DE60027319T2

DE60027319T2 - Pyruvatesterzusammenstellung und verwendungsmethode zur wiederbelebung nach ischemie- und reperfusionsvorfällen

Info

Publication number: DE60027319T2
Application number: DE60027319T
Authority: DE
Inventors: M. Alfred Brookline AJAMI; A. Carrie Boston SIMS; P. Mitchell Pittsburgh FINK
Original assignee: Xanthus Life Sciences Inc Canada; Beth Israel Deaconess Medical Center Inc; Beth Israel Hospital Association
Current assignee: Xanthus Life Sciences Inc Canada; Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2020-10-07
Also published as: JP2003510357A; EP1233767B1; CN1377266A; AU773407B2; CA2386461A1; EP1233767A1; WO2001024793A1; DE60027319D1; AU8000500A; EP1233767A4; ATE322897T1

Description

Die Erfindung betrifft verschiedene neue Pyruvatverbindungen und Verfahren zur Wiederbelebung und Reanimation von Säugetieren, insbesondere Menschen, vor, während oder nach z.B. (1) mesenterischer Ischämie, mesenterischem Thrombus oder mesenterischem Venenverschluss, (2) Beseitigung eines Aorta-Aneurysmas, Bypass-Operation einer Koronararterie oder einer operativen Behandlung von Arterienverschluss der Extremitäten, (3) hämorrhagischem Schock als Ergebnis entweder einer Penetration oder Aufprallverletzung und (4) Konservierung und Transplantation von Organen. Ischämie wird hierbei definiert als Unterbrechung der Sauerstoffzufuhr über das Blut zu einem Organ oder einem Teil eines Organs. Beispiele von ischämischen Vorfällen beinhalten (i) Myokardial-, Cerebral- oder Intestinalinfarkt als Folge der Verstopfung eines Zweigs einer koronaren, cerebralen oder mesenterische Arterie und (ii) Entfernung und Lagerung eines Organs vor der Transplantation. Im Fall eines Myokardialinfarktes ist die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses zum ischämischen Myokardium, d.h. koronare Reperfusion, die Schlüsselkomponente der Behandlung. Dies kommt daher, da die Sterblichkeit direkt mit der Infarktgröße (abgestorbenem Gewebe) verknüpft ist, was mit der Stärke und Dauer des ischämischen Vorfalles zusammenhängt. Die Konsequenzen eines hämorrhagischen Schocks sind ähnlich zu denen einer Ischämie, obwohl das auslösende Ereignis nicht eine Unterbrechung des Blutflusses ist, sondern eher das Ereignis eines massiven Blutverlusts selbst, der einen Mangel an Sauerstoffversorgung verursacht.
Trotz der Notwendigkeit, ein von der normalen Blutzufuhr abgeschnittenes Organ mit Sauerstoff zu versorgen, wurde gefunden, dass bei Wiederherstellung des Blutflusses Reperfusionsverletzung auftreten kann. Dies resultiert aus der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), nämlich Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikalen und Superoxidradikalen unter anderen, die sowohl aus extrazellulären als auch intrazellulären Quellen gebildet werden. ROS sind hochreaktive Spezies, die unter normalen Bedingungen durch endogene Abwehrmechanismen abgefangen werden. Jedoch wechselwirken ROS unter Bedingungen von postischämischem oxidativem Stress mit einer Vielzahl von zellulären Bestandteilen, was Peroxidierung von Lipiden, Denaturierung von Proteinen und interstitielle Gewebezerstörung verursacht und in einer Erhöhung der Membrandurchlässigkeit und Freisetzung von Gewebeenzymen resultiert.
In einem Versuch, diese unerwünschten Nebenwirkungen der Perfusion bei der Behandlung von Ischämie und auch von Schock zu minimieren, haben Forscher die Anwendbarkeit von verschiedenen Antioxidantien im Reperfusionsprozess gezeigt.
Banda et al. (1996), zusammen mit Kurose et al. (1997), schlugen die Verwendung eines Inhibitors für die ROS-Herstellung vor, um das reperfusierte Myokardium zu schützen und die Verwendung von Mitteln und Inhibitoren, welche die ROS-Mengen reduzieren. In einem ähnlichen Zusammenhang haben Forscher bei dem Wunsch, eine wirksamere Wiederbelebung zur Verfügung zu stellen, die zusätzliche Nützlichkeit des Einbringens eines Antioxidanzes und eines vorteilhaften metabolischen Brennstoffes in die Reperfusionsbehandlung gezeigt. Salahudeen et al. (1991) verwenden Lösungen von Pyruvat, einem ROS-Fänger und einem metabolisch wichtigen Vorläuferbrennstoff für die Glukoneogenese, um gegen Wasserstoffperoxid verursachtes akutes Nierenversagen zu schützen. Cicalese et al. (1996) fanden, dass eine Vorbehandlung mit intraluminalem Pyruvat postischämische Dünndarmverletzung verbessert, während Crestanello et al. (1998), DeBoer et al. (1993) und O'Donell-Tormey et al. (1987) diesen Befund durch Untersuchung der verbessernden Effekte von sowohl endogen ausgeschiedenem Pyruvat als auch exogen zugefügtem Material bei der Reperfusion und nachfolgender Funktion von Organ- und Gewebepräparationen, die ischämischem und simuliertem Schock ausgesetzt waren, bestätigt haben. Varma et al. (1998) haben ähnlich gezeigt, dass in einem kultivierten Linsensystem nach der Aussetzung der kultivierten Linse gegenüber einem freien Radikaloxidationsstress Pyruvat und seine Ester gewisse Cyto-schützende und stärkende Effekte haben.
In einer weiteren Bemühung, die auf den Schutz von reperfusiertem Herzgewebe gerichtet ist, offenbart US-Patent Nr. 5,075,210 ein Verfahren für die Reperfusion eines Herzens für die Transplantation. Das Patent offenbart eine kardioplegische Lösung, enthaltend Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumbikarbonat, Natrium-EDTA, Magnesiumchlorid, Natriumpyruvat und ein Protein.
US-Patent Nr. 5,294,641 ist gerichtet auf die Verwendung von Pyruvat, um die nachteiligen Effekte von Ischämie zu verhindern. Das Pyruvat wird vor einem chirurgischen Eingriff verabreicht, um die kardiale Arbeitsleistung eines Patienten und das Herzschlagvolumen zu erhöhen. Das Pyruvat wird als ein Calcium- oder Natriumsalz verabreicht. Das Pyruvat kann alternativ ein Amid von Brenztraubensäure sein, wie z.B. Ethylaminopyruvat. Ähnlich offenbart US-Patent Nr. 5,508,308 die Verwendung von Pyruvylglycin, um Reperfusionsverletzung folgend auf Myokardialinfarkt zu behandeln.
US-Patent Nr. 4,988,515 und 5,705,210 verwenden Pyruvatsalze in kardioplegischen Lösungen und in Konservierungslösungen für das Herz vor der Transplantation. US-Patent Nr. 4,970,143 offenbart die Verwendung von Acetoacetat für die Konservierung von Lebergewebe, einschließlich der Zugabe des Pyruvats zu der Konservierungslösung.
US-Patent Nr. 5,100,677 offenbart die Zusammensetzung von verschiedenen parenteralen Lösungen. Interessant ist ein Vorschlag, Pyruvatanionen (anscheinend von Metallsalzen) in intravenöse Lösungen einzubringen.
US-Patent Nr. 5,798,388 beschreibt weiterhin die Verwendung von Pyruvatsalzen und von verschiedenen Komplexderivaten, wie z.B. Amiden, für die Behandlung von ROS in Zusammenhang mit Atemwegsentzündungengas Patent offenbart eine Pyruvatverbindung in der Form einer covalent gebundenen Pyruvoyl-Aminosäure. Durch Verwendung dieser Art eines Pyruvat-liefernden Systems wird der negative Effekt von Pyruvatsalz vermieden. Jedoch kann die Verabreichung von großen Mengen von Pyruvat-Aminosäure in einer Stickstoffüberbeladung resultieren, welche Patienten mit Leber- und Nierenpathologie verletzen.
In einem ähnlichen Zusammenhang und basierend auf einer ähnlichen Argumentation für die Pyruvatabgabe betreffen US-Patent Nr. 5,876,916 und WO97/34856 die Verwendbarkeit von Pyruvatthiolestern und -polyolestern für die Behandlung oder Vorbeugung von Reperfusionsverletzung, folgend auf Ischämie, diabetische Wirkungen, Cholesterinspiegel, verletzte Organe, Ethanolvergiftung, oder als ein Lebensmittel, und US-Patent Nrn. 5,633,285, 5,648,380, 5,652,274 und 5,685,957 offenbaren verschiedene Zusammensetzungen, Salze, Vorpharmaka und Derivate von Pyruvat in Mischungen mit anderen Oxidantien, Fettsäuren als antientzündliche und immunostimmulierende Wundheilungszusammensetzungen. Jedoch erfordert die Verabreichung von großen Mengen komplexer Pyruvat-Aminosäure und anderen Vorpharmaka-Derivaten enzymatische Hydrolyse vor der Freisetzung ihrer antioxidativen Effekte und kann in Stickstoff- und/oder anderer xenobiotischer Überlastung resultieren, was Patienten direkt verletzen, mit normalem Entgiftungsprozess wechselwirken oder toxische Effekte durch Nebenprodukte mit geringer Lebensdauer verursachen kann.
Trotz der Akzeptanz von Pyruvat als ein wirksamer Bestandteil einer Reperfusionslösung oder anderen unterschiedlichen Anwendungen ist Brenztraubensäure eine starke und instabile Säure, die nicht als solche infundiert werden kann. Beim Stehen in Lösung sind Brenztraubensäure und ihre Salze bei verschiedenen pH-Werten, einschließlich physiologischem Bereich, dafür bekannt, sowohl ein stabiles Hydrat als auch ein Dimer (Parapyruvat) zu bilden, von denen keines mit ROS als ein Antioxidanz reagiert und von denen beide als Inhibitoren für die Pyruvatverwendung als ein metabolischer Brettstoffbekannt sind, wobei jegliche vorteilhafte Wirkungen, die aus der Pyruvatverabreichung in Zusammenhang mit den gerade beschriebenem Stand der Technik angefallen sein könnten, aufgehoben werden.
Weiterhin wurde festgestellt, dass traditionelle pharmakologische Pyruvatverbindungen, wie z.B. Salze von Brenztraubensäure, physiologisch nicht besonders geeignet sind. Zum Beispiel führen diese Verbindungen zur Ansammlung von großen Konzentrationen von Ionen (z.B. Calcium oder Natrium) in den Körperflüssigkeiten des Patienten. Ähnlich können Aminosäureverbindungen, welche Pyruvat enthalten, zu übermäßigen Stickstoffbelastungen führen. Es wurde auch vorgeschlagen, Pyruvylglycin zu infundieren, dessen Amidfunktion vermutlich in Plasma und/oder Geweben hydrolysiert wird, wobei Pyruvat freigesetzt wird.
Jedoch kann bei den hohen Mengen an erforderlicher Pyruvoylglycininfusion, um 1 mM Pyruvat im Plasma zu erreichen, die Glycinbelastung schädlich für Patienten sein, die an hepatischen oder Nierenpathologien leiden. Auch kann ein Fluten von Plasma mit Glycin mit dem Transport von einigen Aminosäuren über die Bluthirnschranke hinweg wechselwirken. Demzufolge sind diese Pyruvatverbindungen, während sie möglicherweise für Organkonservierungen geeignet sind, weniger geeignet für die Behandlung eines Organs in vivo, und es wird festgestellt, dass eine Notwendigkeit existiert, eine Pyruvat-liefernde Verbindung zur Verfügung zu stellen, die physiologisch besser akzeptabel ist.
Es ist ebenfalls eine anerkannte Notwendigkeit, ein Pyruvatliefersystem zur Verfügung zu stellen, das kosteneffektiv ist, einfach und frei von Möglichkeiten der Kontaminierung auf Grund von (1) eingeschränkter Lebensdauer, (2) Komplexität der Formulierung, (3) Reaktivität und Co-Reaktivität mit Arzneiträgern und anderen Formulierungsmaterialien, (4) nachteiliger biochemischer Reaktivität während Transport, Translokation und Aufnahme in Gewebe, sowie (5) dem Erfordernis der metabolischen Aktivierung über enzymatische Hydrolyse durch Amidasen oder Peptidasen. Daher wäre es wünschenswert, eine alternative, physiologisch kompatible, therapeutische Pyruvatverbindung verfügbar zu haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die hier beschriebene Erfindung stellt eine neue und verbesserte, zugängliche Zusammensetzung für die oben angegebenen Verwendungen zur Verfügung.
In einem Gesichtspunkt ist die Erfindung gerichtet auf eine Zusammensetzung aus einem Alkyl-, Aralkyl-, Alkoxyalkyl- oder Carboxyalkylester von 2-Ketoalkansäure und einem Bestandteil zum Einbringen und Stabilisieren der Enolresonanzform des Esters bei physiologischen pH-Werten, nämlich ein biologisch sicheres, anorganisches, zweiwertiges Kation. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung beinhaltet weiterhin ein pharmazeutisch akzeptables Trägermittel, in welchem die Enolresonanzform des Esters bei physiologischen pH-Werten stabilisiert ist.
Vorzugsweise ist der Ester der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein Alkylester von 2-Ketopropionsäure (Brenztraubensäure), bevorzugt der Ethylester, und die stabilisierende Verbindung ist ein anorganisches zweiwertiges Kation, vorzugsweise Calcium oder Magnesium. Der pharmazeutisch akzeptable Träger in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann jedes Trägermittel sein, das allgemein als sicher für die Verabreichung eines therapeutischen Mittels an ein Säugetier anerkannt ist, z.B. eine Pufferlösung für die Infusion, eine Tablette für orale Verabreichung oder in Gel-, Micell- oder Liposomform für örtliche Verabreichung. Eine bevorzugte Pufferlösung ist isotonische oder hypertonische Salzlösung oder ein Bicarbonat, Phosphat, Plasmaexpander, Mikrokolloid oder mikrokristalline Lösung. Besonders bevorzugt ist eine Ringer-Lösung aus isotonischer Salzlösung, ergänzt mit Kaliumionen. In einem besonders bevorzugten Gesichtspunkt beinhaltet die erfindungsgemäße Zusammensetzung Ethylpyruvat, vermischt mit Calciumion in einer Ringer-Lösung bei einem pH im Bereich von 7 bis 8.
In anderen Gesichtspunkten wird der Esteranteil der 2-Ketoalkansäureester-Verbindung in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorzugsweise ausgewählt, aus der Gruppe bestehend aus Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Carboxymethyl-, Carbethoxymethyl- und Ethoxymethylester. Der 2-Ketoalkansäureanteil wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Ketobutyrat, 2-Ketopentanoat, 2-Keto-3-methylbutyrat, 2-Keto-4-methylpentanoat und 2-Ketohexanoat.
In einem anderen Gesichtspunkt ist die Erfindung gerichtet auf Verfahren zur Behandlung von Verletzungen, Bedingungen oder Beschwerden, die mit solchen Ereignissen wie ischämischen Ereignissen oder Reperfusion in Zusammenhang stehen. Formulierungen, welche die neuen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten, erlauben erfolgreiche Verwendung von 2-Ketoalkansäureestern, z.B. Brenztraubensäureestern, für die Behandlung von z.B. ischämischen Ereignissen, Schock, Organreanimierung, Wiederbelebung und anderen bekannten Pyruvat-wirksamen Behandlungen, da ausreichend hohe Beladungen von Pyruvat ohne einen toxischen Bestandteil verabreicht werden können. Darüber hinaus stellt die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen direkten Ersatz für traditionell laktatisierte Ringer-Lösungen zur Verfügung, vereinfacht durch die Zugabe von co-aktiven Bestandteilen oder komplexen Arzneiträgern, wie z.B. solche, die eine Vielzahl von Verbindungen oder molekularen Derivaten von Pyruvat selbst enthalten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind ebenfalls geeignet bei einem Verfahren für die Konservierung von Organteilen, Organen oder Gliedmaßen, die von einem lebenden Säugetier entfernt werden und einer Konservierung bedürfen, z.B. für spätere Transplantation an einen Organempfänger. Solche Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt, wie z.B. in US-Patent Nr. 5,066,578 beschrieben.
Ein weiterer praktischer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren ist die Formulierung des aktiven 2-Ketoalkansäure-Inhaltstoffes als ein biologisch sicherer, leicht hydrolysierbarer Ester, der in Gewebe und Zellen durch diffusive Prozesse durch Membranen hindurch auf Grund der größeren Lipophilie des genannten Esters gegenüber dem korrespondierenden Salz aufgenommen werden kann, während die Fähigkeit, intrazellulär durch nichtspezifische Esterasen und/oder nichtspezifische, marginal alkalische Solvolyse, katalysiert durch organische Säuren oder Basen, wie z.B. Aminosäurereste, bei physiologischen pH-Werten hydrolysiert zu werden, erhalten bleibt.
Wichtiger ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren 2-Ketoalkansäuren, z.B. Brenztraubensäure, in einer stabilisierten Esterform zur Verfügung stellt, welche reaktive Sauerstoffspezies durch mehr als einen Reaktionsmechanismus deaktiviert und deren Reaktionsprodukte mit reaktivem, hypervalentem Sauerstoff, wie z.B. Wasserstoffperoxid, Abbauprodukte hervorbringt, die selbst metabolische Brennstoffe sind anstelle von potentiell schädlichen Abfallprodukten oder Metaboliten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen, in Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen, offensichtlich, wobei:
1 die Struktur des bevorzugten 2-Ketoalkansäureesters der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zeigt,
2 die Strukturen von gewissen bevorzugten Estern in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zeigt, ihre Enolresonanzstrukturen und die Strukturen von gewissen Verbindungen gemäß Stand der Technik,
3 das System und die berechneten Parameter, die für die Messung der mukosal-zu-serosal intestinalen Permeabilität, welche der Durchführung gemäß erfindungsgemäßen Verfahren folgt, zeigt,
4 die intestinalen Permeabilitätsergebnisse zeigt, die für eine Kontrollzusammensetzung im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erreicht wurden, und
5 die Ergebnisse zeigt, die für mukosale Verletzungsauswertungen für erfindungsgemäße Zusammensetzungen erhalten wurden.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Demzufolge ist eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue und verbesserte Zusammensetzungen aus 2-Ketoalkansäureestern und ihre Verwendung für die Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung eines Säugetieres, das an Ischämie oder an Reperfusionsverletzung leidet, zur Verfügung zu stellen.
Um die zuvor genannten Aufgaben zu erfüllen und in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Zweck, so wie hier ausgeführt und ausführlich beschrieben, weist eine neue erfindungsgemäße Zusammensetzung einen 2-Ketoalkansäureester in Übereinstimmung mit den in 1 gezeigten molekularen Strukturen auf, vermischt mit einer ausreichenden Konzentration eines biologisch sicheren, organischen oder anorganischen Kations, um die Enolisierung der 2-Ketofunktionalität des Esters bei physiologischen pH-Werten hervor zu rufen. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Zusammensetzung einen Alkylester von 2-Ketopropionsäure (Brenztraubensäure), wobei der Ester das Ethylanaloge ist und das Kation ein zweiwertiges Kation, insbesondere entweder Calcium oder Magnesium. In einer besonders bevorzugten Formulierung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist die Esterverbindung Ethylpyruvat, vermischt mit Calciumion, in einer Ringer-Lösung bei einem pH von etwa 7 bis 8.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können oral, topisch oder parenteral (z.B. intranasal, subkutan, intramuskulär, intravenös, intraluminal, intraarteriell, intravaginal, transurethral oder rektal) durch Routineverfahren in pharmazeutisch akzeptablen inerten Trägersubstanzen verabreicht werden. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen in einer verzögernd freisetzenden Formulierung unter Verwendung eines bioabbaubaren biokompatiblen Polymeren verabreicht werden oder durch örtliche Verabreichung unter Verwendung von Micellen, Gelen, Liposomen oder einer Pufferlösung. Das aktive Estermittel in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann als ein Infusat bei einer Konzentration von z.B. 20–200 mM bei einer Geschwindigkeit von vorzugsweise 10–100 mg/kg/hr in einer Pufferlösung, wie hier beschrieben, verabreicht werden. In Pillenform kann das aktive Estermittel in einer Dosierung von z.B. 10–200 mg/kg von 1–4mal täglich verabreicht werden. Das Kation in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung liegt bei einer geeigneten Konzentration, um die Enolisierung der 2-Ketofunktionalität der Menge an aktivem Estermittel in der verabreichten Zusammensetzung hervor zu rufen. Optimale Dosierung und Arten der Verabreichung können durch herkömmliche Protokolle bestimmt werden.
Es wird angenommen, dass Pyruvat und andere 2-Ketoalkansäuren, wenn sie intrazellulär aus den verabreichten Estern freigesetzt werden, z.B. durch das Reanimationsperfusat, als NADH-Falle wirken und als Falle für ROS, welches bei Reperfusion erzeugt wird. Im ersten Fall reagiert eine 2-Ketoalkansäure, um Laktat hervorzubringen, den Überschuss NADH zu oxidieren und dabei gegen den „Reduktionsstress", der durch die physiologische Erkrankung, die durch Hypoxie verursacht wurde, zu schützen. Im letzteren Fall reagiert eine 2-Ketoalkansäure mit hypervalentem Sauerstoff, so wie im Stand der Technik demonstriert, um eine Übergangspersäure zu bilden, welche sich spontan zersetzt, und zwar letztendlich zu Acetat und Kohlendioxid. Das erhaltene Acetat ist ein Abfallprodukt, das durch Wiedereinführung in den AcetylCoA-Pool geborgen wird und biochemisch über intermediären Metabolismus in den Krebszyklus oder durch Glukoneogenese geerntet wird.
Jedoch dient bezeichnenderweise der 2-Ketoalkansäureester selbst dem erfindungsgemäßen Zweck als ein Antioxidans durch einen anderen Mechanismus, nämlich über die Reaktion mit hypervalentem Sauerstoff an der Enol-Methylengruppe. ROS ist ein membranassoziierter Prozess, da hypervalenter Sauerstoff durch eine Redox-Kaskade erzeugt wird, die von Cytochromen in den Mikrosomen oder den Mitochrondrien vermittelt wird. Es ist auch ein intrazellulärer Prozess, der eher in einem lipophilen Umfeld als im Cytosol stattfindet und die thermodynamischen Eigenschaften eines 2-Ketoalkansäureesters sind derart, das seine Reaktivität gegenüber Redox-Reaktion in einer lipophilen Phase mutmaßlich durch das Kationen-vermittelte Ketoenolgleichgewicht favorisiert ist. Ab initio und semi-empirische thermodynamische Analysen an Ethylpyruvat als ein repräsentatives enolisierbares Molekül in der Gegenwart von Calcium werden in größerem Detail als Teil von Beispiel I unten diskutiert.
Zum Beispiel bringt die Verwendung von Pyruvat als die beispielhafte 2-Ketoalkansäure, Bildung von Übergangsepoxiden und nachfolgende Neuanordnung die korrespondierenden hydroxylierten Pyruvatester am 3-Kohlenstoff durch einen ähnlichen Mechanismus zu dem der 3-Hydroxypyruvatbildung in einem Zwischenmetabolismus hervor, sowie auch bei Kohlenstoffzugabe zu den verwandten Phosphorenolpyruvaten. Hydroxylierung von alpha- zu Ketogruppen ist ebenfalls ein bekannter Cytochrom vermittelter Prozess bei Steroidmetabolismus und bei mikrosomaler Hydroxylierung von Arzneien. Die erhaltenen Hydroxypyruvate können dann wiederum, wenn sie zu Carbonsäureanionen solvolysiert sind, noch einmal mit hypervalentem Sauerstoff reagieren, um Hydroxyessigsäure (Glykolsäure) hervorzubringen, wobei das Nettoergebnis derart ist, dass Pyruvatester letztendlich zwei Äquivalente ROS abfangen können, während Pyruvate thermodynamisch auf das Abfangen von lediglich einem beschränkt sind. Wie oben erwähnt, sind 2-Ketoalkansäureester, die sich von Pyruvatestern unterscheiden, ebenfalls für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignet, so lange die aktive Verbindung so wie oben für den Pyruvatester beschrieben metabolisierbar ist.
Die folgenden Beispiele werden vorgestellt, um die Vorteile der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und dem Fachmann dabei zu helfen, dergleichen herzustellen und zu verwenden. Diese Beispiele sind nicht in irgendeiner Art und Weise dazu gedacht, den Umfang der Offenbarung einzuschränken.
Beispiel 1
Thermodynamische Modellierung von Pyruvatestern
Semiempirische Quantenchemie erlaubt die vergleichende Berechnung von verschiedenen Pyruvatanaloga in Bezug auf die Eigenschaften, welche jede Reaktivität der Moleküle bestimmen. Wie man als einen markanten Unterschied im biologischen Effekt von Ethylpyruvat gegenüber Natriumpyruvat als Antioxidans feststellen kann, kann die Hypothese, dass diese beiden Moleküle thermodynamisch unterschiedlich sind, durch Hückel-Molekül-Orbital-Analyse (HMO), gefolgt von vollständiger Vernachlässigung der Differential Overlap Analyse (CNDO) unter Verwendung von Molecular Modeling Pro/MOPAC-Software (ChemSW, Inc. Fairfeild, CA) untersucht werden. Die folgenden Ergebnisse werden für die in 2 gezeigten Strukturen erhalten, nachdem ihre Konformationen durch Energieminimierung auf die optimale Konformation gesetzt wurden:
Tabelle 1 Vergleich von thermodynamischen Eigenschaften
Vom Trend der Minimierungsenergien her sind die niedrigeren und daher die stabileren Konfigurationen jene, die mit den Pyruvatestern assoziiert sind, obwohl die Unterschiede alle in eine Größenordnung fallen. Auf der anderen Seite zeigen die Ester bemerkenswert geringere Dipol-Momente, was ihre relativ schwache Ionisierung und Dissoziationspotentiale widerspiegelt, eine Tatsache, die weiterhin durch die höheren LogP-Werte gestützt wird, die ein Maß für die relative Lipophilie sind. Auch sind die Ester schlechtere Wasserstoffbindungsakzeptoren und bessere Wasserstoffbindungsdonoren, in Übereinstimmung mit ihren dipolaren und lipophilen Eigenschaften.
Demzufolge kann man auf einer thermodynamischen ab initio-Basis vorhersagen, dass Ethylpyruvat und seine vermutlichen Enoltautomeren sich wahrscheinlich zwischen einer polaren wässrigen Phase und einer Lipidphase aufteilen, während Konformationsstabilität in der gleichen Größenordnung wie bei den Pyruvatnatriumsalzen aufrecht erhalten wird. Weiterhin soll bemerkt werden, dass der Koordinationskomplex des Pyruvatenolatesters mit einem divalenten Kation, wie z.B. Calcium, wie in 2 als Struktur 6 gezeigt, die am meisten vorhergesagte Veränderung in den Eigenschaften gegenüber Pyruvat selbst hervorbringt, was die Verwendbarkeit dieser Kation-Enolat-Esterkomplexe als Beschleuniger von bisher nicht bekannten Reaktivitäten der Pyruvatkohlenstoff-Skelettkonformation bestätigt.
Beispiel 2
Reaktivitätsmodellierung von Pyruvatestern
Es wurden Recherchen in den Chemical Abstracts und den ISIS-Datenbanken (MDL Information Systems, Inc.) durchgeführt, um aktuelle Beispiele für die Reaktivität von Pyruvaten und ihren Enolaten aufzudecken. Während zahlreiche Präzedenzen für die Reaktionen von Pyruvatsalzen aufgezeichnet wurden, wurden weitaus weniger Beispiele für die molekularen Wechselwirkungen zwischen Pyruvatestern und hypervalentem Sauerstoff in der organischen und biochemischen Literatur berichtet. Die prinzipiellen Reaktionen von Pyruvaten bei physiologischen pH-Werten sind Hydratbildung (2, Struktur 2) und Dimerisierung zu Para-Pyruvat (2, Struktur 7).
Wie von Margolis et al. (1986) berichtet, bildet Natriumpyruvat bei Konzentrationen von 1 Mol/Liter oder weniger unterschiedliche Mengen des Hydrats und des linearen Dimeren 4-Hydroxy-4-methyl-2-ketoglutarsäure. Das Hydrat kann 6–10% und das Dimer 20–25% erreichen, wenn man 48 Stunden stehen lässt. Dieses Reaktivitätsmuster ist eine wichtige Überlegung bei der Bewertung von Natriumpyruvat-enthaltenden Infudaten und Perfudaten, da das Hydrat gegenüber hypervalentem Sauerstoff unreaktiv ist und das Dimer ein Inhibitor der 2-Ketoglutarat-Dehydrogenase ist, einem mitochondralen Atmungsenzym, sowie ein Inhibitor für Glutamat-Transaminasen und Milchsäure-Dehydrogenase. Im Gegensatz dazu wurde weder Hydratbildung, noch Dimerisierung von Pyruvatestern in der chemischen Literatur berichtet.
Während die Enolformen von Pyruvat im Prinzip thermodynamisch stabil sind, ist ihr Auftreten in wässrigen Medien nicht bevorzugt und die Halbwertszeit von Enolaten sind lediglich im 3–5 Sekundenbereich messbar (Kuo et al. (1979)).
Wenn sich die Polarität des Lösungsmittels erhöht, beispielsweise durch die Lösungsumgebung, die von Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid zur Verfügung gestellt wird, erhöht sich die Halbwertszeit des Enols zumindest um zwei Größenordnungen (Chiang et al. (1993), Peliska et al. (1991), Sawyer et al. (1983)).
Was die Reaktivität gegenüber hypervalentem Sauerstoff betrifft, reagieren sowohl Pyruvatsalze, als auch Pyruvatester durch anfängliche Bildung eines Hydroperoxid-Intermediats an der Carbonylstelle, welches sich durch Disproportionierung reorganisiert, um Essigsäure und Kohlendioxid oder Ethoxycarbonsäure zu ergeben, die nachfolgender wässriger Solvolyse zu Kohlendioxid und Ethanol unterliegt (Constantopoulos et al. (1984), Sawyer et al. (1983), Starostin et al. (1980)).
Jedoch können Enolpyruvate auch über einen alternativen Mechanismus reagieren, der die Addition an die Exomethylengruppe beinhaltet, so wie in dem Fall der Enolpyruvat-C-Bromierung am 3-Kohlenstoff (Sekine et al. (1980)), der Chelation kontrollierten Addition an allylische Verbindungen (Muderawan et al. (1998)) und der biologischen Addition von Kohlendioxid, um Oxaloacetat über Phosphorenolpyruvat-Carboxylase zu bilden (Ausenhus et al. (1992)). Enole von biologischen Ketonen reagieren im Allgemeinen, wie durch D-Ring-Acetylsteroide verdeutlicht, mit aktiviertem Sauerstoff über das Cytochrom-P-450-Oxidasesystem, um Hydroxyketone über ein Übergangs-Exomethylen-Epoxidintermediat zu ergeben (Yamazaki et al. (1997)).
Wenn auf den Grundlagen der thermodynamischen Ähnlichkeit und der chemischen Präzedenz bewertet, kann für Pyruvatsalze über das REACCS-Software-Datenbank-Korrelationssystem vorhergesagt werden, ob sie mit hypervalentem Sauerstoff reagieren, um lediglich Decarboxylierung zu Acetat und Kohlendioxid zu ergeben. Es kann auf der anderen Seite erwartet werden, das Pyruvatester nicht nur die paarigen Decarboxylierungsprodukte Acetat und Alkohol ergeben, sondern auch hydroxylierte Addukte am 3-Kohlenstoff, am wahrscheinlichsten ein 3-Hydroxypyruvat. Diese letzteren Spezies können wiederum mit hypervalentem Sauerstoff reagieren, um Glykolsäure und Kohlendioxid zu ergeben (Perera et al. (1997)), wobei zwei Äquivalente des Oxidationsmittels verbraucht werden.
Beispiel 3
Stabilität und Reaktivität von Pyruvatestern in Lösung
Basierend auf den vorhergehenden Modellingübungen stellen die folgenden aus der Hypothese abgeleiteten Experimente Verifizierung in chemischen und biologischen System zur Verfügung und differenzieren das erfindungsgemäße Verfahren weiter vom Stand der Technik.
Ethylpyruvat ergibt eine stabilere wässrige Lösung als Natriumpyruvat in der Gegenwart von Calciumsalzen (Ringer-Lösung) und diese Beobachtung kann auf die Untersuchung von anderen Pyruvatanalogen ausgedehnt werden, so wie in 1 gezeigt, durch Auflösen von diesen in Ringer-Lösung, die zumindest 0,2 Äquivalente Calcium je molarem Äquivalent Pyruvatanalogen enthält, titriert mit Natriumhydroxid oder einem anderen geeigneten anorganischen Alkali auf physiologische pH-Werte. Insbesondere ist in Tabelle 2 die bevorzugte Ausführungsform dieser „pyruvatisierten" Ringer-Lösung für die Verwendung in NMR, die Stabilität und nachfolgende biologische Studien, gezeigt. Es soll verstanden werden, dass das Pyruvatanaloge im gegenwärtigen Beispiel mit jedem der Analogen, die in 1 gezeigt sind, bei jeder Konzentration die ausreicht, um eine homogene Lösung zu ergeben, verwendet werden kann, oder durch Kontrollsubstanzen für Vergleichszwecke substituiert werden kann, wie z.B. Brenztraubensäure, Milchsäure (so wie im Fall von „milchsaurer" Ringer-Lösung) sowie anderen Referenzen oder inaktiven Ketosäureanalogen. Das Calciumkation kann ebenfalls substituiert werden, z.B. durch Magnesium oder jedes andere biologisch sichere Kation, das dazu fähig ist, Calcium zu substituieren und die Bildung von Übergangskoordinationskomplexen mit Pyruvatesterenolaten in wässriger Lösung zu stabilisieren.
Tabelle 2 Bestandteile von pyruvatisierter Ringers-Lösung
Indem den Verfahrensanforderungen für die Analyse von Margolis et al. (1986) bezüglich der Scanzeiten und Frequenzen bei einem 400 MHz-Spektrometer, das im Puls-Fourier-Transform-Modus arbeitet, gefolgt wird, werden sowohl Protonen- als auch Kohlenstoffshifts der charakteristischen Resonanzen für jeden Kohlenstoff- und Protonencluster im enolisierbaren Kohlenstoff als eine Funktion der Zeit beobachtet und gezeigt, dass ein größerer Anteil von Pyruvatestern eine Neigung zum Enolisieren in Ringer-Lösungen zeigt, insbesondere jene, die Calcium oder Magnesium enthalten, während Pyruvatsäureanionen unter ähnlichen Bedingungen überwiegend Hydrierung und Dimerisierung zeigen. Die Ultraviolettabsorption dieser Lösungen wird ebenfalls periodisch über den 230–260 nm-Bereich und die 300–340 nm-Spanne gemessen, wo sich Änderungen in der Enolbildung auswirken und stellt über die merklich unterschiedlichen Solvatationseigenschaften von Pyruvatesteranalogen in Vergleich zu Pyruvatsalzen, die in den verschiedenen Verfahren gemäß Stand der Technik angewendet wurden, Konformationsbeweis zur Verfügung.
Die experimentelle Abfolge, in welcher die größere Nutzbarkeit der erfindungsgemäßen Pyruvatderivate eingesetzt wird, folgt denselben Richtlinien wie die gerade beschriebenen spektralen Vergleichsexperimente. Die gleichen Lösungen von Testsubstanzen werden verwendet, um Enolisierung und damit zusammenhängende Phänomene zu zeigen und werden auch zum Vergleich von Basiswerten für jeden Pyruvat-Kandidaten verwendet auf die Wirkungen von Oxidationsmitteln auf das Verschwinden von charakteristischen Pyruvatresonanzen und das Auftauchen von Acetat oder anderen Abbaustoffen der anfänglichen Testpräparation als eine Funktion des Aussetzens gegenüber diesen Oxidationsmitteln verwendet.
Zum Beispiel zeigen 1 mMolare Lösungen von Brenztraubensäure und Ethylpyruvat, korrigiert auf den Vergleich, mittlere Absorptionswerte von 0,15 bzw. 0,2 bei 230 bis 260 nm in Abwesenheit von Calcium bei pH 7,2. Zugabe von Calcium hat keinen Effekt auf Pyruvat, das lediglich marginale Erhöhung bei der Absorption auf 0,16 zeigt, während Ethylpyruvat in drei Wiederholungsexperimenten zweifach auf 0,41 steigt, mit einem Variationskoeffizienten von weniger als 15%. Wenn 28 mM Lösungen in ähnlicher Art und Weise bei 300 bis 340 nm untersucht werden, verbleibt die Absorption von Pyruvat vor und nach der Calciumzugabe unverändert bei einem Wert von 0,03, während die Ethylpyruvatlösungen für das unbewaffnete Auge merklich strohfarbig werden und die Absorption von 0,07 auf 0,85 ansteigt. Die Gelbfärbung und Erhöhungen in der spektrophotometrischen Absorption im Ultraviolettbereich bestätigt die Bildung eines 1,3-konjugierten Ketonsystems, das aus der Enolisierung von Ethylpyruvat unter Bedingungen resultiert, welche die Brenztraubensäure nicht zu enolisieren scheinen.
Solche Anwendungen von hypervalenten Sauerstoff-Imitatoren, von denen bekannt ist, dass ihr Redoxpotential ein Modell für ROS ist, wie z.B. Wasserstoffperoxid, Fentons Reagenz und Metachlorperbenzoesäure, werden in den Testlösungen bei Konzentrationen im Bereich von 1 bis 50 mMolar verteilt und ihre Abbauwirkungen notiert. Es wird gezeigt, dass Pyruvatester einen größeren Anteil an Oxidadationsmittel je Mol Äquivalent verbrauchen, als ihre gleichartigen freien Säureanaloga.
Beispiel 4
Stabilität und Reaktivität von Pyruvatestern in Gewebekulturen
Pyruvatester und insbesondere Ethylpyruvat sind in Gegenwart von Calciumionen ausreichend lipophil, um von Zellen mit einer größeren Geschwindigkeit aufgenommen zu werden als äquimolare Mengen von Pyruvat im Zellpäparationperfusat. Darüber hinaus dienen die erfindungsgemäßen Verbindungen als Vorpharmaka für intrazelluläre Pyruvatlieferung und werden daher zum Teil als Antioxidantien durch direkte Decarboxylierung der Pyruvateinheit, die intrazellulär eingebracht wird, verwendet und nach nicht spezifischer Estersolvolyse durch ubiquitäre cytosolische Carboxylesterasen bioverfügbar gemacht. Vor der intrazellulären Hydrolyse können diese Pyruvatester auch vorteilhafterweise über Enol-vermittelte Übergangsepoxydierung, vermittelt durch hypervalenten Sauerstoff und verwandte toxische Oxidationsmittel reagieren, um 3-Hydropyruvate zu bilden.
Die resultierenden Hydroxypyruvatester, insbesondere im Fall von Ethylpyruvat und seinen Analogen, die in 1 aufgezeigt sind, werden dann als ein metabolischer Brennstoff durch anapleurotische Aufnahme nach der Solvolyse aufgenommen oder weiterer decarboxylativer Oxidation durch zusätzliche Äquivalente von reaktiven Sauerstoffspezies unterzogen, um die korrespondierenden Hydroxyacetate (Glyoxalsäuren) zu bilden. Es soll somit verstanden werden, dass Pyruvatester zweimal so viel reaktive Sauerstoffspezies quenschen können wie die nicht enolisierten Formen des korrespondierenden unveresterten Ketosäureanions, d.h. zunächst durch die Bildung von 3-Hydroxypyruvaten und dann durch den späteren decarboxylativen Abbau zu einem kleineren Metaboliten, der wie Acetat leicht in den Zwischenmetabolismus eingebracht werden kann. Diese Ergebnisse, in welchen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen als wirksamere Antioxidantien erweisen, sowie als metabolische Brennstoffe nach Aussetzen gegenüber ROS, können durch Kombinationen aus NMR und spektral(UV)-analytischen Verfahren, die z.B. das Schicksal der stabilen isotopenmarkierten Pyruvat-[3-¹³C]-Spezies unter verschiedenen experimentellen Bedingungen verfolgen, gezeigt werden.
Demzufolge stellen Zellen und Gewebekulturen eine wirksame Möglichkeit zum Vergleich der relativen Geschwindigkeiten der Aufnahme und nachfolgenden Abscheidung von Pyruvatanalogen dar, die in der Kultur oder dem Perfusionsmedium verteilt sind und anschließender Beobachtung der Aufnahme in die Zellen unter Verwendung eines stabilen Isotopenmarkers, der Protonen- und Kohlenstoff-magnetischer Resonanzanalyse in Realzeit zugänglich ist, oder durch Massenspektralanalyse von geeigneten Extrakten der untersuchten Biomasse nach einer geeigneten Zeitdauer der Inkubation oder Perfusion.
Insbesondere da Darmischämie eine der eher zerstörenden Bedingungen ist, bei denen die Pyruvate dafür bekannt sind, Rettung und Wiederbelebung zur Verfügung zu stellen, stellt die Verwendung von enterozytischen Zellkulturen ein geeignetes Testmodell dar. Dieses Modell besteht nach einer Basiszeitdauer unter verschiedenen Bedingungen von Anoxie und dann Hyperoxie aus dem Aussetzen von Enterozyten gegenüber einem Perfusat, welches Ringer-Lösung, ergänzt mit Calcium als Kontrolle enthält, und dann verschiedenen Testzusammensetzungen aus Pyruvaten, einschließlich Natriumpyruvat, alle markiert an der 3-Methylposition mit ¹³C. Für die Kohlenstoff-MR-Experimente werden Zellen auf die Oberfläche von Polystyrolmikroträgerperlen in bakteriologischen Petrischalen gesät und drei Tage lang bis zur Konfluenz wachsen lassen, bevor sie geerntet und spektroskopisch analysiert werden, indem dem Verfahren von Artemov et al. (1998) und den Modellingrubriken von Yu et al. (1997) und von Vogt et al. (1997) gefolgt wird. Die Testperfusate werden während der Untersuchungsperiode zum Zweck der Hintergrundsubtraktion aus der Beschaffung der Kohlenstoffresonanzen, die für den Krebszyklus charakteristisch sind, ebenfalls beobachtet.
Demzufolge kann die Geschwindigkeit des Kohlenstoffflusses von exogen zugegebenem Pyruvat durch das Verfahren der Umsetzung zu Citrat und Ketoglutarat/Glutaminsäure verfolgt werden. Es wird erwartet, dass der 3-Kohlenstoff von Pyruvat und der 2-Kohlenstoff von Acetat, erhalten aus Pyruvat, unterschiedliche Anreicherungen an den 2- gegenüber den 4-Positionen von Citrat und Ketoglutarat zur Verfügung zu stellen. Direkter Einbau des Pyruvatkohlenstoffskeletts in Citrat und Ketoglutarat sollte sich in einem schnelleren Anstieg der Markierung an der 2-Position gegenüber der 4-Position ausdrücken, da es bei der letzteren wahrscheinlicher ist, dass sie durch den großen Acetat-Acetyl-CoA-Pool verdünnt wird.
Wenn Hydroxypyruvat in der Reaktion gebildet wird, kann nicht nur die Methylgruppenresonanz direkt bestimmt werden, sondern die nachfolgende Verwendung von Hydroxypyruvat über Decarboxylierung zu Glyoxylat und Homologisierung zu Maleat kann ebenfalls durch das gleiche Schema der differentiellen Markierungsanalyse verfolgt werden. Experimente dieser Art bestätigen, dass Pyruvatester unterschiedlich gegenüber Pyruvatsalzen als Kohlenstoffquelle wirken. Weiterhin bestätigen solche Experimente, dass Laktat, Acetoacetat und verwandte Ester, wenn sie Pyruvatester substituieren, keine Enolisierung zeigen und nicht in Zellen eingebaut werden und/oder über oxidativen Metabolismus in einer ähnlichen Art und Weise und zu einem Ausmaß wie die verwendeten Pyruvatester gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verarbeitet werden.
Beispiel 5
Anwendung der Erfindung in der Ischämierettung
Die Verwendbarkeit von Ethylpyruvat in einem Ringer-Lösungs-Infusat als eine Wiederbelebungsflüssigkeit bei Ischämie/mukosaler Reperfusionsverletzung und Barriere-Dysfunktion wird in diesem anschaulichen Experiment unter Verwendung eines Rattenmodels mit oberem Mesenterialarterienverschluss gezeigt. Das Modelsystem und die Berechnungsparameter sind in 3 veranschaulicht.
Nach Einleiten einer allgemeinen Anästhesie unter Verwendung von intraperitonealem Ketamin und Pentobarbital werden männliche Sprague-Dawley-Ratten (250–350 g) einem 60-minütigen oberen Mesenterialarterienverschluss, gefolgt von 60-minütiger Reperfusion unterzogen. Herzschlag und Hauptarterienblutdruck werden über einen rechten Halsschlagader-Katheter gemessen. Die linke innere Halsvene wird zur intravenösen Infusion kanüliert.
Die Kontrolle (n = 6) erhält milchsaure Ringer-Lösung (Laktat, 28 nM, 111,5 ml/kg/hr Infusion, 1,5 ml/kg Bolus vor der Ischämie und ein 3,0 ml/kg Bolus vor der Reperfusion). Die experimentellen Gruppen (jeweils n = 6) erhalten gleiche Volumina (3 ml) von entweder Pyruvat, Na-Salz (28 mM) oder Pyruvatethylester (28 mM), hergestellt in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren wie in Tabelle 2 gezeigt und mit einer Dosierungsgeschwindigkeit, die 10 mg/kg/hr entspricht. Geringe intestinale mukosal-zu-serosal-Durchlässigkeit C_MS, nl/min/cm²) von FITC-Dextran (mw = 4 kDA) wird unter Verwendung einer umgekehrten Darmsacktechnik, wie zuvor von Wattanasirichaigoon (1999) beschrieben, bewertet. Durchlässigkeit wird gemessen auf der Basislinie, nach 30 und 60 Minuten der Ischämie (I30 bzw. I60) und nach 30 und 60 Minuten Reperfusion (R30 bzw. R60). Histologische Proben auf der Basislinie, I60 und R60, werden auf Zottenhöhe (VH, μ) und Mukosaldicke (MT, μ) bewertet. Mukosaler Verletzungsgrad wird bestimmt gemäß dem von Chiu et al. (1970) beschriebenen Verfahren, bewertet wie in Tabelle 3 wie folgt:
Tabelle 3 Mukosaler Verletzungsgrad
Die Daten werden als Mittel ± Standardabweichung des Mittels zusammengefasst. Signifikanzen und Unterschiede werden bestimmt unter Verwendung eines studentischen t-Tests. Unterschiede werden als signifikant angesehen für p < 0,05.
Die Ergebnisse dieser Experimente auf die Verwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben, dass sowohl Pyruvatzusammensetzungen als freie Säure als auch als Ethylester signifikant mukosale Durchlässigkeit während Reperfusion verringern, wie in 4 gezeigt. Der Ester zeigt einen signifikanten Trend zu früherer und größerer Cytoprotektion, bewertet auf Grund des Ausmaßes des Durchlässigkeitsanstiegs, der ein Zeichen für irreversible Gewebezerstörung ist und bezogen auf die signifikante Schrumpfung des mukosalen Verletzungsmusters, grafisch in 5 gezeigt. Pyruvatethylester erhält darüber hinaus signifikant die Zottenhöhe und die mukosale Dicke aufrecht, sowohl während der Ischämie als auch der Reperfusion (p < 0,01), wie in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Histologische Befunde der vorteilhaften Effekte von „pyruvatisierter" Ringer-Lösung
Bemerkung: Laktat gegenüber Pyruvat und Laktat gegenüber Pyruvatester, p < 0,05 und § p < 0,01.
Zusammengenommen bestätigen diese Befunde die Verwendbarkeit von Pyruvatestern im erfindungsgemäßen Verfahren in Zusammensetzungen für die Behandlung von Ischämie und verwandten Bedingungen, die durch Hypoxie verursacht und dann reperfusiert werden, zusammen mit begleitender reaktiver Sauerstoffzerstörung. Das oben beschriebene Modelsystem, ein Rattenmodell mit oberem Mesenterialarterienverschluss, ist ein Standardmodellsystem, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, der eine therapeutische Behandlung der beschriebenen Art zur Verfügung stellen möchte und die oben angegebenen Ergebnisse sind leicht für die menschliche Verwendung extrapolierbar.
Demzufolge ist es offensichtlich, dass somit in Übereinstimmung mit der Erfindung neue 2-Ketoalkansäure-Esterverbindungen und Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt werden, sowie Verfahren zur Behandlung von nachteiligen Effekten von hypervalenten Oxidantien, die aus hypoxischer Zerstörung, gefolgt von Reperfusion resultieren, welche vollständig die Aufgaben, Wünsche und Vorteile, wie oben angegeben, erfüllen.
REFERENZEN

Artemov, D., Bhujwalla, Z. M., Pilatus, U. and Glickson, J. D., Two compartment model for determination of glycolytic rates of solid tumors by in vivo 13C NMR spectroscopy. NMR in Biomedicine 11: 395–404, 1998.
Ausenhus, S. L. and O'Leary, M. H., Hydrolysis of phosphoenolpyruvate by phosphoenolpyruvate carboxylase from Zea mays. Biochemistry 33: 6427–6431, 1992.
Banda, M. A., and Granger, D. N., Mechanism and protection from ischemic intestinal injury. Transplantation Proceedings 28: 2595–2597, 1996.
Chiang, Y., Kresge, A. J. and Pruszynski, Keto-enol equilibria in the pyruvic acid system: determination of the keto-enol equilibrium constants of pyruvic acid and pyruvate anion and the acidity constant of pyruvate enol in aqueous solution. Journal of the American Society 114: 303–310, 1992.
Chiu, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J. and Gurd, F. N., Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery 101: 478–483, (1970).
Cicalese, L., Lee, K., Schraut, W., Watkins, S., Borle, A. and Stanko, R., Pyruvate prevents ischemia-reperfusion mucosal injury of rat small intestine. American Journal of Surgery 171: 97–100; discussion 100–101, 1996.
Constantopoulos, G. and Barranger, J. A., Non-enzymatic decarboxylation of pyruvate, Analytical Biochemistry 139: 353–358, 1984.
Crestanello, J. A., Lingle, D. M., Millili, J. and Whitman G. J., Pyruvate improves myocardial tolerance to reperfusion injury by acting as an antioxidant: a chemiluminescence study. Surgery 124: 92–9, 1998.
DeBoer, L. W., Bekx, P. A., Han, L. and Steinke, L., Pyruvate enhances recovery of rat hearts after ischemia and reperfusion by preventing free radical generation. American Journal of Physiology 265: H1571–6, 1993.
Kuo, D. J., O'Connell, E. L. and Rose, I. A., Physical, chemical, and enzymological characterization of enolpyruvate. Journal of the American Chemical Society 101: 5025–5030 1979.
Kurose, I., Argenbright, L. W., Wolf, R., Lianxi, L. and Granger, D. N., Ischemia/reperfusion-induced microvascular dysfunction: role of oxidants and lipid mediators. American Journal of Physiology 272: H2976–82, 1997.
Margolis, S. A. and Coxon, B., Identification and quantitation of the impurities in sodium pyruvate. Analytical Chemistry 58: 2504–2510, 1986.
Muderawan, I. W., Bott, R. C., and Young, D. J., Chelation controlled addition of ethyl pyruvate to cyclic allylic stannanes. A diastereospecific route to functionalized bicyclic gamma-lactones. Synthesis 1640–1644, 1998.
O'Donnell-Tormey, J., Nathan, C. F. Lanks, K., DeBoer, C. J. and de la Harpe, J., Secretion of pyruvate. An antioxidant defense of mammalian cells. Journal of Experimental Medicine 165: 500–14, 1987.
Peliska, J. A. and O'Leary, M. H., Preparation and properties of enolpyruvate. Journal of the American Chemical Society 113: 1841–1842, 1991.
Perera, A., Parkes, H. G., Herz, H., Haycock, P., Blake, D. R., and Grootveld, M. C., High resolution NMR investigations of the reactivities of alpha-keto acid anions with hydrogen. Free Radical Research 26: 145–57, 1997.
Salahudeen, A. K., Clark, E. C. and Nath, K. A., Hydrogen peroxide-induced renal injury. A protective role for pyruvate in vitro and in vivo. Journal of Clinical Investigation 88: 1886–93, 1991.
Simpson, P. J. and Lucchesi, B. R., Free radicals and myocardial ischemia and reperfusion injury. Journal of Labaratory & Clinical Medicine 110: 13–30, 1987.
Sawyer, D. T., Stamp, J. J. and Menton, K. A., Reactivity of superoxide ion with ethyl pyruvate, α- diketones, and benzil in dimethylformamide, Journal of Organic Chemistry 48: 3733–3736, 1983.
Sekine, M., Futatsugi, T., Yamada, K. and Hata, T., A convenient synthesis of phosphoenolpyruvate via a silylester intermediate. Tetrahedron Letters 21: 371–372, 1980.
Starostin, E. K., Radyukin, Y. N., Ignatenko, A. V. and Nikishin, G. I., Decomposition of the peroxides of the esters of keto acids by Fe(II) salts. Bulletin of the Academy of Sciences, USSR, Chemical Sciences 29: 109–112, 1980.
Varma, S. D., Devamanoharan, P. S. and Ali, A. H., Prevention of intracellular oxidative stress to lens by pyruvate and its ester. Free Radical Research 28: 131–5, 1998.
Vogt, J. A., Yarmush, D. M., Yu, Y.-M., Zupke, C., Fischman, A. J., Tompkins, R. G. and Buke, J. F., TCA cycle flux estimates from NMR- and GC-MS-determined 13C-glutamate isotopomers in liver. American Journal of Physiology 272: c2049–C2062, 1997.
Wattanasirichaigoon, S., Menconi, M. J., Delude, R. L. and Fink, M. P., Lisofylline ameliorates intestinal mucosal barrier dysfunction caused by ischemia and ischemia/reperfusion. Shock 11: 269–75, 1999.
Yamazaki, H. and Shimada, T., Progesterone and testosterone hydroxylation by cytochromes P450, 2C19, 2C9, and 3A4 in human liver microsomes. Archives of Biochemistry and Biophysics 346: 161–9, 1997.
Yu, X., Alpert, N. M. and Lewandawski, E. D., Modeling enrichment kinetics from dynamic 13C-NMR spectra: theoretical analysis and practical considerations. American Journal of Physiology 272: C2037–C2048, 1997.

Claims

Verwendung eines Esters zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung eines Säugers, der an Ischämie oder einer Reperfusionsverletzung leidet, wobei der Ester ein Ester einer 2-Ketoalkansäure ist, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Alkyl-, Aralkyl-, Alkoxyalkyl oder Carboxyalkylester der 2-Ketoalkansäure besteht, und das Mittel den Ester in einem pharmazeutisch verträglichen Träger aufweist, wobei der Träger weiterhin ein biologisch sicheres anorganisches zweiwertiges Kation enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger eine Ringer-Lösung von isotonischem Kochsalz ist, die mit Kaliumionen ergänzt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der 2-Ketoalkansäureester entweder (a) ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ethylpyruvat, Propylpyruvat, Butylpyruvat, Carboxymethylpyruvat, Carbethoxymethylpyruvat und Ethoxymethylpyruvat besteht, oder (b) ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ethyl 2-ketobutyrat, Ethyl-2-ketopentanoat, Ethyl 2-keto-3-methyl-butyrat, Ethyl 2-keto-4-methyl-pentanoat und Ethyl 2-keto-hexanoat besteht.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der 2-Ketoalkansäureester in einer Kochsalzlösung vermischt ist, wobei die Lösung ein Kation enthält, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Kalzium und Magnesium besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Mittel an einen Säuger vor, während oder nach mesenterischer Ischämie, meschentärischem Thrombus, mesenterischem Venenverschluss, der Beseitigung eines Aortaaneurismas, der Bypassoperation einer Koronararterie oder einer Operationsbehandlung von Arterienverschluss der Extremitäten verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der 2-Ketoalkansäureester Ethylpyruvat ist.
Verfahren zum Schutz von Organteilen, Organen oder Gliedmaßen, die einem lebenden Säuger entnommen worden sind, bei dem man das Organ mit einer Lösung perfundiert, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung mit einem Ester einer 2-Ketoalkansäure, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Alkyl-, Aralkyl-, Alkyloxyalkyl- oder Carboxyalkylester der 2-Ketoalkansäure besteht, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, wobei der Träger weiterhin ein biologisch sicheres anorganisches zweiwertiges Kation aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der 2-Ketoalkansäureester entweder (a) ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ethylpyruvat, Propylpyruvat, Butylpyruvat, Carboxymethylpyruvat, Carbethoxymethylpyruvat und Ethoxymethylpyruvat besteht, oder (b) ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ethyl 2-ketobutyrat, Ethyl-2-ketopentanoat, Ethyl 2-keto-3-methyl-butyrat, Ethyl 2-keto-4-methyl-pentanoat und Ethyl 2-keto-hexanoat besteht.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der 2-Ketoalkansäureester in einer Kochsalzlösung vermischt ist, wobei die Lösung ein Kation enthält, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Kalzium und Magnesium besteht.