CN105343934A - 一种人工角膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工角膜，将动物脱细胞角膜基质先浸泡于光敏剂中，然后在紫外光照射下交联均匀。一种光氧化胶原交联的方法的步骤如下：(1)将动物脱细胞角膜基质在0.01-5mg/ml光敏剂溶液中浸泡1-60min；(2)将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用100-400nm波长紫外光照射1-60min；(3)用PBS溶液浸泡0.5-4h，然后振荡0.5-2h。本发明的有益效果是：可以有效的改善脱动物脱细胞角膜基质的机械强度等生物力学特性；因为生物力学特性主要取决于胶原纤维、胶原纤维束以及它们空间结构的组成，因此，通过光辐照/光敏剂交联术可以改善动物脱细胞角膜基质的生物机械性能及其稳定性。

Description

一种人工角膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料领域，具体为一种人工角膜及其制备方法。

背景技术

光化学胶原交联的基本原理即光氧化反应。根据光敏剂所特有的吸收光谱，在其最大吸收波长范围内，经一定波长辐照后，光敏剂吸收光子能量，激发形成三线态，具备极强的氧化能力，产生超氧自由基或单态氧，氧自由基具备直接修饰胶原蛋白分子的活性，引起胶原中氨基酸残基分子内或之间形成共价键，增加胶原纤维间共价键的密度，从而提高胶原生物力学特性(Ⅱ型光化学反应)。随着近年来对光氧化反应的不断研究，使其作为一种处理生物材料的全新方法用于临床成为可能。而采用该方法处理后的生物材料，具备组织的活性、完整性以及低抗原性，已成功实践于临床中，如采用0.1％的亚甲基蓝作为光敏剂，在白炽灯照射下发生的光敏反应来处理的替代材料：猪主动脉瓣作为主动脉瓣膜的替代材料，牛心包作为组织补片的替代材料和牛颈静脉作为血管的替代材料。

应用此方法较多的是应用于临床疾病的治疗，如紫外光/核黄素角膜交联术，其最早是由德国德累斯顿大学研究小组提出的疗法，用来阻止圆锥角膜的发展，解决临床上角膜材料供源紧张的问题，从21世纪初期应用以来，取得了比较理想的疗效，已被推广到角膜溃疡、角膜炎等多种角膜疾病治疗中。白琼珍等应用紫外线/核黄素角膜交联术治疗真菌性角膜溃疡，相比于传统的治疗，该疗法显著提高了其疗效，避免了传统治疗术后(如结膜瓣遮盖、急性期角膜移植等)的并发症。闵捷等采用紫外光核黄素胶原交联探讨了对兔角膜碱烧伤的治疗作用，结果显示该疗法可以减轻兔角膜碱烧伤后的基质损伤及炎性细胞的浸润，缩短愈合时间。吕雅平等探索了紫外光/核黄素交联法对豚鼠巩膜组织张力和强度的影响，发现该交联法可以有效提高巩膜的生物力学特性，增强组织张力、强度，为临床上治疗高度病理性近视提供新的方法。国内专利中，北京亿仁赛博医疗科技研发中心有限公司应用光敏剂治疗灭活血管斑块、白血病、艾滋病和肝炎等病毒。刘天军等公开了一种含血卟啉或血卟啉铁的口服光敏药物制剂及其在治疗恶性肿瘤中的应用。北京普惠生物医学工程公司采用光氧化剂浓度为0.01-0.1wt％的光氧化法处理异种心脏植入物胶原组织。

自20世纪90年代开始，研究人员就试图采用紫外线处理角膜，通过以氧自由基介导的氧化反应来增加胶原纤维的强度。Wollensak等第一个证明了角膜交联术疗法对于进展行圆锥角膜有疗效，他们采用紫外线/核黄素角膜交联术对22例(23只眼)进展行圆锥角膜患者进行治疗，临床跟踪结果显示，所有患者的圆锥角膜进展都被阻止或延缓。2008年Witting-Silvad等发表了前瞻性研究的早期结果，将接受了角膜胶原交联术的实验组(9只眼)及未接受治疗的对照组(11只眼)比较，发现实验组的视力、扩张强度都有所改善，而对照组继续恶化。Janko等对20例进展行圆锥形角膜患者(25只眼)进行紫外线/核黄素角膜交联术后，所有患者在术后1个月时圆锥角膜都停止了发展，视力也有所提高。随着该技术的兴起，更多临床研究报道了紫外线/核黄素角膜交联术的临床效果。Iseli等对常规抗生素治疗无效的角膜炎患者采用角膜交联术治疗，结果发现所有患者的病变均无发展，验证了角膜交联术对于治疗角膜炎的疗效。Spoerl等将紫外线/核黄素角膜交联术用于猪眼，发现猪角膜对于胶原酶等的耐受性显著增强，降解时间明显延长。对于胶原酶降解，交联后的角膜的抵抗能力明显提高。除此以外，国外也有学者将角膜交联术用于准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)术后引发的角膜扩张。例如Hafezi等治疗了10例LASIK术后引发的角膜扩张患者，随访25个月后发现，全部患者角膜扩张进展均得到了控制，且视力均有提高，角膜交联术对于这类术后引起的角膜扩张亦有一定的疗效。国外欧几里得系统公司在其专利中也阐述了紫外照射用于治疗进展行圆锥角膜、外科手术后的膨隆以及外科手术前强化角膜。

综合以上，光氧化胶原交联法主要是作为治疗疾病的疗法用于临床，作为疗法是相对安全，但由于有部分患者病情进展至晚期或术后并发症的影响，病情并未得到阻止，或者由于治疗深度的限制存在一定的缺陷。例如，Pollhammer和Cursiefen报告了1例患者经紫外光/核黄素角膜交联术治疗后引发了细菌性角膜炎。另外Kymionisd等也报告了紫外线A/核黄素交联后引起的疱疹性虹膜炎、角膜炎的一例患者。据统计，最终需进行角膜移植手术的患者仍占很大比例，约占所有角膜移植患者的16％。在亚洲一些国家，因宗教信仰、社会文化等因素，角膜供源相对短缺，很多患者因此致盲。

所以，寻找制备出具备优良性能且能应用于临床的医用替代材料是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的第一目的针对上述现有技术存在的，提供一种人工角膜。

本发明的另一目的是提供一种人工角膜的制备方法。

为了达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：一种人工角膜，以动物脱细胞角膜基质先浸泡于光敏剂中，然后在紫外光照射下交联均匀，其厚度为50-1000μm。

优选的，所述人工角膜厚度为300-600μm。

一种光氧化胶原交联的方法，其包括的步骤如下：

(1)将动物脱细胞角膜基质在0.01-5mg/ml光敏剂溶液中浸泡1-60min；

(2)将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用100-400nm波长紫外光照射1-60min；

(3)用磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)浸泡0.5-4h，然后振荡0.5-2h；

(4)更换磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)，浸泡0.5-4h，然后振荡0.5-2h。

所述(2)步骤中，在紫外光照射1-30min时换面，然后继续进行照射。

所述(2)步骤中，紫外光照射的功率密度在1mw/cm²-6000mw/cm²。

优选的，所述(2)步骤中，紫外光照射的功率密度在800mw/cm²-3500mw/cm²。

最优选的，所述(2)步骤中，紫外光照射的功率密度在1200mw/cm²-2800mw/cm²。

所述动物脱细胞角膜基质可以是猪、牛、羊、马、兔、猴等动物角膜基质脱细胞后的产品。

所述光敏剂可以是N一甲酰犬脲酸(NFK)，3-经基犬尿酸(3-OH-FK)，君咔琳，核黄素，FMN，FAD，视黄醛等色素光敏剂。

所述光敏剂可以是稠环醌类等天然光敏剂、卟啉类及其衍生物等光敏剂。

动物脱细胞角膜基质低免疫原性，保留替代物本身的形状，且良好的生物相容性使其与宿主周围组织能融合成长为正常组织的部分，利于宿主机体重塑。本发明将脱细胞后的动物角膜基质通过光氧化交联后可以有效提高该动物角膜基质的生物机械强度及稳定性，以便于以后用于临床。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：可以有效的改善脱动物脱细胞角膜基质的机械强度等生物力学特性；因为生物力学特性主要取决于胶原纤维、胶原纤维束以及它们空间结构的组成，因此，通过光辐照/光敏剂交联术可以改善动物脱细胞角膜基质的生物机械性能及其稳定性。

附图说明

图1为透过率曲线图；

图2为缝合力曲线图；

图3为扫描电镜图；

图4为H&E染色图；

图5为人角膜上皮细胞孵育48小时的扫描电镜图；

图6为人角膜上皮细胞孵育72小时的扫描电镜图；

图7为显微镜下观察6h、8h细胞贴附情况图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来对发明作进一步的说明，结合防腐挑战试验和皮肤刺激试验进一步说明本发明的有益效果。但这些实施例只是为了说明，不是对本发明的限制。

原理说明

本发明一种人工角膜的制备方法主要是以动物脱细胞角膜基质为脱细胞支架，其中利用能吸收光线并能把吸收的光能传递给反应物且对人体或动物无毒性或毒性低的光敏剂进行光氧化交联。光敏剂在光辐照(可见光或紫外光辐照)的条件下，被激发到三线态，释放以单线态氧为主的活性氧族，而活性氧化学性质活泼，极不稳定，可以与各种分子反应，诱导胶原纤维分子基团(如氨基)之间发生化学交联反应(Ⅱ型光化学反应)，在胶原纤维内部或之间形成了新的分子链，改善了胶原纤维的机械强度。光敏剂选用NFK、3-经基犬尿酸(3-OH-FK)、君咔琳、核黄素、FMN、FAD、或者视黄醛等这些色素光敏剂；稠环醌类等天然光敏剂、卟啉类及其衍生物等光敏剂。该类光敏剂在其中起到双重作用：一是能够吸收光能并抽取电子；二是可以吸收辐照，阻止对组织深层的影响。对于大部分脱细胞产品的生物力学特性主要取决于胶原纤维、胶原纤维束以及它们空间结构的组成。因此，通过光辐照/光敏剂交联术可以改善人工角膜的生物机械性能及其稳定性。本发明光氧化胶原交联原理如下所示：

胶原肽链间存在离子键、氢键、范德华力及非极性基团产生的疏水剑等作用力。同时，胶原分子内和分子间还存在醇醛缩合交联、醛氨缩合交联和醛醇组氨酸种交联，使胶原肽链牢固连接起来，具备很高的抗张强度。

实施例1

一种人工角膜的制备方法，其包括的步骤如下：

(1)将动物脱细胞角膜基质在浓度为0.05mg/ml光敏剂溶液中浸泡30min；

(2)将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用110nm波长紫外光照射40min；在紫外光照射20min时换面，然后继续进行照射，照射的紫外光的功率密度在3mw/cm²；

(3)用PBS溶液浸泡0.6h，然后振荡0.6h；

(4)换PBS溶液再浸泡0.6h，然后振荡0.6h。

实施例2

一种人工角膜的制备方法，其包括的步骤如下：

(1)将动物脱细胞角膜基质在浓度为4.5mg/ml光敏剂溶液中浸泡55min；

(2)将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用380nm波长紫外光照射56min；在照射28min时换面，然后继续进行照射；所述(2)步骤中，照射的功率密度在5800mw/cm²；

(3)用PBS溶液浸泡4h，然后振荡2h；

(4)更换PBS溶液，再浸泡4h，然后振荡2h。

实施例3

一种人工角膜的制备方法，其包括的步骤如下：

(1)将动物脱细胞角膜基质在0.2mg/ml光敏剂溶液中浸泡50min；

(2)将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用365nm波长紫外光照射30min；照射的功率密度3000mw/cm²；在第15分钟时换面，尽量保证正反两面交联均匀。

(3)用PBS溶液浸泡3h，然后振荡1h；

(4)更换PBS溶液再浸泡3h，然后振荡1h。

上述实施例中，所述脱细胞支架可以是猪、牛、羊、马、兔、猴等动物组织脱细胞后产品。所述光敏剂可以是NFK，3-经基犬尿酸(3-OH-FK)，君咔琳，核黄素，FMN，FAD，视黄醛等色素光敏剂。所述光敏剂可以是稠环醌类等天然光敏剂、卟啉类及其衍生物等光敏剂。优选的，所述光敏剂为0.1mg/ml核黄素磷酸钠溶液。紫外光照射可以用紫外固化机的紫外光照射。最优选的，所述光敏剂为0.1mg/ml核黄素磷酸钠溶液与0.1mg/ml视黄醛溶液的混合溶液，光氧化胶原交联效果最好。在震荡时，可以施加超声波处理，其中超声功率为400-600W，优选的为500W，通过超声波空化作用，可以有效的提高脱细胞处理效果，且可以保证透过率，去除浑浊杂质。

其中，所述动物脱细胞角膜基质是使用脱细胞方法，去除异种角膜中的免疫原性，制备的一种天然角膜支架材料。可以利用脱氧胆酸钠脱细胞方法制作脱细胞猪角膜基质，最大程度的去除异种抗原成分，同时最大限度的保留角膜基质中的天然成分，保持正常的精密超微结构。

所述去细胞人工角膜基质的制备方法如下：

1)利用眼球取材钻等工具将新鲜猪眼球取下后，使用眼科弯剪等工具沿角膜缘外2mm处取下包含部分巩膜环的整个猪角膜片，去除角膜片周围虹膜和结膜组织，得到的正常猪角膜；

2)将猪角膜放入PBS缓冲液中震荡洗去角膜上的血液，然后至纯水中浸泡12h；

3)将角膜浸入质量百分比浓度为6％的脱氧胆酸钠脱细胞溶液中37℃水浴震荡处理12h，其中可以施加超声波处理，其中超声功率为900W，通过超声波空化作用，可以有效的提高脱细胞处理效果，且可以保证透过率，去除浑浊杂质；

4)水浴震荡条件下，PBS缓冲液中清洗；

5)将制备的去细胞人工角膜基质密封于无菌塑料袋中，行钴⁶⁰(25kGey)照射灭菌后，4℃下保存备用。

实施例4

一种人工角膜的制备方法，其包括的步骤如下：将去细胞人工角膜基质在0.1mg/ml核黄素磷酸钠溶液中浸泡30min后，取出放于培养皿中，用紫外固化机在365nm波长下照射30min，照射的功率密度不低于1000mw/cm²。在照射后的第15分钟时换面照射，尽量保证正反两面能够交联均匀。交联结束后，用PBS溶液浸泡3h，再振荡1h，换PBS溶液浸泡3h，再振荡1h。优选的，照射的功率密度为5000mw/cm2，这样光氧化交联效果最好。在震荡时，可以施加超声波处理，其中超声功率为600W，通过超声波空化作用，可以有效的提高脱细胞处理效果，且可以保证透过率，去除浑浊杂质。

检测试验

一、人工角膜的透过率检测

透过率是角膜组织工程支架的一个重要指标，真正角膜的透过率也是随着波长的增加而增大，在波长400nm时，透过率可达80％，500nm以上的波长可以100％通过

1材料和方法:

1.1主要试剂和仪器

生理盐水、玻璃烧杯、组织镊、紫外可见分光光度计、比色皿，擦镜纸。

1.2实验方法

将去细胞人工角膜固定于紫外可见分光光度计的样品仓中，样本表面滴加1滴人工泪液(减少样本表面的光线折射)后，立即在380～800nm波长范围内，每隔10nm波长取一个检测点，连续检测样本的透过率。

2结果

如图1所示，三种型号的去细胞人工角膜在380-800nm波长范围内，透过率均大于72.0％，且在400nm时，各个型号的去细胞人工角膜透过率都达到了80.0％，而在500nm及以上波长处，透过率接近90.0％。可见研发的去细胞人工角膜与真实角膜接近，能用于角膜组织工程。

二、缝合力检测

角膜缝合是角膜移植成功的关键。角膜移植手术中，医生使用圆弧针在角膜植片周围进行缝合操作，除了要求医生能够准确控制圆弧针的运动，使其精确地从植片上的刺入点刺入，穿过角膜移植手术中的植片组织和植床组织，然后从植床上的刺出点刺出外，去细胞人角膜植片也应具备足够承受10-0尼龙缝线缝合时的切割力能力以及承受正常眼内压。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

5-0缝合线、力学试验机、组织镊、玻璃烧杯、生理盐水。

1.2实验方法

用两根5-0的缝线分别扎入去细胞人工角膜两端边缘处，将两根缝线分别固定在力学试验机两端夹具上，用50mm/min的速度向两端拉伸，至缝线撕裂去细胞人工角膜，记下缝线撕裂去细胞人工角膜的最大拉力，即为缝合力。

2结果

如图2所示，随着位移不断增大，去细胞人工角膜拉力呈现上升趋势，达到最大载荷后，慢慢下降。三种不同型号的去细胞人工角膜的最大载荷均大于1.00N，可见去细胞人工角膜具备良好的生物力学性能，能够承受缝合线缝合的切割力。

三、DNA残留检测

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

试剂：蛋白酶K消化用试剂：蛋白酶K，蛋白酶K缓冲液

DNA纯化用试剂：裂解液，磁珠，DNA结合液，漂洗液，溶出液

荧光染色法检测试剂：PicoGreen染料

仪器：磁力架，96孔板(黑色)，荧光酶标仪，DNase-free无菌离心管、吸头，离心机，涡混悬器，高精度天平(0.0001)，恒温水浴锅，超净工作台，加样枪。

1.2实验方法

1.2.1蛋白酶K消化

取待测去细胞人工角膜(201411003)12片，无菌条件下将上述样品水分吸干，超净工作台吹干2小时。精确称重约20mg一个用于消化抽提检测，三个平行样。

将样品加入540μlTLbuffer，60μlProteinK，56℃水浴孵育12h以上。

先用TLBuffer配制一系列浓度标准DNA(0、375ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml、6000ng/ml),并取上标准品DNA按下表加样消化，56℃水浴孵育12h以上。

1.2.2DNA纯化

样品消化完毕后，离心，取上清液150μl每孔，人工抽提，最后用100μlElution溶解回收。(Omega磁珠组织DNA抽提试剂盒)

1.2.3DNA含量测定

(1)样品稀释

稀释液的配制：由20×TEBuffer以DEPC水稀释20倍配制而成。

样品由稀释液稀释，回收率实验DNA纯化样品和待检品DNA纯化样品稀释倍数均稀释20倍，测定荧光强度值。

(2)DNA标准曲线组样品

由10μg/ml的DNA标准品配制1μg/ml的DNA，再由配制的1μg/ml的DNA经TE稀释液配成0ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml的标准品溶液。将稀释好的DNA标准品100μl加入96孔黑色酶标板内，每份样品2个复孔。

取回收率实验DNA纯化样品和待检品DNA纯化样品各100μl，加入到96孔黑色酶标板内。

将10mlTE稀释液加入50μl荧光染料，混匀。每孔100μl加入酶标板中，震荡混匀后室温避光反应5min，用荧光酶标仪测定。测定条件：以485nm为激发光波长，以535nm为发射荧光检测波长进行测定，所得数据作图分析并求得回归方程。以1×TE缓冲液测得的荧光强度为本底，测定和记录各测定孔的荧光值。

2结果

2.1计算

(1)先求标准品OD平均值，并减去标准曲线空白平均值(只有TE，无DNA)；再求出回收率样品以及待测样品的OD平均值，并减去回收率曲线的空白平均值。

(2)然后利用标准品测定值(OD值)为横坐标(x),标准品浓度(ng/ml)为纵坐标(y)，制定标准曲线，获得回归方程；

(3)将各回收率样品及待测样品所测得平均读数扣回收空白读数的OD值代入回归方程的(x)，求得(y)，即为DNA浓度的实测值(ng/ml)；

(4)将此实测值(ng/ml)×测试时的稀释倍数×回收溶液体积×(消化液总体积/抽提液体积)，获得实测(回收)DNA总量(ng)；

(5)用回收的DNA总量对原始投入的DNA总量作回归曲线，以实测回收的总量为横坐标(x)，原始投入的DNA总量为纵坐标(y)；

(6)将待测样品实验回收的DNA总量(ng)代入回收率曲线方程的(x)，求得样品的原始DNA总量(y)；

(7)最后用样品的原始DNA总量除以样品干重量，即可得到被测样品单位重量(mg)的DNA含量。

2.2结论

(1)观察现象：

①样品组各取3个样进行消化，消化完后离心每管取上清液1个进行人工抽提。消化效果较好，无明显沉淀物存在。

②回收率组消化完后，每管取上清液2个进行人工抽提。

(1)样品DNA含量(抽提回收后稀释20倍检测)

去细胞人工角膜的DNA含量为0.88±0.11ng/mg，符合临床安全要求。

四、去细胞人工角膜超微结构检测

角膜基质独特的超微结构是胚胎发育过程中形成的，是保证角膜高度透明和抵抗生理或病理性高眼压的基础，而到目前为止体外方法尚无法复制，因此，如何获得适用的支架材料成为目前制约组织工程化生物角膜构建的瓶颈。脱细胞角膜基质已经包含了天然的基质蛋白，显示出合理的结构特点，并且提供了细胞长入的良好条件。同时细胞外基质蛋白基因序列上较高程度的保守性提供了利用异种动物(通常是猪)角膜基质的可能。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

扫描电镜，冷冻干燥机、真空干燥箱。

1.2实验方法

1.2.1扫描电镜前样品处理

去细胞人工角膜经脱细胞工序后，放入-20℃冰箱，待冷冻后放入冻干机中冻干，真空干燥箱中继续抽干至完全干燥。

1.2.2扫描电镜检测步骤

取出上述样品，角膜上皮面向上，粘导电胶条，镀以金膜，扫描电镜下观察并拍照。

2结果

如图3所示，从电镜扫描结果看，去细胞人工角膜的上表面结构和正常角膜相似，光滑平整。基质底层面扫描结果，其网状结构能够提供间充质细胞生长的空间，保证营养成份和代谢产物的交换，有利于细胞在材料的表面黏附和生长。

五、组织学观察

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

轮转式石蜡切片机，无水乙醇，二甲苯，石蜡，苏木素，伊红。

1.2实验方法

1.2.1石蜡切片和HE染色步骤如下所示：

1.将取回的异种细胞人工角膜进行脱细胞处理，后置于4％的甲醛溶液中固定。

2.组织固定：将去细胞人工角膜在4％甲醛溶液中固定24h。

3.冲洗：用镊子取出固定后的组织放入PBS缓冲液中清洗1h，重复此操作一次。

4.梯度酒精脱水：将组织依次放入不同浓度的酒精中浸泡，依次是50％(2h)﹑70％(50h)﹑85％(40h)、95％(30h)、100％(30h)。

5.透明：将脱水皮肤组织置于等体积比二甲苯与无水乙醇的溶液中浸泡30min，接着在二甲苯中浸泡20min，换新的二甲苯后，再浸泡20min。

6.透蜡：将透明后的皮肤组织放入等体积石蜡和二甲苯的混合液浸泡30min，石蜡中浸泡1h(重复一次)

7.石蜡包埋：将已经透蜡的皮肤组织放入包埋盒中，向包埋盒中浇筑石蜡。静置冷却至室温后，在4℃冰箱中静置20min后，取出蜡块。

8.切片：将蜡块置于轮转式切片机切片上，然后将切片刀角度调至5°，是切片厚度保持5μm。

9.展片与贴片：滴加30％乙醇于载玻片上，将切好的蜡片用毛刷转移至在玻片上，然后将载玻片放入48℃的恒温水浴锅中，切片展开后将置于在玻片上，调整好位置。

10.烤片:将载玻片置于60℃的恒温箱内，烤片30min到1h。

11.脱蜡复水：将烤干蜡片置于二甲苯中浸泡5min，重复操作一次。接着将蜡片置于梯度酒精浸泡，依次是100％(5min，2次)、95％(3min)、70％(3min)、50％(3min)，0％(3min)。

12.使用苏木素染色20min。

13.使用蒸馏水浸泡1min。

14.分化：将载玻片在酸醇(80％酒精含0.5％HCl)中迅速浸蘸后，放入流水中冲洗5min。将载玻片放入80％酒精含0.5％HCl溶液中，浸没后迅速拿起，用流水冲洗5min。

15.使用95％乙醇浸泡3min。

16.使用伊红染色3min。

17.脱水以及透明：使用95％乙醇浸泡5min，100％乙醇浸泡8min(2次)，二甲苯浸泡3min。

18.封片：将中性树脂涂抹在组织周围，盖上盖玻片封片。用二甲苯洗去盖玻片外的中性树脂，在通风柜吹干后，保存至切片盒。

1.2.2溶液配方：

4％中性甲醛固定液的配制：40％甲醛100mL，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠13g，在容量瓶中用蒸馏水定容至1L，室温保存。

1％伊红酒精染液的配制：称取1g伊红，加适量蒸馏水溶解后，滴加冰醋酸至溶液变为糊状。过滤后取滤渣在烘箱中烘干，溶于95％的工业酒精。

苏木精染液的配制：称取2.5g的苏木精，溶解于20ml的无水乙醇中。然后称取25g硫酸铝钾，溶解于330ml的蒸馏水中。两种溶液充分溶解后混合，按顺序加入250mg的碘酸钠、150ml的甘油和10mL的冰醋酸，充分混合后过滤。

1％盐酸乙醇分化液的配制：将1ml的浓盐酸与99ml的70％乙醇混合，室温保存。

2结果

如图4所示，H&E染色显示：未观察到任何完整的细胞和细胞碎片，高度的细胞脱净率，可有效降低其免疫原性。

六、宿主细胞与去细胞人工角膜相容性研究实验

去细胞人工角膜替代修复宿主损伤角膜的过程中，宿主角膜上皮细胞需要以去细胞人工角膜为三维支架，在其表面贴附、爬生和增殖，异种脱细胞角膜基质为宿主细胞提供一个生长环境，诱导宿主细胞再生，随着移植材料逐渐降解为宿主细胞增殖、基质生成、宿主组织重建与改建提供空间和物质基础。因此，异种脱细胞基质与宿主细胞的相容性是一个重要指标。

本实验通过在去细胞人工角膜体外培养细胞并观察细胞生长情况，评价其细胞生物相容性。

1材料和方法:

1.1.1主要试剂和仪器

0.25％胰蛋白酶、青霉素与链霉素混合液、胎牛血清、MEM、DMEM及DMEM/F12均购自美国GIBCO公司、DAPI溶液，DPBS购自美国corning公司，高速台式离心机、超净工作台、CO₂培养箱。

1.1.2培养液的制备

DMEM/F12培养液含体积分数20％胎牛血清及100×10³U·L^-1青霉素与链霉素混合液,PH值7.2～7.4。

DMEM与MEM培养液各含体积分数10％胎牛血清及100×10³U·L^-1青霉素与链霉素混合液,PH值7.2～7.4。

1.2实验方法

1.2.1人源角膜上皮细胞与去细胞人工角膜接触培养

经传代培养的人源角膜上皮细胞细胞80％融合后用PBS冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶1ml倒置显微镜下观察细胞形态变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的DMEM培养液终止消化，收集细胞悬液，离心5min(800·min-1)，计数，以1×10⁵/ml的密度接种在脱细胞角膜的上皮细胞层。细胞接种前，先将脱细胞角膜在PBS中浸泡10min，然后将样品平铺于96孔培养板中，接种后的细胞与支架复合体在37℃、5％CO₂培养箱中静置3h后，再加入适量MEM培养液，继续放孵箱培养，第二天换液一次。倒置显微镜观察细胞生长情况，培养2-3天后，培养的细胞与支架复合体经2.5％的戊二醛固定，脱水，冷冻干燥完做扫描电镜；观察细胞形态。

1.2.2人源皮肤成纤维细胞与去细胞人工角膜接触培养

人源皮肤成纤维细胞培养：人源皮肤成纤维细胞80％融合后用PBS冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶1ml倒置显微镜下观察细胞形态变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的MEM培养液终止消化，收集细胞悬液，离心6～8min(1000·min^-1)，计数，以1×10⁵/ml的密度接种在脱细胞角膜的上皮细胞层。细胞接种前，先将脱细胞角膜在PBS中浸泡10min，然后将样品平铺于48孔培养板中，接种后的细胞与支架复合体在37℃、5％CO₂培养箱中静置2h后，再加入适量培养液，继续放孵箱培养，第二天换液一次。倒置显微镜观察细胞生长情况，培养3-4天后，培养的细胞与支架复合体经2.5％的戊二醛固定，脱水，冷冻干燥完做扫描电镜；观察细胞形态。

1.2.3人源上皮细胞在去细胞人工角膜贴壁率实验

经传代培养的人源角膜上皮细胞细胞，取对数期生长的细胞接种于贴有去细胞人工角膜的24孔培养板，对照组接种于普通培养板，各10孔。在37℃、50mL/LCO₂及饱和湿度条件下的培养箱中培养6h、8h后，DAPI染色观察细胞形态及贴附情况，另采用MTT法测定细胞悬液吸光度值An。通过实验已利用MTT法测得当细胞悬液的密度为M0＝1.0×10⁸/L时，在492nm处的吸光度值为A0＝0.137。根据一定范围内活细胞数与吸光度值成正比，可以计算出6h、8h后贴壁存活细胞数，并据此算得6h、8h细胞贴壁率：pn＝An/A0×100％(n＝1,2,…,10)。

1.2.4扫描电镜前制样步骤：固定+脱水

1)、缓冲液漂洗完3次，使用2.5％戊二醛每孔加1-2ml，固定1天。

2)、固定完后用梯度乙醇脱水(50％，70％，80％，90％，100％)各泡3次，3min/次，接着泡叔丁醇步骤相同；泡完放-20℃冰箱保存5h后，放冷冻干燥机干燥。

2.结果:

2.1电镜观察结果

如图5和图6可见，细胞接种到脱细胞基质48小时后扫描电镜观察发现细胞均贴附到支架材料上，人源角膜上皮细胞在72小时后可见细胞伸展，呈多角形，逐渐融合图。

2.2显微镜下观察6h、8h细胞贴附情况

将密度为M0＝1.0×10⁸/L的细胞悬液分别接种于贴有去细胞人工角膜的24孔培养板及作为对照的普通培养板，6h、8h后DAPI染色置于镜下观察细胞形态并分别计算贴壁率为90.67％和92.67％，详细见图7所示。

去细胞人工角膜的细胞亲和性可以直接接触法进行检测，该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养，可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒，同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。

脱细胞角膜基质经过冷冻干燥处理后，基质结构疏松，电镜显示其网状间隙率为70-200um，细胞在其上接种培养后，可向材料深层迁徒，说明基质层的网状结构能够提供间充质细胞生长的空间，保证营养成份和代谢产物的交换，有利于细胞在材料的表面黏附和生长。

在细胞亲和性检测中，我们也尝试将人源的角膜上皮细胞接种到脱细胞角膜上，细胞在材料界面同样生长良好。表明脱细胞角膜也可作为体外细胞培养的载体。

4.结论:

本实验结果说明制备的去细胞人工角膜具有极低的抗原性、良好的组织相容性和细胞亲和性，可以提供角膜上皮生长的底物-基底膜及相对健康的角膜基质微环境，促进宿主角膜上皮细胞的黏附和生长，是宿主细胞生长的优良载体。

从以上详细的实验数据可见，本发明人工角膜具有良好的透光性、机械强度和韧性，可以有效地在角膜板层缺损区保护眼内容物，防止继发损害；结构与宿主角膜相似，酶残留活性及DNA残留量的检测，说明人工角膜具有极低的抗原性；具备正常角膜超微结构以及良好的细胞亲和性、组织相容性，可以提供角膜上皮生长的底物-基底膜及相对健康的角膜基质微环境，促进宿主角膜上皮细胞的黏附和生长，是宿主细胞生长的优良载体。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，是发明人花费了大量人才财力和时间，在多次试验出来的结果，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种人工角膜，其特征在于，以动物脱细胞角膜基质先浸泡于光敏剂中，然后在紫外光照射下交联均匀，其厚度为50-1000μm。

2.一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，其包括的步骤如下：

(1)将动物脱细胞角膜基质在0.01-5mg/ml光敏剂溶液中浸泡1-60min；

(2)将浸泡后的动物脱细胞角膜基质取出放于培养皿中，用100-400nm波长紫外光照射1-60min；

(3)用磷酸盐缓冲溶液浸泡0.5-4h，然后振荡0.5-2h。

3.根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，还包括以下步骤：(4)更换磷酸盐缓冲溶液，浸泡0.5-4h，然后振荡0.5-2h。

4.根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述(2)步骤中，在紫外光照射1-30min时换面，然后继续进行照射。

5.根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述(2)步骤中，紫外光照射的功率密度在1mw/cm²-6000mw/cm²。

6.根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述动物脱细胞角膜基质是猪、牛、羊、马、兔或者猴角膜基质脱细胞后的产品。

7.根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述光敏剂是NFK、3-经基犬尿酸、君咔琳、核黄素、FMN、FAD及视黄醛。

8.根据权利要求2所述的一种光氧化胶原交联的方法，其特征在于，所述光敏剂是稠环醌类天然光敏剂、卟啉类及其衍生物光敏剂。