einer Porengröße von 0,45 um filtriert, um die groben Teilchen in der Suspension zu entfernen. Das Filtrat wurde schließlich mit einem Dialysator vom Hohlfasertyp (TAF-10SS, Terumo K.K.) konzentriert und das Konzentrat wurde mit physiologischer Salzlösung auf eine Hämoglobinkonzentration von 10% (w/v) eingestellt, um ungefähr 80 ml einer gereinigten Suspension eines Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin herzustellen.

Beispiel 3

(1) Herstellung einer konzentrierten SFH-Lösung

(2) Zugabe von Reagenzien zu der konzentrierten SFH-Lösung

Zu 10 ml einer HEPES-Pufferlösung (50 mM, pH-Wert: 7,4) wurde Mononatriummalat (L-Äpfelsäure, Mononatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die der 4fachen molaren Menge des Hämoglobins in 100 ml der konzentrierten SFH-Lösung, die in dem vorstehend beschriebenen Schritt (1) hergestellt worden war, entsprach, Natriumphytat (Inositolhexaphosphorsäure-dodecanatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die dem 1fachen der molaren Menge des Hämoglobins entsprach, β-NADPW · Na&sub4; (Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.) in einer molaren Menge, die dem 1fachen der molaren Menge des Hämoglobins entsprach, und Natriumglucose-6- phosphat (Sigma Chem. Co.) in einer Menge, die 5 mM entsprach, gegeben. Die resultierende Lösung wurde zu der konzentrierten SFH-Lösung gegeben und die resultierende Mischung wurde gerührt, bis die zugegebenen Reagenzien homogen in der Hämoglobinlösung eingearbeitet worden waren.

(3) Liposomerisation der mit Reagenzien gemischten Lösung

Zu 18 Gramm eines einheitlich gemischten Pulvers (Presome, Nippon Seika), das gereingtes, gesättigtes Phosphatidylcholin (HSPC) mit einem Hydrierungsgrad von 90%, Cholesterol (Chol), Myristinsäure (MA) und Tocopherol (TOC) in einem HSPC : Chol : MA : TOC-Molverhältnis von 7 : 7 : 2 : 0,28 umfaßte, wurde die gleiche Menge aseptisches, gereinigtes Wasser gegeben und die Mischung wurde auf eine Temperatur von 60 bis 70ºC erwärmt, um ein Aufquellen zu ermöglichen. Zu diesem so auf gequollenen Ausgangslipidmaterial wurden 100 ml der reagenzien-gemischten Lösung gegeben, die in dem vorstehenden Beispiel 3(2) hergestellt worden war, und die Mischung wurde 30 Sekunden lang gerührt. Die so hergestellte lipid-konzentrierte SFH-Mischlösung wurde einer Parr-Vorrichtung zur Zellzerstörung (Parr Co.) zugeführt, und mittels Heliumgas wurde ein Druck von 100 kg/cm² ausgeübt, wobei der Druck 30 Minuten lang beibehalten wurde. Die Liposomerisation erfolgte durch die Injektion der Mischlösung aus der Parr- Vorrichtung zur Zellzerstörung durch eine Düse in einem Eisbad, wobei das gleiche Druckniveau beibehalten wurde.

(4) Reinigung des Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin

Das Produkt von Beispiel 3(3) wurde mit und in einer gleichen Menge einer physiologischen Salzlösung und Dextran 40-Injektion verdünnt und suspendiert, und die resultierende Suspension wurde 30 Minuten lang bei 4ºC einer Zentrifugation mit 10.000 Upm (13.000 g) unterzogen. Die Liposomen mit der darin mit hoher Ausbeute eingekapselten Hämoglobinlösung wurden als das Zentrifugat gewonnen. Die überstehende Flüssigkeit, die das restliche freie Hämoglobin, das nicht liposomerisiert werden konnte, als auch die Ausgangslipidbestandteile enthielt, wurde durch Dekantieren oder Absaugen entfernt. Das vorstehend beschriebene Waschverfahren wurde solange wiederholt, bis mit dem bloßen Auge kein freies Hämoglobin mehr in der überstehenden Flüssigkeit erkannt werden konnte. Das resultierende Produkt wurde durch ein Durapore-Membranfilter (Polyvinylidendifluorid) (Minitan System, Millipore Ltd.) mit einer Porengröße von 0,45 um filtriert, um die groben Teilchen in der Suspension zu entfernen. Das Filtrat wurde schließlich mit einem Dialysator vom Hohlfasertyp (TAF-10SS, Terumo K.K.) konzentriert und das Konzentrat wurde mit physiologischer Salzlösung auf eine Hämoglobinkonzentration von 10% (w/v) eingestellt, um ungefähr 80 ml einer gereinigten Suspension eines Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin herzustellen.

Vergleichsbeispiel 1

Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin wurden durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1 hergestellt, außer daß die Hämoglobinlösung kein zugefügtes Natrium-L-Malat enthielt und die Liposomerisation unter Verwendung eines Waring- Mischers unter den nachstehend angegebenen Bedingungen erfolgte.

Liposomerisationsbedingungen unter Verwendung eines Warina- Mischers

Warling-Mischer: Warling Co. Blender 7010S
Volumen der SFH-Mischlösung: 200 ml
Menge des Lipids: 36 g (mit der gleichen Menge an aseptischen, gereinigten Wasser aufgequollen)
Drehgeschwindigkeit: 15.000 Upm
Behandlungsdauer: 30 Minuten
Ein Zyklus aus (1) einer 3minütigen Behandlung und (2) einem 10minütigen Abkühlen bei 4ºC wurde wiederholt.
Die in den Beispielen 1 bis 3 und dem Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin wurden mittels des nachstehend beschriebenen Verfahrens beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und in Fig. 3 gezeigt.

Messung der Hämoglobinoxidation nach 24 Stunden (in vivo)

Die so hergestellten Suspensionen von Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin wurden so eingestellt, daß sich ein Hämoglobingehalt von 5% (w/v) ergab. Einer männlichen ICR- Maus, die 5 Wochen alt war, wurden durch ihre Schwanzvene 1 ml der Liposomsuspension verabreicht. Nach 24 h wurde das gesamte Blut aus ihrer großen Bauchvene gewonnen, und die Oxidationsgeschwindigkeit wurde mittels des nachstehend beschriebenen Verfahrens berechnet.
Die Liposomen mit eingekapselten Hämoglobin sind im Vergleich zu natürlichen Erythrozyten beständiger gegenüber einer Veränderung des osmotischen Drucks, und die Abtrennung der Liposomen mit eingekapselten Hämoglobin von den natürlichen Erythrozyten erfolgte unter Nutzung dieser Eigenschaft. Genauer gesagt wurde das gesamte gewonnene Blut, dem Heparin zugefügt worden war, mit dem 8 bis 10 fachen Volumen hochreinem Wasser gemischt, um den natürlichen Maus-Erythrozyten zu gestatten, eine Hämolyse zu erfahren. Die Mischung wurde dann einer Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation mit 18.000 Upm, 30 Minuten lang, bei einer Temperatur von 4ºC unterzogen, um die Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin als das Zentrifugat zu gewinnen. Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde 3mal wiederholt, um die Blutbestandteile vollständig aus der Probe zu entfernen. Zu der so erhaltenen Probe wurden 2,0 ml eines 10%-igen (w/v) Triton-X100-HEPES- Puffers (0,5 M, pH-Wert 7,4) gegeben, und die Mischung wurde ungefähr 1 Minute lang heftig gerührt. Der Mischung wurden auch 2 ml Freon hinzugefügt, und die Mischung wurde ungefähr eine weitere Minute lang gerührt. Die resultierende Lösung wurde 15 Minuten lang mit 3.000 Upm zentrifugiert und 1 ml des HEPES-Puffers wurde zu ungefähr 1,8 ml der überstehenden Flüssigkeit hinzugefügt. Das Absorptionsspektrum des resultierenden Produktes im sichtbaren Bereich (460 nm bis 700 nm) wurde ausgewertet, um die Geschwindigkeit der Oxidation im Laufe der Zeit zu berechnen.
Die Konzentration für das Oxyhämoglobin, das Methämoglobin und das Hämichrom wurde mittels Multiwellenlängen-Spektroskopie (700 nm, 630 nm, 577 nm und 560 nm) in Übereinstimmung mit den vorhergehend gemessenen Werten aus der Hämoglobin- Absorptionskurve (wie nachstehend angegeben) berechnet.
OxyHb (uM) = 29.8 · ΔAbs (577 nm) - 9.8 · ΔAbs (630 nm) - 22.2 · ΔAbs (560 nm)
MetHb (uM) = 7 · ΔAbs (577 nm) + 76.8 · ΔAbs (630 nm) - 13.8 · ΔAbs (560 nm)
Hämichrom (uM) = -33.2 · ΔAbs (577 nm) - 36 · ΔAbs (630 nm) + 58.2 · ΔAbs (560 nm),
unter der Bedingung, daß
ΔAbs (577 nm) = Abs (577 nm) - Abs (700 nm)
ΔAbs (630 nm) = Abs (630 nm) - Abs (700 nm)
ΔAbs (560 nm) = Abs (560 nm) - Abs (700 nm). Tabelle 1 Zunahme in 24 Stunden
Hb: Hämoglobin; S. A.: Standardabweichung;
* Methämoglobin + Hämichrom.
Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 1 hervorgeht, ist die Oxidation des Hämoglobins der Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin, die in den Beispielen 1, 2 und 3 gemäß der Erfindung erhalten wurden, im Vergleich zu derjenigen der Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin, die in Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurden, nach einer vorgegebenen Zeitdauer deutlich geringer.

Beispiel 4

(1) Herstellung einer an Methämoglobin reichen, konzentrierten SFH-Lösung

Die konzentrierte SFH-Lösung, die in Beispiel 1 (1) hergestellt worden war, wurde 4 Tage lang bei 37ºC inkubiert, um eine konzentrierte SFH-Lösung mit einem Methämoglobingehalt von 35% herzustellen. Zu der so hergestellten, an Methämoglobin reichen Lösung wurde eine frische, konzentrierte SFH-Lösung mit einem Methämoglobingehalt von nicht größer als 2% hinzugefügt, um eine an Methämoglobin reiche, konzentrierte SFH-Lösung mit einem Methämoglobingehalt von 17% herzustellen.

(2) Zugabe von Reagenzien zu der an Methämoglobin reichen, konzentrierten SFH-Lösung

Zu 8 ml einer HEPES-Pufferlösung (50 mM, pH-Wert: 7,4) wurde Mononatriummalat (L-Äpfelsäure, Mononatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die der 4fachen molaren Menge des Hämoglobins in 100 ml der konzentrierten SFH-Lösung, die in dem vorstehend beschriebenen Schritt (I) hergestellt worden war, entsprach, Natriumphytat (Inositolhexaphosphorsäure-dodecanatriumsalz, SIGMA Chem. Co.) in einer molaren Menge, die dem 0,8fachen der molaren Menge des Hämoglobins entsprach, die oxidierte Form des β-NAD+ (β-Nicotinamid-adenin-dinucleotiddinatriumsalz, oxidiert, BMY., Qualität II, 98%) in einer molaren Menge, die dem 0,2fachen der molaren Menge des Hämoglobins entsprach, und die reduzierte Form des β-NADH (β-Nicotinamid-adenin-dinucleotiddinatriumsalz, reduziert, BMY, Qualität II, 98%) in einer molaren Menge, die dem 0,2fachen der molaren Menge des Hämoglobins entsprach, gegeben. Die resultierende Lösung wurde zu 100 ml der methämoglobinreichen, konzentrierten SFH-Lösung gegeben und die resultierende Mischung wurde solange gerührt, bis die zugegebenen Reagenzien homogen in der Hämoglobinlösung eingearbeitet worden waren.

(3) Liposomerisation der mit Reagenzien gemischten Lösung

Die so hergestellte, gemischte Lösung wurde durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1 (3) liposomerisiert.

(4) Reinigung des Liposoms mit eingekapseltem Hämoglobin

Die so hergestellten Liposomen wurden durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1 (4) gereinigt.

Vergleichsbeispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt, außer daß Natriumphytat gleicher Menge das einzige Reagenz war, das dem HEPES-Puffer in Schritt (2) hinzugefügt wurde.

Hämoglobin-Oxidation unmittelbar nach der Herstellung

Die Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin, die in Beispiel 4 und Vergleichsbeispiel 3 hergestellt worden waren, wurden in bezug auf die Hämoglobin-Oxidation unmittelbar nach ihrer Herstellung durch die Messung ihrer Absorptionsspektren mittels Multiwellenlängen-Spektroskopie beurteilt, um den Oxidationsgrad zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Hb: Hämoglobin;
Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse machen deutlich, daß im Falle der Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin von Beispiel 4, denen vor der Liposomerisation Malat, NAD&spplus; und NADH hinzugefügt worden war, die Konzentration des oxidierten Hämoglobins im Laufe ihrer Herstellung eine bemerkenswerte Abnahme erfuhr.

Experimente

Die Lipid-SFH-Mischlösung, die in Beispiel 1 (3) hergestellt worden war, wurde in bezug auf ihre NADH-Methämoglobin- Reduktase-Aktivität und ihre Malat-Dehydrogenase-Aktivität vor und nach der Liposomerisation mit dem Microfluidizer mittels des nachstehend beschriebenen Verfahrens beurteilt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 gezeigt.

Experiment 1

Messung der NADH-Methämoglobin-Reduktase-Aktivität

Die NADH-Methämoglobin-Reduktase-Aktivität wurde nach dem Verdünnen der Lipid-SFH-Lösung mit HEPES-Puffer (50 mM, pH- Wert 7,4, 37ºC) beurteilt. Die Beurteilung der enzymatischen Aktivität pro Einheit Hämoglobin erfolgte in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das in E. Beutler, NADH methemoglobin reductase (NADH-ferricyanid reductase) in E. Beutler (Herausgeber), Red Cell Metabolism: A Manual of Biochemical Methods, 3. Ausgabe, Grune und Stratton, Inc., Orleando, 1984, S. 81 bis 83, beschrieben ist.
Bei der Beurteilung der NADH-Methämoglobin-Reduktase- Aktivität in den Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin wurde die Liposom-Membran mit einem nicht-ionischen, grenzflächenaktiven Mittel, Octylglycopyranosid, löslich gemacht. Die Beurteilung erfolgte wie im Falle der Lösung vor der Liposomerisation. Tabelle 3

Experiment 2

Messung der Malat-Dehydrogenase-Aktivität

Die Malat-Dehydrogenase-Aktivität wurde nach dem Verdünnen der Lipid-SFH-Lösung mit einer HEPES-Pufferlösung (50 mM, pH-Wert 7,4, 37ºC) beurteilt. Die Beurteilung der enzymatischen Aktivität pro Einheit Hämoglobin erfolgte gemäß dem von H. U. Bergmeyer, A. F. Smith und E. Bermth, Malat-Dehydrogenase, in: H. U. Bergmeyer (Hrg.). Methods of Enzymatic Analysis, Bd. 3, 3. engl. Ausgabe, Verlag Chemie Weinheim, 1986, S. 163-175, beschriebenen Verfahren.
Bei der Beurteilung der Malat-Dehydrogenase-Aktivität in den Liposomen mit dem eingekapselten Hämoglobin wurde die Liposommembran mittels eines nicht-ionischen, grenzflächenaktiven Mittels, Octylglycopyranosid, aufgelöst. Die Beurteilung erfolgte wie im Falle der Lösung vor der Liposomerisation. Tabelle 4
Die NADH-Methämoglobin-Reduktase-Aktivität wurde ebenfalls in Übereinstimmung mit dem in dem vorstehenden Experiment 1 beschriebenen Verfahren für Liposomen gemessen, die durch eine Wiederholung des Verfahrens von Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden waren, außer daß während der Liposomerisation unter Verwendung des Warling-Mischers keine Kühlung erfolgte. Die gemessene NADH-Methämoglobin-Reduktase-Aktivität war gering, sie betrug nur 17,9%.
Wie in den Tabellen 3 und 4 gezeigt ist, wiesen die Liposomen mit eingekapselten Hämoglobin, die unter Verwendung des Microfluidizers hergestellt worden waren, eine verbliebene NADH-Methämoglobin-Reduktase-Aktivität von 99,6% und eine verbliebene Malat-Dehydrogenase-Aktivität von 81,4% auf. Die Vorteile einer Liposomerisation unter Verwendung des Microfluidizers werden durch diese Ergebnisse deutlich aufgezeigt. Es sei darauf hingewiesen, daß Malat-Dehydrogenase ein Enzym ist, das mit dem TCA-Zyklus assoziiert ist, und eine Rolle bei der Regeneration der reduzierten Form des Coenzyms NAD in den Liposomen mit eingekapselten Hämoglobin spielt.

VORTEILE DER ERFINDUNG

Wie vorstehend beschrieben, wird die im Laufe der Zeit stattfindende Hämoglobinoxidation in den Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin der Erfindung in bemerkenswertem Ausmaß unterdrückt.
Im allgemeinen erfahren die Liposomen mit eingekapselten Hämoglobin im Laufe ihrer Herstellung oder Lagerung auf Grund der Oxidation des Hämoglobins zu Methämoglobin eine Abnahme oder einen Verlust ihrer Fähigkeit zum Sauerstoff-Transport. Das Liposom mit eingekapselten Hämoglobin der Erfindung hingegen behält seine ausgezeichnete Fähigkeit zum Sauerstoff- Transport bei, da das Hämoglobin vor einer irreversiblen Oxidation geschützt wird. Deshalb weist das Liposom mit eingekapseltem Hämoglobin der Erfindung Eigenschaften auf, die für einen künstlichen Erythrozyten gut geeignet sind.

Claims

1. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin, die ein Liposom, das ein Lipid umfaßt, und eine in dem Liposom eingekapselte enzymatisch aktive Hämoglobinlösung umfaßt, wobei der Hämoglobinlösung mindestens ein Substrat für eine enzymatische Reaktion hinzugefügt wurde, die mindestens ein Element erzeugt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der reduzierten Form des Nicotinamidadenin-dinucleotids (NADH) und der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) besteht, wobei das Substrat aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Äpfelsäure, Oxalessigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, α-Ketoglutarsäure, Succinyl-CoA, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Phosphoenolbrenztraubensäure, Acetyl-CoA und Glutaminsäure besteht.

2. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach Anspruch 1, wobei das Substrat für eine enzymatische Reaktion in einer Menge in einem Bereich von 0,1 bis 25 Mol 1 pro 1 Mol Hämoglobin hinzugefügt ist.

3. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Hämoglobinlösung desweiteren eine Organophosphatverbindung hinzugefügt wurde.

4. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach Anspruch 3, wobei die Organophosphatverbindung Inositolhexaphosphat, Tetrapolyphosphat, Pyridoxal-5'- phosphat oder ATP ist.

5. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach Anspruch 4, wobei die Organophosphatverbindung in einer Menge in einem Bereich von 0,05 bis 4 Mol pro 1 Mol Hämoglobin hinzugefügt ist.

6. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach Anspruch 5, wobei die Organophosphatverbindung in einer Menge in einem Bereich von 0,5 bis 1,5 Mol pro 1 Mol Hämoglobin hinzugefügt ist.

7. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei dem Lipid desweiteren ein Tocopherolanaloges hinzugefügt wurde.

8. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Tocopherolanaloge in einer Menge von 0,5 bis 4,5 Mol-% des gesamten Lipidgehalts der Liposommembran hinzugefügt ist.

9. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Hämoglobinlösung desweiteren mindestens ein Enzym hinzugefügt wurde, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH), der oxidierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NAD), der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) und der oxidierten Form des Nicotinamid-adenin-nucleotidphosphats (NADP) besteht.

10. Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach Anspruch 9, wobei das Enzym in einer Menge in einem Bereich von 0,1 bis 25 Mol pro 1 Mol Hämoglobin hinzugefügt ist.

11. Verfahren zur Herstellung einer Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das die nachstehenden Schritte umfaßt:

(a) Herstellung einer konzentrierten Hämoglobinlösung mit einer Hämoglobinkonzentration von 30 bis 60 Gewichts-%- mittels der Hämolyse gespülter Erythrozyten, der Entfernung des Stroma-Bestandteils und der Konzentrierung der stromafreien Hämoglobinlösung;

(b) Zugabe eines Substrats für eine enzymatische Reaktion, die mindestens ein Element erzeugt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der reduzierten Form des Nicotinamidadenin-dinucleotids (NADH) und der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) besteht, zu der konzentrierten Hämoglobinlösung, und Rühren der resultierenden Hämoglobinlösung; und

(c) Liposomerisierung der Hämoglobinlösung unter gemäßigten Bedingungen, um zu verhindern, daß die Enzyme in der Hämoglobinlösung ihre Aktivität verlieren.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem die Liposomerisierung unter gemäßigten Bedingungen durch die ein- bis mehrmalige Injizierung der Hämoglobinlösung aus einer Düse bei einer Temperatur von bis zu 40ºC und einem Druck von 50 bis 1.800 kg/cm² erfolgt.

13. Verwendung eines Substrats für eine enzymatische Reaktion, die mindestens ein Element erzeugt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH) und der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphats (NADPH) besteht, wobei das Substrat mindestens ein Element ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Äpfelsäure, -Oxalessigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, α-Ketoglutarsäure, Succinyl-CoA, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Asparaginsäure, Brenztraubensäure, Phosphoenolbrenztraubensäure, Acetyl-CoA und Glutaminsäure besteht, um eine Hämoglobinoxidation zu Methämoglobin in einer Suspension eines Lipsosoms mit eingekapseltem Hämoglobin zu verhindern.