CN115869465B - 一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法，属于医疗的技术领域，天然蛋白光刻胶是利用天然蛋白的活性基团进行不饱和修饰，并用其做促溶剂助溶功能蛋白，将改性后蛋白溶液与丙烯酸酯化的天然生物大分子共混，最后加入水溶性光敏剂并搅拌均匀而得到天然蛋白基光刻胶。该光刻胶及细胞支架具有以下优势：优秀的生物相容性；长期保持生物活性；活性氧清除细胞支架可以治疗植入部位的炎症反应；模拟细胞外基质环境以促进细胞粘附；可以快速制备并控制支架结构的精细度，以此调控细胞的粘附、生长和迁移。

Description

一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法

技术领域

本发明属于光刻胶、激光直写、炎症治疗和组织支架技术领域，具体涉及一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法。

背景介绍

支架材料是组织工程的关键组件之一，其可用作接种细胞增殖的模板，产生细胞外基质并最终形成所需的组织类型，开发适合的功能支架是组织工程和再生医学最重要的目标之一。生物支架必须满足基本需求：1.良好的生物相容性和生物安全性：组织修复支架是直接与人体进行接触，其材料本身及其降解产物应对生物体无毒无害，无免疫排斥反应等；2.合适的空间结构：组织工程支架主要是模仿体内细胞的生存微环境，因此合适的空间结构不仅能促进细胞营养物质的传输和代谢废物的排出，而且能调控细胞在支架上的增殖与迁移；3.具有良好的生物学功能。已有研究表明，细胞行为可以由表面形貌和孔隙度来控制并且3D培养条件比2D条件更符合体内情况。因此，理想的细胞支架必须具备3D微结构，并能够以此精准调控细胞的增殖与迁移。传统支架的制造方式有熔融纺丝法、UV光固化法等，但是这些制造方法都难以对支架表面形貌和结构进行精准控制，即使在临床使用的血管支架雕刻的载药槽也需要经过激光的二次加工，因此一种精准、简单、快捷的支架制造方法急需发展。飞秒激光直写技术是一种基于双光子吸收原理的无掩模光刻技术，利用飞秒激光焦点在载体上的光刻胶内进行扫描，无需掩膜版或者模具即可直接产生2D或3D结构。飞秒激光扫描时的体素可以控制在纳米级别，因此该项技术被认为是精细微纳加工的理想手段。

在组织修复的临床治疗过程中，植入手术均在无菌条件下进行，基本上避免了微生物感染，但在术后长时间的恢复过程中创面离开无菌环境后仍存在感染的风险，细菌感染后会导致创面出现严重的急性炎症反应和创面溃烂等行为，最终极大的延缓了创面修复和组织再生的速度；同时，组织受损、病变等会打破局部微环境和微循环的平衡，创伤部位细胞释放大量的促炎分泌物，如白细胞介素(IL-6等)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等，形成慢性无菌性炎症环境，导致构建的组织支架移植入体内后发生病变、退化等现象，增大了组织修复失败的风险。为此，降低并消除感染性炎症或无菌性炎症环境给组织工程植入支架带来的风险已成为组织工程修复治疗的重中之重。

炎症是人体免疫系统对损伤和感染的自然反应，会导致炎症性物质的释放，如：炎症细胞因子，氧化性自由基，激素和其他小分子等，这些因子的产生是一把双刃剑。一方面，炎症性物质会对外部炎症诱因进行进攻，防止人体产生病理性畸变；另一方面，炎症性物质也会诱使人体炎症进一步严重，可能导致其他炎症性疾病。研究已经阐明，异常的活性氧(ROS)产生是炎症发病机制中的关键介质之一，体内过量的ROS会导致各种炎症相关的病理学异常，如类风湿性关节炎、结肠炎、肝炎等。各种抗炎治疗剂已经被广泛开发了数十年，如小分子抗炎药物、金属纳米酶、单原子酶、还原性多酚物质等，其中清除过量ROS以中断异常炎症反应已被认为是炎症抑制和治疗的可行策略之一。依照这种研发思路，已有研究人员提出了不同的纳米粒子用于清除过量ROS以减缓乃至治疗炎症，如聚多巴胺纳米粒子、二氧化铈纳米粒子、普鲁士蓝纳米粒子等。但是，仍少有研究开发基于天然蛋白的激光直写光刻胶及具有广谱活性氧清除功能的细胞支架。

发明内容

针对现有细胞支架技术中存在的缺陷，本发明提供了一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法。

本发明采用以下技术方案实现：

一种基于天然蛋白的激光直写光刻胶及具有广谱活性氧清除功能的细胞支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)配置不同浓度的天然蛋白溶液，即将天然蛋白溶于无菌缓冲液中，使缓冲溶液中蛋白的总浓度为10-200mg/mL，溶液在冰水浴下搅拌至完全溶解；在搅拌条件下，将酸酐缓慢滴加到蛋白溶液中，整个过程持续30min，然后整个体系在冰水浴中持续反应0.5-24h，从而得到修饰有双键的蛋白溶液，产物使用去离子水透析48h后冻干，得到修饰有双键的蛋白冻干粉末；

(2)取步骤(1)所得的修饰有双键的蛋白粉末与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶共分散于去离子水中制成浓度为500mg/mL的悬浮液，其中过氧化氢酶与超氧化物歧化酶的总浓度为50mg/mL，质量比9:1-1:9分布；将丙烯酸酯化天然生物大分子溶于去离子水中，其浓度为20mg/mL-300mg/mL；将等体积的丙烯酸酯化大分子水溶液缓慢滴入蛋白溶液中并搅拌至完全均匀；将水溶性光引发剂加入到溶液中，搅拌至完全均匀，即可得到天然蛋白基光刻胶；最后，整个溶液体系避光保存在4℃下；

(3)取步骤(2)所得的光刻胶，滴于经过清洗并杀菌处理的载体上，载体材料可以选择细胞培养皿、细胞孔板、无菌无纺布、无菌胶布等。

为了去除载体表面上残留的盐和油渍等污垢，本发明采用以下清洗方法：

将载体依次置于去离子水、异丙醇中，分别超声清洗10min后取出干燥；将载体取出并用75％乙醇溶液冲洗，在紫外光下辐照30-60min并自然晾干。

(4)将步骤(3)所得的滴有光刻胶的载体置于激光直写系统上；开启激光直写系统，调节物镜焦距使其焦点聚焦于光刻胶与载体的界面处；载入预先设计好的细胞支架结构，设置激光光强和扫描速度并开始直写实验，飞秒激光直写结束后可以得到光刻胶组合物制得的细胞支架结构；

本发明所使用的飞秒激光直写系统，包括沿光路方向依次设置的飞秒激光器、光开关、振镜、物镜、压电平台，所述压电平台包括平移台和载体，所述平移台用于放置载体并调整其位置，所述的载体为光刻胶载体；所述的飞秒激光器波长为400-900nm，最优波长为780nm、525nm、517nm和405nm中的一种。飞秒激光的极高光密度焦点会聚焦在光刻胶内部，光引发剂吸收能量裂解成活泼自由基从而引发单体聚合。控制焦点的移动路径并逐层扫描即可获得预先设计好的2D或3D结构。

(5)将步骤(4)所得的刻有细胞支架结构的载体水平浸泡在显影液中；吸出70％体积的显影液并加入对应体积的去离子水，浸泡同时用365nm波长的紫外灯照射，浸泡和照射时间为10min，该步骤重复3次；浸泡结束后自然晾干得到细胞支架。上述步骤均须在无菌环境中进行，与光刻胶和支架接触的器材和试剂均需经过灭菌处理。

本发明所述的特定显影液可以是去离子水、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种。

上述技术方案中，进一步地，步骤(1)中所述的天然蛋白是含有赖氨酸或半胱氨酸的天然蛋白质，可以选用牛血清白蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、胶原蛋白、鸡蛋白蛋白中的一种。

进一步地，步骤(1)中所述的缓冲液为碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种。

进一步地，步骤(1)中所述的缓冲液浓度为10-250mmol/L，酸碱度为pH8-11。

进一步地，步骤(1)中所述的酸酐是带两个双键的酸酐，可以选择丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐、4-戊烯酸酐、巴豆酸酐、顺芷酸酐中的一种。

进一步地，步骤(2)中所述的丙烯酸酯化天然生物大分子可以选择甲基丙烯酸酯化透明质酸、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯化海藻酸纳、甲基丙烯酸酯化明胶、甲基丙烯酸酯化壳聚糖中的一种。

进一步地，步骤(2)中所述的引发剂为水溶性光引发剂，可以选择光引发剂2959、亚甲基蓝、四氯四碘荧光素二钠盐、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂中的一种。

进一步地，步骤(2)中所述的光引发剂最终浓度为0.25％wt-5％wt。

本发明的原理是：首先，许多常见的天然蛋白中含有赖氨酸和半胱氨酸，赖氨酸中含有两个氨基，半胱氨酸含有一个氨基和一个巯基，一个氨基用于蛋白质主链连接，另一个氨基和巯基则会暴露在蛋白质分子中，本发明利用该裸露的氨基或巯基与带有两个双键的酸酐进行反应，可以得到修饰有不饱和键的天然蛋白；然后以该天然蛋白为光刻胶基础并作为促溶剂来助溶水溶性一般的功能蛋白并对功能蛋白进行保护，本发明中的两种功能蛋白：过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，这两种功能蛋白能够与炎症部位多种ROS发生级联反应，从而清除炎症处的过量ROS，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的级联反应如下式所示：

2O₂·-+2H⁺→H₂O₂→O₂+H₂O

进一步的，将修饰后的蛋白与丙烯酸酯化的天然生物大分子共混，一方面能增加交联点，提升刻写后支架的力学性能，另一方面可以模拟细胞外基质来促进细胞粘附、迁移和生长；最后，该光刻胶中的引发剂为双光子引发剂，可进行双光子吸收而诱导光刻胶发生聚合反应并引发交联，从而改变曝光区域在显影液中的溶解度，与此同时，飞秒激光可以将刻写的体素控制在纳米级，因此相比于传统UV曝光的支架，飞秒激光直写能够极其精准地调控支架的表面结构，从而更有利于细胞粘附、迁移和生长。

本发明的有益效果在于：

光刻胶以天然蛋白为基，并辅以功能蛋白和丙烯酸酯化的天然生物大分子，使得到的组织支架具有良好的生物相容性，有效防止引起严重的身体排异现象；天然蛋白作为促溶剂，能促进功能蛋白在水中的溶解；天然蛋白对功能蛋白具有保护作用，能够预防功能蛋白变性而失去催化能力；功能蛋白被包含于组织支架内部，能够长期留存于病灶部位并清除产生的多种过量ROS，预防并治疗随着支架植入而可能带来的急性炎症；引入丙烯酸酯化的天然生物大分子，一方面能够作为交联助剂增加交联点并提高支架的力学性能，另一方面还可以模拟细胞外基质，促进细胞的粘附、迁移和生长；利用双光子吸收原理并使用飞秒激光直写加工方式，能够更加精细地调控支架表面结构，利用精细3D结构能够更为方便高效地调控细胞粘附和迁移。

附图说明

图1是光刻胶在不同飞秒激光扫描速度下的刻写阈值阵列的扫描图；

图2是光刻胶的刻写阈值随飞秒激光扫描速度变化曲线图；

图3是光刻胶在飞秒激光下刻写线条的扫描图；

图4是光刻胶以100mm/的飞秒激光扫描速度刻写立方体的扫描图；

图5是对光刻胶激光直写3D精细结构的扫描电子显微图。

图6是光刻胶激光直写后结构清除过氧化氢的紫外-可见光谱和电子自旋共振谱图；

图7是光刻胶激光直写后结构清除超氧阴离子自由基的紫外-可见光谱和电子自旋共振谱图；

图8是光刻胶激光直写后结构清除羟基自由基的紫外-可见光谱和电子自旋共振谱图；

图9是RAW264.7细胞培养状态下清除细胞内ROS的荧光图。

具体实施方式

以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。

实施例1

1)将牛血清白蛋白溶于碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(10mmol，pH8)中，使缓冲溶液中蛋白的浓度为100mg/mL，溶液在冰水浴下搅拌至完全溶解；在搅拌条件下，将甲基丙烯酸酐缓慢滴加到牛血清白蛋白溶液中，整个过程持续30min，然后整个体系在冰水浴中持续反应24h，从而得到修饰有双键的牛血清白蛋白溶液，产物使用去离子水透析48h后冻干，得到修饰有双键的蛋白冻干粉末；

2)取步骤1)所得的修饰有双键的牛血清白蛋白粉末与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶共分散于去离子水中制成浓度为500mg/mL的悬浮液，其中过氧化氢酶与超氧化物歧化酶的总浓度为50mg/mL，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的浓度分别为45mg/mL和5mg/mL；将甲基丙烯酸酯化透明质酸溶于去离子水中，其浓度为100mg/mL；将甲基丙烯酸酯化透明质酸溶液缓慢滴入等体积的蛋白混合液中并在冰水浴下磁力搅拌至完全均匀；将光引发剂2959加入到溶液中，冰水浴下搅拌至完全均匀，光引发剂2959浓度为0.25％wt；整个光刻胶体系避光保存在4℃下；

3)载体清洗与灭菌：将无纺布依次置于去离子水、异丙醇中，分别超声清洗10min后取出干燥；最后将无纺布取出并用75％乙醇溶液冲洗，冲洗后紫外线照射30min杀菌并自然晾干；

4)激光直写：本发明所使用的双光束飞秒激光直写系统包括飞秒激光光源，连续激光光源，光束耦合系统、振镜、压电平台、物镜。将步骤2)所得的光刻胶滴在无菌无纺布上，将无纺布置于直写系统样品架上。开启激光直写系统，调节物镜焦距使其焦点聚焦于光刻胶与无纺布的界面处；载入预先设计好的细胞支架结构，设置激光光强和扫描速度并开始直写实验，飞秒激光直写结束后得到由光刻胶组合物制得的细胞支架结构；

5)显影：将步骤4)所得的刻有细胞支架的无纺布水平浸泡在碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中15min；吸出70％体积的显影液并加入对应体积的去离子水，浸泡同时用365nm波长的紫外灯照射，浸泡和照射时间为10min，该步骤重复3次；浸泡结束后自然晾干得到刻有细胞支架的无纺布。

实施例2

步骤1)将乳清蛋白溶于磷酸盐缓冲液(25mmol/L，pH11)中，使缓冲溶液中蛋白的浓度为200mg/mL，溶液在冰水浴下搅拌至完全溶解；在搅拌条件下，将丙烯酸酐缓慢滴加到乳清蛋白溶液中，整个过程持续30min，然后整个体系在冰水浴中持续反应12h，从而得到修饰有双键的乳清蛋白溶液，产物使用去离子水透析48h后冻干，得到修饰有双键的蛋白冻干粉末；

2)取步骤1)所得的修饰有双键的乳清蛋白粉末与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶共分散于去离子水中制成浓度为500mg/mL的悬浮液，其中过氧化氢酶与超氧化物歧化酶的总浓度为50mg/mL，CAT和SOD的浓度分别为25mg/mL和25mg/mL；将聚乙二醇二丙烯酸酯溶于去离子水中，其浓度为20mg/mL；将等体积的蛋白混合液缓慢滴入聚乙二醇二丙烯酸酯溶液中并在冰水浴下磁力搅拌至完全均匀；将亚甲基蓝溶液加入到溶液中，冰水浴下搅拌至完全均匀，最终亚甲基蓝浓度为1％wt；整个光刻胶体系避光保存在4℃下；

3)载体清洗与灭菌：将无菌胶布依次置于去离子水、异丙醇中，分别超声清洗10min后取出干燥；最后将无菌胶布取出并用75％乙醇溶液冲洗，冲洗后紫外线照射60min杀菌并自然晾干；

4)激光直写：本发明所使用的双光束飞秒激光直写系统包括飞秒激光光源，连续激光光源，光束耦合系统、振镜、压电平台、物镜。将步骤2)所得的光刻胶滴在步骤3)的无菌胶布上，将胶带置于直写系统样品架上。开启激光直写系统，调节物镜焦距使其焦点聚焦于光刻胶与胶带的界面处；载入预先设计好的细胞支架结构，设置激光光强和扫描速度并开始直写实验，飞秒激光直写结束后得到由光刻胶组合物制得的细胞支架结构；

5)显影：将步骤4)所得的刻有细胞支架的胶带水平浸泡在磷酸盐缓冲液中30s；吸出70％体积的显影液并加入对应体积的去离子水，浸泡同时用365nm波长的紫外灯照射，浸泡和照射时间为10min，该步骤重复3次；浸泡结束后自然晾干得到刻有细胞支架的无纺布。

实施例3

步骤1)将鸡蛋白蛋白溶于磷酸缓冲液(250mmol/L，pH10)中，使缓冲溶液中鸡蛋白蛋白的浓度为100mg/mL，溶液在冰水浴下搅拌至完全溶解；在搅拌条件下，将4-戊烯酸酐缓慢滴加到蛋白溶液中，整个过程持续30min，然后整个体系在冰水浴中持续反应0.5h，从而得到修饰有双键的蛋白溶液，产物使用去离子水透析48h后冻干，得到修饰有双键的蛋白冻干粉末；

2)取步骤1)所得的修饰有双键的蛋白粉末与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶共分散于去离子水中制成浓度为500mg/mL的悬浮液，其中过氧化氢酶与超氧化物歧化酶的总浓度为50mg/mL，二者浓度分别为5mg/mL和45mg/mL；将甲基丙烯酸酯化海藻酸纳溶于去离子水中，其浓度为300mg/mL；将等体积的蛋白混合液缓慢滴入甲基丙烯酸酯化海藻酸纳溶液中并在冰水浴下磁力搅拌至完全均匀；将四氯四碘荧光素二钠盐加入到溶液中，冰水浴下搅拌至完全均匀，四氯四碘荧光素二钠盐浓度为5％wt；整个光刻胶体系避光保存在4℃下；

3)载体清洗与灭菌：将细胞培养皿依次置于去离子水、异丙醇中，分别超声清洗10min后取出干燥；最后将细胞培养皿取出并用75％乙醇溶液冲洗，冲洗后紫外线照射45min杀菌并自然晾干；

4)激光直写：本发明所使用的双光束飞秒激光直写系统包括飞秒激光光源，连续激光光源，光束耦合系统、振镜、压电平台、物镜。将步骤2)所得的光刻胶滴在步骤3)的培养皿上，将培养皿置于直写系统样品架上。开启激光直写系统，调节物镜焦距使其焦点聚焦于光刻胶与培养皿的界面处；载入预先设计好的细胞支架结构，设置激光光强和扫描速度并开始直写实验，飞秒激光直写结束后得到由光刻胶组合物制得的细胞支架结构；

5)显影：将步骤4)所得的刻有细胞支架的培养皿水平浸泡在磷酸冲液中15min；吸出70％体积的显影液并加入对应体积的去离子水，浸泡同时用365nm波长的紫外灯照射，浸泡和照射时间为10min，该步骤重复3次；浸泡结束后自然晾干得到刻有细胞支架的培养皿。

实施例4

步骤1)将大豆蛋白溶于Tris缓冲液(50mmol/L，pH9)中，使缓冲溶液中大豆蛋白的浓度为10mg/mL，溶液在冰水浴下搅拌至完全溶解；在搅拌条件下，将巴豆酸酐缓慢滴加到蛋白溶液中，整个过程持续30min，然后整个体系在冰水浴中持续反应12h，从而得到修饰有双键的蛋白溶液，产物使用去离子水透析48h后冻干，得到修饰有双键的蛋白冻干粉末；

2)取步骤1)所得的修饰有双键的蛋白粉末与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶共分散于去离子水中制成浓度为500mg/mL的悬浮液，其中过氧化氢与超氧化物歧化酶的总浓度为50mg/mL，二者的浓度分别为10mg/mL和40mg/mL；将甲基丙烯酸酯化明胶溶于去离子水中，其浓度为200mg/mL；将甲基丙烯酸酯化明胶溶液缓慢滴入等体积的蛋白混合液中并在冰水浴下磁力搅拌至完全均匀；将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入到溶液中，冰水浴下搅拌至完全均匀，苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂浓度为1％wt；整个光刻胶体系避光保存在4℃下；

3)载体清洗与灭菌：将细胞孔板依次置于去离子水、异丙醇中，分别超声清洗10min后取出干燥；最后将细胞培养皿取出并用75％乙醇溶液冲洗，冲洗后紫外线照射30min杀菌并自然晾干；

4)激光直写：本发明所使用的双光束飞秒激光直写系统包括飞秒激光光源，连续激光光源，光束耦合系统、振镜、压电平台、物镜。将步骤2)所得的光刻胶滴在步骤3)的细胞孔板上，将孔板置于直写系统样品架上。开启激光直写系统，调节物镜焦距使其焦点聚焦于光刻胶与孔板的界面处；载入预先设计好的细胞支架结构，设置激光光强和扫描速度并开始直写实验，飞秒激光直写结束后得到由光刻胶组合物制得的细胞支架结构；

5)显影：将步骤4)所得的刻有细胞支架的孔板水平浸泡在Tris冲液中15min；吸出70％体积的显影液并加入对应体积的去离子水，浸泡同时用365nm波长的紫外灯照射，浸泡和照射时间为10min，该步骤重复3次；浸泡结束后自然晾干得到刻有细胞支架的孔板。

实施例5

将胶原蛋白溶于氨基酸缓冲液(10mmol/L，pH8)中，使缓冲溶液中蛋白的浓度为50mg/mL，溶液在冰水浴下搅拌至完全溶解；在搅拌条件下，将顺芷酸酐缓慢滴加到胶原蛋白溶液中，整个过程持续30min，然后整个体系在冰水浴中持续反应24h，从而得到修饰有双键的蛋白溶液，产物使用去离子水透析48h后冻干，得到修饰有双键的蛋白冻干粉末；

2)取步骤1)所得的修饰有双键的胶原蛋白粉末与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶共分散于去离子水中制成浓度为500mg/mL的悬浮液，其中过氧化氢酶与超氧化物歧化酶的总浓度为50mg/mL，CAT和SOD的浓度分别为40mg/mL和10mg/mL；将甲基丙烯酸酯化壳聚糖溶于去离子水中，其浓度为150mg/mL；将甲基丙烯酸酯化透明质酸溶液缓慢滴入等体积的蛋白混合液中并在冰水浴下磁力搅拌至完全均匀；将光引发剂2959加入到溶液中，冰水浴下搅拌至完全均匀，光引发剂2959浓度为5％wt；整个光刻胶体系避光保存在4℃下；

3)载体清洗与灭菌：将细胞培养皿依次置于去离子水、异丙醇中，分别超声清洗10min后取出干燥；最后将细胞培养皿取出并用75％乙醇溶液冲洗，冲洗后紫外线照60min杀菌并自然晾干；

4)激光直写：本发明所使用的双光束飞秒激光直写系统包括飞秒激光光源，连续激光光源，光束耦合系统、振镜、压电平台、物镜。将步骤2)所得的光刻胶滴在步骤3)的培养皿上，将培养皿置于直写系统样品架上。开启激光直写系统，调节物镜焦距使其焦点聚焦于光刻胶与培养皿的界面处；载入预先设计好的细胞支架结构，设置激光光强和扫描速度并开始直写实验，飞秒激光直写结束后得到由光刻胶组合物制得的细胞支架结构；

5)显影：将步骤4)所得的刻有细胞支架的培养皿水平浸泡在氨基酸冲液中15min；吸出70％体积的显影液并加入对应体积的去离子水，浸泡同时用365nm波长的紫外灯照射，浸泡和照射时间为10min，该步骤重复3次；浸泡结束后自然晾干得到刻有细胞支架的孔板。

上表1是五个实施例得到的光刻胶通过飞秒激光刻写的阈值、线宽和收缩率数据。从表中可以看出，不同实施实例均可以实现不低于100mm/s高速3D刻写，这有利于实现支架的量产化应用。在2D平面上，实例展示光刻胶可以实现200nm的精细刻写，有利于控制组织支架表面的精细结构，进而调控细胞在支架表面的粘附、迁移和生长。通过刻写立方体进行测试，可以得到不同配方的光刻胶基本可以将收缩率控制在8％，这对于刻写较大体积的支架来说收缩率可以接受。

图1是光刻胶在不同飞秒激光扫描速度下的刻写阈值阵列的扫描图，图2是光刻胶的刻写阈值随飞秒激光扫描速度变化曲线图，图3是光刻胶在飞秒激光下刻写线条的扫描图。从图1和图2中可以观察到随着刻写速度的增加，激光直写的阈值随之增加，2D线条刻写最快可以实现10mm/s的刻写速度。图3中可以看到，光刻胶可以实现200nm精度的线条刻写。

图4是光刻胶以100mm/的飞秒激光扫描速度刻写立方体的扫描图，表明在对于3D结构，光刻胶可以实现高速刻写，这主要归功于逐层扫描引发的自由基累积效应，能够大幅提高刻写速度，这一特性有利于工业上大规模制备。

图5是对光刻胶激光直写3D精细结构的扫描电子显微图。图5中展示了一个3D超力学结构并且在结构表面设计了细微图案，该结构的完整保持证明了光刻胶固化并显影后拥有良好的机械性能，在植入体内后能够给予细胞和组织生长良好的力学支持。将SEM照片放大，可以看到表面拥有清楚地细微结构，表明本发明的光刻胶可以实现支架表面精细结构刻写。

图6是光刻胶激光直写后结构清除过氧化氢的紫外-可见光谱和电子自旋共振谱图，图7和图8分别是清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的图谱。可以看到，对照组表现出明显的ROS的信号峰，在加入飞秒激光直写的细胞支架后，三种ROS均被明显清除，信号峰明显降低，表明支架具有良好的广谱活性氧清除效果，因此具有良好的抗炎功能。

图9是细胞培养状态下清除细胞内ROS的荧光图。细胞实验使用的是RAW264.7细胞，该细胞为小鼠的巨噬细胞，加入脂多糖共培养可以诱导细胞产生多种ROS，使用ROS检测试剂可以观察到细胞发出绿色荧光。但是在细胞支架上培养的细胞展现出的绿色荧光强度明显降低，表明支架多种细胞内ROS也具有明显的清除效果，为进一步的动物实验提供了有力支撑。

本发明基于天然蛋白材料，整体具有良好的生物相容性，不易引起人体组织排斥；以天然蛋白为基础的光刻胶具有良好的光敏性，能够满足3D支架的高速刻写，有利于工业化大批生产；以天然生物大分子作为交联助剂并且模拟细胞外基质，有助于组织细胞的粘附与增值，从而帮助创伤组织恢复；支架内含具有级联反应功能的两种天然酶，二者相结合使支架具有高效清除超氧阴离子自由基(O₂ ^·-)、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(HO·)的能力，对组织内的ROS具有良好的清除效果，能够减轻创伤部位由过量ROS引起的炎症反应；支架利用双光子吸收原理由飞秒激光直写得到，飞秒激光刻写可以将体素限制在纳米级空间，因此能够更为精密地设计并调控支架表面结构，以此来引导细胞粘附、迁移和定位生长。

以上所述仅为本发明的优选实施实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种天然蛋白光刻胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：配置天然蛋白溶液，即将天然蛋白溶于灭菌缓冲液中，并在冰水浴下搅拌至完全溶解；

S2：在搅拌条件下，将酸酐缓慢滴加到天然蛋白溶液中，然后整个体系在冰水浴中持续反应，得到修饰有双键的蛋白溶液；

S3：将修饰有双键的蛋白溶液使用去离子水透析后冻干，得到修饰有双键的蛋白冻干粉末；

S4：将修饰有双键的蛋白冻干粉末与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶共分散于去离子水中制成悬浮液；

S5：将等体积的蛋白溶液缓慢滴入丙烯酸酯化的天然生物大分子水溶液中并搅拌至完全均匀；

S6：将光引发剂加入到溶液中，搅拌至完全均匀得到天然蛋白基光刻胶组合物；光刻胶体系避光保存在4℃下，所述光引发剂为水溶性光引发剂，包括光引发剂2959、亚甲基蓝、四氯四碘荧光素二钠盐、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂中的一种；光引发剂的浓度为0.25-5％wt。

2.根据权利要求1所述的一种天然蛋白光刻胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中天然蛋白为带有赖氨酸或半胱氨酸的天然蛋白，包括牛血清白蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、胶原蛋白、鸡蛋白蛋白中的一种；配置的天然蛋白溶液中蛋白的总浓度为10-200mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种天然蛋白光刻胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中缓冲液包括碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种；缓冲液浓度为10-250mmol/L，酸碱度为pH 8-11。

4.根据权利要求1所述的一种天然蛋白光刻胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中酸酐为带有两个双键的酸酐，包括丙烯酸酐、甲基丙烯酸酐、4-戊烯酸酐、巴豆酸酐、顺芷酸酐中的一种；滴加过程持续30min；在冰水浴中持续反应时间0.5-24h。

5.根据权利要求1所述的一种天然蛋白光刻胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中透析的时间为48h。

6.根据权利要求1所述的一种天然蛋白光刻胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中制得的悬浮液的浓度为500mg/mL；其中过氧化氢酶与超氧化物歧化酶的总浓度为50mg/mL，质量比9:1-1:9分布。

7.根据权利要求1所述的一种天然蛋白光刻胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中丙烯酸酯化天然生物大分子水溶液的浓度为20mg/mL-300mg/mL，丙烯酸酯化天然生物大分子包括甲基丙烯酸酯化透明质酸、甲基丙烯酸酯化海藻酸纳、甲基丙烯酸酯化明胶、甲基丙烯酸酯化壳聚糖中的一种。

8.一种活性氧清除细胞支架的制备方法，其特征在于，包括激光直写系统，所述激光直写系统包括依次沿光路设置的飞秒激光激光器、光开关、振镜、物镜、压电平台，所述压电平台包括平移台和载体，平移台用于放置载体并调整其位置，载体用于承载权利要求1-7任一项所述的光刻胶组合物，包含以下步骤：

R1：载体清洗与灭菌：将载体依次置于去离子水、异丙醇中，分别超声清洗后取出干燥；最后将载体取出并用乙醇溶液冲洗，冲洗后紫外线照射杀菌并自然晾干；

R2：将清洗干净的载体置于激光直写系统的平移台上，于载体上滴加由权利要求1-7得到的光刻胶组合物；

R3：开启激光直写系统，调节物镜焦距使其焦点聚焦于光刻胶与载体的界面处；载入预先设计好的细胞支架结构，设置激光光强和扫描速度并开始直写实验，飞秒激光直写结束后在载体上得到由光刻胶组合物制得的细胞支架结构；

R4：将刻有细胞支架结构的载体水平浸泡在显影液中；吸出70％体积的显影液并加入对应体积的去离子水，浸泡同时用365nm波长的紫外灯照射，浸泡和照射时间为10min，该步骤重复3次；浸泡结束后自然晾干得到活性氧清除细胞支架。

9.根据权利要求8所述的一种活性氧清除细胞支架的制备方法，其特征在于：步骤R1所述载体的材料为细胞培养皿、细胞孔板、无菌无纺布、无菌胶布中的一种。

10.根据权利要求8所述的一种活性氧清除细胞支架的制备方法，其特征在于：所述步骤R1中每次超声清洗时间10min；乙醇溶液浓度为75％，紫外线照射时间30-60min。

11.根据权利要求8所述的一种活性氧清除细胞支架的制备方法，其特征在于：所述步骤R4中显影时间为30s-30min。

12.根据权利要求8所述的一种活性氧清除细胞支架的制备方法，其特征在于：步骤R4中所述显影液为去离子水、碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、磷酸缓冲液中的一种。