DE69133313T2

DE69133313T2 - Verwendung von Nitroxiden und Oxazolidinen zum Schutz ionisierender Strahlung und oxidativem Stress

Info

Publication number: DE69133313T2
Application number: DE69133313T
Authority: DE
Inventors: William G. Degraff; James B. Mitchell; Stephen Hahn; Amram Samuni
Original assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Department of Commerce
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1991-03-18
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2011-03-19
Also published as: EP0787492A1; US5462946A; ATE249829T1; WO1991013619A1; JPH05501114A; CA2078287C; AU644865B2; EP0520005A1; JP2741427B2; EP0787492B1; EP0520005B1; AU7542391A; ES2207690T3; DE69127437T2; DK0787492T3; CA2078287A1; EP0520005A4; DE69133313D1; ATE157249T1; DE69127437D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Nitroxidverbindungen enthalten, die nützlich sind beim Abmildern der schädlichen Wirkungen von giftigen, mit Sauerstoff verwandten Molekülsorten in lebenden Organismen, sowie Verfahren zum Verwenden derselben.
Beschreibung des Stands der Technik
Die Verwendung von Sauerstoff durch Säugetiere bringt sowohl einen Segen als auch einen potentiellen Fluch mit sich. Der Segen besteht darin, daß alle Säugetiere Sauerstoff zum Leben brauchen. Der potentielle Fluch besteht darin, daß während des Stoffwechsels von Sauerstoff eine Reihe von giftigen, mit Sauerstoff verwandten Molekülsorten, wie das Hydroxylradikal, (•OH); Wasserstoffperoxid, (H₂O₂); und Peroxid, (O•/2) erzeugt werden. Ließe man sie unkontrolliert, so könnten diese freien Radikalsorten zweifelsohne Zellen beschädigen. Jedoch haben Zellen ausgeklügelte Entgiftungs- und Reparatursysteme entwickelt, um sich selbst von diesen potentiell giftigen und unerwünschten Nebenprodukten des Stoffwechsels zu befreien: Superoxiddismutase (SOD) kann Peroxid in H₂O₂ umwandeln, und Katalase (CAT) kann H₂O₂ in H₂O umwandeln.
Ein nochmals anderer Weg, um H₂O₂ (sowie Organoperoxide) zu entgiften, verläuft über die Enzymglutathionperoxidase (GPX), mittels welcher Gluthathion (GSH) ebenfalls H₂O₂ in H₂O umwandelt. Gluthathiontransferase (GST) kann zusätzlich zu seiner Fähigkeit Drogen und Xenobiotika zu konjugieren und zu inaktivieren, auch eine Peroxidaseaktivität aufweisen und kann H₂O₂ entgiften. Diese Systeme stellen die hauptsächlichen Entgiftungswege für mit Sauerstoff verwandte freie Radikalmolekülsorten dar; es gibt jedoch zweifelsohne andere Systeme, welche Schutz bieten können und welche Proteinsulfhydrile umfassen sowie andere mit Thiol verwandten Enzyme, welche an Reparaturmechanismen beteiligt sein könnten.
Trotz der Wirksamkeit dieser enzymatischen Systeme, gibt es ein kleines "Leck" von giftigen Molekülsorten hinter das biochemische Verteidigungsnetzwerk. Von besonderer Wichtigkeit ist das letztendliche Schicksal von H₂O₂, falls es der Entgiftung entkommen sollte. H₂O₂ ist selbst ein Oxidationsmittel, welches in der Lage ist, wichtige Moleküle biologisch zu schädigen, und kann auch eine Reduktion mittels eisenhaltiger Komplexe durchlaufen, um •OH zu erzeugen. Diese Reaktion (welche häufig als Fenton-Chemie bezeichnet wird) erzeugt das hoch reaktive •OH, welches in der Größenordnung von 10^–9 Sekunden folgendes tun kann: 1) Elektronen aus organischen Molekülen entziehen; 2) chemische Bindungen aufbrechen; 3) eine Lipidperoxidation auslösen; und 4) mit einem anderen •OH reagieren kann, um H₂O₂ zu erzeugen. Es ist nicht bekannt, ob eine andauernde Exposition gegenüber einer niedrigen Konzentration von mit Sauerstoff verwandten freien Radikalmolekülsorten schädigend ist; es wird jedoch postuliert, daß der Alterungsprozeß eine Folge sein könnte der Unfähigkeit der Organismen, mit andauerndem oxidativem Stress fertig zu werden. Viele Umstände, die bei der Krebsbehandlung verwendet werden, einschließlich Röntgenstrahlen und einigen chemotherapeutischen Arzneimitteln, üben ihre ZelLtoxizität aus über die Erzeugung von mit Sauerstoff verwandten freien Radikalen, wodurch sie den normalen Entgiftungssystemen eine zusätzliche Last aufbürden. Zusätzlich sind freie Radikale und giftige mit Sauerstoff verwandte Molekülsorten in Zusammenhang mit Ischämie-Reperfusionsschaden in Verbindung gebracht worden und es ist lange davon ausgegangen worden, daß sie wichtig sind bei neutrophilvermittelter Toxizität von Fremdpathogenen. Entsprechend sind Schäden durch freie Radikale in Verbindung gebracht worden mit der Karzinogenese. Der Ausdruck "oxidativer Stress" ist so entstanden, um eine breite Vielfalt von Stress-Symptomen zu umfassen, von denen einige offensichtliche Auswirkungen für die Gesundheitspflege zeigen.
Es hat ein bemerkenswertes Interesse gegeben beim Entwerfen zusätzlicher Vorgehensweisen, neben inhärenten intrazellulären Entgiftungssystemen, um Zellen, Gewebe, Tiere und Menschen vor den giftigen Effekten von beliebigen Agentien oder Verfahren zu schützen, welche zu oxidativem Stress führen. In den letzten paar Jahren haben experimentelle Studien nahe gelegt, daß Enzyme, wie zum Beispiel Katalase und Superoxiddismutase, und Wirkstoffe wie Allopurinol und metallchelatierende Verbindungen, einen Schutz gegen oxidativen Stress bieten. Keine dieser Vorgehensweisen wird gegenwärtig bei Menschen angewendet.
Die Anwendung von Nitroxiden in der vorliegenden Erfindung ist in dieser Hinsicht neu und bietet verschiedene einzigartige Vorteile. Obwohl die Gruppe der chemischen Verbindungen, welche als stabile Nitroxid-Spinmarkierungen bezeichnet werden, weit verbreitete biophysikalische Verwendung gefunden hat, sind diese niemals als Antioxidantien verwendet worden. Sie zeigen eine niedrige Reaktivität mit Sauerstoff als solchem. Da sie ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, ungeladen sind, und in wässriger Lösung löslich, treten sie leicht in das intrazelluläre Millieu ein. Enzyme wie zum Beispiel Katalase und Superoxiddismutase tun dies nicht. Deshalb sollten die Nitrooxide der Katalase und Superoxiddismutase überlegen sein in sofern als sie auch Schutz innerhalb der Zeile bieten können. Sie sind aktiv innerhalb des biologischen pH-Bereichs von ungefähr 5 bis 8. Nitroxide sind keine Proteine; deshalb ist die Wahrscheinlichkeit einer antigenen Stimulation gering. Frühere Superoxiddismutase-Nachahmungen von niedrigem Molekulargewicht waren alle metallabhängig. Die vorliegenden Mittel enthalten keine Metalle, und Probleme mit Dissoziationskonstanten und schädlichen, durch Metalle verursachte Reaktionen werden deshalb vermieden. Diese Verbindungen sind offensichtlich nicht giftig bei wirksamen Konzentrationen. Nitroxidlipophilizität kann kontrolliert werden durch die Zugabe verschiedener organischer Substituenten. Diese organischen Substituenten erleichtern es, die Moleküle spezifischen Organen oder Organellen zuzuführen, wo giftige, vom Sauerstoff abgeleitete Molekülsorten erzeugt werden, und in Bereiche, welche besonders anfällig sind gegenüber oxidativen Schädigungen, oder zum Gehirn, falls dies erwünscht wird. Frühere Schutzmittel gegen Strahlung basierten auf der Sulfhydrylgruppe. Die vorliegenden Mittel haben keine Sulfhydrylgruppe. Zuletzt sei erwähnt, daß die frühere Verwendung dieser Arten von Verbindungen als Kontrastmittel bei Magnetoresonanz sich nicht auf ihre vorliegende Verwendung als Antioxidantien bezieht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Probleme zu überwinden, die verbunden sind mit der Verwendung von undurchlässigen enzymatischen Entgiftungsmitteln wie zum Beispiel Superoxiddismutase und Katalase um lebendes Gewebe vor den schädlichen Wirkungen von giftigen Produkten zu schützen, die während des Sauerstoff-Stoffwechsels erzeugt werden. Dies wird erreicht durch Bereitstellen von Verfahren zur Verwendung von Nitroxidverbindungen als metallunabhängige Antioxidantien mit niedrigem Molekulargewicht als:

1. Schutzmittel gegen ionisierende Strahlung, um die Haut zu schützen und um gegen Mukositis zu schützen, gegen die Effekte einer Ganzkörperbestrahlung, sowie strahlungsinduzierten Haarverlust. Die Verabreichung in diesen Situationen kann bewerkstelligt werden entweder über eine örtliche Anwendung als Salbe, Lotion, oder Creme, sowie intravenös oder oral mittels Pillen oder Pastillen.
2. Schutzmittel gegen eine verstärkte Exposition gegenüber Sauerstoff, um so zum Beispiel posttraumatisches Lungenversagen (ARDS = pulmonary adult respiratory distress syndrome) zu vermeiden.
3. Schutzmittel gegen sauerstoffinduzierte linsenförmige Degeneration und Hyalinmembranerkrankungen bei Kindern und gegen durch oxidativen Stress erzeugten Grauen Star. Die Verbindungen können auch verwendet werden zum Schutz gegen oxidativen Stress in Patienten, die einer Sauerstofftherapie oder einer Sauerstofftherapie bei Überatmosphärendruck unterzogen werden. Die Verabreichung unter diesen Umständen kann durchgeführt werden auf verschiedenen Wegen, die zum Beispiel die Verwendung von Augentropfen umfassen, die Inhalation von Aerosolen, oder eine intravenöse Injektion.
4. Schutzmittel gegen Reperfusionsschäden, die wirksam sind bei der Behandlung von kardiovaskulären Erscheinungen, wie zum Beispiel Herzmuskelinfarkte und Schlaganfälle, Bauchspeicheldrüsenentzündungen oder Darmgeschwüre; um Patienten zu schützen, die Organtransplanate erhalten, sowie in Aufbewahrungslösungen für Organe.
5. Schutzmittel zur Verwendung in Tier- oder Pflanzenzellkulturmedien, um Cytotoxität aufgrund von übersteigerter Oxidation zu verhindern, zur Verwendung in Mitteln, die zur Zucht aerober Mikroorganismen dienen, zur Verwendung beim Stabilisieren labiler chemischer Verbindungen, die eine spontane Zersetzung erfahren beim Erzeugen freier Radikale, zur Verwendung zum Neutralisieren freier Radikale, welche eine Kettenverlängerung während der Polymerbildung katalysieren, wodurch die Polymerverlängerung beendet wird, und zur Verwendung als Stabilisator für Lebensmittel oder Lebensmittelzusatzstoffe, wie zum Beispiel Farben und Geschmacksstoffe, insbesondere in Lebensmitteln, die mittels einer Bestrahlungsbehandlung haltbar gemacht werden.
6. Biologische Antioxidantien, um Menschen und Tiere gegen Mittel, wie zum Beispiel das Insektenvernichtungsmittel Paraquat zu schützen. Unter diesen Umständen kann die pharmazeutische Verbindung zum Beispiel verabreicht werden über Inhalation als ein Aerosol, auf eine Person, die Paraquat ausgesetzt war. Zusätzlich können Pflanzen gegen solche Wirkstoffe geschützt werden, zum Beispiel durch Aufsprühen vor oder nach Exposition gegenüber solchen Verbindungen.
7. Schutzstoffe gegen die cytotoxischen Effekte von chemotherapeutischen Wirkstoffen.
8. Schutzmittel gegen mutagene und karzinogene Wirkstoffe. Die Verabreichung in dieser Situation ist wie bei 6, oben, und kann erzielt werden mittels oraler Einnahme oder parenteral (unter Umgehung der Verdauungstrakts).
9. Entzündungshemmende Mittel, die gegen arthritische Erkrankungen wirksam sind. Zu diesem Zwecke können die Zusammensetzungen parenteral, infra-artikulär oder über orale Einnahme verabreicht werden.
10. Alterungshemmer. Die Verabreichung zu diesem Zwecke kann oral erfolgen, wie über einen tablettenförmigen Zusatz zur Nahrung oder parenteral.
11. Orale oder intravenöse Wirkstoffe, die eine Gewichtsreduktion einleiten.

Diese und andere Ziele werden erreicht durch Bereitstellen einer biologisch verträglichen Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel
enthält; dabei gilt: R, ist -CH₃ und R₂ ist -C₂H₅, -C₃H₇, C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, -CH₂-CH(CH₃)₂, -CHCH₃C₂H₅ oder -(CH₂)₇-CH₃, oder R₁ und R₂ bilden zusammen Spyrozyklopentan, Spyrozyklohexan, Spyrozykloheptan, Spyrozyklooktan, 5-Cholestan oder Norboran; und R₃ ist -O• oder -OH, oder ein physiologisch akzeptierbares Salz hiervon, welches eine antioxidative Wirkung zeigt, sowie einen biologisch verträglichen Träger.
Verbindungen, welche bei der vorliegenden Erfindung nützlich sein können umfassen auch jede beliebige Zusammensetzung, welche eine
oder
aufweisen, oder ein Salz hiervon. Diese Verbindungen können allgemein dargestellt werden durch folgende Formel:
Dabei ist R₃ wie oben festgelegt, und R₄ und R₅ kombinieren zusammen mit dem Stickstoff, um eine heterozyklische Gruppe zu bilden. Die Atome in der heterozyklischen Gruppe (mit Ausnahme des in der obigen Formel gezeigten N-Atoms) können allesamt C-Atome sein oder können C-Atome sein sowie ein oder mehrere N-, O- und/oder S-Atome. Die heterozyklische Gruppe hat bevorzugterweise insgesamt fünf oder sechs Atome. Die heterozyklische Gruppe kann bevorzugterweise ein Pyrrol sein, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, 3-Pyrrolin, Pyrrolidin, Pyridin, Pyrimidin, oder Purin, oder Ableitungen hiervon, zum Beispiel.
Weitere Verbindungen, die nützlich sein können bei der vorliegenden Erfindung umfassen auch jene, in denen R₄ und R₅ selbst eine substituierte oder nicht substituierte zyklische oder heterozyklische Gruppe umfassen.
Nochmals weitere Verbindungen, die nützlich sein können bei der vorliegenden Erfindung umfassen auch Oxazolidinverbindungen, die in der Lage sind, ein Oxazolidin-1-Oxyl zu bilden.
Nochmals weitere Verbindungen, die nützlich sein können in der vorliegenden Erfindung, umfassen auch metallunabhängige Nitroxide.
Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf Verfahren zum Behandeln der schädlichen Wirkungen von schädigenden von Sauerstoff abgeleiteten Stoffwechselprodukten, wie oben aufgeführt.
Physiologisch verträgliche Salze umfassen säurebildende Zusatzsalze, die mit organischen und inorganischen Säuren gebildet werden, zum Beispiel Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate wie Kreatinsulfatsalze, Phosphate, Citrate, Fumarate und Maleate. Für die Verbindungen der Erfindung ist gezeigt worden, daß sie geringe oder keine In-Vitro-Cytoxizität während 5 h bei Konzentrationen von 1 bis 5 mM zeigen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden für die Behandlung der giftigen Wirkungen von oxitativem Stress in einer Vielzahl von Materialien, Zellen und Säugetieren, einschließlich des Menschen, Haus- und Farmtieren, und Labortieren, wie zum Beispiel Hamster, Mäuse, Ratten, Affen u. s. w.. Es wird erwartet, daß die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung in pharmazeutischen Zusammensetzungen ausgeführt werden, welche eine wirksame Menge an Antioxidantien der Verbindungen gemäß Formel (I) aufweisen werden sowie pharmazeutisch verträgliche Träger. Eine wirksame Menge von Antioxidantien der pharmazeutischen Zusammensetzung wird dem Subjekt oder Organismus, Mensch, Tier oder Pflanze auf eine Weise verabreicht, welche die Auswirkungen von oxidativem Stress verhindert. Die Menge der Verbindung (I) und des spezifischen pharmazeutisch verträglichen Trägers werden variieren abhängig von dem Wirt und seiner Verfassung, der Art der Verabreichung und des Typs von zu behandelnden oxidativen Stresszustand.
In einem besonderen Aspekt umfaßt die pharmazeutische Zusammensetzung eine Verbindung nach Formel (I) in einer wirksamen Einheitsdosierungsform. Wie im Folgenden verwendet, soll der Ausdruck "wirksame Einheitsdosierung" oder "wirksame Einheitsdosis" eine vorbestimmte Menge eines Antioxidationsmittels bezeichnen, welche ausreicht, um wirksam zu sein gegen oxidativen Stress in vitro oder in vivo. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind Materialien, die nützlich sind zum Zwecke der Verabreichung des Medikaments, welche bevorzugterweise nicht giftig sind, und welche feste, flüssige oder gasförmige Materialien sein können, die im übrigen inert und medizinisch verträglich sind, und welche kompatibel sind mit den aktiven Wirkstoffen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können andere aktive Inhaltsstoffe umfassen wie zum Beispiel antimikrobiale Wirkstoffe und andere Wirkstoffe wie zum Beispiel Konservierungsmittel.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Form von Lösung, Emulsion, Suspension, Salbe, Creme, Aerosol, Granulat, Pulver, Tropfen, Spray, Tablette, Kapsel, Folienumhüllung, Pastille, Ampulle, Pessar oder Zäpfchen vorliegen. Sie können parenteral, intramuskulär oder subkutan, intravenös, intraartikulär, transdermal, oral, bukkal, als Zäpfchen oder Pessar, lokal, als Aerosolspray oder Tropfen, verabreicht werden.
Die Zusammensetzungen können die Verbindung in einer Menge zwischen 0,1 bis 99 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung umfassen, bevorzugterweise 1 bis 90 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung. Für die intravenöse Injektion kann die Dosis ungefähr 0,1 bis ungefähr 300 mg/kg/Tag umfassen. Falls lokal angewendet als Flüssigkeit, Salbe oder Creme kann die Verbindung vorliegen in einer Menge von ungefähr 0,01 bis ungefähr 100 mg/ml für die Zusammensetzung. Für die Inhalation sollten ungefähr 0,1 bis ungefähr 200 mg/kg Körpergewicht der Verbindung pro Tag verabreicht werden. Für die orale Verabreichung sollte die Verbindung in einer Menge von ungefähr 0,1 bis ungefähr 300 mg/kg/Tag verabreicht werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zum Behandeln der Wirkungen von oxidativem Stress aufgrund der Erzeugung von schädlichen, von Sauerstoff abgeleiteten Molekülsorten, welches das Verabreichen einer wirksamen Antioxidansmenge der oben genannten Verbindung auf einen Organismus, ein Material, ein Säugetier oder einen Menschen umfaßt, die für oxidativen Stress anfällig sind. Solche Stressfaktoren umfassen jene, welche zurückzuführen sind auf Oxidationsmittel, eine verstärkte Exposition gegenüber Sauerstoff, durch Sauerstoff erzeugte Degenerierung oder Krankheit, Reperfusionsschäden, ionisierende Strahlung, karzinogene, chemotherapeutische oder mutagene Wirkstoffe, Alterung oder Arthritis.
Reperfusionsschäden können Herzmuskelinfarkte, Schlaganfälle, Bauchspeicheldrüsenentzündungen und Darmgeschwüre umfassen, während oxidativer Stress, der durch verstärkte Exposition gegenüber Sauerstoff verursacht wird, das posttraumatische Lungenversagen (ARDS = pulmonary adult respiratory distress syndrome) umfaßt.
Andere oxidative Stresssymptome, die einer Behandlung mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung zugänglich sind, umfassen eine sauerstoffausgelöste, hepatolentikuläre Degeneration, Grauer Star oder Hyalinmembran-Krankheiten in Kindern, oder oxidativen Stress, der während einer Sauerstofftherapie oder Sauerstofftherapie bei Überatmosphärendruck auftritt.
Letztlich kann in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung die erfindungsgemäße Verbindung verwendet werden, um die Aufbewahrungsdauer von menschlichen oder Tierzellen, Geweben oder Organen zu verlängern durch In-Kontakt-Bringen dieser Materialien mit einer Aufbewahrungslösung, welche eine wirksame Menge einer solchen Verbindung umfaßt, oder um eine Gewichtsreduktion bei Menschen oder Tieren hervorzurufen.
Der Ausdruck "biologisch verträglich" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, welche keine nachteiligen Effekte bei einem Organismus hervorruft, auf welchen sie einwirken gelassen wird. Die Zusammensetzung ist bevorzugterweise frei von giftigen Substanzen oder anderen Substanzen, welche sie ungeeignet machen würden für die beabsichtigte Verwendung.
Der Ausdruck "parenteral" umfaßt eine Verabreichung durch Injektion wie zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subkutan.
KURZE FIGURENBESCHREIBUNG
Die 1A bis 1D zeigen EPR-Spektren von CHD und TEMPO, welche die Verteilung eines jeden Nitroxids (1 mM) in sowohl den intra- als auch extrazellulären Raum von V79-Zellen zeigt, nämlich die EPR-Signalintensität der Gesamtkonzentration von CHD (intra- und extrazellulär) in 6,4 × 10⁷ V79-Zellen/ml (Graphen A und C) und in der Gegenwart von 110 mM Trioxalatochromiat (CroOx) (Graphen B und D). Die Verstärkungen für die einzelnen Spektren sind wie in den einzelnen Figuren angegeben.
2 zeigt eine Überlebenskurve für V79-Zellen eines chinesischen Hamsters, die in der Gegenwart verschiedener Zusatzstoffe, inklusive der Nitroxide CHD und TEMPOL, welche die Zellen vollständig schützten, HX/XO (Hypoxanthin/Xanthinoxidase) ausgesetzt worden sind. Die V79-Zellen eines chinesischen Hamsters in einem Vollmedium bei 37°C wurden 0,05 U/ml XO + 0,5 mM HX während verschiedener Zeitspannen in der Gegenwart verschiedener Zusatzstoffe ausgesetzt: (•), Kontrolle, keine Zusatzstoffe; (∎), 100 U/ml Katalase; (O), 100 U/ml SOD; (☐), 500 μM DF (Desferrioxamin), welches während 2 h mit den Zellen vor der Hinzufügung von XO in einem Brutkasten vorgezüchtet wurde; (∆), 5 mM CHD; (
), 5 mM TEMPOL.
3 zeigt eine Überlebenskurve für Zellen, die H₂O₂ ausgesetzt waren in Gegenwart verschiedener Zuschlagstoffe inklusive der Nitroxide CHD und TEMPOL, welche die Zellen vollständig schützten. Die Wirkung der verschiedenen Hilfsstoffe auf das Überleben der Zellen wurde gemessen mittels einer Klonprobenanordnung von V79-Zellen eines chinesischen Hamsters, die in vollem Medium bei 37°C verschiedenen Konzentrationen von H₂O₂ während 1 h ausgesetzt waren; (•), Kontrolle, keine Zuschlagstoffe; (∎), 100 U/ml Katalase; (O), 100 μg/ml SOD; (☐), 500 μM DF, welches während 2 h vor der Hinzufügung von H₂O₂ mit den Zellen im Brutkasten vorgebrütet war; (∆), 5 mM CHD; (
), 5 mM TEMPOL.
4 zeigt den Effekt von Nitroxid auf die Ansammlung und Zersetzung von H₂O₂ in einer Gewebekultur von Zellen, die HX/HO ausgesetzt worden sind. V79-Zellen eines chinesischen Hamsters wurden im vollen Medium bedeckt und mit 5 mM HX + 0,04 U/ml XO bei 37°C im Brutkasten vorgebrütet, und bei verschiedenen Zeitpunkten überprüft, und für H₂O₂ getestet unter Verwendung einer Wasserstoffperoxid-selektiven Elektrode.
5 zeigt das Überleben der V79-Zellen eines chinesischen Hamsters, die 600 μM H₂O₂ ± DF oder CHD im Vollmedium bei 37°C während 1 h unter Sauerstoffmangelbedingungen ausgesetzt waren.
6 zeigt die Reaktion zwischen CHD und DNA-Fe(II): CHD in 50 mM MOPS Puffer mit pH 7,0 wurde unter Sauerstoffausschluß bei 22°C mit DNA-Fe(II) gemischt. Alle Lösungen enthielten immer 0,1 mg/ml Lachs DNA. Das Aussehen des DNA-Fe(III) wurde spektrophotometrisch überwacht bei 353 nm, wohingegen der Spinverlust des CHD durch Verfolgen seines EPR- Signals überwacht wurde. Um die Zeitabhängigkeit von ∆OD_353nm(O) zu verfolgen, wurde 1 mM CHD mit 0,1 mM Fe(II) gemischt. Um den Spinverlust von CHD (☐) zu verfolgen, wurde 1 mM Fe(II) mit 0,1 mM CHD gemischt.
Einschub: Zeitabhängigkeit von ln {EPR-Signal} (☐); und von ln {OD – OD_t}(O).
Die 7A bis 7D zeigen das klonogenische Überleben der V79-Zellen eines chinesischen Hamsters, welche behandelt wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von TEMPOL 10 min. vor der Bestrahlung.
8 zeigt den Schutz, welcher ganzen Tieren geboten wurde, die mit TEMPOL behandelt wurden vor einer Ganzkörperbestrahlung. Sechs Wochen alten weiblichen C3H-Mäusen wurden 275 mg/kg TEMPOL intraperitoneal 10 min. vor einer Bestrahlung mit 3 Gy bis 13 Gy verabreicht. Kontrolltieren wurde eine Salzlösung verabreicht.
9 zeigt die Durchschnittsgewichte der Kontrollmäuse und der mit TEMPOL behandelten Mäuse.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
BEISPIEL 1
Synthese und SOD-ähnliche Aktivität von Oxazolidinabkömmlingen in vitro
Desferrioxamin (DF) war ein Geschenk von Ciba Geigy; Hypoxanthin (HX) wurde von Calbiochem-Boehringer Co. gekauft; 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-Oxyl (TEMPO), 4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-Oxyl (TEMPOL), 4-Hydroxypyrazolo[3,4,-d]-Pyrimidin (Allopurinol), p-Toluolsulfonsäure, 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol, 2-Butanon, und Zyklohexanon wurden von Aldrich Chemical Co. gekauft; Trioxalatochromiat (III) (CrOx) wurde von Pfaltz and Bauer, Inc. gekauft und rekristallisiert; Xanthinoxidase (EC 1.2.3.2. Xanthin: Sauerstoffoxidoreduktase) vom Gütegrad III aus Buttermilch, Superoxiddismutase (SOD), und Ferricytochrom c vom Gütegrad V wurden von Sigma erhalten. H₂O₂ wurde von Fisher Scientific Co. gekauft. XO wurde weiter gereinigt in einer G25-Sephadexsäule. Alle anderen Chemikalien wurden zubereitet und verwendet ohne weitere Reinigung. Destilliertes Wasser wurde während aller Experimente verwendet.
CHD, 2-Spirozyklohexandoxyl (2-Spirozyklohexan-5,5-Dimethyl-3-Oxazolidinoxyl) und OXANO, 2-Ethyl-2,5,5-Trimethyl-3-Oxazolidin-1-Oxyl sowie weitere Nitroxide wurden wie von Keana et al. (J. Am. Chem. Soc., 89, 3055–3056, 1967) beschrieben synthetisiert. Für die allgemeine Synthese der zyklischen Amine wurde das geeignete Startketon einer Rekation unterzogen mit 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol in Benzol in der Anwesenheit von katalytischen Mengen von p-Toluolsulfonsäure. Als die zyklische Struktur gebildet wurde, wurde Wasser eliminiert. Das Volumen an Wasser, welches in einem Dean-und-Stark-Apparat gesammelt wurde, wurde beobachtet und dazu verwendet, den Fortschritt der Reaktion zu kalibrieren. Die so hergestellten Amine wurden gereinigt mittels fraktioneller Destillation unter vermindertem Druck, charakterisiert durch 220 MHz ¹H NMR, IR, UV, und entweder EI- oder CI-Massenspektroskopie, und anschließend in die entsprechenden Nitroxide unter Verwendung von m-Chloroperbenzoesäure oxidiert. Die Nitroxide wurden gereinigt mittels Kieselgelstoßchromatographie (Still et al., J. Org. Chem, 43, 2923–2925, 1978). Wasser/Oktanol-Verhältnisse wurden dadurch ermittelt, daß eine Menge an Nitroxid in Wasser + Oktanol innerhalb eines Scheidetrichters gegeben wurde. Die Mischung wurde gründlich durchgeschüttelt, und es wurde ihr erlaubt, sich während 15 min. zu trennen, wobei glatte Bruchteile aus beiden Fraktionen entfernt wurden und das Verhältnis der Nitroxidverteilung bestimmt wurde unter Verwendung von paramagnetischer Elektronenresonanz-(EPR)-Spektroskopie durch Vergleich der Intensitäten der von N₂ erhaltenen Signale.
Um zu überprüfen, ob Oxazolidinoxylabkömmlinge, die sich von OXANO unterschieden, eine SOD-ähnliche Aktivität aufwiesen, wurden verschiedene Nitroxide mit unterschiedlichen Ringsubstituenten synthetisiert. Tabelle 1A zeigt entsprechende synthetisierte Nitroxide mit den damit einhergehenden physikalischen Parametern.
Tabelle 1A. Fünfgliedriges Oxazolidin-1-Oxyl (Doxyl)
Setzte man diese 5-gliedrigen zyklischen Nitroxide einem durch HX/XO hervorgerufenen Sauerstoffluß aus, so führte dies zu einer Verminderung in ihrem EPR- Signal, wie zuvor für OXANO gefunden (Samuni et al., Free Rad. Biol. Med., 6, 141–148, 1989). Für EPR-Experimente wurden Proben (0,05–0,1 ml) von entweder Lösungen von Chemikalien oder Zellsuspensionen mittels einer Injektionsspritze in eine gasdurchlässige Teflonkapillare mit 0,8 mm innerem Durchmesser gezogen, 0,05 mm Wanddicke (Zeus Industrial Products, Inc., Raritan, NJ). Eine jede Kapillare wurde zweimal gefaltet, in eine enge Quarzröhre eingeschoben, die an beiden Enden geöffnet war (2,5 mm inner Durchmesser), und dann horizontal in die EPR-Kavität gegeben. Während der Experimente wurden Gase mit gewünschten Zusammensetzungen um die Probe geblasen, ohne daß die Anordnung der Röhre innerhalb der EPR-Kavität gestört werden mußte. EPR-Spektren wurden aufgezeichnet in einem Varian-E4-(oder E9) X-Band-Spektrometer, dessen Feld eingestellt war bei 3357 G, einer Modulationsfrequenz von 100 kHz, einer Modulationsamplitude von 1G und einer nicht-sättigenden Mikrowellenleistung. Das EPR-Spektrometer war verbunden mit einem IBM-PC durch einen Analog-Digital-Wandler und einer Datenübersetzungshardware (DT2801), und die Spektren wurden mittels kommerziell verfügbarer Erfassungssoftware digitalisiert, was eine Subtraktion des Hintergrundrauschens ermöglichte. Um die Kinetik des Spinverlustes zu studieren, wurden die Spektren willkürlich übermoduliert, und das magnetische Feld wurde konstant gehalten, während die Intensität des EPR-Signals verfolgt wurde.
Nach Beendigung der HX/XO-Reaktion durch Allopurinol wurde der Nitroxidspinverlust umgekehrt durch Hinzufügen von 0,5 mM Ferricyanid, welches anzeigte, daß O•/2 das Nitroxid zu seinem jeweiligen Hydroxylamin reduziert (Samuni et al., Free Rad. Biol. Med., 6, 141–148, 1989). Andererseits war kein Effekt von 0 Z auf das EPR-Signal von 6-gliedrigen Ringnitroxiden wie zum Beispiel TEMPO und TEMPOL erfaßbar (siehe Tabelle 1B).
Tabelle 1B. Kinetische Daten: SOD-ähnliche Aktivität von 5- und 6-gliedrigen zyklischen Nitroxiden
Die Tatsache, daß Peroxid TEMPO und TEMPOL nicht beeinflußte, legte offensichtlich nahe, daß 6-gliedrige zyklische Nitroxide keine SOD-ähnliche Aktivität aufweisen. Als weitere Überprüfung wurde die Reaktion von typischen Vertretern von sowohl 5- und 6-gliedrigen zyklischen Nitroxiden mit O•/2 studiert. Die SOD-unterdrückende Ferricytochrome c Reduktionsanordnung (Fridovich, Handbook of Methods for Oxyden Radical Research, 213–215, 1985) wurde verwendet, um Ratenkonstanten der Reaktion mit O•/2 zu bestimmten. Peroxidradikale wurden bei 25°C in mit Luft angereichertem Phosphatpuffer (50 mM) erzeugt, welcher 50 μM DTPA enthielt, 5 mM HX und 10–50 μM Ferricytochrom c (mit oder ohne 65 U/ml Katalase). Die Reaktion wurde begonnen durch Hinzufügen von 0,01 U/ml XO, und die Rate der Ferricytochrom c Reduktion, in Abwesenheit (V) und in der Gegenwart (v) für verschiedene Nitroxide, wurde bei 550 nm spektrophotometrisch verfolgt. Sowohl die Vergleichs- als auch die Probenküvetten enthielten alle Reagenzien, wobei die Vergleichsküvette 100 Einheiten/ml SOD enthielt, wodurch fehlerhafte Reaktionen davon abgehalten wurden, mit der Bestimmung der Ratenkonstanten zu kollidieren. Die Daten wurden analysiert durch Auftragen von V/v als Funktion von [Nitroxid], und k₁ wurde berechnet basierend auf der Kenntnis von k_CytC+Peroxid, gemäß: (V/v – 1 = k₁ × [Nitroxid]k_CytC+Peroxid × [Cyt-c^III].
Aufgrund dieser Anordnung wurden alle unten aufgeführten Nitroxide dargestellt als Funktion der Superoxiddismutase-Ersatzstoffe.
Tabelle 2. Physikalische Daten der 2-substituierten 5,5-Dimethyl-3-Oxazolidine.
Die Ratenkonstanten der Reaktion der synthetischen Nitroxide mit O₂ bei niedriger ionischer Stärke (10 mM HEPES) und pH 7,0 reichte von 1,1 × 10³ bis 1,3 × 10⁶ M^–1s^–1, verglichen mit 2,3 × 10⁹ M^–1 s^–1 für k_cat des nativen SOD.
Keines der (in den letzten beiden Tabellen) gezeigten Nitroxide zeigte Cytotoxizität, was ermittelt wurde durch eine klonogene Anordnung in V79-Zellen, die während einer Stunde bei 5 mM exponiert waren. Für anschließende Studien wurde das am meisten lipophile Nitroxid, CHD, und das am meisten hydrophile, TEMPOL, ausgewählt.
BEISPIEL 2
Intrazelluläre Lokalisierung von Nitroxid.
1A und C veranschaulichen das EPR-Signal aus 1 mM CHD bzw. TEMPOL, die mit 6,4 × 10⁷ V79-Zellen/ml suspendiert waren. Dieses EPR- Signal entspricht der Gesamtkonzentration der intra- und extrazellulären CHD. Trioxalato-Chromiat ist ein paramagnetisches Verbreiterungsmittel, welches aus dem intrazellulären Volumenraum ausgeschlossen bleibt, und dafür sorgt, daß das EPR-Signal von extrazellulären Molekülsorten nicht erfaßbar wird (Lai, Biophys. J., 52, 625–628, 1987). Werden Zellen zu CHD oder TEMPOL in der Gegenwart von 110 mM Trioxalato-Chromiat hinzugefügt, so wurde ein viel kleineres aber dennoch beobachtbares intrazelluläres Signal erfaßt, wie in 1B und D gezeigt. Diese beobachtbare Linienverbreiterung und der Verlust der Hyperfeinstruktur des intrazellulären Signals zeigen an, daß CHD, jedoch nicht das TEMPOL, einen eingeschränkten Freiheitsgrad hinsichtlich der Bewegung (Anisotropie) innerhalb der intrazellulären Umgebung aufweist und hauptsächlich in einer membranen Umhüllung lokalisiert ist, wie man aufgrund der Unterschiede in ihren Lipophilicitäten erwarten kann.
BEISPIEL 3
Schutz der Zellen gegen oxidative Beschädigung
V79-Zellen eines chinesischen Hamsters wurden in einem F12 Medium gezüchtet, welches ergänzt war mit 10%-igem Kalbsfötenserum, Penicillin und Streptomycin. In allen Studien wurde das Überleben der klonogenen Anordnung erreicht. Der Bedeckungswirkungsgradbereich lag zwischen 80–90%. Vorratskulturen von exponentiell wachsenden Zellen wurden trypsiniert, gespült und plattiert (5 × 10⁵ Zellen/Schale) in eine Anzahl von 100 mm Petrischalen und vor den experimentellen Protokollen bei 37°C während 16 h in einem Brutkasten gebrütet. Die Zellen wurden während einer Stunde bei 37°C entweder 0,5 mM Hypoxanthin (HX) + 0,05 U/ml von Xanthinoxidase (XO) während unterschiedlicher Zeitdauern ausgesetzt, oder H₂O₂ bei unterschiedlichen Konzentrationen. Um eine mögliche Schwankung in der Cytotoxizität zu erzielen, wurden Katalase, 100 U/ml; SOD, 100 μg/ml; DF; 500 μM; und 5 mM von einem jeden der Nitroxide aus Tabelle 1 parallelen Kulturen hinzugefügt. CHD wurde vorbereitet in einer Vorratslösung in Ethanol und in einem Medium verdünnt, so daß die Endkonzentration 5 mM betrug. Dies führte zu einer endgültigen Konzentration von 1% Ethanol im Medium, welche nicht cytotoxisch war und die zelluläre Antwort auf HX/XO oder H₂O₂ nicht beeinflußte. TEMPOL ist wasserlöslich und wurde direkt in einem Gewebekulturmedium hergestellt. Weder Katalase, SOD, DF, CHD noch TEMPOL waren für sich bei den verwendeten Konzentrationen cytotoxisch. DF wurde entweder 2 h vor oder während der Behandlung hinzugefügt, während die anderen Wirkstoffe nur während der HX/XO- oder H₂O₂-Behandlung vorlagen. Nach der Behandlung wurden die Zellen gespült, trypsiniert, gezählt und zur makroskopischen Kolonnenbildung plattiert. Für die Bestimmung einer jeden Dosis wurden Zellen dreifach plattiert, und die Experimente wurden zumindest zweimal wiederholt. Die Platten wurden während 7 Tagen ausgebrütet, danach wurden Kolonien mittels Methanol/Essigsäure fixiert, mit Kristallviolett eingefärbt und gezählt. Kolonien, die mehr als 50 Zellen zählten, wurden gewertet. Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung des Mittelwerts und sind gezeigt, wenn sie größer sind als das Symbol.
Einige Studien verlangten eine Exposition gegenüber H₂O₂ unter sauerstoffarmen Bedingungen. Für diese Studien wurden Zellen in 1,8 ml eines Mediums dispergiert und in speziell entwickelten Glaskolben (Russo et al., Radiat. Res., 103, 232–239, 1985) plattiert. Die Kolben wurden mit weichen Gummistopfen versiegelt, und 19 Eichnadeln wurden hindurchgedrückt, um als Eingangs- und Ausgangsöffnungen für eine angefeuchtete Gasmischung von 95 Stickstoff/5% CO₂ (Matheson Gas Products) zu dienen. Ein jeder Kolben war auch versehen mit einem aus Mattglas gebildeten Seitenarmgefäß, welches dann rotiert sowie invertiert wurde, und welches 0,2 ml H₂O₂ enthaltendes Medium liefern konnte bei einer Konzentration, die, wenn sie der Zellmonoschicht hinzugefügt wurde, letztendlich zu einer Konzentration von H₂O₂ bei 600 μM führte. Mit Stopfen versehene Kolben wurden in Reihe miteinander verbunden und auf eine sich hin und her bewegende Plattform aufgesetzt und bei 37 °C während 45 Min. ausgegast. Diese Ausgasung führte zu einem Gleichgewicht zwischen Gas und der flüssigen Phase (sowohl in dem Medium über der Zellmonoschicht als auch in der Lösung im Seitenarm) und führte zu Sauerstoffkonzentrationen in der flüchtigen Gasphase von < 10 ppm, wie sie mittels einer Thermox-Sonde (Russo et al., Radiat. Res., 103, 232–239, 1985) beschrieben wurde. Nach 45 min. Ausgasung wurde die sauerstoffarme H₂O₂-Lösung zu der Zellmonoschichtkultur hinzugefügt. Die Zellen wurden H₂O₂ während einer Stunde unter sauerstoffarmen Bedingungen ausgesetzt. Der N₂-Gasfluß wurde während der Zeit der H₂O₂ Exposition beibehalten. In parallelen Kolben wurden DF und CHD wie oben beschrieben hinzugefügt und lagen während der gesamten Ausgasungsprozedur vor. Nach der Behandlung wurde das Überleben der Zellen wie oben beschrieben überprüft.
Wasserstoffperoxid wurde in einer Anordnung untersucht unter Verwendung eines YSI Model 27 Industrieanalysators (Yellow Springs Instruments), welcher mit einer für H₂O₂ selektiven Elektrode versehen war. Zur Analyse der zellulären Präparate wurden die Zellen außer der kurzen Zeit, die benötigt wurde zur Entfernung der gleichen Bruchteile für Analysezwecke, in T25-Zuchtkolben bei 37°C in einem kompletten Medium (pH 7,2) gehalten. Gleiche Bruchteile von 25 μl wurden aus der Reaktion oder dem Zellenpräparationssystem zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und in den Analysator eingegeben. [H₂O₂] wurde bestimmt, nachdem das Instrument kalibriert worden war mit bekannten Konzentrationen von H₂O₂. Die Konzentrationen von Standard-H₂O₂-Lösungen wurden kalibriert unter Verwendung einer iodometrischen Anordnung (Hochanadel, J. Phys. Chem., 56, 587–594, 1952).
Um die Zellen einem oxidativen Stress auszusetzen, wurden sie mit HX/XO ausgebrütet. 2 zeigt eine Überlebenskurve für Zellen, die HX/XO ausgesetzt waren. Das Überleben der Zellen wurde nicht verändert, wenn SOD anwesend war während der Exposition gegenüber HX/XO. Im Gegensatz hierzu schützten 5 mM CHD oder TEMPOL die Zellen vollständig. Die anderen Nitroxide, die in Tabelle 1 dargestellt sind, boten einen ähnlichen Schutz (Daten nicht gezeigt). 2 zeigt auch, daß entweder Katalase oder DF einen vollständigen Schutz vor einem durch HX/XO abgeleiteten Schaden bieten. Ein vollständiger Schutz durch DF erforderte ein 2-stündiges Vorbrüten mit DF, bevor die Zellen HX/XO ausgesetzt wurden, wohingegen eine DF Hinzufügung gleichzeitig mit HX/XO nur teilweisen Schutz bot (Daten nicht gezeigt).
Eine Interpretation der in 2 gezeigten Daten besteht darin, daß H₂O₂ die hauptsächliche cytotoxische Molekülsorte ist, die durch das HX/XO-System produziert wird (Link & Riley, Biochem. J., 249, 391–399, 1988). Diese Annahme basiert auf der Tatsache, daß extrazelluläre Katalase einen vollständigen Schutz vor HX/XO bot (2). Um zu testen, ob ein Schutz der Zellen durch die SOD-Nachahmungen aus der Entgiftung von H₂O₂ resultierte, wurden die Zellen H₂O₂, wie in 3 gezeigt. Die Ergebnisse dieser Experimente waren nicht identisch mit den in 2 gezeigten, insoweit als SOD nicht schützte, aber Katalase, DF, TEMPOL und CHD einen vollständigen Schutz gegen H₂O₂-Cytotoxizität boten. An diesem Punkt wurde die Frage gestellt, ob CHD weitere Eigenschaften aufweisen könnte, außer, daß es als SOD-Nachahmung diente, insbesondere, ob CHD die H₂O₂-Konzentration beeinflußt. 4 zeigt die Konzentration von H₂O₂ in einer HX/XO ausgesetzten Gewebekultur. Im Lauf der Zeit ergab sich ein Aufbau, gefolgt von einem langsamen Abklingen im H₂O₂. Die Gegenwart von CHD änderte das Muster der H₂O₂-Erzeugung durch HX/XO nicht wesentlich.
Somit konnte der zelluläre Schutz, welcher durch CHD gegenüber HX/XO und H₂O₂ geboten wurde, nicht auf eine direkte Reaktion des CHD mit H₂O₂ zurückgeführt werden.
Selbst mit der direkten Exposition der Zellen gegenüber H₂O₂ besteht die Möglichkeit, daß Peroxid intrazellulär erzeugt werden konnte als ein Ergebnis der H₂O₂-Behandlung. Falls Peroxid intrazellulär hergestellt wurde, war ein CHD-Schutz der Zellen vor HX/XO und H₂O₂ zu erwarten, basierend auf den Ergebnissen, daß CHD die intrazellulären Räume wie in 1 gezeigt durchdringen kann. Um zu testen, ob der von CHD gebotene Zellschutz lediglich ein Ergebnis seiner Reaktion mit Peroxid war, wurde die Wirksamkeit von CHD untersucht, wenn H₂O₂ auf Zellen gegeben wurde, die in einer Sauerstoffmangelumgebung ausgebrütet waren, Bedingungen, unter denen die Wahrscheinlichkeit zur Bildung von Peroxid wesentlich eingeschränkt sein würde. Wie aus 5 ersichtlich, schützt CHD gegen H₂O₂-Cytotoxizität selbst unter den Bedingungen von Sauerstoffmangel.
5 zeigt auch, daß DF einen kompletten Schutz gegen H₂O₂-Cytotoxizität unter Bedingungen des Sauerstoffmangels bereitstellt. Das Muster des in den 2, 3 und 5 gezeigten DF-Schutzes legt nahe, daß die Cytotoxizität von HX/XO und H₂O₂ direkt die intrazelluläre Reduktion des H₂O₂ durch eisenhaltige Ionen beinhalten kann, um das hochgiftige •OH zu erzeugen. Es stellte sich auch die Frage, ob der aerobe Schutz und der Schutz unter Sauerstoffmangel durch CHD gegen H₂O₂-Exposition das Ergebnis der Tatsache war, daß CDH direkt Elektronen von eisenhaltigen Ionen akzeptiert, wodurch die Erzeugung von •OH verhindert wird. Da das zelluläre Eisen chelatiert wird, wurde die mögliche Rekation von Nitroxid mit chelatiertem Eisen(II) untersucht durch Wiederholen des Experiments in der Gegenwart von DNA. Um die Möglichkeit einer Nitroxid-ausgelösten Oxidation von Übergangsmetallen zu studieren, wurde CHD unter Sauerstoffmangel mit Eisen(II) in der Gegenwart von 0,1 mg/ml Lachs-DNA gemischt. Anschließend wurde DNA-Fe(III) gebildet und das EPR-Signal des Nitroxids verschwand. Die Reaktionskinetik wurde untersucht durch Bereithalten von entweder CHD oder Fe(II) im Überschuß, während die Absorption aufgrund des DNA-Fe(III) und der Nitroxid-Spinverlust jeweils überwacht wurden (6). Sowohl der Abfall des EPR-Signals als auch das Auftreten der OD_353nm folgten einer Kinetik einer pseudoersten Ordnung, aus welcher die Reaktionsratenkonstante zweiter Ordnung berechnet wurde zu 44 M^–1s^–1 oder 33 M^–1s^–1, unter Verwendung der Daten aus der EPR oder mittels optischer Absorption. Wurde TEMPOL oder Sauerstoffmangel mit DNA-Fe(II) vermischt, so fand eine ähnliche Reaktion statt mit einer Reaktionsratenkonstante zweiter Ordnung von 40 M^–1s^–1. Der Spinverlust wurde komplett umgekehrt durch Hinzufügen von 2 mM Ferricyanid, was anzeigte, daß DNA-Fe(II) das jeweilige Nitroxid in sein Hydroxylamin reduzierte.
BEISPIEL 4
In-Vitro- und In-Vivo-Schutz gegen ionisierende Strahlung durch Nitroxid.
V79-Zellen eines chinesischen Hamsters wurden mit variierenden Konzentrationen von TEMPOL 10 min. vor einer Bestrahlung behandelt. Das klonogene Überlebensverhalten im Vergleich zu Kontrollzellen ist in 7 gezeigt. Das Ausmaß des Schutzes für 100 mM TEMPOL betrug ungefähr das 2,5-fache.
Der durch TEMPOL für ganze Tiere gezeigte Schutz wurde bei 6 Wochen alten weiblichen C3H-Mäusen bewertet, denen 275 mg/kg TEMPOL intraperitoneal 10 min. vor der Applizierung von Ganzkörperbestrahlungsdosen im Bereich zwischen 3 Gy bis 13 Gy verabreicht wurden. Kontrolltieren wurde Salzlösung verabreicht. Es wurde das Überleben 30 Tage nach der Exposition gegenüber der Strahlung aufgezeichnet. LD₅₀₍₃₀₎ bezieht sich auf die Strahlungsdosis, bei welcher 50 % der Mäuse 30 Tage nach der Bestrahlung überlebten. Wie aus 8 ersichtlich, hatten mit TEMPOL behandelte Mäuse einen um ungefähr 25 % höheren Wert für LD₅₀₍₃₀₎, was den Schutz vor Gesamtkörperbestrahlung sowie das Fehlen von Giftigkeit zeigt.
Die oben genannten Ergebnisse zeigen, daß TEMPOL einen Strahlungsschutz sowohl in der In-Vitro- als auch in der In-Vivo-Situation zeigt.
BEISPIEL 5
Nitroxid-verursachter Gewichtsverlust in Tieren.
Sechs Wochen alten weiblichen C3H-Mäusen (6 Tiere in jeder Gruppe) wurde gestattet, eine unbeschränkte Menge an Wasser alleine (Kontrollgruppe) oder 4-Hydroxy-Tempo (TEMPOL), gelöst in Wasser bei einer Konzentration von 10 mg pro ml, zu trinken. Eine fortdauernde orale Verabreichung (> 3 Wochen) führte zu keiner offensichtlichen Toxizität für die Tiere, aber zu einer Verringerung des Gewichts im Vergleich zu den Kontrolltieren um 12,5%, wie in 9 gezeigt. Somit scheint Nitroxid, welches über längere Zeiträume gegeben wird, zu einem Gewichtsverlust in Tieren zu führen.
Es ist offensichtlich, daß die so beschriebene Erfindung auf vielfältige Weise abgewandelt werden kann. Solche Abwandlungen sind nicht aufzufassen als Abkehr vom Geist und Schutzbereich der Erfindung, und all solche für den Fachmann als offensichtlich anzusehenden Abwandlungen sollen innerhalb des Schutzbereichs der nachfolgenden Ansprüche liegen.

Claims

Verwendung eines metallunabhängigen Nitroxids oder einer Oxazolidinverbindung, welche in der Lage ist, ein Oxazolidin-Oxyl zu bilden, oder eines physiologisch akzeptierbaren Salzes hiervon, zur Herstellung eines Medikaments zum Schutze eines Patienten vor den Effekten ionisierender Strahlung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Formel R₃-NR₄R₅ hat; dabei gilt R₃ ist -O• oder -OH und entweder ist NR₄R₅ eine heterozyklische Gruppe oder R₄ und R₅ selber umfassen eine substituierte oder nicht substituierte zyklische oder heterozyklische Gruppe.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Formel
hat; dabei gilt: entweder R₁ ist -CH₃ und R₂ ist -C₂H₅, -C₃H₇, C₄H₉, -C₅H₁₁, -C₆H₁₃, -CH₂-CH(CH₃)₂, -CHCH₃C₂H₅ oder -(CH₂)₇-CH₃ oder R₁ und R₂ bilden zusammen Spyrozyklopentan, Spyrozyklohexan, Spyrozykloheptan, Spyrozyklooktan, 5-Cholestan oder Norboran; und R₃ ist -O• oder -OH; oder ein physiologisch akzeptierbares Salz hiervon.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung 4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpyperidin-1-Oxyl ist.
Verwendung einer Verbindung, wie sie in Anspruch 1 oder 3 definiert ist, bevorzugterweise in ihrer oxidierten Form, zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln der Effekte von oxidavitem Stress, wobei der oxidavite Stress auf Oxidationsmitteln beruht, Sauerstofftherapie, Sauerstoffbehandlung bei Überatmosphärendruck, karzinogenen, chemotherapeutischen oder mutagenen Verbindungen.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Verbindung so wie in Anspruch 3 definiert ist; dabei gilt: R₃ ist -O•.
Verwendung einer Verbindung wie in Anspruch 2 oder 4 definiert, bevorzugterweise in ihrer oxidierten Form, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Effekte von oxidativem Stress, wobei der oxidative Stress auf Oxidationsmitteln beruht, Sauerstofftherapie oder Sauerstoffbehandlung bei Überatmosphärendruck.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Verbindung wie in Anspruch 2 definiert ist; dabei gilt: R₃ ist -O•.
Verfahren zur Verlängerung der Lagerdauer von menschlichen oder tierischen Zellen, Geweben oder Organen, welches umfaßt, daß die Zellen, Gewebe oder Organe mit einer Lösung einer Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert in Kontakt gebracht werden.