CN109810267A - 一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：1)材料的灭菌：2)将丝素蛋白溶液、改性透明质酸溶液混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂；3)超声处理步骤2)所得的预聚物溶液，超声后溶液具有流动性且呈半透明状；4)经步骤3)处理所得溶液与细胞混合均匀得细胞预聚溶液，进一步将细胞预聚溶液加入细胞培养板中；5)将步骤4)所得培养板放在紫外光下进行光交联成胶，然后放置在37℃恒温箱中，至预聚溶液变成乳白色后即制得。利用本方法能够实现细胞在高强、高韧的双网络水凝胶中的三维培养，有利于类似软骨等承重软组织组织在体外的三维构建。

Description

一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝 胶的制备方法

技术领域

本发明属于组织工程生物材料领域，具体涉及一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法。

背景技术

在水凝胶类材料是一种具有高度吸水性和保水性，质感柔软的具有三维网络体系的聚合物，与活体软组织质感相近；因其三维网络结构与天然细胞外基质相近，利于种子细胞的存活；可在液态时微创注射至体内再形成半固态的胶体从而减少植入创伤等独特优势，已广泛应用于组织工程中支架类材料的研究。但水凝胶存在力学性能较差以及降解速度过快等缺点,导致其难以用于承重承力的软骨组织的三维构建。因此，如何提高水凝胶的力学强度成为国内外专家学者共同面临的难题之一。

近年来，双网络水凝胶材料由于其具有优良的拉伸性能和更高的机械强度受到了研究人员的广泛重视。双网络水凝胶是由两种不同性质的聚合物形成的互穿网络，第一层为高度交联的刚性聚合物网络，第二层为松散交联的软且韧的中性网络，其中，刚而脆的网络提供高强度的弹性模量，而软而韧的网络可使材料产生大形变从而保证其高韧性。在受到外力作用时，两层网络相互配合，吸收并耗散外界应力，从而达到提高水凝胶强度的目的。由两种不同性质的聚合物通过交联改性形成的双网络水凝胶具有极高的机械强度和韧性，甚至可以和橡胶材料相媲美。然而，当前制备双网络水凝胶的方法大多使用了有毒的交联剂,或者成胶时间过长,难以实现细胞的体外三维装载，不能满足软骨等组织在体外的三维构建的要求。

因此，如何找到一种绿色无毒、快速的成胶方法，并优化双网络水凝胶的制备流程，是实现双网络水凝胶体外细胞三维装载的关键。

发明内容

针对现有双网络水凝胶制备技术的缺陷，本发明提供了一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，所述方法能有效避免有毒交联剂的引入，不会对凝胶中的细胞造成毒害，而且能够实现快速凝胶化，有利于软骨等承重软组织在体外的三维构建。

为实现上述发明目的，具体提供了如下技术方案：

一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)使用高温高压法对丝素溶液和改性透明质酸溶液进行灭菌处理；

2)将丝素蛋白溶液、改性透明质酸溶液按混合形成预聚物溶液，并添加光引发剂；

3)超声处理步骤2)所得的预聚物溶液，超声后溶液具有流动性且呈半透明状；

4)将经步骤3)所得溶液与细胞混合均匀得到细胞预聚溶液；

5)将细胞预聚溶液加入细胞培养板中，在紫外光下进行光交联成胶，然后放置在37℃恒温箱中，至预聚溶液变成乳白色后即制得。

优选的，步骤1)所述丝素蛋白依次采用了脱胶、溶解、透析、浓缩的分离提纯工艺，所述改性透明质酸溶液为甲基丙烯酸酐改性透明质酸溶液。

进一步优选的，步骤1)所述丝素蛋白的质量体积分数为8％，所述改性透明质酸溶液的质量体积分数为2％，所述丝素蛋白溶液与改性透明质酸溶液的添加质量比例为8.6～9.5：1.4～0.5，所述光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.5％。

优选的，步骤1所述高温高压的条件为120℃、0.25MPa,灭菌时间为20min。

优选的，步骤4)所述细胞预聚溶液中细胞密度为100万个/mL。

优选的，步骤5)所述紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²。

本发明的有益效果在于：本发明所述方法通过用甲基丙烯酸酐对透明质酸进行改性，从而使透明质酸具有紫外光光敏感性，利用超声-光交联联合交联技术分别对复合预聚物溶液进行处理，得到了具有优良生物相容性、力学性能较强、理化性能稳定的双网络水凝胶。通过选取具有良好生物相容性和机械性能的原料构建组织工程用支架材料用于细胞的三维装载，并优化制备流程，实现了绿色环保的成胶方法，此方法有效地避免了有毒试剂的加入，不会对细胞造成毒害，并且能够实现细胞的粘附增殖与原位三维装载，有利于软骨组织在体外的三维构建。

附图说明

图1为装载有细胞的丝素蛋白透明质酸双网络水凝胶的荧光染色图。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细说明：

以下实施例使用的丝素蛋白由家蚕蚕丝分离提纯制得，分离提纯工艺如下：

丝素蛋白的分离提纯：

1)脱胶：采用碱煮法对家蚕蚕丝进行脱胶处理：

取1g无水碳酸钠加入2L的蒸馏水中溶解，加热至溶液沸腾后放入20g蚕丝。在溶液持续沸腾下用玻璃棒不断搅拌，0.5h后取出蚕丝，用去离子水清洗10次以上。更换2L去离子水，提升Na₂CO₃溶液浓度至1％(w/v)，将洗好的蚕丝放入其中继续沸腾搅拌煮0.5h，取出蚕丝再次用去离子水反复清洗，最后风干备用。

2)溶解：

采用高浓度溴化锂溶液(浓度约为9.3M)对脱胶蚕丝进行溶解，且脱胶蚕丝的质量与溶液的体积比为4:25。

称取4g脱胶蚕丝和21g溴化锂粉末，将21g溴化锂溶于25mL去离子水中，待溴化锂完全溶解并释放大量热的同时，将4g脱胶蚕丝加入到该溶液中，待蚕丝整体溶解后，将其放在60℃烘箱内约20min，维持一定温度以确保蚕丝完全溶解。当溶液完全处于澄清透明状后即可认定蚕丝完全溶解。

3)透析：利用截留分子量为3500D的透析袋，并在4℃的条件下透析：

将溶解后的丝素蛋白倒入截留分子量为3500D的透析袋中，并将其放入去离子水中，每天更换5次去离子水，透析3天即可。

4)浓缩：利用高浓度的聚乙二醇(PEG)溶液进行浓缩：

将透析结束的丝素蛋白溶液进行离心处理，离心时间5min、转速4000rmp,除去不溶杂质后再次将溶液倒入3500D的透析袋中，并放入高浓度的PEG溶液内以除去部分水分。本发明中涉及到的丝素蛋白溶液的质量体积分数为8％，通过浓缩和稀释可调节至相应的浓度。

以下实施例所使用透明质酸为使用甲基丙烯酸酐进行改性的透明质酸，具体步骤为：称取2g低分子透明质酸钠溶解于100mL二次去离子水中，用磁力搅拌器进行匀速搅拌，待溶解完全后，缓慢滴入2mL(分两次加入，每次加入1ml)的甲基丙烯酸酐溶液，此过程需要保持在室温25℃左右。滴加完全之后保持一定转速在室温下反应24h，此过程中需要用5mol/L的NaOH溶液调节pH值，保持整个过程中溶液pH值在弱碱性范围，将反应好的溶液放到截留分子量为3500D的透析袋中，用二次去离子水在4℃下透析5天，每天更换5次或者更多次去离子水。透析完成后将所得的透明质酸溶液冷冻干燥处理，最终得到具有紫外光敏感性的改性透明质酸(HA)。本发明所涉及的透明质酸溶液的质量体积分数为2％。

实施例1

1、一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)材料的灭菌：采用高温高压的方法，在120℃、0.25MPa高温高压环境下对丝素蛋白溶液和改性透明质酸溶液分别进行灭菌处理，灭菌时间为：20min。

2)将质量体积分数为8％的丝素蛋白溶液、质量体积分数为2％的改性透明质酸溶液按照质量比10:0混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，其中光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.5％；

3)将步骤2)所得溶液超声处理15s，超声后溶液具有流动性且透明；

4)经步骤3)处理所得溶液与细胞反复吹打混合均匀后得细胞预聚溶液，密度为100万个/mL，取500μL细胞/预聚溶液滴入细胞24孔培养板中，成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用FDA/PI复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在荧光显微镜下进行观察。

实施例2

1、一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)材料的灭菌：提前采用高温高压的方法，在120℃、0.25Mpa高温高压环境下对丝素蛋白溶液和改性透明质酸溶液进行20min的灭菌处理；

2)将质量体积分数为8％的丝素蛋白溶液、质量体积分数为2％的甲基丙烯酸酐改性透明质酸溶液按照质量比9.5:0.5混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，其中，光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.5％；

3)将步骤2)所得溶液超声处理13s，超声后溶液具有流动性且透明；

4)经步骤3)处理所得溶液与细胞反复吹打混合均匀后得细胞预聚溶液，密度为100万个/mL，取500μL细胞/预聚溶液滴入24孔细胞培养板中，然后置于紫外光(紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²)下交联固化5s，成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用FDA/PI复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在荧光显微镜下进行观察。

实施例3

1、一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)材料的灭菌：采用高温高压的方法，在120℃、0.25MPa高温高压环境下对丝素蛋白溶液和改性透明质酸溶液分别进行灭菌处理，灭菌时间为：20min。

2)将质量体积分数为8％的丝素蛋白溶液、质量体积分数为2％的改性透明质酸溶液按照质量比9:1混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.5％；

3)将步骤2)所得溶液超声处理12s，超声后溶液具有流动性且透明；

4)经步骤3)处理所得溶液与细胞反复吹打混合均匀后得细胞预聚溶液，密度为100万个/mL，取500μL细胞/预聚溶液滴入24孔细胞培养板中，然后置于紫外光(紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²)下交联固化5s，成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用FDA/PI复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在荧光显微镜下进行观察。

实施例4

1、一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)材料的灭菌：采用高温高压的方法，在120℃、0.25MPa高温高压环境下对丝素蛋白溶液和改性透明质酸溶液分别进行灭菌处理，灭菌时间为：20min。

2)将质量体积分数为8％的丝素蛋白溶液、质量体积分数为2％的改性明胶溶液按照质量比8.6:1.4混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，其中光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.5％；、

3)将步骤2)所得溶液超声处理11s，超声后溶液具有流动性且透明；

4)经步骤3)处理所得溶液与细胞反复吹打混合均匀后得细胞预聚溶液，密度为100万个/mL，取500μL细胞/预聚溶液滴入24孔细胞培养板中，然后置于紫外光(紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²)下交联固化5s，成胶之后加入足够的培养基，培养一段时间后用FDA/PI复染溶液对细胞/水凝胶进行染色，并在荧光显微镜下进行观察。

实施例1～4所得装载有细胞的丝素蛋白透明质酸双网络水凝胶的荧光染色图见图1所示，所有的实施例中都成功实现了细胞的三维装载，而且装载的细胞都保持了较高的活性，证实了该双网络凝胶具有优良的生物相容性，是一种细胞友好的双网络水凝胶的制造方法。同时从图中可以看出，相对于

实施例1，实施例2-4中的死细胞数量轻微地升高，这是因为在这几组凝胶的制造中引入了紫外光交联，一定量紫外辐照会引起细胞的凋亡，造成细胞活性的降低。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)使用高温高压法对丝素溶液和改性透明质酸溶液进行灭菌处理；

2)将丝素蛋白溶液、改性透明质酸溶液按混合形成预聚物溶液，并添加光引发剂；

3)超声处理步骤2)所得的预聚物溶液，超声后溶液具有流动性且呈半透明状；

4)将经步骤3)所得溶液与细胞混合均匀得到细胞预聚溶液；

5)将细胞预聚溶液加入细胞培养板中，在紫外光下进行光交联成胶，然后放置在37℃恒温箱中，至预聚溶液变成乳白色后即制得。

2.根据权利要求1所述一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1)所述丝素蛋白依次采用了脱胶、溶解、透析、浓缩的分离提纯工艺，所述改性透明质酸溶液为甲基丙烯酸酐改性透明质酸溶液。

3.根据权利要求1所述一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1)所述丝素蛋白的质量体积分数为8％，所述改性透明质酸溶液的质量体积分数为2％，所述丝素蛋白溶液与改性透明质酸溶液的添加质量比例为8.6～9.5：1.4～0.5，所述光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.5％。

4.根据权利要求1所述一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1所述高温高压的条件为120℃、0.25MPa,灭菌时间为20min。

5.根据权利要求1所述一种可实现三维细胞装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤4)所述细胞预聚溶液中细胞密度为100万个/mL。

6.根据权利要求1所述一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤5)所述紫外光光源波长：320-480nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²。