CN115887772A - 一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3d打印生物墨水及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用生物材料技术领域,具体涉及一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水及其应用。本发明中的明胶/海藻酸钠水凝胶基生物墨水由对羟基苯丙酸功能化的明胶、酪胺修饰的海藻酸钠和人脐带间充质干细胞组成,采用挤出式生物3D打印技术加工成型,通过可见光诱导的光催化氧化还原交联形成第一层网络,并通过金属离子介导的二次离子交联获得离子‑共价双交联体系,从而极大地增强了3D打印支架的力学性能,且间充质干细胞能够分泌相应的活性因子,为提高3D打印水凝胶在皮肤创伤修复中的应用提供保障。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域,具体涉及一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水及其应用。
背景技术
皮肤作为人体最大和最复杂的身体器官,在日常生活中极易受到损伤。3D生物打印可以精准制造类似于组织原始结构的构建体,连通的多孔结构有利于血管生成,因而3D打印的皮肤组织支架在伤口愈合、皮肤置换和体外人体皮肤模型方面具有巨大的应用潜力。然而,限制其发展的一个关键挑战是获得合适的生物3D打印墨水。复杂的皮肤组织结构对生物墨水的保真度、力学性能和生物功能提出了很高的要求。尽管最近开发的用于皮肤创伤修复的生物墨水能够挤出预期的结构,但在获得与受损组织器官相匹配的机械性能和生物学功能方面仍不能令人满意。因此,开发适合用于皮肤创伤修复的生物3D打印墨水,具有重要的研究与应用价值。
水凝胶具有与细胞外基质相似的微环境,可以促进氧气和养分等的输送,逐渐成为用于皮肤创伤修复最常见的生物3D打印墨水材料。其中,明胶是一种通过胶原蛋白水解获得的蛋白质,具有良好的生物相容性和生物降解性,链段中包含的多种肽序列有利于细胞的黏附与生长。此外,海藻酸盐作为一种具有线性结构的阴离子生物聚合物,可通过添加无毒的金属阳离子(如Ca2+)触发凝胶化,方法简单高效。干细胞则可分泌生物活性因子,通过旁分泌产生微环境,增强血管生成并加速伤口闭合,在皮肤修复中具有潜在用途。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水。
本发明还要解决的技术问题是提供一种基于挤出式3D打印的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水在制备促进皮肤创伤修复的生物3D打印支架中的应用。
发明思路:本发明中所述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水由对羟基苯丙酸功能化的明胶(Gel-HPA)、酪胺修饰的海藻酸钠(Alg-Tyr)和人脐带间充质干细胞组成,采用挤出式生物3D打印技术加工成型,通过可见光诱导的光催化氧化还原交联形成第一层网络,并通过金属离子介导的二次离子交联获得离子-共价双交联体系,从而极大地增强了3D打印支架的力学性能,且人脐带间充质干细胞能够分泌相应的活性因子,为提高3D打印水凝胶在皮肤创伤修复中的应用提供保障。
为了解决上述第一个技术问题,本发明公开了一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水,它包括如下组分:
组分A:对羟基苯丙酸功能化的明胶和酪胺修饰的海藻酸钠的混合物;
组分B:光引发剂溶液。
具体地,上述明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水还包括组分C:人脐带间充质干细胞。
其中,组分A、组分B和组分C分别进行单独包装,在应用时进行混合。
其中,对羟基苯丙酸功能化的明胶可以按照现有技术其他方法制备,也可以按照以下方法进行制备:将对羟基苯丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行反应,得到羧基活化的对羟基苯丙酸;随后羧基活化的对羟基苯丙酸与明胶反应,得到对羟基苯丙酸功能化的明胶。
优选地,本发明中对羟基苯丙酸功能化的明胶的制备方法为:将对羟基苯丙酸溶于N,N-二甲基甲酰胺,得到第一混合液;将N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于去离子水,得到第二混合液;将明胶溶于蒸馏水,得到第三混合液;将第一混合液与第二混合液混合,搅拌反应,得到羧基活化的对羟基苯丙酸;随后将上述体系和第三混合液混合,反应;反应结束后,将体系中的反应物置于透析袋中,用蒸馏水透析,冷冻干燥分离,得到对羟基苯丙酸功能化的明胶。
其中,酪胺修饰的海藻酸钠可以按照现有技术其他方法制备,也可以按照以下方法进行制备:将海藻酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行反应,得到羧基活化的海藻酸钠;将羧基活化的海藻酸钠与酪胺盐酸盐反应,得到酪胺修饰的海藻酸钠。
优选地,本发明中酪胺修饰的海藻酸钠的制备方法为:将海藻酸钠溶于蒸馏水中,冰浴,然后向体系中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行反应;随后向体系中加入酪胺盐酸盐在冰浴条件下反应,再在室温条件下继续反应,反应结束后将体系中的反应物置于透析袋中,用蒸馏水透析,冻干,得到酪胺修饰的海藻酸钠。
具体地,在组分A中,所述的对羟基苯丙酸功能化的明胶与酪胺修饰的海藻酸钠的质量比为5~15:1.5~4.5,优选为5~10:1.5~3,更优选为10:1.5。
具体地,在组分B中,所述的光引发剂溶液,溶质为光引发剂,溶剂为磷酸缓冲盐溶液(PBS),磷酸缓冲盐溶液的pH=7.2~7.4;所述的光引发剂为三联吡啶氯化钌六水合物和过硫酸钠,三联吡啶氯化钌六水合物与过硫酸钠的摩尔比为1:18~25,优选为1:20,三联吡啶氯化钌六水合物在光引发剂溶液中的浓度为0.4~0.7mmol/L,优选为0.5mmol/L。
其中,所述的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中钠离子的浓度为3.61g/L,钾离子的浓度为0.17g/L,氯离子的浓度为4.95g/L,磷酸氢根的浓度是0.98g/L,磷酸二氢根的浓度是0.17g/L。
具体地,在组分C中,所述的人脐带间充质干细胞,用完全培养基进行培养,随后放在37℃、1.013*105Pa、体积分数为5%CO2的培养箱中孵育,最后将孵育后的人脐带间充质干细胞进行消化、离心。
上述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水也在本发明的保护范围之内。
为了解决上述第二个技术问题,本发明公开了上述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水在制备促进皮肤创伤修复的生物3D打印支架中的应用。
具体地,当明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水中包含组分A和组分B时,具体的应用方法为:将组分A和组分B混合后进行物理交联,然后进行挤出式3D打印;打印结束后,利用可见光诱导进行光交联,并通过钙离子液浸泡进行离子交联,制得3D打印支架。
具体地,当明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水中包含组分A、组分B和组分C时,具体的应用方法为:将组分A、组分B和组分C混合后进行物理交联,然后进行挤出式3D打印;打印结束后,利用可见光诱导进行光交联,并通过钙离子液浸泡进行离子交联,制得3D打印支架。
优选地,上述的挤出式3D打印在灭菌条件下进行。
具体地,当明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水中包含组分A和组分B时,组分A中对羟基苯丙酸功能化的明胶与组分B的质量体积比为5%~15%g:1mL,优选为10%g:1mL;组分A中酪胺修饰的海藻酸钠与组分B的质量体积比为1.5%~4.5%g:1mL,优选为1.5%g:1mL。
具体地,当明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水中包含组分A、组分B和组分C时,组分A中对羟基苯丙酸功能化的明胶与组分B的质量体积比为5%~15%g:1mL,优选为10%g:1mL;组分A中酪胺修饰的海藻酸钠与组分B的质量体积比为1.5%~4.5%g:1mL,优选为1.5%g:1mL;组分C人脐带间充质干细胞在体系中的细胞密度为2.5×106~3.5×106cells/mL,优选为3×106cells/mL。
其中,所述的体系为组分A、组分B和组分C混合后得到的产物。
具体地,所述的物理交联,交联温度为23~26℃,优选为25℃,交联时间为25~35min,优选为30min;所述的挤出式3D打印,工艺参数为:打印温度为25℃,打印压力为0.8bar,打印速度为8mm/s;在光交联中,可见光的波长为450nm,可见光的功率为20~40mW/cm2,优选为30mW/cm2,交联温度为4~6℃,优选为4℃,交联时间为1~3min,优选为1min;在离子交联中,钙离子液为2%g/mL CaCl2水溶液,交联温度为23~26℃,优选为25℃,交联时间为5~15min,优选为10min。
上述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水在制备促进皮肤创伤修复的生物3D打印支架中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果:
与现有技术相比,本发明具有如下优势:
(1)本发明的明胶/海藻酸钠水凝胶基生物3D打印支架,机械性能和细胞相容性良好,且有利于皮肤伤口愈合。
(2)本发明采用具有温敏性的生物墨水,利用其温敏成胶特性,通过控制打印温度使其预交联,能够从针头顺利挤出细丝,并且在低温环境中快速成型,保持形状,具有优异的形状保真度。
(3)光交联中常用的光引发剂多为紫外线波段引发剂,但紫外线的穿透性具有局限性,并且对于细胞和组织具有一定的损害。本发明所采用可见光范围内吸收的光引发剂,其具有增强的生物相容性和穿透性,有利于构建大型组织工程替代物。
(4)本发明选用明胶和海藻酸钠为生物墨水原料,两种原料改性方法简便,并且原料已经实现商业化。因此,选用其作为原料并建立此类凝胶方法对于推动其在组织工程和再生医学中的应用具有重要价值。
(5)人脐带间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多向分化的潜力,其旁分泌功能可产生各种因子(如生长因子、细胞因子、外泌体)。本发明通过将人脐带间充质干细胞与对羟基苯丙酸功能化的明胶和酪胺修饰的海藻酸钠混合制备得到生物墨水,利用生物3D打印技术将其打印成伤口缺损部位的形状用于皮肤创伤修复。在打印过程中设计合适的孔洞结构,以提高透气性,便于氧气和营养的传输,有益于皮肤创伤修复。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为改性明胶和改性海藻酸钠的1H核磁共振氢谱。
图2为单交联3D打印支架和双交联3D打印支架的压缩应力-应变曲线以及压缩模量分析。
图3为单交联3D打印支架和双交联3D打印支架的稳定性分析;其中,图3(A)为单交联3D打印支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-P图,图3(B)为双交联3D打印支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D图。
图4为载干细胞生物3D打印支架中干细胞的细胞活力分析。
图5为3D打印支架处理后的小鼠伤口图片和定量分析。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本发明实施例中所用的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中钠离子的浓度为3.61g/L,钾离子的浓度为0.17g/L,氯离子的浓度为4.95g/L,磷酸氢根的浓度是0.98g/L,磷酸二氢根的浓度是0.17g/L,pH=7.2~7.4。
实施例1
(1)分别将对羟基苯丙酸(1.70g)溶于25mL N,N-二甲基甲酰胺,得到第一混合液;将NHS(1.75g)和EDC(1.95g)溶于在50mL去离子水中,得到第二混合液;将明胶(Gel,5.00g)通过40℃加热溶解于250mL蒸馏水中,得到第三混合液。将第一混合液和第二混合液进行混合,在室温搅拌5h,随后向体系中加入第三混合液,混合,在40℃下搅拌反应24h。反应结束后,将体系中所得反应产物倒入透析袋中(MW~3500Da),用蒸馏水透析三天,并通过冷冻干燥分离,得到对羟基苯丙酸功能化的明胶(Gel-HPA)。
(2)将1.00g海藻酸钠(Alg)溶解在100mL蒸馏水中,然后将EDC(0.96g)和NHS(0.58g)加入冰浴的上述溶液中反应15min;随后向体系中加入酪胺盐酸盐(0.69g)在冰浴中反应1h,再将体反应系转移至室温下反应24h。反应结束后,将体系中所得反应产物在蒸馏水中透析3天(MW~8000-12000Da),然后冻干,得到酪胺修饰的海藻酸钠(Alg-Tyr)。
(3)分别称取15.00mg的Gel、Gel-HPA、Alg和Alg-Tyr,并分别溶解在550μL的重水中,用核磁共振波谱仪测试,相关的1H NMR谱图见图1。
图1(A)显示了Gel和Gel-HPA的核磁共振氢谱,两者均在7.3ppm处有一特征峰,其对应苯丙氨酸和酪氨酸残基的芳香质子。此外,Gel-HPA在化学位移为6.8ppm和7.1ppm处出现了新的质子峰,其归属为对羟基苯丙酸的芳香质子,表明Gel-HPA的成功制备。
图1(B)所示为Alg和Alg-Tyr的核磁共振氢谱图,与Alg的核磁图相比,在Alg-Tyr中发现一些新峰,新特征峰在6.5ppm和7.5ppm之间,是酪胺根上的4个质子产生的,证明了Alg-Tyr的成功制备。
实施例2
(1)将经紫外杀菌的三联吡啶氯化钌六水合物/过硫酸钠(Ru/SPS)光引发剂溶于灭菌的PBS中,配制得到浓度为0.5/10mmol/L的光引发剂溶液;其中,PBS溶液的pH=7.2~7.4。
(2)将实施例1中制备的Gel-HPA、实施例1中制备的Alg-Tyr溶于Ru/SPS光引发剂溶液中;其中,Gel-HPA与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为10%g:1mL,Alg-Tyr与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为1.5%g:1mL,得到用于3D打印的生物墨水。
将生物墨水放置在25℃打印料筒中保持30min以诱导物理交联,然后在25℃、灭菌条件下使用25G的一次性打印针头以8mm/s的速度和0.8bar的压力进行挤出式3D打印,打印结束后立即使用波长450nm,功率30mW/cm2的可见光照射进行光交联,交联温度为4℃,交联时间为1min,得到单交联3D打印水凝胶支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-P。
(3)将实施例1中制备的Gel-HPA、实施例1中制备的Alg-Tyr溶于Ru/SPS光引发剂溶液中;其中,Gel-HPA与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为10%g:1mL,Alg-Tyr与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为1.5%g:1mL,得到用于3D打印的生物墨水。
将生物墨水放置在25℃打印料筒中保持30min以诱导物理交联,然后在25℃、灭菌条件下使用25G的一次性打印针头以8mm/s的速度和0.8bar的压力进行挤出式3D打印,打印结束后立即使用波长450nm,功率30mW/cm2的可见光照射进行光交联,交联温度为4℃,交联时间为1min;随后用2%g/mL CaCl2水溶液浸泡诱导进一步的离子交联,交联温度为25℃,交联时间为10min,得到双交联3D打印水凝胶支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D。
(4)将实施例1中制备的Gel-HPA和实施例1中制备的Alg-Tyr进行混合,Gel-HPA与Alg-Tyr的质量比为10:1.5,得到Gel-HPA/Alg-Tyr水凝胶。
打印前首先测试并记录了生物墨水的黏度随温度的变化规律,如图2(A)所示,在30℃之前,Gel-HPA/Alg-Tyr水凝胶随着温度的上升生物墨水的粘度缓慢下降,30℃~35℃的温度变化区间内溶液的粘度急剧下降,35℃后下降速度再次变缓。这是因为在温度上升的过程中明胶分子链间的物理键被破坏从而使得体系的粘度下降,该结果表明明胶/海藻酸钠基生物墨水具有温度响应性,即温敏性。
此外,打印后分别记录单/双交联3D打印支架的厚度,并使用万能力学试验机以3mm/min的应变速率压缩,分析得到应力-应变曲线。图2(B)为单/双交联3D打印水凝胶支架的压缩应力-应变曲线,通过分析得到如图2(C)所示的压缩模量,以反应支架的机械性能;其中,双交联3D打印支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D相较于单交联3D打印支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-P具有更高的压缩模量,这可能是因为双交联体系的引入使3D打印支架内部网络结构更加紧密,从而提高了3D打印支架的机械性能。
(5)为了探究3D打印支架的稳定性,将打印后的支架放入37℃的DMEM培养基中孵育一周。如图3(A)所示:单交联3D打印支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-P由于结构不稳定,在培养第2天就出现结构坍塌。如图3(B)所示:双交联3D打印支架3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D的结构完整性保持良好,一周内未出现坍塌的现象,并且网格结构明显,说明双交联3D打印支架在培养过程中具有更优异的稳定性。
实施例3
(1)将实施例1中制备的Gel-HPA和Alg-Tyr打印材料应用于本实施例。将经紫外杀菌的三联吡啶氯化钌六水合物/过硫酸钠(Ru/SPS)光引发剂溶于灭菌的PBS中,配制得到浓度为0.5/10mmol/L的光引发剂溶液;其中,PBS溶液的pH=7.2~7.4。
(2)将实施例1中制备的Gel-HPA、实施例1中制备的Alg-Tyr溶于Ru/SPS光引发剂溶液中,其中,Gel-HPA与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为10%g:1mL,Alg-Tyr与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为1.5%g:1mL,得到3D打印生物墨水。
用完全培养基培养人脐带间充质干细胞,并放在37℃、1.013*105Pa、体积分数为5%CO2的培养箱中孵育。培养后的干细胞经消化离心后与本实施例制备得到的3D打印生物墨水混合均匀,得到负载干细胞的生物墨水;其中,人脐带间充质干细胞在负载干细胞的生物墨水中的细胞密度为3×106cells/mL。
将负载干细胞的生物墨水放置在25℃打印料筒中保持30min以诱导物理交联,然后在25℃、灭菌条件下使用25G的一次性打印针头以8mm/s的速度和0.8bar的压力进行挤出式生物3D打印,打印结束后立即使用波长450nm,功率30mW/cm2的可见光照射进行光交联,交联温度为4℃,交联时间为1min;随后2%g/mL CaCl2水溶液浸泡诱导进一步的离子交联,交联温度为25℃,交联时间为10min,得到包裹干细胞的3D打印结构(3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D)。将包裹干细胞的3D打印结构(3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D)置于含有完全培养基的12孔板中,并在37℃下培养,定期更换培养基。
(3)生物3D打印封装的人脐带间充质干细胞的细胞活力通过活/死染色评估。在设定的时间点(1、3和5天)去除原培养基,加入细胞活/死染色溶液进行孵育,随后用PBS进行洗涤。用倒置荧光显微镜进行观察,获得3D打印结构中活细胞和死细胞的图像。为了确定设定时间内三维培养和3D打印结构内细胞的增殖情况,使用CCK-8试剂孵育3h后,并用酶标仪测定吸光度。细胞增殖情况通过下式计算,计算方法为:相对细胞活力(%)=(样品组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100。
(4)用完全培养基培养人脐带间充质干细胞,并放在37℃、1.013*105Pa、体积分数为5% CO2的培养箱中孵育。培养后的干细胞经消化离心后与本实施例的3D打印生物墨水(步骤(2)中制备得到)混合均匀,得到负载干细胞的生物墨水;其中,人脐带间充质干细胞在负载干细胞的生物墨水中的细胞密度为3×106cells/mL。
取负载干细胞的生物墨水于12孔板中并立即使用波长450nm,功率30mW/cm2的可见光照射进行光交联,交联温度为4℃,交联时间为1min;随后2%g/mL CaCl2水溶液浸泡诱导进一步的离子交联,交联温度为25℃,交联时间为10min,得到包裹干细胞的块状结构(对照组)。
(5)图4(A)为负载干细胞的3D打印结构(3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D)培养1、3和5天后的荧光图像。干细胞在支架中均匀分布,说明在打印过程中,明胶的物理交联导致生物墨水的粘度增加,因此细胞沉积较少,干细胞与生物墨水能够均匀混合。第3天时,支架中部分干细胞呈现纺锤形,在支架中铺展良好,并且大多数细胞为绿色,细胞状态良好。在5天的培养过程中,支架仍能保持良好的网格结构,并且支持内部细胞的生长。细胞增殖实验同样证明了这一点,如图4(B)所示,第1天时,由于打印产生的剪切力导致少量细胞死亡,3D打印结构中的细胞活力略低于包裹干细胞的块状结构(对照组)三维培养中的细胞。随着时间增加,干细胞呈现增殖现象。第3天,3D打印结构中的细胞活力大于对照组三维培养中的细胞活力,增殖更快。第5天,对照组三维培养和3D打印结构中细胞分别增殖到约1.6倍和1.9倍。
实施例4
(1)将实施例2中制备的3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D双交联3D打印支架和实施例3中的3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D载干细胞双交联3D打印支架应用于本实施例。
(2)将经紫外杀菌的三联吡啶氯化钌六水合物/过硫酸钠(Ru/SPS)光引发剂溶于灭菌的PBS中,配制得到浓度为0.5/10mmol/L的光引发剂溶液;其中,PBS溶液的pH=7.2~7.4。
将实施例1中制备的Gel-HPA、实施例1中制备的Alg-Tyr溶于Ru/SPS光引发剂溶液中;其中,Gel-HPA与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为10%g:1mL,Alg-Tyr与Ru/SPS光引发剂溶液的质量体积比为1.5%g:1mL,得到用于3D打印的生物墨水。
将生物墨水使用波长450nm,功率30mW/cm2的可见光照射进行光交联,交联温度为4℃,交联时间为1min,随后2%g/mL CaCl2水溶液浸泡诱导进一步的离子交联,交联温度为25℃,交联时间为10min,得到Gel-HPA/Alg-Tyr-D水凝胶。
(3)将40只ICR雄性小鼠(20g)进行麻醉,剔除背部毛发,随机分为5组:生理盐水组(阴性对照,NS)、3M Tegaderm敷料组(阳性对照)、Gel-HPA/Alg-Tyr-D水凝胶组、双交联3D打印支架组(3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D)和载干细胞3D打印支架组(3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D)。将小鼠背部消毒后使用圆形刀片对全层皮肤进行切除。按照分组对伤口进行处理后,使用无菌纱布将实验组进行固定。在设定的时间(第0、3、7、14天)对伤口进行拍摄并使用Image J软件测量伤口的大小。通过公式计算伤口闭合率,伤口闭合率(%)=[面积(0天)-面积(n天)]/面积(0天)×100。其中n代表第几天,如0、3、7、14天。
从图5(A)和图5(B)所示,治疗后所有组的伤口区域逐渐变小。处理3天后,3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D和3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D处理后的伤口闭合率分别为39.9%和52.3%,均大于生理盐水组、3M Tegaderm敷料组和Gel-HPA/Alg-Tyr-D水凝胶组。7天后,伤口区域面积进一步减小,3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D和3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D组处理后的伤口闭合率分别为85.9%和90.4%。第14天,生理盐水和3M Tegaderm敷料处理后的伤口还未完全闭合(生理盐水组和3M Tegaderm敷料组伤口愈合率分别为85.9%和91.6%),而3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D组和3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D组伤口基本已完全闭合(伤口区域面积小于3%)。并且与3D-Gel-HPA/Alg-Tyr-D组相比,3DC-Gel-HPA/Alg-Tyr-D组伤口愈合效果更好,小鼠的新生皮肤与周围正常皮肤相似,部分小鼠伤口处已经覆盖有毛发。
本发明提供了一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水及其应用的思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (11)
1.一种明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水,其特征在于,它包括如下组分:
组分A:对羟基苯丙酸功能化的明胶和酪胺修饰的海藻酸钠的混合物;
组分B:光引发剂溶液。
2.根据权利要求1所述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水,其特征在于,它包括组分C:人脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水,其特征在于,在组分A中,所述的对羟基苯丙酸功能化的明胶与酪胺修饰的海藻酸钠的质量比为5~15:1.5~4.5。
4.根据权利要求1所述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水,其特征在于,在组分B中,所述的光引发剂溶液,溶质为光引发剂,溶剂为磷酸缓冲盐溶液,磷酸缓冲盐溶液的pH=7.2~7.4;所述的光引发剂为三联吡啶氯化钌六水合物和过硫酸钠,三联吡啶氯化钌六水合物与过硫酸钠的摩尔比为1:18~25,三联吡啶氯化钌六水合物在光引发剂溶液中的浓度为0.4~0.7mmol/L。
5.根据权利要求2所述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水,其特征在于,在组分C中,所述的人脐带间充质干细胞,用完全培养基进行培养,随后放在37℃、1.013*105Pa、体积分数为5%CO2的培养箱中孵育,最后将孵育后的人脐带间充质干细胞进行消化、离心。
6.权利要求1或2所述的明胶/海藻酸钠水凝胶基3D打印生物墨水在制备促进皮肤创伤修复的生物3D打印支架中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,将组分A和组分B混合后进行物理交联,然后进行挤出式3D打印;打印结束后,利用可见光诱导进行光交联,并通过钙离子液浸泡进行离子交联,制得3D打印支架。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,将组分A、组分B和组分C混合后进行物理交联,然后进行挤出式3D打印;打印结束后,利用可见光诱导进行光交联,并通过钙离子液浸泡进行离子交联,制得3D打印支架。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,组分A中对羟基苯丙酸功能化的明胶与组分B的质量体积比为5%~15%g:1mL;组分A中酪胺修饰的海藻酸钠与组分B的质量体积比为1.5%~4.5%g:1mL。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,组分A中对羟基苯丙酸功能化的明胶与组分B的质量体积比为5%~15%g:1mL;组分A中酪胺修饰的海藻酸钠与组分B的质量体积比为1.5%~4.5%g:1mL;组分C人脐带间充质干细胞在体系中的细胞密度为2.5×106~3.5×106cells/mL。
11.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于,所述的物理交联,交联温度为23~26℃,交联时间为25~35min;所述的挤出式3D打印,工艺参数为:打印温度为25℃,打印压力为0.8bar,打印速度为8mm/s;在光交联中,可见光的波长为450nm,可见光的功率为20~40mW/cm2,交联温度为4~6℃,交联时间为1~3min;在离子交联中,钙离子液为2%g/mLCaCl2水溶液,交联温度为23~26℃,交联时间为5~15min。
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