CN116421780A - 一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水及其制备与应用。本发明中基于丝素蛋白和明胶的天然大分子基生物墨水具有极佳的生物相容性和增强的力学性能，并具备快速光固化能力，通过数字光处理生物打印技术得以实现负载软骨细胞支架的精细制造，实现软骨细胞在打印支架中的存活和增殖，并促进软骨细胞基质的生成与软骨的修复；本发明的双组分生物墨水不仅能够大幅提升打印结构的强度和结构维持能力，同时由于软骨细胞的存在，其作为软骨缺损修复材料具有更佳的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料的技术领域，尤其涉及一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水及其制备与应用。
背景技术
软骨组织缺乏血管和神经，少细胞，代谢活性低，一旦受损很难自我修复，继而引发一系列疾病，损害患者的身心健康，而现有临床治疗方法均存在较大限制。软骨组织工程方案中，相比于水凝胶空支架，含细胞支架中细胞的存在对软骨再生产生是具有显著促进作用的。支架通过模拟软骨细胞外基质(ECM)的三维微环境，来调控内部细胞行为从而形成具有功能的软骨组织。
提高营养递送效率、保证细胞存活是负载细胞需要解决的问题。3D打印技术能控制生物墨水高精度成型，通过结构的设计可以利于营养物质扩散，从而有助细胞生存。DLP细胞打印对生物墨水的流动性和粘度要求更低，打印条件温和，具有一定优势。
作为常见的生物墨水，GelMA生物性能优异，具有光敏特性。但其得到的水凝胶支架力学性能不佳，降解过快，不适用于软骨组织结构的打印。因此目前希望能够通过各种方式增强GelMA材料，以接近和匹配软骨组织的性质。
本发明通过增加交联密度和形成互穿网络结构的方式来增强GelMA。丝素蛋白本身生物性能优异，对再生丝素蛋白进行甲基丙烯缩水甘油酯的改性，改进条件以避免自发β-折叠，得到光敏丝素蛋白，与GelMA复合，优化墨水组分，大幅提升力学性能并延缓降解。作为生物墨水进行DLP打印，提高印刷结构的形态稳定性，保证软骨细胞生存并表达相关基质，实现修复效果更佳的“活体”材料打印，在作为软骨缺损修复材料方面具有很大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点和不足，提供一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水及其制备与应用。
本发明通过增加交联密度和形成互穿网络结构的方式来增强GelMA。丝素蛋白本身生物性能优异，对再生丝素蛋白进行甲基丙烯缩水甘油酯的改性，改进条件以避免自发β-折叠，得到光敏丝素蛋白，与GelMA复合，优化墨水组分，大幅提升力学性能并延缓降解。作为生物墨水进行DLP打印，提高印刷结构的形态稳定性，保证软骨细胞生存并表达相关基质，实现修复效果更佳的“活体”材料打印，在作为软骨缺损修复材料方面具有很大的应用潜力。
本发明通过下述技术方案实现：
一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水，两者侧链均带有可引发光交联的双键，可用于光投影原理的DLP打印，结构如下：
其中，GelMA为甲基丙烯酸酐取代的明胶；SilGMA为甲基丙烯缩水甘油酯取代的丝素蛋白。
步骤一：使用碳酸钠溶液将蚕茧脱去丝胶蛋白，得到不溶性丝素蛋白；
步骤二：使用溴化锂过饱和溶液溶解不溶性丝素蛋白，加入甲基丙烯缩水甘油酯混合反应，得到甲基丙烯甘油酯化丝素蛋白；
步骤三：将明胶溶解后与甲基丙烯酸酐混合反应，得到甲基丙烯酰化明胶；
步骤四：将步骤二和步骤三中的产物SilGMA和GelMA灭菌后分别按预设比例溶解，并加入色素与光引发剂，与细胞混合后得到生物打印墨水。
步骤一中，碳酸钠溶液脱胶需进行两次，第一次浓度为5％(w/v)，第二次浓度为10％(w/v)，且蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为1:100(g/mL)；
步骤二中，过饱和溴化锂溶液浓度为的9.3mol/L，脱胶丝素蛋白与溴化锂溶液的质量体积比为4:25(g/mL)，甲基丙烯酸酐缩水甘油酯和溴化锂溶液的体积比为2:25(mL/mL)；
步骤三中，明胶溶液浓度为0.1g/mL，明胶溶液与甲基丙烯酸酐的体积比为5:1(mL/mL)；
步骤(4)中，色素柠檬黄，浓度0.1％(w/v)；光引发剂LAP，浓度为0.5％(w/v)。
步骤一中，碳酸钠溶液为水溶液，碱性溶液用于丝胶蛋白的脱去；
步骤二中，以溴化锂的水溶液为反应介质；
步骤三中，以PBS缓冲液作为反应介质，以控制pH值为中性至弱碱性，利于取代反应正向进行；
步骤四中，均以PBS缓冲液作为溶解体系。
步骤一中，脱胶反应的时间为30分钟/次，共两次；脱胶反应的温度为90℃以上；
步骤二中，取代反应的条件为60℃下反应4h；
步骤三中，反应的溶解条件为45℃下1h，反应条件为50℃下5h；
步骤四中，SilGMA溶解条件为低温静置、轻晃；GelMA的溶解条件为37℃水浴、摇晃。
步骤二中，取代反应完后，以4℃去离子水经多次换水透析7天以除去小分子单体，冷冻干燥后-20℃保存；
步骤三中，取代反应完后，以20-25℃去离子水经多次换水透析4-7天以除去小分子单体，冷冻干燥后4℃保存；
步骤四中，产物以2.5-5kgy剂量电子束辐照灭菌并维持材料较好的溶解性。
步骤四中，对于生物打印墨水的DLP打印条件控制为光波长405nm，光功率800w，老化层3层，老化层单层固化25s，普通层n层，普通层单层固化15s，同时保证打印支架的强度、精确度及内部细胞的高存活率。
本发明基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水，可应用于制备负载软骨细胞的软骨组织工程支架以用于软骨再生修复。
SilGMA的制备步骤：
(1)将家养桑蚕茧洗净后剪成小片，然后将10g的小片蚕茧加入约1L
0.05M的Na2CO3溶液中，加热至90℃以上煮30分钟后，丝胶蛋白溶于Na2CO3，用去离子水洗涤多次脱胶蚕丝。
(2)再次加入1L 0.1M Na2CO3溶液中90℃以上煮30分钟，使丝胶蛋白完全被去除，再用去离子水洗涤多次，放入烘箱中烘干。
(3)干燥后，将4g脱胶蚕丝溶于60℃的25mL 9.3M过饱和LiBr溶液中，300rpm溶解1h。
(4)完全溶解后，逐滴缓慢滴加甲基丙烯缩水甘油酯(GMA)约2mL，滴加完毕后，维持60℃继续反应3-4h。
(5)9000rpm离心5min去除不溶杂质，取上清液于4℃去离子水中透析(3500Da)，前期频繁换水，后期减缓。
(6)透析7天至无味后，冷冻干燥产物，所得样品SilGMA保存于-20℃。
步骤(1)中，丝素蛋白不溶于Na2CO3从而被分离开，丝胶蛋白使溶液呈现明显的暗黄色。
步骤(2)中，使Na2CO3溶液浓度加倍目的在于更高效彻底地除去丝胶蛋白，或改为0.5M溶液脱胶3-4次。
步骤(3)中，LiBr溶液需要定容至25mL或持续添加至无法溶解才能够达到过饱和，非过饱和LiBr溶液对丝素蛋白溶解能力有限，丝素蛋白分子量仍较大，易产生自发构象转变影响使用。
步骤(4)中，物料比为较大取代度的合适比例，需要更高取代度则要考虑使用缓冲液体系稳定pH值。
步骤(5)和(6)中，低温透析、频繁换水、-20℃保存目的在于延缓丝素蛋白主链结构的不可逆β-转变。
GelMA的制备步骤：
(1.1)称取6g明胶，加入60mL PBS缓冲液(1×)溶液中，在45℃，300rpm条件下溶解1小时。
(1.2)完全溶解后升温至50℃，缓慢滴加甲基丙烯酸酐(MA)约12mL，滴加完毕后保持温度反应5h。
(1.3)将白色反应液稀释10倍后在45℃，300rpm搅拌1h。
(1.4)9000rpm离心5min去除不溶物，取上清液在常温去离子水中透析(8000-14000Da)，若有沉淀析出，则重新加热溶解后再继续透析。
(1.5)透析4-7天至无味后，冷冻干燥产物，所得样品GelMA保存于4℃。
步骤(1.1)中，PBS缓冲液作用为保证体系pH为弱碱性，利于取代反应正向进行，提高接枝率。
步骤(1.2)中，MA添加完全过量，但不影响接枝率。
步骤(1.3)中，操作可以尽量避免步骤(1.4)中的沉淀析出。
本发明的改性丝素蛋白与改性明胶与软骨细胞共同打印光固化得到的打印得到的软骨组织工程支架，其本身可以模仿软骨细胞外基质，且精细结构有利于营养物质与氧气的运输，为内部软骨细胞的生存和表达提供条件，支架的缓慢降解也为软骨细胞长期培养提供支持，而内部的软骨细胞在长期培养过程中出现增殖，合成大量细胞外基质，逐步形成类软骨组织。因此可应用于生物材料领域中，特别适合于负载软骨细胞对应特定形态的软骨缺损和再生。
相较于传统3D打印方式，基于光固化投影原理的数字光处理(DLP)打印方式在打印温度与打印环境方面更温和，常温打印且避免了打印过程中对细胞的挤压损害作用，细胞存活情况更佳，同时，成型的支架精度更高且自由定制，对生物墨水的流动性和粘度要求更低，能得到更复杂结构的同时保证高细胞存活率。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的原料来源于天然物质，获取简单，制备方法具有线路简单，操作方便，试剂毒性低，纯化方式简单，产率较高且产物易保存等优点。
(2)本发明使用的DLP打印作为生物打印更合适。
(3)本发明中光敏丝素蛋白同样可以与甲基丙烯酰明胶一样作为DLP打印材料，复合后作为增强组分能够大幅提升材料的力学强度和形态维持能力，匹配软骨强度与多样的形态缺损。
(4)本发明的丝素明胶复合打印支架用于负载软骨细胞作为软骨组织工程支架时，利于软骨细胞增殖和基质分泌并促进软骨再生，实现更好的修复效果。
附图说明
图1为本发明中甲基丙烯甘油酯化丝素蛋白(SilGMA)和甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的合成路线示意图，其中，a为SilGMA制备反应示意图；b为GelMA制备反应示意图；
图2为实施例1所得两个改性天然大分子的核磁谱图；
图3为实施例1所得复合墨水成胶之后的力学性能结果图(也与添加纯丝素蛋白对比)；
图4为实施例1所得复合墨水在不同DLP打印条件下所得样品外观图；
图5为实施例1所得复合墨水负载细胞打印后所得支架内细胞的存活和增殖情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述。
实施例中家养桑蚕茧由网购得，自蚕茧提取丝素蛋白，而明胶、甲基丙烯缩水甘油酯、甲基丙烯酸酐直接购得。
图1为本发明中甲基丙烯甘油酯化丝素蛋白(SilGMA)和甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的合成路线示意图，其中，a为SilGMA制备反应示意图；b为GelMA制备反应示意图。
实施例1：
(1)先对蚕茧做简单清洗，用剪刀剪成小片，然后将8g的小片蚕茧加入800mL0.05M的Na2CO3溶液中，100℃煮沸30分钟后，用去离子水洗涤至少5次，随后再加入1L 0.1MNa2CO3溶液中煮沸30分钟，去离子水洗涤5次以上。置于50℃烘箱内干燥后，取4g干燥丝素蛋白溶于60℃的25mL 9.3M LiBr溶液中，300rpm溶解1h至无明显不溶物。逐滴滴加GMA 2mL，滴加完毕后，保持同样条件反应继续反应3h。以9000rpm离心5min去除不溶深色杂质，上清液于4℃低温去离子水中透析(3500Da)7天至无甘油酯味后，冷冻干燥，所得样品SilGMA保存于-20℃；
(2)称取6g明胶，加入60mL PBS溶液(1x)中，加热至45℃，300rpm搅拌溶解。完全溶解后溶液呈暗黄色，升温至50℃，缓慢滴加MA 12mL，滴加完毕后继续反应5h。取下反应液，用PBS稀释10倍后在45℃条件下，300rpm搅拌1h。随后以9000rpm离心5min去除白色不溶物，取上清液20℃透析(8000-14000Da)4天，中途出现沉淀时，重新加PBS并加热溶解，继续透析，直至无酸酐味后，冷冻干燥，所得样品GelMA保存于4℃；
(3)取步骤(1)产物50mg和步骤(2)中产物50mg溶于0.6mL氘代水测核磁氢谱，接枝率由核磁氢谱特征峰计算得到。SilGMA接枝率约为30.3％，GelMA接枝率约为82.1％。本实施例的产物的核磁测试结果见图2。
(4)设置GelMA含量相同，SilGMA含量不同的组别，配置墨水。以在定制的模具中紫外固化成型得到水凝胶，以用于多项性能测试。使用SGXGY表示SilGMA含量为X％，GelMA含量为Y％。力学强度高的G10、SG7.5G10、SG10G10组被用作生物墨水。灭菌材料后，直接溶解冻干材料。将色素、引发剂溶解后过滤灭菌，再与GelMA共同加热溶解，而SilGMA单独常温溶解，最后混合均匀后立用于打印条件的探索。确定打印条件后，负载细胞打印并进行后续测试。
实施例2：
(1)蚕茧做简单清洗后剪成小片，然后将20g的小片蚕茧加入2L 0.05M的Na2CO3溶液中，90℃以上煮沸30分钟后，用去离子水洗涤至少5次，随后重复该步骤，此步骤共重复三次。置于50℃烘箱内干燥后，取4g干燥丝素蛋白溶于60℃的25mL 9.3M LiBr溶液中，300rpm溶解1h至无明显不溶物。逐滴滴加GMA 1.5mL，滴加完毕后，保持同样条件反应继续反应3h。以9000rpm离心5min去除不溶深色杂质，上清液于4℃低温去离子水中透析(3500Da)7天至无甘油酯味后，所得SilGMA溶液直接保存于4℃，使用时再用6000Da的20％聚乙二醇(PEG)溶液反透析至需要的浓度；
(2)称取10g明胶，加入100mL PBS溶液(1x)中，加热至45℃，300rpm搅拌溶解。完全溶解后溶液呈暗黄色，升温至50℃，缓慢滴加MA 20mL，滴加完毕后继续反应5h。取下反应液，用PBS稀释8倍,，在45℃条件下，300rpm搅拌1h。随后以9000rpm离心5min去除白色不溶物，取上清液常温透析(8000-14000Da)4天，中途出现沉淀时，重新加PBS并加热溶解，继续透析，直至无酸酐味后，冷冻干燥，所得样品GelMA保存于-20℃；
(3)将步骤(1)部分产物冻干后取50mg，和步骤(2)中产物50mg溶于0.6mL氘代水测核磁氢谱，接枝率由核磁氢谱特征峰计算得到。SilGMA接枝率约为29.0％，GelMA接枝率约为77.8％。
(4)设置GelMA含量相同，SilGMA含量不同的组别，配置生物墨水。力学强度高的G10、SG7.5G10、SG10G10组被用作生物墨水。将色素、引发剂溶解后过滤灭菌，同GelMA一起加热溶解，而SilGMA溶液反透析后过滤灭菌，最后混合均匀后作为墨水和细胞混合后进行细胞打印并开展后续测试。
性能测试：
对实施例1制备得到的复合墨水在紫外光下照射2min得到的水凝胶G10、SF2.5G10、SF5G10、SF7.5G10、SF10G10、SG2.5G10、SG5G10、SG7.5G10、SG10G10进行压缩强度测定(其中SG代表SilGMA，而SF代表未改性的丝素蛋白)，结果见图3；
将复合墨水通过DLP打印机打印，改变打印参数如光功率和单层光固化时间，通过样品外观和力学强度判断打印效果，结果如图4所示；
将复合生物墨水加入DLP打印机后，按恰当打印参数打印所得支架分别在第1、4、7、14天时通过活死双染试剂盒染色，在37℃孵育30min后洗去染液，使用激光扫描共聚焦显微镜拍摄图像，统计增殖和存活率情况，结果见图5，结果表明软骨细胞在内可以长期存活，且存在增殖。
如上所述，便可较好地实现本发明。
本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水，其特征在于结构如下：
其中，GelMA为甲基丙烯酸酐取代的明胶；SilGMA为甲基丙烯缩水甘油酯取代的丝素蛋白。
2.根据权利要求1所述基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水的制备方法，其特征在于：
步骤一：使用碳酸钠溶液将蚕茧脱去丝胶蛋白，得到不溶性丝素蛋白；
步骤二：使用溴化锂过饱和溶液溶解不溶性丝素蛋白，加入甲基丙烯缩水甘油酯混合反应，得到甲基丙烯甘油酯化丝素蛋白；
步骤三：将明胶溶解后与甲基丙烯酸酐混合反应，得到甲基丙烯酰化明胶；
步骤四：将步骤二和步骤三中的产物SilGMA和GelMA灭菌后分别按预设比例溶解，并加入色素与光引发剂，与细胞混合后得到生物打印墨水。
3.根据权利要求2所述基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水的制备方法，其特征在于：
步骤一中，碳酸钠溶液脱胶需进行两次，第一次浓度为5％(w/v)，第二次浓度为10％(w/v)，且蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为1:100(g/mL)；
步骤二中，过饱和溴化锂溶液浓度为的9.3mol/L，脱胶丝素蛋白与溴化锂溶液的质量体积比为4:25(g/mL)，甲基丙烯酸酐缩水甘油酯和溴化锂溶液的体积比为2:25(mL/mL)；
步骤三中，明胶溶液浓度为0.1g/mL，明胶溶液与甲基丙烯酸酐的体积比为5:1(mL/mL)；
步骤(4)中，色素柠檬黄，浓度0.1％(w/v)；光引发剂LAP，浓度为0.5％(w/v)。
4.根据权利要求2所述基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水的制备方法，其特征在于：
步骤一中，碳酸钠溶液为水溶液；
步骤二中，以溴化锂的水溶液为反应介质；
步骤三中，以PBS缓冲液作为反应介质，以控制pH值为中性至弱碱性，利于取代反应正向进行；
步骤四中，均以PBS缓冲液作为溶解体系。
5.根据权利要求2所述基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水的制备方法，其特征在于：
步骤一中，脱胶反应的时间为30分钟/次，共两次；脱胶反应的温度为90℃以上；
步骤二中，取代反应的条件为60℃下反应4h；
步骤三中，反应的溶解条件为45℃下1h，反应条件为50℃下5h；
步骤四中，SilGMA溶解条件为低温静置、轻晃；GelMA的溶解条件为37℃水浴、摇晃。
6.根据权利要求2所述基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水的制备方法，其特征在于：
步骤二中，取代反应完后，以4℃去离子水经多次换水透析7天以除去小分子单体，冷冻干燥后-20℃保存；
步骤三中，取代反应完后，以20-25℃去离子水经多次换水透析4-7天以除去小分子单体，冷冻干燥后4℃保存；
步骤四中，产物以2.5-5kgy剂量电子束辐照灭菌。
7.根据权利要求2所述基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水的制备方法，其特征在于：
步骤四中，对于生物打印墨水的DLP打印条件控制为光波长405nm，光功率800w，老化层3层，老化层单层固化25s，普通层n层，普通层单层固化15s。
8.根据权利要求2-7中任一项所述制备方法制得基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水，应用于制备负载软骨细胞的软骨组织工程支架以用于软骨再生修复。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310310457.1A CN116421780A (zh) | 2023-03-28 | 2023-03-28 | 一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水及其制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310310457.1A CN116421780A (zh) | 2023-03-28 | 2023-03-28 | 一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水及其制备与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116421780A true CN116421780A (zh) | 2023-07-14 |
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|---|---|---|---|
| CN202310310457.1A Pending CN116421780A (zh) | 2023-03-28 | 2023-03-28 | 一种基于丝素蛋白和明胶的生物打印墨水及其制备与应用 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116421780A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117159801A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-05 | 中国人民解放军总医院第七医学中心 | 一种缓释opg和sdf-1促进骨组织再生的纳米复合水凝胶支架的制备方法 |
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2023
- 2023-03-28 CN CN202310310457.1A patent/CN116421780A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117159801A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-05 | 中国人民解放军总医院第七医学中心 | 一种缓释opg和sdf-1促进骨组织再生的纳米复合水凝胶支架的制备方法 |
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