DE60119784T2

DE60119784T2 - Cyclische salen metall verbindungen als einfänger von sauerstoffradikalen und verwendbar als antioxidantien bei der behandlung und vorbeugung von krankheiten

Info

Publication number: DE60119784T2
Application number: DE60119784T
Authority: DE
Inventors: Bernard Arlington MALFROY-CAMINE; Susan Roslindale DOCTROW
Original assignee: Eukarion Inc
Current assignee: Eukarion Inc
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-11-28
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2021-11-29
Also published as: WO2002044187A3; US20040059107A1; US6589948B1; RU2003119169A; CN1636007A; US20070123503A1; EP1688425A3; WO2002044187A2; CA2430133A1; CA2430133C; EP1688425A2; CN1318435C; AU2002239381B2; AU3938102A; JP4316878B2; ATE326475T1; US7122537B2; EP1349864A2; DE60119784D1; JP2004514724A

Description

Die vorliegende Erfindung stellt, unter anderem, Antioxidationszusammensetzungen, darin eingeschlossen pharmazeutische Zusammensetzungen, von synthetischen katalytischen cyclischen Salen-Metall-Antioxidanzien und Fänger für Reaktiv-Sauerstoff-Spezies für die Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen und die Vermeidung von Sauerstoff- bzw. Oxy-Radikal-vermittelter Oxidation; Verfahren zur Verwendung solcher cyclischer Salen-Metall-Antioxidanzien bei der Vorbeugung und Behandlung von pathologischen Zuständen; Verfahren zur Verwendung solcher cyclischer Salen-Metall-Antioxidanzien als Konservierungsmittel und Oxyradikal-Quenchmittel; Verfahren zur Verwendung solcher cyclischer Salen-Metall-Antioxidanzien für den zielgerichteten Schutz von Geweben und/oder Zelltypen während der Krebschemotherapie; und Verfahren zur Verwendung solcher cyclischer Salen-Metall-Antioxidanzien zur Vermeidung toxikologischer Schädigungen bei Personen, die reizenden Oxidanzien oder anderen Quellen einer oxidativen Schädigung ausgesetzt sind, insbesondere von Sauerstoff abgeleitete oxidative Spezies, wie das Superoxidradikal und Wasserstoffperoxid, bereit. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die für die Vermeidung von oxidativer Schädigung bei menschlichen Transplantatorganen und für die Unterdrückung von Reoxygenierungsschädigung im Anschluss an eine Reperfusion von ischämischen Geweben von Nutzen sind. Ferner stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die für die Chemoprävention von chemischer Karzinogenese und die Veränderung eines Arzneistoff-Metabolismus, an dem Epoxid oder freie Sauerstoffradikalintermediate beteiligt sind, von Nutzen sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch neue cyclische Salen-Metall-Verbindungen (CSMCs) mit therapeutisch nützlichen katalytischen Eigenschaften sowie solche neuen Verbindungen enthaltende Zusammensetzungen bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Molekularer Sauerstoff ist ein wesentlicher Nährstoff für nicht-fakultative aerobe Organismen, darin eingeschlossen selbstverständlich Menschen. Sauerstoff wird auf vielen wichtigen Wegen verwendet, und zwar als terminaler Elektronenakzeptor bei der oxidativen Phosphorylierung, bei zahlreichen Dioxygenasereaktionen, darin eingeschlossen die Synthese von Prostaglandinen und von Vitamin A aus Karotenoiden, bei einer ganzen Reihe von Hydroxylasereaktionen, darin eingeschlossen die Bildung und Modifikation von Steroidhormonen, und sowohl bei der Aktivierung als auch der Inaktivierung von Xenobiotika, einschließlich Karzinogenen. Das umfangreiche P-450-System nutzt molekularen Sauerstoff in einer ganzen Reihe von bedeutenden Zellreaktionen. In der gleichen Weise nutzt die Natur freie Radikale in einer großen Vielzahl an Enzymreaktionen.
Zu hohe Konzentrationen verschiedener Formen von reaktiver Sauerstoffspezies und von freien Radikalen können ernsthafte schädliche Auswirkungen auf lebende Systeme haben, darin eingeschlossen die Peroxidation von Membranlipiden, die Hydroxylierung von Nukleinsäurebasen und die Oxidation von Sulfhydrylgruppen und von anderen empfindlichen Einheiten in Proteinen. Daraus können Mutationen und/oder Zelltod resultieren, wenn diese nicht bekämpft werden.
Biologische Antioxidanzien schließen klar definierte Enzyme, wie Superoxiddismutase, Katalase, Selenglutathionperoxidase und Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidase ein. Nicht-enzymatische biologische Antioxidanzien schließen Tocopherole und Tocotrienole, Karotenoide, Chinone, Bilirubin, Ascorbinsäure, Harnsäure und metallbindende Proteine ein. Verschiedene Antioxidanzien, die sowohl lipid als auch wasserlöslich sind, sind in allen Teilen von Zellen und Geweben zu finden, obgleich jedes spezifische Antioxidans häufig ein charakteristisches Verteilungsmuster zeigt. Die so genannten Ovothiole, die Mercaptohistidinderivate sind, bauen ebenfalls Peroxide auf nichtenzymatischem Wege ab.
Freie Radikale, insbesondere von molekularem Sauerstoff abgeleitete freie Radikale, sollen eine wesentliche Rolle bei einer großen Vielfalt an biologischen Phänomenen spielen. In der Tat wurde zu bedenken gegeben, dass viele als kritisch geltende Krankheiten eine Sauerstoffradikal-("Oxyradikal"-)Pathophysiologie einbeziehen können (Zimmermann, J.J. (1991) Chest 100:189S). Oxyradikale Schädigung ist mit der Pathogenese von pulmonarer Sauerstoff-Toxizität, dem Atmungsbeschwerdensyndrom bei Erwachsen (ARDS), bronchopulmonaler Dysplasie, dem Sepsissyndrom und einer Vielzahl an Ischämie-Reperfusions-Syndromen, darin eingeschlossen Myokardinfarkt, Schlaganfall, kardiopulmonarer Bypass, Organtransplantation, nekrotisierende Enterokolitis, akute renale tubuläre Nekrose und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Sauerstoffradikale können mit Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden und anderen biologischen Makromolekülen, die bei Zellen und Geweben, insbesondere bei kritisch erkrankten Patienten, Schäden hervorrufen, reagieren.
Freie Radikale sind Atome, Ionen oder Moleküle, die ein ungepaartes Elektron enthalten (Pryor, W.A. (1976) Free Radicals in Biol. 1:1 ). Freie Radikale sind in der Regel instabil und zeigen kurze Halbwertszeiten. Elementarer Sauerstoff ist hoch elektronegativ und lässt leicht Übertragungen einzelner Elektronen von Cytochromen und anderen reduzierten Zellkomponenten zu; ein Teil des O₂, der durch an der aeroben Atmung beteiligte Zellen verbraucht wird, wird monovalent zu einem Superoxidradikal (d. h. •O₂ ^–) reduziert (Cadenas, E. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:79). Die sequentielle monovalente Reduktion von •O₂ produziert Wasserstoffperoxid (d. h. H₂O₂), ein Hydroxylradikal (d. h. •OH), und Wasser.
Freie Radikale können von zahlreichen Quellen stammen, darin eingeschlossen die aerobe Atmung, Cytochrom-P-450-katalysierte Monooxygenierungsreaktionen von Arzneistoffen und Xenobiotika (z. B. Trichlormethylradikale, d. h. CCl₃•, gebildet durch die Oxidation von Tetrachlorkohlenstoff), sowie ionisierende Strahlung. Wenn zum Beispiel Gewebe Gammastrahlung ausgesetzt werden, wird der größte Teil der in den Zellen abelagerten Energie durch Wasser absorbiert und führt zu einer Spaltung der kovalenten Sauerstoff-Wasserstoff-Bindungen in Wasser, wobei ein einzelnes Elektron auf Wasserstoff und eines auf Sauerstoff zurückbleibt, wodurch zwei Radikale entstehen, nämlich H• und •OH. Das Hydroxylradikal, d. h. •OH, ist das am stärksten reaktive Radikal, das in der Chemie bekannt ist. Es reagiert mit Biomolekülen, löst Kettenreaktionen aus und kann mit den Purin- oder Pyrimidinbasen von Nukleinsäuren wechselwir ken. De facto kann eine strahlungsinduzierte Karzinogenese durch Schäden durch freie Radikale initiiert werden (Breimer, L.H. (1988) Brit. J. Cancer 57:6). Außerdem erzeugt der "oxidative Burst bzw. Entladungsstoß" von aktivierten Neutrophilen reichlich Superoxidradikale, was vermutlich ein wesentlicher Faktor bei der Erzeugung des cytotoxischen Effekts von aktivierten Neutrophilen ist. Die Reperfusion von ischämischen Geweben erzeugt auch große Konzentrationen an Oxyradikalen, typischerweise Superoxid (Gutteridge and Halliwell (1990) Arch. Biochem. Biophys. 283:223). Darüber hinaus kann Superoxid physiologisch durch Endothelzellen für die Reaktion mit Stickstoffmonoxid, einem physiologischen Regler, unter Bildung von Peroxynitrit, d. h. ONOO^–, das zerfallen kann und zur Entstehung von Hydroxylradikalen, •OH, führen kann, gebildet werden (Marletta, M.A. (1989) Trends Biochem. Sci. 14:488; Moncada et al. (1989) Biochem. Pharmacol. 38:1709; Saran et al. (1990) Free Rad. Res. Commun. 10:221; Beckman et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:1620). Zusätzliche Quellen von Oxyradikalen sind ein "Verlust" von Elektronen aus zerstörten Elektronentransportketten aus Mitochondrien und aus dem endoplasmatischen Retikulum, Prostaglandinsynthese, Oxidation von Katecholaminen und Plättchenaktivierung.
Sauerstoff kann, obwohl er für den aeroben Metabolismus essentiell ist, zu giftigen Metaboliten umgewandelt werden, wie das Superoxidanion und Wasserstoffperoxid, bekannt unter einem Sammelbegriff als reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Eine erhöhte ROS-Bildung unter pathologischen Zuständen soll Zellschäden durch die Wirkung dieser hoch reaktiven Moleküle auf Proteine, Lipide und DNA verursachen. Während der Entzündung werden ROS durch aktivierte phagozytische Leukozyten aktiviert. Wie oben beschrieben, wird während des "respiratorischen Burst" von Neutrophilen Superoxidanion durch die membrangebundene NADPH-Oxidase erzeugt. ROS sollen sich auch anlagern, wenn Gewebe einer Ischämie, gefolgt von einer Reperfusion, ausgesetzt werden.
Zahlreiche Reaktionen freier Radikale sind für Zellkomponenten überaus schädlich, d. h. sie vernetzen Proteine, mutagenisieren DNA und peroxidieren Lipide. Freie Radikale können, nachdem sie gebildet wurden, wechselwirken unter Erzeugung anderer freier Radikale und von Nicht-Radikal-Oxidanzien, wie Singulettsauerstoff (¹O₂) und Peroxiden. Der Abbau einiger der Produkte der Reaktionen freier Radikale kann auch po tenziell schädigende chemische Spezies erzeugen. Zum Beispiel ist Malondialdehyd ein Reaktionsprodukt von peroxidierten Lipiden, das mit praktisch jedem Amin enthaltenden Molekül reagiert. Sauerstofffreie Radikale verursachen auch eine oxidative Modifikation von Proteinen (Stadtman, E.R. (1992) Science 257:1220).
Aerobe Zellen enthalten allgemein eine Reihe von Schutzvorkehrungen gegenüber den schädlichen Wirkungen von Oxyradikalen und ihren Reaktionsprodukten. Superoxiddismutasen (SODs) katalysieren die Reaktion: 2 •O₂ ^– + 2H⁺ → O₂ + H₂O₂ welche Superoxid entfernt und Wasserstoffperoxid bildet. H₂O₂ ist kein Radikal, ist aber toxisch gegenüber Zellen und wird durch die enzymatischen Aktivitäten von Katalase und Glutathionperoxidase (GSH-Px) entfernt. Die Katalase katalysiert die Reaktion: 2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂ und GSH-Px entfernt Wasserstoffperoxid durch dessen Verwendung zur Oxidation von reduziertem Glutathion (GSH) zu oxidiertem Glutathion (GSSG) gemäß der folgenden Reaktion: 2 GSH + 2 H₂O₂ → GSSG + 2 H₂O
Andere Enzyme, wie Phospholipidhydroperoxidglutathionperoxidase (PLOOH-GSH-Px) wandelt reaktive Phospholipidhydroperoxide, freie Fettsäurehydroperoxide und Cholesterolhydroperoxide in entsprechende unschädliche Fettsäurealkoholen um. Glutathion-S-transferasen sind auch an der Entgiftung organischer Peroxide beteiligt. In Abwesenheit dieser Enzyme und in Gegenwart von Übergangsmetallen, wie Eisen oder Kupfer, können Superoxid und Wasserstoffperoxid an den folgenden Reaktionen beteiligt sein, welche das extrem reaktive Hydroxylradikal, nämlich •OH^– erzeugen: •O₂ ^– + Fe³⁺ → O₂ + Fe²⁺ H₂O₂ + Fe²⁺ → •OH + OH^– + Fe³⁺
Zusätzlich zur enzymatischen Entgiftung von freien Radikalen und oxidierender Spezies dient eine Vielzahl von niedermolekulargewichtigen Antioxidanzien, wie Glu tathion, Ascorbat, Tocopherol, Ubichinon, Bilirubin und Harnsäure, als natürlich vorkommende physiologische Antioxidanzien (Krinsky, N.I. (1992) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 200:248-54). Karotenoide sind eine weitere Klasse von Antioxidanzien unter den kleinen Molekülen und sind als Schutzmittel gegen oxidativen Stress und chronische Erkrankungen betrachtet worden. Canfield et al. (1992) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 200:260 fassen die Beziehungen zwischen Karotenoiden und verschiedenen chronischen Erkrankungen, darin eingeschlossen Erkrankungen der Herzkranzgefäße, Katarakt und Krebs, über die berichtet wurde, zusammen. Karotenoide verringern dramatisch das Auftreten bestimmter prämaligner Erkrankungszustände, wie Leukoplakie, bei einigen Patienten.
Um den schädlichen Wirkungen von freien Radikalen und mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen vorzubeugen, wurden große Anstrengungen unternommen, um neue Antioxidanzien zu entwickeln, die bei der Beseitigung gefährlicher Oxydradikale effizient sind, insbesondere von Superoxid und Wasserstoffperoxid, und die preisgünstig herzustellen sind, stabil sind und vorteilhafte pharmakokinetische Eigenschaften besitzen, wie die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überschreiten und in Gewebe einzudringen. Erst kürzlich erreichten Malfroy-Camine et al. dieses Ziel mit ihrer unerwarteten Feststellung, dass Vertreter der Klasse von Verbindungen, die ursprünglich als Epoxidationskatalysatoren beschrieben wurden, die so genannten Salen-Metall-Komplexe, ebenfalls eine wirkungsvolle Superoxid-Dismutaseaktivität und/oder -Katalase-Aktivität zeigen und mithin wirksam als Katalysatoren für die Entfernung von freien Radikalen sowohl in vitro als auch in vivo fungieren (siehe die US-Patente Nr. 5 403 834, 5 834 509, 5 696 109 und 5 827 880, die alle an Malfroy-Camine erteilt wurden). Vor dieser Feststellung waren die Salen-Übergangsmetall-Komplexe lediglich beschrieben worden und als chirale Epoxidationskatalysatoren für verschiedene Anwendungen der synthetischen Chemie verwendet worden (siehe Fu et al. (1991) J. Org. Chem. 56:6497; Zhang, W. und Jacobsen, E.N. (1991) J. Org. Chem. 56:2296; Jacobsen et al.. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6703; Zhang et al.. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:2801; Lee, N.H. und Jacobsen, E.N. (1991) Tetrahedron Lett. 32:6533; Jacobsen et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:7063; Lee et al. (1991) Tetrahedron Lett. 32:5055).
Die US-A-6 046 188 beschreibt antioxidierende Salen-Metall-Komplexe und pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung von mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungszuständen.
Malfroy-Camine et al.. stellten jetzt fest, dass Salen-Metall-Komplexe auch als wirksame Antioxidanzien für verschiedene biologische Anwendungen nützlich sind, darin eingeschlossen deren Verwendung als Pharmazeutika für die Prävention und/oder Behandlung von mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen. Pharmazeutische Formulierungen, Nahrungsmittelzusätze, verbesserte Zell- und Organkulturmedien, verbesserte Kryokonservierungsmedien, topische Salben und Chemoschutz- und Strahlenschutzzusammensetzungen können nun mit einer wirksamen Menge oder Konzentration von mindestens einem antioxidierenden Salen-Metall-Komplex hergestellt werden. Ferner stellten Malfroy-Camine et al. fest, dass Salen-Metall-Komplexe ebenfalls verwendet werden können, um die Entwicklung von neurodegenerativen Erkrankungen teilweise oder völlig zu stoppen. Zum Beispiel können antioxidierende Salen-Metall-Komplexe für die Behandlung und Prophylaxe von neurodegenerativen Erkrankungen, wie amyotropher lateraler Sklerose (ALS), multipler Sklerose (MS), Parkinson-Erkrankung, Alzheimer-Erkrankung etc. verwendet werden. Andere Verwendungen für solche Salen-Metall-Komplexe sind in den US-Patenten Nr. 5 403 834, 5 834 509, 5 696 109 und 5 827 880 offenbart.
Obwohl die Beiträge von Malfroy-Camine et al. das Gebiet der Antioxidanzien, die bei der Vorbeugung und Behandlung von mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen nützlich sind, revolutioniert haben, wäre es dennoch von Vorteil, wenn Salen-Metall-Verbindungen mit einer erhöhten Stabilität entwickelt werden könnten. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses und andere Ziele.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde jetzt festgestellt, dass die Stabilität von Salen-Metall-Verbindungen oder damit austauschbar Salen-Metall-Komplexen durch Cyclisieren solcher Verbindungen an der 3,3'-Position erhöht werden kann. Somit stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt cyclische Salen-Metall-Verbindungen mit einer erhöhten Stabilität bereit. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, wel che solche antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Verbindungen umfassen, therapeutische Verwendungen solcher antioxidierender cyclischer Salen-Metall-Verbindungen und Verfahren und Zusammensetzungen für die Verwendung solcher antioxidierender cyclischer Salen-Metall-Verbindungen in Diagnostik-, Therapie- und Forschungsanwendungen, zum Beispiel in der Human- oder Veterinärmedizin, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt cyclische Salen-Metall-Verbindungen bereit, wie in 1 gezeigt.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die wirksame Antioxidanz- und/oder Radikalfängereigenschaften haben und als in-vitro- und in-vivo-Antioxidanzien fungieren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Dosis von mindestens einer Spezies eines cyclischen Salen-Metall-Komplexes. von 1, typischerweise eines Salen-Mangan-Komplexes, wie eines Salen-Mn(III)-Komplexes. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen besitzen die Aktivität von dismutierendem Superoxid (d. h. Superoxid-Dismutaseaktivität) und vorteilhafterweise die Fähigkeit zur Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff (d. h. Katalase-Aktivität). Als Solche sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wirksam in der Verringerung einer pathologischen Schädigung in Zusammenhang mit der Bildung von reaktiver Sauerstoffspezies (ROS).
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Prävention und/oder Behandlung von mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen bereit. Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung von cyclischen Salen-Metall-Verbindungen bereit, um einen Patienten zu behandeln oder zu schützen, welcher dem Folgenden ausgesetzt ist oder erwartungsgemäß ausgesetzt sein wird: (1) einem ischämischen Ereignis, wie einem Myokardinfarkt, einem zerebralen ischämischen Vorfall, einer Transplantationsoperation, einer Operation am offenen Herzen, einer elektiven Angioplastik, einer Herzkranzgefäß-Bypassoperation, Gehirnoperation, einem renalen Infarkt, einer posttraumatischen Einblutung, einer Tourniquet-Anbringung; (2) einer antineoplastischen oder antihelminthischen Chemotherapie unter Verwendung eines Chemotherapeutikums, das freie Radikale erzeugt; (3) einem endotoxischen Schock oder Sepsis; (4) Exposition an ionisierende Strahlung; (5) Exposition an exogene chemische Verbindungen, die freie Radikale sind oder freie Radikale erzeugen; (6) thermischen oder chemischen Verbrennungen oder Geschwüren; (7) hyperbarem Sauerstoff; (8) Apoptose einer vorbestimmten Zellpopulation (z. B. Lymphozyten- Apoptose); (9) einer entzündlichen Reaktion; oder (10) altersbedingten pathologischen Veränderungen oder Leiden.
Noch genauer sieht die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen für das Folgende vor: (1) Vermeidung von ischämischem/Reoxygenierungsschaden bei einem Patienten; (2) Konservieren von Organen für die Transplantation in einem anoxischen, hypoxischen oder hyperoxischen Zustand vor der Transplantation; (3) Schützen normaler Gewebe vor durch freie Radikale induzierte Schäden als eine Folge einer Exposition an ionisierende Strahlung (UV-Licht, Gammastrahlung, etc.) und/oder Chemotherapie (z. B. mit Bleomycin); (4) Schutz von Zellen und Geweben vor durch freie Radikale induzierter Schädigung als eine Folge eines Ausgesetztseins an xenobiotische Verbindung, die freie Radikale bilden, entweder direkt oder als eine Folge einer Monooxygenierung durch das Cytochrom P-450-System; (5) Verbessern der Kryokonservierung von Zellen, Geweben, Organen und Organismen durch Erhöhen der Lebensfähigkeit von gewonnenen Proben; (6) Prävention oder Behandlung von neurologischen Schäden und/oder neurodegenerativen Erkrankungen und (7) prophylaktische Verabreichung zur Verhinderung beispielsweise von Karzinogenese, Zellalterung, Kataraktbildung, Bildung von Malondialdehydaddukten, HIV-Pathologie und makromolekularer Vernetzung, wie Kollagenvernetzung.
Andere Merkmale, Ziele und Vorteile der Erfindung und deren bevorzugte Ausführungsformen werden anhand der ausführlichen nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 veranschaulicht cyclische Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Allgemeiner Überblick
Die vorliegende Erfindung stellt cyclische Salen-Metall-Verbindungen mit einer erhöhten Stabilität bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Salen-Metall-Verbindungen bereit, die an der 3,3'-Position cyclisiert sind. Von Bedeutung ist, dass die cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Aktivität des Abfangens von Superoxid (d. h. Superoxiddismutase-Aktivität) und vorteilhafterweise die Fähigkeit zur Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff (d. h. Katalase-Aktivität) besitzen. Als Solche besitzen die Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung starke Antioxidations- und/oder ROS-Abfangeigenschaften und fungieren als in-vitro- und in-vivo-Antioxidanzien.
Mithin stellt die vorliegende Erfindung – zusätzlich zu der Bereitstellung von cyclischen Salen-Metall-Verbindungen – Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung derartiger cyclischer Salen-Metall-Verbindungen bei der Vorbeugung und der Behandlung pathologischer Zustände; Verfahren zur Verwendung solcher cyclischer Salen-Metall-Verbindungen als Konservierungsmittel und oxyradikale Quenchmittel; Verfahren zur Verwendung solcher cyclischer Salen-Metall-Verbindungen für den zielgerichteten Schutz von Geweben und/oder Zelltypen während einer Krebschemotherapie; und Verfahren zur Verwendung solcher cyclischer Salen-Metall-Verbindungen zur Verhinderung toxikologischer Schädigungen bei einzelnen Personen, die reizauslösenden Oxidanzien oder anderen Quellen von oxidativer Schädigung, insbesondere von Sauerstoff abgeleiteter oxidativer Spezies, wie dem Superoxidradikal, ausgesetzt sind, bereit. Ferner stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Verhinderung oxidativer Schädigung bei menschlichen Transplantationsorganen und zur Inhibierung von Reoxygenierungsschädigung im Anschluss an die Reperfusion von ischämischen Geweben bereit. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die für eine Chemoprävention chemischer Karzinogenese und eine Veränderung eines Arzneistoffmetabolismus, an welchem Epoxid oder freie Sauerstoffradikalzwischenprodukte beteiligt sind, nützlich sind. Andere Verfahren und Zusammensetzungen für die Verwendung der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind hierin offenbart.
Allgemein sind die im Folgenden verwendete Nomenklatur und die Verfahrensweisen im Labor in Zellkultur, analytischer Chemie, organischer präparativer Chemie und der unten beschriebenen pharmazeutischen Formulierung solche, die im Fachbereich allgemein bekannt sind und gebräuchlicherweise Anwendung finden. Standardtechniken werden für chemische Synthesen, chemische Analysen, die pharmazeutische Formulierung und Abgabe und die Behandlung von Patienten angewandt.
II. Definitionen
Falls nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie dies dem Verständnis eines Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, entspricht. Die hierin gegebenen Definitionen sollen die im Fachbereich anerkannten Definitionen ergänzen, und nicht ersetzen.
Wie hierin verwendet, ist ein "Antioxidans" eine Substanz, die, wenn sie in einer Mischung oder Struktur, welche ein biologisches oxidierbares Substratmolekül enthält, vorliegt, die Oxidation des biologischen Substratmoleküls beträchtlich verzögert oder verhindert. Antioxidanzien können durch Einfangen biologisch bedeutender reaktiver freier Radikale oder anderer reaktiver Sauerstoffspezies (z. B. •O₂ ^–, H₂O₂, •OH, HOCl, Ferryl, Peroxyl, Peroxynitrit, und Alkoxyl), oder durch Verhinderung von deren Bildung oder durch katalytische Umwandlung der freien Radikale oder von anderer reaktiver Sauerstoffspezies in eine weniger reaktive Spezies fungieren. Ein antioxidierender Salen-Übergangsmetall-Komplex der Erfindung besitzt allgemein eine nachweisbare ROS-Abfängeraktivität. Ein Salen-Übergangsmetall-Komplex der Erfindung besitzt Antioxidanzaktivität, wenn der Komplex, wenn er einer Zellkultur oder einer Assayreaktion hinzugefügt wird, für eine nachweisbare Abnahme der Menge eines freien Radikals, wie Superoxid, oder einer nicht-radikalen reaktiven Sauerstoffspezies, wie Wasserstoffperoxid, sorgt im Vergleich mit einer parallelen Zellkultur oder Assayreaktion, die nicht mit dem Komplex behandelt wird. Die relative Menge einer Spezies freier Radikale wird oft durch den Nachweis eines sekundären Indikators (z. B. eines oxidierten Substrats; peroxidierten Lipids, von reduziertem NBT, Cytochrom c) bestimmt. Geeignete Konzentrationen (d. h. eine wirksame Dosis) können durch verschiedene Verfahren, darin einge schlossen die Erstellung einer empirischen Dosis-Ansprech-Kurve, die Vorhersage der Potenz und der Wirksamkeit eines artverwandten Mittels mit Hilfe von QSAR-Verfahren oder Molekülmodellierung, und anderer Verfahren, die in den pharmazeutischen Wissenschaften angewandt werden, bestimmt werden. Da der oxidative Schaden allgemein kumulativ ist, gibt es keinen minimalen Schwellenwert (oder keine minimale Dosis) bezüglich der Wirksamkeit, obwohl Mindestdosen für die Bereitstellung eines nachweisbaren therapeutischen oder prophylaktischen Effekts für spezielle Erkrankungszustände festgelegt werden können. Antioxidierende Salen-Metall-Komplexe der Erfindung können Glutathionperoxidase-Aktivität oder Peroxidase-Aktivität im Allgemeinen haben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "mit freien Radikalen assoziierte Erkrankung" auf einen pathologischen Zustand einer Einzelperson, der zumindest teilweise aus der Bildung oder der Exposition an freie Radikale, im Besonderen Oxyradikale, und andere reaktive Sauerstoffspezies resultiert. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich, dass die meisten pathologischen Zustände multifaktoriell sind, nämlich dadurch, dass mehrere zu dem Erkrankungszustand beitragende Faktoren vorliegen und dass das Zuweisen oder Identifizieren des/der vorherrschenden kausalen Faktors/Faktoren für irgendeinen einzelnen pathologischen Zustand häufig extrem schwierig ist. Aus diesen Gründen umfasst der Begriff "mit freien Radikalen assoziierte Erkrankung" pathologische Zustände, die im Fachbereich als Zustände anerkannt sind, bei welchen angenommen wird, dass Schäden durch freie Radikale oder reaktive Sauerstoffspezies zu der Pathologie dieses Erkrankungszustands beitragen, oder bei welchen die Verabreichung eines Inhibitors von freien Radikalen (z. B. Desferrioxamin), Fängers (z. B. Tocopherol, Glutathion) oder Katalysators (z. B. SOD, Katalase), wie sich zeigt, für einen nachweisbaren Vorteil durch Verringerung der Symptome, Erhöhung des Überlebens oder Vorsehung anderer nachweisbarer klinischer Vorteile bei der Behandlung oder Prävention des pathologischen Zustands sorgt. Als Beispiel, ohne eine Einschränkung zu sein, gelten die hierin besprochenen Erkrankungszustände als mit freien Radikalen assoziierte Erkrankungen (z. B. ischämischer Reperfusionsschaden, entzündliche Erkrankungen, systemischer Lupus erythematosus, Myokardinfarkt, Schlaganfall, traumatische Hämorrhagie, Gehirn- und Rückenmarktrauma, Morbus Crohn, Autoimmunkrankheiten (z. B. rheumatische Arthritis, Diabetes), Kataraktbildung, Uveitis, Emphysem, Magengeschwüre, Sauerstofftoxizität, Neoplasie, unerwünschte Zellenapoptose, Strahlenkater und andere hierin offenbarte pathologische Zustände, wie Toxämie und akute Lungenschädigung). Solche Krankheiten können " Apoptose-bedingte ROS" einschließen, die sich auf reaktive Sauerstoffspezies (z. B. O₂ ^–, HOOH) bezieht, die kritische Zellkomponenten (z. B. Lipidperoxidation) in Zellen schädigen, die stimuliert werden, um eine Apoptose einzugehen, und solche Apoptose-bedingte ROS kann in einer Zelle als Reaktion auf einen apoptotischen Reiz gebildet und/oder durch nichtrespiratorische Elektronentransportketten gebildet werden (d, h. im Gegensatz zu ROS, die durch oxidative Phosphorylierung gebildet wurde).
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für Therapie und Prophylaxe von mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen bereit, welche das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung eines antioxidierenden Salen-Metall-Komplexes an einen Patienten umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren zur Prävention, Eindämmung oder Behandlung von (1) neurologischen Schäden, wie Parkinson-Erkrankung oder Alzheimer-Erkrankung, (2) Herzgewebenekrose, die aus kardialer Ischämie resultiert, (3) Autoimmun-Neurodegeneration (z. B. Enzephalomyelitis); (4) akuter Lungenschädigung, wie bei Sepsis und Endotoxämie, (5) neuronaler Schädigung, die von Ischämie herrührt (z. B. Schlaganfall, Ertrinken, Gehirnchirurgie) oder Trauma (z. B. Erschütterung oder Strangulationsschock) und (6) strahleninduzierter Schädigung angewandt.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke "SOD-mimetisch", "SOD"mimisch", "Superoxiddismutase-mimetisch" und "Superoxidkatalysator" auf Verbindungen, die eine nachweisbare katalytische Aktivität zum Abfangen von Superoxid besitzen, wie durch einen Assay bestimmt. Allgemein besitzt ein SOD-Mimetikum mindestens etwa 0,001 Prozent der SOD-Aktivität von humaner Mn-SOD oder Zn,Cu-SOD auf Gewichtsbasis, wie durch standardmäßige Assayverfahren, wie zum Beispiel den hierin weiter unten angewandte SOD-Assay bestimmt.
Der Ausdruck "pharmazeutisches Mittel oder Arzneistoff', wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine chemische Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Herbeiführung einer erwünschen therapeutischen Wirkung bei korrekter Verabreichung an einen Patienten fähig ist.
Andere chemische Ausdrücke hierin werden gemäß dem herkömmlichen Gebrauch im Fachbereich verwendet, wie durch das McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Lexikon chemischer Begriffe von MacGraw-Hill) (Parker, S. Hrsg.), 1985), McGraw-Hill, San Francisco) erläutert, das hierin durch den Bezug eingeschlossen ist.
III. Cyclische Salen-Metall-Verbindungen
Die vorliegende Erfindung stellt cyclische Salen-Metall-Verbindungen mit einer erhöhten Stabilität bereit.
Die 1 stellt cyclische Salen-Metall-Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung dar. Auf die Salen-Metall-Verbindungen in dieser Tabelle und in dieser gesamten Patentbeschreibung wird durch Verbindungsnummern Bezug genommen, die lediglich der Einfachheit halber verwendet werden und für die Zwecke dieser Erfindung streng willkürlich sind.
Bestimmte cyclische Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen asymmetrische Kohlenstoffatome (optische Zentren) oder Doppelbindungen; die Racemate, Diastereomere, geometrischen Isomere und einzelnen Isomere sollen alle innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung umfasst sein. Optisch aktive (R)- und (S)- oder (D)- und (L)-Isomere können unter Verwendung chiraler Synthone oder chiraler Reagenzien aufgespalten werden oder mit Hilfe von herkömmlichen Techniken aufgelöst werden. Wenn die hierin beschriebenen Verbindungen olefinische Doppelbindungen oder andere Zentren von geometrischer Asymmetrie enthalten, sollen diese, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist, sowohl geometrische E- als auch Z-Isomere einschließen. Ebenso sollen alle tautomeren Formen eingeschlossen sein.
Die cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auf eine Vielzahl von Wegen unter Anwendung herkömmlicher Techniken der präparativen Chemie synthetisiert werden. Typischerweise werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß dem in Beispiel I, B dargelegten Reaktionsschema hergestellt. In dem ersten Schritt dieses Reaktionsschemas wird ein 2,3-Dihydroxybenzaldehyd bei spielsweise mit einem Alkyldihalogenid umgesetzt unter Bildung eines 3,3'-Alkendioxy-bis(2-hydroxybenzaldehyds). In dem zweiten Schritt wird der 3,3'-Alkendioxy-bis(2-hydroxybenzaldehyd) mit einem Diamin (z. B. 1,2-Ethylendiamin, 1,2-Phenylendiamin etc.) und Mangan(II)-acetattetrahydrat umgesetzt unter Bildung der cyclischen Salen-Metall-Verbindung mit einer 3,3'-Überbrückungsgruppe. Die Verwendung geeigneter organischer Lösungsmittel, Temperatur- und Zeitbedingungen zur Durchführung der Reaktionen liegen innerhalb des Kenntnisstands des Fachbereichs.
Andere Verfahren können zur Synthese der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Zum Beispiel können in den Schemata 1–4 gezeigte Verfahren angewandt werden. Wie in Schema 1 veranschaulicht, wird der Teil des Rings, welcher von dem Diamin abgeleitet ist, zum Beispiel durch Bilden einer Schiffschen Base zwischen einem Aldehyd i und einem Diamin hergestellt. Die resultierende Schiffsche Base wird dann beispielsweise durch Natriumcyanoborhydrid oder ein ähnliches Reduktionsmittel unter Bildung von ii reduziert.
Schema 1
Eine Gruppe von Ringschlussreaktionen ist nützlich zur Bildung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Wie in Schema 2 veranschaulicht, werden Diamingebundene Phenylgruppen, welche Abgangsgruppen tragen (z. B. Halogen) ii, mit einem Allylboronat umgesetzt unter Bildung des entsprechenden cyclischen Addukts iii. Die Kupplungschemie von Allylboronaten ist im Fachbereich allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Miyaura et al., Tetrahedron Lett: 22:127 (1981)). Die Alkengruppen des resultierenden Makrozyklus werden anschließend beispielsweise durch Hydrierung unter Bildung der Verbindungen der Erfindung reduziert. Die Hydrierung von Alkenen, die sowohl Elektronen abgebende als auch Elektronen abziehende Substituenten tragen, ist im Fachbereich allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Rylander, Hydrogenation Methods (Hydrierungsverfahren); Academic Press: New York 1985).
Schema 2

a. L₂B-CH=CH-(CH₂)n-CH=CH-BL₂; Pd(Ph₃)₄; Base

Benzyl-Einheiten, die Abgangsgruppen tragen, können ebenfalls zu den Makrocyclen der Erfindung durch Reaktion mit einem Allyl-Boronat umgewandelt werden. Die Bildung von Makrozyklen auf Basis von benzylischen Systemen ist in Schema 3 veranschaulicht. In Schema 3 ist eine Verbindung iv, in welcher die benzylischen Kohlenstoffatome eine Abgangsgruppe tragen, an ein Allylboronat gekoppelt, um den makrozyklischen Ring zu schließen, wodurch die Verbindung v erzeugt wird. Die Alkengruppen des resultierenden Makrozyklus werden dann reduziert, wie weiter oben erläutert.
Schema 3

a L₂B-CH=CH-(CH₂)n-CH=CH-BL₂; Pd(Pn₃)₄; Base

Die Makrozyklen der Erfindung können auch mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt werden, das auf einer Olefin-Metathese basiert, wie in Schema 4 veranschaulicht. Beginnend mit einer Verbindung mit zwei Alkengruppen, vi, wird das makrozyklische Ringsystem durch Olefin-Metathese geschlossen unter Bildung der Verbindung vii. Der Ringschluss durch Olefin-Metathese ist im Fachbereich bekannt (siehe zum Beispiel Kroll et al., Chem. Commun. 839 (1971)). Zahlreiche Olefin-Metathese-Katalysatoren sind im Fachbereich bekannt, und viele davon sind geeignete Katalysatoren für die in Schema 4 dargestellte Reaktion (siehe zum Beispiel Grubbs et al., Acc. Chem. Res. 28:446-452 (1995)).
Schema 4

b. Olefin-Metathesekatalysator

Nachdem die cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können diese leicht hinsichtlich katalytischer und biologischer Aktivitäten unter Verwendung der hierin offenbarten Assays sowie von jenen, die in den US-Patenten Nr. 5 403 834, 5 834 509, 5 696 109 und 5 827 880 und der PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/US96/10267 offenbart sind, gescreent werden. Zum Beispiel kann die SOD-Aktivität der hergestellten cyclischen Salen-Metall-Verbindungen mit Hilfe standardmäßiger Assayverfahren auf SOD-Aktivität, wie sie im Fachbereich bekannt sind und weiter unten erläutert werden, bestimmt werden. Cyclische Salen-Metall-Verbindungen mit mindestens 0,001 Prozent Human-SOD-Aktivität auf Gewichtsbasis in wässriger Lösung sind antioxidierende Salen-Metall-Verbindungen. In bevorzugten Ausführungsformen besitzen die antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Verbindungen mindestens etwa 0,01 Prozent SOD-Aktivität pro Gewichtseinheit und stärker bevorzugt mindestens etwa 0,1 Prozent SOD-Aktivität pro Gewichtseinheit. Ferner können, wie im Beispielabschnitt weiter unten dargelegt, die cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung leicht auf andere katalytische Aktivitäten hin (z. B. Katalase-Aktivität, Peroxidase-Aktivität etc.) und andere biologische Aktivitäten mit Hilfe standardmäßiger Assays gescreent werden, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und von diesen angewandt werden.
IV. Verfahren der Verwendung cyclischer Salen-Metall-Verbindungen
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen von 1 bereit, um mit freien Radikalen assoziierte Schäden oder mit freien Radikalen assoziierte Krankheiten zu verhindern und/oder zu behandeln. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet, welche mindestens einen antioxidierenden cyclischen Salen-Übergangsmetall-Komplex der Erfindung umfassen, um einen Patienten zu behandeln oder zu schützen, welcher ausgesetzt ist oder erwartungsgemäß ausgesetzt sein wird: (1) einem ischämischen Vorfall, wie einem Myokardinfarkt, einem zerebralen ischämischen Vorfall, einer Transplantationsoperation, einer Operation am offenen Herzen, einer elektiven Angioplastik, einer Herzkranzgefäß-Bypassoperation, Gehirnoperation, einem renalen Infarkt, einer traumatischen Einblutung, einer Tourniquet-Anbringung; (2) einer antineoplastischen oder antihelminthischen Chemotherapie unter Verwendung eines Chemotherapeutikums, das freie Radikale erzeugt; (3) einem endotoxischen Schock oder Sepsis; (4) einer Exposition an ionisierende Strahlung; (5) einer Exposition an exogene chemische Verbindungen, die freie Radikale sind oder freie Radikale erzeugen; (6) thermischen oder chemischen Verbrennungen oder Geschwüren; (7) hyperbarem Sauerstoff; oder (8) Apoptose einer vorbestimmten Zellpopulation (z. B. Lymphozyten- Apoptose).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine therapeutische oder prophylaktische Dosis eines cyclischen Salen-Metall-Komplexes von 1 entweder allein oder in Kombination beispielsweise mit einem der Folgenden verabreicht: (1) einem oder mehreren antioxidierenden Enzymen, wie einer Mn-SOD, einer Cu, Zn-SOD oder Katalase; und/oder (2) einem oder mehreren Fängern freier Radikale, wie Tocopherol, Ascorbat, Glutathion, DMTU, N-Acetylcystein oder N-2-Mercaptopropionylglycin; und/oder (3) einem oder mehreren oxyradikalen Inhibitoren, wie Desferrioxamin oder Allopurinol; und/oder (4) einem oder mehreren biologischen Modifikationsmitteln, wie Calpain-Inhibitoren. Wie für Fachleute auf dem Gebiet leicht ersichtlich ist, hängt die tatsächlich verwendete Formulierung zum Beispiel von dem spezifischen pathologi schen Zustand, der behandelt oder vermieden werden soll, der Route und der Form der Verabreichung, und dem Alter, Geschlecht und dem Zustand des Patienten ab. Solche Zusammensetzungen können für verschiedene Indikationen verabreicht werden, darin eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, die Folgenden: (1) für die Vermeidung von ischämischer/Reoxygenierungsschädigung bei einem Patienten; (2) für die Konservierung von Organen für die Transplantation in einem anoxischen, hypoxischen oder hyperoxischen Zustand vor der Transplantation; (3) zum Schutz normaler Gewebe vor durch freie Radikale induzierten Schäden als eine Folge des Ausgesetztseins an ionisierende Strahlung und/oder Chemotherapie wie mit Bleomycin; (4) zum Schutz von Zellen und Geweben vor durch freie Radikale induzierter Schädigung als eine Folge des Ausgesetztseins an xenobiotische Verbindungen, die freie Radikale bilden, entweder direkt oder als Folge einer Monooxygenierung durch das Cytochrom-P-450-System; (5) zum Verbessern der Kryokonservierung von Zellen, Geweben, Organen und Organismen durch Erhöhen der Lebensfähigkeit von gewonnenen Proben; und (6) zur prophylaktischen Verabreichung zur Verhinderung beispielsweise von Karzinogenese, Zellalterung, Kataraktbildung, Bildung von Malondialdehydaddukten, HIV-Pathologie und makromolekularer Vernetzung, wie Kollagenvernetzung.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung und Prävention pathologischer Zustände durch Aufbringen oder Verabreichen von Zusammensetzungen von cyclischen Salen-Metall-Komplexen in einer therapeutischen oder prophylaktischen Dosis bereit. Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren zur Prävention oder Verringerung von ischämischer/Reperfusionsschädigung bei kritischen Geweben, wie dem Myokard und dem zentralen Nervensystem, bereit. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Prävention oder Verringerung von Zellschaden bereit, der aus der Exposition an verschiedene chemische Verbindungen resultiert, die potenziell schädliche Spezies freier Radikale erzeugen, und an ionisierende Strahlung, wie UV-Licht oder ionisierende Strahlung. Solche Verfahren umfassen typischerweise die Verabreichung an einen Patienten einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Dosis von mindestens einer Spezies eines cyclischen Salen-Übergangsmetall-Komplexes von 1, vorzugsweise eines cyclischen Salen-Mangan-Komplexes mit einer nachweisbaren SOD-Aktivität und vorzugsweise einer nachweisbaren Katalase-Aktivität. Wie hierin beschrieben, können solche antioxidierenden cyclischen Salen- Übergangsmetall-Komplexe über eine Vielzahl an Routen, einschließlich parenteral, topisch und oral, verabreicht werden.
Gemäß anderen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zur Verbesserung der Wiederherstellung von Haut eines warmblütigen Tieres von Wunden, wie chirurgische Einschnitte, Verbrennungen, Entzündungen (z. B. Psoriasis, atopische Dermatitis etc.) Geschwüre (z. B. Magengeschwüre, diabetische Geschwüre etc.) oder kleinere Reizungen aufgrund oxidativer Schäden etc. bereit. Solche Verfahren umfassen typischerweise die Verabreichung an die Haut, Wunde oder Reizung einer therapeutischen oder, in einigen Fällen, einer prophylaktisch wirksamen Menge eines cyclischen Salen-Metall-Komplexes der Formeln I oder II.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe der Formeln von 1 zur Modulierung der Exprimierung von natürlich vorkommenden Genen oder anderen Polynukleotidsequenzen unter der Transkriptionskontrolle eines Response-Elements auf oxidativen Stress- (z. B. eines antioxidierenden Response-Elements, ARE), wie eines antioxidierenden Response-Elements eines Glutathion-5-transferase-Gens oder eines NAD(P)H:Chinon-Reduktase-Gens eingesetzt. Die antioxidierenden Salen-Metall-Komplexe können zur Modulierung der Transkription von ARE-regulierten Polynukleotidsequenzen in Zellkulturen (z. B. ES-Zellen) und bei unversehrten Tieren, insbesondere bei transgenen Tieren, bei welchen ein Transgen eines oder mehrere AREs als Transkriptionsregulierungssequenzen umfasst, eingesetzt werden.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Verhinderung von Nahrungsmittelverderb und Oxidation durch Aufbringen auf Nahrungsmittel einer wirksamen Menge von mindestens einem antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplex bereit. Die Erfindung stellt zudem Zusammensetzungen für die Verhinderung von Nahrungsmittelverderb bereit, welche eine wirksame Menge von mindestens einer Spezies eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes von 1, gegebenenfalls in Kombination mit mindestens einem zusätzlichen Nahrungskonservierungsmittel (z. B. butyliertem Hydroxyto-luol, butyliertem Hydroxyanisol, Sulfaten, Natriumnitrit, Natriumnitrat), umfassen. Zum Beispiel wird ein antioxidierender cyclischer Salen-Metall-Komplex in ein Nahrungsmit tel eingebracht, das einem Ranzigwerden (z. B. Oxidation) unterliegt, um die Rate der oxidativen Zersetzung des Nahrungsmittels bei einer Exposition an molekularen Sauerstoff zu verringern.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung antioxidierende Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen, um die Bildung unerwünschter Kohlenwasserstoffpolymere, die durch mittels freier Radikale vermittelte Polymerisationsmechanismen erzeugt werden, insbesondere durch oxyradikalvermittelte Polymerisation und/oder oxyradikal-vermitteltes Ranzigwerden oder Gumbildung, zu inhibieren. Die antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe der Erfindung können auf eine Vielzahl von Kohlenwasserstoffen angewandt werden, um eine unerwünschte Oxidation und/oder Polymerisation zu verringern oder um eine Polymerisationsreaktion bei einem gewünschten Stand der Polymerbildung (z. B. bei einem gewünschten Molekulargewicht oder einer durchschnittlichen Kettenlänge) zum Stillstand zu bringen. Beispiele für solche gesättigten und ungesättigten Kohlenwasserstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Petroleumdestillate und Petrochemikalien, Terpentin, Lack, synthetischen und natürlichen Kautschuk, pflanzliche Öle und Wachse, Tierfette, polymerisierbare Harze, Polyolefin und dergleichen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen in Kohlenwasserstoffzusammensetzungen zur Verringerung und/oder Bekämpfung der Bildung unerwünschter Polymere, welche solche Kohlenwasserstoffzusammensetzungen verunreinigen, darin eingeschlossen Kohlenwasserstoffe, die in wässrigen Systemen, wässrigen/organischen Zweiphasensystemen und organischen Lösungsmittelsystemen vorhanden sind. Diese Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Zusammensetzung zur Bekämpfung der Bildung von Polymeren in solchen Systemen, welche/s eine antioxidierende Zusammensetzung mit einer antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Verbindung, gegebenenfalls in Kombination mit einem Antioxidans oder Stabilisator, welcher/s keine Salen-Metall-Verbindung ist (z. B. BHT, BHA, Katechol, Tocopherol, Hydrochinon etc.) umfasst. Die Menge der einzelnen Bestandteile der antioxidierenden Zusammensetzung wird in Abhängigkeit von der Schwere der unerwünschten Polymerbildung, die infolge der Polymerisation durch freie Radikale sowie der Aktivität der verwendeten Salen-Metall-Verbindung anzutreffen ist, variieren.
Wie weiter oben erläutert, stellt die vorliegende Erfindung auch cyclische Salen-Metall-Verbindungen bereit, die Peroxidase-Aktivität besitzen und die daher als wirksame Peroxidase-Ersatzstoffe dienen können. Solche Verbindungen sind nützlich als Arzneistoffe für die Prävention zahlreicher pathologischer Zustände, darin eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, Neoplasie, Apoptose von somatischen Zellen, Hautalterung, Katarakte und dergleichen; und als Antioxidanzien zum Abfangen von H₂O₂ und anderen Peroxiden. Zudem können die cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung in diagnostischen Assays verwendet werden. Zum Beispiel können die Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung in zahlreichen diagnostischen Assays an Stelle der herkömmlicherweise verwendeten Abfänger-Antioxidanzien, wie Meerrettich-Peroxidase, verwendet werden. Für Fachleute auf dem Gebiet wird ohne Weiteres ersichtlich, dass die Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung in diagnostischen Assays in einer ähnlichen Weise wie die Meerrettich-Peroxidase und die anderen Abfänger-Antioxidanzien verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verringerung von H₂O₂ und/oder anderen Peroxiden bereit, welches das Kontaktieren von H₂O₂ und/oder anderen Peroxiden mit einer geeigneten Menge jeglicher der Verbindungen der Erfindung, die wirksam ist hinsichtlich der Verringerung von H₂O₂ und/oder anderer Peroxide, umfasst. Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Peroxidinduzierten Zustands bei einem Patienten bereit, welches das Verabreichen an den Patienten einer Menge irgendeiner der Verbindungen der Erfindung, die bei der Verringerung von Peroxid in einem Patienten wirksam ist, umfasst, wodurch der Peroxidinduzierte Zustand behandelt wird. Weiterhin stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Menge irgendeiner der Verbindungen der Erfindung umfasst, die wirksam Peroxid in einem Patienten mit einem Peroxid-induzierten Zustand verringert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger bereit. Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Peroxid-induzierten Zustands bei einem Patienten, z. B. einem menschlichen Patienten, bereit, welches das Verabreichen, z. B. durch topische, orale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, intradermale oder subkutane Verabreichung an den Patienten einer Menge einer antioxidierenden Salen-Metall-Verbindung, die wirksam Peroxid bei dem Patienten verringert, umfasst, wodurch der Peroxid-induzierte Zustand behandelt wird. Der Peroxid-induzierte Zustand kann Katarakte, Entzündung eines Gewebes, Ischämie, eine allergische Reaktion oder eine durch oxidativen Stress verursachte Pathologie beinhalten. Wo der Peroxid-induzierte Zustand Katarakte beinhaltet, erfolgt die Verabreichung durch topischen Kontakt mit der Oberfläche eines Auges, ohne aber hierauf beschränkt zu sein.
Andere Verfahren zur Verwendung der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen von 1 werden Fachleuten auf dem Gebiet durch die Lektüre dieser Offenbarung leicht ersichtlich und sollen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
V. Pharmazeutische Formulierungen
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, wobei die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge von mindestens einer cyclischen Salen-Metall-Verbindung, vorzugsweise einer cyclischen Salen-Übergangsmetall-Verbindung und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, Exzipiens oder Adjuvans umfasst. Die bei der Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Zusammensetzung kann in einer Vielzahl von Formen vorliegen. Solche Formen schließen zum Beispiel feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Liposomen-Präparate, inhalierbare, injizierbare und infusionierbare Lösungen ein. Die bevorzugte Form hängt von der gewünschten Art der Verabreichung und der therapeutischen oder prophylaktischen Anwendung ab. Typischerweise wird eine sterile Lösung eines cyclischen Salen-Metall-Komplexes in einem wässrigen Lösungsmittel (z. B. Kochsalzlösung) intravenös verabreicht. Die Zusammensetzungen schließen auch vorzugsweise herkömmliche pharmazeutisch annehmbare Träger und Adjuvanzien ein, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind; siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co: Easton, PA, 17. Ausg. (1985). Allgemein erfolgt die Verabreichung über orale oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Routen, oder durch topische Aufbringung oder Infusion in eine Körperhöhle, oder als eine Badelösung für Gewebe während der Chirurgie.
Es sollte sich selbstverständlich verstehen, dass die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen Antioxidanzien verwendet werden können, die SOD-Aktivität, Katalase-Aktivität oder Peroxidase-Aktivität besitzen, oder mit anderen Mitteln, die Fänger freier Radikale oder Inhibitoren der Bildung freier Radikale sind. Während es möglich ist, den Wirkstoff, d. h. den cyclischen Salen-Metall-Komplex dieser Erfindung allein zu verabreichen, wird dieser doch vorzugsweise als Teil einer pharmazeutischen Formulierung verabreicht. Die pharmazeutisch annehmbaren Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens eine cyclische Salen-Metall-Verbindung in einer pharmazeutisch oder therapeutisch wirksamen Dosis zusammen mit einem oder mehreren therapeutisch oder pharmazeutisch annehmbaren Trägern und, gegebenenfalls, anderen therapeutischen Bestandteilen. Die verschiedenen Überlegungen, die in die Formulierung eines Therapeutikums oder Prophylaktikums Eingang finden, sind z. B. bei Gilman et al.. (Hrsg.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (Die pharmakologischen Grundlagen der Therapeutik), B. Ausg., Pergamon Press; und Remington's, weiter oben, beschrieben, die jeweils durch den Bezug hierin eingeschlossen sind. Verfahren für die Verabreichung werden darin besprochen, z. B. für die orale, intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung und andere Arten der Verabreichung.
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Träger" jedweden der standardmäßigen pharmazeutischen Träger, wie sterile Lösungen, Tabletten, beschichtete Tabletten und Kapseln. Typischerweise enthalten solche Träger Exzipienzien, wie Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Typen von Ton, Gelatine, Stearinsäuren oder Salze davon, Magnesium- oder Calciumstearat, Talk, pflanzliche Fette oder Öle, Gumme, Glykole oder andere bekannte Exzipienzien. Solche Träger können auch Geschmacksstoff und Farbzusätze oder andere Bestandteile einschließen. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, die Folgenden: Wasser, Kochsalzlösung, Puffer, inerte, nichttoxische Feststoffe (z. B. Mannitol, Talk) und andere Verbindungen, die z. B, im Merck Index beschrieben sind (Merck & Co., Rahway, NJ, der hierin durch den Bezug eingeschlossen wird).
Zusammensetzungen, die solche Träger umfassen, werden durch allgemein bekannte herkömmliche Verfahren formuliert. Je nach der gewünschten Art der Verabrei chung und der gewünschten Verwendung können die Zusammensetzungen in der Form fester, halbfester oder flüssiger Dosierungsformen, wie zum Beispiel Pulvern, Granulaten, Kristallen, Flüssigkeiten, Suspensionen, Liposomen, Pasten, Cremes, Salben etc., vorliegen und können in Einheitsdosierungsformen vorliegen, die für die Verabreichung von relativ exakten Dosen geeignet sind. Für halbfeste Zusammensetzungen, wie dies für Pasten und Cremes, die für die topische Verabreichung bestimmt sind, zweckmäßig wäre, können die cyclischen Salen-Metall-Komplexe getrennt bereitgestellt werden oder können mit herkömmlichen nichttoxischen Trägern, wie zum Beispiel Aloe-vera-Gel, Squalan, Glycerolstearat, Polyethylenglykol, Cetylalkohol, Stearinsäure und Propylenglykol, u.a., kompoundiert werden. Solche Zusammensetzungen können etwa 0,005 –100 % Wirkstoff, stärker bevorzugt etwa 0,5–25 % enthalten. Die Konzentration der Salen-Metall-Komplexe in diesen Formulierungen kann stark schwanken und wird in erster Linie nach der gewünschten Anwendung, den Viskositäten etc. entsprechend der speziellen Art der gewählten Verabreichung gewählt. Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung enthält in jedem Fall eine Menge der cyclischen Salen-Metall-Komplexe, die ausreichend ist, um die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Wirkung bei dem zu behandelnden Patienten zu erzielen. Typische Zusammensetzungen schließen Lotionen ein, die Wasser und/oder Alkohole und Erweichungsmittel, wie Kohlenwasserstofföle und -Wachse, Silikonöle, pflanzliche, tierische oder marine Fette oder Öle, Glyceridderivate, Fettsäuren oder Fettsäureester, oder Alkohole oder Alkoholether, Lecithin, Lanolin und Derivate, mehrwertige Alkohole oder Ester, Wachsester, Sterole, Phospholipide und dergleichen, und allgemein auch Emulgatoren (nichtionisch, kationisch oder anionisch) enthalten, obgleich einige der Erweichungsmittel von sich aus emulgierende Eigenschaften besitzen. Diese selben allgemeinen Bestandteile können eher zu einer Creme als zu einer Lotion, oder zu Gelen, oder zu festen Stiften durch die Verwendung unterschiedlicher Verhältnisse der Bestandteile und/oder durch den Einschluss von Verdickungsmitteln, wie Gummen oder anderen Formen hydrophiler Kolloide, formuliert werden. Solche Zusammensetzungen werden hierin als dermatologisch annehmbare Träger bezeichnet.
In einer Ausführungsform werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch parenterale oder orale Verabreichung für die prophylaktische und/oder therapeutische Behandlung verabreicht. Die pharmazeutischen Zusam mensetzungen können in einer Vielzahl von Einheitsdosierungsformen je nach Verabreichungsmethode verabreicht werden. Zum Beispiel schließen Einheitsdosierungsformen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln und Dragees ein.
Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare nichttoxische Zusammensetzung durch die Einbringung von irgendeinem der normalerweise eingesetzten Exzipienzien, wie zum Beispiel von pharmazeutischen Güteklassen von Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Cellulosen, Glucose, Sucrose, Magnesium, Carbonat und dergleichen, gebildet. Solche Zusammensetzungen haben die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Pulvern, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung und dergleichen. Solche Zusammensetzungen können 0,01–95 % Wirkstoff, vorzugsweise 1–70 %, enthalten.
Die parenterale Verabreichung ist allgemein durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös, gekennzeichnet. Injizierbare Präparate können in herkömmlichen Formen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, festen Formen, die für die Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen hergestellt werden. Geeignete Exzipienzien sind zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder dergleichen. Zudem können die zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen auf Wunsch auch kleinere Menge an nichttoxischen Hilfssubstanzen, wie Benetzungsmitteln oder Emulgatoren, pH-Puffermitteln und dergleichen, wie zum Beispiel Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat etc., enthalten.
Eine erst kürzlich ausgedachte Methode für die parenterale Verabreichung verwendet die Implantation eines Systems mit langsamer Freisetzung oder verzögerter Freisetzung, sodass ein konstantes Dosierungsniveau beibehalten wird. Siehe z. B. das US-Patent Nr. 3 710 795, das hierin durch den Bezug eingeschlossen ist. Antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe können durch transdermale Pflaster (z. B. iontophoretische Übertragung) für die lokale oder systemische Anwendung verabreicht werden.
Die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung umfassen häufig eine Lösung eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes oder eines Cocktails davon, gelöst in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger oder organischen Lösungsmittel (z. B. Ethanol, solvatisiertes PEG, etc.) Da viele der cyclischen Salen-Metall-Komplexe der Erfindung lipophil sind, ist es bevorzugt, in dem Träger eine hydrophobe Base (z. B. Polyethylenglykol, Tween 20, etc.) einzuschließen. Eine Vielzahl an wässrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,9 % Kochsalzlösung, 0,3 % Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und allgemein frei von teilchenförmiger Substanz. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche wohlbekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Diese Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen je nach Bedarf enthalten, um sich physiologischen Zuständen anzunähern, wie pH-Einstell- und -Puffermittel, die Toxizität einstellende Mittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat, etc. Die Konzentration des/der antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes) in diesen Formulierungenkann stark schwanken, d. h. von weniger als etwa 1 nM, in der Regel mindestens etwa 1 μM bis so hoch wie 100 mM, und wird in erster Linie auf Basis der Fluidvolumina, Viskositäten, etc. entsprechend der speziellen Art der ausgewählten Verabreichung gewählt. Am üblichsten liegt der antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplex in einer Konzentration von 0,1 mM bis 10 mM vor. Zum Beispiel umfasst eine typische Formulierung für die intravenöse Injektion eine sterile Lösung eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes in einer Konzentration von 1 bis 5 mM in physiologischer Kochsalzlösung oder Ringerscher Lösung. Die allgemein hydrophobe Natur einiger der bevorzugten antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe zeigt an, dass ein hydrophobes Vehikel verwendet werden kann, oder dass ein wässriges Vehikel, das ein Detergenz oder anderes lipophiles Mittel umfasst (z. B. Tween, NP-40, PEG), verwendet werden kann. Alternativ können die antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe als eine Suspension in einem wässrigen Träger oder als eine Emulsion verabreicht werden.
Als Solche kann eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die intramuskuläre Injektion so hergestellt werden, dass sie 1 ml steriles Wasser und etwa 0,1–100 mg eines bzw. von antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes/en enthält.
Eine typische Zusammensetzung für die intravenöse Infusion kann so gebildet sein, dass sie 250 ml sterile Kochsalzlösung oder Ringersche Lösung und etwa 10 – 1000 mg eines bzw. von antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes/en enthält. Lipophile Mittel können in Formulierungen von lipophilen cyclischen Salen-Metall-Komplexen eingeschlossen werden. Konkrete Verfahren zur Herstellung von parenteral zu verabreichenden Zusammensetzungen sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt oder offensichtlich und sind ausführlicher zum Beispiel bei Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), beschrieben, das hierin durch den Bezug eingeschlossen ist. Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für die topische Anwendung kann mit geeigneten Hautsalben, Cremes, Lotionen, Augensalben und -Lösungen, Atem-Aerosolen und anderen Exzipienzien hergestellt werden. Exzipienzien sollten mit dem bzw. den antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexen chemisch kompatibel sein, welches der/die Hauptwirkstoffe des Präparats ist/sind, und sollten allgemein die Zersetzung, Denaturierung oder Aggregation von Wirkstoff(en) nicht erhöhen. Häufig weisen Exzipienzien lipophile Komponenten, wie Öle und Lipidemulsionen, auf.
Wie hierin beschrieben, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch intravenös verabreicht werden. Mithin stellt diese Erfindung Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung bereit, welche eine Lösung der Verbindung, gelöst oder suspendiert in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, umfassen. Eine Vielzahl an wässrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,9 %ige Kochsalzlösung und dergleichen. Häufig können/kann die/der antioxidierende(n) cyclische(n) Salen-Metall-Komplex(e) in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden und entweder direkt aufgebracht oder in ein wässriges Lösungsmittel verdünnt werden. Typischerweise werden antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe, die relativ lipophil sind, in einem organischen Lösungsmittel und, falls gewünscht, anschließend in einem stärker polaren Lösungsmittel, wie Wasser, verdünnt. Diese Zusammensetzungen werden manchmal durch herkömmliche, allgemein bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert oder können vorzugsweise steril filtriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können für den Gebrauch so, wie sie sind, verpackt werden oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat mit einer sterilen wässrigen Lösung vor der Verabrei chung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen bei Bedarf enthalten, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie pH-Einstell- und -Puffermittel, die Stärke einstellende Mittel, Benetzungsmittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat und dergleichen.
Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche nichttoxische feste Träger verwendet werden, die zum Beispiel pharmazeutische Güteklassen von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Sucrose, Magnesiumcarbonat und dergleichen einschließen. Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare nichttoxische Zusammensetzung gebildet durch die Einbringung irgendeines der normalerweise verwendeten Exzipienzien, wie der zuvor aufgeführten Träger, und allgemein 0,001–95 % Wirkstoff, vorzugsweise etwa 20 %.
Kits können ebenfalls für den Gebrauch mit dem/den betreffenden antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexen) für die Verwendung beim Schutz vor oder der Therapie von mit freien Radikalen assoziierten Schäden oder mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen bereitgestellt werden. Somit kann die betreffende Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung üblicherweise in einer lyophilisierten Form oder einer wässrigen Lösung in einem Behälter, entweder allein oder in Verbindung mit zusätzlichen/m antioxidierenden/m Salen-Metall-Komplex(en), und zwar cyclischen oder sonstigen, des gewünschten Typs bereitgestellt werden. Die/der antioxidierende/n cyclische/n Salen-Metall-Komplexen) werden/wird in den Kits mit Puffern, wie Tris, Phosphat, Carbonat etc., Stabilisatoren, Bioziden, inerten Proteinen, z. B. Serumalbumin oder dergleichen, sowie einer Reihe von Anleitungen für den Gebrauch eingeschlossen. Allgemein liegen diese Materialien in weniger als etwa 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge an antioxidierenden/m cyclischen/m Salen-Metall-Komplex(en), vor und liegen in der Regel in einer Gesamtmenge von mindestens etwa 0,001 %, bezogen wiederum auf die Konzentration, vor. Häufig ist es erwünscht, ein inertes Streckmittel oder Exzipiens zur Verdünnung der Wirkstoffe einzuschließen, wobei das Exzipiens in etwa von 1 bis 99,999 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung vorliegen kann.
Darüber hinaus können die cyclischen Salen-Metall-Komplexe der vorliegenden Erfindung in eine hypothermische Kardioplegie-Lösung in einer Konzentration von mindestens etwa 1 mM gemäß Amano et al. (1982), Jpn. J. Surg. 12:87, eingebracht werden, die hierin durch den Bezug mit eingeschlossen ist.
Wie hierin erläutert, variiert die Dosis von SOD-mimetischem/n cyclischem/n Salen-Metall-Komplexen) jeweils mit jeder speziellen Anwendung. Typischerweise wird die Zusammensetzung entweder systemisch oder topisch verabreicht. Die systemische Verabreichung schließt per os- und parenterale Routen ein, wohingegen die topische Verarbreichung in situ-Anwendungen einschließt. Die in situ-Methode schließt zum Beispiel das Verabreichen eines SOD-mimetischen cyclischen Salen-Metall-Komplexes durch endoskopische Bolus-Wäsche und/oder paravenöse Injektion, oder im Falle von 'Behandlungen des unteren Gastrointestinaltrakts' durch Einlauf ein. Wie weiter oben erläutert, schließen parenterale Routen zum Beispiel subkutane, intradermale, intramuskuläre und intravenöse Routen ein. Die Menge an SOD-mimetischem/n cyclischem/n Salen-Metall-Komplexen) liegt im Bereich von etwa 0,02 bis 5000 mg oder mehr, typischerweise von etwa 1 bis 1000 mg, je nach Verabreichungszeitraum und -route, die von einer einzelnen oralen Dosis, parenteralen Dosis und/oder topischen Dosis bis zu mehreren oralen Dosen, parenteralen Dosen und/oder topischen Dosen über einen Zeitraum von einigen Tagen oder mehr als 5 Wochen reichen können. Wiederum kann die Dosis auch mit der Schwere der Erkrankung variieren.
Wie für Fachleute auf dem Gebiet ohne Weiteres offensichtlich sein wird, können/kann der/die antioxidierende/n Salen-Metall-Komplexe) dieser Erfindung für die Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor dem Gebrauch rekonstituiert werden. Ferner wird von Fachleuten auf dem Gebiet anerkannt, dass, obschon nicht erwartet, die Lyophilisierung und Rekonstitution zu unterschiedlichen Graden des Verlusts von Antioxidanzaktivität führen können, und somit müssen die Gebrauchsmengen wohl so eingestellt werden, um einen derartigen Verlust auszugleichen.
Darüber hinaus wird für einen Fachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres ersichtlich sein, dass die cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung entweder allein oder in Kombination mit anderen bekannten Antioxidanzien und Therapeu tika verwendet werden können. Zum Beispiel wird in bevorzugten Ausführungsformen mindestens eine Spezies eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes in Kombination mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen verabreicht, darin eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, N-2-Mercaptopropionylglycin, N-Acetylcystein, Glutathion, Dimethylthioharnstoff, Desferrioxamin, Mannitol, α-Tocopherol, Ascorbat, Allopurinol, 21-Aminosteroide, Calpain-Inhibitoren, Glutamatrezeptor-Antagonisten, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Streptokinase, Urokinase, nicht-steroidales entzündungshemmendes Mittel, Cortison und Karotenoide. Antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe können ebenfalls in Verbindung mit Polypeptiden mit SOD- und/oder Katalase-Aktivität, insbesondere im Hinblick auf die Fähigkeit der cyclischen Salen-Metall-Komplexe der vorliegenden Erfindung, die Blut-Hirn-Schranke zu überschreiten (im Gegensatz zu den meisten SOD-Polypeptiden), verabreicht werden, wodurch die systemische SOD-Verabreichung ergänzt wird.
Da oxidative Schäden proportional zu dem Überfluss an freien Radikalen und reaktiver Sauerstoffspezies auftreten, wird erwartet, dass die Verabeichung von antioxidierenden cyclischen Salen-Übergangsmetall-Komplexen bei sogar niedrigen Mengen eine Schutzwirkung gegen oxidative Schädigung verleiht. Somit ist zu erwarten, dass es keinen Schwellenwert gibt, unterhalb welchem antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe unwirksam sind.
Wie hierin erläutert, wird eine therapeutisch oder pharmazeutisch wirksame Menge eines antioxidierenden cyclischen Salen-Übergangsmetall-Komplexes an einen Patienten verabreicht, um eine mit freien Radikalen assoziierte Erkrankung zu behandeln oder dieser vorzubeugen. Die erforderliche Dosis hängt von der Natur der mkit freien Radikalen assoziierten Erkrankung, der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, der vorausgehenden Therapie, dem Gesundheitszustand des Patienten und dem Ansprechverhalten auf den antioxidierenden cyclischen Salen-Übergangsmetall-Komplex sowie der Einschätzung durch den behandelnden Arzt ab. Im Allgemeinen liegt für die Behandlung von mit freien Radikalen assoziierten Erkrankungen eine geeignete wirksame Dosis des antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes in dem Bereich von 0,001 bis 1000 Milligramm (mg) pro Kilogramm (kg) Körpergewicht des Empfängers pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Ein zelne oder mehrere Verabreichungen der Zusammensetzungen können durchgeführt werden, wobei die Dosierungsmengen und das Dosierungsmuster durch den behandelnden Arzt ausgewählt werden. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge des/der antioxidierenden cyclischen Salen-Übergangsmetall-Komplexe(s) dieser Erfindung vorsehen, die ausreichend ist, um den Patienten wirksam zu behandeln. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die gewünschte Dosierung in einer, zwei, drei, vier oder mehr Subdosierungen gegeben, die in geeigneten Zeitintervallen über den ganzen Tag verabreicht werden. Diese Subdosierungen können als Einheitsdosierungsformen verabreicht werden, die zum Beispiel 0,01 bis 10 000 mg, vorzugsweise 1 bis 1000 mg Wirkstoff pro Einheitsdosierungsform enthalten.
Wiederum können Zusammensetzungen, die den/die antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe) der vorliegenden Erfindung oder Cocktails davon enthalten, für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden die Zusammensetzungen an einen Patienten verabreicht, der bereits durch die jeweilige mit freien Radikalen assoziierte Erkrankung befallen ist, und zwar in einer Menge, die ausreicht, um den Zustand und dessen Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zum Stillstand zu bringen. Eine angemessene Menge, um dies zu bewerkstelligen, ist als eine "therapeutisch wirksame Dosis oder Menge" oder "wirkungsvolle Dosis oder Menge" definiert. Mengen, die für diese Anwendung wirksam sind, hängen von der Schwere des Zustands, dem allgemeinen Befinden des Patienten und der Route der Verabreichung ab, liegen aber allgemein im Bereich von etwa 1 mg bis etwa 10 g eines bzw. von antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes/en pro Dosis, wobei eher Dosierungen von 10 mg bis 2000 mg pro Patient üblicherweise verwendet werden. Wenn zum Beispiel akute myokardiale Ischämie-/Reoxygenierungsvorfälle behandelt werden, können etwa 10 bis 1000 mg eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes systemisch durch intravenöse Infusion verabreicht werden, oder es können alternativ etwa 1 mg bis 500 mg eines bzw. von antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes/en durch intraperikardiale Injektion verabreicht werden, um erhöhte lokale Konzentrationen von SOD-Aktivität im Myokard vorzusehen.
Bei prophylaktischen Anwendungen können Zusammensetzungen, welche den/die antioxidierenden cyclischen Salen-Übergansmetall-Komplex(e) oder Cocktails davon enthalten, an einen Patienten verabreicht werden, der nicht bereits im Erkrankungszustand ist, um die Widerstandfähigkeit des Patienten zu verbessern oder um die Progression der Krankheit zu verlangsamen. Eine solche Menge ist als "prophylaktisch wirksame Dosis oder Menge" definiert. Bei dieser Anwendung hängen die exakten Mengen wiederum vom Gesundheitszustand des Patienten und vom allgemeinen Immunitätsniveau ab, liegen aber allgemein im Bereich von 1 mg bis 10 g pro Dosis, insbesondere 10 bis 1000 mg pro Patient. Eine typische Formulierung eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes enthält zwischen etwa 2,5 und 250 mg des cyclischen Salen-Metall-Komplexes in einer Einheitsdosierungsform.
Nachdem es zu einer feststellbaren Verbesserung in den Befindlichkeiten des Patienten gekommen ist, wird eine Aufrechterhaltungsdosis bei Bedarf verabreicht. Anschließend können die Dosis, die Häufigkeit der Verabreichung oder beides verringert werden als eine Funktion der Symptome, und zwar in einem Grade, in dem der verbesserte Zustand aufrechterhalten wird. Wenn die Symptome auf die gewünschte Ebene abgeschwächt wurden, kann die Behandlung aufhören. Patienten können jedoch eine intermittierende Behandlung auf Langzeitbasis bei einem erneuten Auftreten der Krankheitssymptome oder als eine prophylaktische Maßnahme zur Verhinderung des Wiederauftretens des Krankheitssymptoms benötigen.
VI. Andere Anwendungen und Zusammensetzungen für die cyclischen Salen-Metall-Verbindungen
A. Verwendung von cyclischen Salen-Metall-Verbindungen zum Schutz von Blut, Geweben und Organen
Gemäß einem weiteren Aspekt kann/können der/die antioxidierende/n cyclische/n Salen-Metall-Komplexe der vorliegenden Erfindung extravasiertem Blut für die Transfusion zugegeben werden, um oxyradikale Schäden an den Blutzellen und Komponenten während der Lagerung zu inhibieren. Außerdem können solche antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe auch zur Verringerung oxyradikaler Schädigung bei Blutzellen in vivo oder ex vivo verwendet werden.
Antioxidierende(r) cyclische(r) Salen-Metall-Komplexe) können/kann ebenfalls den Perfusions-, Spül- oder Aufbewahrungslösungen für Organe und Gewebe, wie für die Organtransplantation oder für chirurgische Spülungen, zugegeben werden. Zum Beispiel werden herausgeschnittene Organe häufig vor der Transplantation in einen Empfänger in eine Konservierungslösung gegeben. Der Einschluss von mindestens einer Spezies eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes in einer Konservierungslösung, in der Regel in einer Konzentration von etwa 0,01 mM bis etwa 10 mM, ist für die Verringerung von Schäden infolge von Ischämie während der Aufbewahrung und Reperfusionsschaden im Anschluss an die Reimplantation in den Empfänger erwünscht. Verschiedene im Fachbereich beschriebene Lösungen sind für den Einschluss eines Salen-Metall-Komplexes geeignet, darin eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, jene, die in dem US-Patent Nr. 5 145 771; Beyersdorf (1990) Chem. Abst. 113: 84849w; US-Patent Nr. 4 879 283; US-Patent Nr. 4 873 230; und US-Patent Nr. 4 798 824 beschrieben, die alle hierin durch den Bezug eingeschlossen sind.
Typischerweise liegt der antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplex in der Spül- oder Aufbewahrungslösung in einer Konzentration von etwa 1 μM bis etwa 1 mM, und stärker bevorzugt in einer Konzentration von etwa 10 bis100 μM vor. Zum Beispiel umfasst eine geeignete Spüllösung, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Ringersche Lösung (102 mM NaCl, 4 mM KCl, 3 mM CaCl₂, 28 mM Natriumlactat, pH-Wert 7,0) oder eine Ringersche Lösung mit 0,1 mM Adenosin und einen der antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe der vorliegenden Erfindung in einer Endkonzentration von 50 μM. Die Spüllösung kann weiter zusätzliche Antioxidanzien (z. B. Glutathion, Allopurinol etc.) umfassen. Konservierungs-, Perfusions- oder Spüllösungen, die einen antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplex enthalten, können zur Vorsehung einer verbesserten Aufbewahrung oder zur Ausspülung von Organen (z. B. Niere, Leber, Pankreas, Lunge, fötales neurales Gewebe, Herz, vaskuläre Transplantate, Knochen, Band, Sehne, Haut, Cornea bzw. Hornhaut etc.) verwendet werden, was die Lebensfähigkeit des Gewebes verbessern soll und die Beständigkeit gegenüber oxidativer Schädigung (z. B. als eine Folge von Ischämie/Reperfusion) erhöhen soll.
Alternativ kann die Fähigkeit der antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe, den Abbau von reaktiver Sauerstoffspezies zu katalysieren, in vorteilhafter Weise zur Inhibierung oder Verlangsamung von Beschädigung biologischer Gewebe und Zellen verwendet werden. Zum Beispiel ist Benzoylperoxid eine weithin angewandte Behandlung von Läsionen durch Akne. Jedoch kann eine übermäßige oder unangemessene Aufbringung von Benzoylperoxid (z. B. die unbeabsichtigte Aufbringung auf die Augen) durch lokale (oder falls gewünscht, systemische) Verabreichung eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Desgleichen können oxyradikal-induzierte Schäden bei Bindegeweben (z. B. Kollagen), die mit der Exposition an UV-Licht, Zigarettenrauchen und Alterung einhergehen, durch die Verabreichung eines antioxidierenden Salen-Metall-Komplexes ungefähr gleichzeitig mit der Exposition an UV-Licht, Zigarettenrauchen oder einem anderen Oxyradikale erzeugenden Prozess (z. B. Zellalterung) verringert werden.
B. Verwendung von cyclischen Salen-Metall-Verbindungen für den Chemoschutz und Strahlenschutz
Antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe, typischerweise antioxidierende cyclische Salen-Übergangsmetall-Komplexe, können zum Schutz von Zellen und Geweben vor freie Radikale erzeugenden Mitteln, wie ionisierender Strahlung (z. B. UV-Strahlung, Gamma- (γ-)Strahlung etc.) und Chemotherapeutika (z. B. Bleomycin) verwendet werden. Vorzugsweise wird eine Schutzdosis, welche mindestens etwa 1 μg eines cyclischen Salen-Metall-Komplexes/kg Körpergewicht umfasst, über eine oder mehrere Routen (z. B. oral, intravenös, intraperitoneal, intragastrale Spülung, Einlauf, Infusion über die Pfortader (Vena portae), topisch, oder die Inhalation von Nebel) verabreicht. Die antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe werden vorzugsweise zuvor an einen Patienten vorher, vor Beginn der Chemotherapie und/oder Strahlentherapie, in der Regel innerhalb etwa 24 Stunden ab Beginn, und vorzugsweise innerhalb etwa 3–6 Stunden ab Beginn der Chemotherapie und/oder Strahlentherapie verabreicht. Antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe können kontinuierlich an den Patienten im Verlauf der Therapie und/oder nach der Therapie (z. B. unmittelbar nach der Therapiebehandlung) verabreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verabreichung durch Injektion von Liposomen oder Immunoliposomen für die zielgerichtete Abgabe der antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexe zum Schutz normaler Zellen, zum Beispiel vor der Toxizität freier Radikale in Zusammenhang mit Chemotherapie oder Strahlentherapie, zum Beispiel eines Neoplasmas. Zum Beispiel kann eine Lösung eines antioxidierenden Salen-Metall-Komplexes in Micellen eingekapselt werden zur Bildung von Immunoliposomen (siehe das US-Patent Nr. 5 043 164, US-Patent Nr. 4 957 735, US-Patent Nr. 4 925 661; Connor und Huang (1985) J. Cell Biol. 101:582; Lasic, D.D. (1992) Nature 355:279; Novel Drug Delivery (Hrsg. Prescott L. F. und Nimmo W. S.: Wiley, New York, 1989); und Reddy et al.. (1992) J. Immunol. 148:1585, die alle durch den Bezug hierin eingeschlossen sind). Die Immunoliposomen, welche die antioxidierende cyclische Salen-Metall-Verbindung enthalten, können eine Targetbindungseinheit (z. B. einen monoklonalen Antikörper) umfassen, welcher die Immunoliposomen entweder auf nicht-neoplastische oder neoplastische Zellen richtet, die sonst empfindlich gegenüber Strahlentherapie oder Chemotherapie sind. Zum Beispiel können Immunoliposomen mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch an ein hämatopoetisches Stammzellenantigen bindet, das nicht auf den Krebszellen der individuellen Person vorliegt, zur Targetbindung von antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexen auf hämatopoietischen Stammzellen verwendet werden, wodurch die Stammzellen gegenüber Strahlentherapie oder Chemotherapie geschützt werden, die zur Behandlung von Krebs angewandt werden. Eine solche Strategie kommt vorzugsweise zum Einsatz, wenn das Chemotherapeutikum freie Radikale in vivo bildet (z. B. Bleomycin).
Antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe können auch an einzelne Personen verabreicht werden, um eine Strahlungsschädigung oder chemische Schädigung durch freie Radikale erzeugende Mittel zu verhindern. Zum Beispiel können an militärisches Personal und Personen, die in der Atom-, Nuklearmedizin- und/oder Chemie-Industrie arbeiten, cyclische Salen-Metall-Komplexe prophylaktisch verabreicht werden. Antioxidierende Salen-Metall-Komplexe können ebenfalls als Chemoschutzmittel verwendet werden, um chemische Karzinogenese; insbesondere durch Karzinogene, die reaktive Epoxidintermediate (z. B. Benzo-[a]-pyren, Benzanthracen) bilden, und durch Karzinogene oder unterstützende Mittel bzw. Promotoren, die freie Radikale direkt oder indirekt bilden (z. B. Phenobarbital, TPA, Benzoylperoxid, Peroxisom-Proliferatoren: Ciprofibrat, Clofibrat etc.), zu verhindern. Personen, die an solche chemischen Karzinogene ausgesetzt sind, können mit einem antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes vorbehandelt werden, um das Auftreten oder das Risiko der Entwicklung von Neoplasie zu verringern.
Antioxidierende cyclische Salen-Metall-Komplexe können auch in eine lipophile Grundlage (oder falls gewünscht in einen wässrigen Träger) für die topische Aufbringung bei Kosmetika oder zu einem Basis- oder Dental-Liniment (z. B. periodontale Erkrankung) für die topische Aufbringung für die lokale Prävention von Entzündungen und/oder Gewebeschäden als eine Folge von Entzündungen (z. B. Psoriasis, atopische Dermatitis etc.) formuliert werden. Wie für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich wird, können die cyclischen Salen-Metall-Komplexe der vorliegenden Erfindung allein zur Behandlung von Entzündungen verwendet werden, oder alternativ können sie in Kombination mit anderen bekannten entzündungshemmenden Mitteln verwendet werden. Eine Vielzahl an steroidalen und nicht-steroidalen entzündungshemmenden Mitteln kann mit einer antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Verbindung der vorliegenden Erfindung kombiniert werden und zur Behandlung von Entzündungen verwendet werden.
Beispiele für geeignete steroidale entzündungshemmende Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Corticosteroide, wie Hydrocortison, Hydroxyltriamcinolon, α-Methyldexamethason, Dexamethasonphosphat, Beclomethasondipropionat, Clobetasolvalerat, Desonid, Desoxymethason, Desoxycorticosteronacetat, Dexamethason, Dichlorison, Diflorasondiacetat, Diflucortolonvalerat, Fluadrenolon, Fluclorolonacetonid, Fludrocortison, Flumethasonpivalat, Fluocinolonacetonid, Fluocinonid, Flucortinbutylester, Fluocortolon, Flupredniden (Fluprednyliden)acetat, Flurandrenolon, Halcinonid, Hydrocortisonacetat, Hydrocortisonbutyrat, Methylprednisolon, Triamcinolonacetonid, Cortison, Cortodoxon, Flucetonid, Fluradrenolonacetonid, Medryson, Amcinafel, Amcinafid, Betamethason und die Summe ihrer Ester, Chlorprednison, Chlorprednisonacetat, Clocortolon, Clescinolon, Dichlorison, Difluprednat, Flucloronid, Flunisolid, Fluormethalon, Fluperolon, Flupreclescinolon, Hydrocortisonvalerat, Hydrocortisoncyclopentylpropionat, Hydrocortamat, Pammethason, Prednisolon, Prednison, Triamcinolon und Mischungen davon können verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der cyclische Salen-Metall-Komplex der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Hydrocortison verwendet.
Beispiele für geeignete nichtsteroidale entzündungshemmende Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Piroxicam, Isoxicam, Tenoxicam, Sudoxicam, CP-14 304, Aspirin, Disalcid, Benorylat, Trilisat, Safapryn, Solprin, Diflunisal, Fendosal, Diclofenac, Fenclofenac, Indomethacin, Sulindac, Tolmetin, Isoxepac, Furofenac, Tiopinac, Zidometacin, Acemetacin, Fentiazac, Zomepirac, Clidanac, Oxepinac, Felbinac, Mefenamin-, Meclofenamin-, Flufenamin-, Niflumin-, Tolfenaminsäuren, Ibuprofen, Naproxen, Benoxaprofen, Flurbiprofen, Ketoprofen, Fenoprofen, Fenbufen, Indoprofen, Pirprofen, Carprofen, Oxaprozin, Pranoprofen, Miroprofen, Tioxaprofen, Suprofen, Alminoprofen, Tiaprofenin, Phenylbutazon, Oxyphenbutazon, Feprazon, Azapropazon, Trimethazon und dergleichen. Mischungen dieser nichtsteroidalen entzündungshemmenden Mittel können ebenfalls verwendet werden, ebenso wie die pharmazeutisch annehmbaren Salze und Ester dieser Mittel. Von den nichtsteroidalen entzündungshemmenden Mitteln sind Ibuprofen, Ketoprophen, Naproxen, Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, Meclofenaminsäure, Piroxicam und Felbinac bevorzugt, und Ibuprofen, Naproxen und Flufenaminsäure sind am meisten bevorzugt. Außerdem ist Etofenamat, ein Flufenaminsäurederivat, besonders nützlich für die topische Aufbringung.
Schließlich sind so genannte "natürliche" entzündungshemmende Mittel in der vorliegenden Erfindung nützlich. Zum Beispiel können Kandelillawachs, α-Bisabolol, Aloe vera, Manjistha (extrahiert aus Pflanzen der Gattung Rubia, insbesondere Rubia Cordifolia) und Guggul (extrahiert aus Pflanzen der Gattung Commiphora, insbesondere Commiphora Mukul) ebenfalls verwendet werden.
Die pharmazeutischen/kosmetischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zum Beispiel als Lösungen formuliert sind, schließen typischerweise ein pharmazeutisch oder kosmetisch annehmbares organisches Lösungsmittel ein. Die Ausdrücke "pharmazeutisch annehmbares organisches Lösungsmittel" und " kosmetisch annehmbares organisches Lösungsmittel" beziehen sich auf ein organisches Lösungsmittel, welches zusätzlich zu der Tatsache, dass darin eine cyclische Salen-Metall-Verbindung der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls ein weiteres entzün dungshemmendes Mittel dispergiert oder gelöst werden kann, auch eine akzeptable Sicherheit (z. B. Reizungs- und Sensibilisierungscharakteristika) sowie gute ästhetische Eigenschaften besitzt (z. B. fühlt es sich nicht schmierig oder klebrig an). Das üblichste Beispiel für ein solches Lösungsmittel ist Isopropanol. Beispiele für andere geeignete organische Lösungsmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Propylenglykol, Polyethylenglykol (200-600), Polypropylenglykol (425-2025), Glycerol, 1,2,4-Butantriol, Sorbitolester, 1,2,6-Hexantriol, Ethanol, Butandiol, Wasser und Mischungen davon. Typischerweise enthalten diese Lösungen etwa 0,0001 % bis etwa 20 %, vorzugsweise etwa 0,01 % bis etwa 1 % eines antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplexes und gegebenenfalls etwa 0,01 % bis etwa 5 %, vorzugsweise etwa 0,5 % bis etwa 2 % eines entzündungshemmenden Mittels und etwa 80 % bis etwa 99 %, vorzugsweise etwa 90 % bis etwa 98 % eines annehmbaren organischen Lösungsmittels.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Erweichungsmittel" auf Materialien, die für die Verhinderung von oder Erleichterung bei Trockenheit sowie für den Schutz der Haut verwendet werden. Eine breite Vielzahl an geeigneten Erweichungsmitteln ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und kann hierin verwendet werden (siehe Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2. Ausg., Bd. 1, S. 32-43 (1972), die hierin durch den Bezug mit eingeschlossen ist und zahlreiche Beispiele von geeigneten Materialien enthält). Beispiele für Klassen nützlicher Erweichungsmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, die Folgenden: Kohlenwasserstofföle und -wachse; Silikonöle; Triglyceridester; Acetoglyceridester; ethoxylierte Glyceride; Alkylester von Fettsäuren mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen; Alkenylester von Fettsäuren mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen; Fettsäuren mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen; Fettalkohole mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen; Fettalkoholether; Ether-Ester, wie Fettsäureester von ethoxylierten Fettalkoholen; Lanolin und Derivate; mehrwertige Alkohole und Polyetherderivate; Ester mehrwertiger Alkohole; Wachsester, wie Bienenwachs, Spermazet, Myristylmyristat, Stearylstearat; Bienenwachsderivate; pflanzliche Wachse, einschließlich Karnauba- und Kandelillawachse; Phospholipide, wie Lecithin und Derivate; Sterole; und Amide. Eine ausführlichere Auflistung, die solche Vertreter von Musterbeispielen jeder dieser Klassen von nützlichen Erweichungsmitteln darlegt, ist in den US-Patenten Nr. 5 403 834, 5 834 509, 5 696 109 und 5 827 880 zu finden.
Besonders nützliche Erweichungsmittel sind jene, die Hautkonditionierungseigenschaften vermitteln, und schließen zum Beispiel Glycerol, Hexantriol, Butantriol, Milchsäure und deren Salze, Harnstoff, Pyrrolidoncarbonsäure und deren Salze, Aminosäuren, Guanidin, Diglycerol und Triglycerol ein. Ferner sind andere bevorzugte Hautkonditionierungsmittel die propoxylierten Glycerolderivate.
Die Erfindung wird ausführlicher anhand spezifischer Beispiele beschrieben. Die folgenden Beispiele dienen zu Erläuterungszwecken und sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken. Fachleute auf dem Gebiet werden ohne Weiteres eine Vielzahl an nicht kritischen Parametern erkennen, die verändert oder modifiziert werden können, um im Wesentlichen die gleichen Resultate zu liefern.
BEISPIELE
I. Beispiel I
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Salen-Metall-Verbindungen und insbesondere von cyclischen Salen-Metall-Verbindungen mit einer Überbrückungsgruppe an der 3,3'-Position.
A. Allgemeines Verfahren für die Herstellung von Salen-Metall-Verbindungen:
Schritt I: Herstellung von 2-Hydroxy-3-alkyloxybenzaldehyd:
Einer Suspension von NaH (2,3 Äquivalente) in trockenem DMSO (10 ml/g) unter Argon wird eine Lösung von 2,3-Dihydroxybenzaldehyd (1 Äquivalent) in trockenem DMSO (4 ml/g) über einen Zeitraum von 1 h unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Temperatur wurde unter 25°C gehalten. Nach Rühren während 1 h wurde 1 Äquivalent von RX, d. h. das Alkylhalogenid (Chlorid, Bromid oder Iodid) in 1 Portion zugegeben. Diese Mischung wurde 24 h lang gerührt. Diese Mischung wurde dann mit Wasser gelöscht. Die resultierende Lösung wurde zwei Mal mit Ethylacetat extrahiert. Diese organischen Extrakte, die kleine Mengen des nicht umgesetzten Alkylhalogenids enthalten, wurden weggeschüttet. Die wässrige Schicht wurde mit 6M HCl auf einen pH-Wert von etwa 1 angesäuert und drei Mal mit Ethylacetat extrahiert. Diese kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ (wasserfrei) getrocknet und konzentriert unter Erhalt eines Rohprodukts. Das Rohprodukt wurde auf Silicagel auf einer Säule unter Verwendung eines Gradientenlösungsmittelsystems aus Ethylacetat und Hexan gereinigt. Ausbeute: 60 %. Das Produkt wurde durch NMR-Analyse nachgewiesen.
Schritt II: Herstellung von Mangan-Salen-Komplexen:
2-Hydroxy-3-alkyloxybenzaldehyd (1 Äquivalent) wurde in absolutem Ethanol (15 ml/g) gelöst. 1,2-Ethylendiamin (1 Äquivalent) und Mangan(II)-acetattetrahydrat (1 Äquivalent) wurden der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde während 24 h gerührt. Druckluft (oder Sauerstoff) wurde über die Reaktionsmischung während 4 h geblasen, um den Oxidationsvorgang abzuschließen. Die Reaktionsmischung wurde dann auf einem Rotationsverdampfer konzentriert, und der erhaltene Rückstand wurde mit Aceton trituriert, filtriert und getrocknet. Ausbeute: 80 %. Das Rohprodukt wurde aus Methanol-Ether auskristallisiert. Das Produkt wurde durch Elementaranalyse nachgewiesen.
B. Allgemeines Verfahren für die Herstellung von cyclisierten Salen-Metall-Verbindungen:
Schritt I: Herstellung von 3,3'-Alkendioxy-bis(2-hydroxybenzaldehyd)
Einer Suspension von NaH (2,3 Äquivalente) in trockenem DMSO (10 ml/g) unter Argon wird eine Lösung von 2,3-Dihydroxybenzaldehyd (1 Äquivalent) in trockenem DMSO (4 ml/g) über einen Zeitraum von 1 h unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Temperatur wurde unter 25°C gehalten. Nach Rühren während 1 h wurden 0,47 Äquivalente des Alkyldihalogenids (Chlorid, Bromid oder Iodid) in 1 Portion zugegeben. Diese Mischung wurde 24 h lang gerührt. Diese Mischung wurde dann mit Wasser gelöscht. Die resultierende Lösung wurde zwei Mal mit Ethylacetat extrahiert. Diese organischen Extrakte, die kleine Mengen des nicht umgesetzten Alkyldihalogenids enthalten, wurden weggeschüttet. Die wässrige Schicht wurde mit 6M HCl auf einen pH-Wert von etwa 1 angesäuert und drei Mal mit Ethylacetat extrahiert. Diese kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ (wasserfrei) getrocknet und konzentriert unter Erhalt eines Rohprodukts. Das Rohprodukt wurde auf Silicagel auf einer Säule unter Verwendung eines Gradientenlösungsmittelsystems von Ethylacetat und Hexan gereinigt. Ausbeute: 60 %. Das Produkt wurde durch NMR-Analyse nachgewiesen.
Schritt II: Herstellung von cyclisierten Salen-Metall-Verbindungen:
Der Bisaldehyd (1 Äquivalent) wurde in absolutem Ethanol (1333 ml/g) gelöst. Das Diamin (1 Äquivalent von 1,2-Phenylendiamin oder 1,2-Ethylendiamin) und Mangan(II)acetattetrahydrat wurden der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde während 24 h gerührt. Druckluft (oder Sauerstoff) wurde über die Reaktionsmischung während 4 h geblasen, um das Oxidationsverfahren abzuschließen. Die Reaktionsmischung wurde dann auf einem Rotationsverdampfer konzentriert, und der erhaltene Rückstand wurde mit Aceton trituriert, filtriert und getrocknet. Ausbeute: 80 %. Das Rohprodukt wurde aus Methanol-Ether auskristallisiert. Das Produkt wurde durch Elementaranalyse und GPC-Analyse nachgewiesen.
C: Allgemeines Herstellungsverfahren für C155:
Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren, das zur Herstellung von C155 verwendet werden kann, welches hierin auch als FC-06-155 bezeichnet wird.
1. Experimentelle Verfahrensweise
Allgemein. Alle Ausgangsmaterialien wurden von Aldrich erhalten und wie erhalten verwendet. Alle feuchtigkeitsempfindlichen Reaktionen wurden unter einer Atmosphäre von trockenem Stickstoff durchgeführt. Trockenes DMSO wurde durch Destillation über aktivierten 4Ǻ-Molekülsieben erhalten und auf aktivierten 4Ǻ-Molekülsieben gehalten.
2. II-1-Triethylenglykolditoluol-4-sulfonat (FC-06-145)
Die angewandte Verfahrensweise stammte von Cornforth, J.W. et al., Tetrahedron, 1973, 29, 1659-1667, deren Lehren hierin durch den Bezug eingeschlossen sind.
Eine Lösung von Toluol-4-sulfonylchlorid (84 g) in THF (150 ml) wurde in kleinen Portionen unter Schütteln zu einer Lösung von Tri-(ethylenglykol) (30 g) und NaOH (21 g) in Wasser (100 ml) zugegeben. Die Mischung wurde während 2 h geschüttelt und über Nacht stehen gelassen. Das Produkt wurde mit Toluol extrahiert, der Toluol-Extrakt wurde mit Wasser, verdünntem wässrigem Na₂CO₃ und Wasser gewaschen, getrocknet (CaCl₂) und bis zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde aus Toluol/Ether auskristallisiert. Das Präzipitat wurde filtriert und mehrmals mit Ether gewaschen, was zu einem weißen Pulver führte (80,96 g, 88 % Ausbeute).
¹H NMR (CDCl₃) δ 7,80 (d,J = 8,4 Hz, 4H, HAr), 7,35 (d,J = 8,4 Hz, 4H, HAr), 4,15 (m, 4H, TsOCH₂CH₂O), 3,66 (m, 4H, TsOCH₂CH₂O), 3,41 (S, 4H, OCH₂CH₂O), 2,46 (s, 6H, CH₃); Massenspektrometrie, (EI, 70 eV) m/z = 286 (M-TsOH, 0,69 %); Anal. berechnet für C₂₀H₂₆O₈S₂; C, 52,39; H, 5,72. Festgestellt: C, 52,67; H, 5,31.
3. II-2-3,3'-(3,6-Dioxaoctan-1,8-diyldioxy)bis(2-hydroxybenzaldehyd) (FC-06-148)
Die angewandte Verfahrensweise stammte von Van Staveren, C.J., J. Am. Chem. Soc., 1998, 110, 4994-5008, deren Lehren hierin durch den Bezug eingeschlossen sind.
Einer Suspension von NaH (60 % in Öl) unter N₂ (6,48 g, 0,16) in 35 ml trockener DMSO wurde eine Lösung von 2,3-Dihydroxybenzaldehyd (10,18 g, 0,073 Mol) in 40 ml trockenem DMSO über einen Zeitraum von 2 h unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Temperatur wurde unterhalb 25°C gehalten. Nach Rühren während 1 h wurde (FC-06-145) (16,73 g, 0,036 Mol) in 1 Portion zugegeben. Diese Mischung wurde während 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 300 ml Wasser zugegeben, und diese wässrige Schicht wurde mit 6M HCl auf einen pH-Wert von 1 angesäuert und mit CHCl₃ (1 L) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden über MgSO₄ getrocknet. Nach der Entfernung von Lösungsmittel wurde ein Rohprodukt erhalten, welches durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (CH₂Cl₂, iPrOH 2,5 %). Die Schichten, welche das Produkt mit Rf = 0,35 enthielten, wurden kombiniert und Lösungsmittel wurden entfernt. MeOH wurde dem klebrigen orangefarbenen Öl zugegeben, bis die Verbindung ausfiel. Das Präzipitat wurde abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, was zu einer leicht gelben Festsubstanz führte (6,3 g, 44 % Ausbeute).
¹H NMR (CDCl₃) δ 10,88 (s, 2H, OH), 9,95 (s, 2H, CHO), 7,19 (m, 4H, HAr), 6,92 (m, 2H, HAr), 4,22 (t,J = 5,1 Hz, 4H, ArOCH₂CH₂O), 3,90 (t, J = 5,1 Hz, 4H, ArOCH₂CH₂O), 3,78 (s, 4H, OCH₂CH₂O); Massenspektrometrie, (EI, 70 eV) m/z = 390 (M+, 18,47 %); IR (Nujol) 1637 (C=O) cm^–1; Anal. berechnet für C₂₀H₂₂O₈; C, 61,53; N, 5,68. Festgestellt: C, 60,67; N, 5,40.
4. II-3-EUK-500 (FC-06-155 oder C155)
(FC-06-148) wurde zuvor zerstoßen, um ein sehr feines Pulver zu erhalten. (FC-06-148) (0,92 g, 2,3 mMol), (1R, 2R)-(+)-diphenylethylendiamin (0,50 g, 2,3 mMol) und Mangan(II)-acetattetrahydrat (0,57 g, 2,3 mMol) wurden zum gleichen Zeitpunkt in 500 ml absoluten Ethanol unter N₂ zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde während 4 h Luft durch die Lösung perlen gelassen. Nach der Entfernung von Lösungsmittel wurde das erhaltene schwarze Öl in der Mindestmenge von Aceton gelöst und durch Zugeben einer großen Menge von Hexan ausgefällt. Das Präzipitat wurde dann abfiltriert, mehrmals mit Hexan gewaschen und unter Vakuum 72 h lang getrocknet, was zu einem dunklen Pulver führte (1,7 g, 98 % Ausbeute).
Massenspektrometrie, (ES-MS, MeOH) m/z = 619,2 (M+); UV-sichtbar (MeOH HPLC-Güteklasse) λ (ε mol^–1 L cm^–1): 236 (51,1 × 10³), 288 (15,3 × 10³), 324 (13,5 × 10³), 412 (5,2 × 10³); Anal. berechnet für C₃₆H₃₅N₂O₈Mn•3H₂O: C, 59,02; N, 5,64; N, 3,82. Festgestellt: C, 58,76; H, 5,32; N, 3,72.
D. Allgemeines Verfahren für die Herstellung von C151:
Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren, das zur Herstellung von C151 angewandt werden kann, das hierin auch als FC-06-151 bezeichnet wird.
1. Experimentelle Verfahrensweise
Allgemein. Alle Ausgangsmaterialien wurden von Aldrich erhalten und wie erhalten verwendet. Alle feuchtigkeitsempfindlichen Reaktionen wurden unter einer Atmosphäre von trockenem Stickstoff durchgeführt. Trockenes DMSO wurde durch Destillation über aktivierten 4Ǻ-Molekülsieben erhalten und auf aktivierten 4Ǻ-Molekülsieben gehalten.
2. II-1-Triethylenglykolditoluol-4-sulfonat (FC-06-145)
Die angewandte Verfahrensweise folgte derjenigen, die bei Cornforth, J.W. et al., Tetrahedron, 1973, 29, 1659-1667, dargelegt ist, deren Lehren hierin durch den Bezug eingeschlossen sind.
Eine Lösung von Toluol-4-sulfonylchlorid (84 g) in THF (150 ml) wurde in kleinen Portionen unter Schütteln zu einer Lösung von Tri-(ethylenglykol) (30 g) und NaOH (21 g) in Wasser (100 ml) zugegeben. Die Mischung wurde während 2 h geschüttelt und über Nacht stehen gelassen. Das Produkt wurde mit Toluol extrahiert, der Toluol-Extrakt wurde mit Wasser, verdünntem wässrigem Na₂CO₃ und Wasser gewaschen, getrocknet (CaCl₂) und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Toluol/Ether auskristallisiert. Das Präzipitat wurde filtriert und mehrmals mit Ether gewaschen, was zu einem weißen Pulver führte (80,96 g, 88 % Ausbeute).
¹H NMR (CDCl₃) δ 7,80 (d,J = 8,4 Hz, 4H, HAr), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 4H, HAr), 4,15 (m, 4H, TsOCH₂CH₂O), 3,66 (m, 4H, TsOCH₂CH₂O), 3,41 (S, 4H, OCH₂CH₂O), 2,46 (s, 6H, CH₃); Massenspektrometrie, (EI, 70 eV) m/z = 286 (M-TsOH, 0,69 %); Anal. berechnet für C₂₀H₂₆O₈S₂; C, 52,39; N, 5,72. Festgestellt: C, 52,67; H, 5,31.
3. II-2-2,3'-(3,6-Dioxaoctan-1,8-diyldioxy)bis(2-hydroxybenzaldehyd) (FC-06-148)
Die angewandte Verfahrensweise wurde bei Van Staveren, C. J., et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 110, 4994-5008, deren Lehren hierin durch den Bezug eingeschlossen sind, dargelegt.
Einer Suspension von NaH (60 % in Öl) unter N₂ (6,48 g, 0,16) in 35 ml trockenem DMSO wurde eine Lösung von 2,3-Dihydroxybenzaldehyd (10,18 g, 0,073 Mol) in 40 ml trockenem DMSO über einen Zeitraum von 2 h unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Temperatur wurde unterhalb 25°C gehalten. Nach Rühren während 1 h wurde (FC-06-145) (16,73 g, 0,036 Mol) in 1 Portion zugegeben. Diese Mischung wurde während 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 300 ml Wasser zugegeben, und diese wässrige Schicht wurde mit 6M HCl auf einen pH-Wert = 1 angesäuert und mit CHCl₃ (1 L) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden über MgSO₄ getrocknet. Nach der Entfernung von Lösungsmittel wurde ein Rohprodukt erhalten, welches durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (CH₂Cl₂, iPrOH 2,5 %). Die Schichten, welche das Produkt mit Rf = 0,35 enthielten, wurden kombiniert und Lösungsmittel wurden entfernt. MeOH wurde dem klebrigen orangefarbenen Öl zugegeben, bis die Verbindung ausfiel. Das Präzipitat wurde abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, was zu einer leicht gelben Festsubstanz führte (6,3 g, 44 % Ausbeute).
¹H NMR (CDCl₃) δ 10,88 (s, 2H, OH), 9,95 (s, 2H, CHO), 7,19 (m, 4H, HAr), 6,92 (m, 2H, HAr), 4,22 (t,J = 5,1 Hz, 4H, ArOCH₂CH₂O), 3,90 (t, J = 5,1 Hz, 4H, ArOCH₂CH₂O), 3,78 (s, 4H, OCH₂CH₂O); Massenspektrometrie, (EI, 70 eV) m/z = 390 (M+, 18,47 %); IR (Nujol) 1637 (C=O) cm^–1; Anal. berechnet für C₂₀H₂₂O₈: C, 61,53; H, 5,68. Festgestellt: C, 60,67; H, 5,40.
4. II-3-EUK-500 (FC-06-151 oder C151)
(FC-06-148) wurde zuvor zerstoßen, um ein sehr feines Pulver zu erhalten. (FC-06-148) (1,99 g, 5,1 mMol), (1R, 2R)-(-)-diaminocyclohexan (0,58 g, 5,1 mMol) und Mangan(II)-acetattetrahydrat (1,25 g, 5,1 mMol) wurden zum gleichen Zeitpunkt in 500 ml absolutem Ethanol unter N₂ zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde während 4 h Luft durch die Lösung perlen gelassen. Nach der Entfernung von Lösungsmittel wurde das erhaltene schwarze Öl in der Mindestmenge von Methanol gelöst und durch Zugeben einer großen Menge von Diethylether ausgefällt. Das Ausfällungsprodukt wurde dann abfiltriert, mehrmals mit Diethylether gewaschen und unter Vakuum während 22 h getrocknet, was zu einem dunklen Pulver führt (2,5 g, 78 % Ausbeute).
Massenspektrometrie, (ES-MS, MeOH) m/z = 521,2 (M+); UV-sichtbar (MeOH HPLC-Güteklasse) λ (ε mol^–1 L cm^–1): 232 (44,5 × 10³), 292 (13,3 × 103), 320 (12,0 × 10³), 402 (5,1 × 10³); Anal. berechnet für C₂₈H₃₃N₂O₈Mn•2,5H₂O: C, 53,76; N, 6,12; N, 4,47. Festgestellt: C, 53,95; H, 5,86; N, 4,32.
II. Beispiel II
Dieses Beispiel erläutert die verschiedenen Assays, die zum Screening der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen (CSMCs) der vorliegenden Erfindung auf biologische Aktivität verwendet werden können. Ferner sind geeignete Assays zum Screening der cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf biologische Aktivität auch in den US-Patenten Nr. 5 403 834, 5 834 509, 5 696 109 und 5 827 880 offenbart, deren Lehren hierin durch den Bezug für alle Zwecke eingeschlossen sind.
A. Assays zum Screening auf katalytische Aktivitäten
Die folgenden Assays können zum Screenen auf antioxidierende katalytische Aktivität verwendet werden. Insbesondere können die folgenden Assays zum Screenen auf Superoxiddismutase- und Katalase-Aktivitäten verwendet werden.
Die SOD-Aktivität der Verbindungen kann durch Evaluierung der Inhibierung der Verringerung von Cytochrom c, das durch das freie Sauerstoffradikale erzeugende System, Xanthin plus Xanthinoxidase, gebildet wird, bestimmt werden. Die Verringerung von Cytochrom c wird spektrophotometrisch bei 550 nm gemäß dem Verfahren, das in Darr, et al. (1987), Arch Biochem. Biophys. 258:351 beschrieben ist, das hierin durch den Bezug mit eingeschlossen ist, überwacht. Die Konzentration von Xanthinoxidase wird so eingestellt, dass sie eine Verringerungsrate von Cytochrom c bei 550 nm von 0,025 Extinktionseinheiten pro Minute vorsieht. Unter diesen Bedingungen ist die Menge an SOD-Aktivität, die zur Inhibierung der Rate der Verringerung von Cytochrom c um 50 Prozent erforderlich ist (d. h. auf eine Rate von 0,0125 Extinktionseinheiten pro Minute) als 1 Aktivitätseinheit definiert. Cyclische Salen-Metall-Komplexe werden als Antioxidanzien identifiziert, wenn sie mindestens 0,1 Aktivitätseinheiten bei einer Konzentration von 1 mM unter diesen Standard-Assaybedingungen aufweisen.
Die Katalase-Aktivität kann mit Hilfe eines spektrophotometrischen Verfahrens gemessen werden, in welchem der Abbau von Wasserstoffperoxid bei 240 nm gemäß dem Verfahren von Aebi, et al. (1984) Methods Enzymol. 105:121, das hierin durch den Bezug eingeschlossen ist, überwacht wird. 1 Einheit der Katalase-Aktivität ist als die Menge an Enzym (oder Salen-Metall-Komplex) definiert, die erforderlich ist, um 1 μMol Wasserstoffperoxid pro Minute abzubauen.
Jede der Verbindungen, die getestet werden sollen, wird in Wasser oder Kochsalzlösung formuliert, in welcher die Verbindungen stabil sind, d. h. es ist kein Verlust an Aktivität nach mehreren Wochen Lagerung bei Raumtemperatur festzustellen. Häufig ist es wünschenswert, zuerst den cyclischen Salen-Metall-Komplex in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Ethanol) zu lösen und dann die Lösung in ein stärker polares Lösungsmittel wie Wasser zu verdünnen. Dies ist besonders bevorzugt für Salen-Metall-Spezies, die relativ hydrophob sind.
B. Assays zum Screenen auf biologische Aktivität in vivo bei Gehirn-Ischämie
Mit Hilfe des folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung leicht gescreent werden, um ihr therapeutisches Potenzial bei Gehirn-Ischämie (Schlaganfall) zu bestimmen.
Ein in breitem Umfang angewandter Assay zur Bestimmung des therapeutischen Potenzials von cyclischen Salen-Metall-Verbindungen bei Gehirn-Ischämie (Schlaganfall) besteht in der Bewertung von deren Fähigkeit zur Prävention irreversibler Schäden, die durch eine anoxische Episode in Gehirnschnitten, die unter physiologischen Bedin gungen gehalten werden, herbeigeführt werden. Schnitte von Rattengehirn werden bei 35°C in einer Interface-Kammer in einer künstlichen zerebrospinalen Flüssigkeit aufbewahrt, die Folgendes enthält: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH₂PO₄, 3 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 26 mM NaHCO₃, 10 mM D-Glucose und 2 mM L-Ascorbat, die kontinuierlich mit einer Mischung von O₂:CO₂ (95:5) begast wurde. Die Atmosphäre der Kammer wird ebenfalls kontinuierlich mit der Mischung von O₂:CO₂ (95:5) begast, außer während der anoxischen Episode, in der diese durch N₂ ersetzt wird. Axone werden elektrisch stimuliert und die hervorgerufenen exzitatorischen postsynaptischen Potenziale (EPSPs) werden unter Verwendung von Mikroelektroden aufgezeichnet.
Typischerweise werden die EPSPs unter normalen Bedingungen aufgezeichnet, fünf Minuten nach der Ersetzung von O₂ durch N₂ (ischämische Periode), und 30 bis 40 Minuten nach der Reoxygenierung. Der Grad der permanenten Schädigung kann durch Messen sowohl der Amplitude (in mV) als auch der Anfangssteigung (in mV/ms) der EPSP quantifizierung werden. Insbesondere werden Gehirnschnitte in Abwesenheit oder in Gegenwart von 50 μM einer cyclischen Salen-Metall-Verbindung (CSMC) inkubiert und einer Episode von Ischämie/Reoxygenierung unterworfen. Nach 5 Minuten Basislinienaufzeichnung wird O₂ durch N₂ während durchschnittlich 5 Minuten ersetzt. O₂ wird dann erneut eingeführt und die Aufzeichnung wird für weitere 50 Minuten fortgeführt. Als eine zusätzliche Bewertung der Wirksamkeit kann der Prozentsatz der lebensfähigen Schnitte nach wiederholten ischämischen Episoden evaluiert werden. Ein Schnitt gilt als lebensfähig, wenn ein EPSP mit einer Amplitude von 3 mV durch die Erhöhung der Stimulationsintensität hervorgerufen werden konnte.
C. Assays für Tests in einem Tiermodell von Parkinson-Krankheit
Unter Verwendung des folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung leicht gescreent werden, um deren therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von Parkinson-Krankheit zu bestimmen.
Ein Tiermodell von Parkinson-Krankheit, das die iatrogene Erzeugung von Hydroxylradikalen durch MPTP beinhaltet (Chiueh, et al. (1992) Synapse 91:346, hierin durch den Bezug mit eingeschlossen) kann zur Evaluierung der Schutzwirkung von cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf die durch freie Radikale in duzierte Schädigung verwendet werden. Das Neurotoxin, MPTP, führt, wie gezeigt wurde, zur Degeneration von dopaminergen Neuronen im Gehirn, womit ein gutes Modell von experimentell induzierter Parkinson-Krankheit geliefert wird (z. B. iatrogene Toxizität). Dieses Modell ist nun weithin im Fachbereich anerkannt und wird zur Evaluierung potenzieller Therapeutika für diese Krankheit verwendet.
Die Zahl von dopaminergen Neuronen in Gehirnen von Mäusen, die entweder behandelt wurden mit: (1) MPTP allein, (2) dem antioxidierenden cyclischen Salen-Metall-Komplex (CSMC), (3) einer Vorbehandlung mit CSMC und danach MPTP, oder (4) unbehandelten Kontrollen, wird durch Messung der Bindung des Dopaminwiederaufnahme-Liganden, Mazindol, untersucht. Tritiiertes Mazindol wird für Bindungsstudien mit Proben des Globus pallidus, Nucleus Caudatus und Striatum des Mäusegehirns gemäß herkömmlicher Verfahren verwendet; die spezifische Bindung von tritiiertem Mazindol wird autoradiographisch oder durch Membranbindung (spezifische Bindung an die Membranfraktion) bestimmt. Das Experiment wird typischerweise über einen 7-Tage-Zeitraum durchgeführt. Mäuse in der MPTP-Gruppe werden intraperitoneal mit MPTP allein behandelt (40 mg/kg an jedem Tag, an den Tagen 1 und 2). Mäuse in der MPTP+CSMC-Gruppe werden mit CSMC (33 mg/kg, i.p.) unmittelbar vor MPTP an den Tagen 1 und 2 vorbehandelt, und es wird ihnen CSMC (33 mg/kg) allein am Tag 3 gegeben. Die Tiere werden nach 7 Tagen geopfert, und die Ergebnisse werden analysiert.
D. Assays zum Screenen auf die Fähigkeit zum Schutz vor Ischämie und Reperfusion
Unter Verwendung der folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Herzen vor einer Ischämie-/Reoxygenierungsschädigung, sowohl funktionell als auch strukturell, zu schützen, evaluiert werden.
Ratten wird eine intramuskuläre Injektion von 0,25 ml einer Eisen-Dextran-Lösung (100 g Eisenhydroxid, 99 g Dextran, Wasser auf 1 L) jeden dritten Tag während eines 5-wöchigen Zeitraums gegeben, um eine signifikante Eisenüberladung im Herzgewebe zu erreichen. Am Ende dieser Behandlung werden Ratten mit Natriumpentobarbital (40 mg/kg) anästhetisiert und Heparin (1000 IU/kg) wird über eine femorale Vene verabreicht. Die Herzen werden dann entfernt und rasch durch die Aorta gemäß der von Lan gendorff, O., (1895) Pflügers Arch. 61:291, beschriebenen Technik, bei einer konstanten Strömungsrate von 11 ml/Minute perfundiert. Die Perfusionsflüssigkeit ist ein modifizierter Krebs-Henseleit-Puffer, der Folgendes enthält (in mMol/l): NaCl 118, KCl 5,9, NaHCO₃ 25, MgCl₂ 1,2, NaH₂PO₄ 0,6, CaCl₂ 2,4, Glucose 11. Der pH-Wert wird auf etwa 7,4 ± 0,05 gehalten, wenn das Pertusionsmedium mit O₂-CO₂ (95 %–5 %) bei 37°C gesättigt wird. Die Perfusionsvorrichtung wird vollständig thermostatiert, sodass die Temperatur des Perfusionsmediums etwa 37 ± 0,5°C beträgt, wenn es die Aorta erreicht. Ein extrem dünner Ballon wird in den linken Ventrikel unmittelbar nach der Einleitung der Aorta-Perfusion eingeführt und wird aufgeblasen, um so einen enddiastolischen Druck von 5 mm Hg zu erzielen. Ein 15-minütiger Stabilisierungszeitraum wird unmittelbar im Anschluss an die Ballonpositionierung initiiert. Am Ende dieses Zeitraums werden der systolische und diastolische ventrikuläre Druck und die Herzschlagrate (HR) durch einen mit dem ventrikulären Ballon verbundenen Drucktransducer aufgezeichnet. Der entwickelte Linksventrikel-Druck (LVDP) wird durch die Differenz zwischen dem systolischen und diastolischen Druck berechnet und das Produkt HR × LVDP wird als ein Index für den Sauerstoffverbrauch genommen. Herzen werden einer 15-minütigen totalen globalen normothermischen Ischämie unterworfen, gefolgt von 15 Minuten Reperfusion mit dem zu Anfang verwendeten Perfusionsmedium. Während dieser 15-minütigen Reperfusion werden die Herzrate und der diastolische und systolische Druck überwacht. Frühzeitiges Kammerflimmern wird 1 min nach Beginn der Reperfusion analysiert.
Drei Versuchsgruppen werden üblicherweise untersucht. Die Gruppe 1, in welcher Herzen mit der Standard-Perfusionsflüssigkeit perfundiert werden (Kontrollgruppe); die Gruppe 2, in welcher Herzen in Gegenwart von Dimethylthioharnstoff (DMTU, 10 mM, perfundiert werden; die Gruppe 3, in welcher Herzen in Gegenwart der CSMC der vorliegenden Erfindung perfundiert werden (50 μM). Die Herzraten (HR), systolischen Drücke (SP), diastolischen Drücke (DP) und die Produkte HR × LVDP in den drei Versuchsgruppen werden nach 15 Minuten Perfusion, vor der Ischämie, 1 Minute nach der Reperfusion und 15 Minuten nach der Reperfusion bestimmt. Die Zahl der Herzen, die Kammerflimmer-Episoden 1 Minute nach der Reperfusion zeigen, wird ebenfalls bestimmt.
Nach der 15-minütigen Reperfusion werden 3 Herzen in jeder Gruppe für die Elektronenmikroskopie durch Perfusion mit 2,5 % Glutaraldehyd präpariert. Extrem dünne Schnitte (500–600 Å Dicke) werden untersucht. Mitochondrien und Sarcomere werden bewertet. Mitochondrien werden in Typ A (normal), Typ B (angeschwollen, unzerbrochen) und Typ C (zerborstene Membranen) eingeteilt. Sarcomere werden in Typ A (normal) und Typ B (kontaktiert und/oder Nekrose) eingeteilt.
E. Assays zum Screenen auf die Fähigkeit zur Verhinderung der Entwicklung von symptomatischer EAE
Unter Verwendung des folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung leicht auf ihre Fähigkeit, die Entwicklung von symptomatischer EAE zu verhindern, gescreent werden.
Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell von multipler Sklerose. Typischerweise werden 30 weibliche SJL-Mäuse im Alter von 10 Wochen in 2 Gruppen von 20 Mäusen (Kontrolle) und 10 Mäusen (CSMC-behandelt) aufgeteilt.
Mäuse in beiden Gruppen werden mit einem enzephalitogenen PLP-Peptid in komplettem Freund'schem Adjuvans subkutan immunisiert, gefolgt von Pertussis-Toxin (IV). Pertussis-Toxin wird am Tag 3 nach der Immunisierung wiederholt.
Mäuse in der CSMC-Gruppe werden täglich (1 mg/Maus, ungefähr 40 mg/kg) durch IP-Injektion behandelt, beginnend ab 2 Tagen vor der Immunisierung bis zum Tag 14 nach der Immunisierung. Tiere werden untersucht, um festzustellen, ob sie symptomatische EAR entwickelten, und werden wie folgt bewertet:

Stufe I: Schlaft-Schwanz-Syndrom
Stufe II: Hinterbeinlähmung
Stufe III: Hinterbeinlähmung-Nachziehbewegung
Stufe IV: Paralytische Immobilität, Gewichtsverlust

F. Assays zum Screenen auf die Fähigkeit zur Behandlung akuter Lungenschädigung (ALI)
Unter Verwendung des folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung leicht auf ihre Fähigkeit, Endotoxin-induzierte, z. B. Sepsis-induzierte, ALI bei Menschen zu behandeln, gescreent werden.
Reaktiv-Sauerstoff-Metabolite (ROMs) sind wichtige Mediatoren von akute Lungenschädigung (ALI) bei Sepsis und Endotoxämie. Wenn die Behandlung mit CSMCs der vorliegenden Erfindung vor der Lipopolysaccharid-(LPS; Endotoxin-)Infusion begonnen wird, können solche Mittel viele der Manifestationen von LPS-induzierter ALI bei Schweinen verhindern. Die Behandlung mit CSMC nach der LPS-Verabreichung kann dazu verwendet werden, um festzustellen, ob die CSMC Schutz vor Endotoxininduzierter ALI bei Schweinen gewährt.
Alle Schweine werden bei T = –18 h mit Escherichia coli 0111:B4 LPS (20 μ/kg) vorbehandelt. Schweine in der Ringer-Lactat-(RL)-Gruppe erhalten keine weitere Behandlung. Von T = 0 bis 60 min werden Schweine in beiden, der LPS- und der LPS/CSMC-Gruppe, mit LPS (250 μ/kg) herausgefordert. Unmittelbar im Anschluss an die Beendigung der LPS-Infusion, beginnend bei T = 60 min, erhalten Schweine in der LPS/C7-Gruppe eine Bolus-Dosis von CSMC (10 mg/kg in 5 % Dextrose), gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion (z. B. 10 mg/kg-h). Verschiedene physiologische Parameter, welche die Lungenfunktion widerspiegeln, werden überwacht (Gonzalez, et al. (1995) J. Pharm. Exp. Ther. 275:798). Das Verhältnis der Lungen-Nass- zu -Trocken-Gewichte wird postmortal bestimmt. Die Lungen-Lipid-Peroxidation wird fluorometrisch durch Messen der Thiobarbitursäure-reaktiven Produkte in der Lipidfraktion von parenchymalem Lungengewebe, das bei T = 300 min gewonnen wird, geschätzt.
G. Assays zum Screenen auf die Fähigkeit zur Prävention der durch Azidose induzierten Lipid-Peroxidation
Unter Verwendung des folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung leicht auf ihre Fähigkeit gescreent werden, durch Azidose induzierte Lipid-Peroxidation zu verhindern. Azidose verursacht bekanntlich beträchtliche oxidative Schädigung. Die Lipid-Peroxidation ist eine Folge von solcher oxidativer Schädigung und ist, wie man feststellte, mit einer Reihe von Human-Pathologien assoziiert.
Hippocampus-Schnitte (400 μm dick) können von Sprague-Dawley-Ratten (150–200 g) erhalten werden und in präoxygeniertem (95 % O₂/ 5 % CO₂) Krebs-Ringer-Phosphatmedium (pH-Wert 7,4), das NaCl 120 mM, KCl 5 mM, CaCl₂ 1,3 mM, MgCl₂ 1,2 mM, NaPhosphat 16 mM (pH-Wert 7,4) und Glucose 10 mM enthält, gesammelt werden. Nach 15 Minuten Präinkubation in einem Wasserbad bei 35°C unter Bewegung wird der Puffer durch den gleichen Puffer (Kontrolle) oder einen modifizierten Puffer (Lactatpuffer), der NaCl 90 mM, KCl 5 mM, CaCl₂ 1,3 mM, MgCl₂ 1,2 mM, NaPhosphat 16 mM und Milchsäure 30 mM (pH-Wert 5,0) enthält, ersetzt. Im Falle des Vorhandenseins wird der cyclische Salen-Metall-Komplex (50 μM) während der Präinkubation und der Inkubationszeiträume zugegeben. Nach 100 Minuten werden Schnitte gesammelt und in 0,9 ml TCA 5 % homogenisiert, wohingegen 0,35 ml TCA 5 % zu 0,5 ml des Inkubationsmediums zugegeben werden. Die Lipid-Peroxidation wird durch die Zugabe von 0,25 ml eines Thiobarbitursäure-Reagens (TBAR) zu 0,85 ml der TCA-Extrakte und Inkubieren der Mischung während 60 Minuten bei 85–93°C gemessen. Lipide werden dann mit 2 × 0,5 ml 1-Butanol durch Vortexen während 10 Sekunden, danach durch Zentrifugieren bei 2000 U/min während 10 Minuten extrahiert. Die Absorption von peroxidierten Lipiden in der Alkoholphase wird bei 532 nm in einem Spektrophotometer gemessen. Die Daten werden als nMol von Malondialdehyd (MDA) unter Verwendung von authentischem MDA ausgedrückt, um eine Standardkurve zu erstellen. Proteine werden aus einem Aliquot der TCA-Extrakte mit Hilfe des Verfahrens von Bradford (Anal. Biochem., 72:248-254 (1976)) gemessen, und die Endresultate werden als nMol MDA, das pro mg Protein gebildet wurde, berechnet.
H. Assays zum Screenen auf die Fähigkeit zum Schutz vor neuronaler Verletzung
6-OHDA bei Mäusen. Erwachsene männliche CFW-Mäuse werden mit Ketamin und Rompum anästhetisiert und in einer stereotaxischen Vorrichtung immobilisiert. 6-OHDA, als das Hydrobromidsalz, wird in normaler Kochsalzlösung mit 1 % Ascorbat gelöst, und 50 μg werden im lateralen Ventrikel mittels einer 10-μl-Hamilton-Spritze verabreicht. Der CSMC der vorliegenden Erfindung (66 mg/kg, i.p.) wird täglich während 4 Tagen verabreicht. Tiere werden etwa 7 Tage später geopfert, und die neuronale Pa thologie wird durch Messen der ³H-Mazindol-Bindung in Striatum-Homogenaten bewertet.
Unter Verwendung des vorgenannten Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung leicht auf deren Fähigkeit gescreent werden, einer 6-OHDA-induzierten neuronalen Schädigung, d. h. 6-OHDA-induziertem Verlust von nigrostriatialen dopaminergen Neuronen, vorzubeugen.
I. Assays zum Screenen auf Peroxidase-Aktivität
Unter Verwendung der folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung auf Peroxidase-Aktivität gescreent werden.
Die Peroxidase-Aktivität kann durch Überwachen der Wasserstoffperoxidabhängigen Oxidation von 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6)-sulfonsäure (ABTS) spektrophotometrisch ermittelt werden. Standard-Assaymischungen bestehen aus 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 8,1, 0,9 % Natriumchlorid, 0,5 mM ABTS und H₂O₂ und dem CSMC der vorliegenden Erfindung. In bestimmten Ausführungsformen können 50 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 oder einem pH-Wert von 7,1 substituiert werden. Assays werden bei etwa 27 ± 0,2°C durchgeführt. Die ABTS-Oxidation wird bei 740 oder 500 nm überwacht, um die Interferenz durch den CSMC zu eliminieren, von denen viele in der Nähe der λ_max des oxidierten ABTS absorbieren, und um Absorptionswerte zu vermeiden, die den linearen Bereich des Spektrophotometers überschritten. Die Menge an oxidiertem ABTS wird mit Hilfe eines Δε₇₄₀ von 20300 M^–1cm¹ oder Δε⁵⁰⁰ 3400 M^–1cm¹, berechnet auf Basis des veröffentlichten molaren Extinktionskoeffizienten bei 405 nm (36800), geschätzt.
J. Assays zum Screening auf Zellschutz
Unter Verwendung des folgenden Assays können die CSMCs der vorliegenden Erfindung leicht auf deren Fähigkeit gescreent werden, Zellen vor Glucose und Glucoseoxidase, einem Wasserstoffperoxid erzeugenden System, zu schützen.
Humane dermale Fibroblaste (Amerikanische Typ-Kultur-Sammlung) wurden bis zum Zusammenfließen auf Platten mit 96 Vertiefungen in Kulturmedium, bestehend aus modifiziertem Eagle's Medium von Dulbecco (4,5 g Glucose/Liter) mit 10 % Kälberserum und Antibiotika, gezüchtet. Um die oxidative Toxizität zu induzieren, wurden Zellen mit Kulturmedium, welches 0,02 Einheiten Glucoseoxidase /ml enthielt, während 18 h in Gegenwart oder in Abwesenheit von Testsubstanzen (entweder Salen-Mangan-Komplex oder Rinderleber-Katalase) inkubiert, wie in der Legende der Figur angegeben. Nach der Inkubationsperiode wurden Zellschichten mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und frischem Medium, dem Glucoseoxidase fehlte, gewaschen, und es wurden Testsubstanzen zugegeben. Die Zelllebensfähigkeit wurde dann unter Verwendung des XTT-Reagens entsprechend den Anleitungen des Herstellers bewertet, wobei die Absorption bei 490 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Modell 3550, BioRad, Hercules, Kalifornien) abgelesen wurde. Die Zelllebensfähigkeit wurde auch durch visuelle Beurteilung der Monoschichten unter einem Phasenkontrastmikroskop nachgewiesen. Salen-Mangan-Komplexe, die unter diesen Bedingungen verwendet wurden, beeinträchtigten die XTT-assoziierte Farbentwicklung nicht.
III. Beispiel III
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Mausmodell, das zum Screenen auf verzögerte Hypersensibilität (DTH) verwendet werden kann.
Mäuse wurden mit 3 % Oxazolon auf dem Unterleib vorsensibilisiert und am Tag 8 mit 1,7 % Oxazolon topisch auf einem Ohr herausgefordert, um ein entzündliches Ödem zu induzieren. C113 oder Ethanol, d. h. die Vehikelkontrolle, wurde topisch auf das Ohr unmittelbar nach der Herausforderung mit Oxazolon aufgebracht. Das Ohr-Ödem wird durch Vergleichen des Gewebewassergehalts (dem Nassgewicht abzüglich des Trockengewichts) des exponierten Ohrs mit demjenigen des Kontrollohrs gemessen. Die Ödem-Prozentanteile (% Wasser im rechten/linken Ohr) in der Vehikelkontrolle waren 8,1 % und für eine C113-Dosis von 27 nMol/Ohr4,6 %.
IV. Beispiel IV

Dieses Beispiel erläutert ein Beispiel einer topischen Formulierung, welche eine Salen-Metall-Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst. Alle Prozent- und Verhältnisangaben hierin sind gewichtsbezogen, wenn nichts anderes angegeben ist. Eine als Musterbeispiel dienende feuchtigkeitsspendende Lotion kann durch Kombinieren der folgenden Komponenten unter Anwendung herkömmlicher Mischtechniken hergestellt werden.

Komponenten	Gewichtsprozent der Zusammensetzung
Wasser (gereinigt)	70,94
Carbomer-Viskositätsregulierungsmittel (kommerziell verfügbar in der Acritamer-Reihe von R.I.T.A. Corp.)	0,23
Alkylparabene	0,90
Glycerin	3,50
Kaliumhydroxid	0,09–0,15
Cetylalkohol	1,25
Stearinsäure	0,75
Glycerolstearat	0,63
Polyoxyethylenstearylalkohl (kommerziell verfügbar in der Brij-Reihe von ICI Americas, Inc.)	1,75
Cococaprylat/Caprat	2,00
C12-C15-Alkoholbenzoat (Finsoly TN – kommerziell verfügbar von Finetex, Inc.)	2,00
Cyclische Salen-Metall-Verbindung	2,00
Octylmethoxycinnamat	7,50
Benzophenon-3	1,00
Octyldimethyl PABA	1,00
Dimethicon	0,30
Imidazolidinylharnstoff	0,10
Ethylen-Acrylat-Copolymer	3,80
Tyros me	0,10

Diese Lotion kann topisch aufgebracht werden, um eine durch akute oder chronische UV-Exposition verursachte Schädigung zu inhibieren. Die Verwendung einer Menge an Lotion, die ausreichend ist, um etwa 0,1 bis 100 μg/cm² der CSMC der vorliegen den Erfindung auf die Haut unmittelbar vor der UV-Exposition aufzubringen, ist zweckmäßig. Im Wesentlichen werden ähnliche Resultate erzielt, wenn die Lotion auf die Haut bis zu 4 Stunden vor der UV-Exposition oder bis zu 30 Minuten nach der UV-Exposition aufgebracht wird. Im Wesentlichen ähnliche Resultate werden erzielt, wenn das Octylmethoxycinnamat, Benzophenon-3 und Octyldimethyl PABA ganz oder zum Teil durch 2-Ethylhexyl-p-methoxycinnamat, Butylmethoxydibenzoylmethan, 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon und Mischungen davon ersetzt werden.

Eine Hautlotion wird durch Kombinieren der folgenden Komponenten unter Nutzung herkömmlicher Mischtechniken hergestellt.

Komponenten	Gewichtsprozent der Zusammensetzung
4-N,N-(2-Ethylhexyl)methylamino-benzoesäure Ester von 4-(2-Hydroxyethoxy)-dibenzoylmethan	10,00
Wasser (gereinigt)	47,54
Dimethylisosorbid	8,00
Dioctylmaleat	8,00
C12-15-Alkoholbenzoat (Finsoly TN – kommerziell verfügbar von Finetex, Inc.)	8,00
Glycerin	3,50
Ethylen-Acrylat-Copolymer	3,80
Antioxidierende Salen-Metall-Verbindung (z. B. C7)	2,00
Cetylalkohol	1,75
Polyoxyethylenstearylalkohol (kommerziell verfügbar in der Brij-Reihe von ICI Americas, Inc.)	1,75
Stearinsäure	1,25
Glycerylstearat	1,13
Alkylparabene	0,90
Titandioxid	0,90
Dimethicon	0,30
Carbomer-Viskositätsregulierungsmittel (kommerziell verfügbar in der Acri-tamer-Reihe von R.I.T.A. Corp.)	0,23
Imidazolidinylharnstoff	0,10
Kaliumhydroxid	0,15
Tyrosin	0,10

Diese Lotion ist für die topische Aufbringung nützlich, um eine durch akute oder chronische UV-Exposition oder Exposition an eine oxyradikale Umgebung verursachte Schädigung zu inhibieren. Die Verwendung einer Menge an Lotion, die ausreichend ist, um etwa 0,1 bis 100 μg/cm² des antioxidierenden CSMC der vorliegenden Erfindung auf die Haut unmittelbar vor der UV-Exposition aufzubringen, ist zweckmäßig. Im Wesentlichen ähnliche Resultate werden erzielt, wenn die Lotion auf die Haut bis zu 4 Stunden vor der UV-Exposition oder bis zu 30 Minuten nach der UV-Exposition aufgebracht wird.
V. Beispiel V
Dieses Beispiel erläutert die Stabilität von als Musterbeispiel dienenden cyclischen Salen-Metall-Verbindungen der vorliegenden Erfindung sowohl in Rattenplasma als auch in Säure.
A. Stabilität von cyclischen Salen-Mangan-Komplexen in Rattenplasma
Jede Verbindung (12–16 μM) wurde in Rattenplasma, 3-fach verdünnt in Wassser, bei 37°C inkubiert. Aliquots wurden entnommen (das T₁-Aliquot wurde so schnell wie möglich entnommen, ~ 20–30 s nach dem Mischen), mit Methanol – 1 % Trichloressigsäure extrahiert, und die Extrakte wurden mittels HPLC auf die Stammverbindung analysiert.
B. Stabilität von cyclischen Salen-Mangan-Komplexen in Säure
Jede Verbindung (50 bis 100 μM) wurde in 1 M HCl während 24 Stunden inkubiert:
Die Menge der verbleibenden Verbindung wurde spektrophotometrisch bestimmt.

Claims

Eine Salen-Metall-Verbindung, wobei diese Salen-Metall-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Salen-Metall-Verbindung aus Anspruch 1 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger, Zusatzstoff oder Hilfsstoff umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine antioxidierende Menge der Salen-Metall-Verbindung umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung aus Anspruch 2, wobei diese Salen-Metall-Verbindung in einer Menge vorliegt, so dass die pharmazeutische Zusammensetzung einen zuvor bestimmten Grad an Superoxiddismutase-Aktivität und/oder nachweisbarer Katalase-Aktivität pro mmol, gelöst in einer wässrigen Lösung, aufweist.
Eine Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1, die eine nachweisbare Superoxiddismutase-Aktivität, nachweisbare Katalase-Aktivität, nachweisbare Peroxidase-Aktivität, nachweisbare Katalyse- und Peroxidase-Aktivität, oder eine nachweisbare Superoxiddismutase-, Katalase- und Peroxidase-Aktivität aufweist.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1, um durch Reaktive Sauerstoff-Spezies bewirkte Schäden an Zellen, vorzugsweise Blutzellen zu inhibieren.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 6, wobei diese Zellen in einem entnommenen Organ vorliegen, wobei dieses entnommene Organ vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Herz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Leber, Lunge, Haut, Augenhornhaut und dem Gefäßsystem.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1, um eine mit freien Radikalen verbundene Erkrankung in einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, zu behandeln, vorzugsweise in einer Form, die sich dazu eignet, diesem Säugetier eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu verabreichen.
Die Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 8, die in einer pharmazeutisch geeigneten Formulierung mit einem Träger, Zusatzstoff oder Hilfsstoff vorliegt.
Die Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 8, wobei die mit freien Radikalen verbunden Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus neurologischen Schäden infolge einer Parkinson-Erkrankung, Alzheimer-Erkrankung oder einer Schädigung durch vorübergehenden Sauerstoffmangel im Hirn; Nekrose des Herzgewebes infolge einer Herz-Ischämie; Autoimmun-Neurodegeneration; einer akuten Lungenschädigung durch Sepsis und/oder Endotoxinämie; neuronale Schäden infolge von Sauerstoffmangel oder Trauma; und der iatrogenen Giftigkeit freier Radikale.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Behandlung von Nekrose des Herzgewebes infolge einer Herz-Ischämie, einer akuten Lungenschädigung durch Sepsis und/oder Endotoxinämie, neuronale Schäden infolge von Sauerstoffmangel oder Trauma, oder der iatrogenen Giftigkeit freier Radikale infolge einer MPTP-Vergiftung in einem Säuger, vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, diesem Säuger eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu verabreichen.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Behandlung einer Ischämie oder Schädigung durch die Wiederzufuhr von Sauerstoff in einem Säuger, vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, diesem Säuger eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu verabreichen.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Behandlung von Entzündungen in einem Säuger, vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, diesem Säuger eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu verabreichen.
Die Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 13, die in einer pharmazeutisch geeigneten Formulierung mit einem Träger, Zusatzstoff oder Hilfsstoff vorliegt, vorzugsweise in einem pharmazeutisch geeigneten, topischen Träger.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verhinderung oder Verzögerung der Hautalterung, vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, eine wirksame Menge der Verbindung topisch auf diese Haut aufzutragen.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verhinderung der schädlichen Wirkungen durch die Einwirkung von ultraviolettem Licht auf die Haut, vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, eine wirksame Menge der Verbindung topisch auf diese Haut aufzutragen, vor, in Verbindung mit oder nach der Einwirkung von ultraviolettem Licht.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Steigerung der Heilung der Haut eines Säugers von einer Wunde, vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, eine wirksame Menge der Verbindung topisch auf diese Haut aufzutragen.
Die Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 17, wobei die Wunde ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus chirurgischen Einschnitten, Verbrennungen, Entründungen, Geschwüren und Reizungen infolge von oxidativen Schäden.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zum Schutz von Zellen, vorzugsweise menschlicher Zellen, vor den schädlichen Wirkungen ionisierender Strahlung, vorzugsweise ultravioletter Strahlung oder gamma (γ)-Strahlung, und vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, diese Zellen mit einer wirksamen Menge der Verbindung in Kontakt zu bringen.
Die Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 19 in einer Form, die geeignet ist, sie einem Menschen zu verabreichen.
Eine antioxidierende Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1 zum Schutz von Zellen, vorzugsweise menschlicher Zellen, vor den schädlichen Wirkungen eines chemotherapeutischen Mittels, vorzugsweise in einer Form, die geeignet ist, diese Zellen mit einer wirksamen Menge der Verbindung in Kontakt zu bringen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur topischen Anwendung verwendet werden kann, wobei diese Zusammensetzung einen topischen Träger und eine Salen-Metall-Verbindung aus Anspruch 1 umfasst.
Die Salen-Metall-Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei diese Salen-Metall-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Die antioxidierende Salen-Metall-Verbindung aus einem der Ansprüche 5, 6, 8, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 19 oder 21, wobei diese antioxidierende Salen-Metall-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: