CN113388133A - 甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：配制浓度为1～10g/100ml的乳清蛋白粉原液，先向乳清蛋白粉原液中加入甲基丙烯酸酐，然后调节pH至6.0～10.0，10～25℃持续搅拌反应3～24h；所得反应后溶液用去离子水稀释后透析48～72h，将透析后的截留液冻干，得冻干粉；在去离子水加入冻干粉，再于避光条件下加入光引发剂，用紫外线或可见光照射10～60s后，得水凝胶。本发明还同时提供了上述甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶在化妆品中的应用。

Description

甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料及食品、化妆品等技术领域，具体涉及一种甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法及在食品、化妆品和生物医学材料领域的应用。
背景技术
水凝胶是由亲水性分子通过物理或化学交联作用，形成的一种具有三维交联网状结构的软湿材料，具有亲水性而又不溶于水，其功能多样，特性优异，在生物医用、化妆品以及食品工业等众多领域都得到广泛的应用。水凝胶多孔的网络结构和优异的吸水性使得水凝胶能够模仿人体组织的微环境，其物化性能、机械性能以及功能性均可通过调整水凝胶制备工艺而得以改善，因此，水凝胶在生物医学和医药领域备受青睐。然而，现有的医用水凝胶还存在产品性质不均一，功能特性不稳定，原材料成本较高等问题。
乳清蛋白是一类存在于牛奶乳清中的优质蛋白，主要包含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白以及乳铁蛋白等生物活性成分。乳清蛋白是干酪加工的副产物，是可获得的最经济的食物蛋白质资源之一，它不仅营养价值高，还具有多种生物活性，如抗氧化、促进创伤愈合、促进骨骼修复以及调节免疫等。乳清蛋白具有热稳定性好、乳化稳定性好、泡沫稳定性好以及易溶解等优点。此外，乳清蛋白中含有游离的氨基和羟基等活性基团，因此适用于化学改性处理。这些特性都使乳清蛋白十分适于加工成医用等领域的水凝胶。
目前已报道的乳清蛋白水凝胶主要通过以下方法来制备：首先通过加热使蛋白分子展开，暴露内部的疏水基团；然后在高温条件下，蛋白与蛋白分子间，以及蛋白与溶剂分子间会重新相互作用形成凝胶。或者在加热使蛋白分子展开后，在环境温度下引入盐、酸或碱，以诱导蛋白凝胶的形成。
上述方法普遍存在反应条件复杂，凝胶时间长，产品性质不稳定，难以产业化等缺陷。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
1)、将乳清蛋白粉在室温下溶解于PBS缓冲液(pH7～8，即，1×PBS缓冲液)中，配制成浓度为1～10g/100ml(优选5±1g/100ml)的乳清蛋白粉原液；
2)、先向乳清蛋白粉原液中加入甲基丙烯酸酐，所述甲基丙烯酸酐与步骤1)的乳清蛋白粉的用量比(v/w)为1ml/20g～2ml/1g(优选0.2～1.0v/w)；然后调节pH至6.0～10.0(优选pH8)，10～25℃持续搅拌反应3～24h；
3)、将步骤2)所得反应后溶液用去离子水稀释后透析48～72h，将透析后的截留液冻干，得冻干粉(甲基丙烯酰化乳清蛋白粉)；
4)、在去离子水加入冻干粉，搅拌至冻干粉溶解，得冻干粉浓度为10～20g/100ml(优选15±2g/100ml)的冻干粉溶液；
再于避光条件下，加入光引发剂至光引发剂的终浓度为0.05～0.5g/100ml(即，0.05％～0.5％，w/v)，混匀；
5)、用紫外线(380～405nm)或可见光(含300～450nm)照射步骤4)所得混合液10～60s后，得水凝胶(甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶)。
作为本发明的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法的改进，所述步骤4)的光引发剂为苯基2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)。
即，苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂，为水溶性的光引发剂。
作为本发明的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法的进一步改进，步骤3)中：透析袋截留分子量为5000～10000Da；反应后溶液：去离子水＝1:2～5的体积比，每6h更换一次透析用去离子水。
作为本发明的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法的进一步改进：步骤5)中，所述的紫外光强度为10～30mW/cm2。
作为本发明的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法的进一步改进，所述步骤2)中：
利用过0.22μm滤径的滤膜、且浓度为5～10mol/L的碱溶液进行pH的调节；
所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
作为本发明的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法的进一步改进，所述步骤3)中的冻干为：于-45～-55℃干燥16～24h。
本发明还同时提供了利用上述任一方法制备所得的的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶在化妆品中的应用。
在本发明中：
乳清蛋白粉为食品级乳清蛋白分离蛋白粉(蛋白浓度>90％)，例如可购自郑州裕和食品添加剂有限公司。
在本发明中，首先甲基丙烯酸酐与乳清蛋白在室温下反应形成甲基丙烯酰化乳清蛋白，该甲基丙烯酰化乳清蛋白含有双键，其水溶液在少量光引发剂存在以及紫外光照下，在10s左右即可形成水凝胶。本发明所涉及的水凝胶制备工艺简单易行，反应条件温和，产品性质稳定，适于工业化生产。
本发明具有以下优势：
(1)本发明所用原料为乳清分离蛋白，原料来源安全，成本低廉，属于干酪加工的副产物。本发明将成本低廉的食品原料转化为具有生物活性的水凝胶医用材料，大大提高了经济效益。
(2)本发明所研制的水凝胶属于乳源蛋白医用材料，其安全系数高，产量大，价格比大多同类医用材料更加低廉。
(3)本发明所采用的成胶工艺简单易行，适于大规模工业化生产。
(4)本发明所研制的水凝胶在体内易降解，生物相容性好，用途广泛，如皮肤修复，心肌修复等，具有广阔的应用前景。
综上所述，本发明通过化学改性等手段制备一种以乳清蛋白为基质的水凝胶，将乳清蛋白转化为具有生物活性的医用材料，可用于解决生物医药、化妆品及特殊食品等领域。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为实施例1的甲基丙烯酰化乳清蛋白中氨基的接枝率的核磁图谱；
图2为实施例1、2的甲基丙烯酰化乳清蛋白中氨基的接枝率；
图3为实施例1的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶图；
图4为实施例3的甲基丙烯酰化乳清蛋白流变特性示意图；
图5为实验1的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的体外细胞相容性。
图6为实施例4的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶组大鼠术后7天组织HE染色100倍(A)及200倍(B)镜下图；
图7为对比例2-1的甲基丙烯酰化乳清蛋白流变特性示意图；
图8为对比例2-2的甲基丙烯酰化乳清蛋白流变特性示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1、一种甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法：
1)、将乳清蛋白粉在室温(20～25℃)下充分溶解于1×PBS缓冲液(pH7～8)中，配制成浓度为5g/100ml的乳清蛋白粉原液。
2)、向乳清蛋白粉原液中加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与乳清蛋白粉的比例(v/w)为1ml/5g。并用0.22μm滤径的滤膜过滤后的5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0，20～25℃持续搅拌反应24h；
3)、在步骤2)所得的反应后溶液中加入2体积倍的去离子水进行稀释；透析72h，每6h换透析用去离子水一次，透析袋截留量为10000Da。透析后的截留液冻干(-45～-55℃干燥16～24h)，所得的冻干粉为甲基丙烯酰化乳清蛋白粉。
步骤3)所得的甲基丙烯酰化乳清蛋白粉采用核磁共振光谱法(NMR)分析乳清蛋白中被双键修饰的基团(图1)。根据图1可知，当甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的投料比例(v/w)为0.2时(即，1ml/5g时)，反应后产物的分子结构中存在双键，证明本实例中的反应体系能将双键高效地接枝到乳清蛋白分子上，实现乳清蛋白分子的化学改性。
采用TNBS显色法测定甲基丙烯酰化乳清蛋白中氨基的接枝率(图2)。根据图2可知，当甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的投料比例(v/w)为1ml/5g时，反应后产物的游离氨基已被完全接枝(接枝率100％)，此时的产物含有的双键量最高，在紫外光照下最易于形成水凝胶。因此，在制备甲基丙烯酰化乳清蛋白时，甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的最佳投料比例(v/w)为1ml/5g。
4)、将上述冻干粉溶解于去离子水，得浓度为15g/100ml的冻干粉溶液；
再于避光条件下，加入苯基2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)作为光引发剂后混匀，光引发剂的终浓度为0.05％(0.05g/100ml)；
5)、用紫外线(380～405nm)照射步骤4)所得混合液20s后，即可制成水凝胶，紫外光强度为30mW/cm2。所得甲基丙烯酰化乳清蛋白(WPI-MA)水凝胶的形态如图3。
实施例2、将甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的投料比例(v/w)由0.2(1ml/5g)分别改成0、0.4、0.6、0.8、1.0，其余同实施例1的步骤1)～3)。
所得的甲基丙烯酰化乳清蛋白中氨基的接枝率的对比如图2所示。根据图2可得知：上述投料比例过大时，会导致反应过程中溶液出现浑浊和沉淀，致使甲基丙烯酰化乳清蛋白的产率降低。此外，酸酐的过量加入无益于接枝率的升高，而且会增加产品成本。
实施例3：
将实施例1的步骤5)紫外光强度由30mW/cm2改为12mW/cm2。照射时间由0s直至为200s；其余等同于实施例1；从而验证甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的流变特性。
按照常规的流变学测量方法，采用MCR302流变仪测定甲基丙烯酰化乳清蛋白的流变特性，应力为1％，频率为50Hz，甲基丙烯酰化乳清蛋白的储能模量(G’)和损耗模量(G”)随时间的变化参见图4。
根据图4可知，该实施例中的甲基丙烯酰化乳清蛋白水溶液的凝胶时间仅约为12s(从溶液转变为凝胶的临界点时间)，其凝胶速度远远高于其他已报道的乳清蛋白水溶液；而且该实例中的水凝胶特性优良，具有良好的应用前景。
实验1、甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的体外细胞相容性：
1、将实施例1制备所得的甲基丙烯酰化乳清蛋白(WPI-MA)水凝胶，采用DMEM标准培养基浸提甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶，水凝胶与培养基的质量体积比为1g/20ml，浸提时间为24h，浸提温度为37℃；制备得甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶浸提液。
2、选用小鼠血管内皮细胞进行培养，得到细胞悬液后进行细胞计数，按细胞数量将细胞悬液稀释至5万/mL。
3、在96孔板中接种细胞悬液，每孔接种100μL，培养12h使细胞粘附于孔板底部。
4、去除原先培养基，向实验组各孔中加入100μL甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶浸提液。对照组各孔加入100μL DMEM培养基。
5、将培养板放入培养箱中孵育24h，孵育温度为37℃。
6、配置含10％CCK-8的培养基，以换液的形式加入孔板。
7、将培养板放入培养箱中孵育2h，孵育温度为37℃。
8、用酶标仪测定450nm处的吸光度(OD)。
甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的细胞相容性如图5所示，该试验结果表明，本发明中的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶与小鼠血管内皮细胞相容性可达100％，细胞相容性优良。
实验2、甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的体内细胞相容性和降解性。
1、使用实施例1制备所得的甲基丙烯酰化乳清蛋白(WPI-MA)水凝胶。
2、在大鼠背部中线两侧选取对称部位，剪开皮肤后将0.1g水凝胶埋入皮下，对伤口进行缝合处理。保证每次埋入水凝胶的形状和质量一致。
3、大鼠于术后7天处死，于创缘切取标本同时切取部分创面底部及周边健康皮肤组织。标本置于福尔马林中固定。
4、石蜡切片HE染色拍照具体流程如下所示：
(1)组织脱水：标本组织依次经75％酒精(4h)-85％酒精(2h)-90％酒精(1.5h)-95％酒精(1h)-无水乙醇Ⅰ(0.5h)-无水乙醇Ⅱ(0.5h)完成组织脱水。
(2)组织透明：脱水组织依次经过无水乙醇：二甲苯(1：1)(10min)-二甲苯Ⅰ(10min)-二甲苯Ⅱ(7min)完成组织透明过程。
(3)浸蜡：透明后的组织块依次经3缸石蜡(60℃)进行浸蜡。石蜡Ⅰ(60℃)(1h)-石蜡Ⅱ(60℃)(1h)-石蜡Ⅲ(60℃)(1h)。
以上步骤都在生物组织脱水机里面完成。
(4)包埋：包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体，使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。
(5)切片和烤片：切片前蜡块切面在冻台上冷冻数分钟，标本夹固定目标包埋块，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并使包埋块稍突出。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度(4μm)，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，开始进行切片。右手用力均匀匀速转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于42℃左右水浴展片锅中。切好的切片需展平后贴附于载玻片。捞片法具体流程：首先将连串的切片放入到42℃左右的温水浴展片锅中，待切片浮于水面，并由于表面张力的作用自然展平，用镊子将切片分开，然后用APES或多聚赖氨酸处理过的防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，贴服完成后于60℃烤箱烤片3个小时。
(6)切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ(10min)-二甲苯Ⅱ(10min)-无水乙醇Ⅰ(5min)-无水乙醇Ⅱ(5min)-95％酒精(3min)-90％酒精(3min)-80％酒精(2min)-70％酒精(2min)，然后蒸馏水浸洗2min。
(7)HE染色：Harris氏苏木素染液染色5-7min，自来水洗浸洗返蓝。切片入1％的盐酸酒精分化2-5s，自来水洗浸洗返蓝。切片入1％水溶性伊红染液染色2min，自来水洗浸洗30s。切片入无水乙醇脱水，二甲苯透明，风干后中性树胶封片。
(8)镜下拍照：染色完成后光学镜下观察。
根据图6所示，背埋甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶7天后，水凝胶材料周围形成纤维囊包裹，水凝胶材料表面有炎症细胞浸润，无溃烂等不良反应，证实本实例中水凝胶在体内具有良好的组织相容性。同时，由于细胞能够寝食水凝胶材料，证明材料可以被降解。
对比例1-1、将实施例1步骤2中的“甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的比例(v/w)”改为1/20，其余等同于实例1。
对比例1-2、将实施例1步骤2中的“甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的比例(v/w)”改为1/10，其余等同于实例1。
对比例1-1、对比例1-2以及实施例1中的甲基丙烯酰化乳清蛋白的氨基接枝率和凝胶状况见表1：
表1、不同甲基丙烯酸酐与乳清蛋白投料比所对应的氨基接枝率和凝胶状况(紫外线照射20s)
Figure BDA0003109537490000071
氨基接枝率计算公式如下：
Figure BDA0003109537490000072
氨基接枝率越高，表明甲基丙烯酰化乳清蛋白中的双键含量越高，从而表明该甲基丙烯酰化乳清蛋白在紫外光照下越容易形成凝胶。根据表1可知，在对比例1-1中，甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的投料比例(v/w)为1/20，反应后产物的游离氨基的接枝率仅为29％，甲基丙烯酰化乳清蛋白溶液未能形成凝胶。在对比例1-2中，甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的投料比例(v/w)为1/10，虽然甲基丙烯酰化乳清蛋白溶液虽然可以形成凝胶，但是其游离氨基的接枝率为58％。相比之下，实施例1中甲基丙烯酰化乳清蛋白游离氨基的接枝率最高，可达为100％，且凝胶状态最优。
对比例2-1、将实施例3步骤2中的“甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的比例(v/w)”改为1/20，其余等同于实例2。
对比例2-2、将实施例3步骤2中的“甲基丙烯酸酐与乳清蛋白的比例(v/w)”改为1/10，其余等同于实例2。
对比例2-1、对比例2-2以及实施例3中的甲基丙烯酰化乳清蛋白的凝胶时间见表2：
表2、不同甲基丙烯酸酐与乳清蛋白投料比所对应的甲基丙烯酰化乳清蛋白凝胶时间
Figure BDA0003109537490000073
对比例2-1、对比例2-2以及实施例3中甲基丙烯酰化乳清蛋白的储能模量(G')和损耗模量(G")随时间的变化分别参见图7、图8和图4。一般来说，储能模量(G')数值大于损耗模量(G")时，样品表现为固态，反之，则表现为液体。因此，当两者相等时，认为是样品处于凝胶态，达到凝胶态的时间即为凝胶时间。凝胶时间越短又有利于水凝胶的生产。根据表2可知，在对比例2-1和对比例2-2中的甲基丙烯酰化乳清蛋白凝胶时间长于实施例3中的甲基丙烯酰化乳清蛋白。因此，甲基丙烯酸酐与乳清蛋白投料比为1/5时，最有利于甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备。
实施例4、一种乳清蛋白水凝胶面膜的制备方法：
1)、将5份营养剂(甘醇酸、卵磷脂和大豆多糖的混合物制成)；5份美白剂(维生素C和维生素E的混合物)；10份抗氧化剂(花青素提取物)；10份保湿剂(丙二醇)混合均匀；
2)、将步骤1)所得的混合物和20份的乳清白凝胶剂(实施例1制备所得)混合，95℃以上保持30分钟以上，加入有海藻纤维支持的面膜模具中；
3)、放入-10℃以下冷却8h，移出在室温下解冻，制成2mm后的水凝胶面膜；
4)、面膜脱模后进行分装。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将乳清蛋白粉在室温下溶解于PBS缓冲液中，配制成浓度为1～10g/100ml的乳清蛋白粉原液；
2)、先向乳清蛋白粉原液中加入甲基丙烯酸酐，所述甲基丙烯酸酐与步骤1)的乳清蛋白粉的用量比为1ml/20g～2ml/1g；然后调节pH至6.0～10.0，10～25℃持续搅拌反应3～24h；
3)、将步骤2)所得反应后溶液用去离子水稀释后透析48～72h，将透析后的截留液冻干，得冻干粉；
4)、在去离子水加入冻干粉，搅拌至冻干粉溶解，得冻干粉浓度为10～20g/100ml的冻干粉溶液；
再于避光条件下，加入光引发剂至光引发剂的终浓度为0.05～0.5g/100ml，混匀；
5)、用紫外线或可见光照射步骤4)所得混合液10～60s后，得水凝胶。
2.根据权利要求1所述的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤4)的光引发剂为苯基2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
3.根据权利要求2所述的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于所述步骤3)中：透析袋截留分子量为5000～10000Da。
4.根据权利要求3所述的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于所述步骤3)中：反应后溶液：去离子水＝1:2～5的体积比，每6h更换一次透析用去离子水。
5.根据权利要求4所述的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述的紫外光强度为10～30mW/cm2。
6.根据权利要求1～5任一所述的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中：
利用过0.22μm滤径的滤膜、且浓度为5～10mol/L的碱溶液进行pH的调节；
所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
7.根据权利要求6所述的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中的冻干为：于-45～-55℃干燥16～24h。
8.如权利要求1～7任一方法制备所得的甲基丙烯酰化乳清蛋白水凝胶在化妆品中的应用。
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